CN110389228B - 一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置及其制作方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置及其制作方法和应用,其特征在于,所述制作方法包括以下步骤:图样设计、芯片原件制作、电极在纸基上的构建、芯片原件连接、合成功能化分子印迹聚合物层、电化学聚合、洗脱模板分子;所述装置用于用于对血清样品中生物标志物的分析检测。本发明的有益效果在于:发明提供了一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置及其制作方法和应用,为临床检测生物标志物提供了一种全新的装置,利用该装置进行原位合成生物标志物分子印迹聚合物,形成一套临床应用方法,开创了无抗体生物标志物分析的新策略,实现了在纸基装置上完成从装置制作到检测结果输出的全部过程,兼具经济、便携、快速等优势。
Description
技术领域
本发明属于电分析与医学诊断技术领域,涉及微流控芯片技术的应用,具体涉及一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置及其制作方法和应用。
背景技术
人体生物标志物分析是一种有效的医学诊断方法,随着生物科学的发展,越来越多的生物标志物被发现并用于诊断人类疾病。其中,肿瘤标志物分析在肿瘤发病率的诊断中得到了广泛的应用,但由于诊断的不及时,往往会延误最佳治疗时机。因此,为肿瘤标志物分析提供具有样品要求少、成本低、使用方便等特点的仪器,具有重要的意义。
此外,更高的灵敏度,更高的信息量和低成本的分析技术也可以提高诊断的可靠性。酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种广泛应用于肿瘤生物标志物分析的临床和实验室检测技术。但它存在抗体成本高、保存条件严格、反应时间长、洗涤过程繁琐等缺点。而分子印迹聚合物(MIPs)以其简单、成本低、制备方便、储存方便、选择性高、灵敏度高等独特的性能受到人们的广泛关注。
微流控芯片技术是把化学、生物、医学分析等过程中的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上,自动完成分析过程。纸基微流控装置作为微流控芯片的一个重要分支,目前被广泛应用到许多领域;纸作为分析的基底材料有成本低廉、生物相容性好、可降解、化学性能良好等优点。通过在纸基装置上构建微流通道,试样可以在设计的通道内通过毛细作用力流动,不需要借助外部动力,可自动驱动待测样品。在现场检测和经济欠发达地区,纸芯片有着很好的应用前景。
为了解决生物标志物分析过程遇到的挑战,基于以上技术的发展,本发明开发了一种基于微流控芯片技术、移动阀、分子印迹技术的纸基电分析装置,并将其用于临床生物标志物的分析检测,满足了肿瘤标志物分析对样品要求少、成本低、使用方便等要求,也满足了医学诊断对高灵敏度,高信息量,低成本的要求。
发明内容
为了弥补现有技术的不足,本发明提供了一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置及其制作方法和应用,为临床检测生物标志物提供了一种全新的装置,利用该装置进行原位合成生物标志物分子印迹聚合物,形成一套临床应用方法,开创了无抗体生物标志物分析的新策略。该装置的新型可移动阀设计,使流体输送连续可靠,克服了多次补充试剂溶液的不均匀性,的保证了长时间的电聚合制备分子印迹结构性能的实现,最终利用电化学差分脉冲伏安法实现对人体血清中肿瘤标志物的临床快速检测,实现了在纸基装置上完成从装置制作到检测结果输出的全部过程,兼具经济、便携、快速等优势。
本发明提供了一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置的制作方法,包括以下步骤:
(1.1)图样设计:用制图软件设计4种芯片图样,分别为一个工作电极部分、四个对/参比电极部分、一个洗涤液回收部分、一个移动阀;且要求前述工作电极部分具有两个样品池、一个材料添加池、两个指向前述两个样品池的断开通道、三个铆钉孔,前述洗涤液回收部分具有两个洗涤引流亲水通道,前述对/参比电极部分居中位置具有和前述样品池同样大小的亲水区域,每个前述对/参比电极部分具有一个铆钉孔,前述移动阀具有一段贯通的条形疏水通道和一个铆钉孔;
(1.2)芯片原件制作:在植物纤维纸上用蜡印法印制步骤(1.1)设计的前述4种芯片图样,并用控温加热装置对印制好的前述植物纤维纸进行加热,利用重力渗透,前述植物纤维纸表层的蜡融化后均匀渗透到纸张内部形成疏水屏障;
(1.3)电极在纸基上的构建:用任意软件设计工作电极、对电极和参比电极三种电极的形状,采用3D打印的方法构造对应电极图案形状的图章;将对应工作电极、对电极和参比电极的导电浆料蘸取于前述图章上,并加盖于纸基上对应的区域位置;前述工作电极使用导电碳浆构建位于工作电极部分反面的样品池,前述对电极利用导电碳浆、参比电极利用银/氯化银浆料构建位于对/参比电极部分的正面;
(1.4)芯片原件连接:将印有4种芯片图样的纸张按图样裁剪,即得到一个工作电极部分、四个对/参比电极部分、一个洗涤液回收部分和一个移动阀;将前述洗涤液回收部分与前述工作电极部分相连,通过折叠的方式可将前述洗涤引流亲水通道与前述样品池重叠连接,进而使前述样品池中的洗涤液顺利导出;前述四个对/参比电极部分没两个为一组,通过空心铆钉与前述工作电极部分样品池附近预留的铆钉孔铆接,通过旋转实现与前述样品池的分离与重合;前述移动阀也通过空心铆钉与前述工作电极部分对应的预留铆钉孔铆接,前述移动阀利用自身的亲水通道,通过旋转活动实现前述样品池与前述材料添加池的连通与断开;前述工作电极部分、对/参比电极部分与移动阀在对应位置上通过空心铆钉相连,三者可实现以铆钉孔为圆心的相对旋转移动;前述洗涤液回收部分可通过折叠的方式相对于前述工作电极部分做分离与贴合的移动;
(1.5)合成功能化分子印迹聚合物层:在前述工作电极部分所在区域表面修饰氧化石墨烯和壳聚糖,增强前述工作电极部分导电性、生物亲和性与粘附力,之后将模板分子生物标志物加入到前述工作电极部分,粘附平衡后,旋转前述对/参比电极部分与前述样品池重合,旋转打开前述移动阀使前述材料添加池与前述样品池连通,之后在前述材料添加池中加入多巴胺溶液,连接电化学工作站,采用循环伏安法进行电化学聚合过程;
(1.6)电化学聚合:每当前述材料添加池中加入的多巴胺溶液将干燥时,就打开前述移动阀,通过前述移动阀进行多巴胺溶液的补充,通过前述移动阀补充的多巴胺溶液中的溶质可在电极表面柔和均匀分布;通过前述移动阀上贯通的条形疏水通道实现对多巴胺溶液的导流,进而实现在纸基芯片上长时间连续的进行电聚合反应;
(1.7)洗脱模板分子:将前述移动阀关闭,前述对/参比电极部分旋离前述样品池,再将前述洗涤液回收部分折叠至与前述工作电极部分贴合,在设置有工作电极的前述样品池滴加洗脱液,前述洗脱液渗入前述洗涤液回收部分的两个洗涤引流亲水通道中,实现废液的引流;同时工作电极上聚多巴胺膜上的模板分子被洗脱,形成分子印迹层。
优选的,步骤(1.3)中所述工作电极呈棒状,有效电极面积50mm2,所述对电极和所述参比电极呈月牙状,所有电极采用便捷式图章盖印的方式一次性印刷形成。
优选的,步骤(1.5)中在所述电聚合过程中可通过前述移动阀补充试剂溶液数次。
本发明还提供了一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置,采用前述的制作方法制作得到。
前述的一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置用于对血清样品中生物标志物的分析检测。
优选的是,前述对血清样品中生物标志物的分析检测包括以下步骤:
(2.1)根据需要诊断的肿瘤类型选择对应的一种或几种生物标志物,制作可检测前述生物标志物的基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置;
(2.2)将血清样品滴加到前述工作电极部分的样品池,待达到平衡后,将前述洗涤液回收部分折叠至与前述工作电极部分贴合,并用缓冲液清洗前述样品池,去除干扰物质;
(2.3)经过步骤(2.2)后,将用于检测的前述对/参比电极部分旋转至于前述样品池重合,连接电化学工作站,滴加指示剂,使用差分脉冲伏安法进行分析,并记录氧化峰峰值,通过与空白的差值,求出峰电流差,根据标准溶液得出线性方程,实现对前述生物标志物的定量和/或定性分析。
前述的一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置用于一个或多个血清样品中不同种类肿瘤标志物的分析检测。
本发明的有益效果在于:本发明提供的一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置及其制作方法和应用具有以下优势:
①本发明第一次公开了一种基于移动阀和分子印迹技术的微流体纸基电化学分析装置,是对微流控纸基装置功能化设计,使纸基电分析装置具有从合成到传感检测过程一体化的功能,采用在经喷蜡疏水处理含有通道的纸基装置结合移动阀设计,进行合成原料的引入和运输,成功实现了电分析过程,进而实现了对人血清生物标志物的的定性定量检测,为临床检测生物标志物提供了进行无抗体分析的新策略。
②本发明的装置采用移动阀的设计,使流体输送连续方便,保证了长时间电聚合制备分子印迹结构的性能。
③本发明的装置利用纸质设备上的分子印迹直接检测抗原,大大降低了临床检测的成本,减少了繁琐的洗涤程序,无需考虑酶联免疫吸附试验(ELISA)中抗体的保存。
④本发明的装置体型小型、操作简单、易于保存与携带,这些特性使得该装置非常适合于现场家庭处理或商用产品,可以为世界资源有限地区的人们提供服务,为家庭护理与临床分析开辟了一条新的道路。
附图说明
图1为本发明实施例1制作的一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置的4种芯片图样的示意图;
图2为本发明实施例1制作的一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置中具有工作电极部分的表面结构示意图;
图3为本发明实施例1制作的一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置中移动阀的工作方式示意图;
图4为本发明实施例1中的一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置中的移动阀功能效果数据考察图;
图5为本发明实施例1制作的一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置的4种芯片原件连接方式示意图;
图6为本发明实施例1中的一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置的分子印迹层合成原理示意图;
图7为本发明实施例1制作的一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置与电化学工作站连接方式示意图;
图8为本发明实施例2中的一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置用于对癌坯抗原(CEA)肿瘤标志物的定性定量分析时建立的线性方程。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置的制作方法,包括以下步骤:
(1.1)图样设计:用Adobe illustrator制图软件设计4种芯片图样(见图1),分别为一个工作电极部分、四个对/参比电极部分、一个洗涤液回收部分、一个移动阀。
且要求工作电极部分(见图2)大小为50mm×25mm,具有两个直径为9mm的圆形样品池、一个直径为5mm的材料添加池、两个2mm宽的指向两个样品池的断开通道、三个铆钉孔;洗涤液回收部分大小为40mm×50mm,与工作电极部分相连,具有两个洗涤引流亲水通道;对/参比电极部分为圆形,直径24mm,居中位置具有和样品池同样大小的亲水区域,每个对/参比电极部分具有一个铆钉孔;移动阀(工作方式见图3,功能效果考察数据见图4)具有一段贯通的条形疏水通道和一个铆钉孔。
(1.2)芯片原件制作:在Whatman No.1滤纸上用喷蜡打印机印制步骤(1.1)设计的4种芯片图样,并用控温加热装置对印制好的Whatman No.1滤纸加热到150℃,30s后取出,冷却到室温,利用重力渗透,Whatman No.1滤纸表层的蜡融化后均匀渗透到纸张内部形成疏水屏障。
(1.3)电极在纸基上的构建:用任意软件设计工作电极、对电极和参比电极三种电极的形状,采用3D打印的方法构造对应电极图案形状的图章;工作电极呈棒状,有效电极面积50mm2,对电极和参比电极成月牙状,将对应工作电极、对电极和参比电极的导电浆料蘸取于图章上,并加盖于纸基上对应的区域位置;工作电极使用导电碳浆构建位于工作电极部分反面的样品池,对电极利用导电碳浆、参比电极利用银/氯化银浆料构建位于对/参比电极部分的正面。
(1.4)芯片原件连接(见图5):将印有4种芯片图样的纸张按图样裁剪,即得到一个工作电极部分、四个对/参比电极部分、一个洗涤液回收部分和一个移动阀;将洗涤液回收部分与工作电极部分相连,通过折叠的方式可将洗涤引流亲水通道与样品池重叠连接,进而使样品池中的洗涤液顺利导出;四个对/参比电极部分没两个为一组,通过空心铆钉与工作电极部分样品池附近预留的铆钉孔铆接,通过旋转实现与样品池的分离与重合;移动阀也通过空心铆钉与工作电极部分对应的预留铆钉孔铆接,移动阀利用自身的亲水通道,通过旋转活动实现样品池与材料添加池的连通与断开;工作电极部分、对/参比电极部分与移动阀在对应位置上通过空心铆钉相连,三者可实现以铆钉孔为圆心的相对旋转移动;洗涤液回收部分可通过折叠的方式相对于工作电极部分做分离与贴合的移动。
(1.5)合成功能化分子印迹聚合物层(原理见图6):在工作电极部分所在区域表面修饰氧化石墨烯和壳聚糖,增强工作电极部分导电性、生物亲和性与粘附力,具体过程为:将所有的对/参比电极部分转离工作电极部分,工作电极部分的样品池中滴加5.0μL,0.1g/L的氧化石墨烯,在室温下干燥;随后滴加5.0μL,0.25mg/mL的壳聚糖,室温下干燥后再滴加5.0μL,2.5%的戊二醛溶液,在室温下反应2小时,打开洗涤液回收部分,用PBS缓冲液(pH7.4)冲洗3次,每次20μL。之后将滴加8μL,50μg/mL癌坯抗原于样品池中,粘附平衡30分钟后,旋转对/参比电极部分与样品池重合,旋转打开移动阀使材料添加池与样品池连通,之后在材料添加池中加入10μL,5mM多巴胺溶液(溶于10mM PBS缓冲液中),待其流过移动阀进入到样品池中,平衡30s后,连接电化学工作站(连接方式见图7),采用循环伏安法进行电化学聚合,扫描电势范围-0.5V到0.5V,扫描速度20mV/s,设定扫描圈数30圈。
(1.6)电化学聚合:在经过10圈的循环伏安扫描后,材料添加池中加入的多巴胺溶液将干燥时,移动阀再次移动至开启状态,通过移动阀进行多巴胺溶液(10μL,5mM多巴胺溶液)的补充,之后每经过10圈的扫描,开启移动阀添加一次多巴胺溶液,直到30圈扫描结束。
(1.7)洗脱模板分子:将移动阀关闭,对/参比电极部分旋离样品池,再将洗涤液回收部分折叠至与工作电极部分贴合,在设置有工作电极的样品池滴加乙酸和十二烷基硫酸钠溶液(1%乙酸和1g/L十二烷基硫酸钠),洗涤3遍(使用溶液共200μL),随后用二次水洗涤3遍,洗脱液渗入洗涤液回收部分的两个洗涤引流亲水通道中,实现废液的引流;同时工作电极上聚多巴胺膜上的模板分子被洗脱,形成用于检测癌坯抗原的移动阀纸基电分析装置上分子印迹层分子印迹层,装置保存待用。
实施例2
使用实施例1制备的一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置用于对人血清中癌坯抗原肿瘤标志物的定性定量分析,具体包括以下步骤:
(2.1)根据需要诊断的肿瘤类型选择癌坯抗原肿瘤标志物,制作可检测生物标志物的基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置;
(2.2)首先将对/参比电极部分、移动阀、洗涤液回收部分关闭,使其离开工作电极部分。将5μL血清样品滴加到工作电极部分的样品池,在室温下平衡10分钟后,将洗涤液回收部分折叠至与工作电极部分贴合,并用10mM,pH=7.4的PBS缓冲液洗涤样品池3遍,去除干扰物质;
(2.3)经过步骤(2.2)后,将用于检测的对/参比电极部分旋转至于样品池重合,连接电化学工作站,15μL,5mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液(PBS,0.1mol/L,pH 7.4)滴加到该装置三电极系统组成的电化学池中,利用差分脉冲伏安法在室温下进行分析,电势范围-0.2V到0.6V,幅度50mM,脉冲宽度50ms,跨步电压5mV,并记录氧化峰峰值,通过与空白的差值,求出峰电流差,根据标准溶液得出线性方程(见图8),实现对血清中癌坯抗原肿瘤标志物的定性定量分析。
纸芯片是分子印迹合成和电化学检测的载体,在纸芯片平台上采用分子印迹技术能够实现抗原的特异性识别,无需利用抗体,移动阀的使用有助于上述过程的顺利完成。
应当理解,以上所描述的具体实施例仅用于解释本发明,并不用于限定本发明。由本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (4)
1.一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置的制作方法,其特征在于,所述制作方法包括以下步骤:
(1.1)图样设计:用制图软件设计4种芯片图样,分别为一个工作电极部分、四个对/参比电极部分、一个洗涤液回收部分、一个移动阀;且要求所述工作电极部分具有两个样品池、一个材料添加池、两个指向所述两个样品池的断开通道、三个铆钉孔,所述洗涤液回收部分具有两个洗涤引流亲水通道,所述对/参比电极部分居中位置具有和所述样品池同样大小的亲水区域,每个所述对/参比电极部分具有一个铆钉孔,所述移动阀具有一段贯通的条形疏水通道和一个铆钉孔;
(1.2)芯片原件制作:在植物纤维纸上用蜡印法印制步骤(1.1)设计的所述4种芯片图样,并用控温加热装置对印制好的所述植物纤维纸进行加热,利用重力渗透,所述植物纤维纸表层的蜡融化后均匀渗透到纸张内部形成疏水屏障;
(1.3)电极在纸基上的构建:用任意软件设计工作电极、对电极和参比电极三种电极的形状,采用3D打印的方法构造对应电极图案形状的图章;将对应工作电极、对电极和参比电极的导电浆料蘸取于所述图章上,并加盖于纸基上对应的区域位置;所述工作电极使用导电碳浆构建位于工作电极部分反面的样品池,所述对电极利用导电碳浆、参比电极利用银/氯化银浆料构建位于对/参比电极部分的正面;
(1.4)芯片原件连接:将印有4种芯片图样的纸张按图样裁剪,即得到一个工作电极部分、四个对/参比电极部分、一个洗涤液回收部分和一个移动阀;将所述洗涤液回收部分与所述工作电极部分相连,通过折叠的方式可将所述洗涤引流亲水通道与所述样品池重叠连接,进而使所述样品池中的洗涤液顺利导出;所述四个对/参比电极部分没两个为一组,通过空心铆钉与所述工作电极部分样品池附近预留的铆钉孔铆接,通过旋转实现与所述样品池的分离与重合;所述移动阀也通过空心铆钉与所述工作电极部分对应的预留铆钉孔铆接,所述移动阀利用自身的亲水通道,通过旋转活动实现所述样品池与所述材料添加池的连通与断开;所述工作电极部分、对/参比电极部分与移动阀在对应位置上通过空心铆钉相连,三者可实现以铆钉孔为圆心的相对旋转移动;所述洗涤液回收部分可通过折叠的方式相对于所述工作电极部分做分离与贴合的移动;
(1.5)合成功能化分子印迹聚合物层:在所述工作电极部分所在区域表面修饰氧化石墨烯和壳聚糖,增强所述工作电极部分导电性、生物亲和性与粘附力,之后将模板分子生物标志物加入到所述工作电极部分,粘附平衡后,旋转所述对/参比电极部分与所述样品池重合,旋转打开所述移动阀使所述材料添加池与所述样品池连通,之后在所述材料添加池中加入多巴胺溶液,连接电化学工作站,采用循环伏安法进行电化学聚合过程;
(1.6)电化学聚合:每当所述材料添加池中加入的多巴胺溶液将干燥时,就打开所述移动阀,通过所述移动阀进行多巴胺溶液的补充,通过所述移动阀补充的多巴胺溶液中的溶质可在电极表面柔和均匀分布;通过所述移动阀上贯通的条形疏水通道实现对多巴胺溶液的导流,进而实现在纸基芯片上长时间连续的进行电聚合反应;
(1.7)洗脱模板分子:将所述移动阀关闭,所述对/参比电极部分旋离所述样品池,再将所述洗涤液回收部分折叠至与所述工作电极部分贴合,在设置有工作电极的所述样品池滴加洗脱液,所述洗脱液渗入所述洗涤液回收部分的两个洗涤引流亲水通道中,实现废液的引流;同时工作电极上聚多巴胺膜上的模板分子被洗脱,形成分子印迹层。
2.根据权利要求1所述的一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置的制作方法,其特征在于,步骤(1.6)中在所述电聚合过程中可通过所述移动阀补充试剂溶液数次。
3.根据权利要求1所述的一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置的制作方法,其特征在于,步骤(1.3)中所述工作电极呈棒状,有效电极面积50mm2,所述对电极和所述参比电极呈月牙状,所有电极采用便捷式图章盖印的方式一次性印刷形成。
4.一种基于移动阀与分子印迹技术的纸基装置,其特征在于,所述装置采用权利要求1所述的制作方法制作得到。
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