CN107541545A - 一种检测唾液中egfr突变的纸芯片传感器的构建 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于纸芯片检测肺癌病人唾液中EGFR突变的方法。我们首先建立了一个微流控纸芯片电化学DNA生物传感器，通过分析纸电极表面DNA杂交反应可以检测非小细胞肺癌患者是否发生EGFR突变。电化学聚合的聚吡咯带正电荷，溶液中DNA的磷酸基团带负电荷，单链DNA与聚吡咯膜之间通过静电作用吸附到金电极表面，采用微分脉冲伏安法通过辣根过氧化物酶催化过氧化氢和亚甲基蓝的氧化还原反应。这项工作探讨了一种无创的电化学DNA检测方法，并为肺癌肿瘤标志物的检测提供了潜在的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测唾液中EGFR突变的纸芯片传感器的构建，属于电化学DNA检测技术领域。
背景技术
近几年来癌症发病率及死亡率呈现逐步上升的趋势，因此寻找快速、定量、灵敏的检测肿瘤标记物的方法在早期检测和治疗监控中非常重要。常见的临床诊断方法包括活体检查和血液抽样检查，而唾液中不仅含有各种蛋白质，还含有 DNA、RNA、脂肪酸以及各种微生物等。研究发现，血液中的各种蛋白质成分同样存在于唾液中，唾液能反映出血液中各种蛋白质水平的变化。因此，我们构建的体系就通过唾液的检测来进行肺癌疾病的诊断。
发明内容
随着科技的快速发展，各种生物传感设备朝着简单化、小型化的方向发展，因此微流控纸质分析设备越来越多的受到大家的关注。纸芯片具有廉价、储量丰富、可折叠、易于储藏等特点，因而常被使用作为现场即时检测的平台。这种微流控纸芯片分析器件的工作原理如下：在纸芯片上绘制疏水的蜡打印图案，未绘制疏水图案的部分借助于纸的毛细驱动力而构成亲水通道。基于纸的分析器件廉价、制作简便、试剂消耗量低、且可多元检测，并且操作简单，无需复杂昂贵的仪器设备，可以作为一次性分析器件，可用于包括医学诊断、药物研发、水质监测和环境质量监控等广阔领域。尤其在医学欠发达的发展中国家以及贫困偏远地区，纸芯片在疾病诊断和分析应用中将具有很大的应用前景。
常见的临床诊断方法包括活体检查和血液抽样检查，这些检测方法在取样时往往需要手术或者抽血，而唾液样品的获得更加简单方便快速，在纸芯片表面上修饰金贵金属离子和待测物，通过电化学信号来分析DNA之间的杂交反应，从而能够实现肺癌病人的无创检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是在微流控纸芯片上建立电化学分析检测方法。
一种检测唾液中EGFR突变的纸芯片传感器的构建，其特征是包括以下步骤：
1.1 在Adobe illustrator CS4上设计如附图1所示的三维微流控纸芯片的疏水蜡批量打印图案；
1.2 将纸剪裁成常用A4大小的纸，将步骤（1.1）中设计的疏水蜡批量打印图案打印到A4纸上，随后将带有蜡图案的A4纸放置到平板加热器或烘箱中，在150 ºC加热2 min；使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙；
1.3 采用丝网印刷的方法，将阵列工作电极、参比电极、对电极印刷图案依次印刷到步骤（1.2）中得到的纸上，最后所得的样式如附图1所示，其中右侧为工作区印有1个工作电极，左侧为参比区印有参比电极和对电极；
1.4探针预变性
首先，捕获探针和FITC标记的检测探针以及目标DNA，在95 ºC下分别孵育5 min；将这三种溶液在室温条件下放30 min；
1.5电极表面的杂交反应
首先，在裸纸电极上滴加金纳米粒子生长液，待生长液自然干燥后，通过电聚合反应将0.1 M吡咯和100 nM捕获探针聚合到制备好的金纸电极表面，循环伏安法施加电压在-0.1到0.7 V之间，扫描速度为50 mV/s，扫描20次；然后，将100 nM检测探针和100 nM目标DNA用同样的方法聚合到电极表面；缓冲溶液的成分为pH=7.0的PBS缓冲液；杂交反应后，将150U/mL的抗荧光素抗体滴加到电极表面，30分钟之后将辣根过氧化物酶滴加到电极表面，最后用二次水冲洗并在室温下干燥；
1.6电化学检测
取10 mL的PBS缓冲液(pH 7.4)加入1.0 mM的亚甲基蓝和15 mM的过氧化氢, 差分脉冲法施加电压在-0.4到0.2 V之间，脉冲振幅为50 mV，脉冲宽度为50 ms；
1.7 实际样品的检测
重复步骤1.5，将目标DNA换成唾液中提取的DNA进行检测；
本发明的有益效果
（1）通过电化学信号分析DNA之间的杂交反应，从而能够实现肺癌病人的无创检测；
（2）本发明所述方法操作简单、快速。
附图说明
图1为本文所用纸芯片的设计图案；图2为本文所述方法的实验原理图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施。
实施例1
1. 一种检测唾液中EGFR突变的纸芯片传感器的构建，其特征是包括以下步骤：
1.1 在Adobe illustrator CS4上设计如附图1所示的三维微流控纸芯片的疏水蜡批量打印图案；
1.2 将纸剪裁成常用A4大小的纸，将步骤（1.1）中设计的疏水蜡批量打印图案打印到A4纸上，随后将带有蜡图案的A4纸放置到平板加热器或烘箱中，在150 ºC加热2 min；使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙；
1.3 采用丝网印刷的方法，将阵列工作电极、参比电极、对电极印刷图案依次印刷到步骤（1.2）中得到的纸上，最后所得的样式如附图1所示，其中右侧为工作区印有1个工作电极，左侧为参比区印有参比电极和对电极；
1.4探针预变性
首先，捕获探针和FITC标记的检测探针以及目标DNA，在95 ºC下分别孵育5 min；将这三种溶液在室温条件下放30 min；
1.5电极表面的杂交反应
首先，在裸纸电极上滴加金纳米粒子生长液，待生长液自然干燥后，通过电聚合反应将0.1 M吡咯和100 nM捕获探针聚合到制备好的金纸电极表面，循环伏安法施加电压在-0.1到0.7 V之间，扫描速度为50 mV/s，扫描20次；然后，将100 nM检测探针和100 nM目标DNA用同样的方法聚合到电极表面；缓冲溶液的成分为pH=7.0的PBS缓冲液；杂交反应后，将150U/mL的抗荧光素抗体滴加到电极表面，30分钟之后将辣根过氧化物酶滴加到电极表面，最后用二次水冲洗并在室温下干燥；
1.6电化学检测
取10 mL的PBS缓冲液(pH 7.4)加入1.0 mM的亚甲基蓝和15 mM的过氧化氢, 差分脉冲法施加电压在-0.4到0.2 V之间，脉冲振幅为50 mV，脉冲宽度为50 ms；
1.7 实际样品的检测
重复步骤1.5，将目标DNA换成唾液中提取的DNA进行检测。
SEQUENCE LISTING
<110> 济南大学
<120> 一种基于纸芯片检测肺癌病人唾液中EGFR突变的方法
<130> 3
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<170> PatentIn version 3.3
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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cgtcgctatc aaggaagcaa caaggtgaga aagttaaaat tcc 43
Claims (1)
1.一种基于纸芯片检测肺癌病人唾液中EGFR突变的方法，其特征是包括以下步骤：
1.1 在Adobe illustrator CS4上设计如附图1所示的三维微流控纸芯片的疏水蜡批量打印图案；
1.2 将纸剪裁成常用A4大小的纸，将步骤（1.1）中设计的疏水蜡批量打印图案打印到A4纸上，随后将带有蜡图案的A4纸放置到平板加热器或烘箱中，在150 ºC加热2 min；使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙；
1.3 采用丝网印刷的方法，将阵列工作电极、参比电极、对电极印刷图案依次印刷到步骤（1.2）中得到的纸上，最后所得的样式如附图1所示，其中右侧为工作区印有1个工作电极，左侧为参比区印有参比电极和对电极；
1.4探针预变性
首先，捕获探针和FITC标记的检测探针以及目标DNA，在95 ºC下分别孵育5 min；将这三种溶液在室温条件下放30 min；
1.5电极表面的杂交反应
首先，在裸纸电极上滴加金纳米粒子生长液，待生长液自然干燥后，通过电聚合反应将0.1 M吡咯和100 nM捕获探针聚合到制备好的金纸电极表面，循环伏安法施加电压在-0.1到0.7 V之间，扫描速度为50 mV/s，扫描20次；然后，将100 nM检测探针和100 nM目标DNA用同样的方法聚合到电极表面；缓冲溶液的成分为pH=7.0的PBS缓冲液；杂交反应后，将150U/mL的抗荧光素抗体滴加到电极表面，30分钟之后将辣根过氧化物酶滴加到电极表面，最后用二次水冲洗并在室温下干燥；
1.6电化学检测
取10 mL的PBS缓冲液(pH 7.4)加入1.0 mM的亚甲基蓝和15 mM的过氧化氢, 差分脉冲法施加电压在-0.4到0.2 V之间，脉冲振幅为50 mV，脉冲宽度为50 ms；
1.7 实际样品的检测
重复步骤1.5，将目标DNA换成唾液中提取的DNA进行检测；
如权利要求1所述的一种基于纸芯片检测肺癌病人唾液中EGFR突变的方法，在计算机上用Adobe illustrator CS4设计电化学三维微流控纸芯片的疏水蜡批量打印图案；
如权利要求1所述的一种基于纸芯片检测肺癌病人唾液中EGFR突变的方法，其特征是步骤（1.5）中的抗荧光素抗体浓度为150 U/mL；
如权利要求1所述的一种基于纸芯片检测肺癌病人唾液中EGFR突变的方法，其特征是步骤（1.7）中检测目标物为唾液。
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| CN110220951A (zh) * | 2019-07-03 | 2019-09-10 | 济南大学 | 一种利用整合式装置检测食物中的鼠伤寒沙门氏菌的方法 |
| CN110389228A (zh) * | 2019-07-24 | 2019-10-29 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置及其制作方法和应用 |
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2016
- 2016-09-08 CN CN201610807456.8A patent/CN107541545A/zh active Pending
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