CN110129188B - 一种整合式核酸检测装置 - Google Patents
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Abstract
本专利公开一种整合式核酸检测装置，该装置集成了多层磁结构，FTA卡和纸电极芯片，可以完成核酸提取，环介导等温扩增（LAMP）扩增和电化学检测。其核心多层结构由上部样品层，中层滑动层和下层电极板组成。上层样品板提供能够滴加样品、纯化缓冲液进而扩增试剂的圆孔。中层磁性板扮演控制阀门的角色，通过简单地滑动磁板来控制样品，纯化缓冲液和扩增试剂的连续引入。亚甲基蓝（MB）和双链LAMP扩增产物之间的电化学询问反应与纸电极装置组合,用于高灵敏度监测LAMP扩增反应。本发明成功构建了一种从“样品—答案”的整合式核酸检测装置，通过简单的滑动操作，实现整个核酸检测的过程，展现出令人满意的医疗诊断和食品安全分析的能力。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，更具体地说是一种结合微流控技术和电化学方法完成核酸提取、等温扩增和检测步骤的整合式核酸检测装置。
背景技术
核酸检测（NAT）拥有卓越的敏感性和特异性，近年来在疾病诊断，食品和水安全性分析以及环境监测领域受到了越来越多的关注。核酸检测通过设计引物的碱基序列，与目标核酸实现特异性结合，并对目标序列进行扩增，进而实现目标核酸的特异性高灵敏检测。核酸检测在肿瘤早期诊断，传染病监测等领域发挥着越来越重要的作用。
但是，传统的核酸检测方法（PCR）通常需要精密的仪器，训练有素的操作人员和复杂的程序来完成核酸提取和纯化，扩增以及检测的步骤。然而这些条件在资源受限的环境中往往难以获得，使得核酸诊断在资源受限环境中的应用性大大降低。近年来，随着癌症和传染病发病率的增加，核酸诊断的实际应用在临床诊断和公共卫生安全方面也面临严峻挑战。
为了解决核酸诊断在资源受限环境中的应用受阻的问题，我们需要开发一种能快速、灵敏的完成核酸提取、等温扩增和检测步骤的整合式核酸检测装置。相较于传统的核酸检测方法，整合式检测装置应具有操作简捷、快速灵敏、成本低廉、无需大型设备仪器等特点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是构建一种能快速、简捷的完成核酸提取、等温扩增和检测步骤的整合式核酸检测装置。
一种整合式核酸检测装置，其特征是包括以下步骤：
（1）装置的设计
该整合式检测装置设计为多层板状样式，核心结构分为上层样品板，中层滑动板和下层电极板，由磁板结合粘贴膜和纸电极芯片构建而成，磁板和粘贴膜的尺寸为15 cm× 5 cm,纸电极芯片的尺寸为3 cm × 3 cm，上层样品板有三个直径5 mm的圆孔和一个2mm深3 cm长的正方形槽，三个圆孔分别用于滴加生物样品、纯化缓冲液和扩增试剂，正方形槽用于放置印有碳电极和银电极的纸芯片，中层滑动板由一个可滑动的磁板和两条固定磁条组成，可滑动的磁板有一个直径5 mm的圆孔，圆孔中塞有直径5 mm的、用于从生物样本中提取核酸FTA圆盘，通过抽拉可滑动的磁板，使FTA圆盘与上层样品板的圆孔对齐，即可通过上层圆孔完成生物样品、纯化缓冲液和扩增试剂的滴加，下层电极板包含一个10 cm × 5cm大小的吸收板和一个5 cm × 5 cm的磁板，在磁板上有一个2 mm深3 cm长的正方形槽，吸收板用于从FTA圆盘中吸收细胞裂解后的废物，正方形槽用于放置印有工作电极的纸芯片，在纸电极芯片的工作电极区域修饰金纳米粒子，以对工作区域进行改性。利用磁板的吸引力和粘贴膜，构建了一个密闭的扩增反应室，以保证在反应室中等温扩增反应能顺利的进行，将三层板和粘贴膜依次堆叠起来，挤压成型；
（2）装置的制造
利用数字化切割机将磁板和粘贴膜切割为15 cm × 5 cm大小，并在磁板和粘贴膜的特定位置用打孔机打5 mm的圆孔，利用切割机将Whatman纸切割为10 cm × 5 cm大小，纸电极芯片的构建的具体步骤如下：利用蜡打印技术在色谱纸上打印图案，将打印蜡的图案放在恒温150 ºC下2 min，未打印蜡的地方为亲水区，纸电极芯片的疏水屏障形状是由Adobe illustrator CS6软件设计的，利用丝网印刷银/氯化银参比电极，碳对电极和碳工作电极组成，此外，它还包含一个直径7 mm的辅助区和一个直径7 mm的工作区域，在纸电极芯片的工作区域修饰Au纳米粒子的具体步骤如下：先将80 mL 蒸馏水加热至90 ℃，然后加入0.8 mL 质量分数为 1% 的氯金酸溶液继续加热至96 ℃ 保持1分钟，最后加入2.8 mL质量分数为 1% 的柠檬酸钠，加热8分钟得到金种子溶液，取20 μL 金种子溶液滴加在工作层亲水区域，静置晾干，重复三次，制备得到修饰金纳米粒子的工作电极；
（3）装置的使用步骤
该装置主要通过滑动中间磁板来实现生物样本、纯化试剂和扩增试剂的添加，滑动中间磁板，使FTA圆盘与上层样品板的样品孔对齐，滴加生物样品，室温干燥15 min，用于裂解细胞和提取核酸；15 min后，滑动中间磁板，使FTA圆盘与上层样品板的清洗孔对齐，滴加纯化缓冲液，清洗细胞裂解废物；65 ℃加热5 min,干燥FTA圆盘；干燥后，继续滑动中间磁板，使FTA圆盘与上层样品板的试剂孔对齐，滴加等温扩增反应混合溶液；再次滑动中间磁板至白色标线露出，使FTA圆盘滑动至密闭的扩增反应室；将整个装置放置热板上65 ℃加热60 min，使等温扩增反应充分进行，60 min后，将装置从热板上去下，在冷却至室温后，将装置的碳电极、银电极和金电极连接至电化学工作站，用差分脉冲伏安法（DPV）测量并记录电流响应。
本发明的有益效果
（1）利用微流控技术和电化学方法，构建了一种能快速、简捷的完成核酸提取、等温扩增和检测步骤的整合式核酸检测装置；
（2）相比于传统的核酸提取方法，避免了繁琐的操作步骤和仪器的需求；
（3）在资源受限的环境下，利用该装置能实现“样品—答案”的核酸检测与分析。
附图说明
图1为本文所述装置的原理图，图2为本文所述装置的操作图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施。
实施例1
一种整合式核酸检测装置，其特征是包括以下步骤：
（1）装置的设计
该整合式检测装置设计为多层板状样式，核心结构分为上层样品板，中层滑动板和下层电极板，由磁板结合粘贴膜和纸电极芯片构建而成，磁板和粘贴膜的尺寸为15 cm× 5 cm,纸电极芯片的尺寸为3 cm × 3 cm，上层样品板有三个直径5 mm的圆孔和一个2mm深3 cm长的正方形槽，三个圆孔分别用于滴加生物样品、纯化缓冲液和扩增试剂，正方形槽用于放置印有碳电极和银电极的纸芯片，中层滑动板由一个可滑动的磁板和两条固定磁条组成，可滑动的磁板有一个直径5 mm的圆孔，圆孔中塞有直径5 mm的、用于从生物样本中提取核酸的FTA圆盘，通过抽拉可滑动的磁板，使FTA圆盘与上层样品板的圆孔对齐，即可通过上层圆孔完成生物样品、纯化缓冲液和扩增试剂的滴加，下层电极板包含一个10 cm ×5 cm大小的吸收板和一个5 cm × 5 cm的磁板，在磁板上有一个2 mm深3 cm长的正方形槽，吸收板用于从FTA圆盘中吸收细胞裂解后的废物，正方形槽用于放置印有工作电极的纸芯片，在纸电极芯片的工作电极区域修饰金纳米粒子，以对工作区域进行改性，利用磁板的吸引力和粘贴膜，构建了一个密闭的扩增反应室，以保证在反应室中等温扩增反应能顺利的进行，将三层板和粘贴膜依次堆叠起来，挤压成型；
（2）装置的制造
利用数字化切割机将磁板和粘贴膜切割为15 cm × 5 cm大小，并在磁板和粘贴膜的特定位置用打孔机打5 mm的圆孔。利用切割机将Whatman纸切割为10 cm × 5 cm大小，纸电极芯片的构建的具体步骤如下：利用蜡打印技术在色谱纸上打印图案，将打印蜡的图案放在恒温150 ºC下2 min，未打印蜡的地方为亲水区，纸电极芯片的疏水屏障形状是由Adobe illustrator CS6软件设计的，利用丝网印刷银/氯化银参比电极，碳对电极和碳工作电极组成，此外，它还包含一个直径7 mm的辅助区和一个直径7 mm的工作区域，在纸电极芯片的工作区域修饰Au纳米粒子的具体步骤如下：先将80 mL 蒸馏水加热至90 ℃，然后加入0.8 mL 质量分数为 1% 的氯金酸溶液继续加热至96 ℃ 保持1分钟，最后加入2.8 mL质量分数为 1% 的柠檬酸钠，加热8分钟得到金种子溶液，取20 μL 金种子溶液滴加在工作层亲水区域，静置晾干，重复三次，制备得到修饰金纳米粒子的工作电极；
（3）装置的使用步骤
用标准加入沙门氏菌的牛奶作为分析模板来验证该装置的可行性，沙门氏菌的培养步骤如下：将鼠伤寒沙门氏菌在Luria-Bertani（LB）平板上37 ℃过夜培养，然后，选取单个鼠伤寒沙门氏菌菌落刺破并在10 ml LB液体培养基中37℃过夜生长，同时以110 rpm摇晃，用紫外分光光度计测量细菌悬浮液在600 nm处的吸光度（OD 600），来确定细菌浓度，将细菌悬浮液用PBS缓冲液分别稀释1、10、100、500和1000倍，取10 μL等量的鼠伤寒沙门氏菌稀释液分别加入100 μL牛奶中，摇晃混合均匀，取10 μL加入1倍稀释细菌的牛奶，通过上层样品板的样品孔滴加至FTA圆盘上，室温干燥15 min，用于裂解细胞和提取核酸；15 min后，滑动中间磁板，使FTA圆盘与上层样品板的清洗孔对齐，滴加45 μL FTA纯化试剂和90 μL清洗缓冲液，清洗细胞裂解物；65 ℃加热5 min,干燥FTA圆盘；干燥后，继续滑动中间磁板，使FTA圆盘与上层样品板的试剂孔对齐，滴加15μL等温扩增反应混合溶液；再次滑动中间磁板至白色标线露出，使FTA圆盘滑动至密闭的扩增反应室；将整个装置放置热板上65 ℃加热60 min，使等温扩增反应充分进行；60 min后，将装置从热板上取下。在冷却至室温后，将装置的碳电极、银电极和金电极连接至电化学工作站，用差分脉冲伏安法（DPV）测量并记录电流响应。同样的步骤用于10、100、500和1000倍稀释细菌的牛奶样本。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一种新型整合式核酸检测装置
<130> 2019
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Claims (1)
1.一种整合式核酸检测装置，其特征是包括以下步骤：
（1）装置的设计
该整合式检测装置设计为多层板状样式，核心结构分为上层样品板，中层滑动板和下层电极板，由磁板结合粘贴膜和纸电极芯片构建而成，磁板和粘贴膜的尺寸为15 cm × 5cm,纸电极芯片的尺寸为3 cm × 3 cm，上层样品板有三个直径5 mm的圆孔和一个2 mm深3cm长的正方形槽，三个圆孔分别用于滴加生物样品、纯化缓冲液和扩增试剂，正方形槽用于放置印有碳电极和银电极的纸芯片，中层滑动板由一个可滑动的磁板和两条固定磁条组成，可滑动的磁板有一个直径5 mm的圆孔，圆孔中塞有直径5 mm的、用于从生物样本中提取核酸的FTA圆盘；通过抽拉可滑动的磁板，使FTA圆盘与上层样品板的圆孔对齐，即可通过上层圆孔完成生物样品、纯化缓冲液和扩增试剂的滴加，下层电极板包含一个10 cm × 5 cm大小的吸收板和一个5 cm × 5 cm的磁板，在磁板上有一个2 mm深3 cm长的正方形槽，吸收板用于从FTA圆盘中吸收细胞裂解后的废物，正方形槽用于放置印有工作电极的纸芯片，在纸电极芯片的工作电极区域修饰金纳米粒子，以对工作区域进行改性，利用磁板的吸引力和粘贴膜，构建了一个密闭的扩增反应室，以保证在反应室中等温扩增反应能顺利的进行，将三层板和粘贴膜依次堆叠起来，挤压成型；
（2）装置的制造
利用数字化切割机将磁板和粘贴膜切割为15 cm × 5 cm大小，并在磁板和粘贴膜的特定位置用打孔机打5 mm的圆孔，利用切割机将Whatman纸切割为10 cm × 5 cm大小，纸电极芯片的构建的具体步骤如下：利用蜡打印技术在色谱纸上打印图案，将打印蜡的图案放在恒温150 ºC下2 min，未打印蜡的地方为亲水区，纸电极芯片的疏水屏障形状是由Adobe illustrator CS6软件设计的，利用丝网印刷银/氯化银参比电极，碳对电极和碳工作电极组成，此外，它还包含一个直径7 mm的辅助区和直径7 mm的一个工作区域，在纸电极芯片的工作区域修饰Au纳米粒子的具体步骤如下：首先将80 mL 蒸馏水加热至90 ℃，然后加入0.8 mL 质量分数为 1% 的氯金酸溶液继续加热至96 ℃ 保持1分钟，最后加入2.8 mL质量分数为 1% 的柠檬酸钠，加热8分钟得到金种子溶液，取20 μL 金种子溶液滴加在工作层亲水区域，静置晾干，重复三次，制备得到修饰金纳米粒子的工作电极；
（3）装置的使用步骤
用标准加入沙门氏菌的牛奶作为分析模板来验证该装置的可行性，沙门氏菌的培养步骤如下：将鼠伤寒沙门氏菌在Luria-Bertani（LB）平板上37 ℃过夜培养，然后，选取单个鼠伤寒沙门氏菌菌落刺破并在10 ml LB液体培养基中37℃过夜生长，同时以110 rpm摇晃，用紫外分光光度计测量细菌悬浮液在600 nm处的吸光度（OD 600），来确定细菌浓度，将细菌悬浮液用PBS缓冲液分别稀释1、10、100、500和1000倍，取10 μL等量的鼠伤寒沙门氏菌稀释液分别加入100 μL牛奶中，摇晃混合均匀，取10 μL加入1倍稀释细菌的牛奶，通过上层样品板的样品孔滴加至FTA圆盘上，室温干燥15 min，用于裂解细胞和提取核酸；15 min后，滑动中间磁板，使FTA圆盘与上层样品板的清洗孔对齐，滴加45 μL FTA纯化试剂和90 μL清洗缓冲液，清洗细胞裂解物；65 ℃加热5 min,干燥FTA圆盘；干燥后，继续滑动中间磁板，使FTA圆盘与上层样品板的试剂孔对齐，滴加15μL等温扩增反应混合溶液；再次滑动中间磁板至白色标线露出，使FTA圆盘滑动至密闭的扩增反应室；将整个装置放置热板上65 ℃加热60min，使等温扩增反应充分进行；60 min后，将装置从热板上取下，在冷却至室温后，将装置的碳电极、银电极和金电极连接至电化学工作站，用差分脉冲伏安法（DPV）测量并记录电流响应，同样的步骤用于10、100、500和1000倍稀释细菌的牛奶样本。
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