CN108273573A - 一种可一步实现elisa免疫反应的三维纸芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片及其制备方法，本发明涉及一种三维纸芯片及其制备方法。本发明要解决现有酶反应的信号放大方法往往需要多步和更加复杂的处理过程，且易出现交叉污染和样品使用量多的问题。一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片包括第一固定板、第二固定板、第三固定板、第一引流层、第二引流层、第三引流层、第四引流层、存储层、第一结合孵化层、第二结合孵化层、捕获层、第一吸水层及第二吸水层；方法：一、三位纸芯片的加工；二、三维纸芯片的组装。
Description
技术领域
本发明涉及一种三维纸芯片及其制备方法。
背景技术
纸基微流控芯片(Microfluidic paper based analytical devices,μPADs)在2007年由Whitesides课题组提出。近年来在各个领域中获得了越来越多的关注，比如，医疗诊断、食品安全检测、环境分析以及细胞培养等等。纸芯片通常可以利用PDMS或者光刻胶等在纸表面加工出各种各样的疏水图案或者通道。基于光刻或者PDMS绘制等工艺加工纸芯片，往往需要光刻机、光刻胶以及昂贵的喷绘打印机等设备。同时光刻胶往往很难去除干净，残留在纸芯片上的光刻胶还会影响检测结果。然而普通的喷蜡打印工艺仍然需要喷蜡打印机，在资源有限的偏远地区不容易获得。Wijitar等人2011年提出了基于丝网印刷工艺加工纸芯片的方法。该方法简单，加工材料容易获得，且不需要昂贵的设备。
基于纸芯片的诊断检测，具有低成本，易操作，一次性等优点，在即时检测领域获得了越来越多研究者的关注。试纸条检测基于胶体金技术已经被用来检测蛋白或者抗体。然后它只适合单步操作，不能集成复杂操作或者信号增强的步骤等，因而具有较低的灵敏度。为解决上述问题，可以通过金或银纳米颗粒的增强反应来放大检测后的化学信号，或者通过酶反应的方式来得到较高灵敏度的检测信号。然而这些信号放大或者酶反应的操作过程往往需要多步复杂的反应，在纸芯片如何实现这些操作的关键在于如何精确的控制流体在纸芯片中的流动时间或方式。Yager等人通过设计不同的纸通道长度，进而控制了流体或者样品在不同通道中的流动时间，来实现了多步的反应。此外还可以通过将蔗糖或者蜡溶解在亲水区域，来控制流体在亲水通道中的流动时间。Schonhorn等人基于胶体金技术在三维纸芯片中实现了夹心免疫反应，但是没有信号放大步骤，不能得到较高的检测灵敏度。Han等人基于金颗粒增强反应，提出了一个三维滑移的纸芯片平台。然而该芯片结构只适合与单个样品的检测。综上可以看出，尽管酶反应可以增强检测灵敏度，但是基于酶反应的免疫检测在纸芯片的研究比较少。究其原因，基于酶反应的信号放大方法往往需要多步和更加复杂的处理过程，且易出现交叉污染和样品使用量多(90微升)的问题。Whiteside等人提供了一个简易轻便的纸芯片，可通过滑动纸条来完成酶联免疫反应。然而该芯片仍然需要多次滴加水，并定时移动纸条。因此，这些繁琐的步骤限制了非专业人员的使用，阻碍广泛的应用。
发明内容
本发明要解决现有酶反应的信号放大方法往往需要多步和更加复杂的处理过程，且易出现交叉污染和样品使用量多的问题，而提供一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片及其制备方法。
一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片包括第一固定板、第二固定板、第三固定板、第一引流层、第二引流层、第三引流层、第四引流层、存储层、第一结合孵化层、第二结合孵化层、捕获层、第一吸水层及第二吸水层；
第一固定板、第二固定板、第一引流层、第二引流层、第三引流层、第四引流层、存储层、第一结合孵化层、第二结合孵化层、捕获层、第一吸水层、第二吸水层及第三固定板按由上至下依次设置；
第一固定板上均布设置第一混合液进入区域、第一样品进入区域及第一水体进入区域；
第二固定板上对应第一固定板的第一混合液进入区域、第一样品进入区域及第一水体进入区域分别设置结构及位置相同的第二混合液进入区域、第二样品进入区域及第二水体进入区域；
第一引流层上对应第二固定板的第二混合液进入区域、第二样品进入区域及第二水体进入区域分别设置结构及位置相同的第三混合液进入区域、第三样品进入区域及第三水体进入区域；
第二引流层上对应第一引流层的第三混合液进入区域、第三样品进入区域及第三水体进入区域分别设置结构及位置相同的第四混合液进入区域、第四样品进入区域及第四水体进入区域，且第四样品进入区域通过通道与第一上流区域相连通；
第三引流层上对应第二引流层的第四混合液进入区域、第四样品进入区域、第四水体进入区域及第一上流区域分别设置结构及位置相同的第五混合液进入区域、第五样品进入区域、第五水体进入区域及第二上流区域；
第四引流层上对应第三引流层的第五混合液进入区域、第五样品进入区域、第五水体进入区域及第二上流区域分别设置结构及位置相同的第六混合液进入区域、第六样品进入区域、第六水体进入区域及第三上流区域，且第六混合液进入区域通过通道与第三上流区域相连通；
存储层上对应第四引流层的第六样品进入区域、第六水体进入区域分别设置结构及位置相同的存储区域及第七水体进入区域；
第一结合孵化层上对应存储层的存储区域及第七水体进入区域分别设置结构及位置相同的第一结合孵化区域及第八水体进入区域，且第一结合孵化区域通过通道与第八水体进入区域相连通；
第二结合孵化层上对应第一结合孵化层的第一结合孵化区域设置结构及位置相同的第二结合孵化区域；
捕获层上对应第二结合孵化层的第二结合孵化区域设置结构及位置相同的捕获区域；
第一吸水层上对应捕获层的捕获区域设置结构及位置相同的第一吸水区域；
所述的第二吸水层整体为第二吸水区域。
一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片的制备方法是按以下步骤进行的：
一、三位纸芯片的加工：
①、首先选择层析纸作为第一引流层、第二引流层、第三引流层、第四引流层、存储层、第一结合孵化层、第二结合孵化层、捕获层、第一吸水层及第二吸水层，然后用CoreldrawX8软件按第一引流层、第二引流层、第三引流层、第四引流层、存储层、第一结合孵化层、第二结合孵化层、捕获层及第一吸水层图案设计丝网印刷版的结构，并制备出相应结构的丝网印刷版；
所述的丝网印刷版为150目～300目；
②、将步骤一①制备的丝网印刷版置于层析纸上，并将固体蜡透过丝网印刷版，反复摩擦印刷3min～5min，得到印刷有固体蜡的层析纸；
③、将印刷有固体蜡的层析纸置于温度为100℃～130℃的热板上，加热至固体蜡完全溶解于层析纸中形成疏水区域，得到带有疏水区域的层析纸，将带有疏水区域的层析纸置于室温下冷却，得到第一引流层、第二引流层、第三引流层、第四引流层、存储层、第一结合孵化层、第二结合孵化层、捕获层及第一吸水层；
二、三维纸芯片的组装：
①、对厚度为8μm～12μm的薄双面胶进行切割处理，得到切割后的薄双面胶；
②、将第一引流层、第二引流层、第三引流层、第四引流层、存储层、第一结合孵化层、第二结合孵化层、捕获层、第一吸水层、第二吸水层、第二固定板及第三固定板按设计进行叠放，然后利用切割后的薄双面胶进行粘贴，最后用多个螺栓和螺母在四周进行固定拧紧，得到固定后的三维纸芯片，将第一固定板置于固定后的多个螺栓和螺母中心，并利用螺栓和螺母加紧，即完成一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片的制备方法。
本发明的有益效果是：
本发明基于折叠技术和双面胶，设计了适用于免疫反应(ELISA)的三维纸芯片结构。可以自动完成多步复杂的反应。在该三维芯片中，仅需要在装置的入口处滴加样品和水，溶液通过三维芯片中各个独立的流体通道来完成多步复杂的免疫诊断分析与检测。为了评估该装置的可行性，对基于传统的双夹心免疫法对兔IgG进行了免疫检测和定量分析。验证了该三维芯片平台不仅操作简单，成本低，适用于非专业人员的操作，而且具有良好的免疫检测性能。
在芯片中设计不同的微通道结构，提前将免疫反应的各种试剂布置在纸芯片中，仅仅通过旋转顶端的第一固定板，既可一步完成整个免疫反应。由于设计长短不同的通道，因此，第一混合液进入区域、第一样品进入区域及第一水体进入区域进入的液体到达同一位置的时间不同，因而现实一步操作。为了消除背景干扰并得到更加均匀的显色结果，对检测层的布置和入口的数量进行了设计，在三维纸芯片中进行了免疫反应实验，得到了更加均匀的结果，同时消除了背景的干扰。最后用Adobe Photoshop CS6对免疫反应的显色结果进行灰度计算和定量分析，得到了灰度值随着兔IgG浓度的变化曲线，验证了该三维芯片平台的良好性能。
该三维纸芯片首先利用固体蜡和丝网印刷技术在每一张纸上加工出各种疏水结构，进而在每张纸上构成亲水的微通道或者图案。其次，利用折纸技术和双面胶，可将多层布置有不同结构的纸组装成完整芯片。用薄双面胶将三维纸芯片中的非检测层(或过渡层)永久粘连在一起，同时基于折纸技术，利用上下端的亚克力板将多个检测层和非检测层压紧，用螺栓固定在一起，进而完成芯片加工，本发明可以减少交叉污染和样品使用量(50微升～70微升)。
本发明用于一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片及其制备方法。
附图说明
图1为本发明可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片的结构示意图；
图2为本发明第一固定板的结构示意图；
图3为本发明第二固定板的结构示意图；
图4为本发明第一引流层的结构示意图；
图5为本发明第二引流层的结构示意图；
图6为本发明第三引流层的结构示意图；
图7为本发明第四引流层的结构示意图；
图8为本发明存储层的结构示意图；
图9为本发明第一结合孵化层的结构示意图；
图10为本发明第二结合孵化层的结构示意图；
图11为本发明捕获层的结构示意图；
图12为本发明第一吸水层的结构示意图；
图13为实施例一的可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片的结构示意图；
图14为实施例一的可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片中第一固定板与第二固定板位置相错的实物图；
图15为实施例一的可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片中第一固定板与第二固定板位置相对应的实物图；
图16为实施例一兔IgG样品浓度为0ng/mL时，捕获层的捕获区域的显色效果图；
图17为实施例一兔IgG样品浓度为5ng/mL时，捕获层的捕获区域的显色效果图；
图18为实施例一兔IgG样品浓度为10ng/mL时，捕获层的捕获区域的显色效果图；
图19为实施例一兔IgG样品浓度为30ng/mL时，捕获层的捕获区域的显色效果图；
图20为实施例一兔IgG样品浓度为60ng/mL时，捕获层的捕获区域的显色效果图；
图21为实施例一兔IgG样品浓度为100ng/mL时，捕获层的捕获区域的显色效果图；
图22为实施例一兔IgG样品浓度为300ng/mL时，捕获层的捕获区域的显色效果图；
图23为实施例一可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片中捕获层的捕获区域灰度值随着兔IgG样品浓度的变化曲线；
图24为具体实施方式六可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片的制备方法流程图，1为层析纸，2为丝网印刷版，3为固体蜡，4为热板，5为疏水区域；
图25为实施例一缺少一层结合孵化层、一层吸水层及水体进入区域时，兔IgG样品浓度为0ng/mL时，捕获层的捕获区域的显色效果图；
图26为实施例一缺少一层结合孵化层、一层吸水层及水体进入区域时，兔IgG样品浓度为30ng/mL时，捕获层的捕获区域的显色效果图；
图27为实施例一缺少一层结合孵化层、一层吸水层及水体进入区域时，兔IgG样品浓度为60ng/mL时，捕获层的捕获区域的显色效果图；
图28为实施例一缺少一层结合孵化层、一层吸水层及水体进入区域时，兔IgG样品浓度为100ng/mL时，捕获层的捕获区域的显色效果图。
具体实施方式
具体实施方式一：结合图1至12具体说明本实施方式，本实施方式一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片包括第一固定板1-1、第二固定板1-2、第三固定板1-3、第一引流层2-1、第二引流层2-2、第三引流层2-3、第四引流层2-4、存储层3、第一结合孵化层4-1、第二结合孵化层4-2、捕获层5、第一吸水层6-1及第二吸水层6-2；
第一固定板1-1、第二固定板1-2、第一引流层2-1、第二引流层2-2、第三引流层2-3、第四引流层2-4、存储层3、第一结合孵化层4-1、第二结合孵化层4-2、捕获层5、第一吸水层6-1、第二吸水层6-2及第三固定板1-3按由上至下依次设置；
第一固定板1-1上均布设置第一混合液进入区域7-1、第一样品进入区域8-1及第一水体进入区域9-1；
第二固定板1-2上对应第一固定板1-1的第一混合液进入区域7-1、第一样品进入区域8-1及第一水体进入区域9-1分别设置结构及位置相同的第二混合液进入区域7-2、第二样品进入区域8-2及第二水体进入区域9-2；
第一引流层2-1上对应第二固定板1-2的第二混合液进入区域7-2、第二样品进入区域8-2及第二水体进入区域9-2分别设置结构及位置相同的第三混合液进入区域7-3、第三样品进入区域8-3及第三水体进入区域9-3；
第二引流层2-2上对应第一引流层2-1的第三混合液进入区域7-3、第三样品进入区域8-3及第三水体进入区域9-3分别设置结构及位置相同的第四混合液进入区域7-4、第四样品进入区域8-4及第四水体进入区域9-4，且第四样品进入区域8-4通过通道与第一上流区域10-1相连通；
第三引流层2-3上对应第二引流层2-2的第四混合液进入区域7-4、第四样品进入区域8-4、第四水体进入区域9-4及第一上流区域10-1分别设置结构及位置相同的第五混合液进入区域7-5、第五样品进入区域8-5、第五水体进入区域9-5及第二上流区域10-2；
第四引流层2-4上对应第三引流层2-3的第五混合液进入区域7-5、第五样品进入区域8-5、第五水体进入区域9-5及第二上流区域10-2分别设置结构及位置相同的第六混合液进入区域7-6、第六样品进入区域8-6、第六水体进入区域9-6及第三上流区域10-3，且第六混合液进入区域7-6通过通道与第三上流区域10-3相连通；
存储层3上对应第四引流层2-4的第六样品进入区域8-6、第六水体进入区域9-6分别设置结构及位置相同的存储区域11及第七水体进入区域9-7；
第一结合孵化层4-1上对应存储层3的存储区域11及第七水体进入区域9-7分别设置结构及位置相同的第一结合孵化区域12-1及第八水体进入区域9-8，且第一结合孵化区域12-1通过通道与第八水体进入区域9-8相连通；
第二结合孵化层4-2上对应第一结合孵化层4-1的第一结合孵化区域12-1设置结构及位置相同的第二结合孵化区域12-2；
捕获层5上对应第二结合孵化层4-2的第二结合孵化区域12-2设置结构及位置相同的捕获区域13；
第一吸水层6-1上对应捕获层5的捕获区域13设置结构及位置相同的第一吸水区域14；
所述的第二吸水层6-2整体为第二吸水区域。
本实施方式的有益效果是：
本实施方式基于折叠技术和双面胶，设计了适用于免疫反应(ELISA)的三维纸芯片结构。可以自动完成多步复杂的反应。在该三维芯片中，仅需要在装置的入口处滴加样品和水，溶液通过三维芯片中各个独立的流体通道来完成多步复杂的免疫诊断分析与检测。为了评估该装置的可行性，对基于传统的双夹心免疫法对兔IgG进行了免疫检测和定量分析。验证了该三维芯片平台不仅操作简单，成本低，适用于非专业人员的操作，而且具有良好的免疫检测性能。
在芯片中设计不同的微通道结构，提前将免疫反应的各种试剂布置在纸芯片中，仅仅通过旋转顶端的第一固定板，既可一步完成整个免疫反应。由于设计长短不同的通道，因此，第一混合液进入区域7-1、第一样品进入区域8-1及第一水体进入区域9-1进入的液体到达同一位置的时间不同，因而现实一步操作。为了消除背景干扰并得到更加均匀的显色结果，对检测层的布置和入口的数量进行了设计，在三维纸芯片中进行了免疫反应实验，得到了更加均匀的结果，同时消除了背景的干扰。最后用Adobe Photoshop CS6对免疫反应的显色结果进行灰度计算和定量分析，得到了灰度值随着兔IgG浓度的变化曲线，验证了该三维芯片平台的良好性能。
该三维纸芯片首先利用固体蜡和丝网印刷技术在每一张纸上加工出各种疏水结构，进而在每张纸上构成亲水的微通道或者图案。其次，利用折纸技术和双面胶，可将多层布置有不同结构的纸组装成完整芯片。用薄双面胶将三维纸芯片中的非检测层(或过渡层)永久粘连在一起，同时基于折纸技术，利用上下端的亚克力板将多个检测层和非检测层压紧，用螺栓固定在一起，进而完成芯片加工。可以减少交叉污染和样品使用量(50微升～70微升)，同时可在多层实现物质的检测。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的第一固定板1-1、第二固定板1-2及第三固定板1-3均为PMMA板。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二之一不同的是：第四样品进入区域8-4通过长为7mm的通道与第一上流区域10-1相连通。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：第六混合液进入区域7-6通过长为10mm的通道与第三上流区域10-3相连通。其它与具体实施方式一至三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：第一结合孵化区域12-1通过长为7mm的通道与第八水体进入区域9-8相连通。其它与具体实施方式一至四相同。
具体实施方式六：结合图24具体说明本实施方式，本实施方式所述的一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片的制备方法是按以下步骤进行的：
一、三位纸芯片的加工：
①、首先选择层析纸作为第一引流层2-1、第二引流层2-2、第三引流层2-3、第四引流层2-4、存储层3、第一结合孵化层4-1、第二结合孵化层4-2、捕获层5、第一吸水层6-1及第二吸水层6-2，然后用CoreldrawX8软件按第一引流层2-1、第二引流层2-2、第三引流层2-3、第四引流层2-4、存储层3、第一结合孵化层4-1、第二结合孵化层4-2、捕获层5及第一吸水层6-1图案设计丝网印刷版的结构，并制备出相应结构的丝网印刷版；
所述的丝网印刷版为150目～300目；
②、将步骤一①制备的丝网印刷版置于层析纸上，并将固体蜡透过丝网印刷版，反复摩擦印刷3min～5min，得到印刷有固体蜡的层析纸；
③、将印刷有固体蜡的层析纸置于温度为100℃～130℃的热板上，加热至固体蜡完全溶解于层析纸中形成疏水区域，得到带有疏水区域的层析纸，将带有疏水区域的层析纸置于室温下冷却，得到第一引流层2-1、第二引流层2-2、第三引流层2-3、第四引流层2-4、存储层3、第一结合孵化层4-1、第二结合孵化层4-2、捕获层5及第一吸水层6-1；
二、三维纸芯片的组装：
①、对厚度为8μm～12μm的薄双面胶进行切割处理，得到切割后的薄双面胶；
②、将第一引流层2-1、第二引流层2-2、第三引流层2-3、第四引流层2-4、存储层3、第一结合孵化层4-1、第二结合孵化层4-2、捕获层5、第一吸水层6-1、第二吸水层6-2、第二固定板1-2及第三固定板1-3按设计进行叠放，然后利用切割后的薄双面胶进行粘贴，最后用多个螺栓和螺母在四周进行固定拧紧，得到固定后的三维纸芯片，将第一固定板1-1置于固定后的多个螺栓和螺母中心，并利用螺栓和螺母加紧，即完成一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片的制备方法。
本实施方式步骤一三维纸芯片是通过丝网印刷的方法，将固体蜡印刷在纸上，通过加热融化成疏水障碍物，进而在每张纸上形成不同结构的亲水通道或者图案。
本实施方式步骤二结合薄双面胶和折纸技术，将蜡印刷后的纸芯片进行组装和集成。
本实施方式步骤一②中将固体蜡透过丝网印刷版，反复摩擦印刷3min～5min，以确保将固体蜡很好的印刷在纸上。
本实施方式步骤一③中将使用后的丝网印刷版放在带有吸水纸的热板上加热10min，以便去除残留在印刷版上的固体蜡。
本实施方式步骤二①中利用刀片或者专业切割设备对厚度为8μm～12μm的薄双面胶进行切割处理。
本实施方式在实验完成后，可以很方便的取出捕获层进行分析处理，上下端的固定板用螺栓和螺母进行固定拧紧。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：步骤一①中所述的丝网印刷版为200目。其它与具体实施方式六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式六或七之一不同的是：步骤一②中将步骤一①制备的丝网印刷版置于层析纸上，并将固体蜡透过丝网印刷版，反复摩擦印刷5min，得到印刷有固体蜡的层析纸。其它与具体实施方式六或七相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式六至八之一不同的是：步骤一③中将印刷有固体蜡的层析纸置于温度为120℃的热板上，加热至固体蜡完全溶解于层析纸中形成疏水区域，得到带有疏水区域的层析纸。其它与具体实施方式六至八相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式六至九之一不同的是：步骤二①中对厚度为10μm的薄双面胶进行切割处理，得到切割后的薄双面胶。其它与具体实施方式六至九相同。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一：结合图13具体说明本实施例。
一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片包括第一固定板1-1、第二固定板1-2、第三固定板1-3、第一引流层2-1、第二引流层2-2、第三引流层2-3、第四引流层2-4、存储层3、第一结合孵化层4-1、第二结合孵化层4-2、捕获层5、第一吸水层6-1及第二吸水层6-2；
第一固定板1-1、第二固定板1-2、第一引流层2-1、第二引流层2-2、第三引流层2-3、第四引流层2-4、存储层3、第一结合孵化层4-1、第二结合孵化层4-2、捕获层5、第一吸水层6-1、第二吸水层6-2及第三固定板1-3按由上至下依次设置；
第一固定板1-1上均布设置第一混合液进入区域7-1、第一样品进入区域8-1及第一水体进入区域9-1；
第二固定板1-2上对应第一固定板1-1的第一混合液进入区域7-1、第一样品进入区域8-1及第一水体进入区域9-1分别设置结构及位置相同的第二混合液进入区域7-2、第二样品进入区域8-2及第二水体进入区域9-2；
第一引流层2-1上对应第二固定板1-2的第二混合液进入区域7-2、第二样品进入区域8-2及第二水体进入区域9-2分别设置结构及位置相同的第三混合液进入区域7-3、第三样品进入区域8-3及第三水体进入区域9-3；
第二引流层2-2上对应第一引流层2-1的第三混合液进入区域7-3、第三样品进入区域8-3及第三水体进入区域9-3分别设置结构及位置相同的第四混合液进入区域7-4、第四样品进入区域8-4及第四水体进入区域9-4，且第四样品进入区域8-4通过通道与第一上流区域10-1相连通；
第三引流层2-3上对应第二引流层2-2的第四混合液进入区域7-4、第四样品进入区域8-4、第四水体进入区域9-4及第一上流区域10-1分别设置结构及位置相同的第五混合液进入区域7-5、第五样品进入区域8-5、第五水体进入区域9-5及第二上流区域10-2；
第四引流层2-4上对应第三引流层2-3的第五混合液进入区域7-5、第五样品进入区域8-5、第五水体进入区域9-5及第二上流区域10-2分别设置结构及位置相同的第六混合液进入区域7-6、第六样品进入区域8-6、第六水体进入区域9-6及第三上流区域10-3，且第六混合液进入区域7-6通过通道与第三上流区域10-3相连通；
存储层3上对应第四引流层2-4的第六样品进入区域8-6、第六水体进入区域9-6分别设置结构及位置相同的存储区域11及第七水体进入区域9-7；
第一结合孵化层4-1上对应存储层3的存储区域11及第七水体进入区域9-7分别设置结构及位置相同的第一结合孵化区域12-1及第八水体进入区域9-8，且第一结合孵化区域12-1通过通道与第八水体进入区域9-8相连通；
第二结合孵化层4-2上对应第一结合孵化层4-1的第一结合孵化区域12-1设置结构及位置相同的第二结合孵化区域12-2；
捕获层5上对应第二结合孵化层4-2的第二结合孵化区域12-2设置结构及位置相同的捕获区域13；
第一吸水层6-1上对应捕获层5的捕获区域13设置结构及位置相同的第一吸水区域14；
所述的第二吸水层6-2整体为第二吸水区域。
一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片的制备方法是按以下步骤进行的：
一、三位纸芯片的加工：
①、首先选择层析纸作为第一引流层2-1、第二引流层2-2、第三引流层2-3、第四引流层2-4、存储层3、第一结合孵化层4-1、第二结合孵化层4-2、捕获层5、第一吸水层6-1及第二吸水层6-2，然后用CoreldrawX8软件按第一引流层2-1、第二引流层2-2、第三引流层2-3、第四引流层2-4、存储层3、第一结合孵化层4-1、第二结合孵化层4-2、捕获层5及第一吸水层6-1图案设计丝网印刷版的结构，并制备出相应结构的丝网印刷版；
所述的丝网印刷版为200目；
②、将步骤一①制备的丝网印刷版置于层析纸上，并将固体蜡透过丝网印刷版，反复摩擦印刷5min，得到印刷有固体蜡的层析纸；
③、将印刷有固体蜡的层析纸置于温度为120℃的热板上，加热至固体蜡完全溶解于层析纸中形成疏水区域，得到带有疏水区域的层析纸，将带有疏水区域的层析纸置于室温下冷却，得到第一引流层2-1、第二引流层2-2、第三引流层2-3、第四引流层2-4、存储层3、第一结合孵化层4-1、第二结合孵化层4-2、捕获层5及第一吸水层6-1；
二、三维纸芯片的组装：
①、对厚度为10μm的薄双面胶进行切割处理，得到切割后的薄双面胶；
②、将第一引流层2-1、第二引流层2-2、第三引流层2-3、第四引流层2-4、存储层3、第一结合孵化层4-1、第二结合孵化层4-2、捕获层5、第一吸水层6-1、第二吸水层6-2、第二固定板1-2及第三固定板1-3按设计进行叠放，然后利用切割后的薄双面胶进行粘贴，最后用多个螺栓和螺母在四周进行固定拧紧，得到固定后的三维纸芯片，将第一固定板1-1置于固定后的多个螺栓和螺母中心，并利用螺栓和螺母加紧，即完成一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片的制备方法。
所述的层析纸为Whatman chromatography paper#1；
本实施例中可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片分为两部分进行ELISA免疫反应，即一部分的第一混合液进入区域7-1、第一样品进入区域8-1及第一水体进入区域9-1为圆形区域，另一部分的第一混合液进入区域7-1、第一样品进入区域8-1及第一水体进入区域9-1为正方形区域，形成两部分通道，可同时进行两种ELISA免疫反应。
本实施例中圆形第一混合液进入区域7-1的直径为12mm，圆形第一样品进入区域8-1及圆形第一水体进入区域9-1的直径为6mm；本实施例中正方形第一混合液进入区域7-1的直径为11mm，正方形第一样品进入区域8-1及正方形第一水体进入区域9-1的直径为5.5mm；
本实施例第四样品进入区域8-4通过长为7mm的通道与第一上流区域10-1相连通；
本实施例第六混合液进入区域7-6通过长为10mm的通道与第三上流区域10-3相连通；
本实施例第一结合孵化区域12-1通过长为7mm的通道与第八水体进入区域9-8相连通。
本实施例所述的第一固定板1-1、第二固定板1-2及第三固定板1-3均为PMMA板。
本实施例中第一引流层2-1、第二引流层2-2、第三引流层2-3、第四引流层2-4、存储层3、第一结合孵化层4-1及第二结合孵化层4-2之间设置薄双面胶；其他层面之间仅仅利用上下两端第二固定板1-2及第三固定板1-3，进行物理压紧的方式进行贴合，从而在实验完成后，可以很方便的取出各层进行分析处理，上下端的第二固定板1-2及第三固定板1-3板用螺栓和螺母进行固定拧紧。
在本实施例制备的可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片组装之前，需要在部分层中提前滴加相应物质的检测试剂；
上述一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片具体是按以下方法使用的：
一、在捕获层5上的捕获区域13先滴加2微升1mg/mL的羊抗兔IgG溶液，10分钟之后，然后在捕获区域13以及其他所有亲水区域滴加封闭液进行封闭处理10分钟；
所述的封闭液为pH为7.4的PBS溶液、吐温20及BSA的混合溶液，封闭液中吐温20与pH为7.4的PBS溶液的体积比为0.05:100，封闭液中BSA的质量与pH为7.4的PBS溶液的体积比为1g:100mL；
二、在存储层3上的存储区域11滴加3微升的2μg/mL的辣根过氧化酶标记的鼠抗兔IgG，处理10分钟；
三、将0.45mg的粉末状过碳酸钠储存在两张纸片中间，两张存储粉末状过碳酸钠的纸片置于第一固定板1-1上的第一混合液进入区域7-1；
四、将DAB溶解在pH为7.4的PBS溶液中，得到浓度为2mg/mL的DAB溶液，然后将10微升2mg/mL的DAB滴加在一张纸片中，晾干，得到含有DAB的纸片；
五、三维纸芯片的组装：
①、对厚度为8μm～12μm的薄双面胶进行切割处理，得到切割后的薄双面胶；
②、将第一引流层2-1、第二引流层2-2、第三引流层2-3、第四引流层2-4、存储层3、第一结合孵化层4-1、第二结合孵化层4-2、捕获层5、第一吸水层6-1、第二吸水层6-2、第二固定板1-2及第三固定板1-3按设计进行叠放，然后利用切割后的薄双面胶进行粘贴，最后用多个螺栓和螺母在四周进行固定拧紧，得到固定后的三维纸芯片，将含有DAB的纸片和两张存储粉末状过碳酸钠的纸片由上至下放置于第一固定板1-1上的第一混合液进入区域7-1，然后将第一固定板1-1置于固定后的多个螺栓和螺母中心，并利用螺栓和螺母加紧，调节第一固定板1-1上的第一混合液进入区域7-1、第一样品进入区域8-1及第一水体进入区域9-1与第二固定板1-2上的第二混合液进入区域7-2、第二样品进入区域8-2及第二水体进入区域9-2位置相错；
六、将320微升的水滴加在第一固定板1-1上含有DAB的纸片和两张存储粉末状过碳酸钠的纸片的第一混合液进入区域7-1处，将100微升水滴加在第一水体进入区域9-1，将60微升的样品滴加在第一样品进入区域8-1处，静置5分钟，最后将顶端的圆形PMMA板旋转，使得第一固定板1-1上的第一混合液进入区域7-1、第一样品进入区域8-1及第一水体进入区域9-1与第二固定板1-2上的第二混合液进入区域7-2、第二样品进入区域8-2及第二水体进入区域9-2位置分别对应，一步触发了整个免疫反应；
所述的样品为浓度为0ng/mL的兔IgG样品；
七、反应20分钟后显色反应完成，对捕获层5的捕获区域13显色图像进行后续处理，首先通过肉眼观察显色反应层，通过颜色的变化可以得到定性的分析，然后用手机进行捕获区域13拍照，将照片导入图像处理软件Adobe Photoshop CS6，得到捕获区域13的平均灰度值；
八、观察实验现象并记录；
九、实验数据的处理和分析；
十、不断调兔IgG的浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、100ng/mL、300ng/mL，按使用方法重复进行。
步骤一中所述的封闭处理是为了避免非特异性结合反应；
步骤三目的为产生双氧水；步骤四目的为获得相应溶度的DAB溶液；
步骤七中保证DAB溶解同时过碳酸钠充分产生了双氧水。
步骤五②中调节第一固定板1-1上的第一混合液进入区域7-1、第一样品进入区域8-1及第一水体进入区域9-1与第二固定板1-2上的第二混合液进入区域7-2、第二样品进入区域8-2及第二水体进入区域9-2位置相错，如图14所示，图14为实施例一的可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片中第一固定板1-1与第二固定板1-2位置相错的实物图；
步骤六将顶端的圆形PMMA板旋转，使得第一固定板1-1上的第一混合液进入区域7-1、第一样品进入区域8-1及第一水体进入区域9-1与第二固定板1-2上的第二混合液进入区域7-2、第二样品进入区域8-2及第二水体进入区域9-2位置分别对应，如图15所示，图15为实施例一的可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片中第一固定板1-1与第二固定板1-2位置相对应的实物图。
本实施中样品滴加在第一样品进入区域8-1处，320微升水滴加在第一固定板1-1上含有DAB的纸片和两张存储粉末状过碳酸钠的纸片的第一混合液进入区域7-1处，将100微升水滴加在第一水体进入区域9-1，旋转后，样品、320微升水及100微升水同时流入三维纸芯片中，样品沿第二样品进入区域8-2、第三样品进入区域8-3、第四样品进入区域8-4、第五样品进入区域8-5、第六样品进入区域8-6、存储区域11、第一结合孵化区域12-1、第二结合孵化区域12-2、捕获区域13及第一吸水区域14形成的通道流动；
320微升水滴入第一混合液进入区域7-1以保证DAB溶解同时过碳酸钠充分产生了双氧水，得到混合液，混合液沿着第二混合液进入区域7-2、第三混合液进入区域7-3、第四混合液进入区域7-4、第五混合液进入区域7-5、第六混合液进入区域7-6、第三上流区域10-3、第二上流区域10-2、第一上流区域10-1、第四样品进入区域8-4、第五样品进入区域8-5、第六样品进入区域8-6、存储区域11、第一结合孵化区域12-1、第二结合孵化区域12-2、捕获区域13及第一吸水区域14形成的通道流动；
100微升水沿着第二水体进入区域9-2、第三水体进入区域9-3、第四水体进入区域9-4、第五水体进入区域9-5、第六水体进入区域9-6、第七水体进入区域9-7、第八水体进入区域9-8、第一结合孵化区域12-1、第二结合孵化区域12-2、捕获区域13及第一吸水区域14形成的通道流动；
由于通道长短不同，因此，三种液体到达同一位置的时间不同，样品首先经过经过存储区域11与3微升的2μg/mL的辣根过氧化酶标记的鼠抗兔IgG结合，通过两层的结合孵化层，首先到达捕获层5在捕获层形成夹心类型的免疫结合物，然后100微升水经过捕获层5进行冲洗，未结合的物质被溶液清洗掉了，最后320微升水滴入第一混合液进入区域7-1以保证DAB溶解同时过碳酸钠充分产生了双氧水，得到的混合液最后流经捕获层5，从而引发了酶反应，形成显色。
本实施例增加了纸芯片的层数，即检测抗体被布置在了第八层的捕获层5，此外，增加一个水体进入区域，使得在酶反应之前具有一个冲洗的过程，以便保证抗体抗原反应更充分并同时可以更好冲洗，消除背景噪声，得到较高的检测灵敏度。通过旋转顶端的第一固定板1-1，让相应的试剂依次有序的流入纸芯片通道中的各个区域。在顶端的第一固定板1-1旋转，使得第一固定板1-1上的第一混合液进入区域7-1、第一样品进入区域8-1及第一水体进入区域9-1与第二固定板1-2上的第二混合液进入区域7-2、第二样品进入区域8-2及第二水体进入区域9-2位置分别对应，等待20分钟，拆开三维芯片，利用手机相机对检测区域的显色信号进行拍摄。
图16为实施例一兔IgG样品浓度为0ng/mL时，捕获层的捕获区域的显色效果图；图17为实施例一兔IgG样品浓度为5ng/mL时，捕获层的捕获区域的显色效果图；图18为实施例一兔IgG样品浓度为10ng/mL时，捕获层的捕获区域的显色效果图；图19为实施例一兔IgG样品浓度为30ng/mL时，捕获层的捕获区域的显色效果图；图20为实施例一兔IgG样品浓度为60ng/mL时，捕获层的捕获区域的显色效果图；图21为实施例一兔IgG样品浓度为100ng/mL时，捕获层的捕获区域的显色效果图；图22为实施例一兔IgG样品浓度为300ng/mL时，捕获层的捕获区域的显色效果图；通过滴加不同浓度的兔IgG样品，可以得到不同浓度IgG下的显色效果图，如图16～22所示。由图可知，通过增加冲洗步骤，背景干扰可以得到有效的抑制，而且本实施例的检测区域布置，使得检测区域的显色信号分布更加均匀。此外，显色信号强度随着兔IgG样品浓度的增加而增加。
图23为实施例一可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片中捕获层的捕获区域灰度值随着兔IgG浓度的变化曲线；最后利用Adobe Photoshop CS6对免疫反应的显色结果进行灰度计算和定量分析，如图22所示，由图可知，在一定浓度范围内，兔IgG的浓度和检测信号强度呈线性关系，因而可以用该装置来高效，低成本的进行免疫检测。
若本实施例中的结构缺少一层结合孵化层、一层吸水层及水体进入区域时，不同浓度IgG下的显色效果图具有微弱的背景颜色，而且检测区域的显色信号分布不均匀，如图25～28。图25为实施例一缺少一层结合孵化层、一层吸水层及水体进入区域时，兔IgG样品浓度为0ng/mL时，捕获层的捕获区域的显色效果图；图26为实施例一缺少一层结合孵化层、一层吸水层及水体进入区域时，兔IgG样品浓度为30ng/mL时，捕获层的捕获区域的显色效果图；图27为实施例一缺少一层结合孵化层、一层吸水层及水体进入区域时，兔IgG样品浓度为60ng/mL时，捕获层的捕获区域的显色效果图；图28为实施例一缺少一层结合孵化层、一层吸水层及水体进入区域时，兔IgG样品浓度为100ng/mL时，捕获层的捕获区域的显色效果图造成此结果的原因可能有两个，首先，当流体从结合孵化层流向捕获层时，由于流体的层流特性，流体会沿着结合孵化层中的孵化通道的边缘流向捕获层中的检测区域，进而导致了不均匀性。此外，可能由于芯片顶端只有两个入口，缺乏冲洗步骤，导致了微弱的背景干扰。
Claims (10)
1.一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片，其特征在于一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片包括第一固定板(1-1)、第二固定板(1-2)、第三固定板(1-3)、第一引流层(2-1)、第二引流层(2-2)、第三引流层(2-3)、第四引流层(2-4)、存储层(3)、第一结合孵化层(4-1)、第二结合孵化层(4-2)、捕获层(5)、第一吸水层(6-1)及第二吸水层(6-2)；
第一固定板(1-1)、第二固定板(1-2)、第一引流层(2-1)、第二引流层(2-2)、第三引流层(2-3)、第四引流层(2-4)、存储层(3)、第一结合孵化层(4-1)、第二结合孵化层(4-2)、捕获层(5)、第一吸水层(6-1)、第二吸水层(6-2)及第三固定板(1-3)按由上至下依次设置；
第一固定板(1-1)上均布设置第一混合液进入区域(7-1)、第一样品进入区域(8-1)及第一水体进入区域(9-1)；
第二固定板(1-2)上对应第一固定板(1-1)的第一混合液进入区域(7-1)、第一样品进入区域(8-1)及第一水体进入区域(9-1)分别设置结构及位置相同的第二混合液进入区域(7-2)、第二样品进入区域(8-2)及第二水体进入区域(9-2)；
第一引流层(2-1)上对应第二固定板(1-2)的第二混合液进入区域(7-2)、第二样品进入区域(8-2)及第二水体进入区域(9-2)分别设置结构及位置相同的第三混合液进入区域(7-3)、第三样品进入区域(8-3)及第三水体进入区域(9-3)；
第二引流层(2-2)上对应第一引流层(2-1)的第三混合液进入区域(7-3)、第三样品进入区域(8-3)及第三水体进入区域(9-3)分别设置结构及位置相同的第四混合液进入区域(7-4)、第四样品进入区域(8-4)及第四水体进入区域(9-4)，且第四样品进入区域(8-4)通过通道与第一上流区域(10-1)相连通；
第三引流层(2-3)上对应第二引流层(2-2)的第四混合液进入区域(7-4)、第四样品进入区域(8-4)、第四水体进入区域(9-4)及第一上流区域(10-1)分别设置结构及位置相同的第五混合液进入区域(7-5)、第五样品进入区域(8-5)、第五水体进入区域(9-5)及第二上流区域(10-2)；
第四引流层(2-4)上对应第三引流层(2-3)的第五混合液进入区域(7-5)、第五样品进入区域(8-5)、第五水体进入区域(9-5)及第二上流区域(10-2)分别设置结构及位置相同的第六混合液进入区域(7-6)、第六样品进入区域(8-6)、第六水体进入区域(9-6)及第三上流区域(10-3)，且第六混合液进入区域(7-6)通过通道与第三上流区域(10-3)相连通；
存储层(3)上对应第四引流层(2-4)的第六样品进入区域(8-6)、第六水体进入区域(9-6)分别设置结构及位置相同的存储区域(11)及第七水体进入区域(9-7)；
第一结合孵化层(4-1)上对应存储层(3)的存储区域(11)及第七水体进入区域(9-7)分别设置结构及位置相同的第一结合孵化区域(12-1)及第八水体进入区域(9-8)，且第一结合孵化区域(12-1)通过通道与第八水体进入区域(9-8)相连通；
第二结合孵化层(4-2)上对应第一结合孵化层(4-1)的第一结合孵化区域(12-1)设置结构及位置相同的第二结合孵化区域(12-2)；
捕获层(5)上对应第二结合孵化层(4-2)的第二结合孵化区域(12-2)设置结构及位置相同的捕获区域(13)；
第一吸水层(6-1)上对应捕获层(5)的捕获区域(13)设置结构及位置相同的第一吸水区域(14)；
所述的第二吸水层(6-2)整体为第二吸水区域。
2.根据权利要求1所述的一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片，其特征在于所述的第一固定板(1-1)、第二固定板(1-2)及第三固定板(1-3)均为PMMA板。
3.根据权利要求1所述的一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片，其特征在于第四样品进入区域(8-4)通过长为7mm的通道与第一上流区域(10-1)相连通。
4.根据权利要求1所述的一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片，其特征在于第六混合液进入区域(7-6)通过长为10mm的通道与第三上流区域(10-3)相连通。
5.根据权利要求1所述的一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片，其特征在于第一结合孵化区域(12-1)通过长为7mm的通道与第八水体进入区域(9-8)相连通。
6.如权利要求1所述的一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片的制备方法，其特征在于一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片的制备方法是按以下步骤进行的：
一、三位纸芯片的加工：
①、首先选择层析纸作为第一引流层(2-1)、第二引流层(2-2)、第三引流层(2-3)、第四引流层(2-4)、存储层(3)、第一结合孵化层(4-1)、第二结合孵化层(4-2)、捕获层(5)、第一吸水层(6-1)及第二吸水层(6-2)，然后用CoreldrawX8软件按第一引流层(2-1)、第二引流层(2-2)、第三引流层(2-3)、第四引流层(2-4)、存储层(3)、第一结合孵化层(4-1)、第二结合孵化层(4-2)、捕获层(5)及第一吸水层(6-1)图案设计丝网印刷版的结构，并制备出相应结构的丝网印刷版；
所述的丝网印刷版为150目～300目；
②、将步骤一①制备的丝网印刷版置于层析纸上，并将固体蜡透过丝网印刷版，反复摩擦印刷3min～5min，得到印刷有固体蜡的层析纸；
③、将印刷有固体蜡的层析纸置于温度为100℃～130℃的热板上，加热至固体蜡完全溶解于层析纸中形成疏水区域，得到带有疏水区域的层析纸，将带有疏水区域的层析纸置于室温下冷却，得到第一引流层(2-1)、第二引流层(2-2)、第三引流层(2-3)、第四引流层(2-4)、存储层(3)、第一结合孵化层(4-1)、第二结合孵化层(4-2)、捕获层(5)及第一吸水层(6-1)；
二、三维纸芯片的组装：
①、对厚度为8μm～12μm的薄双面胶进行切割处理，得到切割后的薄双面胶；
②、将第一引流层(2-1)、第二引流层(2-2)、第三引流层(2-3)、第四引流层(2-4)、存储层(3)、第一结合孵化层(4-1)、第二结合孵化层(4-2)、捕获层(5)、第一吸水层(6-1)、第二吸水层(6-2)、第二固定板(1-2)及第三固定板(1-3)按设计进行叠放，然后利用切割后的薄双面胶进行粘贴，最后用多个螺栓和螺母在四周进行固定拧紧，得到固定后的三维纸芯片，将第一固定板(1-1)置于固定后的多个螺栓和螺母中心，并利用螺栓和螺母加紧，即完成一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片的制备方法。
7.根据权利要求6所述的一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片的制备方法，其特征在于步骤一①中所述的丝网印刷版为200目。
8.根据权利要求6所述的一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片的制备方法，其特征在于步骤一②中将步骤一①制备的丝网印刷版置于层析纸上，并将固体蜡透过丝网印刷版，反复摩擦印刷5min，得到印刷有固体蜡的层析纸。
9.根据权利要求6所述的一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片的制备方法，其特征在于步骤一③中将印刷有固体蜡的层析纸置于温度为120℃的热板上，加热至固体蜡完全溶解于层析纸中形成疏水区域，得到带有疏水区域的层析纸。
10.根据权利要求6所述的一种可一步实现ELISA免疫反应的三维纸芯片的制备方法，其特征在于步骤二①中对厚度为10μm的薄双面胶进行切割处理，得到切割后的薄双面胶。
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