CN104122393A - 一种光电化学三维纸芯片的制备及其在肿瘤检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种光电化学三维纸芯片的制备方法及所述的光电化学传感器测定样品中六种肿瘤标记物的方法。利用蜡打印技术在纸上制备疏水区域及亲水区域，通过配置合适的油墨，在纸上印制相应的参比电极和工作电极，再对工作区域进行功能化，抗原识别；将制备好的纸芯片进行折叠，构成三电极体系，在反应区域滴加含有抗坏血酸的缓冲溶液，在紫外灯的照射下，实现了待测物的高灵敏检测。

Description

一种光电化学三维纸芯片的制备及其在肿瘤检测中的应用
技术领域
本发明涉及一种光电化学分析检测技术领域，更具体地说是一种以适合于光电化学分析的微流控纸芯片实验室技术平台的构建。 
背景技术
近几年来国民癌症发病率及死亡率呈现逐步走高的趋势，因此寻找快速、定量、灵敏的检测肿瘤标记物的方法在早期检测和治疗监控中非常重要。常见的临床诊断途径主要有以下两种：通过医院中比较昂贵的大型的仪器分析设备进行检测；是通过掌上小型简易设备，实现快速灵敏的现场分析诊断。然而，在临床检测中单种肿瘤标记物的检测往往导致检测结果的假阳性，而多肿瘤标记物的联合检测则可以提高检测结果的准确性及可靠性，因此我们所构建的体系中也采用了多肿瘤标记物的联合检测。 
随着科技的快速发展，各种免疫传感设备朝着简单化、小型化、集成化的方向发展，因此微流控纸质分析设备越来越多的受到大家的关注。纸，作为这种分析设备的支撑，具有廉价、储量丰富、可折叠、可任意处置、放置时间长、易于储藏等特点，因而常被使用作为现场即时检测的平台。这种微流控纸芯片分析器件的工作原理如下：在纸芯片上绘制疏水的蜡打印图案，未绘制疏水图案的部分借助于纸的毛细驱动力而构成亲水通道。基于此原理可以在不使用额外的流动运输装置下将生物、化学分析检测过程引用到纸芯片上，实现检测的微型化及简单化。此外，纸上光电化学免疫传感器以其仪器设备简单，电子检测成本低、灵敏度高、可批量生产等优点逐渐引起大家的关注。 
为了解决肿瘤标记物在低浓度下便能进行检测的问题，信号放大策略变的尤为重要。然而，单独的纸芯片导电性非常差，且不具有信号放大的功效，如果在纸纤维上连接上比表面积大、导电性及生物相容性好的金、银、铂等贵金属纳米粒子以及感光性纳米材料如氧化锌、硫化镉量子点等，那么我们所获得的功能化的高通量微流控纸芯片分析器件便能够很好的实现信号放大，进而实现肿瘤标记物的低含量检测。 
发明内容
本发明要解决的技术问题是在微流控纸芯片上建立光电化学发光分析检测方法。进一步构建高通量的三维微流控纸芯片，并用于血清试样中6种抗原含量的同时检测。 
为了解决上述技术问题，本发明是通过构建一种新型的光电化学三维微流控纸芯片来实现的，该光电化学三维微流控纸芯片的制备方法为： 
(1) 在计算机上设计如附图1所示的光电化学三维微流控纸芯片的疏水蜡批量打印图案，放大后的样式如附图2所示；
(2) 将纸片剪裁成常用A4大小的纸，将步骤(1)中设计的疏水蜡批量打印图案打印到A4纸上，随后将带有蜡图案的A4纸放置到平板加热器或烘箱中，在150 oC加热2 min；使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙；
(3) 采用丝网印刷的方法，将阵列工作电极、参比电极、对电极印刷图案依次印刷到步骤(2)中得到的纸上，最后所得的样式如附图3所示，其中左侧为工作区，上面印刷有6个工作电极，右侧为参比区，上面印有参比电极和对电极；
(4) 对(3)中亲水区域功能化，将抗体固定在亲水区域，随后用牛血清白蛋白封锁活性位点；
(5) 将目标物或血清试样在固定抗体的反应区域孵育；
(6) 将经(5)处理后的纸芯片折叠，将含有抗坏血酸的磷酸缓冲液滴加到印有参比电极对电极的纸层上，在紫外灯的照射下，连接电化学设备进行测试；
一种光电化学三维微流控纸芯片的制备及在多种肿瘤检测中的应用，其特征在于该方法的具体步骤为：
(1) 在计算机上利用Adobe illustrator CS4设计光电化学三维微流控纸芯片的疏水蜡批量打印图案；
(2) 将纸剪裁成常用A4大小的纸，利用蜡打印技术在纸上打印蜡疏水图案，将打印蜡的图案在恒温150 oC下2 min，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙，没有打印蜡的部分为亲水区即为工作区；
(3) 采用丝网印刷技术进行电极印刷。以石墨为原料，取等体积的丙酮和环己酮溶液，再加入对应量的乙酸纤维素，使用超声波超声使乙酸纤维素充分的溶解在丙酮和环己酮的混合溶剂中，最后加入一定量的石墨粉，用玻璃棒充分混匀，得到碳墨以作为工作电极的原料，在纸上印制6个工作电极，一个碳对电极和Ag/AgCl参比电极；
(4) 将(3)所得的纸进行功能化，制备工作区
制备Pt纳米粒子：称取170 mg的聚乙烯吡咯烷酮加入到5 mL 1 mM H2PtCl6中，将此溶液用去离子水稀释到58 mL，在磁力搅拌下加入新配置的2 mL 1%的NaBH4，继续磁力搅拌3 h；在纸上生长纳米多孔Pt粒子：量取15 μL制备的Pt纳米粒子，滴加到(2)上印有工作电极的反面工作区上，室温下孵育1 h，目的是使Pt纳米粒子牢固的吸附在纸纤维上，去离子水冲洗3次以移除未成功附着的Pt纳米粒子，将长有Pt种子的纸片放于烧杯中，随后将10 mL的多孔Pt的生长溶液，此生长溶液包含0.5 mM的H2PtCl6和0.01 mM的抗坏血酸，加入到烧杯中，60 oC水浴加热20 min，取出纸芯片，室温下自然干燥；在生长有纳米多孔Pt粒子的纸芯片上水热法生长ZnO纳米棒：将长有纳米多孔Pt粒子的纸芯片放于匀胶机上，向此纸芯片上滴加40 mM的Zn(CH3COO)2·2H2O，以1000 rpm的速度旋涂60 s，取出纸片放于恒温干燥箱中150 oC干燥10 min，将旋涂和加热干燥的步骤重复6次，即可获得附着有ZnO种子且生长有纳米多孔Pt 粒子的纸芯片，随后将此纸芯片放于25 mM Zn(NO3)2·6H2O与25 mM六次甲基四胺的水溶液中，90 oC加热6 h即可；在ZnO纳米棒上生长CdS量子点：将上述生长有ZnO纳米棒的纸芯片放于10 mM的Cd(NO3)2和10 mM硫代乙酰胺中，室温下反应60 min，取出纸芯片，去离子水冲洗4次后干燥；将5 μL抗体固定在经上述功能化的纸芯片上的亲水区域，室温下干燥，随后用5 μL 1%的牛血清白蛋白掩蔽活性位点，室温下孵育50 min；
(5) 将目标抗原或血清样品滴加到反应区，室温下孵育50 min；
(6) 将纸芯片折叠，将40 μL含有抗坏血酸的、pH等于7.4的磷酸缓冲液，滴加到印有参比电极对电极的纸层上，在紫外灯的照射下，连接电化学设备进行测试，其中抗坏血酸和磷酸缓冲液的浓度均为0.1 mol·L-1；
本发明所述纸材料为一级色谱纸。
附图说明
图1：疏水蜡打印图案； 
图2：疏水蜡打印图案的放大图，其中右侧为参比区，左侧为工作区；
图3：疏水蜡打印图案上丝网印刷上6个工作电极，1个参比电极及对电极后的图，其中，1为参比电极，2为对电极，3为工作电极。
具体实施方式
实施案例1
一种光电化学三维纸芯片的制备及其在肿瘤检测中的应用
(1) 在计算机上用Adobe illustrator CS4设计光电化学三维微流控纸芯片的疏水蜡批量打印图案；
(2) 将纸剪裁成常用A4大小的纸，利用蜡打印技术在纸上打印蜡疏水图案，将打印蜡的图案在恒温150 oC下2 min，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙，没有打印蜡的部分为亲水区即为工作区；
(3) 采用丝网印刷技术进行电极印刷。以石墨为原料，取等体积的丙酮和环己酮溶液，再加入对应量的乙酸纤维素，使用超声波超声使乙酸纤维素充分的溶解在丙酮和环己酮的混合溶剂中，最后加入一定量的石墨粉，用玻璃棒充分混匀，得到碳墨以作为工作电极的原料，在纸上印制6个工作电极，一个碳对电极和Ag/AgCl参比电极；
(4) 将(3)所得的纸进行功能化，制备工作区
制备Pt纳米粒子：称取170 mg的聚乙烯吡咯烷酮加入到5 mL 1 mM H2PtCl6，将此溶液用去离子水稀释到58 mL，在磁力搅拌下加入新配置的2 mL 1%的NaBH4，继续磁力搅拌3 h；在纸上生长纳米多孔Pt粒子：量取15 μL制备的Pt纳米粒子，滴加到(2)上印有工作电极的反面工作区上，室温下孵育1 h，目的是使Pt纳米粒子牢固的吸附在纸纤维上，去离子水冲洗3次以移除未成功附着的Pt纳米粒子，将长有Pt种子的纸片放于烧杯中，随后将10 mL的多孔Pt的生长溶液，此生长溶液包含0.5 mM的H2PtCl6和0.01 mM的抗坏血酸，加入到烧杯中，60 oC水浴加热20 min，取出纸芯片，室温下自然干燥；在生长有纳米多孔Pt粒子的纸芯片上水热法生长ZnO纳米棒：将长有纳米多孔Pt粒子的纸芯片放于匀胶机上，向此纸芯片上滴加40 mM的Zn(CH3COO)2·2H2O，以1000 rpm的速度旋涂60 s，取出纸片放于恒温干燥箱中150 oC干燥10 min，将旋涂和加热干燥的步骤重复6次，即可获得附着有ZnO种子且生长有纳米多孔Pt粒子的纸芯片，随后将此纸芯片放于25 mM Zn(NO3)2·6H2O与25 mM六次甲基四胺的水溶液中，90 oC加热6 h即可；在ZnO纳米棒上生长CdS量子点：将上述生长有ZnO纳米棒的纸芯片放于10 mM的Cd(NO3)2和10 mM硫代乙酰胺中，室温下反应60 min，取出纸芯片，去离子水冲洗4次后干燥；将5 μL的6种目标抗原的相应抗体固定在上述功能化的纸芯片上的亲水区域，室温下干燥，随后用5 μL 1%的牛血清白蛋白封锁活性位点，室温下孵化50 min；
(5) 将5 μL不同浓度的6种目标抗原即：AFP, CEA, POA, CA199， CA125，CA15-3滴加到相应工作区，室温下孵化50 min;
(6) 将纸芯片折叠，将40 μL含有抗坏血酸的、pH等于7.4的磷酸缓冲液，滴加到印有参比电极对电极的纸层上，在紫外灯的照射下，连接电化学设备进行测试，其中抗坏血酸和磷酸缓冲液的浓度均为0.1 mol·L-1，六种抗原检测所得结果列于表1中。
表1 本发明测定六种肿瘤标记物的性能 
通过表1我们可以发现，我们所构建的光电化学三维微流控纸芯片具有宽的线性范围，低的检测限，可以实现多肿瘤标记物的现场同时检测。单一肿瘤标记物的检测常常导致检测结果不准确，而且还常常伴随检测结果的假阳性，因此癌胚抗原 (CEA)，糖类抗原125 （CA125）及糖类抗原153 (CA153) 的联合检测淋巴结转移阴性肺腺癌中有重要参考价值。此外，血清甲胎蛋白 (AFP)，肿瘤抗原 (CA199)，胰胚抗原 (POA) 联合测定对肝癌含量的测定具有重要的参考价值。
相类似的，我们同样可以用此光电化学三维微流控纸芯片联合测定其它组分的含量，由此可以看出我们所构筑的生物传感器具有非常广阔的应用前景。 

Claims (3)

1.一种光电化学三维纸芯片的制备及其在肿瘤检测中的应用，其特征是包括以下步骤：
1.1 在计算机上设计如附图1所示的光电化学三维微流控纸芯片的疏水蜡批量打印图案，放大后的样式如附图2所示；
1.2 将纸剪裁成常用A4大小的纸，将步骤（1.1）中设计的疏水蜡批量打印图案打印到A4纸上，随后将带有蜡图案的A4纸放置到平板加热器或烘箱中，在150 oC加热2 min；使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙；
1.3 采用丝网印刷的方法，将阵列工作电极、参比电极、对电极印刷图案依次印刷到步骤（1.2）中得到的纸上，最后所得的样式如附图3所示，其中左侧为工作区，上面印刷有6个工作电极，右侧为参比区，上面印有参比电极和对电极；
1.4 对（1.3）中亲水区域功能化，将抗体固定在亲水区域，随后用牛血清白蛋白封锁活性位点；
1.5将目标物或血清试样在固定抗体的反应区域孵育；
1.6将经（1.5）处理后的纸芯片折叠，将含有抗坏血酸的磷酸缓冲液滴加到印有参比电极对电极的纸层上，在紫外灯的照射下，连接电化学设备进行测试。
2.根据权利要求书所述光电化学三维微流控纸芯片的制备及其在多肿瘤标记物现场即时检测中的应用，其特征在于该方法的具体步骤为：
2.1 在计算机上用Adobe illustrator CS4设计光电化学三维微流控纸芯片的疏水蜡批量打印图案；
2.2 将纸剪裁成常用A4大小的纸，利用蜡打印技术在纸上打印蜡疏水图案，将打印蜡的图案在恒温150 oC下2 min，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙没有打印蜡的部分为亲水区即为工作区；
2.3 采用丝网印刷技术、石墨为原料，取等体积的丙酮和环己酮溶液，再加入对应量的乙酸纤维素，使用超声波超声使乙酸纤维素充分的溶解在丙酮和环己酮的混合溶剂中，最后加入一定量的石墨粉，用玻璃棒充分混匀，在纸上印制6个工作电极，一个碳对电极和Ag/AgCl参比电极；
2.4 将（2.3）所得的纸进行功能化，制备工作区
制备Pt纳米粒子：称取170 mg的聚乙烯吡咯烷酮加入到5 mL 1mM H2PtCl6，将此溶液用去离子水稀释到58 mL，在磁力搅拌下加入新配置的2 mL 1%的NaBH4，继续磁力搅拌3 h；在纸上生长纳米多孔Pt粒子：量取15 μL制备的Pt纳米粒子，滴加到（2）上印有工作电极的反面工作区上，室温下孵育1 h，目的是使Pt纳米粒子牢固的吸附在纸纤维上，去离子水冲洗3次以移除未成功附着的Pt纳米粒子，将长有Pt种子的纸片放于烧杯中，随后将10 mL的多孔Pt的生长溶液，此生长溶液包含0.5 mM的H2PtCl6和0.01 mM的抗坏血酸，加入到烧杯中，60 oC水浴加热20 min，取出纸芯片，室温下自然干燥；在生长有纳米多孔Pt粒子的纸芯片上水热法生长ZnO纳米棒：将长有纳米多孔Pt粒子的纸芯片放于匀胶机上，向此纸芯片上滴加40 mM的Zn(CH3COO)2·2H2O，以1000 rpm的速度旋涂60 s，取出纸片放于恒温干燥箱中干燥150 oC干燥10 min，将旋涂和加热干燥的步骤重复6次，即可获得附着有ZnO种子且生长有纳米多孔Pt粒子的纸芯片；随后将此纸芯片放于25 mM Zn(NO3)2·6H2O与25 mM六次甲基四胺的水溶液中，90 oC加热6 h即可；在ZnO纳米棒上生长CdS量子点：将上述生长有ZnO纳米棒的纸芯片放于10 mM的Cd(NO3)2和10 mM硫代乙酰胺中，室温下反应60 min，取出纸芯片，去离子水冲洗4次后干燥；将5 μL抗体固定在经上述功能化的纸芯片上的亲水区域，室温下干燥，随后用5 μL 1%的牛血清白蛋白掩蔽活性位点，室温下孵育50 min；
2.5将目标抗原或血清样品滴加到反应区，室温下孵化50 min；
2.6将纸芯片折叠，将40 μL含有抗坏血酸的、pH等于7.4的磷酸缓冲液，滴加到印有参比电极对电极的纸层上，在紫外灯的照射下，连接电化学设备进行测试，其中抗坏血酸和磷酸缓冲液的浓度均为0.1mol·L-1。
3. 根据权利要求1所述丝网印刷电极所用的纸材料为一级色谱纸。
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