CN102980998A - 高通量微流控纸芯片即时快速检测多种人体肿瘤标志物 - Google Patents

Abstract

本发明要解决的技术问题是提供了一种无需特殊样品前处理、诊断监测速度快、灵敏度高、特异性强，现场体外即时多疾病同时诊断监测的多通道微流控纸芯片免疫传感器的制备及检测方法，此方法可以在绝大多数实验室中轻易实现而不需要复杂繁琐的大型设备支持。该传感器底端的胶片电极可以多次反复使用，大大降低了诊断监测成本。灵敏度高，可以达到ng级；诊断监测速度快，完成一个基本诊断监测过程仅需1-2分钟的时间，可在短时间内实现大量样本的高通量筛选。

Description

高通量微流控纸芯片即时快速检测多种人体肿瘤标志物

技术领域

本发明涉及一种检测装置，尤其涉及一种能高通量检测样品中多种肿瘤标志物的便携式快速检测微流控纸芯片装置及其与自制胶片电极的结合应用。 

背景技术

血液和组织中的肿瘤标志物的水平为临床癌症筛选和疾病诊断提供了非常重要的信息，因此，如能现场快速即时诊断肿瘤标志物将促进疾病的及时发现与治疗。目前，化学传感器领域中一个非常重要的新领域就是为医学诊断发展一种简单经济实用的传感器。具备简单、经济、快速、信号稳定等性能的传感器装置，使发展中国家及边远地区普及使用医疗保健设备成为可能。为适应临床诊断和即时检测的要求，实验室芯片应运而生，为全球健康及其它应用提供了可能行。实验室芯片的重要性和应用性已被广泛认知，复杂的实验室设备和概念验证也正被进一步的研究。目前市场上已有几种使用无尘技术的商业化芯片产品，但为数不多，这一方面是因为实验室芯片尽管比传统分析设备简单，但仍然没有得到普及，特别是在发展中国家；另一方面大多数的实验室芯片部件是由玻璃、塑料、硅胶原料等构成的通道、泵、阀门等，这些部件复杂且比较昂贵，再次这类产品检测样品所花费的时间比较长。 

为使越来越多的人能够使用即时检测装置，新型传感器需具备以下特征：原材料易得、廉价，有实用可读的分析仪器可供使用。需要注意的是现存的很多临床检测都是使用多孔基质，比如抓绒、过滤膜、丝网等等，这些装置因为体积小，均已被称为实验室芯片。纸通常是由纤维素纤维构成的，数量丰富、价格便宜、可放置时间长，可一次性使用，易于储藏、运输，易于进行化学修饰、并为大众所熟悉。怀特塞得等人第一次描述了构建微流控纸传感器，其中微流控通道是通过光刻胶产生的疏水图案，该微流控纸芯片装置具有以下优点：通过毛吸作用而不需要额外的流动运输装置，只需要很小的样品体积，可以用来过滤或者分离样品，易于焚化处理。有很多经济实用的构建微流控纸芯片的方法已被应用，其中打印是最经济，并最容易进行大量生产的方式之一，而打印中最省时有效的构建纸传感器的则是蜡打印。微流控纸芯片传感器可用比色法和电化学方法来检测，其中电化学免疫传感器之所以引起公众极大的兴趣是由于此法大量生产时成本较低，需样量较少及较高的灵敏度。电化学尤其适合免疫传感器检测因为其整体检测装置已经像市场上现有的血糖仪一样简单微型化，涉及到的丝网印刷电极的生产及使用技术也已非常成熟。此外，纸上电化学呈现出了较好的运行结果；纤维素纤维没有任何扩散阻碍，反而，黏贴在电极表面的浸透的芯片使检测更不易受震动和其它对流的影响。由于肿瘤标志物的特异选择性，同时筛选多种癌症的多通道免疫检测方法迫切需要。这些方法通常使用酶比如辣根过氧化物酶来产生电化学信号。为了能在疾病早期检测更低水平的生物标记物，人们采用了很多信号放大的措施来增强识别电子信号的传输，特别是纳米材料的应用，像金纳米粒子、碳纳米管、金属氧化物、半导体等等。本专利选用碳纳米管为例，因为他们具有抗张强度大、比表面积大、电子传导率高、导热性能好等的优点；碳纳米管生物传感器因其具有现成可用的框架模块，能适用微量检测的小型化设备，以及碳纳米管极好的电子传输特性而被广泛关注并运用；此外，碳纳米管可以固定生物分子并维持它们的生物活性，比如酶反应和识别功能；最重要的是小型化的纳米传感器平台的开发实现了半自动化的一次性样品检测。 

本文第一次在使用碳纳米管的基础上将微流控纸芯片与电化学相结合。将蜡打印微流控纸芯片与丝网印刷电极相结合，构建低成本、一次性使用的碳纳米管电化学微流控纸芯片传感器。在安培免疫检测中采用的多路复用电极避免了串扰和除氧过程，这极大地简化了检测过程。此类传感器通过碳纳米管壳聚糖修饰的纸芯片来捕获抗体，碳纳米管用于加速电子转移速率，放大酶信号以提高传感器的灵敏度。用几种抗原作为实例分析物，超灵敏多路复用免疫传感器展现了极好的分析性能。这种简单、经济、线性范围广、重现性好、灵敏度高的免疫传感器在临床检测不同的肿瘤标志物方面有很好的发展前景。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供了一种诊断监测速度快、灵敏度高、特异性强，现场体外即时多疾病同时诊断监测的多通道微流控纸芯片免疫传感器的制备及检测方法，此方法可以在绝大多数实验室中轻易实现而不需要复杂繁琐的大型设备支持。 

本发明用碳纳米管多通道微流控纸芯片免疫传感器的制造方法，其特征包括以下步骤 

（1）在色谱纸上用蜡打印机打印设计的通道图案，用电子控温仪器对蜡印的色谱纸进行加热，目的是将蜡烤化并使其均匀的渗透到色谱纸的内部，从而在未印蜡的部位形成亲水通道；

（2）选择病人体内的某几种肿瘤标志物作为抗原，并制备与抗原一一对应的抗体；

（3）采用辣根过氧化物酶标记的抗体作为二抗，便于检测电化学信号；

（4）将纳米材料修饰于处理后的纸芯片通道上，用以提高微流控纸芯片的导电性，提高其灵敏度；

（5）在步骤（4）之后修饰用于捕捉抗体的壳聚糖等多糖类；

（6）处理好的微流控纸芯片需要与丝网印刷电极相结合检测电信号；

（7）丝网印刷电极在使用前需要用抛光粉打磨光滑，备用。

本发明所述电极为多电极体系形成的多通道免疫，多通道数量可以在2—8之间； 

本发明所述纳米材料包括石墨烯、碳纳米管、金纳米离子、金属氧化物、半导体等等；

附图说明

图1. a—微流控纸芯片免疫修饰过程的区域； 

    b—将工作电极与参比电极和对电极相连使其能顺利通过电化学方法进行检测；

    c—对应a的两个工作电极；

    d—银/氯化银参比电极；

    e—石墨对电极；

    f—导电通道；

    g—聚酰胺纤维胶片；

图2. 1—图1中的a区域的剖面图；

    2—在a区域中先修饰碳纳米管再修饰壳聚糖后的示意图；

    3—在2步骤后，捕获与抗原相应的抗体；

    4—用牛血清白蛋白封闭可能结合抗原的位点；

    5—抗体捕获相应的抗原；

    6—用酶标记的抗体与抗原结合。

实施例1 CEA 和CA125 两种肿瘤标记物的检测

CEA：癌胚抗原，一种酸性糖蛋白。主要存在于胎儿消化到上皮组织、胰脏和肝脏。正常成人血清中CEA的含量极低，但发生肿瘤时可重新表达，并随肿瘤分期的进展、细胞恶性程度的升高而逐渐升高。其中以结肠癌升高为甚，约有70%~90%显示阳性。血清CEA水平变化与结肠癌Duke分期密切相关。对于CEA升高的结肠癌患者，血清CEA水平与癌肿大小、有无转移存在一定关系，当发生肝转移时，CEA升高更为明显。

   CA125：1983年由Bast等从上皮性卵巢癌抗原检测出可被单克隆抗体OC125结合的一种糖蛋白。95%的健康女性CA125水平≤35U/mL。如果病人血清CA125的水平是基线水平的两倍，就应该立即进行检查。另外, CA125不仅是卵巢癌的特异性标志物，输卵管腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、胰腺癌、肠癌、乳腺癌和肺癌患者CA125的水平也会升高。 

具体步骤： 

（1）在血液或分泌物样品中提取CEA和CA125作为抗原。然后通过动物体内注射方法制备上述抗原对应的抗体。

（2）制备双工作电极检测装置：设计双电极丝网印刷模板，用丝网印刷机或手工印刷石墨电极和银氯化银电极，并打磨光滑备用。设计与胶片电极模型对应的纸芯片，用蜡印机打印出设计的图案，并烘烤至蜡渗透纸芯片，制备吸水的工作区域， 

（3）将150微升酸化好的碳纳米管滴加到工作电极对应的工作区域进行修饰，并进一步分别滴加50微升的壳聚糖和戊二醛对纸芯片进行修饰，为接抗原抗体做好准备。

（4）将步骤（1）中制备的相应的5微升的一抗修饰到步骤（2）中处理好的纸芯片上，随后用30微升牛血清白蛋白封闭可能存在的活性位点，随后接相应的5微升的抗原，反应完全后，接带辣根过氧化物酶标记的10微升的二抗，每一步接抗原抗体的后面都用pH 6.8的缓冲溶液进行洗涤，以洗涤掉吸附性不稳固的抗原或者抗体，使检测更加灵敏、准确。 

（5）如图所示，将修饰有CEA和CA125的微流控纸芯片免疫传感器置于底端的胶片电极上，将电极与电化学工作站相连接，检测时滴加一定浓度的双氧水，使其与辣根过氧化物酶反应，此时用电化学工作站记录下显示的电流值，根据电流值的大小准确诊断检测物质的量。 

实施例2. AFP和CA199、CEA三种肿瘤标记物的检测

AFP：甲胎蛋白又称APF，它是胚胎时期血液里含有的一种特殊蛋白质，只有在胎儿的肝细胞中才能合成，尤其在怀孕16—20周时，胎儿的这种蛋白质含量最高，100毫升血中可达到300—400毫克，以后逐渐减少，待出生以后一周完全消失。一般情况下只存在于胎儿的血液中，正常人的肝细胞是不产生甲胎蛋白的，可是当得了肝癌时，由于肝细胞幼稚化无休止地生长恶化，就又恢复了合成甲胎蛋白的能力，有时在100毫升血中竟达到1000毫克的高度，所以检查AFP在血液中的含量，对这类疾病的发现和诊断有重要意义。

CA199：CA199是胰腺癌和结、直肠癌的标志物。血清CA199阳性的临界值为37KU/L。胰腺癌患者85%-95%为阳性。肿瘤切除后CA199浓度会下降，如在上升，则可表示复发。结直肠癌、胆囊癌、胆管癌、肝癌和胃癌的阳性率也很高，若同时检测CEA和AFP可进一步提高阳性检测率。 

CEA：癌胚抗原，一种酸性糖蛋白。主要存在于胎儿消化到上皮组织、胰脏和肝脏。正常成人血清中CEA的含量极低，但发生肿瘤时可重新表达，并随肿瘤分期的进展、细胞恶性程度的升高而逐渐升高。其中以结肠癌升高为甚，约有70%~90%显示阳性。血清CEA水平变化与结肠癌Duke分期密切相关。对于CEA升高的结肠癌患者，血清CEA水平与癌肿大小、有无转移存在一定关系，当发生肝转移时，CEA升高更为明显。 

具体步骤： 

（1）在血液或分泌物样品中提取AFP、CA125和CA199作为抗原。然后通过动物体内注射方法制备上述抗原对应的抗体。

（2）制备三工作电极检测装置：设计双电极丝网印刷模板，用丝网印刷机或手工印刷石墨电极和银氯化银电极，并打磨光滑备用。设计与胶片电极模型对应的纸芯片，用蜡印机打印出设计的图案，并烘烤至蜡渗透纸芯片，制备吸水的工作区域， 

（3）将150微升酸化好的碳纳米管滴加到工作电极对应的工作区域进行修饰，并进一步分别滴加50微升的壳聚糖和戊二醛对纸芯片进行修饰，为接抗原抗体做好准备。

（4）将步骤（1）中制备的相应的5微升的一抗修饰到步骤（2）中处理好的纸芯片上，随后用30微升牛血清白蛋白封闭可能存在的活性位点，随后接相应的8微升的抗原，反应完全后，接带辣根过氧化物酶标记的16微升的二抗，每一步接抗原抗体的后面都用pH 6.8的缓冲溶液进行洗涤，以洗涤掉吸附不稳固的抗原或者抗体，使检测更加灵敏、准确。 

（5）如图所示，将修饰有AFP、CA199和CEA的微流控纸芯片免疫传感器置于底端的胶片电极上，将电极与电化学工作站相连接，检测时滴加一定浓度的双氧水，使其与辣根过氧化物酶反应，此时用电化学工作站记录下显示的电流值，根据电流值的大小准确诊断检测物质的量。 

  

具体实施方式

（1）手动印刷本实验所用胶片电极，并用三氧化二铝抛光粉将电极打磨光滑，备用； 

（2）使用蜡打印机打印如图1-A所示图案，并使用电子控温仪器对印蜡的色谱纸进行加热，使蜡均匀的渗透到色谱纸内部，未印蜡的区域形成微流控纸芯片通道；

（3）选用多壁碳纳米管，用硝酸和硫酸的混合酸酸化碳纳米管，使其带羧基；

（4）将100-200微升酸化的碳纳米管溶液滴到图1所示的a区域即通道区域；

（5）待碳纳米管溶液在纸上完全干燥后，在a区域滴加10-100微升的壳聚糖溶液；

（6）待壳聚糖溶液在纸上与碳纳米管结合完全，并稳定吸附于纸上后，a区域滴加10-100微升的戊二醛溶液，并等其自然干燥；

（7）用pH为6.8的Tris-HNO₃缓冲溶液冲洗三次，冲洗方法为：正面滴加缓冲溶液，在反面用吸水纸引水；

（8）缓冲溶液干透后，在a区域的两端分别滴加1-10微升的两种不同种类的一抗；

（9）重复步骤（7），洗去未吸附或吸附不牢固的抗体

（10）待一抗溶液在a区域吸附稳固后，再滴加20-100微升的牛血清白蛋白溶液，以封闭可能得活性位点；

（11）重复步骤（7）；

（12）在a区域滴加与步骤（8）中分别相对应的1-10微升的抗原，使其反应完全；

（13）在反应完全后，立即重复步骤（7）；

（14）缓冲溶液洗脱后即可在a区域滴加相对应的5-20微升的二抗，使其充分反应；

（15）之后立即重复步骤（7）；

（16）在完成最后一步洗涤后，将微流控纸芯片通道放置于制备好的胶片电极上，并滴加一定浓度的双氧水，立即用电化学工作站进行检测。至此即可准确测定样品中抗原的浓度。

本发明简便、经济、是用，有很好的发展前景。 

本文示意图以两电极体系为例，多工作电极体系可以依次类推增加工作电极的个数。 

本发明的有益效果： 

1. 本发明底端的胶片电极可以设计为2-8电极体系，这样对应的纸芯片亦需要设计为对应电极数的工作区域，利用不同界面的抗原抗体的特异性结合，识别肿瘤细胞，即可进行同时检测；这样修饰的样品可以同时对血液样品进行识别，相应的抗原抗体结合，使诊断检测步骤更加简单，更易于非专业人士操作；该传感器底端的胶片电极可以多次反复使用，大大降低了诊断监测成本。

2. 本发明所得到的现场快速体外即时多疾病同时诊断监测微流控纸芯片免疫传感器，可以实现样本中多种疾病抗原的高特异性、高灵敏度、同时快速诊断监测。 

3. 本发明的现场快速体外即时多疾病同时诊断监测微流控纸芯片免疫传感器的特异性强，样品中其它非特异性物质对诊断监测结果无影响；灵敏度高，可以达到ng级；诊断监测速度快，完成一个基本诊断监测过程仅需1-2分钟的时间，可在短时间内实现大量样本的高通量筛选，成本低。 

4. 本发明的现场快速体外即时多疾病同时诊断监测微流控纸芯片免疫传感器诊断监测疾病抗原的方法，操作快速简单，反应及结果均由仪器自动完成和记录，避免了主观因素的影响，并保证有很好的重复性，便于现场诊断监测。 

5. 本发明的现场快速体外即时多疾病同时诊断监测微流控纸芯片免疫传感器可以用于环境样品溶液、体液、血液或分泌物样品等多种样品的诊断监测，这就是使得该免疫传感器可用于传染病的传播和流行环节的诊断和监测，并能现场及时的发现、预防、快速诊断传染性疾病。 

6. 本发明的工作电极可以多个（2-8个），但参比电极和对电极可以共用一套，这样既有利于制备电极时成本的节省，也有利于减小不同电极间的误差，更有利于整体检测的准确性和灵敏度。 

Claims (2)

1.本发明用碳纳米管多通道免疫微流控纸芯片的制造方法，其特征包括以下步骤：

（1）在色谱纸上用蜡打印机打印设计的通道图案，用电子控温仪器对蜡印的色谱纸进行加热，目的是将蜡烤化并使其均匀的渗透到色谱纸的内部，从而在未印蜡的部位形成亲水通道；

（2）选择病人体内的某几种肿瘤标志物作为抗原，并制备与抗原一一对应的抗体；

（3）采用辣根过氧化物酶标记的抗体作为二抗，便于检测电化学信号；

（4）将纳米材料修饰于处理后的纸芯片通道上，用以提高微流控纸芯片的导电性，提高其灵敏度；

（5）在步骤（4）之后修饰用于捕捉抗体的壳聚糖等多糖类；

（6）处理好的微流控纸芯片需要与丝网印刷电极相结合检测电信号；

（7）丝网印刷电极在使用前需要用抛光粉打磨光滑，备用。

2.本发明所述电极为多电极体系形成的多通道免疫，多通道数量可以在2—8之间；

本发明所述纳米材料包括石墨烯、碳纳米管、金纳米离子、金属氧化物、半导体等等； 

具体实施步骤包括：

（1）手动印刷本实验所用胶片电极，并用三氧化二铝抛光粉将电极打磨光滑，备用；

（2）使用蜡打印机打印设计好的图案，并使用电子控温仪器对印蜡的色谱纸进行加热，使蜡均匀的渗透到色谱纸内部，未印蜡的区域形成微流控纸芯片通道；

（3）选用多壁碳纳米管，用硝酸和硫酸的混合酸酸化碳纳米管，使其带羧基；

（4）将100-200微升酸化的碳纳米管溶液滴到通道区域；

（5）待碳纳米管溶液在纸上完全干燥后，在通道区域滴加10-100微升的壳聚糖溶液；

（6）待壳聚糖溶液在纸上与碳纳米管结合完全，并稳定吸附于纸上后，通道区域滴加10-100微升的戊二醛溶液，并等其自然干燥；

（7）用pH为6.8的Tris-HNO₃缓冲溶液冲洗三次，冲洗方法为：正面滴加缓冲溶液，在反面用吸水纸引水；

（8）缓冲溶液干透后，在通道区域的两端分别滴加1-10微升的两种不同种类的一抗；

（9）重复步骤（7），洗去未吸附或吸附不牢固的抗体；

（10）待一抗溶液在a区域吸附稳固后，再滴加20-100微升的牛血清白蛋白溶液；

（11）重复步骤（7）；

（12）在通道区域滴加与步骤（8）中分别相对应的1-10微升的抗原，使其反应完全；

（13）在反应完全后，立即重复步骤（7）；

（14）缓冲溶液洗脱后即可在通道区域滴加相对应的5-20微升的二抗，使其充分反应；

（15）之后立即重复步骤（7）；

（16）在完成最后一步洗涤后，将微流控纸芯片通道放置于制备好的胶片电极上，并滴加一定浓度的双氧水，立即用电化学工作站进行检测，至此即可根据显示的电流值准确测定样品中抗原的浓度。

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