DE212016000125U1 - Oligonukleotid vermittelte Analyse von Biomarkern - Google Patents

Oligonukleotid vermittelte Analyse von Biomarkern Download PDF

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Abstract

Vorrichtung, die Folgendes umfasst: eine Scheibe mit mehreren mikrofluidischen Kanälen, die in einer radialen Richtung der Scheibe verlaufen, wobei jeder mikrofluidische Kanal mehrere für wenigstens ein Target spezifische Fängermoleküle umfasst, ausgewählt aus einem Oligonukleotid, einem Protein oder einem Kleinmolekül, wobei jedes Fängermolekül ein Oligonukleotid umfasst und an ein Substrat gefügt ist.

Description

  • Nach den Bestimmungen des Gebrauchsmustergesetzes unterliegen nur Geräte und Vorrichtungen, wie sie in den anliegenden Schutzansprüchen definiert sind, dem Schutz und dem Gebrauchsmuster, nicht aber Verfahren. Soweit in der nachstehenden Beschreibung gegebenenfalls auf Verfahren Bezug genommen wird, dienen diese Hinweise nur zur exemplarischen Erläuterung der mit den anliegenden Schutzansprüchen geschützten Vorrichtungen und Geräte.
  • Die vorliegende Anmeldung beansprucht den Prioritätsvorzug der am 23. Juni 2015 eingereichten provisorischen US-Anmeldung Nr. 62/183,294 und der am 7. August 2015 eingereichten provisorischen US-Anmeldung Nr. 62/202,353, die hierin jeweils in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft allgemein den Nachweis von mit einem Gesundheitszustand assoziierten Biomarkern, z.B. zum Assistieren bei medizinischer Untersuchung und/oder Diagnose.
  • HINTERGRUND
  • Biomarker und andere Analyte können nützliche medizinische und/oder diagnostische Informationen geben. Und doch können Krankheiten und andere Gesundheitszustände zahlreiche biochemische Spezies und Reaktionen involvieren. Zum Beispiel, Brustkrebs ist eine komplexe Krankheit, die dasselbe Krankheitsstadium mit ähnlichen Symptomen für den Patienten über mehrere Pfade erzeugt. Während Forscher nach neuen Biomarkern gesucht haben, bleibt die Fähigkeit, auf verschiedene Krankheiten zu untersuchen, weiterhin begrenzt. Die Forschung hat sich im Laufe des letzten Jahrzehnts auf die Entdeckung neuer Biomarker konzentriert, um genaue Krankheitsdiagnose zu ermöglichen, therapeutische Entscheidungsfindung zu führen und zukünftige Krankheitsmuster vorherzusagen. Doch einige Krankheiten wie Brustkrebs sind möglicherweise keine einzelne Krankheit, sondern eine genetisch heterogene Gruppe von Krankheiten. Für solche Zustände ist es evtl. schwierig oder unmöglich, eine Diagnose mit einem einzigen Biomarker zu finden. Nachweis und Quantifizierung spezifischer Analyte können zusätzliche Hürden darstellen, insbesondere angesichts eines wachsenden Bedarfs an prompten Diagnoseinformationen.
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Die vorliegende Offenbarung beinhaltet Vorrichtungen, die eine Scheibe mit mehreren mikrofluidischen Kanälen umfassen, die in einer radialen Richtung der Scheibe verlaufen, wobei jeder mikrofluidische Kanal mehrere Fängermoleküle umfasst, die für wenigstens ein Target spezifisch sind, das aus einem Oligonukleotid, einem Protein und einem Kleinmolekül ausgewählt ist, wobei jedes Fängermolekül ein Oligonukleotid umfasst und jedes Fängermolekül an ein Substrat angefügt ist. In einigen Beispielen können die mehreren Fängermoleküle wenigstens ein Aptamer, ein Oligonukleotid, das eine Sequenz umfasst, die zumindest teilweise oder völlig komplementär zu einer Sequenz der ein oder mehreren Targets ist, und/oder wenigstens ein chimeres Molekül beinhalten, das ein Oligonukleotid umfasst. In einigen Aspekten kann jedes Oligonukleotid der mehreren Fängermoleküle eine Sequenz umfassen, die zumindest teilweise oder völlig komplementär zu einer Sequenz des wenigstens einen Targets ist.
  • Die mehreren Fängermoleküle können natürliche Nukleotide, synthetische Nukleotide oder eine Kombination davon umfassen. Ferner können die Oligonukleotide der Fängermoleküle eine Länge im Bereich von 5 bis 10.000 Nukleotiden wie von 20 bis 5000 Nukleotiden oder von 100 bis 1000 Nukleotiden haben. In einigen Beispielen können die mehreren Fängermoleküle DNA und/oder RNA oder ein Fragment von DNA und/oder RNA umfassen.
  • Gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung kann das Substrat ein Microarray oder mehrere Microbeads umfassen. Zum Beispiel, das Substrat kann ein Microarray umfassen, das ein oder mehrere Typen von Fängermolekülen beinhaltet, die zu diskreten Gruppierungen angeordnet oder über die Oberfläche des Microarray verteilt sind. Das Microarray kann Fängermoleküle beinhalten, die für wenigstens ein Target, wenigstens zwei unterschiedliche Targets oder wenigstens drei unterschiedliche Targets spezifisch sind, die zu diskreten Bereichen oder Merkmalen angeordnet oder über die Oberfläche des Microarray verteilt sind. In einigen Beispielen können die mehreren Fängermoleküle eine erste Mehrzahl von Fängermolekülen, die für ein erstes Target spezifisch ist, das an einen ersten Bereich des Microarray angefügt ist, und eine zweite Mehrzahl von Fängermolekülen beinhalten, die für ein zweites Target spezifisch sind, das an einen zweiten Bereich des Microarray angefügt sind. Zum Beispiel, der erste Bereich kann zwei oder mehr diskrete Merkmale auf dem Microarray beinhalten, die durch eine Gruppierung der ersten Mehrzahl von Fängermolekülen definiert werden. Ebenso kann der zweite Bereich zwei oder mehr diskrete Merkmale auf dem Microarray beinhalten, die durch eine Gruppierung der zweiten Mehrzahl von Fängermolekülen definiert werden. Wenn Microbeads als Substrate verwendet werden, dann können die Microbeads einen durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von etwa 10 nm bis etwa 100 μm wie einen durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 100 nm bis 10 μm haben.
  • Die ein oder mehreren Targets einer mit der Vorrichtung nachzuweisenden Probe können mit einer Krankheit oder einem anderen Gesundheitszustand assoziierte Biomarker umfassen. So können die mehreren Fängermoleküle beispielsweise Fängermoleküle beinhalten, die für einen oder mehrere eine Krankheit anzeigende Biomarker spezifisch sind. Gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung können die mehreren Fängermoleküle Fängermoleküle beinhalten, die für Biomarker spezifisch sind, die Krebs, eine Herzkrankheit, eine Atemwegskrankheit, eine neurologische Krankheit, eine Infektionskrankheit oder antiobiotikaresistente Gene anzeigen. Mit Bezug auf Infektionskrankheiten, zum Beispiel, können die mehreren Fängermoleküle Fängermoleküle beinhalten, die für mit einer Infektionskrankheit assoziierte Pathogene spezifisch sind.
  • Ferner kann die Scheibe in einigen Beispielen Fängermoleküle enthalten, die für unterschiedliche Krankheiten oder Gesundheitszustände spezifisch sind, z.B. einen ersten mikrofluidischen Kanal mit mehreren ersten Fängermolekülen, die für ein erstes Target spezifisch sind, und einen zweiten mikrofluidischen Kanal mit mehreren zweiten Fängermolekülen, die für ein zweites Target spezifisch sind, das sich von dem ersten Target unterscheidet. Die ersten und zweiten Targets können Biomarker derselben oder unterschiedlicher Krankheiten oder für einen anderen Gesundheitszustand sein.
  • Die mikrofluidischen Kanäle der Scheibe können eine oder mehrere Kammern enthalten oder damit in Verbindung sein. Gemäß einigen Aspekten kann wenigstens einer der mikrofluidischen Kanäle wenigstens eine Probenvorbereitungskammer beinhalten, konfiguriert zum Extrahieren von genomischem Material, das in der von der Vorrichtung zu analysierenden Probe vorliegt, wobei das genomische Material die ein oder mehreren Targets umfasst. Zusätzlich oder alternativ kann/können die Probenvorbereitskammer(n) so konfiguriert sein, dass sie Blut in die Komponenten Plasma, Serum und Zellen trennen. Die mikrofluidischen Kanäle können eine oder mehrere Reaktionskammern beinhalten, z.B. wenigstens eine Reaktionskammer, die das Substrat und die mehreren Fängermoleküle enthält. In einigen Beispielen kann wenigstens einer der mikrofluidischen Kanäle zwei Reaktionskammern in Verbindung miteinander beinhalten, wobei eine der beiden Reaktionskammern die mehreren Fängermoleküle enthält. Die andere Reaktionskammer kann beispielsweise Reagenzien zum Durchführen einer Amplifikationsreaktion mit dem wenigstens einen Target wie eine Polymerasekettenreaktion oder eine isothermische Amplifikationsreaktion beinhalten. Solche Reagenzien können mehrere Oligonukleotidsequenzen als Primer zum Amplifizieren der ein oder mehreren Targets enthalten. In einigen Beispielen können die mehreren mikrofluidischen Kanäle mehrere Nachweismoleküle umfassen, wobei jedes Nachweismolekül eine nachweisbare Markierung beinhaltet. Die Vorrichtung kann ferner eine Stromquelle und einen Detektor umfassen, die zum Nachweisen von Fluoreszenz, zum Sammeln von optischen Bildern oder beidem konfiguriert sein können. Die mikrofluidischen Kanäle der Scheibe können ein oder mehrere Ventile wie zum Beispiel ein Berstventil, zum Steuern oder Regeln von Fluidfluss durch die Kanäle umfassen.
  • Die vorliegende Offenbarung beinhaltet auch Verfahren zum Nachweisen von wenigstens einem Target in einer Fluidprobe mit einer mikrofluidischen Vorrichtung, z.B einer der hierin beschriebenen Vorrichtungen. Gemäß einigen Aspekten kann das Verfahren das Einleiten der Fluidprobe in wenigstens einen mikrofluidischen Kanal einer Scheibe der Vorrichtung, das Drehen der Scheibe, so dass die Fluidprobe radial auswärts durch wenigstens einen mikrofluidischen Kanal der Scheibe fließt, um sich mit wenigstens einem von mehreren Fängermolekülen zu kombinieren, und das Nachweisen eines Signals von der Scheibe beinhalten, das die Anwesenheit von wenigstens einem Target in der Probe anzeigt. Die ein oder mehreren Targets können z.B. ein Oligonukleotid, ein Protein, ein Kleinmolekül oder eine Kombination davon umfassen.
  • In einigen Verfahren können die mehreren Fängermoleküle wenigstens ein Aptamer beinhalten, das sich an ein oder mehrere Targets in der Fluidprobe bindet. Alternativ oder zusätzlich können die mehreren Fängermoleküle wenigstens ein Oligonukleotid beinhalten, das mit einem oder mehreren Targets in der Fluidprobe hybridisiert. Gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung kann das Verfahren zum Nachweisen von einem oder mehreren Targets in der Fluidprobe das Amplifizieren der ein oder mehreren Targets vor dem Nachweisen der ein oder mehreren Targets beinhalten. Das Amplifizieren der ein oder mehreren Targets kann das Durchführen einer Polymerasekettenreaktion oder eines isothermischen Amplifikationsprozesses beinhalten. In einigen Beispielen kann das Amplifizieren der ein oder mehreren Targets das Erhitzen einer Kammer der Scheibe beinhalten, in der das wenigstens eine Target amplifiziert wird. Die Fluidprobe kann ein beliebiges geeignetes biologisches Fluid umfassen. Zum Beispiel, die Fluidprobe kann Blut umfassen oder kann von Blut gewonnen werden. In einigen Beispielen kann das Verfahren das Extrahieren von in der Fluidprobe vorhandenem genomischem Material umfassen, wobei das genomische Material die ein oder mehreren nachzuweisenden Targets umfasst.
  • Die Verfahren hierin können das Nachweisen eines Signals von der Scheibe durch Nachweisen eines Fluoreszenzsignals eines an die ein oder mehreren Targets angefügten Nachweismoleküls umfassen. Gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung kann das Nachweisen des Signals von der Scheibe das Analysieren der Fluidprobe mit einem optischen Leser beinhalten, um die An- oder Abwesenheit der ein oder mehreren Targets in der Fluidprobe zu bestimmen. In wenigstens einem Beispiel können die ein oder mehreren Targets Biomarker sein, die Krebs, eine Herzkrankheit, eine Atemwegskrankheit, eine neurologische Krankheit, eine Infektionskrankheit oder antibiotikaresistente Gene anzeigen.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die Begleitzeichnungen, die in die vorliegende Spezifikation integriert und Bestandteil davon sind, illustrieren verschiedene beispielhafte Ausgestaltungen und dienen, zusammen mit der Beschreibung, zum Erläutern der Grundsätze der offenbarten Ausgestaltungen. Alle Merkmale einer hierin beschriebenen Ausgestaltung (z.B. Zusammensetzung, medizinische Vorrichtung, Behandlungsverfahren usw.) können mit jeder anderen Ausgestaltung kombiniert werden und können durch die vorliegende Offenbarung umfasst werden.
  • 1A, 1B und 1C zeigen beispielhafte mikrofluidische Scheiben gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung.
  • 2 zeigt eine beispielhafte mikrofluidische Scheibe gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung.
  • 3A und 3B sind Schemata von an ein Substrat angefügten Fängermolekülen gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung.
  • 4, 5 und 6 zeigen Ablaufdiagramme von beispielhaften Assays gemäß der vorliegenden Offenbarung.
  • 7 zeigt beispielhafte Komponenten einer Vorrichtung gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung.
  • 8 zeigt einen beispielhaften Container einer Vorrichtung gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
  • Ausgestaltungen der vorliegenden Offenbarung können den Bedarf an alternativen Vorrichtungen und Verfahren zum Nachweisen von Targets oder Analyten von Interesse in einer Probe decken. Aspekte der vorliegenden Offenbarung können bestimmte Vorteile beim Untersuchen von Patienten, einschließlich großer Populationen, für verschiedene Gesundheitszustände bieten.
  • Die Singularformen „ein/e/r“ und „der/die/das“ schließen Pluralreferenzen ein, wenn der Kontext nicht etwas anderes diktiert. Die Begriffe „ungefähr“ und „etwa“ beziehen sich auf fast dasselbe wie die/der referenzierte Zahl oder Wert. Die hierin benutzten Begriffe „ungefähr“ und „etwa“ sind im Allgemeinen so zu verstehen, dass sie ±5 % eines vorgegebenen Betrags oder Wertes einschließen.
  • Die hierin verwendeten Begriffe „umfasst“, „umfassend“ oder jede andere Variation davon sollen einen nicht exklusiven Einschluss abdecken, so dass ein(e) Prozess, Verfahren, Artikel oder Vorrichtung, der/das/die eine Liste von Elementen umfasst, nicht nur diese Elemente beinhaltet, sondern auch andere Elemente beinhalten kann, die nicht ausdrücklich aufgeführt oder in einem/r solchen Prozess, Verfahren, Artikel oder Vorrichtung inhärent sind. Der Begriff „beispielhaft“ wird in dem Sinne von „Beispiel“ anstatt von „Ideal“ benutzt.
  • Vorrichtungen gemäß der vorliegenden Offenbarung können eine rasche Analyse einer relativ geringen Probenmenge zulassen, um ein oder mehrere Targets von Interesse in der Probe nachzuweisen. In einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung können Oligonukleotide als Sonden oder Fängermoleküle für das spezifische und/oder parallele Einfangen von Targets benutzt werden. Die Oligonukleotide können mit einem Substrat wie zum Beispiel Microbeads und/oder einem Microarray gekoppelt sein. Die Vorrichtungen und Verfahren hierin können zum Nachweisen und/oder Quantifizieren unterschiedlicher Typen von Targetanalyten benutzt werden, einschließlich, aber ohne darauf begrenzt zu sein, Oligonukleotide, Proteine und Kleinmoleküle. In einigen Aspekten kann die Verwendung von Microbeads das Trennen des Targets von Reagenzien und/oder anderen Komponenten der Probe zulassen, die ein reineres Signal bereitstellen können.
  • In einigen Aspekten können zum Beispiel Oligonukleotide (natürliche oder nicht natürliche) als Sonden oder Fängermoleküle benutzt werden, um natürlich vorkommende Oligonukleotide wie DNA und/oder RNA in einer Probe nachzuweisen und/oder zu quantifizieren (einschließlich z.B. einer komplexen Probe wie einer rohen Probe). Zum Beispiel, das Sonden- oder Fänger-Oligonukleotid kann eine einzelsträngige Nukleinsäure sein, die wenigstens teilweise komplementär zu einer Targetnukleinsäure ist, um Hybridisierung zwischen den Sonden- und Target-Oligonukleotiden zu ermöglichen. Ferner kann zum Beispiel das Sonden- oder Fänger-Oligonukleotid ein Aptamer sein, das sich an ein spezifisches Target wie ein Protein oder Kleinmolekül binden kann.
  • Die mit den Vorrichtungen und Verfahren hierin zu analysierende Probe kann von einem beliebigen Subjekt von Interesse gewonnen oder abgeleitet werden, einschließlich Säugetiersubjekten wie z.B. menschlichen Subjekten, z.B. Patienten. Zu Säugetiersubjekten gehören sowohl Menschen als auch Primate. Beispiele für Säugetiere, für die Proben gemäß den Verfahren hierin analysiert werden können, sind, aber ohne darauf begrenzt zu sein, Menschen, Primate, Hunde, Katzen, Mäuse, Rinder, Pferde und Schweine.
  • Gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung kann die Probe Blut und/oder andere flüssige Proben biologischen Ursprungs, feste Gewebeproben wie eine Biopsieprobe, Gewebekultur oder davon abgeleitete Zellen oder Abkömmlinge davon beinhalten. Zum Beispiel, die Probe kann komplex sein, z.B. eine rohe Probe, die mehrere unterschiedliche Typen von Zellen, Oligonukleotiden, Proteinen und/oder anderen biologischen Spezies umfasst. Die Probe kann eine einzige Zelle oder mehr als eine einzelne Zelle, z.B. eine Mehrzahl von Zellen umfassen. Proben können klinische Proben, Zellen in Kultur, Zellüberstände und/oder Zelllysate beinhalten. In wenigstens einem Beispiel kann die Probe eine rohe Blutprobe oder eine Blutprobe umfassen, die wenigstens teilweise verarbeitet wurde, z.B. Blutplasma, das von Blutkörperchen getrennt wurde. In einigen Aspekten kann eine Probe kanzerösen Ursprungs sein, z.B. von Krebsgewebe gewonnen. Zum Beispiel, die Probe kann von kanzerösen Brustgeweben erhalten werden.
  • Die Probe kann mit einer oder mehreren Prozeduren oder Behandlungsschritten nach ihrer Beschaffung von einem Subjekt manipuliert oder verarbeitet werden. Zum Beispiel, eine Probe kann mit einem oder mehreren Reagenzien behandelt, solubilisiert und/oder mit bestimmten Komponenten angereichert werden. Das Anreichern einer Probe kann zum Beispiel das Konzentrieren eines oder mehrerer Bestandteile der Probe beinhalten, um bei Nachweis, Analyse und/oder Identifikation dieser Bestandteile zu assistieren. In wenigstens einem Beispiel kann eine Probe mit Bezug auf ein oder mehrere Targetproteine und/oder -polynukleotide vor dem Aussetzen der Probe Fängermolekülen zum Binden und Nachweisen der ein oder mehreren Targets angereichert werden. Der oder die Verarbeitungsschritte kann/können vor und/oder nach dem Einleiten der Probe in die Vorrichtung zur Analyse durchgeführt werden.
  • In einigen Beispielen kann eine rohe Probe verarbeitet werden, um Zellmaterial wenigstens teilweise von Flüssigkeit zu trennen, z.B. Blutkörperchen in einer rohen Blutprobe von Blutplasma zu trennen. Der flüssige Überstand kann dann in die Vorrichtung zum Nachweisen von in der Flüssigkeit vorliegenden Analyten eingeleitet werden. In einigen Beispielen kann eine rohe biologische Probe verarbeitet werden, um Zellmaterial chemisch und/oder mit mechanischen Kräften zu lysieren, und wenigstens ein Teil der lysierten Probe kann in die Vorrichtung zur Analyse eingeleitet werden. In anderen Aspekten kann eine rohe biologische Probe in die Vorrichtung zwecks Trennung und/oder Lyse von Zellmaterial eingeleitet werden, z.B. in einem mikrofluidischen Kanal. Zum Beispiel, die Konfiguration des Kanals und/oder der in dem Kanal befindlichen Beads (oder sonstigen Objekte) kann Scherkräfte oder andere mechanische Kräfte erzeugen, um Zellmembranen aufzubrechen. Ferner kann der Kanal zum Beispiel chemische und/oder biochemische Reagenzien beinhalten, die Zellwände in der Probe nach Kontakt mit der Probe aufbrechen können. In weiteren Beispielen kann die Vorrichtung erhitzt und/oder mit Ultraschallenergie beaufschlagt werden, um Lyse des Zellmaterials in einer Probe zu induzieren.
  • In einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung können die in einer Probe nachzuweisenden Targets und/oder die zum Nachweisen der Targets benutzten Spezies Oligonukleotide umfassen. Der Begriff „Oligonukleotid“ beinhaltet, aber ohne darauf begrenzt zu sein, Nukleosidsubeinheit-Polymere mit zusammenhängenden Subeinheiten. Die Nukleosidsubeinheiten (z.B. Adenosin, Desoxyadenosin, Guanosin, Desoxyguanosin, 5-Methyluridin, Thymidin, Uridin, Desoxyuridin, Cytidin, Desoxycytidin, unter anderen Nukleosiden) können mit einer Reihe verschiedener Inter-Subeinheitsverknüpfungen aneinander gefügt werden, einschließlich, aber ohne darauf begrenzt zu sein, Phosphodiester-, Phosphotriester-, Methylphosphonat-, P3´→N5´ Phosphoramidat-, N3´→P5´ Phosphoramidat-, N3´→P5´ Thio-phosphoramidat- und Phosphorthioatverknüpfungen. Der hierin verwendete Begriff „Nukleosid“ beinhaltet, aber ohne darauf begrenzt zu sein, natürliche Nukleoside, einschließlich z.B. 2´-Desoxy- und 2´-Hydroxylformen und Analoga davon. Der Begriff „Analoga“ mit Bezug auf Nukleoside beinhaltet, aber ohne darauf begrenzt zu sein, synthetische Nukleoside mit modifizierten Basenanteilen und/oder modifizierten Zuckeranteilen. Solche Analoga können beispielsweise synthetische Nukleoside beinhalten, die zum Verbessern von Bindungseigenschaften, z.B. Stabilität, Spezifität oder dergleichen, ausgelegt sind.
  • Die Oligonukleotide hierin können eine oder mehrere Modifikationen am Zuckergerüst (z.B. Ribose- oder Desoxyribosesubeinheiten), am Zucker (z.B. 2´-Substitutionen), an den Nukleobasen und/oder an den 3´- und/oder 5´-Termini beinhalten. In Beispielen, in denen der Oligonukleotidanteil mehrere Inter-Subeinheitsverknüpfungen beinhaltet, kann jede Verknüpfung mit derselben Chemie (z.B. derselben Verknüpfungsgruppe) oder einem Gemisch von unterschiedlichen Verknüpfungschemien (z.B. unterschiedliche Typen von Verknüpfungsgruppen) gebildet werden. Der Begriff „Polynukleotid“ kann hierin austauschbar mit dem Begriff „Oligonukleotid“ verwendet werden. Die Oligonukleotide können natürlich und/oder nicht natürlich (synthetisch) sein. Zum Beispiel, die Oligonukleotide können DNA, RNA, microRNA (miRNA), synthetische Nukleinsäuren, Fragmente davon oder eine beliebige Kombination davon umfassen. In einigen Aspekten kann das Oligonukleotid ein, zwei oder mehr als zwei nicht natürliche Nukleoside umfassen. In einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung können die Oligonukleotide 5 bis 10.000 Nukleotide wie 20 bis 5000 Nukleotide oder 100 bis 1000 Nukleotide umfassen. In wenigstens einem Beispiel umfasst das Targetoligonukleotid eine miRNA.
  • Gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung können die in einer Probe nachzuweisenden Targetanalyte Biomarker umfassen. Der Begriff „Biomarker“ bezieht sich im Allgemeinen auf einen chemischen oder biochemischen Indikator, der mit einem oder mehreren Gesundheitszuständen assoziiert ist. Ein Biomarker kann, aber ohne darauf begrenzt zu sein, ein Molekül von Interesse oder einen Teil eines Moleküls von Interesse beinhalten, der nachgewiesen und/oder analysiert werden soll. Beispielhafte Biomarker sind Oligonukleotidsequenzen (z.B. DNA-Sequenzen und RNA-Sequenzen), Kleinmoleküle, Peptide und Proteine. Ferner können Biomarker gemäß der vorliegenden Offenbarung Fragmente, Spleißvarianten und/oder Volllängenpeptide umfassen. Biomarker gemäß der vorliegenden Offenbarung beinhalten genetische Marker, z.B. DNA-Sequenzen eines Organismus, die beim Identifizieren von Charakteristiken dieses Organismus nützlich sein können. Zum Beispiel, der Analyt kann ein Biomarker einer genetischen Krankheit, einer umweltbedingten Erkrankung, eines Pathogens oder einer Antibiotikaresistenz sein. In einigen Aspekten können mit einer Krankheit oder einem sonstigen Gesundheitszustand assoziierte genetische Marker eine oder mehrere Veränderungen, Variationen und/oder Mutationen in einer DNA-Sequenz im Vergleich zu einer DNA-Sequenz beinhalten, die nicht mit der Krankheit oder einem anderen Gesundheitszustand assoziiert ist. Ein Biomarker oder eine Kombination von Biomarkern kann mit einem bestimmten physischen Zustand oder Gesundheitszustand, z.B. einer Krankheit oder einem Krankheitszustand assoziiert sein. Zum Beispiel, der oder die Biomarker kann/können mit Brustkrebs, z.B. Brustkrebs in einem späten Stadium assoziiert sein.
  • Der Begriff „Fängermolekül“ beinhaltet, aber ohne darauf begrenzt zu sein, ein Molekül, das an eine Oberfläche angefügt, z.B. darauf immobilisiert ist, zum Fangen eines in einer zu analysierenden Probe vorhandenen Targets. Der hierin verwendete Begriff „immobilisiert“ beinhaltet immobilisiert, gebunden und/oder verknüpft an/mit eine(r) Oberfläche wie ein Substrat. Beispiele für Substrate sind Microarrays (inkl. z.B. Objektträger, Multiwell-Platten und die Wände oder sonstigen Innenflächen einer Nachweisvorrichtung) und Microbeads.
  • Für die vorliegende Offenbarung geeignete Fängermoleküle beinhalten, aber ohne darauf begrenzt zu sein, RNA, DNA, Aptamere und proteinbasierte Aptamere. Ein Fängermolekül kann sich an ein Target, z.B. einen Biomarker, in einer zu analysierenden Probe binden. In einigen Beispielen kann das Fängermolekül ein Oligonukleotid, ein Aptamer, eine eine oder mehrere Oligonukleotidsequenzen umfassende chimere Struktur oder einen Antikörper umfassen.
  • In wenigstens einem Beispiel beinhaltet das Fängermolekül ein Oligonukleotid. Das Fängeroligonukleotid kann eine Sequenz haben, die mindestens teilweise oder völlig komplementär zur Sequenz eines in der Probe nachzuweisenden Targetoligonukleotids ist. Zum Beispiel, das Fängeroligonukleotid kann 5 bis 10.000 Nukleotide komplementär zum Target, z.B. 20 bis 1000 komplementäre Nukleotide, 50 bis 500 komplementäre Nukleotide oder 100 bis 300 komplementäre Nukleotide umfassen. Somit kann das Fängeroligonukleotid an das Targetoligonukleotid hybridisieren, um eine an ein Substrat angefügte doppelsträngige Nukleinsäure zu bilden.
  • In einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung kann sich ein Target an ein Fängermolekül, z.B. ein Aptamer binden. Ein Molekül oder eine andere chemische/biochemische Spezies kann dann als „Bindung“ aufweisend angesehen werden, wenn es/sie häufiger, schneller, mit größerer Dauer und/oder mit größerer Affinität mit einem oder mehreren bestimmten Targets reagiert oder assoziiert als mit alternativen Substanzen (z.B. anderen Targets oder Nicht-Target-Spezies). Zum Beispiel, ein Fängermolekül kann sich an ein Target „binden“, wenn es sich mit größerer Affinität, Avidität, leichter und/oder mit größerer Dauer an das Target als an andere Substanzen anfügt. In wenigstens einem Beispiel kann das Fängermolekül ein Oligonukleotid umfassen, das sich spezifisch oder wenigstens bevorzugt an ein Target (z.B. einen Biomarker) mit größerer Affinität, Avidität, leichter und/oder mit größerer Dauer bindet als sich das Oligonukleotid an andere Substanzen bindet.
  • In wenigstens einem Beispiel umfasst das Fängermolekül ein Aptamer. Das Aptamer kann zum Beispiel ein einzelsträngiges Oligonukleotid (z.B. DNA oder RNA) umfassen, das sich durch strukturelles Anpassen an das Target an dieses binden kann. Das Aptamer kann für ein Target hoch spezifisch sein und eine starke Bindung damit bilden.
  • Einige Verfahren gemäß der vorliegenden Offenbarung können eine Größenauswahl von in der Probe vorhandenen Oligonukleotiden beinhalten, z.B. zum Produzieren von Targetoligonukleotiden einer gewünschten Größe (z.B. Nukleotidlänge). Eine Größenauswahl kann beispielsweise mit chemischen Reagenzien oder Enzymen erzielt werden, um Oligonukleotide in der Probe in kürzere Fragmente zu spalten, die zum Fangen und Nachweisen geeignet sind. Solche Fragmente können eine Länge innerhalb eines vorbestimmten Bereichs haben, z.B. auf der Basis der Eigenschaften der chemischen Reagenzien oder Enzyme und Reaktivität mit der Probe.
  • Die gewünschte Größe eines Targetoligonukleotids kann auf der Basis der Größe und anderer Eigenschaften des entsprechenden Fängermoleküls ausgewählt werden, z.B. zum Optimieren von Hybridisierungskinetik zwischen dem Target und dem Fängermolekül. Für Fängermoleküle mit einer Länge zwischen 25 und 60 Nukleotiden können beispielsweise Targetoligonukleotide mit einer Länge zwischen 50 und 200 Nukleotiden eine geeignete Hybridisierung bieten. Für Fängermoleküle, die Tausende von Nukleotiden umfassen, können größere Targetoligonukleotide für Bindung oder Hybridisierung zweckmäßig sein. In einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung kann eine Größenauswahl von Targetoligonukleotiden Gleichförmigkeit von Targets bereitstellen, z.B. um die Hybridisierungskinetik konsistent zu halten. In wenigstens einigen Beispielen erfolgt evtl. keine Größenauswahl von Oligonukleotidien in einer Probe. Zum Beispiel, miRNAs sind typischerweise kurze Sequenzen (z.B. mit einer Länge von 17 bis 25 Nukleotiden), so dass Target-miRNAs in einer Probe mit Fängermolekülen ohne Größenauswahl kombiniert werden können.
  • Fängermoleküle können evtl. in der Lage sein oder auch nicht, sich nur an das Target von Interesse zu binden. Zum Beispiel, ein Fängermolekül kann eine Bindungsstelle oder eine Mehrzahl von zwei oder mehr Bindungsstellen haben. Fängermoleküle gemäß der vorliegenden Offenbarung können sich an nur ein Target (z.B. das Fängermolekül ist für ein bestimmtes Target spezifisch), an eine gewählte Anzahl von Targets (z.B. das Fängermolekül ist für zwei oder mehr Targets spezifisch) oder an mehrere Target- und Nicht-Target-Spezies binden.
  • Ferner kann sich ein Fängermolekül, das sich spezifisch oder bevorzugt an ein erstes Target bindet, evtl. spezifisch oder bevorzugt an ein zweites Target binden oder auch nicht. In einigen Aspekten kann sich zum Beispiel ein Fängermolekül an zwei oder mehr Targets binden, wobei die Natur der Bindung mit jedem Target etwa gleich oder unterschiedlich sein kann (z.B. das Fängermolekül hat eine größere Affinität für ein Target als für ein anderes Target). Somit erfordert eine „Bindung“ nicht unbedingt eine exklusive Bindung (kann aber eine haben). In einigen Aspekten kann sich ein Bezug auf „Bindung“ auf eine bevorzugte Bindung beziehen, z.B. einen Vorzug für eine Reaktion oder Assoziation mit einem oder mehreren Targets im Vergleich zu anderen Spezies oder Substanzen. Das Konzept der „Bindung“ wird auch so verstanden, dass es das Konzept von Spezifität beinhaltet, z.B. eine selektive Anfügung zwischen zwei Spezies (z.B. ein Fängermolekül und ein Target). Eine spezifische Bindung kann biochemisch als sättigbar charakterisiert werden (eine nicht-spezifische Bindung ist nicht sättigbar).
  • Die ein oder mehreren Fängermoleküle können beispielsweise ein oder mehrere Antikörper, Peptide, Proteine oder eine Kombination davon beinhalten. Beispielhafte Fängermoleküle, die für die vorliegende Offenbarung geeignet sind, beinhalten, aber ohne darauf begrenzt zu sein, RNA, DNA, Peptide, Antikörper, Aptamere und proteinbasierte Aptamere. Beispiele für Antikörper umfassende Fängermoleküle sind in der am 5. Mai 2016 eingereichten internationalen Anmeldung Nr. PCT/US2016/030959 beschrieben, die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
  • Das Verknüpfen eines Fängermoleküls mit einer Oberfläche kann kovalent oder nicht kovalent sein. Das Verknüpfen von Fängermolekülen mit einem Substrat kann mit beliebigen geeigneten Verfahren erzielt werden. Zum Beispiel, die Substratoberfläche kann mit einer oder mehreren chemischen funktionellen Gruppen funktionalisiert werden, z.B. zum Konjugieren an Fängermoleküle. Beispiele für funktionelle Gruppen sind, aber ohne darauf begrenzt zu sein, Amin-, Thiol-, Phosphat-, Alkyl-, Alken-, Alkyn-, Aren-, Alkohol-, Keton-, Aldehyd-, Carboxyl- und Alkoxygruppen.
  • In einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung kann der Nachweis eines Targets das Binden des Targets an ein Nachweismolekül beinhalten. Zum Beispiel, die Nachweismoleküle können wenigstens eine nachweisbare Markierung (z.B. ein chemischer Tag oder ein Sondenmolekül) umfassen, die mit einer Analysetechnik wie optischer Nachweis, z.B. Absorbanz, Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder Elektrochemilumineszenz nachweisbar ist. Zum Beispiel, die nachweisbare Markierung kann fluoreszierende Agenzien, kolorimetrische Agenzien, magnetische Agenzien oder elektrische Agenzien oder eine beliebige Kombination davon umfassen. Zu fluoreszierenden Agenzien gehören, aber ohne darauf begrenzt zu sein, Quantenpunkte und Fluorophore, z.B. einschließlich Alexa Fluor® 546 Farbstoffmolekülen und Alexa Fluor® 488 Farbstoffmolekülen, produziert von ThermoFisher Scientific, Phykoerythrin (PE) und Allophycynin (APC).
  • In wenigstens einigen Beispielen können die Fängermoleküle an Microbead-Oberflächen angefügt oder darauf immobilisiert sein. Der hierin verwendete Begriff „Microbead“ beinhaltet, aber ohne darauf begrenzt zu sein, Partikel mit einer allgemein gekrümmten Form. In wenigstens einem Beispiel können die Microbeads sphärisch mit einem gleichmäßigen Durchmesser sein. Microbeads gemäß der vorliegenden Offenbarung können starr sein und können eine Oberfläche haben, die glatt oder porös ist oder die sowohl glatte Abschnitte als auch poröse Abschnitte beinhaltet. Ein Microbead kann ein Material oder eine Kombination von Materialien umfassen. Die Microbeads können in einigen Ausgestaltungen magnetische Eigenschaften haben, z.B. die Microbeads können ein magnetisches Material oder eine Kombination von Materialien umfassen.
  • Gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung können die Microbeads einen durchschnittlichen Durchmesser zwischen etwa 10 nm und etwa 100 μm, wie von etwa 50 nm bis etwa 50 μm, von etwa 100 nm bis etwa 10 μm, von etwa 100 nm bis etwa 5 μm, von etwa 500 nm bis etwa 5 μm, von etwa 100 nm bis etwa 1 μm, von etwa 1 μm bis etwa 50 μm, von etwa 5 μm bis etwa 10 μm oder von etwa 10 μm bis etwa 50 μm haben. Zum Beispiel, die Microbeads können einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 10 nm, etwa 100 nm, etwa 500 nm, etwa 1 μm, etwa 5 μm, etwa 10 μm, etwa 50 μm oder etwa 100 μm haben.
  • In einigen Beispielen können die Fängermoleküle an eine Oberfläche angefügt oder darauf immobilisert sein, um ein Microarray zu bilden. In einigen Beispielen können mehrere für dasselbe Target spezifische Fängermoleküle in unmittelbarer Nähe zueinander gruppiert werden und ein „Merkmal“ des Microarray bilden. So kann das Microarray beispielsweise ein oder mehrere Merkmale zum Nachweisen desselben Targets beinhalten. In einigen Aspekten kann das Microarray mehrere Merkmale zum Nachweisen unterschiedlicher Typen von Targets beinhalten, z.B. jedes Merkmal umfasst mehrere für ein Target spezifische Fängermoleküle. Jedes Merkmal kann eine Querschnittsgröße im Bereich von etwa 10 μm bis etwa 500 μm, wie von etwa 50 μm bis etwa 100 μm, von etwa 75 μm bis etwa 250 μm oder von etwa 100 μm bis etwa 200 μm, z.B. eine Querschnittsgröße von etwa 10 μm, etwa 50 μm, etwa 75 μm, etwa 100 μm, etwa 150 μm, etwa 200 μm oder etwa 250 μm haben. In einigen Beispielen kann das Microarray ein Merkmal bis 1 Million Merkmale oder mehr, wie 5 bis 10.000 Merkmale, 10 bis 1000 Merkmale oder 100 bis 500 Merkmale aufweisen. Ferner kann das Microarray zum Beispiel 2 bis 48 Merkmale, 5 bis 30 Merkmale oder 8 bis 25 Merkmale aufweisen. Die Konfiguration des Microarray kann auf der Basis der Anzahl von gewünschten Merkmalen, der Anzahl und/oder der Typen von nachzuweisenden Targets und/oder des verfügbaren Raums auf der Oberfläche des Substrats gewählt werden (z.B. der Raum, der in den ein oder mehreren Kammern der Scheibe zum Aufnehmen des Microarray verfügbar ist). In einigen Beispielen können die Merkmale in einem regelmäßigen Muster wie zum Beispiel einem rechteckigen, quadratischen, kreisförmigen, dreieckigen oder hexagonalen Muster oder einer Kombination davon angeordnet werden. Zum Beispiel, das Microarray kann eine rasterähnliche Konfiguration von 9 Merkmalen (z.B. 3 × 3 Quadrat oder konzentrische Kreise von 5 und 4), 12 Merkmalen (z.B. 3 × 4 Rechteck), 16 Merkmalen (z.B. 4 × 4 Quadrat), 20 Merkmalen (z.B. 4 × 5 Rechteck) oder 25 Merkmalen (z.B. 5 × 5 Quadrat) haben. Jeder Kanal kann ein Microarray oder mehrere Microarrays beinhalten.
  • Die 3A und 3B illustrieren Beispiele für an Substrate angefügte Fängermoleküle gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung.
  • 3A zeigt einen Teil eines beispielhaften Substrats 350, das ein Microarray umfasst. Das Substrat 350 kann in einer Nachweisvorrichtung angeordnet oder integriert sein. Zum Beispiel, das Substrat 350 kann eine Wand der Vorrichtung (z.B. die Wand einer Kammer oder eines mikrofluidischen Kanals) bilden oder kann ein mit einer Wand der Vorrichtung gekoppeltes Microarray umfassen. Wie gezeigt, können zwei unterschiedliche Typen von Fängermolekülen 355, 356 an das Substrat 350 angefügt sein. Jedes Fängermolekül 355, 356 kann über eine beliebige geeignete chemische Verknüpfungsgruppe oder Entität des Fängermoleküls 355, 356 und/oder der Oberfläche des Substrats 350 kovalent an die Oberfläche gebunden sein, so dass ein Abschnitt 357, 358 der jeweiligen Fängermoleküle 355, 356 für eine Bindung an ein oder eine Hybridisierung mit einem Target verfügbar ist. Der zum Reagieren mit einem Target verfügbare Abschnitt 357, 358 jedes Fängermoleküls 355, 356 kann eine Bindungsstelle sein, wie z.B. eine dreidimensionale sekundäre Struktur des Fängermoleküls (z.B. im Falle eines für ein bestimmtes Target spezifisches Aptamer) oder eine Länge des Fängermoleküls wie eine Nukleinsäuresequenz (z.B. im Falle von Oligonukleotiden, die zum Hybridisieren mit einem bestimmten Target geeignet sind).
  • In Kombination mit einer Probe, die mehrere Targets 363, 364 umfasst, kann sich ein Fängermolekül 355 selektiv an ein Target 363, aber nicht an ein Target 364 binden oder damit hybridisieren (z.B. das Fängermolekül 355 ist nicht für das Target 364 spezifisch oder dazu komplementär). Ferner ist das Fängermolekül 356 evtl. nicht für das Target 364 spezifisch oder damit komplementär, so dass es sich nicht an das Target 364 bindet oder damit hybridisiert. Ein Nachweismolekül 365, das einen nachweisbaren Tag (z.B. einen Fluoreszenz-Tag) umfasst, der für das Target 363 spezifisch oder dazu komplementär ist, kann sich auch an das Target 363 binden oder damit hybridisieren, um einen Nachweis zuzulassen. So kann das Target 363 zum Nachweisen auf der Oberfläche des Substrats 350 über seine Assoziation mit dem immobilisierten Fängermolekül 355 eingefangen werden, während das Target 364 evtl. nicht nachgewiesen wird.
  • 3B zeigt ein beispielhaftes Microbead 300 als Substrat zur Verwendung in einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung. Wie gezeigt, können zwei unterschiedliche Typen von Fängermolekülen 305, 306 an die Oberfläche des Microbead 300 angefügt sein. Jedes Fängermolekül 305, 306 kann kovalent über eine beliebige geeignete chemische Verknüpfungsgruppe oder Entität des Fängermoleküls 305, 306 und/oder der Oberfläche des Microbead 300 an die Oberfläche gebunden werden, so dass ein Abschnitt 307, 308 der jeweiligen Fängermoleküle 305, 306 zum Binden an oder Hybridisieren mit einem Target zur Verfügung steht. Bei Kombination mit einer Probe, die mehrere Targets 313, 314 umfasst, kann sich das Fängermolekül 305 selektiv an das Target 313, aber nicht an das Target 314 binden oder damit hybridisieren (z.B. einen Fängermolekül-Microbead/Target-Komplex bilden). Ein Nachweismolekül 315, das einen nachweisbaren Tag (z.B. einen Fluoreszenz-Tag) umfasst, der für das Target 313 spezifisch oder dazu komplementär ist, kann sich auch an das Target 313 binden, um einen Nachweis zuzulassen. Ferner ist das Fängermolekül 306 evtl. nicht für das Target 314 spezifisch oder dazu komplementär, so dass es sich nicht an das Target 314 bindet oder damit hybridisiert. So kann das Target 313 über seine Assoziation mit dem Microbead 300 und dem Fängermolekül 305 nachgewiesen werden, während das Target 314 evtl. nicht nachgewiesen wird.
  • Während die 3A und 3B Beispiele illustrieren, bei denen unterschiedliche Typen von Fängermolekülen an dieselbe Substratoberfläche angefügt sind (z.B. zum Einfangen und Nachweisen von unterschiedlichen Targets), beinhaltet das Substrat in anderen Beispielen evtl. nur einen Typ von Fängermolekül. Zum Beispiel, wenn Microbeads als Substrate verwendet werden, dann beinhalten mehrere Microbead-Sätze evtl. denselben Typ von Fängermolekül, so dass die Microbeads für ein Target spezifisch sind. Jedes Microbead der mehreren Microbeads kann dieselbe Größe, Form und chemische Zusammensetzung haben wie die anderen Microbeads, oder die mehreren Microbeads können wenigstens ein Microbead mit einer anderen Größe, Form und/oder chemischen Zusammensetzung haben als wenigstens ein anderes Microbead der mehreren Microbeads. Ebenso kann eine Oberfläche einer Kammer oder eines Kanals einer mikrofluidischen Vorrichtung mehrere Fängermoleküle desselben Typs beinhalten oder die Oberfläche kann in zwei oder mehrere Bereiche unterteilt werden (die z.B. mehrere diskrete Merkmale auf der Oberfläche zum Bilden eines Microarray definieren), die jeweils einen anderen Fängermolekültyp umfassen.
  • In einigen Beispielen können die ein oder mehreren Fängermoleküle markiert werden, z.B. mit wenigstens einer nachweisbaren Markierung (z.B. einem chemischen Tag oder Sondenmolekül). Zum Beispiel, die ein oder mehreren Fängermoleküle können eine Markierung umfassen, die mit einer Analysetechnik wie optischer Nachweis, z.B. Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder Elektrochemilumineszenz nachweisbar ist. In einigen Aspekten können die ein oder mehreren Fängermoleküle ein fluoreszent markiertes/n Oligonukleotid, Antikörper oder Protein umfassen.
  • Einige Aspekte der vorliegenden Offenbarung beinhalten das Analysieren einer Probe in einem Diagnose-Assay zum Bestimmen der An- oder Abwesenheit von einem oder mehreren Targets, die als Biomarker dienen, und/oder zum Messen der Menge von einem oder mehreren Biomarkern in der Probe. In wenigstens einer Ausgestaltung kann das Assay ein oder mehrere Fängermoleküle umfassen. Zum Beispiel, das Assay kann eine Mehrzahl oder einen Satz von Fängermolekülen umfassen. In einigen Ausgestaltungen kann der Satz wenigstens zwei separate Fängermoleküle umfassen, wobei jedes separate Fängermolekül ein anderes Target nachweisen oder damit hybridisieren kann (z.B. ein Biomarker). Der Satz von Fängermolekülen kann im Bereich von 2 bis 1000 oder mehr Fängermolekülen liegen. In einigen Ausgestaltungen kann der Satz von Fängermolekülen wenigstens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 100, 150, 200, 250, 500, 750 oder 1000 oder mehr separate Fängermoleküle umfassen. Zum Beispiel, der in einer Scheibe enthaltene Satz von Fängermolekülen (z.B. mit Microbeads in derselben oder in unterschiedlichen Kammern gekoppelt, oder an eine Oberfläche angefügt, um ein oder mehrere Microarrays in denselben oder in unterschiedlichen Kammern zu bilden) kann im Bereich von 2 bis 1000 separaten Fängermolekülen wie von 100 bis 1000, von 50 bis 500 oder von 2 bis 100 separaten Fängermolekülen liegen.
  • In wenigstens einem Beispiel beinhaltet der Satz von Fängermolekülen 5, 6 oder 7 separate Fängermoleküle, die jeweils für einen anderen Biomarker in Bezug auf einen bestimmten Gesundheitszustand wie z.B. Krebs, eine Herzkrankheit oder eine neurologische Krankheit spezifisch oder dazu komplementär sind. In einem anderen Beispiel beinhaltet der Satz von Fängermolekülen 12 separate Fängermoleküle, die jeweils für einen anderen Biomarker in Bezug auf einen bestimmten Krankheitszustand spezifisch oder dazu komplementär sind. In noch einem anderen Beispiel beinhaltet der Satz von Fängermolekülen 20 bis 1000 oder 20 bis 60 separate Fängermoleküle, die jeweils für einen anderen Biomarker in Bezug auf einen bestimmten Krankheitszustand oder eine Kombination von Krankheitszuständen spezifisch oder dazu komplementär sind. In einigen Beispielen können ein oder mehrere Targetbindungsagenzien zusätzlich zu den hierin beschriebenen Fängermolekülen und Fängermolekülsätzen benutzt werden.
  • Anzahl und Typ(en) von Fängermolekülen können von einem oder mehreren der folgenden Parameter abhängig sein: den vorgesehenen Verwendungszwecken und Anwendungen der Fängermoleküle, Komplexität und Zusammensetzung der Probe, Bindungsaffinität und/oder Spezifität der Fängermoleküle und/oder Stabilität der Fängermoleküle. Zum Beispiel, die Wahl von Fängermolekülen kann von den in der Probe nachzuweisenden Targets abhängig sein. In einigen Aspekten können die ein oder mehreren Fängermoleküle für einen oder mehrere Biomarker aus einem Satz von Biomarkern wie z.B. einem Biomarker-Panel spezifisch oder dazu komplementär sein. Zum Beispiel, Fängermoleküle können für Biomarker spezifisch sein, die mit einem bestimmten Krankheitszustand assoziiert sind. In einigen Aspekten kann jedes Fängermolekül für einen Biomarker des Panels spezifisch sein.
  • In einigen Beispielen können die nachzuweisenden Targets mit Brustkrebs assoziierte Biomarker sein. Zum Beispiel, die Biomarker können menschlichen Östrogenrezeptor 2 (Her-2), Matrix-Metallopeptidase-2 (MMP-2), Krebsantigen 15-3 (CA 15-3), Osteopontin (OPN), Tumorprotein p53 (p53), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Krebsantigen 125 (CA 125), Serum-Östrogenrezeptor (SER) oder eine Kombination davon beinhalten. Beispiele für Sequenzidentifikatoren in der HUGO Gene Nomenclature Committee Online-Datenbank für solche Marker beinhalten, aber ohne darauf begrenzt zu sein, Her-2 (X03363), MMP-2 (NM_004530), OPN (NM_001040058), p53 (NM_000546), VEGF (MGC70609), CA 125 (Q8WX17), SER (NP 000116.2) und CA 15-3 (NM_002456).
  • Die hierin offenbarten Vorrichtungen und Verfahren können zum Nachweisen und/oder Diagnostizieren anderer Zustände oder Krankheiten als Brustkrebs benutzt werden. Zum Beispiel, Sätze von Biomarkern können für andere Krankheiten gewählt werden, wie z.B. für Prostatakrebs, Eierstockkrebs, Herzkrankheit, neurologische Krankheit, Atemwegskrankheiten und Infektionskrankheiten wie sexuell übertragene Krankheiten (STD). Beispielhafte Biomarker für ein Prostatakrebs-Panel (z.B. Biomarker, die beim Einholen von Diagnoseinformationen über Prostatakrebs nützlich sind) können, aber ohne darauf begrenzt zu sein, PSA beinhalten. Beispielhafte Biomarker für ein Eierstockkrebs-Panel (z.B. Biomarker, die beim Einholen von Diagnoseinformationen über Eierstockkrebs nützlich sind) können, aber ohne darauf begrenzt zu sein, CA 125 beinhalten. Beispielhafte Biomarker für ein Herzkrankheit-Panel (z.B. Biomarker, die beim Einholen von Diagnoseinformationen über Herzkrankheit nützlich sind) können, aber ohne darauf begrenzt zu sein, Troponin T, Troponin I, CRP, Homocystein, Myoglobin und/oder Kreatinkinase beinhalten. Beispielhafte Biomarker für ein Atemwegskrankheit-Panel (z.B. Biomarker, die beim Einholen von Diagnoseinformationen über Atemwegskrankheit nützlich sind) können, aber ohne darauf begrenzt zu sein, Influenza A, Influenza B und respiratorisches Syncytial-Virus (RSV) beinhalten. In einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung können die Biomarker eines Panel mit Pathogenen (z.B. Bakterien, Viren, Parasiten) assoziiert sein oder sie auf andere Weise anzeigen, die mit STDs und/oder anderen Infektionskrankheiten verknüpft sind. In einigen Beispielen können die Biomarker eines Panel mit Antibiotikaresistenz gegen ein oder mehrere Pathogene assoziiert sein oder sie auf andere Weise anzeigen.
  • Gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung kann sich „nachweisen“ auf das Identifizieren der Anwesenheit, Abwesenheit und/oder Menge eines Targets beziehen, wie zum Beispiel ein Oligonukleotid, Gen, Kleinmolekül oder Protein, unter anderen beispielhaften Targets. Der Nachweis kann visuell und/oder mit Hilfe einer geeigneten Vorrichtung wie z.B. einem Scanner und/oder Detektor erfolgen. Ferner kann jede geeignete Analysetechnik zum Nachweisen verwendet werden, einschließlich, aber ohne darauf begrenzt zu sein, optischer Techniken. Nicht begrenzende Beispiele für Techniken, die beim Nachweisen gemäß der vorliegenden Offenbarung benutzt werden können, sind Absorbanz, Fluoreszenz, Chemilumineszenz und Elektrochemilumineszenz. In einigen Aspekten kann der Nachweis die Verwendung von ladungsträgergekoppelten Schaltungen (CCD) zur Bildgebung beinhalten, z.B. eine CCD-Kamera.
  • Der hierin verwendete Begriff „analysieren“ kann, aber ohne darauf begrenzt zu sein, das Bestimmen eines mit einer gegebenen Probe assoziierten Wertes oder Wertesatzes durch eine Messung beinhalten. Zum Beispiel, Analysieren gemäß einigen Beispielen der vorliegenden Offenbarung kann das Messen von Bestandteilexpressionsniveaus in einer Probe und das Vergleichen der Niveaus mit Bestandteilniveaus in einer Probe oder einem Satz von Proben von demselben Subjekt oder von einem oder mehreren anderen Subjekten beinhalten.
  • Vorrichtungen, die für verschiedene Ausgestaltungen der vorliegenden Offenbarung geeignet sind, können Point-of-Care-Tests beinhalten, z.B. um Diagnoseinformationen für Patienten an oder nahe dem Zeitpunkt und dem Ort der Patientenbetreuung zu erhalten. Zum Beispiel, die Vorrichtung kann tragbar und/oder eigenständig sein. Ferner können Vorrichtungen gemäß der vorliegenden Offenbarung zum Messen mehrerer Targets (z.B. Biomarker) gleichzeitig in einem Multiplex-Assay benutzt werden. In einigen Aspekten kann die Vorrichtung mikrofluidische Kanäle zum Durchführen eines Multiplex-Assay beinhalten.
  • Mikrofluidische Vorrichtungen können die Kinetik von Einfang oder Nachweis angesichts kleiner benutzter Volumen und des in den Prozessen involvierten laminaren Flusses verbessern. Auf einer Mikrofluidik-Plattform reicht beispielsweise ein relativ geringes Probenvolumen (z.B. in der Größenordnung von Mikrolitern (μl)) aus, um Niveaus für mehrere Biomarker zu messen. Darüber hinaus ergeben kleinere Volumen effizientere lokale Erwärmungs- und/oder Kühlprozesse, die z.B. zum Beschleunigen oder anderweitigen Erleichtern von thermisch induzierten Reaktionen nützlich sein können, wie zum Beispiel die Polymerasekettenreaktion (PCR).
  • In einigen Aspekten kann die Vorrichtung eine mikrofluidisch basierte Immunoassay-Nachweisvorrichtung sein, die eine mikrofluidische Scheibe, einen Motor zum Regeln der Schleuderrate der Scheibe und einen Detektor, wie einen optischen Leser, z.B. zum Messen von Biomarkern umfasst. Mikrofluidische Vorrichtungen gemäß der vorliegenden Offenbarung können beliebige der Merkmale enthalten, die in der am 7. August 2015 eingereichten provisorischen US-Anmeldung Nr. 62/202,353 offenbart sind, die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
  • Mikrofluidische Scheiben der vorliegenden Offenbarung können einen oder mehrere Kanäle umfassen, die eine Serie von miteinander verbundenen Kammern beinhalten, in denen Reagenzien und Probe gemischt und/oder durch Anwenden einer Zentrifugalkraft von Kammer zu Kammer bewegt werden können. So kann beispielsweise die mikrofluidische Scheibe die ein oder mehreren Kanäle, durch die Fluid fließt, und die Kammern bereitstellen, in denen Reagenzien gelagert und/oder mit einer Probe gemischt werden, die der Scheibe in einem Diagnose-Assay zugegeben wird. Im Allgemeinen kann die Drehzahl der mikrofluidischen Scheibe im Bereich von 50 bis 20.000 Umdrehungen pro Minute (RPM) wie von 100 bis 16.000 RPM, von 200 bis 5000 RPM oder von 500 bis 10.000 RPM liegen. Die Scheibe kann im Uhrzeigersinn, gegen den Uhrzeigersinn oder abwechselnd sowohl im Uhrzeigersinn als auch gegen den Uhrzeigersinn während eines Assay rotieren.
  • In einigen Beispielen kann die mikrofluidische Scheibe an ein mobiles Substrat angefügte Fängermoleküle enthalten, wie Microbeads, die verschiedene Prozesse (z.B. Bindung, Trennung, Nachweis) des Assay erfahren können, durch Bewegen durch mikrofluidische Kanäle und Kammern der Scheibe. In wenigstens einem Beispiel kann die mikrofluidische Scheibe mehrere mit spezifischen Fängeroligonukleotiden konjugierte Microbeads enthalten. Zusätzlich oder alternativ kann die mikrofluidische Scheibe an ein stationäres Substrat angefügte Fängermoleküle enthalten, wie ein Microarray, die einen Teil einer/s mikrofluidischen Kammer oder Kanals der Vorrichtung bilden oder damit gekoppelt sein können. In wenigstens einem Beispiel kann die mikrofluidische Scheibe ein Microarray mit mehreren an die Microarray-Oberfläche angefügten Oligonukleotiden beinhalten. Andere Reagenzien als an ein Substrat gefügte Fängermoleküle können in Flüssigkeits-, Gel- oder lyophilisierter Form vorliegen. Wenn ein Teil der Reagenzien lyophilisiert ist, dann kann die in die mikrofluidische Scheibe zur Analyse eingeleitete Probe oder Probenkomponente die ein oder mehreren lyophilisierten Materialien rekonstituieren.
  • In einigen Beispielen kann die mikrofluidische Scheibe Oligonukleotide, die als Primer für eine Nukleinsäureamplifikationsreaktion dienen, und einen geeigneten Satz von Reagenzien für Bindungs-, Nachweis- und Trennprozesse enthalten. Zum Beispiel, die als Primer dienenden Oligonukleotide sind evtl. nicht an ein Substrat angefügt, sondern können stattdessen in eine oder mehrere Kammern oder Kanäle der mikrofluidischen Scheibe vorgeladen werden. So können sich nach dem Einleiten einer Probe in die mikrofluidische Scheibe in der Probe vorhandene Targets mit den Oligonukleotiden kombinieren, um das Target zu amplifizieren oder zu kopieren, um den Nachweis des Targets zu erleichtern.
  • Die ein oder mehreren Kanäle der mikrofluidischen Scheibe können eine beliebige geeignete Form haben, einschließlich z.B. rund, trapezförmig, dreieckig oder andere geometrische Formen. Kanäle können gerade, gekrümmte, zickzackförmige, U-förmige oder andere Konfigurationen haben, z.B je nach Anwendung und Funktion des Kanals. Kanalgrößen können auf der Basis von einem oder mehreren Faktoren wie Typ(en) und/oder Anzahl von zu analysierenden Targets (z.B. Biomarkern) in einer Probe, Typ(en) und/oder Anzahl von in der Scheibe zum Binden mit den ein oder mehreren Targets gespeicherten Fängermolekülen, Natur der Bindung zwischen Targets und Fängermolekülen, unter anderen Faktoren, ausgewählt werden. In einigen beispielhaften Scheiben können die Kanäle eine Tiefe von etwa 0,01 Mikron bis 5 Millimeter und eine Breite von 0,01 Mikron bis etwa 5 Millimeter haben. Zum Beispiel, die Kanäle können eine Tiefe im Bereich von etwa 0,05 Mikron bis etwa 5 Millimeter und einen Durchmesser von etwa 0,01 Mikron bis etwa 1 Zentimeter oder mehr haben. Die Fluidkapazität der Kanäle kann je nach Anwendung im Bereich von etwa 1 Nanoliter bis etwa 1 ml oder mehr liegen.
  • Jeder Kanal kann mit einem Einlass zum Einleiten der zu analysierenden Probe in Verbindung sein. Im Allgemeinen kann dem Einlass ein Aliquot der Probe (wie z.B. Vollblut oder anderes biologisches Fluid) im Bereich von etwa 1 μl bis etwa 300 μl oder mehr (~ ein bis mehrere Tropfen) zugegeben werden, wie zum Beispiel von etwa 1 μl bis etwa 280 μl, von etwa 1 μl bis etwa 250 μl, von etwa 1 μ1 bis etwa 220 μl, von etwa 1 μl bis etwa 200 μl, von etwa 1 μl bis etwa 180 μl, von etwa 1 μl bis etwa 150 μl, von etwa 1 μl bis etwa 120 μl, von etwa 1 μl bis etwa 100 μl, von etwa 1 μl bis etwa 80 μl, 1 μl bis etwa 80 μl, von etwa 1 μl bis etwa 40 μl, von etwa 1 μl bis etwa 20 μl, von etwa 1 μl bis etwa 6 μl, von etwa 20 μl bis etwa 250 μl, von etwa 20 μl bis etwa 200 μl, von etwa 50 μl bis etwa 100 μl, von etwa 50 μl bis etwa 250 μl, von etwa 100 μl bis etwa 200 μl, von etwa 5 μl bis etwa 80 μl oder von etwa 2 μl bis etwa 5 μl. Zum Beispiel kann ein Aliquot von Probe von etwa 1 μl, etwa 2 μl, etwa 3 μl, etwa 4 μl, etwa 5 μl, etwa 6 μl, etwa 20 μl, etwa 40 μl, etwa 60 μl, etwa 80 μl, etwa 100 μl, etwa 120 μl, etwa 150 μl, etwa 180 μl, etwa 200 μl, etwa 220 μl, etwa 240 μl, etwa 250 μl, etwa 280 μl oder etwa 300 μl benutzt werden. Während die Scheibe rotiert, kann die Probe durch Zentrifugalkraft durch die ein oder mehreren Kanäle radial auswärts fließen.
  • Die mikrofluidischen Scheiben können aus einem beliebigen Material oder einer Kombination von für das Assay geeigneten Materialien gefertigt sein. Zum Beispiel, die mikrofluidische Scheibe kann eine oder mehrere Polymere oder Copolymere umfassen. Beispiele für für die mikrofluidischen Scheiben hierin geeignete Materialien sind, aber ohne darauf begrenzt zu sein, Polypropylen, Polystyrol, Polyethylen, Acrylate wie Poly(methylmethacrylat) (PMMA), cyclische Olefinpolymere (COP), cyclische Olefin-Copolymere (COP), Polydimethylsiloxan (PDMS), Polyacrylamide und Kombinationen davon.
  • 1A zeigt ein Beispiel für für einige Assays geeignete mikrofluidische Scheibe 100 gemäß der vorliegenden Offenbarung, in der Microbeads benutzt werden. Wie gezeigt, umfasst die Scheibe 100 einen mikrofluidischen Kanal, der eine Serie von miteinander verbundenen Kammern umfasst, durch die Fluid während eines Assay fließen kann, nur für illustrative Zwecke. Die Scheibe 100 kann mehrere Kanäle beinhalten, die an unterschiedlichen radialen Positionen angeordnet sind (siehe z.B. 2). Wie gezeigt, kann der Kanal beispielsweise wenigstens einen Probeneinlass 102, wenigstens eine Probenvorbereitungskammer 104, wenigstens eine Reaktionskammer 106, wenigstens eine Trennkammer 108 und wenigstens eine Nachweiskammer 110 beinhalten. Die Scheibe 100 kann eine zentrale Öffnung 105 beinhalten, z.B. zum Koppeln der Scheibe 100 mit einer angetriebenen Komponente, um die Scheibe 100 während eines Assay in Drehung zu versetzen.
  • Die Kombination, Typen und Sequenz von Kammern wie in 1A gezeigt sind lediglich illustrativ. Anzahl und Design der Kammern können an die jeweiligen nachgewiesenen Targets und die verwendeten Reagenzien angepasst werden. Zum Beispiel, die Scheibe 100 beinhaltet evtl. keine Probenvorbereitungskammer 104, z.B. wenn das Assay keine Probenverarbeitung vor dem Kombinieren mit in die Scheibe 100 vorgeladenen Reagenzien beinhaltet. Ferner beinhaltet die Scheibe zum Beispiel evtl. keine Reaktionskammer 106, z.B. dann, wenn das Assay keinen Reaktionsschritt vor dem Einfangen von Targets durch ein Microarray-Substrat beinhaltet.
  • In einer beispielhaften Prozedur wird eine Probe, z.B. eine Blutprobe, die die Targets von Interesse beinhaltet, dem Probeneinlass 102 der mikrofluidischen Scheibe 100 zugegeben. Die Probenvorbereitungskammer 104 kann Vorverarbeitung der Probe vor dem Mischen mit in der Scheibe 100 gespeicherten Reagenzien ermöglichen. Zum Beispiel, verschiedene Komponenten der Probe können getrennt werden, z.B. über ein Filter oder aufgrund der Konfiguration des Kanals, so dass nur ein Teil der ursprünglichen Probe durch den Kanal zu nachfolgenden Kammern zur Analyse fließt. Zum Beispiel, der Probeneinlass 102 kann zum Trennen von Vollblut in Plasma, Serum und Zellkomponenten konfiguriert sein. In einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung kann die Probenvorbereitungskammer 104 Reagenzien umfassen, um bei Lyse und/oder Größentrennung von in der Probe vorliegenden Oligonukleotiden zu assistieren.
  • Je nach dem benutzten Probenverarbeitungstyp kann die Scheibe 100 zusätzliche Probenvorbereitungskammern 104 in Sequenz beinhalten, z.B. zum Durchführen unterschiedlicher Verarbeitungsschritte, während die Probe durch den Kanal fließt. Ferner kann die Scheibe 100 in einigen Beispielen eine Trenn- oder Sedimentationskammer hinter der Probenvorbereitungskammer 104 zum Trennen von Zellmaterial vom flüssigen Überstand beinhalten (der die nachzuweisenden und zu analysierenden Targets umfasst) (siehe z.B. die am 7. August 2015 eingereichte provisorische US-Anmeldung Nr. 62/202,353, die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist). Wenn das Assay keine Verarbeitung der Probe vor dem Kombinieren mit in der Scheibe 100 gelagerten Reagenzien beinhaltet (z.B. Verarbeitung ist nicht nötig/gewünscht oder Verarbeitung erfolgt vor dem Einleiten der Probe in die Scheibe 100), dann enthält die Scheibe 100 evtl. keine Probenvorbereitungskammern 104.
  • In einigen Aspekten kann die Probe dann weiter durch den Kanal fließen, um zum Kombinieren mit in die Reaktionskammer 106 vorgeladenen Reagenzien in diese einzutreten. In einigen Beispielen kann die Menge an mit Reagenzien zur Analyse gemischter Probenkomponente (z.B. Blutplasma) allgemein im Bereich von etwa 1 μl bis etwa 6 μl liegen. Zum Beispiel, die Menge an Probe oder Probenkomponente, die für ein Multiplex-Assay gemäß der vorliegenden Offenbarung ausreicht, kann im Bereich von etwa 2 μl bis etwa 5 μl liegen, z.B. ein Aliquot von Probe von etwa 1 μl, etwa 2 μl, etwa 3 μl, etwa 4 μl, etwa 5 μl oder etwa 6 μl.
  • Der Begriff „Reaktionskammer“ soll eine Kammer umfassen, in der verschiedene Typen von Reaktionen und/oder anderen Interaktionen zwischen Targetanalyten und in die Scheibe vorgeladenen Reagenzien erfolgen kann, und ist nicht als auf einen bestimmten Typ von chemischer Reaktion oder Interaktion begrenzt anzusehen. Zum Beispiel, die Reaktionskammer 106 kann zum Binden oder Hybridisieren an ein Target ausgelegte Reagenzien und/oder für eine Amplifikation eines Targets ausgelegte Reagenzien beinhalten. So können zum Beispiel an Microbeads (siehe z.B. 3B) angefügte Fängermoleküle und/oder Primer-Oligonukleotide für eine Amplifikationsreaktion in der Reaktionskammer 106 enthalten sein. In wenigstens einigen Beispielen kann die Reaktionskammer 106 zum Regeln der Menge an Probe konfiguriert sein, die in eine nachfolgende Kammer (z.B. die Trennkammer 108) eintreten darf, so dass ein Teil der Reaktionskammer 106 als Dosierkammer dient. Zusätzliche Beispiele zum Dosieren der Probe werden nachfolgend erörtert.
  • Wenn das Assay mehrere Reaktionsschritte beinhaltet, dann kann die Scheibe 100 zwei oder mehr Reaktionskammern 106 in Folge beinhalten, wobei jede Reaktionskammer 106 die zweckmäßigen Reagenzien für die Reaktion beinhaltet. Zum Beispiel, die Scheibe 100 kann zwei oder mehr Reaktionskammern 106 zum Ausführen verschiedener Schritte des Assay beinhalten, z.B. eine erste Reaktionskammer 106, die einen ersten Satz von Reagenzien zum Amplifizieren eines Targets enthält, gefolgt von einer zweiten Reaktionskammer 106, die einen zweiten Satz von Reagenzien zum Binden des amplifizierten Targets mit Fängermolekülen enthält. Die Reaktionskammer(n) 106 kann/können mit einer oder mehreren Abfallkammern zum Aufnehmen und Lagern von überschüssiger Probe und/oder überschüssigen Reagenzien in Verbindung sein.
  • Hinter der/den Reaktionskammer(n) 106 fließt die Probe weiter durch den Kanal und tritt in die Trennkammer 108 ein. Die Trennkammer 108 kann als Substrate dienende Microbeads umfassen, z.B. Fängermoleküle, die an die Microbeads angefügt sind, um Fängermolekül-Microbead/Target-Komplexe zu bilden, wenn sie mit Targets in einer Probe kombiniert werden; siehe 3B. Die Trennkammer 108 kann zum Trennen der Microbeads von anderen Reagenzien konfiguriert sein. Zum Beispiel, die Trennkammer 108 kann ein Dichtemedium umfassen, z.B. mit einer Dichte, die geringer als die der Microbeads und größer als die von ungebundenen Reagenzien ist. Ein Beispiel für Dichtemedien ist Ficoll, aber es können auch andere Materialien mit zweckmäßigen Dichtecharakteristiken verwendet werden. Die Microbeads können sich aufgrund von Zentrifugalkräften von der rotierenden Scheibe 100 durch das Dichtemedium bewegen, um sich in einem Pellet in der Nachweiskammer 110 zu sammeln, während ungebundene Reagenzien in der Trennkammer 108 verbleiben. Das Pellet kann dann von einem Detektor analysiert werden, um die Anwesenheit und/oder Konzentration von Targets zu bestimmen und zu analysieren. Die Formen der Trennkammer 108 und der Nachweiskammer 110 können zum Erleichtern der Passage der Microbeads durch das Dichtemedium und zum Sammeln am Ende des Kanals ausgelegt sein. Zum Beispiel, die Nachweiskammer 110 kann eine allgemein konische, V-förmige Basis wie in 1A gezeigt oder eine beliebige andere geeignete Form haben.
  • Wenn das Nachweisverfahren Chemilumineszenz oder Elektrochemilumineszenz ist, dann kann die Scheibe 100 ein geeignetes Substrat/Reagens beinhalten, das in die Nachweiskammer 110 vorgeladen ist, so dass der Fängermolekül-Microbead/Target-Komplex mit dem Substrat/Reagens reagieren kann, um Licht (z.B. ultraviolettes, sichtbares oder infrarotes Licht) für den Nachweis zu erzeugen. In einigen Aspekten kann das Substrat/Reagens in einer separaten Reservoir-Kammer vorhanden sein und dem Pellet in derselben Kammer, in der das Pellet erzeugt wird (z.B. die Nachweiskammer 110), oder in einer separaten Kammer zugegeben werden, in der das Pellet und das Substrat/Reagens kombiniert werden.
  • In einigen Beispielen kann die Scheibe 100 Merkmale zum Regeln des Fluidflusses beinhalten. Zum Beispiel, die Scheibe 100 kann ein Ventilsystem mit relativ engen Kanälen oder Berstventile zum Regeln von Fluidfluss beinhalten. Wie in 1A gezeigt, kann die Scheibe 100 ein Ventil 111 zwischen einer Probenvorbereitungskammer 104 und einer Reaktionskammer 106 aufweisen. Zusätzlich oder alternativ kann die Scheibe 100 ein Ventil 111 zwischen einer Reaktionskammer 106 und einer Trennkammer 108, zwischen zwei Reaktionskammern 106 oder zwischen beliebigen anderen hierin erörterten Kammern aufweisen. Die ein oder mehreren Ventile 111 können einem Fluidstrom durch die Kanäle widerstehen, bis die Kraft ausreicht, um einen solchen Widerstand zu überwinden. Ein Beispiel für Kraft zum Überwinden eines solchen Widerstands kann durch Schleudern der Scheibe mit einer Schwellendrehzahl angewandte Zentrifugalkraft beinhalten. Jedes Ventil kann so ausgelegt oder justiert werden, dass es einer oder mehreren bestimmten Drehzahlen entspricht, z.B. damit auf unterschiedliche Kammern selektiv zugegriffen werden kann, um das Fluid zu einer gewünschten Zeit gemäß den Vorgängen der Vorrichtung zu bewegen. In einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung kann die Scheibe 100 eine Luftkammer oder eine Druckspeicherkammer umfassen, wie in der am 7. August 2015 eingereichten provisorisichen US-Anmeldung Nr. 62/202,353 erörtert, die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
  • 1B zeigt eine beispielhafte mikrofluidische Scheibe 140, die für einige Assays gemäß der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, z.B. in der ein Microarray zum Nachweisen von Targets benutzt wird. Die Scheibe 140 ist mit einem mikrofluidischen Kanal nur für illustrative Zwecke zu sehen; die Scheibe 140 kann mehrere Kanäle beinhalten, die in unterschiedlichen radialen Positionen angeordnet sind (siehe z.B. 2). Der in 1B illustrierte Kanal kann wenigstens einen Probeneinlass 142, wenigstens eine Probenvorbereitungskammer 144, wenigstens eine Reaktionskammer 146 und wenigstens eine Array-Kammer 149 beinhalten.
  • Die Scheibe 140 kann beliebige der oben erörterten Merkmale der Scheibe 100 aufweisen. Zum Beispiel, die Scheibe 140 kann eine zentrale Öffnung 145, z.B. um die Scheibe 140 durch eine angetriebene Komponente in Drehung zu versetzen, und ein oder mehrere Ventile 151 zwischen den Kammern zum Regeln des Fluidflusses aufweisen. Ferner können der Probeneinlass 142, die Probenvorbereitungskammer 144 und die Reaktionskammer 146 beliebige der Merkmale des Probeneinlasses 102, der Probenvorbereitungskammer 104 und der Reaktionskammer 106 der Scheibe 100 aufweisen.
  • Wenn ein Microarray als Substrat für Fängermoleküle benutzt wird, dann kann die Array-Kammer 149 das Microarray-Substrat enthalten oder als solches dienen. Zum Beispiel, Fängermoleküle können an die Oberfläche der Array-Kammer 149 zum Binden an oder Hybridisieren mit in der Probe vorhandene(n) Targets angefügt sein (siehe z.B. 3A). Wie oben erörtert, kann das Microarray zum Nachweisen von einem Target (z.B. das Microarray mit Fängermolekülen, die für ein einzelnes Target spezifisch sind) oder von mehreren unterschiedlichen Targets ausgelegt sein (z.B. das Microarray mit einem Satz von Fängermolekülen, wobei jedes Fängermolekül für ein anderes Target spezifisch ist und ein anderes Merkmal des Microarray definiert). Es ist zu bemerken, dass in einigen Assays die nachzuweisenden Targets an Fängermoleküle eines Microarray gebunden oder damit hybridisiert sein können, ohne zunächst die Probe mit Reagenzien zur Reaktion zu bringen. In solchen Fällen beinhaltet die Scheibe 140 evtl. keine Reaktionskammer 146, so dass der Probeneinlass 142 oder die Probenvorbereitungskammer 144 in eine Array-Kammer 149 führen kann.
  • In einigen Aspekten kann die Array-Kammer 149 Nachweismoleküle beinhalten, die für die Targets spezifisch oder dazu komplementär sind, um beim Nachweis zu assistieren. Die Nachweismoleküle können mit den Targets kombiniert werden, bevor oder nachdem sich die Targets an die Fängermoleküle des Microarray gebunden haben.
  • Nach der Bindung der Targets an die Fängermoleküle des Microarray kann die Array-Kammer 149 mit einer Pufferlösung gewaschen werden, z.B. um eventuelle ungebundene oder unreagierte Reagenzien zu entfernen. Die Pufferlösung kann durch Aktivieren von einer oder mehreren Reservoir-Kammern in Verbindung mit der Array-Kammer 149 eingeleitet werden. Die Reservoir-Kammern können beispielsweise durch Schleudern der Scheibe 140 mit einer Schwellendrehzahl aktiviert werden, um Ventile zwischen der Array-Kammer 149 und den ein oder mehreren Reservoiren zu öffnen. Nach dem Waschen kann das Microarray mit einem Detektor abgetastet oder abgebildet werden, um die Targets in der Probe zu analysieren. Eine solche Analyse kann das Identifizieren und/oder Quantifizieren von einer oder mehreren Abfragepositionen (z.B. Targetnukleotidsequenz) in den Targets beinhalten. Zum Beispiel, an Merkmale eines Microarray in der Array-Kammer 149 gebundene Targets können mit einer CCD-Kamera abgebildet werden, um die relative Intensität jedes Merkmals des Microarray nachzuweisen und zu messen. Die Position jedes Merkmals kann mit einem spezifischen Fängermolekül assoziiert sein (z.B. einem Aptamer oder Oligonukleotid mit bekannter Nukleinsäuresequenz), so dass die Positionen der Merkmale zum Identifizieren der nachgewiesenen Targets benutzt werden können. In einigen Beispielen kann die Intensität jedes Merkmals zum Bestimmen der Konzentration des Targets in der Probe benutzt werden (z.B. auf der Basis einer bekannten Beziehung oder Korrelation von Intensität zu Targetkonzentration). Der Nachweis kann in einem Einzelfarbmodus oder einem Doppelfarbmodus erfolgen. Ein Doppelfarbmodus kann beispielsweise in einer Vergleichsstudie nützlich sein, um eine relative Kopiezahl von Genen oder eine Überexpression oder Unterexpression spezifischer Gene oder Proteine in einer Kontrollprobe (z.B. gesunder Patient) im Vergleich zu einer unbekannten Probe zu bestimmen.
  • 1C zeigt eine beispielhafte mikrofluidische Scheibe 180, die für einige Assays gemäß der vorliegenden Offenbarung wie Assays geeignet ist, die keine Microbeads und kein Microarray zum Nachweisen von Targets benutzen. Die Scheibe 180 ist mit einem mikrofluidischen Kanal nur für illustrative Zwecke dargestellt; die Scheibe 180 kann mehrere Kanäle beinhalten, die in unterschiedlichen radialen Positionen angeordnet sind (siehe z.B. 2). Der in 1C illustrierte Kanal kann wenigstens einen Probeneinlass 182, wenigstens eine Probenvorbereitungskammer 184, wenigstens eine Reaktionskammer 186 und wenigstens eine Amplifikations- und Nachweiskammer 190 beinhalten.
  • Die Scheibe 180 kann beliebige der Merkmale der Scheiben 100 und/oder 140 wie oben erörtert aufweisen. Zum Beispiel, die Scheibe 180 kann eine zentrale Öffnung 185, z.B. um die Scheibe 180 durch eine angetriebene Komponente in Drehung zu versetzen, und ein oder mehrere Ventile 191 zwischen Kammern aufweisen, um Fluidfluss zu regeln. Ferner können der Probeneinlass 182, die Probenvorbereitungskammer 184 und die Reaktionskammer 186 beliebige der Merkmale der Probeneinlässe 102, 142, Probenvorbereitungskammern 104, 144 und Reaktionskammern 106, 146 der Scheiben 100 und 140 wie oben erörtert aufweisen.
  • Die Reaktionskammer 186 und/oder die Amplifikations- und Nachweiskammer 190 können Reagenzien zum Amplifizieren von einem oder mehreren Targetoligonukleotiden in der Probe enthalten. Die amplifizierten Targets können dann z.B. ohne Verwendung eines Substrats nachgewiesen werden. In einigen Beispielen kann die Amplifikationsreaktion ein Nebenprodukt (z.B. Phosphat) erzeugen, das in dem Probenfluid unlöslich sein kann. In solchen Fällen kann der Fortschritt der Reaktion z.B. durch Messen der Trübung in der Amplifikations- und Nachweiskammer 190 im Laufe der Zeit überwacht werden. In anderen Beispielen kann die Amplifikations- und Nachweiskammer 190 Fängermoleküle mit spezifischen, relativ kurzen Sequenzen enthalten, die einen Quencher und einen nachweisbaren Tag (z.B. einen fluoreszierenden Tag) nahe beieinander haben. Wenn die Fängermoleküle in Anwesenheit einer komplementären Targetsequenz sind, dann können sie mit dem Target hybridisieren und dabei können Quencher und nachweisbarer Tag auseinander gedrückt werden. Nach dem Auseinanderdrücken des nachweisbaren Tag und des Quenchers kann zugelassen werden, dass der Tag ein Signal erzeugt. Zum Beispiel, es kann zugelassen werden, dass ein fluoreszierender Tag Licht emittiert.
  • Wie oben erwähnt, können einige Kammern einer mikrofluidischen Scheibe eine Dosierfunktion ausüben, z.B. zum Regulieren einer Menge von Probe, die in eine nachfolgende Kammer eintritt. Zusätzlich oder alternativ kann die Scheibe eine separate Dosierkammer beinhalten. In einigen Beispielen können die mikrofluidischen Scheiben hierin eine oder mehrere Dosierkammern zum Aufteilen einer Probe zwischen mehreren nachfolgenden Kammern umfassen, z.B. zum Ausmessen des geeigneten Probenvolumens zur Analyse, während die Probe während eines Assay radial auswärts fließt. Mit Bezug auf 1A, zum Beispiel, die Scheibe 100 kann eine Dosierkammer beinhalten, die die Probenvorbereitungskammer 104 mit mehreren Reaktionskammern 106 mit demselben oder etwa demselben Radius verbindet. So kann die verarbeitete Probe nach dem anfänglichen Verarbeiten einer rohen Probe in der Probenvorbereitungskammer auf zwei oder mehr Reaktionskammern 106 aufgeteilt werden, die jeweils für ein anderes Target spezifische Reagenzien enthält. Jede Reaktionskammer 106 kann dann mit einer anderen Trennkammer 108 zum Nachweisen und Analysieren der unterschiedlichen Targets in Verbindung sein. Zusätzlich oder alternativ kann die Scheibe 100 eine Dosierkammer zwischen zwei Reaktionskammern 106 beinhalten, z.B. zum Aufteilen der Probe nach einer ersten Reaktion in mehrere Aliquote vor einer zweiten Reaktion. Zum Beispiel, die Scheibe 100 kann eine erste Reaktionskammer 106 beinhalten, die einen Satz von Reagenzien zum Amplifizieren von einem oder mehreren Targets in der Probe enthält, während die erste Reaktionskammer 106 in eine Dosierkammer führt, um die Probe mit den ein oder mehreren amplifizierten Targets zwischen mehreren zweiten Reaktionskammern 106 aufzuteilen. Jede zweite Reaktionskammer 106 kann einen Satz von Reagenzien zum Binden der ein oder mehreren amplifizierten Targets mit unterschiedlichen Typen von Fängermolekülen enthalten. Die Scheibe(n) 140 und/oder 180 kann/können ebenfalls solche Dosierkammern enthalten. Dosierkammern werden in Verbindung mit 2 ausführlicher erörtert.
  • 2 zeigt eine beispielhafte mikrofluidische Scheibe 200, die mehrere mikrofluidische Kanäle gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung umfasst, wobei die Scheibe 200 für ein Multiplex-Assay geeignet ist. Jeder Kanal kann wenigstens einen Probeneinlass 202, wenigstens eine Probenvorbereitungskammer 204, wenigstens eine Dosierkammer 206, wenigstens eine Reaktionskammer 207, wenigstens eine Trennkammer 208 und wenigstens eine Nachweiskammer 210 beinhalten oder damit in Verbindung sein. Zum Beispiel, die Kanäle können in regelmäßig beabstandeten Intervallen radial auswärts verlaufen. In einigen Aspekten kann die Anzahl von Trennkammern 208 und Nachweiskammern 210 (zum Nachweisen eines Targets) größer sein als die Anzahl von Probeneinlässen 202. Wie gezeigt, beinhaltet die Scheibe 200 zum Beispiel 12 Probeneinlässe 202, die jeweils in eine Probenvorbereitungskammer 204 führen. Jede der 12 Probenvorbereitungskammern 204 ist mit 5 Dosierkammern 206 in Verbindung. Jede Dosierkammer 206 führt in eine Reaktionskammer 207 (z.B. wo Reagenzien in die Scheibe 200 vorgeladen werden können), eine Trennkammer 208 und eine Nachweiskammer 210. So kann die Scheibe 200 insgesamt 60 Kanäle haben, so dass 12 unterschiedliche Proben analysiert werden können, und wenigstens 5 unterschiedliche Targets pro Probe (z.B. wenn jede Reaktionskammer 207 für ein anderes Target spezifische Reagenzien beinhaltet). Jeder Kanal kann ein oder mehrere Ventile ähnlich den Ventilen 111, 151 und 191 von 1A–1C beinhalten. Die mikrofluidische Scheibe 200 kann eine zentrale Öffnung 205 ähnlich den Öffnungen 105, 145 und 185 der Scheiben 100, 140 und 180 in 1A–1C beinhalten. Die Scheibe 200 kann beliebige der oben für die Scheiben 100, 140 und/oder 180 von 1A–1C erörterten Merkmale wie eine Array-Kammer, mehrere Reaktionskammern und/oder mehrere Dosierkammern aufweisen.
  • Mikrofluidische Scheiben gemäß der vorliegenden Offenbarung können so ausgelegt werden, dass sie unterschiedliche Assay-Typen durchführen. Die 4, 5 und 6 sind Ablaufdiagramme, die die Schritte von mehreren beispielhaften Assays mit Hilfe einer mikrofluidischen Scheibe umreißen, die beliebige der Merkmale der oben erörterten mikrofluidischen Scheiben 100 und/oder 200 aufweisen. 4 zeigt zum Beispiel die Schritte eines Assay, das in einer mikrofluidischen Scheibe durchgeführt werden kann, die wenigstens einen Einlass, eine Probenvorbereitungskammer, eine oder mehrere Reaktionskammern, eine Trennkammer und eine Nachweiskammer umfasst. Oligonukleotide mit einer bekannten Nukleotidsequenz komplementär zur Sequenz eines Targets von Interesse können an Microbeads angefügt sein, die in die Reaktionskammer vorgeladen sein können.
  • In dem Assay kann eine Probe wie eine rohe Blutprobe z.B. mit einer Pipette oder einer anderen geeigneten Injektionsvorrichtung in den Einlass der Scheibe eingeleitet werden. Nach dem Drehen der Scheibe kann Fluid durch die Kanäle radial auswärts vom Einlass zur Probenvorbereitungskammer zur Lyse des Zellmaterials fließen. Die Probe kann dann zu einer Reaktionskammer zum Binden der Targets an Fängermoleküle, die an die Microbeads angefügt sind und an Nachweismoleküle weitergehen. Die Bindung kann während einer Inkubationsperiode erfolgen. Die so in der Probe gebildeten Microbead/Target-Komplexe können weiter zur Trennkammer verlaufen, die ein Dichtemedium umfasst, um die Komplexe von ungebundenen Reagenzien zu trennen. Schließlich können die Komplexe weiter zur Nachweiskammer in der Nähe des Randes der Scheibe gehen und sich als Pellet zum Nachweisen sammeln.
  • 5 zeigt die Schritte eines Assay mit einigen Schritten ähnlich denen von 4, aber es kann ein Microarray anstatt von Microbeads zum Binden an das/die Target(s) benutzt werden. Zum Beispiel, der in 5 umrissene Assay-Typ kann in einer mikrofluidischen Scheibe durchgeführt werden, die wenigstens einen Einlass, eine Probenvorbereitungskammer, eine oder mehrere Reaktionskammern und eine Array-Kammer umfasst. Oligonukleotide mit einer bekannten Nukleotidsequenz komplementär zur Sequenz eines Targets von Interesse können an das Microarray in der Array-Kammer angefügt sein. Die Array-Kammer kann auch für das Target von Interesse spezifische Nachweismoleküle beinhalten, um eine Markierung der an das Microarray gebundenen Targets, gefolgt von einem Nachweis zuzulassen.
  • Wie in den 4 und 5 gezeigt, können einige Assays Amplifikation von einem oder mehreren Target-Oligonukleotiden in der Probe vor dem Binden an in die mikrofluidische Scheibe vorgeladene Fängermoleküle und/oder zum Erleichtern des Nachweises der Targets beinhalten. Um den Nachweis spezifischer in der Probe vorhandener Sequenzen zu amplifizieren, kann das Assay einen Schritt zum Amplifizieren des genomischen Targetmaterials beinhalten. Zum Beispiel, das Assay kann eine Nukleinsäureamplifikationstechnik beinhalten, bei der eine oder mehrere Regionen eines in der Probe vorhandenen Targetoligonukleotids durch PCR oder isothermische Techniken amplifiziert werden kann. In einigen Aspekten kann zum Beispiel eine Reaktionskammer mehreren Temperaturgradienten ausgesetzt werden, um eine PCR-ähnliche Reaktion oder eine isothermische Amplifikationsreaktion zu erzeugen. Die Temperatur kann lokal an den Reaktionskammern und/oder innerhalb der Vorrichtung geregelt werden, um den gewünschten Gradienten zu erhalten. In wenigstens einem Beispiel kann in der Probe vorhandene RNA mit Reverse-Transkriptase-Enzymen behandelt werden, um die relative komplementäre DNA (cDNA) zu erhalten. Ferner kann das Assay zum Beispiel Amplifikation durch Verwenden von spezifischen oder unspezifischen Primern beinhalten, um eine Anreicherung spezifischer Regionen von Interesse des Targets oder eine ganze Genomamplifikation zu erzielen. Solche Amplifikationsprozesse können in Anwesenheit von nicht natürlichen Nukleotiden oder Nukleosiden durchgeführt werden und/oder können solche beinhalten, um spezifische biophysikalische Eigenschaften in den Oligonukleotiden wie Schmelztemperatur (Tm) zu erzielen.
  • Amplifikation von Targetsequenzen gemäß der vorliegenden Offenbarung können mit und/oder ohne Bias durchgeführt werden. Zum Beispiel, einige Assays können Amplifikation ohne Bias enthalten, wie eine ganze Genomamplifikation. Zum Beispiel, eine relativ geringe Menge an genomischem Targetmaterial (z.B. etwa 10 ng bis etwa 50 ng) in einer Probe kann repliziert werden, um eine größere Menge von Targets zu erhalten, die für den Nachweis besser geeignet ist. Bei der Amplifikation kann eine nachweisbare Markierung dem/den nachzuweisenden Target(s) zugegeben werden oder nicht.
  • In anderen Beispielen kann die Amplifikation polarisiert werden, wie durch Verwenden von Adhoc-Primern zum Amplifizieren spezifischer Sequenzen von Interesse der Targets. Polarisierte Amplifikationsreaktionen können beispielsweise zum Nachweisen der Anwesenheit eines spezifischen Gens, eines Satzes von Genen und/oder eines Teils eines Gens nützlich sein. Zum Beispiel, ein Assay kann durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob eine Probe einen spezifischen Bakterientyp enthält und ob die Bakterien gegenüber einem spezifischen Antibiotikum resistent sind. Das Assay kann spezifische Primer, die zum Amplifizieren des Teils des Genoms der Bakterien ausgelegt sind, der für die Identifikation dieser Bakterienspezies spezifisch ist, und Primer für die Amplifikation des bakteriellen Gens beinhalten, die eine Resistenz gegenüber einer gegebenen Klasse von Antibiotika anzeigen.
  • Die folgenden Beispiele (1) und (2) beschreiben Assays des in 4 gezeigten allgemeinen Typs.
  • (1) Nukleinsäuresonde auf Microbeads zum Nachweisen von Oligonukleotiden
  • In wenigstens einem Beispiel können Oligonukleotide (die natürliche und/oder nicht natürliche Nukleotide umfassen) mit bekannter/n Sequenz(en) und variabler Länge (z.B. mit 5 bis 10.000 Nukleotiden wie von 20 bis 5000 Nukleotide) auf der Oberfläche von Microbeads mit einem Durchmesser zwischen etwa 10 nm und 100 μm, wie zwischen 100 nm und 10 μm immobilisiert werden. Die Microbeads können in eine mikrofluidische Scheibe vorgeladen werden.
  • Eine genomisches Material umfassende Probe kann in einen Einlass der Scheibe eingeleitet werden. Die Scheibe kann dann mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden. Durch die Rotation der Scheibe erzeugte Zentrifugalkräfte können einen Fluss der Probe in eine Probenvorbereitungskammer bewirken, wo die Probe Reagenzien kontaktieren kann, die in die Probenvorbereitungskammer vorgeladen werden, die zum Extrahieren des genomischen Materials von der Probe z.B. über chemische oder physikalische Lyse ausgelegt ist.
  • Die Scheibe kann dann mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM in beiden Richtungen, z.B. abwechselnd im und gegen den Uhrzeigersinn, für eine Zeit zwischen 30 Sekunden und 30 Minuten geschleudert werden. Zum Beispiel, die Scheibe kann für weniger als jeweils 1 Sekunde, jeweils etwa 1 Sekunde, jeweils etwa 10 Sekunden, jeweils etwa 1 Minute, jeweils etwa 5 Minuten oder jeweils etwa 10 Minuten im und gegen den Uhrzeigersinn geschleudert werden, mit Wiederholungen bis zu einer Gesamtzeit zwischen etwa 30 Sekunden und etwa 30 Minuten. Die Rotationen im und gegen den Uhrzeigersinn brauchen nicht von identischer Dauer zu sein, so können z.B. die Rotationen im Uhrzeigersinn länger sein als die Rotationen gegen den Uhrzeigersinn. Ferner können aufeinander folgende Rotationen unterschiedliche Dauern haben.
  • Nach dem Extraktions-/Lyseschritt kann die Scheibe mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden und die verarbeitete Probe kann zu einer Trennkammer übertragen werden, um festes Zellmaterial vom flüssigen Überstand zu trennen. Zum Beispiel, die Scheibe kann mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um die Zellen vom Rest der Probe zu trennen. Dann kann der flüssige Überstand der das genomische Material, frei von Zellen, umfassenden Probe in eine erste Dosierkammer übertragen werden, wo die Probe in mehrere Reaktionskammern (erste Reaktionskammern) von identischen oder unterschiedlichen Volumen aufgeteilt werden kann. In einigen Aspekten kann die Übertragung des Überstands mit der Aktivierung einer Luftkammer erzielt werden, z.B. durch entsprechendes Regeln der Schleuderrate der Scheibe.
  • Die erste Dosierkammer kann über ein hydrophobes Ventil mit jeder der ersten Reaktionskammern verbunden werden. Die Scheibe kann dann mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um die Probe von der ersten Dosierkammer in die ersten Reaktionskammern zu bewegen. In den ersten Reaktionskammern kann das in der Probe vorhandene genomische Material mit vorgeladenen Reagenzien (die z.B. Primer, Enzyme, Pufferlösung, Fluoreszenzfarben, unter anderen geeigneten Reagenzien) interagieren können, die in den ersten Reaktionskammern vorhanden sind. Jede erste Reaktionskammer kann Reagenzien beinhalten, die für eine oder mehrere Abfragepositionen (z.B. Targetnukleotidsequenzen) in dem genomischen Material von Interesse spezifisch sind.
  • Die ersten Reaktionskammern können gegenüber mehreren Temperaturgradienten ausgesetzt werden, um eine PCR-ähnliche Reaktion oder eine isothermische Amplifikationsreaktion wie oben erörtert zu erzeugen. In einigen Aspekten können die Oligonukleotidprodukte der oben beschriebenen Reaktionen einem Lyseschritt unterzogen werden, um die Größe der Oligonukleotide zu regeln, z.B. so, dass sie 50 bis 10.000 Nukleotide umfassen.
  • Nach Abschluss der Reaktion kann die Scheibe mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um die reagierte Probe in eine zweite Dosierkammer zu übertragen, wo die Probe auf mehrere Reaktionskammern (zweite Reaktionskammern) von identischen oder unterschiedlichen Volumen aufgeteilt werden kann. Die zweite Dosierkammer kann über ein hydrophobes Ventil mit jeder der zweiten Reaktionskammern verbunden werden. Die Scheibe kann mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um das Produkt der Reaktion in die zweiten Reaktionskammern zu bewegen, die mit Microbeads vorgeladen sein können, konjugiert an Fängeroligonukleotide mit Sequenzen, die wenigstens teilweise komplementär zu den Sequenzen der Targets sind. So können beispielsweise die Targetoligonukleotide mit den Fängeroligonukleotide hybridisieren, um die Targets an die Microbeads zu fesseln. Die zweiten Reaktionskammern können ebenfalls Nachweismoleküle mit einer/m nachweisbaren Markierung oder Tag wie einem fluoreszierenden Tag beinhalten, wobei sich die Nachweismoleküle an den hybridisierten Target/Fängermolekül/Microbead-Komplex binden können.
  • Die Scheibe kann in beiden Richtungen z.B. mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM für eine Zeit zwischen 5 Minuten und 24 Stunden geschleudert werden. Während dieser Zeit können die zweiten Reaktionskammern auf einer konstanten Temperatur oder auf einem Gradienten von unterschiedlichen Temperaturen gehalten werden, z.B. zwischen 15°C und 95°C.
  • Nach Abschluss des Hybridisierungsreaktionsschrittes kann die Scheibe mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um die Microbeads in eine Nachweiskammer zu bewegen, die zumindest teilweise oder völlig mit Dichtemedium gefüllt ist. Das Dichtemedium kann so gewählt werden, dass es eine relative Dichte hat, die niedriger als die Microbeads und höher als die Reagenzien und unreagierten Komponenten in der Probe ist.
  • Die Scheibe kann mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, so dass sich die Microbeads am Boden der Nachweiskammer in Form eines Pellets absetzen können. Das so erzeugte Pellet kann durch Fluoreszenz oder mit anderen Methoden je nach der Natur der nachweisbaren Markierung nachgewiesen werden.
  • (2) Aptamere Sonden auf Microbeads zum Nachweisen von Targetanalyten
  • In wenigstens einem Beispiel können Oligonukleotide (die natürliche oder nicht natürliche Nukleotide umfassen) mit bekannter/n Sequenz(en) und von variabler Länge (z.B. mit 5 bis 10.000 Nukleotiden wie von 20 bis 1000 Nukleotiden) auf der Oberfläche von Microbeads mit einem Durchmesser zwischen etwa 10 nm und 100 μm wie zwischen 100 nm und 10 μm immobilisiert werden. Die Microbeads können in eine mikrofluidische Scheibe vorgeladen werden.
  • Die Sequenzen der Oligonukleotide (Aptamere) können so gewählt werden, dass sie eine starke und spezifische Bindungsinteraktion mit einem großen Satz von molekular und/oder klinisch relevanten Entitäten haben, einschließlich, aber ohne darauf begrenzt zu sein, Proteine oder Kleinmoleküle.
  • Eine Probe, die das Material von Interesse umfasst, kann dann in die mikrofluidische Scheibe eingeleitet werden. Die Scheibe kann dann bei einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um die Probe in die Probenvorbereitungskammer zu bewegen. Die Probenvorbereitungskammer kann Reagenzien zum Trennen von Zellmaterial enthalten, z.B. durch chemische oder physikalische Lyse.
  • Die Scheibe kann mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um die Zellen vom Rest der Probe zu trennen. In wenigstens einem Beispiel kann die Scheibe in beiden Richtungen, z.B. abwechselnd im und gegen den Uhrzeigersinn, mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um Lyse von Zellen in der Probe zu aktivieren und/oder um das Zellmaterial zu trennen.
  • Nach Abschluss des Trennschrittes kann die Scheibe mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert und die Probe in eine Dosierkammer übertragen werden, die über ein hydrophobes Ventil mit einer Serie von Reaktionskammern verbunden ist. In einigen Aspekten kann die Übertragung des Überstands mit der Aktivierung einer Luftkammer erzielt werden, z.B. durch geeignetes Regeln der Schleuderrate der Scheibe.
  • Die Scheibe kann dann mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um die Probe von der Dosierkammer in die Reaktionskammern zu bewegen. Jede Reaktionskammer kann mit den an Microbeads angefügten Aptameren, sowie Nachweismolekülen, die sich an die Targets binden können, vorgeladen werden. Beispielhafte Nachweismoleküle können, aber ohne darauf begrenzt zu sein, fluoreszent markierte Antikörper, fluoreszent markierte Proteine und andere fluoreszent markierte Moleküle beinhalten. Es können jedoch auch andere nachweisbare Tags als fluoreszierende Tags oder Markierungen benutzt werden.
  • Die Scheibe kann dann in beiden Richtungen, z.B. abwechselnd im und gegen den Uhrzeigersinn, mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM für eine Gesamtzeit zwischen 5 Minuten und 24 Stunden wie zwischen 5 Minuten und 1 Stunde geschleudert werden. Während dieser Zeit können die Reaktionskammern auf einer konstanten Temperatur und/oder auf einem Gradienten von unterschiedlichen Temperaturen wie zwischen 15°C und 95°C gehalten werden.
  • Nach Abschluss der Reaktion mit den Microbead-gebundenen Aptameren und Nachweismolekülen kann die Scheibe mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert und die Probe in eine Nachweiskammer übertragen werden, die teilweise oder völlig mit Dichtemedium gefüllt ist. Das Dichtemedium kann so gewählt werden, dass es eine relative Dichte hat, die niedriger als die Microbeads und höher als die Reagenzien und unreagierten Komponenten in der Probe ist.
  • Die Scheibe kann mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um es zuzulassen, dass sich die Beads am Boden der Nachweiskammer in Form eines Pellet absetzen. Das so erzeugte Pellet kann durch Fluoreszenz oder mit anderen Methoden je nach der Natur der nachweisbaren Markierung nachgewiesen werden.
  • Die folgenden Beispiele (3) und (4) beschreiben Assays des in 5 gezeigten allgemeinen Typs.
  • (3) Nukleinsäurenachweis durch Hybridisierung
  • In wenigstens einem Beispiel können Oligonukleotide (die natürliche und/oder nicht natürliche Nukleotide umfassen) mit bekannter/n Sequenz(en) und von variabler Länge (die z.B. 5 bis 10.000 Nukleotide wie 20 bis 5000 Nukleotide umfassen) auf einer Oberfläche, z.B. einem Microarray immobilisiert werden. Das Microarray kann mehrere Oligonukleotid-Fängermoleküle (Nukleinsäuresonden) beinhalten, die in einem vorbestimmten Muster verteilt sind, z.B. einer Konfiguration von Merkmalen, wobei das Sammeln von für ein Target spezifischen Fängermolekülen jedes Merkmal auf der Microarray-Oberfläche definiert. So können die topische Verteilung der Sonden und ihrer Sequenzen bekannt und auf eine vorbestimmte Weise organisiert sein. Die Größe jedes Merkmals auf der Oberfläche kann im Bereich von etwa 1 μm bis etwa 500 μm wie von etwa 50 μm bis etwa 150 μm, z.B. etwa 100 μm liegen. In einigen Beispielen kann die Gesamtzahl von Merkmalen auf dem Microarray im Bereich von 10 bis 100 Millionen wie von 50 bis 100.000 oder 100 bis 10.000 Merkmalen liegen.
  • Eine Probe, die das genomische Material von Interesse umfasst, kann in einen Einlass der Scheibe eingeleitet werden. Die Scheibe kann dann mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden. Durch die Rotation der Scheibe erzeugte Zentrifugalkräfte können einen Fluss der Probe in eine Probenvorbereitungskammer bewirken, wo die Probe in die Probenvorbereitungskammer vorgeladene Reagenzien kontaktieren kann, ausgelegt zum Extrahieren des genomischen Materials aus der Probe, z.B. über chemische oder physikalische Lyse.
  • Die Scheibe kann dann mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM in beiden Richtungen, z.B. abwechselnd im und gegen den Uhrzeigersinn, für eine Zeit zwischen 30 Sekunden und 30 Minuten geschleudert werden. Zum Beispiel, die Scheibe kann im und gegen den Uhrzeigersinn für jeweils 10 Sekunden, jeweils 1 Minute, jeweils 5 Minuten oder jeweils 10 Minuten geschleudert werden, mit Wiederholungen bis zu einer Gesamtzeit zwischen 30 Sekunden und 30 Minuten.
  • Nach dem Extraktions-/Lyseschritt kann die Scheibe mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert und die verarbeitete Probe in eine Trennkammer übertragen werden, um festes Zellmaterial vom flüssigen Überstand zu trennen. Zum Beispiel, die Scheibe kann mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um die Zellen vom Rest der Probe zu trennen. Dann kann der flüssige Überstand der Probe, der das genomische Material, frei von Zellen, umfasst, in eine Dosierkammer übertragen werden, die über ein hydrophobes Ventil mit mehreren Reaktionskammern verbunden ist. In einigen Aspekten kann die Übertragung des Überstands mit der Aktivierung einer Luftkammer erzielt werden, z.B. durch geeignetes Regeln der Schleuderrate der Scheibe.
  • Die Scheibe kann dann mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um die Probe von der Dosierkammer in die Reaktionskammern zu bewegen. In den Reaktionskammern kann das in der Probe vorliegende genomische Material mit in den Reaktionskammern vorhanden vorgeladenen Reagenzien (die z.B. Primer, Enzyme, Pufferlösung, Fluoreszenzfarben, unter anderen geeigneten Reagenzien enthalten können) interagieren. Jede Reaktionskammer kann Reagenzien enthalten, die für eine oder mehrere Abfragepositionen (z.B. Targetnukleotidsequenzen) in dem genomischen Material von Interesse spezifisch sind.
  • Die Reaktionskammern können mehreren Temperaturgradienten ausgesetzt werden, um eine PCR-ähnliche Reaktion oder eine isothermische Amplifikationsreaktion wie oben erörtert zu erzeugen. In einigen Aspekten können die Oligonukleotidprodukte der oben beschriebenen Reaktionen einem Lyseschritt unterzogen werden, um die Größe der Oligonukleotide zu regeln, z.B. so, dass sie 10 bis 10.000 Nukleotide umfassen.
  • Nach Abschluss der Reaktion kann die Scheibe mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um das Produkt der Reaktionen in jeweilige Array-Kammern in Verbindung mit den Reaktionskammern zu bewegen. Jede Array-Kammer kann denselben oder einen anderen Microarray-Typ beinhalten und kann auch für die nachzuweisenden Targets spezifische Nachweisreagenzien beinhalten.
  • Die Scheibe kann in beiden Richtungen, z.B. abwechselnd im und gegen den Uhrzeigersinn, mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM für eine Gesamtzeit zwischen 1 Minute und 24 Stunden geschleudert werden. Während dieser Zeit können die Array-Kammern auf einer konstanten Temperatur und/oder auf einem Gradienten von unterschiedlichen Temperaturen gehalten werden, z.B. zwischen 15°C und 95°C.
  • Nachdem sich die Targets an die Microarrays und Nachweismoleküle in den Array-Kammern gebunden haben, kann die Scheibe mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um die Probe (die ungebundene Komponenten umfasst) von den Array-Kammern zu jeweiligen Abfallkammern oder einer gemeinsamen Abfallkammer zu bewegen. Die Array-Kammer kann dann mit einer Pufferlösung durch Aktivieren von einer oder mehreren Reservoir-Kammern in Verbindung mit den Array-Kammern gewaschen werden. Zum Beispiel, zum Öffnen des Ventils zwischen den Reservoir- und Array-Kammern kann die Scheibe mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden. Nach dem Waschen können die Microarrays in den Array-Kammern abgetastet oder abgebildet werden, um die Abfragepositionen (Nukleotidsequenzen) von Interesse in dem genomischen Material der Probe zu analysieren und/oder zu quantifizieren.
  • (4) Nachweisen von Kleinmolekülen oder Proteinen durch Hybridisierung an aptameren Arrays
  • In wenigstens einem Beispiel können Oligonukleotide (die natürliche und/oder nicht natürliche Nukleotide umfassen) mit bekannten Sequenzen und von veränderlicher Länge (z.B. die 5 bis 5000 Nukleotide wie 20 bis 1000 Nukleotide umfassen) auf einer Oberfläche, z.B. einem Microarray immobilisiert werden. Ähnlich wie das Beispiel (3) oben können die topologischen Verteilungen von Oligonukleotid-Fängermolekülen (Nukleinsäuresonden) und deren Sequenzen bekannt und auf dem Microarray in einer vorbestimmten Weise organisiert sein. Die Größe jedes Merkmals auf der Oberfläche kann im Bereich von etwa 1 μm bis etwa 500 μm wie von 50 μm bis etwa 150 μm, z.B. bei etwa 100 μm liegen. In einigen Beispielen kann die Gesamtzahl von Merkmalen auf dem Microarray im Bereich von 10 bis 100 Millionen wie von 50 bis 100.000 liegen.
  • Die Sequenzen der Oligonukleotide (Aptamere) können so gewählt werden, dass sie eine starke und/oder spezifische Bindungsinteraktion mit einem relativ großen Satz von molekular und/oder klinisch relevanten Entitäten haben, einschließlich, aber ohne darauf begrenzt zu sein, Proteine oder Kleinmoleküle.
  • Eine Probe, die das genomische Material von Interesse umfasst, kann in einen Einlass der Scheibe eingeleitet werden. Die Scheibe kann dann mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um die Probe in die Probenvorbereitungskammer zu bewegen, wo die Probe mit vorgeladenen Reagenzien in Kontakt ist.
  • Durch die Rotation der Scheibe erzeugte Zentrifugalkräfte können bewirken, dass die Probe in eine Probenvorbereitungskammer fließt, wo die Probe in die Probenvorbereitungskammer vorgeladene Reagenzien kontaktieren kann, ausgelegt zum Extrahieren des genomischen Materials von der Probe, z.B. über chemische oder physikalische Lyse. Die Scheibe kann dann mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um die Zellen vom Rest der Probe zu trennen.
  • In einigen Beispielen kann die Scheibe in beiden Richtungen, z.B. abwechselnd im und gegen den Uhrzeigersinn mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um die in der Probe vorhandenen Lysezellen zu aktivieren.
  • Nach dem Extraktions-/Lyseschritt kann die Scheibe mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um die verarbeitete Probe in eine Dosierkammer zu bewegen, die über ein hydrophobes Ventil mit einer Serie von Array-Kammern verbunden ist. In einigen Aspekten kann die Übertragung des Überstands mit der Aktivierung einer Luftkammer erzielt werden, z.B. durch geeignetes Regeln der Schleuderrate der Scheibe.
  • Die Scheibe kann mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um die Probe von der Dosierkammer in die Array-Kammer zu bewegen. Die Array-Kammern können mit Nachweisreagenzien, z.B. Nachweismolekülen, vorgeladen werden. Beispielhafte Nachweismoleküle können, aber ohne darauf begrenzt zu sein, fluoreszent markierte Antikörper, fluoreszent markierte Proteine und andere fluoreszent markierte Moleküle beinhalten. Es können jedoch auch andere nachweisbare Tags als fluoreszierende Tags oder Markierungen verwendet werden.
  • Die Scheibe kann dann in beiden Richtungen, z.B. abwechselnd im und gegen den Uhrzeigersinn, mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM für eine Gesamtzeit zwischen 5 Minuten und 24 Stunden wie zwischen 5 Minuten und 1 Stunde geschleudert werden. Während dieser Zeit können die Array-Kammern auf einer konstanten Temperatur und/oder auf einem Gradienten von unterschiedlichen Temperaturen, z.B. zwischen 15°C und 95°C gehalten werden.
  • Nachdem sich die Targets an die Microarrays und Nachweismoleküle in den Array-Kammern gebunden haben, kann die Scheibe mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um die Probe (die ungebundene Komponenten umfasst) von den Array-Kammern zu jeweiligen Abfallkammern oder einer gemeinsamen Abfallkammer zu bewegen. Die Array-Kammer kann dann durch Aktivieren von einer oder mehreren Reservoir-Kammern in Verbindung mit den Array-Kammern mit einer Pufferlösung gewaschen werden. Zum Beispiel, zum Öffnen des Ventils zwischen den Reservoir- und Array-Kammern kann die Scheibe mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden. Nach dem Waschen können die Microarrays in den Array-Kammern abgetastet oder abgebildet werden, um die Abfragepositionen (Nukleotidsequenzen) von Interesse in dem genomischen Material der Probe zu analysieren und/oder zu quantifizieren.
  • (5) Nukleinsäureamplifikationsnachweis
  • 6 zeigt noch einen anderen Assay-Typ, der auf einer mikrofluidischen Scheibe gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung durchgeführt werden kann. In diesem Assay-Typ können Targets in der Probe wie oben erörtert amplifiziert (z.B. über eine PCR-ähnliche Reaktion oder eine isothermische Amplifikationsreaktion) und dann mit Nachweismolekülen zur Reaktion gebracht werden, um den Nachweis der Targets zuzulassen. Im Gegensatz zu den oben erörterten Beispielen (1)–(4) beinhaltet das Assay evtl. keine an einem Substrat (z.B. Microbeads oder ein Microarray) angefügten Fängermoleküle, um die Targets an das Substrat zum Nachweis zu binden. Stattdessen können die an die Nachweismoleküle gebundenen Targets in einer Nachweiskammer (oder einer Amplifikations- und Nachweiskammer) zum Nachweisen lokalisiert oder konzentriert sein, z.B. durch optischen Nachweis oder durch eine andere für den Tag des Nachweismoleküls zweckmäßige Nachweistechnik. Der Nachweis kann das Überwachen des Produkts einer Amplifikationsreaktion oder das Beobachten eines nachweisbaren Tag nach dem Trennen von einem Quencher wie oben erörtert beinhalten.
  • In wenigstens einem Beispiel können Oligonukleotide (die natürliche oder nicht natürliche Nukleotide umfassen) mit bekannten Sequenzen und von variabler Länge (z.B. zwischen 5 und 500 Nukleotiden) als Primer für eine Enzymkatalysierte Amplifikation von spezifischen Targetsequenzen in Oligonukleotiden von Interesse in der Probe benutzt werden.
  • In dem Assay kann eine das genomische Material von Interesse umfassende Probe in einen Einlass der Scheibe eingeleitet werden. Die Scheibe kann dann mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden. Die durch die Rotation der Scheibe erzeugten Zentrifugalkräfte können bewirken, dass die Probe in eine Probenvorbereitungskammer fließt, wo die Probe mit in die Probenvorbereitungskammer vorgeladenen Reagenzien in Kontakt kommen kann, ausgelegt zum Extrahieren des genomischen Materials aus der Probe, z.B. über chemische oder physikalische Lyse.
  • Nach dem Extraktions/Lyse-Schritt kann die Scheibe mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert und die verarbeitete Probe zu einer Trennkammer übertragen werden, um festes Zellmaterial vom flüssigen Überstand zu trennen. Zum Beispiel, die Scheibe kann mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um die Zellen vom Rest der Probe zu trennen. Dann kann der flüssige Überstand der Probe, der das genomische Material umfasst, frei von Zellen, in eine Dosierkammer übertragen werden, die über ein hydrophobes Ventil mit mehreren Reaktionskammern von identischen oder unterschiedlichen Volumen verbunden ist. In einigen Aspekten kann die Übertragung des Überstands mit der Aktivierung einer Luftkammer erzielt werden, z.B. durch zweckmäßiges Regeln der Schleuderrate der Scheibe.
  • Die Scheibe kann dann mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um die Probe von der Dosierkammer in die Reaktionskammern zu bewegen. In den Reaktionskammern kann das in der Probe vorhandene genomische Material mit in den Reaktionskammern vorhandenen vorgeladenen Reagenzien (die z.B. Primer, Enzyme, Pufferlösung, unter anderen geeigneten Reagenzien beinhalten können) interagieren. Jede Reaktionskammer kann Reagenzien beinhalten, die für eine oder mehrere Abfragepositionen (z.B. Targetnukleotidsequenzen) in dem genomischen Material von Interesse spezifisch sind.
  • Die Reaktionskammern können mehreren Temperaturgradienten ausgesetzt werden, um eine PCR-ähnliche Reaktion oder eine isothermische Amplifikationsreaktion wie oben erörtert zu erzeugen. Die Temperatur kann lokal an den Reaktionskammern und/oder innerhalb der Vorrichtung geregelt werden, um den gewünschten Temperaturgradienten zu erhalten.
  • In einigen Beispielen können die Reagenzien zum Nachweis in die Reaktionskammern vorgeladen werden, so dass der Fortschritt der Amplifikationsreaktion in Echtzeit und/oder nach Abschluss des Amplifikationsprozesses überwacht werden kann. Zusätzlich oder alternativ kann der Nachweis in separaten Nachweiskammern in Verbindung mit einer entsprechenden Reaktionskammer erfolgen. Zum Beispiel, nach Abschluss der Amplifikationsreaktion kann die Scheibe mit einer Drehzahl zwischen 100 und 16.000 RPM wie zwischen 500 und 10.000 RPM geschleudert werden, um die Produkte der Reaktion in die Nachweiskammern zu bewegen. In den Nachweiskammern können die amplifizierten Produkte mit den Nachweisreagenzien (z.B. Nachweismoleküle wie interkalierende Farbstoffe, fluoreszent markierte Sonden, unter anderen geeigneten Nachweismolekülen) reagieren, um eine Messung und Quantifizierung der Amplifikation von Targets zuzulassen und um die Anwesenheit der Abfragepositionen (z.B. Targetnukleotidsequenzen) in dem genomischen Material der Probe nachzuweisen.
  • Vorrichtungen gemäß der vorliegenden Offenbarung können zum Aufnehmen einer mikrofluidischen Scheibe zum Durchführen der Assays konfiguriert sein. 7 zeigt ein Beispiel für eine Vorrichtung, die eine Nachweiskomponente zum Nachweisen eines Targets (z.B. Biomarker) in den verschiedenen oben erörterten Assays umfasst. Wie in 7 gezeigt, kann die Vorrichtung eine mikrofluidische Scheibe 500, eine Energiequelle wie einen Motor 550 und eine Nachweiskomponente 560 umfassen. Die Scheibe 500 kann über eine Welle 540 operativ mit dem Motor 550 gekoppelt werden, so dass der Motor 550 die Scheibe 500 über die Welle 540 in Drehung versetzen kann. Der Motor kann die Rotation der Scheibe 500 gegen den Uhrzeigersinn (in Richtung des Pfeils wie in 5 gezeigt) und/oder im Uhrzeigersinn mit einer vorbestimmten Drehzahl oder einer Reihe vorbestimmter Drehzahlen regeln.
  • In einigen Aspekten kann die Vorrichtung zum Erhitzen bestimmter Kammern der Scheibe mit einer/m vorbestimmten Temperatur oder Temperaturgradienten wie während einer Amplifikationsreaktion oder einem anderen Reaktionstyp konfiguriert sein. Zum Beispiel, die Vorrichtung kann ein oder mehrere Heizelemente sehr nahe an der Scheibe 500 beinhalten, z.B. über und/oder unter der Scheibe 500. Die Position der Heizelemente kann dem/den Ort(en) der Kammer(n) der zu erhitzenden Scheibe 500 entsprechen, so dass die Erhitzung auf die gewünschte(n) Kammer(n) lokalisiert ist. In einigen Beispielen können die Kammern so ausgelegt sein, dass nur einige der Kammern (z.B. mit derselben radialen Distanz) von den Heizelementen erhitzt werden, während andere Kammern nicht erhitzt werden. In einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung können Teile der mikrofluidischen Scheibe ein Isoliermaterial oder Wärmeübertragungsmaterial umfassen, um eine lokalisierte Heizung von Kammern zu unterstützen.
  • Die Scheibe 500 kann beliebige der Merkmale der Scheiben 100, 140, 180 und/oder 200 wie oben erörtert beinhalten, einschließlich z.B. mehrere Kanäle 503 und eine zentrale Öffnung 505. Jeder Kanal 503 kann die richtigen Kammern und andere für das durchgeführte bestimmte Assay ausgelegte Merkmale beinhalten. Zum Beispiel, die Kanäle 503 können jeweiligen Kammern am äußersten Ende der Kanäle 503 beinhalten (z.B. Nachweiskammern oder Array-Kammern), in 7 sequentiell mit A-P beschriftet, die die von dem nachzuweisenden Assay produzierten markierten Targets enthalten können.
  • In einigen Beispielen kann die Nachweiskomponente 560 zum Nachweisen der Anwesenheit von Targets durch Messen von Signalen von an die Targets in jeweiligen Kammern A-P an oder nahe dem Rand der Scheibe 500 gebundenen Nachweismolekülen konfiguriert sein. Die Nachweiskomponente 560 kann zum Beispiel Absorbanz, Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder Elektrochemilumineszenz oder jeden anderen Typ von Signalen von einer an die Targets innerhalb der Kanäle 503 der Scheibe 500 gebundenen nachweisbaren Markierung nachweisen. Die Menge eines Targets in jeder Kammer A-P (und somit die Konzentration des Targets in der ursprünglichen Probe) kann auf der Basis des nachgewiesenen Signalpegels, von Orts- und/oder Konfigurationsinformationen für jede Kammer A-P und/oder Rotationscharakteristiken der Scheibe 500 nachgewiesen werden. Zum Beispiel, jede Kammer A-P kann für einen anderen Targettyp spezifische Reagenzien beinhalten, so dass die Position jeder Kammer relativ zu den anderen zum Identifizieren des nachgewiesenen Targets benutzt werden kann. Wenn das Sammeln von Signalen beginnt, wenn die Nachweiskomponente 560 mit der Kammer A ausgerichtet ist, während die Scheibe 500 rotiert, kann die Menge an von Kammer A emittiertem Signal von der Menge an von Kammern B-P emittiertem Signal auf der Basis von Drehzahl und Ort der Kammer A unterschieden werden. So kann für jede volle Rotation der Scheibe 500 die Nachweiskomponente 560 Signale für jede der Kammern A-P sammeln.
  • Wenn Microarrays als Substrate zum Binden an Targets verwendet werden, dann kann auch die vorbestimmte Konfiguration des Microarray (z.B. Anzahl und Position von jedem Target entsprechenden Merkmalen) zum Assoziieren des für das Microarray gemessenen Signals mit der Identität des das Signal erzeugenden Targets benutzt werden. Wenn die Kammern A-P unterschiedliche Targets enthalten (z.B. aufgrund der Verwendung unterschiedlicher Fängermoleküle und/oder unterschiedlicher Nachweismoleküle zum Binden an die Targets, wie oben erörtert), dann können die Konzentrationen mehrerer in der Probe vorhandener Targets gleichzeitig oder im Wesentlichen gleichzeitig nachgewiesen werden.
  • In einigen Aspekten kann die Nachweiskomponente 560 ein optischer Detektor mit einer Lichtquelle 565 zum Erzeugen von Licht, einem Detektor 567 und einer Optik 562 (z.B. Spiegel und/oder Linsen) zum Leiten von Licht von der Lichtquelle 565 zur Scheibe 500 und zum Umleiten von von der Scheibe 500 emittiertem Licht zum Detektor 567 sein. In wenigstens einer Ausgestaltung umfasst die Nachweiskomponente Lichtanregung bei verschiedenen Wellenlängen in der sichtbaren Region und auch außerhalb der sichtbaren Region, einschließlich, aber ohne Begrenzung, einer Laseranregung oder einer LED-(Leuchtdioden)-Anregung, und einen komplementären Metalloxidhalbleiter-(CMOS)-Sensor zum Nachweisen spezifischer Wellenlängen, unter Verwendung von einem oder mehreren geeigneten Filtern und/oder dichroitischen Strahlenteilern.
  • Die Nachweiskomponente 560 kann ferner einen Leser zum Analysieren von Daten vom Detektor 567 und einen Bildschirm zum Anzeigen des Ausgangs vom Leser beinhalten. Der Leser kann optisch sein. In einigen Ausgestaltungen kann die Nachweiskomponente 560 ein Abbildungssystem beinhalten, das z.B. eine CCD-(Charge Coupled Device)-Kamera umfasst. Der Ausgang vom Abbildungssystem kann auf einem Computerbildschirm oder einer anderen Benutzeroberfläche oder einer Sichtvorrichtung angezeigt werden, einschließlich, aber ohne Begrenzung, z.B. einer Flüssigkristallanzeige-(LCD)-Vorrichtung. In einigen Aspekten kann der Ausgang vom Abbildungssystem zu einer fernen Benutzeroberfläche wie einem Tablet-Computer oder einer anderen computergesteuerten Vorrichtung wie einem Laptop oder Smartphone übertragen werden. Die Daten können per drahtgebundener oder drahtloser Kommunikation wie zum Beispiel, aber ohne Begrenzung, Bluetooth übertragen und/oder auf fernen Servern z.B. im Internet Cloud gespeichert oder archiviert werden.
  • 8 zeigt ein Beispiel für ein Gehäuse 600 einer Vorrichtung gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung. Zum Beispiel, das Gehäuse kann die Vorrichtung von 7 enthalten. In einigen Aspekten kann das Gehäuse 600 eine Abdeckung (z.B. über Scharniere wie gezeigt oder über einen anderen geeigneten Mechanismus beweglich) und eine Tür 620 beinhalten, die zum Eingeben und Entnehmen einer mikrofluidischen Scheibe, z.B. einer der Scheiben 100, 200 oder 500, geöffnet und geschlossen werden.
  • Die Spezifikation und die Beispiele sind lediglich beispielhaft anzusehen, der wahre Umfang und das Wesen der vorliegenden Offenbarung werden durch die nachfolgenden Ansprüche angezeigt.

Claims (39)

  1. Vorrichtung, die Folgendes umfasst: eine Scheibe mit mehreren mikrofluidischen Kanälen, die in einer radialen Richtung der Scheibe verlaufen, wobei jeder mikrofluidische Kanal mehrere für wenigstens ein Target spezifische Fängermoleküle umfasst, ausgewählt aus einem Oligonukleotid, einem Protein oder einem Kleinmolekül, wobei jedes Fängermolekül ein Oligonukleotid umfasst und an ein Substrat gefügt ist.
  2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die mehreren Fängermoleküle wenigstens ein Aptamer beinhalten.
  3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei jedes Oligonukleotid der mehreren Fängermoleküle eine Sequenz umfasst, die zumindest teilweise oder völlig komplementär zu einer Sequenz des wenigstens einen Targets ist.
  4. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die mehreren Fängermoleküle wenigstens ein chimeres Molekül beinhalten, das ein Oligonukleotid umfasst.
  5. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei jedes Oligonukleotid der mehreren Fängermoleküle eine Länge im Bereich von 20 Nukleotiden bis 5000 Nukleotiden hat.
  6. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die mehreren Fängermoleküle natürliche Nukleotide, synthetische Nukleotide oder eine Kombination davon umfassen.
  7. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die mehreren Fängermoleküle DNA oder RNA umfassen.
  8. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Substrat ein Microarray oder mehrere Microbeads umfasst.
  9. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Substrat ein Microarray umfasst und die mehreren Fängermoleküle eine erste Mehrzahl von für ein erstes Target spezifischen Fängermolekülen, angefügt an einen ersten Bereich des Microarray, und eine zweite Mehrzahl von für ein zweites Target spezifischen Fängermolekülen beinhalten, angefügt an einen zweiten Bereich des Microarray.
  10. Vorrichtung nach Anspruch 8, wobei der erste Bereich zwei oder mehr diskrete Merkmale auf dem Microarray beinhaltet, die durch eine Gruppierung der ersten Mehrzahl von Fängermolekülen definiert sind.
  11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8–10, wobei das Microarray für wenigstens drei unterschiedliche Targets spezifische Fängermoleküle beinhaltet.
  12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1–8, wobei das Substrat mehrere Microbeads mit einem durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 100 nm bis 10 μm umfasst.
  13. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das wenigstens eine Target ein Biomarker ist, so dass die mehreren Fängermoleküle Fängermoleküle beinhalten, die für Biomarker spezifisch sind, die eine Krankheit anzeigen.
  14. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die mehreren Fängermoleküle Fängermoleküle beinhalten, die für Biomarker spezifisch sind, die Krebs, eine Herzkrankheit, eine Atemwegskrankheit, eine neurologische Krankheit, eine Infektionskrankheit oder antibiotikaresistente Gene anzeigen.
  15. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die mehreren Fängermoleküle Fängermoleküle beinhalten, die für mit einer Infektionskrankheit assoziierte Pathogene spezifisch sind.
  16. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die mehreren mikrofluidischen Kanäle einen ersten mikrofluidischen Kanal mit mehreren ersten für ein erstes Target spezifischen Fängermolekülen und einen zweiten mikrofluidischen Kanal mit mehreren zweiten für ein zweites Target spezifischen Fängermolekülen umfasst, das sich von dem ersten Target unterscheidet.
  17. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei wenigstens einer der mikrofluidischen Kanäle wenigstens eine Probenvorbereitungskammer beinhaltet, konfiguriert zum Extrahieren von in der Probe vorhandenem genomischem Material, wobei das genomische Material das wenigstens eine Target umfasst.
  18. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei wenigstens einer der mikrofluidischen Kanäle wenigstens eine Probenvorbereitungskammer beinhaltet, konfiguriert zum Trennen von Blut in Komponenten von Plasma, Serum und Zellen.
  19. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei wenigstens einer der mikrofluidischen Kanäle wenigstens eine Reaktionskammer beinhaltet, die das Substrat und die mehreren Fängermoleküle enthält.
  20. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei wenigstens einer der mikrofluidischen Kanäle zwei Reaktionskammern in Verbindung miteinander beinhaltet und eine der beiden Reaktionskammern die mehreren Fängermoleküle enthält.
  21. Vorrichtung nach Anspruch 20, wobei die andere der beiden Reaktionskammern Reagenzien zum Durchführen einer Amplifikationsreaktion mit dem wenigstens einen Target enthält.
  22. Vorrichtung nach Anspruch 21, wobei die Amplifikationsreaktion eine Polymerasekettenreaktion oder eine isothermische Amplifikationsreaktion ist.
  23. Vorrichtung nach Anspruch 21 oder Anspruch 22, wobei die Reagenzien zum Durchführen der Amplifikationsreaktion mehrere Oligonukleotidsequenzen als Primer zum Amplifizieren des wenigstens einen Targets umfassen.
  24. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die mehreren mikrofluidischen Kanäle mehrere Nachweismoleküle umfassen, wobei jedes Nachweismolekül eine nachweisbare Markierung beinhaltet.
  25. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, die ferner eine Energiequelle und einen Detektor umfasst.
  26. Vorrichtung nach Anspruch 25, wobei der Detektor zum Nachweisen von Fluoreszenz konfiguriert ist, um optische Bilder zu sammeln, oder beides.
  27. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Vorrichtung zum Durchführen eines Verfahrens zum Nachweisen von wenigstens einem Target in einer Fluidprobe eingerichtet ist.
  28. Vorrichtung nach Anspruch 27, wobei das Verfahren Folgendes beinhaltet: Einleiten der Fluidprobe in wenigstens einen mikrofluidischen Kanal der Scheibe; Drehen der Scheibe, so dass die Fluidprobe radial auswärts durch den wenigstens einen mikrofluidischen Kanal strömt, um sich mit wenigstens einem Fängermolekül der mehreren Fängermoleküle zu kombinieren; und Nachweisen eines Signals von der Scheibe, das die Anwesenheit von wenigstens einem Target in der Probe anzeigt.
  29. Vorrichtung nach Anspruch 27 oder Anspruch 28, wobei das wenigstens eine Target ein Oligonukleotid, ein Protein oder ein Kleinmolekül umfasst.
  30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27–29, wobei die mehreren Fängermoleküle wenigstens ein Aptamer beinhalten, das sich an das wenigstens eine Target bindet.
  31. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27–30, wobei die mehreren Fängermoleküle wenigstens ein Oligonukleotid beinhalten, das mit dem wenigstens einen Target hybridisiert.
  32. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27–31, wobei das Verfahren das Amplifizieren des wenigstens einen Targets vor dem Nachweisen des wenigstens einen Targets beinhaltet.
  33. Vorrichtung nach Anspruch 32, wobei das Amplifizieren des wenigstens einen Targets das Durchführen einer Polymerasekettenreaktion oder eines isothermischen Amplifikationsprozesses beinhaltet.
  34. Vorrichtung nach Anspruch 32 oder Anspruch 33, wobei das Amplifizieren des wenigstens einen Targets das Erhitzen einer Kammer der Scheibe beinhaltet, in der das wenigstens eine Target amplifiziert wird.
  35. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28–34, wobei die Fluidprobe Blut umfasst oder von Blut gewonnen wurde.
  36. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28–35, wobei das Verfahren ferner das Extrahieren von in der Fluidprobe vorhandenem genomischem Material umfasst, wobei das genomische Material das wenigstens eine Target umfasst.
  37. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28–36, wobei das Nachweisen des Signals von der Scheibe das Nachweisen eines Fluoreszenzsignals eines an das wenigstens eine Target angefügten Nachweismoleküls beinhaltet.
  38. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28–37, wobei das Nachweisen des Signals von der Scheibe das Analysieren der Fluidprobe mit einem optischen Leser beinhaltet, um die An- oder Abwesenheit des wenigstens einen Targets in der Fluidprobe zu bestimmen.
  39. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27–38, wobei das wenigstens eine Target ein Biomarker ist, der Krebs, eine Herzkrankheit, eine Atemwegskrankheit, eine neurologische Krankheit, eine Infektionskrankheit oder antibiotikaresistente Gene anzeigt.
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