CN107922978A - 用于性别和类别识别的电化学dna生物传感器 - Google Patents

用于性别和类别识别的电化学dna生物传感器 Download PDF

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宗可辉阿布德拉希德
刘宝嫱
德迪弗特拉
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Abstract

电化学DNA生物传感器包括以金纳米颗粒改性的丝网印刷的电极、二氧化硅纳米球复合物层、寡核苷酸序列、交联剂和氧化还原剂指示物。二氧化硅纳米球复合物层沉积在丝网印刷的电极上，且寡核苷酸序列使用交联剂固定在二氧化硅纳米球复合物层上。此外，寡核苷酸序列与来自相关的鱼的核酸的独特目标序列互补，使得来自相关的鱼的核酸杂交寡核苷酸序列来形成dsDNA。此外，氧化还原指示物嵌有dsDNA，其允许通过伏安法检测鱼的性别和类别。

Description

用于性别和类别识别的电化学DNA生物传感器
技术领域
本发明的实施例涉及生物传感器，并且更具体地涉及快速地识别样本DNA来用于识别龙鱼的性别和类别而不需要任何熟练操作者的电化学DNA生物传感器。此外，其可根据使用需要来小型化。另外，其提供了便携和用户友好的结构的优点。
背景技术
近年来，对马来西亚金龙鱼(Scleropagesformosus)的需求在世界范围内不断提高。这种价格昂贵的观赏鱼是马来西亚特有的，并且每年出口高达60,000条鱼，每条鱼的平均价格在10,000马币。因此，由于其高需求，故识别此物种是重要的。所以，已经在积极进行对用于快速诊断这些鱼的性别和类别的便携式、易用且低成本的生物分析系统的研究和开发。在这些系统中，基于DNA杂交的生物传感器由于它们不太昂贵且提供快速结果而变成了一种主要的诊断工具。
常规生物传感器由生物识别构件、生物换能器构件和包括信号放大器、处理器和显示器的电子系统构成。生物识别构件与相关分析物交互，且交互由生物换能器测量，生物换能器输出与样本中的目标分析物的存在成比例的可测量信号。检测的分析物在性质上可为有机和无机两者。
WO2008099163A1描述了一种检测样本中DNA的依赖蛋白质的重合的方法，其包括使用引入具有一个或多个DNA片段的DNA中的一个或多个发光体的发光来检测，其中片段使用一种或多种DNA结合蛋白质来结合。此外，发光技术包括使用ALEX-FRET。
US20060228738A1公开了一种基于DNA聚吡咯的生物传感器，以及使用此生物传感器来快速检测大肠杆菌和其它微生物的方法。DNA聚吡咯生物传感器用于检测微生物来监测来自饮用水或食物源的样本的水质。此外，该生物传感器使用从自然环境取得的基因组DNA来用于快速检测微生物，以提供水污染的早期警告。
CN103529036A描述了一种用于杂交黄颡鱼(Richardson)的幼鱼的性别识别方法。此杂交鱼通过活体性腺挤压、乙酸胭脂红染色和乙醇结晶紫染色的方法来识别。此外，该方法的准确性通过性腺组织的石蜡切片来验证。
具体而言，该生物传感器的至少一个优点在于它们可检测痕量的样本溶液。待分析的样本暴露于附加的化学物质，其附于分析物上，以便标注或标记它们。在添加化学物质的情况下，标注的分析物变得更大，且不同地响应于特定光频率或以使它们较容易检测的一些方式另外改变物理性质。
尽管常规的生物传感器可提供各种优点如上文所述的那些，但常规生物传感器在各种其它问题上受限，如，放射性标记或氧化还原标记的探针的使用是有问题的，因为放射性标记寿命短，这需要在短时间段内完成分析。此外，氧化还原标记的使用取决于可存在真实样本中的干扰的颜色变化。
此外，常规分析物检测系统基于分析物与分析物结合受体之间的分析物特有的结合。此类系统通常需要复杂的多构件检测系统，如，酶联免疫吸附试验、电化学检测系统，或需要分析物和受体以检测分子标记，例如，荧光共振能量转移(FRET)系统。此外，其包括使用诸如聚合酶链反应(PCR)和凝胶电泳的仅可由熟练操作者完成的技术。此外，这些技术太慢，且劳动强度大，且可仅在实验室中执行。
因此，在现有技术中，仍需要具有克服前述问题和不足的改进的生物传感器。
然而，本领域中仍需要快速地识别样本DNA来用于经由电化学检测识别龙鱼的性别和类别的电化学DNA生物传感器。此外，该生物传感器便携且提供简单且快速的结果。另外，其可由非熟练操作者如农民操作。
发明内容
本发明的实施例针对提供一种电化学DNA生物传感器，其快速地识别样本DNA来经由电化学检测识别龙鱼的性别和类别。此外，提出的生物传感器测量产生的电流，其不取决于颜色变化，且因此消除了真实样本中的干扰的风险。此外，电化学DNA生物传感器涉及直接检测方法，且定性且定量地给出快速结果，而不需要PCR放大反应。另外，其为用户友好且便携的。本发明提供由权利要求1的特征，然而本发明还可在于权利要求的特征的任何组合。
根据本发明的实施例，电化学DNA生物传感器包括以金纳米颗粒改性的丝网印刷的电极、二氧化硅纳米球复合物层、寡核苷酸序列、交联剂和氧化还原指示物。二氧化硅纳米球复合物层沉积在丝网印刷的电极上，且寡核苷酸序列使用交联剂固定在二氧化硅纳米球复合物层上。此外，寡核苷酸序列与来自相关的鱼的核酸的独特目标序列互补，使得来自相关的鱼的核酸杂交寡核苷酸序列来形成dsDNA。此外，氧化还原介体嵌有dsDNA，其允许通过伏安法检测鱼的性别和类别。
根据本发明的实施例，丝网印刷的电极是碳丝网印刷的电极。
根据本发明的实施例，寡核苷酸序列是马来西亚金龙鱼(Scleropagesformosus)的DNA序列。
根据本发明的实施例，交联剂是戊二醛(GA)。
根据本发明的实施例，氧化还原指示物是单磺酸蒽醌(AQMS)。
根据本发明的实施例，目标序列是DNA或RNA。
根据本发明的实施例，鱼是马来西亚金龙鱼(Scleropagesformosus)。
根据本发明的实施例，电化学DNA生物传感器还包括干试剂垫，其包括缓冲盐和氧化还原指示物。此外，氧化还原指示物和缓冲盐固定在干试剂垫中。
根据本发明的实施例，伏安法是微分脉冲伏安法(DPV)。
尽管本文通过举例使用实施例和示范性图来描述本发明，但本领域的技术人员将认识到，本发明不限于所述一个或多个附图中的实施例，且不旨在代表各种构件的比例。此外，可形成本发明的一部分的一些构件可为了简化图示而在某些图中不示出，且此类省略并未以任何方式限制提出的实施例。应当理解，附图及其详细描述不旨在将本发明限于公开的特定形式，而相反，本发明将覆盖落入如由所附权利要求限定的本发明的范围内的所有改型、等同方案和备选方案。本文使用的标题仅用于组织目的，且不意在用于限制描述或权利要求的范围。如本描述各处使用的词语"可"是以允许意义(即，意指有可能)而非强制意义(即，意指必须)使用。此外，词语"一个"或"一种"意指"至少一个"，除非另外指出。此外，本文使用的术语和短语仅用于描述目的，且不应当看作是在限制范围。语言如"包括"、"包含"、"具有"、"含有"或"涉及"，以及其变型旨在为宽泛的，且涵盖下文列出的主题、等同方案和未叙述的附加主题，且不旨在排除其它添加物、构件、整数或步骤。类似地，出于适用法律性目的，用语"包括"看作是与用语"包括"或"含有"同义。文献、动作、材料、装置、制品等的任何论述都仅用于提供本发明的背景的目的而包括在说明书中。并未建议或代表任何或所有这些主题都形成现有技术的基础的一部分，或是关于本发明的领域中的常见的普通知识。
在本公开案中，每当成分或元件或元件组前面有过渡性短语"包括"时，将理解到，我们还构想出了相同成分、元件或元件组在成分、元件或元件组的叙述之前具有过渡性短语"构成"、"构造成"、"选自以下构成的集合"、"包含"或"是"。
附图说明
所以，可详细理解本发明的上述特征的方式、本发明的更具体的描述、简要概括的上文，可参照实施例，其中一些在附图中示出。然而，将注意到的是，附图仅示出了本发明的典型实施例，且因此不认作是限制其范围，因为本发明可允许其它同样有效的实施例。
本发明的这些及其它特征、好处和优点将通过参照以下附图变为清楚，其中相似的参考标号表示各种视图中的相似结构，在附图中：
图1示出了根据本发明的实施例的电化学DNA生物传感器电极的分解视图。
图2为示出通过使用SiNSp改性金纳米颗粒SPE电极的来自电化学DNA生物传感器的AQMS电流的微分脉冲伏安图的图表。
图3为示出金纳米颗粒(A)、二氧化硅纳米球(B)、DNA探针浓度(C)、温度(D)、DNA杂交时间(E)和磷酸钠缓冲剂的pH(F)对由AQMS指示物验证的电化学DNA生物传感器响应的效果的图表。
图4为示出由电化学DNA生物传感器生成的DPV峰值电流响应的微分脉冲伏安图(A)和校准曲线(B)的图表。
图5为示出具有作为再生溶液(15min)的NaOH(0.1M)(B)和以1.0x10-9M cDNA固定在Si-Au-SPE上的DNA探针(30min)(A)的电化学DNA生物传感器的再生性能的图表。
具体实施方式
下文通过参照附图的各种实施例描述了本发明，其中附图中使用的参考标号在本描述的各处对应于相似的元件。然而，本发明可体现为许多不同的形式，且不应当看作是限于本文所述的实施例。相反，实施例提供成以便本公开内容将为彻底和完全的，且将将本发明的范围完全传达给本领域的技术人员。在以下详细描述中，数值和范围提供成用于所述实施方式的各种方面。这些值和范围仅处理为实例，且不旨在限制权利要求的范围。此外，许多材料识别为适用于实施方式的各种方面。这些材料处理为示例性的，且不旨在限制本发明的范围。
本发明的实施例针对提供一种电化学DNA生物传感器，其快速地识别样本DNA来经由电化学检测识别龙鱼的性别和类别。本发明能够提供备选的电化学DNA生物传感器来替换常规的生物传感器。此外，公开的电化学DNA生物传感器是无试剂的。换言之，在其操作期间，不可能添加试剂。此外，提出的电化学DNA生物传感器测量产生的电流，以便检测样本。另外，其是便携的，且在现场提供快速结果(例如，15min内)，而不需要任何熟练操作者。
根据本发明的实施例，电化学DNA生物传感器包括以金纳米颗粒改性的丝网印刷的电极、二氧化硅纳米球复合物层、寡核苷酸序列、交联剂和氧化还原指示物。二氧化硅纳米球复合物层沉积在丝网印刷的电极上，且寡核苷酸序列使用交联剂固定在二氧化硅纳米球复合物层上。此外，寡核苷酸序列与来自相关的鱼的核酸的独特目标序列互补，使得来自相关的鱼的核酸杂交寡核苷酸序列来形成dsDNA。此外，氧化还原指示物嵌有dsDNA，其允许通过伏安法检测鱼的性别和类别。
根据本发明的实施例，丝网印刷的电极由二氧化硅纳米球(SiNSp)和金纳米颗粒(AuNPs)的复合物制成，以形成改性的碳丝网印刷电极(Si-Au-SPE)。二氧化硅纳米球(SiNSp)是生物相容的，且便于高度的DNA结合。另外，它们提供了大表面面积和沉积在电极上的便利性。
根据本发明的实施例，寡核苷酸序列(DNA探针)通过用作交联剂的戊二醛(GA)共价耦合到二氧化硅纳米球层上。
根据本发明的实施例，寡核苷酸序列与龙鱼的目标DNA序列互补。此外，目标DNA序列是从龙鱼样本取得的cDNA。此外，目标cDNA与寡核苷酸序列(DNA探针)杂交来形成dsDNA。氧化还原指示物(蒽醌-2-磺酸一水钠(AQMS)盐嵌有dsDNA，且允许使用微分脉冲伏安法(DPV)来检测马来西亚金龙鱼的性别和类别。
根据本发明的实施例，电化学DNA生物传感器包括干试剂垫。干试剂垫包括氧化还原指示物、缓冲盐和聚乙烯醇(PVA)。此外，氧化还原指示物和缓冲液固定在干试剂垫中来避免使用化学物质。在目标cDNA与寡核苷酸序列(DNA探针)杂交期间，干试剂垫在它们嵌有dsDNA时允许氧化还原指示物的缓慢释放。
在下文中，本发明的实例将提供更详细的阐释。
实例
1.寡核苷酸序列(DNA探针)的选择
用于涉及性别和类别的确定的多个探针(其为2到3个不同探针)的寡核苷酸序列将涉及性别或类别确定。这些探针在超过一百个龙鱼组织样本上通过分子技术(PCR、克隆和电泳)而获得。对于龙鱼性别或类别有最佳特异性的两到三个探针被选出，且随后用于生物传感器制造。这些探针是20到25bp长。
2.基于二氧化硅纳米球复合物的DNA生物传感器的制备
如图1中所示的电化学DNA生物传感器电极(100)的三电极系统用于DNA生物传感器测量，具有作为工作电极(102)的碳膏丝网印刷电极(Scrint技术(M))、作为基准电极(106)的印刷的Ag/AgCl电极，以及碳膏反电极(104)。DNA生物传感器包括干试剂垫(108)，其还包括固定在聚乙烯醇(PVA)中的缓冲盐和氧化还原指示物。在杂交时，干试剂垫(108)允许氧化还原指示物的缓慢释放。丝网印刷的电极在与DNA探针的目标cDNA杂交发生时是电流的换能器。电化学测量使用利用Autolab PGSTAT 12稳压器(Metrohm,Ultrecht,Netherlands)的微分脉冲伏安法(DPV)来执行。DPV的参数在-0.85到-0.15V的扫描范围中是0.02V跨步电势。
3.二氧化硅纳米球的制备
氨基功能化的二氧化硅纳米球通过使用改良的Tang等人的方法来产生。去离子水(2mL)、氨溶液(5mL)和乙醇(20mL)的混合物在室温下声处理10min。随后，四乙氧基硅烷(TEOS)(2mL)和乙醇(4mL)的混合物加到上述混合物中，且在56℃下声处理另外30min。二氧化硅纳米球胶质直接以3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)(2ml)功能化，且在25℃下搅拌整夜。在离心处理(4000rpm,20min)之后，SiNSp在环境温度下空气干燥整夜，且大约6mg的干燥的氨改性的SiNSp然后悬置500μL的乙醇中来用于生物传感器的开发。
4.目标cDNA与DNA探针的杂交
乙醇中的大约10μL的金纳米颗粒(AuNPs)悬液(1mg/300μL)载入碳SPE，且在环境温度下空气干燥。以AuNPs改性的SPE(Au-SPE)然后滴涂二氧化硅纳米球胶质(2μL)。Si-Au-SPE浸泡在400μL的戊二醛(GA)(5％)中两小时,以活化胺化SiNPs的表面，且以去离子水清洗。GA功能化的Si-Au-SPE在4℃下在300μL的DNA探针(2μM)溶液中培养整夜，且以磷酸钾缓冲剂(0.05M，pH7.0)小心清洗，以除去未结合的DNA探针。固定的DNA探针浸没在含有NaCl(1M)和AQMS(1mM)的300μL目标cDNA溶液中30min，以允许杂交过程，且以去离子水彻底清洗多次，且浸没在磷酸钾缓冲剂中6min，以物理地释放吸附的cDNA和/或AQMS。DPV电流信号的所有测量都在250℃下在450μL的磷酸钾缓冲剂(0.05M，pH7.0)中执行。
5.DNA生物传感器响应的优化
观察到了DNA生物传感器响应的优化来获得生物传感器的最佳工作。载入0.01到0.05mg的金纳米颗粒。二氧化硅纳米球在0.001到0.05mg之间优化堆叠在Au-SPE上。加强的DNA生物传感器响应通过将0.01到30μM的DNA探针固定在二氧化硅纳米球改性的Au-SPE电极上来评估。此外，DNA杂交反应在16℃到60℃下在水浴中培养。同时通过将DNA探针固定的Si-Au-SPE浸没在互补的DNA(cDNA)溶液中1到240min来评估DNA生物传感器的最佳杂交时间。为了确定最佳pH，磷酸钠缓冲剂的pH证实从pH3.0到pH9.0。为了确定干试剂垫中的最佳缓冲盐和PVA浓度，缓冲盐和PVA分别证实从0.01到0.5M和1％到10％。固定在PVA中的AQMS的量也是最佳的。浸出时间优化成从15到200min。
6.DNA杂交确定
在从1.0x10-19到1.0x10-7M的一系列cDNA目标溶液浓度下研究了DNA生物传感器。DNA生物传感器在25℃下的30minDNA杂交反应之后收集到。同时DNA生物传感器的可复制性通过使用两个不同的cDNA浓度来批量制备，即，1.0x10-11和1.0x10-9M。DNA生物传感器的10个单元的DPV信号在30min的杂交反应之后评估。提出的DNA生物传感器的再生通过将固定的DNA探针在25℃下在300μL的DNA目标溶液(1.0x10-9M)中培养来执行。然后，DNA生物传感器在0.1M的NaOH溶液中浸泡15min来引入dsDNA断裂，且以磷酸钾缓冲剂(0.05M，pH7.0)仔细清洗2min。沉积的DNA探针与1.0x10-9M的cDNA在室温下再次执行杂交30min。
7.从DNA真实样本确定龙鱼类别
用于确定龙鱼类别的取得的DNA浓度使用磷酸钠缓冲剂(0.05M，pH7.0)100倍稀释。含有NaCl(1M)和AQMS(1mM)的大约300mL的DNA获取溶液声处理15min来释放dsDNA断裂。然后，固定的DNA探针浸泡30min来允许DNA杂交过程，且以去离子水仔细清洗，以除去未结合或吸附的获得的DNA。基于DPV峰值电流信号评估龙鱼的DNA类别在DNA杂交反应之后测量，且与对照物的DPV电流响应相比较。而对照物是没有分析物(获得的龙鱼DNA)的DNA探针功能化的Si-Au-SPE电极。
结果
1.DNA生物传感器响应的特征化
图2中示出了使用AQMS作为电化学杂交标签来确定不同DNA序列的DNA生物传感器的微分脉冲伏安图(DPV)峰值电流信号。在0.5Vs-1的扫描率对Ag/AgCl下，在磷酸钾缓冲剂(0.05M，pH7.0)中执行测量。由于加强的DNA杂交反应和AQMS嵌入固定的dsDNA，故相比于其它改性SPE，发现了DNA探针功能化的cDNA-Si-Au-SPE中的最高DPV峰值电流响应。这指出了胺化的DNA探针通过交联剂(戊二醛)成功地载入二氧化硅纳米球上。而dcDNA提供到改性的DNA探针-Si-Au-SPE相比于cDNA改性的DNA探针-Si-Au-SPE给出的相当低的DPV电流信号，因为DNA杂交反应并未在ncDNA与DNA探针之间发生，结果AQMS与dsDNA的嵌合失败。同时，由于AQMS与DNA探针功能化的SPE之间的静电排斥，故引入Si-Au-SPE的DNA探针并未给出DPV峰值电流信号。另外，由于AQMS在电极表面上的非特异性吸附，故Si-Au-SPE和Au-SPE未示出DPV峰值电流信号。
2.实验条件的优化
图3中示出了金纳米颗粒(AuNPs)、二氧化硅纳米球(SINSp)、DNA探头、温度、DNA杂交时间和磷酸钠缓冲剂的pH朝DNA生物传感器响应的效果。由于SiNSp是半导体聚合物，故从DNA杂交氧化还原指示物到电极表面的电子移动可由此聚合物阻挡。因此，涂布在碳SPE表面上来加速电子转移的AuNPs需要优化。由于从AQMS氧化还原介体到金纳米颗粒改性SPE电极表面的加强的电子转移，故DNA生物传感器信号随AuNPs沉积从0.001增大到0.003mg(图3A)而增大。当AuNPs的量从0.003增大到0.01mg时，由于增大的AuNPs的量覆盖组件中心碳SPE电极，故DNA生物传感器响应减小。
对于二氧化硅纳米球，DNA生物传感器响应随SiNSp从0.002加载到0.014mg(图3B)而增大。这指出了增大的SiNSp浓度可主要准备SiNPs的活性胺部位，以与DNA探针反应，随后是与cDNA的杂交反应，这进一步加强了与dsDNA的嵌合。当SiNSp浓度从0.014增大到0.02mg时，DNA生物传感器响应由于大量SiNSp阻挡AQMS氧化还原剂到SPE电极表面的电子转移而减小。因此，最佳的AuNPs和SiNSp加载分别是0.003mg和0.012mg。
类似地，对于如图(图3C)中所示的DNA探针加载，DNA生物传感器信号随0.1到2.0μM的DNA探针溶液加载而逐渐地增大。这隐含了增大的DNA探针的量与SiNSp的活性胺部位反应，导致提高的DNA杂交和AQMS与dsDNA的嵌合。DNA生物传感器响应利用从2.0到3.0μM的DNA探针溶液来维持，这关于DNA探针与cDNA完全耦合。
此外，温度DNA杂交反应的影响通过在水浴中培养DNA生物传感器来观察。由于在较高温度条件下的较大质量转移和DNA分子反应的速率贡献了加强的DNA杂交，故DNA生物传感器响应随温度从16℃升高到25℃(图3D)而增大。当温度从25℃升高到60℃时，DNA生物传感器响应在形成的双标准DNA(dsDNA)由于较高温度下DNA变性而开始变到单标准DNA(ssDNA)而减小。
此外，DNA生物传感器响应从5到30min的DNA杂交时间(图3E)稳定地增大，其中DNA探针作为嵌有Si-Au-SPE电极表面上的DNA探针的大量cDNA。当DNA杂交反应时间从45min继续到240min时，发现DNA生物传感器信号是恒定的，因为Si-A-SPE电极上的固定DNA探针与目标cDNA完全耦合。因此，最佳DNA杂交时间在将DNA探针保持在cDNA溶液中30分钟之后选择。
另外，pH对DNA杂交反应的影响通过使用磷酸钠缓冲剂来研究。如图3F中展示那样，由于DNA探针与目标cDNA的杂交加强，故DNA生物传感器信号从pH5.5增大到pH6.5。当pH从6.5增大到8.0时，生物传感器响应逐渐地减小。这涉及DNA磷酸二酯键上的质子的量由于更大碱性的磷酸钠缓冲剂的加入而逐渐地减小，这导致带负电的磷酸二酯DNA分子之间的静电排斥增大。因此，在pH6.5的磷酸钠缓冲剂对于DNA杂交反应选择为最佳的pH。
分别干试剂垫的缓冲盐和PVA的最佳浓度分别为0.05M和5％。发现最佳的浸出时间为30min。发现干试剂垫中固定在PVA中的AQMS的最佳量是0.715mg。
3.DNA杂交评估
图4中示出了通过在25℃下以30min的DNA杂交使用从1.0x10-13到1.0x10-1μM的各种目标龙鱼DNA浓度观察到的DNA生物传感器的校准曲线。由于加强的DNA杂交和AQMS嵌入电极表面上的dsDNA中，故DNA杂交响应与二氧化硅纳米球改性的Au-SPE电极上固定的cDNA的量增大成比例地增大(图4)。基于DNA生物传感器的Si-Au复合物示出了线性响应范围在1.0x10-17到1.0x10-7M的范围中，且最低检测极限是1.4x10-18M。这些结果示出了，胺化的DNA探针通过戊二醛与表面胺化的二氧化硅纳米球功能化的Au-SPE的共价结合通过杂交交互来与目标cDNA成功地反应(图4B)。这指出了DNA生物传感器的高灵敏度，这由大表面面积、优异的扩散性，以及SiNSp在电极表面上的粘合性贡献。
此外，DNA生物传感器的选择性特征通过使用目标互补DNA(cDNA)和非互补DNA(ncDNA)来评估(表2)。DNA生物传感器响应展示了发现朝cDNA的100％的选择性，以及朝ncDNA获得低于4.0％的选择性。因此，提出的DNA生物传感器朝龙鱼DNA选择。
表2。由AQMS DPV峰值电流强度验证的cDNA与ncDNA之间的DNA杂交信号水平的比较。
通过使用10个不同的电极，且利用两个cDNA浓度(即，1.0x10-9和1.0x10-7M)执行来评估DNA生物传感器的可复制性。10个不同DNA生物传感器的DNA杂交测量的相对标准偏差(RSD)在2.4％到4.5％的范围中。这指出了提出的DNA生物传感器示出了令人满意的可复制性，以确定龙鱼DNA。
图5中示出了开发的生物传感器响应的再生性能。DNA生物传感器响应在滴入NaOH溶液(0.1M)15分钟之后下降，因为dsDNA的碱基对之间的氢键结合由NaOH溶液断开，且OH-离子与来自DNA糖磷酸骨架的氢原子相互作用，随后dsDNA断裂。当DNA生物传感器与1.0x10-9M的cDNA再杂交30min时，杂交加强，且发现可逆性在4.41％到7.05％的范围中(RSD，n＝5)。
4.龙鱼类别DNA的确定
通过使用DNA生物传感器，观察了大约39个龙鱼基因组DNA样本，且发现相对标准偏差(RSD)在8.48％到1.154％的范围中(表2)。基于米勒和米勒技术的统计t测试用于比较对照物与样本(获得的DNA)之间的DPV峰值电流信号。基于计算的t值，在金龙鱼类别中发现了大约13个龙鱼DNA样本，而在其它龙鱼类别中发现了26个样本。表3中归纳了使用生物传感器和常规方法测量的真实样本中检测龙鱼类别的实验结果的比较。结果证实，DNA生物传感器和聚合酶链反应确定基因组样本中的龙鱼DNA种类的一致性在龙鱼DNA类别的一致性中＞80.0％。因此，提出的DNA生物传感器的方法对于评估生物样本中的龙鱼类别有很大潜力。
表3。通过使用DNA生物传感器和聚合酶链反应方法观察到的确定基因组样本中的龙鱼DNA类别的实验结果。
5.龙鱼性别的确定
通过使用DNA生物传感器和PCR观察了大约14个龙鱼样本，且发现相比于雌性龙鱼，用于DNA生物传感器开发的DNA探针对于雄性龙鱼是特异性的。相比于常规的PCR方法(表4中总结)，使用DNA生物传感器准确地(100％)检测到所有雄性龙鱼。发现PCR和DNA生物传感器在性别检测中的总体准确性分别是86％和79％(表5中总结)。使用DNA生物传感器和PCR观察了大约31个龙鱼组织样本，且发现基于雌鱼的＜0.1μA的切断电流，相比于显示出＞90％的准确性的PCR方法，生物传感器显示出龙鱼性别识别中＞80％的准确性(表6中总结)。对于DNA生物传感器，准确性的极限是1-2bp的失配。换言之，其不可检测＜2bp的失配。因此，DNA生物传感器在使用特定DNA探针时能够检测不同龙鱼种群。
12/14(86％) 11/14(79％)
表4。通过规模取样的性别确定
性别 生物传感器 PCR方法
雄性 100％ 71％
雌性 57％ 100％
表5。性别检测中的总体准确性
29/31 25/31
表6。通过组织样本的性别确定
总结
已经进行了对用于确定龙鱼类别的基于聚合酶链反应(PCR)的分子生物技术和电化学DNA生物传感器的研究。结果证实，安培电化学DNA生物传感器可在高灵敏度和选择性下以更简单且快速的方式通过分析途径检测龙鱼类别。效度研究显示，电化学DNA生物传感器与以＞80％的一致性检测基因组样本中的马来西亚金龙鱼类别的PCR技术较好地相符。电化学DNA生物传感器可适于在成年和幼年阶段检测龙鱼的性别和类别。此外，非专业人士如农民也可容易地操作此生物传感器来识别鱼的性别，以在鱼生产期间最佳地繁殖，以便满足较高的龙鱼需求。另外，电化学DNA生物传感器在水产业、农业和人类疾病诊断中具有病原检测的商业潜力。具体通过监测微生物污染和生物危害引起的环境污染，电化学DNA生物传感器由于其快速、灵敏且对监测食品安全和质量具有较大的实用性而是有用的。
上文所述的示例性实施方式以特定的形状、大小和其它特点示出，但本发明的范围包括各种其它形状、大小和特点。另外，如上文所述的电化学DNA生物传感器可按各种其它方式制造，且可包括各种其它材料，包括各种其它DNA探针、电极、盐等。
类似地，上文所述的示例性实施方式包括氧化还原标签、电极、缓冲盐等的特定实例，但多种其它此类制造步骤可在本发明的范围内使用，包括附加步骤、省略一些步骤，或以不同顺序执行过程。
本领域的技术人员从描述和附图中将清楚这些实施例的各种改型。与本文所述的各种实施例相关联的原理适用于其它实施例。因此，描述不旨在限于连同附图示出的实施例，而是在于提供与本文公开或提出的原理及新颖性和创造性特征一致的最宽范围。因此，本发明构想成保留落入本发明和所附权利要求的范围内的所有其它此类备选方案、改型和变型。

Claims (10)

1.一种电化学DNA生物传感器，包括：
以金纳米颗粒改性的丝网印刷的电极；
沉积在所述丝网印刷电极上的二氧化硅纳米球复合物层；
由交联剂固定在所述二氧化硅纳米球复合物层上的寡核苷酸序列；
氧化还原指示物；
其中所述寡核苷酸序列的至少一部分与来自相关的鱼的核酸的独特目标序列互补，使得来自所述相关的鱼的所述核酸与所述寡核苷酸序列杂交来形成dsDNA，
其中所述氧化还原指示物嵌有所述dsDNA，其允许通过伏安法检测所述鱼的性别和类别。
2.根据权利要求1所述的电化学DNA生物传感器，其特征在于，所述丝网印刷的电极是碳丝网印刷电极。
3.根据权利要求1所述的电化学DNA生物传感器，其特征在于，所述寡核苷酸序列是马来西亚金龙鱼(Scleropagesformosus)的DNA序列。
4.根据权利要求1所述的电化学DNA生物传感器，其特征在于，所述交联剂是戊二醛(GA)。
5.根据权利要求1所述的电化学DNA生物传感器，其特征在于，所述氧化还原指示物是单磺酸蒽醌。
6.根据权利要求1所述的电化学DNA生物传感器，其特征在于，所述目标序列是DNA或RNA。
7.根据权利要求1所述的电化学DNA生物传感器，其特征在于，所述鱼是马来西亚金龙鱼(Scleropagesformosus)。
8.根据权利要求1所述的电化学DNA生物传感器，其特征在于，所述生物传感器还包括干试剂垫，其包括缓冲盐和所述氧化还原指示物。
9.根据权利要求8所述的电化学DNA生物传感器，其特征在于，所述缓冲盐和所述氧化还原指示物固定在所述干试剂垫中。
10.根据权利要求1所述的电化学DNA生物传感器，其特征在于，所述伏安法是微分脉冲伏安法(DPV)。
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