CN112410405A - 一种复杂样品中细菌的快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复杂样品中细菌的快速检测方法，属于分子生物学技术领域。所述方法包括：(1)将待测样品加入到含有溶菌酶的环介导等温扩增反应体系溶液中，再往反应体系中加入水凝胶单体，室温下形成水凝胶；(2)将水凝胶体系置于恒温条件下进行等温扩增反应；(3)利用荧光成像技术分析等温扩增反应后的水凝胶体系中的荧光信号，计算出待测样品中的目标细菌浓度。本发明将LAMP反应体系从以往的溶液态创新性地转变为水凝胶态，进行LAMP原位扩增，水凝胶中的众多纳米孔洞可以起到隔离有机质、重金属等抑制剂的作用，从而实现细菌的绝对定量分析，为真实复杂样品中细菌检测提供了一种价格低廉，操作灵活简洁的数字核酸检测技术。

Description

一种复杂样品中细菌的快速检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种基于纳米多孔水凝胶体系的环介导等温扩增方法快速检测复杂样品中的细菌。

背景技术

传统的致病菌检测通过细菌培养来实现定量测定，但它们的操作时间过长并且在识别某些物种方面存在局限性。核酸扩增反应可以将检测时间缩短到几个小时，如环介导等温扩增反应(LAMP)，是一种新型的等温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6-8个区域设计4-6种特异引物，在链置换DNA聚合酶的作用下，65℃恒温扩增并可在60分钟左右实现10⁹倍的核酸扩增，该方法具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。与此同时，反应析出大量的白色焦磷酸镁沉淀，利用这个特点，实验人员可以通过观察反应体系的浑浊程度或者荧光强度来判断结果是阴性还是阳性。基于以上特点，LAMP在细菌检测等方面有着广泛的应用前景。

但是当LAMP直接被用来检测真实复杂样品时，扩增反应容易被真实复杂样品中的有机质、重金属等抑制剂所抑制，造成反应结果假阴性且无法成功检测。现有的核酸扩增技术扩增前通常需要耗时费力的样品预处理步骤，例如DNA提取和纯化，特别是未经处理的真实复杂样品。另外，核酸扩增技术扩增需要昂贵的仪器来进行实时荧光测量，难以进行细菌数目的绝对定量分析，并且不适用于低成本的现场操作和精确的定量分析。

公布号为CN111549147A的中国发明专利申请文件公开了一种细菌快速检测方法及试剂，以细菌的16S rRNA或其PCR扩增产物作为测定靶标，设计捕获探针和检测探针；将附着有16S rRNA或其PCR扩增产物的捕获探针的微球、检测探针以及经细胞裂解处理的待测样品混合；检测复合物中不同微球的微球识别信号以及可检测标记物，从而确定待测样品中各待测细菌的存在与否以及存在的量，使检测变得更快、更简便、更合理，成本低廉，检测效果良好。但是该非数字化检测方法只能作为一种简单的判定手段，无法进行准确定量检测，且无法对未经过预处理的真实复杂样品进行直接快速检测。

近年来，数字核酸检测技术发展迅速，该技术通过将单个细菌核酸分子分隔在单个隔室中并进行独立的核酸扩增反应以鉴定目标核酸的绝对准确浓度。更高的特异性和准确度，更好的变异分析能力以及终点检测和绝对定量等性能使数字化扩增技术在各种检测中得以扩展。

现有的基于微流控芯片阵列反应室的数字化环介导等温扩增方法(digitalLAMP)的设计和使用成本相对较高，可扩展性有限，更重要的是微流控装置加工过程过于繁琐，而且价格昂贵，难以一次性使用，且该方法也有低亮暗比、容易受抑制剂影响等缺点。因此，迫切需要开展一种具有技术稳定，操作简单灵活，成本低廉的数字量化检测方法来快速检测真实复杂样品中的细菌。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够对真实复杂样品如全血、奶茶等中的细菌进行直接快速检测的方法，克服复杂样品中有机质、重金属等抑制剂的作用，实现细菌的绝对定量分析。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种复杂样品中细菌的快速检测方法，所述复杂样品为含有有机质或金属离子的混合物，所述检测方法包括以下步骤：

(1)将待测样品加入到含有溶菌酶的环介导等温扩增反应体系溶液中，再往反应体系中加入水凝胶单体，室温下形成水凝胶；所述环介导等温扩增反应体系包括特异性扩增目标细菌DNA的引物；

(2)将水凝胶体系置于恒温条件下进行等温扩增反应；

(3)利用荧光成像技术分析等温扩增反应后的水凝胶体系中的荧光信号，计算出待测样品中的目标细菌浓度。

本发明将反应体系从以往的溶液态转变为水凝胶态，研究发现，在纳米多孔水凝胶中进行LAMP原位扩增，可以有效克服有机质、重金属等物质对LAMP反应的干扰。

具体的，所述复杂样品可以为人全血、牛全血、奶茶等。

所述的目标细菌可以为大肠杆菌、沙门氏菌或李斯特菌，也可以是其他菌种。根据目标细菌DNA设计配套的LAMP引物。

步骤(1)中，待测样品无需预处理，直接加入到含有溶菌酶的LAMP体系中，所述溶菌酶可以直接裂解待测样品里的细菌，省去DNA提取这一费力耗时的步骤，大大缩短了样品准备和检测时间。

所述的环介导等温扩增反应体系包括：1×LAMP buffer，6mM MgSO₄，1.4mM dNTP，640U/mL Bst 2.0DNA聚合酶，引物混合物，1.0mg/mL BSA，0.1mg/mL溶菌酶和荧光染料。

进一步地，所述引物混合物为1.6μM FIB和BIP，0.2μM F3和B3与0.8μM LF和LB的混合物。

进一步地，所述荧光染料为Eva Green、STBR Green、Syto 9和SYTOX Orange中的任意一种。

本发明采用聚乙二醇基水凝胶，所述水凝胶单体包括四臂乙二醇丙烯酸酯(Four-arm PEG Acrylate)和巯基-聚乙二醇-巯基(SH-PEG-SH)。上述两种单体在水溶液中混合，室温条件下成胶，时间为3-5分钟。

进一步地，四臂乙二醇丙烯酸酯的分子量为1000～10000MW，巯基-聚乙二醇-巯基的分子量为2000～20000MW，两者的摩尔比为1:1～4，四臂乙二醇丙烯酸酯以质量体积比(m/v)10％添加至反应体系中。

更进一步，Four-arm PEG Acrylate和SH-PEG-SH分子量分别为10000MW及3400MW，摩尔比为1:2，在每个水凝胶系统(25μL体系)的添加量为1.6mg Four-arm PEG Acrylate和1.1mg SH-PEG-SH。

进一步地，步骤(2)中，水凝胶体系置于防止水分蒸发的密封空间内进行等温扩增反应。利用密封空间防止水凝胶中的水分蒸发，保证检测结果的准确性。具体地，将混合后的体系溶液滴加到透明的密封小室中，静置成胶，用薄膜密封。密封小室和薄膜构成的密封体系可以防止水分蒸发。

进一步地，所述等温扩增反应的条件为60～70℃恒温加热10～60min。

步骤(3)中，利用荧光成像技术对水凝胶体系中LAMP原位扩增后产生的荧光点进行成像，即扩增产物在激发光照射下所发出的荧光可以在荧光显微镜下清楚地进行识别。实验结果表明，细菌经溶菌酶裂解后成功进行扩增并且一个细菌仅对应荧光成像的一个荧光点，因此可通过直接计算荧光点个数来分析细菌个数。

进一步地，步骤(3)中，利用Image J软件对水凝胶体系的荧光图像进行计数分析。

进一步地，直接利用发蓝光或紫色的LED手电筒照射水凝胶系统进行计数分析。LED手电筒主要用于野外分析或现场检测时进行现场快速检验(point-of-care testing,POCT)。

本发明提供的上述方法不仅可以用于数字化扩增，还可以用于液滴微流控领域如单细胞分析。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

(1)本发明的方法与微流控芯片数字PCR相比，不需要复杂的微流控装置及芯片、温控装置等成本较高的设备即可完成对细菌核酸的数字分析，具有简易的实验步骤，快速高效，操作简单，成本低廉的特点。

(2)本发明的方法对目标细菌没有依赖性，只要进行配套的引物设计即可开展目标细菌的数字检测。

(3)本发明中所用纳米多孔水凝胶成本低廉，可直接进行LAMP原位扩增，水凝胶中的众多纳米孔洞可以起到隔离有机质、重金属等抑制剂的作用，从而实现细菌的绝对定量分析，不存在样品污染的潜在风险，为真实复杂样品中细菌检测提供了一种价格低廉，操作灵活简洁的数字核酸检测技术。

(4)本发明方法可以使用蓝光LED手电筒进行野外分析和现场检测，为资源匮乏地区的细菌快速检测提供了一种新的思路。

附图说明

图1为水凝胶SEM扫描图，标尺为200nm。

图2为实施例1中不同样品荧光拍照计数时膜系统的荧光图，其中(a-e)分别为实施例1中人全血样品a至人全血样品e的荧光图；(f)为人全血样品测量大肠杆菌细菌浓度与实际大肠杆菌细菌浓度的拟合图。

图3为实施例2中不同奶茶样品添加量对溶液LAMP体系和水凝胶LAMP体系的影响，通过出峰时间和扩增时间来比较不同体系受不同奶茶样品添加量的抑制程度。

图4为实施例3中牛全血样品检测的数据图，其中(a)为未经处理的牛全血样品实物图；(b)为实施例3中不同牛全血样品添加量对溶液LAMP体系和水凝胶LAMP体系的影响，通过出峰时间和扩增时间来比较不同体系受不同奶茶样品添加量的抑制程度；(c)为实施例3中直接使用LED手电筒照射并进行荧光点计数的示意图。

图5为实施例4中水凝胶单体单独加入时对LAMP体系的影响，通过出峰时间和扩增时间来比较水凝胶单体的抗抑制能力。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本领域技术人员在理解本发明的技术方案基础上进行修改或等同替换，而未脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围内。

以下实施方式采用配制真实复杂样品作为待测样品进行测量，根据测量得到的细菌浓度与真实复杂样品中实际细菌浓度来判断本发明的检测方法的准确性。

实施例中所使用的引物来源于上海生工生物工程有限公司；LAMP反应体系混合物中其他扩增试剂购于New England Biolabs公司；水凝胶单体购于美国Laysan Bio公司；荧光染料购买于美国ThermoFisher Scientific公司；人全血来自于当地医院，牛全血样品和奶茶购买当地市场，并作为实施例中所使用的真实复杂样品。

以下实施方式的纳米多孔水凝胶SEM如图1所示，孔洞直径在纳米级，在实验过程中，水凝胶中的众多纳米孔洞可以起到隔离包括但不限于本发明中所提及的真实复杂样品中抑制剂如未处理人全血和牛全血中的血红细胞、免疫球蛋白等物质或奶茶中的蛋白质、钙离子等物质的作用，从而实现细菌的绝对定量分析，可直接进行LAMP原位扩增。

实施例1基于纳米多孔水凝胶的环介导等温扩增方法分析人全血样品中致病性大肠杆菌Escherichia coli O157：H7(CICC 10907)

1、引物序列如下：

F3：5'-GCCATCTCCTGATGACGC-3'；

B3：5'-ATTTACCGCAGCCAGACG-3'；

LF：5'-CTTTGTAACAACCTGTCATCGACA-3'；

LB：5'-ATCAATCTCGATATCCATGAAGGTG-3'；

FIP：5'-CATTTTGCAGCTGTACGCTCGCAGCCCATCATGAATGTTGCT-3'；

BIP：5'-CTGGGGCGAGGTCGTGGTATTCCGACAAACACCACGAATT-3'；

2、人全血样品a至e中大肠杆菌实际DNA原始浓度分别为：

人全血样品a：大肠杆菌DNA原始浓度为1CFU/μL；

人全血样品b：大肠杆菌DNA原始浓度为10CFU/μL

人全血样品c：大肠杆菌DNA原始浓度为20CFU/μL；

人全血样品d：大肠杆菌DNA原始浓度为40CFU/μL；

人全血样品e：大肠杆菌DNA原始浓度为80CFU/μL；

3、将1.0μL人全血样品a至e分别添加1×LAMP buffer，6mM MgSO₄，1.4mM dNTP，640U/mL Bst 2.0DNA聚合酶，1.6μM FIP和BIP，0.2μM F3和B3，0.8μM LF和LB，1mg/mL BSA，0.1mg/mL溶菌酶，1X EvaGreen，1.6mg Four-arm PEG Acrylate和1.1mg SH-PEG-SH制得5个含人全血样品的LAMP反应体系混合物(25μL)。

4、在密封小室中滴加上述含人全血样品的LAMP反应体系混合物来形成水凝胶系统，将水凝胶系统用薄膜密封；

将整个水凝胶系统在65℃恒温加热20min，进行等温扩增。

5、用Image J软件对等温扩增后的水凝胶系统荧光拍照计数，定量计算出LAMP反应体系混合物中待测物的原始浓度。

如图2所示，其中图2中(a)至(e)分别为人全血样品a、人全血样品b、人全血样品c、人全血样品d、人全血样品e扩增后的水凝胶系统荧光图像。对扩增后的水凝胶系统进行荧光计数，计算得出人全血样品中细菌原始浓度，利用该方法测量计算得到的人全血样品细菌原始浓度与人全血样品中实际细菌原始浓度的拟合图如图2中(f)所示，可以看出测量的细菌浓度与实际细菌浓度十分相符，拟合度可达0.9983，说明本发明方法用于定量分析人全血样品中大肠杆菌时，准确性非常高。

实施例2基于纳米多孔水凝胶的环介导等温扩增方法分析奶茶样品中单核细胞增生李斯特菌Listeria monocytogenes(CICC 21633)

1、引物序列如下：

F3：5'-TTGCGCAACAAACTGAAGC-3'；

B3：5'-GCTTTTACGAGAGCACCTGG-3'；

LF：5'-TAGGACTTGCAGGCGGAGATG-3'；

LB：5'-GCCAAGAAAAGGTTACAAAGATGG-3'；

FIP：5'-CGTGTTTCTTTTCGATTGGCGTCTTTTTTTCATCCATGGCACCACC-3'；

BIP：5'-CCACGGAGATGCAGTGACAAATGTTTTGGATTTCTTCTTTTTCTCCAC AAC-3'；

2、将0.83μL，1.67μL和2.50μL奶茶样品分别添加1×LAMP buffer，6mM MgSO₄，1.4mM dNTP，640U/mL Bst 2.0DNA聚合酶，1.6μM FIP和BIP，0.2μM F3和B3，0.8μM LF和LB，1mg/mL BSA，0.1mg/mL溶菌酶，1X EvaGreen，2.0μL菌液或DNA溶液，1.6mg Four-arm PEGAcrylate和1.1mg SH-PEG-SH制得3个不同奶茶样品浓度的LAMP反应水凝胶体系混合物(25μL)。

3、样品使用Applied Biosystems^TM实时PCR机(ThermoFisher Scientific)在65℃下孵育60分钟，每隔1分钟监测反应体系的荧光强度。

如图3所示，随着奶茶样品浓度提高，常规的溶液体系(即不添加Four-arm PEGAcrylate和SH-PEG-SH，其他同上述水凝胶体系)出峰时间逐渐延长，最终无法检测样品是否存在细菌，这是因为奶茶中有蛋白质等物质会抑制LAMP反应，而水凝胶体系中出峰时间和荧光强度值基本不变，说明水凝胶体系具有很好的抗抑制能力，该方法可以在真实复杂样品检测中使用。

实施例3基于纳米多孔水凝胶的环介导等温扩增方法分析牛全血样品中伤寒沙门氏菌Salmonella typhi(CICC 10871)

1、引物序列如下：

F3：5'-GGCGATATTGGTGTTTATGGGG-3'；

B3：5'-AACGATAAACTGGACCACGG-3'；

LF：5'-GACGAAAGAGCGTGGTAATTAAC-3'；

LB：5'-GGGCAATTCGTTATTGGCGATAG-3'；

FIP：5'-GACGACTGGTACTGATCGATAGTTTTTCAACGTTTCCTGCGG-3'；

BIP：5'-CCGGTGAAATTATCGCCACACAAAACCCACCGCCAGG-3'。

2、将0.5μL，1.0μL和2.0μL牛全血样品分别添加1×LAMP buffer，6mM MgSO₄，1.4mM dNTP，640U/mL Bst 2.0DNA聚合酶，1.6μM FIP和BIP，0.2μM F3和B3，0.8μM LF和LB，1mg/mL BSA，0.1mg/mL溶菌酶，1X EvaGreen，2.0μL菌液或DNA溶液，1.6mg Four-arm PEGAcrylate和1.1mg SH-PEG-SH制得3个不同牛全血样品浓度的LAMP反应水凝胶体系混合物(25μL)。

3、样品使用Applied Biosystems^TM实时PCR机(ThermoFisher Scientific)在65℃下孵育60分钟，每隔1分钟监测反应体系的荧光强度。

如图4(b)所示，随着牛全血样品浓度提高，常规的溶液体系(即不添加Four-armPEG Acrylate和SH-PEG-SH，其他同上述水凝胶体系)出峰时间逐渐延长，最终无法检测样品是否存在细菌，这是因为牛全血中有血红蛋白等物质会抑制LAMP反应，而水凝胶体系中出峰时间和荧光强度值基本不变，说明水凝胶体系具有很好的抗抑制能力，该方法可以在真实复杂样品检测中使用。

该方法也可用LED手电筒照射并计数，具体步骤如下：

(1)在密封小室中滴加含有2.0μL牛全血样品的25μL LAMP反应体系混合物来形成水凝胶系统，将水凝胶系统用薄膜密封；

(2)将整个水凝胶系统在70℃恒温加热10min，进行等温扩增；

(3)直接使用LED手电筒照射水凝胶系统进行计数，直接得出LAMP反应体系混合物中牛全血的原始浓度。

加热结束后使用LED手电筒对水凝胶系统进行计数，如图4(c)所示，直接得出牛全血样品中细菌原始浓度，说明本发明该方法用于定量分析沙门氏菌时，可以不依托于荧光显微镜等实验室仪器，从而实现现场快速检测。

实施例4单独使用Four-arm PEG Acrylate和SH-PEG-SH的环介导等温扩增方法分析人全血样品中致病性大肠杆菌Escherichia coli O157：H7(CICC10907)

1、引物序列如下：

F3：5'-GCCATCTCCTGATGACGC-3'；

B3：5'-ATTTACCGCAGCCAGACG-3'；

LF：5'-CTTTGTAACAACCTGTCATCGACA-3'；

LB：5'-ATCAATCTCGATATCCATGAAGGTG-3'；

FIP：5'-CATTTTGCAGCTGTACGCTCGCAGCCCATCATGAATGTTGCT-3'；

BIP：5'-CTGGGGCGAGGTCGTGGTATTCCGACAAACACCACGAATT-3'；

2、将2.5μL人全血样品分别添加1×LAMP buffer，6mM MgSO₄，1.4mM dNTP，640U/mL Bst 2.0DNA聚合酶，1.6μM FIP和BIP，0.2μM F3和B3，0.8μM LF和LB，1mg/mL BSA，0.1mg/mL溶菌酶，1X EvaGreen，2.0μL菌液或DNA溶液，单独加入1.6mg Four-rm PEGAcrylate或1.1mg SH-PEG-SH或者两者都不加入从而制得3个不同的LAMP反应水凝胶体系混合物(25μL)。

3、样品使用Applied Biosystems^TM实时PCR机(ThermoFisher Scientific)在65℃下孵育60分钟，每隔1分钟监测反应体系的荧光强度。

如图5所示，单独加入水凝胶单体的LAMP体系和没有加入水凝胶单体的LAMP体系在检测人全血样品过程中均受到了抑制，导致LAMP反应扩增失败，因此单独加入水凝胶单体无法起到抗抑制的作用。

Claims (10)

1.一种复杂样品中细菌的快速检测方法，其特征在于，所述复杂样品为含有有机质或金属离子的混合物，所述检测方法包括以下步骤：

(1)将待测样品加入到含有溶菌酶的环介导等温扩增反应体系溶液中，再往反应体系中加入水凝胶单体，室温下形成水凝胶；所述环介导等温扩增反应体系包括特异性扩增目标细菌DNA的引物；

(2)将水凝胶体系置于恒温条件下进行等温扩增反应；

(3)利用荧光成像技术分析等温扩增反应后的水凝胶体系中的荧光信号，计算出待测样品中的目标细菌浓度。

2.如权利要求1所述的复杂样品中细菌的快速检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的环介导等温扩增反应体系包括：1×LAMP buffer，6mM MgSO₄，1.4mM dNTP，640U/mL Bst2.0DNA聚合酶，引物混合物，1.0mg/mL BSA，0.1mg/mL溶菌酶和荧光染料。

3.如权利要求2所述的复杂样品中细菌的快速检测方法，其特征在于，所述引物混合物为1.6μM FIB和BIP，0.2μM F3和B3与0.8μM LF和LB的混合物。

4.如权利要求2所述的复杂样品中细菌的快速检测方法，其特征在于，所述荧光染料为Eva Green、STBR Green、Syto 9和SYTOX Orange中的任意一种。

5.如权利要求1所述的复杂样品中细菌的快速检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述水凝胶单体包括四臂乙二醇丙烯酸酯和巯基-聚乙二醇-巯基。

6.如权利要求5所述的复杂样品中细菌的快速检测方法，其特征在于，四臂乙二醇丙烯酸酯的分子量为1000～10000MW，巯基-聚乙二醇-巯基的分子量为2000～20000MW，两者的摩尔比为1:1～4，四臂乙二醇丙烯酸酯以质量体积比10％添加至反应体系中。

7.如权利要求1所述的复杂样品中细菌的快速检测方法，其特征在于，步骤(2)中，水凝胶体系置于防止水分蒸发的密封空间内进行等温扩增反应。

8.如权利要求1所述的复杂样品中细菌的快速检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述等温扩增反应的条件为60～70℃恒温加热10～60min。

9.如权利要求1所述的复杂样品中细菌的快速检测方法，其特征在于，步骤(3)中，利用Image J软件对水凝胶体系的荧光图像进行计数分析。

10.如权利要求1所述的复杂样品中细菌的快速检测方法，其特征在于，步骤(3)中，利用发蓝光或紫色的LED手电筒照射水凝胶系统进行计数分析。

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