CN109061190A - 基于纸芯片的多通道生物传感器阵列制备及免疫检测应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于纸芯片的多通道生物传感器阵列制备及免疫检测应用,利用蜡打印技术在纸上制备疏水区以及亲水区，通过配置绝缘层油墨制作绝对疏水的免疫工作区域以优化传感器的精确度和重复率；通过配置相应的导电油墨，在纸上印制相应的参考电极，工作电极和对电极，再对工作电极修饰纳米金以提高电极的灵敏度和相应区间；对工作电极进行功能化，将样品溶液中疾病抗体对固定的抗原进行特异性识别，使用第二抗体与第一抗体产生特异性酶联反应；利用电化学检测原理，第二抗体的酶对电化学基地溶液进行氧化还原反应，以此来量化样品中待测抗体的含量，实现了待测抗体的高灵敏检测。

Description

基于纸芯片的多通道生物传感器阵列制备及免疫检测应用

技术领域

本发明涉及电化学分析领域，具体涉及一种基于纸芯片的多通道生物传感器阵列制备及免疫检测应用。

背景技术

疾病的控制和治疗依赖于准确的诊断，其中，酶联免疫吸附法可用于检测多种疾病诊断，如艾滋、结核病、和肝炎。酶联免疫吸附测定也是临床诊断中使用最广泛的免疫学测试，它涉及抗原和抗体之间的特异性相互作用，并且通过标记抗体和底物之间的酶促反应测量分析物浓度。酶联免疫吸附法具有高灵敏度和特异性，可用于精确检测多种疾病标记物，如艾滋病，结核病，疟疾和乙型肝炎和丙型肝炎。然而，传统的酶联免疫吸附法是为装备精良的临床实验室设计的，需要昂贵的仪器和技术人员，消耗大量的样品和试剂，流程复杂且耗时。常规酶联免疫法的这些特征使得它难以在护理点或资源贫乏的环境中实施。

近些年来，基于技术的发展和进步，越来越多的报告已经证明微流体纸芯片生物传感器可以提供一种低成本，快速且可靠诊断设备的有利平台，并且可以用在发展中国家和发达国家的传染性疾病检测中。在检测方法方面，比色检测广泛应用于许多纸芯片传感器设计中，因为它的简单性和基于相机的兼容性远程医疗，适用于定性和半定量测试。然而，电化学检测有在纸芯片传感器设计中也很流行，而且更具吸引力由于其高精度和灵敏度。许多已经证明了电化学纸芯片传感器检测下限比比色测定的结果更低更有优势。此外，电化学检测对环境不敏感照明条件和样品中的杂质(例如灰尘和不溶性颗粒)，使其特别适合用于现场或肮脏的环境。由于电化学检测的多样性，高精度和高灵敏度，它被广泛地认可，和应用于纸芯片微流控传感器中。电化学纸芯片传感器可以借助酶联免疫吸附法，对待测蛋白进行特异性结合，并且通过酶催化电化学反应来量化检测待测物的浓度。

血糖试纸条代表低价便携且极具前景的电化学纸芯片检测平台，但是这些电化学读取器仅容纳一次一个纸传感器和一个被测物，并需要多次重复的手动操作，比如移液，信号读取，设备交换等等。在需要执行大量测试的情况下，这种设计将阻碍诊断。例如，临床鉴定未知发烧的起源可能归因于几种可能结核病，艾滋病毒和单核细胞增多症等疾病，往往需要多组生物标志物的检测，现有的电话线纸芯片传感器设计无法满足这种需求。

并且，现有的电化学传感器往往更关注电极的修饰以提高检测灵敏度，对于检测的高通量和高重复性无法满足。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于纸芯片的多通道生物传感器阵列制备及免疫检测应用，能够在实际应用中更快速检测血液中不同的待测物，和同种检测物的多次可靠的检测，而且电极的简单修饰更易扩展到不同的待测物检测中。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于纸芯片的多通道生物传感器阵列制备，制备方法包括以下步骤：

步骤1)在色谱纸上，用蜡打印机印制多个工作区域图案，用电加热板对具有蜡印的色谱纸进行加热，将蜡烤化并均匀渗透到色谱纸的内部，形成多组同样大小的工作区域与非工作区域；

步骤2)分别在多个工作区域内利用丝网印刷绝缘层油墨，形成完全不亲水的工作区域；

步骤3)在多个工作区域内利用丝网印刷多个电化学电极，在多个非工作区域内利用丝网印刷多个连接电极，连接电极用于连接电化学电极和检测仪器；

电化学电极包括参考电极、工作电极和对电极，参考电极、工作电极和对电极利用丝网印刷设置在工作区域内，并且参考电极的连接端、工作电极的连接端和对电极的连接端均穿过工作区域与对应的银连接电极连接；

步骤4)在多组工作区域内的工作电极的表面分别滴加纳米金溶液，静置待纳米金溶液中的液体自然蒸发后形成纳米金层；

步骤5)蒸发结束后，对工作区域清洗，得到阵列形式的多通道生物传感器。

进一步的，步骤1)中的烘烤温度为150摄氏度；步骤2)中在丝网印刷绝缘层油墨前，先采用二氧化碳切割机加工出具有与工作区域一致面积尺寸的镂空单层贴纸，将镂空单层贴纸覆盖非工作区域，露出工作区域；在丝网印刷绝缘层油墨后，先揭去镂空单层贴纸，而后置于60摄氏度下烘焙2个小时。

进一步的，步骤3)中的参考电极和工作电极之间设置有绝缘间隙并紧密靠近；对电极上设置有包覆臂，所述包覆臂环绕在工作电极外周上，所述包覆臂一端与参考电极一端相对设置；

进一步的，所述步骤3中参考电极、工作电极和对电极在绝缘层表面的覆盖面积大于绝缘层总面积的75％。

进一步的，所述连接电极、参考电极、工作电极和对电极均通过激光切割机加工的模板制备而成。

进一步的，所述连接电极的材质为银，连接电极通过丝网印刷后置于60摄氏度环境中烘培30分钟；所述参考电极的材质为银或氯化银，参考电极通过丝网印刷后置于60摄氏度环境中烘培60分钟；所述工作电极和对电极均为碳电极，通过丝网印刷后置于60摄氏度环境中烘培60分钟。

进一步的，所述步骤4)中在滴加纳米金溶液前，先采用去离子水冲洗工作区域并擦拭干净，静置待去离子水挥发；

步骤4)中在滴加纳米金溶液后，也采用去离子水冲洗工作区域并擦拭干净，静置待去离子水挥发；

步骤4)中滴加的纳米金溶液需要在工作电极表面形成一个凸起但不破裂的球形；

所述去离子水冲洗的次数至少为3次。

一种免疫检测应用，包括上述任意一项所述的多通道生物传感器，包括以下步骤：

步骤A，在工作电极的纳米金层表面滴加抗原，静置待抗原和纳米金层表面进行结合；结合结束后在纳米金层表面滴加缓冲液冲洗，并用滤纸从工作电极边缘将缓冲液吸附干净，重复此步骤3次，以洗去多余或者吸附不牢靠的抗原；

步骤B，在纳米金层表面滴加牛血清蛋白溶液作为阻断蛋白，静置待阻断蛋白与纳米金层表面未被抗原占领的位置进行结合；结合结束后在纳米金层表面滴加缓冲液冲洗，并用滤纸从工作电极边缘将缓冲液吸附干净，重复此步骤3次，洗去多余或者粘附不牢靠的阻断蛋白；

步骤C，在工作电极的纳米金层表面滴加待测样品液体，静置待样品中待测的第一抗体与固定好的抗原进行特异性免疫结合；结合结束后在纳米金层表面滴加缓冲液冲洗，并用滤纸从工作电极边缘将缓冲液吸附干净，重复此步骤3次，以洗去多余蛋白；

步骤D，在工作电极表面滴加第二抗体溶液，静置待第二抗体与第一抗体进行特异性免疫结合；结合结束后在纳米金层表面滴加缓冲液冲洗，并用滤纸从工作电极边缘将缓冲液吸附干净，重复此步骤3次，以洗去多余蛋白；

步骤E，在工作区域滴加电化学基底溶液，电化学基底溶液覆盖整个工作区域，将传感器的连接电极连接上多通道电化学仪进行同时测试，至此准确测定待测样品中抗体的浓度。

进一步的，当步骤B中冲洗结束后，能够静置在冰箱4摄氏度条件下待用。

本发明的有益效果：

本发明是一种基于纸芯片的高通量电化学诊断平台，能够进行抗体检测的多重电化学酶联免疫吸附测定；该平台集成了基于电化学微流体纸的免疫传感器阵列，可以在至少8个血清样品上行进行酶联免疫法，在20分钟内产生检测结果，并通过感应电极的表面生物功能化提高测定灵敏度；为了更适用临床待测体液的复杂性，本发明利用绝缘层油墨，将它覆盖在色谱纸上，以降低蛋白质在纸空隙里的非特异性吸附，以优化了电极基底设计以提高检测的重复性；本发明所提出的纸芯片传感器可对多种抗体进行准确检测，适用范围广。

附图说明

图1是本发明的制作工艺流程示意图；

图2是本发明的传感器示意图；

图3是本发明的传感器爆炸示意图；

图4是本发明使用时的抗体检测酶联免疫原理图；

图5是本发明传感器在抗体检测中的标定曲线。

图中标号说明：1、色谱纸，2、蜡印，3、工作区域，4、绝缘层油墨，5、连接电极，6、参考电极，7、工作电极，8、对电极，9、纳米金层，10、抗原，11、阻断蛋白，12、第一抗体，13、第二抗体，14、酶，15、电化学基底溶液。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明的基于纸芯片的多通道生物传感器阵列制备的一实施例：

以能够供给8组样品同时检测为例，制备方法如图1至图3所示，并包括以下步骤：

首先利用AutoCAD软件设计出一个76毫米乘以28毫米的纸芯片，在纸芯片内设计8组半径4毫米的工作区域，在非工作区域覆蜡；纸芯片采用色谱纸1为基材，用蜡打印机印制8个工作区域图案，用电加热板对具有蜡印2的色谱纸进行加热，在150摄氏度下将蜡烤化并均匀渗透到色谱纸的内部，形成8组同样大小的工作区域3与非工作区域；

然后采用二氧化碳激光切割机加工出具有与工作区域一致面积尺寸的镂空单层贴纸，将镂空单层贴纸覆盖非工作区域，露出工作区域；分别在8个工作区域内利用丝网印刷绝缘层油墨4，印刷结束后揭去镂空单层贴纸，而后置于60摄氏度下烘焙2个小时形成稳定的不粘连的绝缘层，即形成完全不亲水的工作区域以降低蛋白质在色谱纸内的非特异性粘连，提高化学和蛋白免疫反应的重复率和精确度；

接着用激光切割机加工出用于印制连接电极的模版，在8个非工作区域内利用丝网印刷24个连接电极5,每个非工作区域内印刷3个，然后置于60摄氏度下烘焙半小时以形成帖服的连接电极5，连接电极用于连接电化学电极和检测仪器，连接电极的材质较佳为银；

而后用激光切割机加工出用于印制电化学电极的模版，电化学电极包括参考电极6、工作电极7和对电极8，参考电极、工作电极和对电极的使用端位于工作区域内，连接端则位于非工作区域内，参考电极、工作电极和对电极利用丝网印刷设置，并且参考电极的连接端、工作电极的连接端和对电极的连接端均穿过工作区域与对应的银连接电极连接；制备好后置于60摄氏度下烘焙1小时以形成帖服的电化学电极；上述的参考电极的材质为银或氯化银，工作电极和对电极均为碳电极，因此工作电极和对电极可以同时制备，参考电极与工作电极和对电极分开制备；制备后的工作区域即为电化学池，参考电极和工作电极之间设置有绝缘间隙并紧密靠近，以稳定电化学池的电压；对电极上设置有包覆臂，包覆臂环绕在工作电极外周上，包覆臂一端与参考电极一端相对设置，以提供有效对电流；

其中参考电极、工作电极和对电极在绝缘层表面的覆盖面积大于绝缘层总面积的75％，较佳为80％以上，使工作区域的面积最大化，以增大传感器的灵敏度和对不同待测物浓度的适应能力；

最后在8组工作区域内的工作电极的表面分别滴加纳米金溶液，先采用100微升去离子水冲洗工作区域并擦拭干净，重复此步骤3次，以形成干净且一致的工作电极；在干净容器里静置10分钟待水分完全挥发；平置传感器，在工作电极的表面小心滴加40微升的纳米金溶液，以形成一个凸起但不破裂的球形，纳米金溶液球刚好覆盖整个绝缘层领域内的工作电极区域；碳材质的工作电极的表面张力可以刚好支撑住40微升的纳米金溶液重量，使工作电极表面的纳米金数量最大化，以形成面积最大且一致的纳米金层；在传感器上方覆盖黑匣子，静置8个小时，让纳米金溶液内的液体全部随空气蒸发；结束后也采用100微升去离子水冲洗工作区域并小心擦拭干净，重复此步骤3次，以形成干净且一致的工作电极，此时工作电极表面具有纳米金层9；在干净容器里静置10分钟待水分完全挥发，即可得到阵列形式的多通道生物传感器。

利用此多通道生物传感器和酶联免疫吸附法，可以进行多种性传播疾病中免疫检测的应用，以艾滋病抗体检测为例；基于此高通量电化学传感器，本实验将采用间接酶联免疫法实施的步骤为：

在多通道生物传感器的8个工作电极的纳米金层表面滴加4微升的艾滋病gp41抗原10(以下步骤中均为8个工作区域同时制备)，静置3分钟，待抗原和纳米金表面进行结合；结合结束后轻轻在纳米金层表面滴加60微升磷酸盐缓冲液冲洗，并用滤纸从工作电极边缘将溶液吸附干净，重复此步骤3次，以洗去多余或者粘附不牢靠的抗原，形成固定好且一致的抗原、纳米金层和碳工作电极的多层结构；

在纳米金层表面滴加4微升的牛血清蛋白溶液作为阻断蛋白11，静置10分钟，待阻断蛋白与纳米金层表面未被抗原占领的位置进行结合；结合结束后轻轻在纳米金层表面表面滴加60微升磷酸盐缓冲液冲洗，并用滤纸从工作电极边缘将溶液吸附干净，重复此步骤3次，以洗去多余或者粘附不牢靠的阻断蛋白，以形成全部站位点被抗原或阻断蛋白结合成功的纳米金层和碳电极多层结构；

此时多通道生物传感器能够静置在冰箱4摄氏度条件下待用；

取出一片生物传感器，在工作电极的纳米金层表面滴加待测样品液体，静置5分钟，待样品中待测的第一抗体12与固定好的抗原进行特异性免疫结合；结合结束后轻轻在纳米金层表面滴加60微升磷酸盐缓冲液冲洗，并用滤纸从工作电极边缘将缓冲液吸附干净，重复此步骤3次，以洗去多余蛋白；

接着在工作电极表面滴加ALP标记的山羊抗兔IgG(用作第二抗体13)用于与人艾滋病抗体结合，通过第二抗体的酶14反应，静置5分钟，待第二抗体与第一抗体进行特异性免疫结合；结合结束后在纳米金层表面滴加缓冲液冲洗，并用滤纸从工作电极边缘将缓冲液吸附干净，重复此步骤3次，以洗去多余蛋白；

最后在工作区域滴加电化学基底溶液15，电化学基底溶液覆盖整个工作区域，将传感器的24个连接电极连接上多通道电化学仪进行同时测试，利用0.12V电压的计时安培分析法(chronoamperometry)，获取电流，至此可准确测定待测血液中艾滋病抗体的浓度。

如图4所示，为艾滋病抗体检测酶联免疫原理图，如图5所示，为传感器在艾滋病抗体检测中的标定曲线。

上述在操作过程中，可以加入不同浓度艾滋病抗体的人血清应用于WE，使艾滋病抗体与固定的艾滋病gp41抗原结合,然后洗涤WE以除去血清中的所有其他组；将ALP标记的山羊抗兔IgG(用作第二抗体)用于与人艾滋病抗体结合，然后进行另一个洗涤步骤.因此，WE表面上的酶量与结合到板上的艾滋病抗体的量成比例；最后加入酶的pAPP底物并通过ALP催化，产生电流测量电流输出；酶联免疫法结果报告为安培计电流，作为血清中艾滋病抗体浓度的函数。

它可以在纸的微流体通道中自动完成酶联免疫测试，不需要复杂的设备和人为操作；可以检测纸基传感器中的生物标记物，并同步无线传输给电脑和手机；它成本低、易操作、可靠、精度高，可进行家庭医疗和点对点护理；

电极修饰：为了进一步提高蛋白质检测的灵敏度，利用纳米金颗粒修饰工作电极，以：(i)使碳电极更亲水，使溶液更好地电极润湿；(ii)提供用于与蛋白质生物标志物结合的氨基；(iii)增大体表比；(iv)纳米金颗粒修饰的工作电极更具亲水性以吸收液体和转移缓冲液；

本传感器具有高通量，高重复率，使用绝缘层油墨，灵敏度高，高便携性，价格低廉的效果。

本发明利用蜡打印技术在纸上制备疏水区以及亲水区，通过配置绝缘层油墨制作绝对疏水的免疫工作区域以优化传感器的精确度和重复率；通过配置相应的导电油墨，在纸上印制相应的参考电极，工作电极和对电极，再对工作电极修饰纳米金以提高电极的灵敏度和相应区间；对工作电极进行功能化，将样品溶液中抗体对固定的抗原进行特异性识别，使用第二抗体与第一抗体产生特异性酶联反应；利用电化学检测原理，第二抗体的酶对电化学基地溶液进行氧化还原反应，以此来量化样品中待测抗体的含量，实现了待测抗体的高灵敏检测。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (9)

1.一种基于纸芯片的多通道生物传感器阵列制备，其特征在于，制备方法包括以下步骤：

步骤1)在色谱纸上，用蜡打印机印制多个工作区域图案，用电加热板对具有蜡印的色谱纸进行加热，将蜡烤化并均匀渗透到色谱纸的内部，形成多组同样大小的工作区域与非工作区域；

步骤2)分别在多个工作区域内利用丝网印刷绝缘层油墨，形成完全不亲水的工作区域；

步骤3)在多个工作区域内利用丝网印刷多个电化学电极，在多个非工作区域内利用丝网印刷多个连接电极，连接电极用于连接电化学电极和检测仪器；

电化学电极包括参考电极、工作电极和对电极，参考电极、工作电极和对电极利用丝网印刷设置在工作区域内，并且参考电极的连接端、工作电极的连接端和对电极的连接端均穿过工作区域与对应的银连接电极连接；

步骤4)在多组工作区域内的工作电极的表面分别滴加纳米金溶液，静置待纳米金溶液中的液体自然蒸发后形成纳米金层；

步骤5)蒸发结束后，对工作区域清洗，得到阵列形式的多通道生物传感器。

2.如权利要求1所述的基于纸芯片的多通道生物传感器阵列制备，其特征在于，步骤1)中的烘烤温度为150摄氏度；步骤2)中在丝网印刷绝缘层油墨前，先采用二氧化碳激光切割机加工出具有与工作区域一致面积尺寸的镂空单层贴纸，将镂空单层贴纸覆盖非工作区域，露出工作区域；在丝网印刷绝缘层油墨后，先揭去镂空单层贴纸，而后置于60摄氏度下烘焙2个小时。

3.如权利要求1所述的基于纸芯片的多通道生物传感器阵列制备，其特征在于，步骤3)中的参考电极和工作电极之间设置有绝缘间隙并紧密靠近；对电极上设置有包覆臂，所述包覆臂环绕在工作电极外周上，所述包覆臂一端与参考电极一端相对设置。

4.如权利要求1所述的基于纸芯片的多通道生物传感器阵列制备，其特征在于，所述步骤3中参考电极、工作电极和对电极在绝缘层表面的覆盖面积大于绝缘层总面积的75％。

5.如权利要求1所述的基于纸芯片的多通道生物传感器阵列制备，其特征在于，所述连接电极、参考电极、工作电极和对电极均通过激光切割机加工的模板制备而成。

6.如权利要求1所述的基于纸芯片的多通道生物传感器阵列制备，其特征在于，所述连接电极的材质为银，连接电极通过丝网印刷后置于60摄氏度环境中烘培30分钟；所述参考电极的材质为银或氯化银，参考电极通过丝网印刷后置于60摄氏度环境中烘培60分钟；所述工作电极和对电极均为碳电极，通过丝网印刷后置于60摄氏度环境中烘培60分钟。

7.如权利要求1所述的基于纸芯片的多通道生物传感器阵列制备，其特征在于，所述步骤4)中在滴加纳米金溶液前，先采用去离子水冲洗工作区域并擦拭干净，静置待去离子水挥发；

步骤4)中在滴加纳米金溶液后，也采用去离子水冲洗工作区域并擦拭干净，静置待去离子水挥发；

步骤4)中滴加的纳米金溶液需要在工作电极表面形成一个凸起但不破裂的球形；

所述去离子水冲洗的次数至少为3次。

8.一种免疫检测应用，其特征在于，包括权利要求1-7中任意一项所述的多通道生物传感器，包括以下步骤：

步骤A，在工作电极的纳米金层表面滴加抗原，静置待抗原和纳米金层表面进行结合；结合结束后在纳米金层表面滴加缓冲液冲洗，并用滤纸从工作电极边缘将缓冲液吸附干净，重复此步骤3次，以洗去多余或者吸附不牢靠的抗原；

步骤B，在纳米金层表面滴加牛血清蛋白溶液作为阻断蛋白，静置待阻断蛋白与纳米金层表面未被抗原占领的位置进行结合；结合结束后在纳米金层表面滴加缓冲液冲洗，并用滤纸从工作电极边缘将缓冲液吸附干净，重复此步骤3次，洗去多余或者粘附不牢靠的阻断蛋白；

步骤C，在工作电极的纳米金层表面滴加待测样品液体，静置待样品中待测的第一抗体与固定好的抗原进行特异性免疫结合；结合结束后在纳米金层表面滴加缓冲液冲洗，并用滤纸从工作电极边缘将缓冲液吸附干净，重复此步骤3次，以洗去多余蛋白；

步骤D，在工作电极表面滴加第二抗体溶液，静置待第二抗体与第一抗体进行特异性免疫结合；结合结束后在纳米金层表面滴加缓冲液冲洗，并用滤纸从工作电极边缘将缓冲液吸附干净，重复此步骤3次，以洗去多余蛋白；

步骤E，在工作区域滴加电化学基底溶液，电化学基底溶液覆盖整个工作区域，将传感器的连接电极连接上多通道电化学仪进行同时测试，至此准确测定待测样品中抗体的浓度。

9.如权利要求8所述的一种免疫检测应用，其特征在于，当步骤B中冲洗结束后，能够静置在冰箱4摄氏度条件下待用。