CN110940809A

CN110940809A - 一种基于激光诱导荧光结合纸芯片检测血液中甲胎蛋白的技术

Info

Publication number: CN110940809A
Application number: CN201911249212.2A
Authority: CN
Inventors: 王伟; 蔡小玉; 虞秀凤
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2019-12-09
Filing date: 2019-12-09
Publication date: 2020-03-31

Abstract

本发明是基于激光诱导荧光检测法(LIF)检测技术与纸芯片结合方法对甲胎蛋白进行检测，解决了以下几个技术问题：（1）简化了传统纸芯片对AFP检测时抗体以及扩增方法的固定，且Ab1‑AFP‑Ab2的三明治检测方法具有较好的高选择性；（2）低样品和低试剂消耗，10μL的样品即可完成检测；（3）检测速度快，检测时间短；（4）等温杂交链式反应实现信号放大，不需要酶参与反应，整个过程没有温度变化，保证抗体的活性；（5）仪器设备以及纸芯片材料成本低。

Description

一种基于激光诱导荧光结合纸芯片检测血液中甲胎蛋白的技术

技术领域

本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种基于激光诱导荧光结合纸芯片检测血液中甲胎蛋白的技术。

背景技术

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其死亡率仅次于胃癌及食管癌，我国每年死于肝癌的患者约十一万，占全世界肝癌死亡人数的45%。如果不予治疗，生存期仅0.7-8个月。这使得肝癌的早期发现和治疗变得格外重要。肝癌早期常无特异性症状，中晚期肝癌则可出现肝区疼痛、腹胀、消瘦，进行性肝大或上腹部包块等，部分患者出现黄疸、上消化道出血，肝癌破裂后出现急腹症等症状。肝癌一旦出现症状，多已经处于中晚期，治疗效果极差。

肝癌的早期检测在早期诊断和随后的治疗中起关键作用。传统的肝癌筛查方法包括：X光，B超，CT等一些影像学设备的影像检测。但是经过影像学检查查出的肿瘤(肿瘤> 2cm可确诊)都是比较大的肿瘤了，基本都到了中晚期。作为早期筛查，影像学手段检测比较有限的。然而如果肿瘤大小< 2 cm，同时血清中AFP含量≥ 400 μg/L持续1个月或200 μg/L持续2个月，并能排除其他原因引起的AFP升高可确诊肝癌。因此，不管针对于早期肝癌筛查还是临床治疗，开发出一种简单、快速的血清中甲胎蛋白含量检测技术均十分重要的。

AFP是一种重要的肿瘤标志物，AFP在胎儿肝脏和卵黄囊中发现，出生后逐渐消失。健康成年人中AFP的血清浓度通常低于25 ng / mL，AFP的血清水平升高与肝癌和消化道癌症有关，而羊水中浓度升高可能表明严重的先天性胎儿缺陷，例如脊柱裂和无脑等。因此，对AFP的灵敏，准确的早期检测和诊断至关重要。

最常见的AFP检测方法有：化学发光、电化学发光、荧光、表面增强拉曼散射（SERS）、等离子体共振（LSPR）、酶联免疫测定、亲和印迹检测等。但是大多数方法在临床实践上都存在一定缺点：灵敏度低，检测范围小，临床实践耗时，检测前处理麻烦，复杂且昂贵的仪器设备，检测所需样品体积量多等，因此，开发一种快速，简便，高灵敏的AFP检测方法是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于激光诱导荧光结合纸芯片检测血液中甲胎蛋白的技术。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

（1）将壳聚糖滴加到纸芯片μPAD疏水区域，干燥后加入含2.5%戊二醛的PBS溶液，在室温下进行反应，用PBS溶液反复冲洗疏水区域；

（2）滴加甲胎蛋白一抗溶液，室温下反应，PBS洗涤未固定的一抗，接着滴加 0.5%BSA溶液，放在室温下干燥，并用PBS进行冲洗，避光保存；

（3）在疏水区域上滴加检测样本，在室温下完成孵育，用PBS进行多次反复冲洗，然后依次滴加二抗溶液，DNA-戊二醛溶液，室温条件下反应，用PBS反复洗涤，接着滴加H1 + H2 +SPSA缓冲液，室温条件下反应，重复滴加一次H1 + H2 + SPSA缓冲液，最后用PBS反复冲洗，完成后将μPAD放于检测界面进行检测。

步骤（1）纸芯片的制备方法如下：首先通过喷蜡打印机，将设计图案打印至纸质基底之上，将蜡打印好的μPAD放置于烘箱加热，保证蜡完全融化在μPAD上形成疏水区域。

步骤（3）所述DNA-戊二醛溶液的制备方法为：将1 × 10^-7DNA、甲醇、冰醋酸、戊二醛按体积比1:1:1:1混合后，在40℃条件下反应1 反应制得；

所述DNA碱基序列为TTTCTCCATACGCGGAAGTGAGGT AAAAA AAAAA-NH2。

步骤（3）所述H1 + H2 + SPSA缓冲液的制备方法为：将浓度为1.00 × 10^-5M的H1、H2和SPSC缓冲液（SPSC缓冲液配制方法：称取10.96 g的NaCl，4.48 g Na₂HPO₄·12H₂O的溶于250 mL容量瓶。然后用HCl调节至pH为7.4。）按体积比1:1:8配制；

所述H1和H2碱基序列如下：

H1：ACCTCACTTCCGCGTATGGAGAAAGGTTAATTTCTCCATACGCGGAAG –FAM；

H2：FAM-TTTCTCCATACGCGGAAGTGAGGTCTTCCGCGTATGGAGAAATTAACC。

进一步地，将上述方法应用于癌症检测中。

判定标准为：血液中检测到AFP浓度高于25 ng/mL，则判定为患有肿瘤或者慢性疾病等。

本发明的优点在于：

（1）相比于肝癌筛查法，本方法对样品的处理要求不高，同时检测的样品量少，仅需几微升尽可完成检测，且操作简单，不需要专门负责熟练人员耗时操作。

（2）检测的灵敏度高，对甲胎蛋白的检测限可以达到1pg/mL。

（3）特异性强，仅能检测到血清样品中的甲胎蛋白（在同样条件下测试了凝血酶、溶酶菌、PSA、CEA、IgG等物质在μPAD上荧光信号的强弱，荧光强度约等于空白峰信号）。

（4）等温杂交链式反应实现信号放大，不需要酶参与反应，整个过程没有温度变化，保证抗体的活性，保存时间久。

附图说明

图1为纸芯片设计图；

图2为检测原理图；其中1为壳聚糖；2为一抗；3为BSA；4为甲胎蛋白；5为二抗；6为DNA；7为HCR反应；

图3为装置示意图；其中8为LIF检测仪；9为铁线；10为铁片，11为载玻片夹层；12为纸芯片；13为小型发动机。

具体实施方式

1、样品准备

（1）核酸链碱基序列如下（序列由5' to 3'）：

DNA：TTTCTCCATACGCGGAAGTGAGGT AAAAA AAAAA-NH2；

H1：ACCTCACTTCCGCGTATGGAGAAAGGTTAATTTCTCCATACGCGG

AAG –FAM；

H2：FAM-TTTCTCCATACGCGGAAGTGAGGTCTTCCGCGTATGGAGAAA

TTAACC。

（2）细胞样品处理

将获得的血液样品经8000 rpm，离心5 min,取离心完的上清液进行检测。

2、纸芯片制作：

首先通过喷蜡打印机，将设计图案打印至纸质基底之上。将蜡打印好的μPAD放置于烘箱加热，保证蜡完全融化在μPAD上形成疏水区域。纸芯片设计图如图图1 所示。

免疫测定过程：

PBS缓冲液：浓度为50mM，pH=7.4；

DNA-戊二醛溶液：由1 × 10^-7M DNA 、甲醇、冰醋酸、戊二醛在体积比为1:1:1:1在40℃条件下反应1 反应制得；

H1 + H2 + SPSA缓冲液：由浓度为1.00 × 10^-5M的H1、H2和SPSC缓冲液按体积比1:1:8配制；

SPSC缓冲液配制：称取10.96 g的NaCl，4.48 g Na₂HPO₄·12H₂O的溶于250 mL容量瓶。然后用HCl调节至pH为7.4。

①将10 μL 0.5 mg/mL壳聚糖滴加到μPAD疏水区域，室温条件下自然干燥，然后滴加含2.5%戊二醛的PBS溶液，在室温下进行反应40 min，用10 μL PBS缓冲液反复冲洗疏水区域。然后，滴加10 μL 20 μg/mL甲胎蛋白一抗溶液(购于郑州博赛生物技术有限公司，货号：CTA-1001)，室温下反应30 min，用同样的方法洗涤未固定的一抗，接着再滴加 0.5%BSA溶液，放在室温下干燥，并用PBS缓冲液进行冲洗，避光保存。

②在疏水区域上滴加10 μL不同浓度的AFP溶液，在室温下孵育45 min，用PBS进行多次反复冲洗，然后依次滴加10 μL 100 μg/mL二抗溶液(购于郑州博赛生物技术有限公司，货号：CTA-1002)，DNA-戊二醛溶液，室温条件下反应45 min，用PBS反复洗涤，接着滴加10 μL H1 + H2 + SPSA缓冲液，室温条件下反应30 min，重复滴加一次10 μL H1 + H2 +SPSA缓冲液。最后用PBS反复冲洗，完成后将μPAD放于检测界面进行检测（原理图见图2）。相关的纸芯片-LIF检测接口见图3，在LIF（激发波长：473 nm，发射波长：525 nm）上，有一块由一块深色铝合金制成的滑块。在滑块的中间是一个矩形孔（1.4 cm × 0.8 cm），滑块被两个挡板限制，直线左右移动，将纸片（μPAD）夹在两块石英玻璃之间，用磁铁来保持两块玻璃的紧密，然后放置在滑块上，在检测过程中，拉杆被推向左侧。首先屏蔽LIF的激光。黑色滑块可以吸收光线并将反射光线减少到光电倍增管，然后以速度（2.2 cm/s）将拉杆向右拉，使光线短时间通过孔径，当光接触μPAD上的样品时，可以激发荧光，纸上的光斑直径为2mm，通过光圈后，光线再次被滑块遮挡，然后可以获得样品荧光信号。在相同的条件下，将样品溶液换成蒸馏水进行检测，即可测得空白峰，用样品检测所得的峰高扣除空白峰即可得到我们所检测的甲胎蛋白的荧光信号峰高。发现在1.0 - 100 ng/mL以及2.5 - 1000 pg/mL范围中AFP浓度与荧光强度成线性，线性方程分别为Y = 2.10 X + 240.88（R²=0.9913）（X:ng/mL）、Y = 0.25 X + 12.06（R²=0.9957）（X:pg/mL）。

如果患者身体内或者孕妇羊水中的AFP浓度异常，说明该患者可能患有恶性肿瘤，如肝癌或消化道癌症，而孕妇的胎儿可能患有脊柱裂和无脑畸形等。当把该患者经过离心的血液溶液加到以上处理过的纸芯片中以后，依照图2进行滴加实验溶液，在纸芯片上完成DNA等温杂交链式信号扩增与抗体-抗原-抗体三明治夹心检测相结合，实现癌症病人以及正常人血清的甲胎蛋白检测，如果在成人的血液中检测到AFP浓度高于25 ng/mL，说明该患者身体可能患有肿瘤或者慢性疾病等。

通过该方法和传统CLIA方法检测4个血清样品中的AFP含量进行对比，样品1和样品2分别是肝恶性肿瘤以及慢性乙型病毒性肝炎病人的血清，样品3为可能患有肝硬化以及肝占位病变病人血清，样品4是正常人的血清。鉴于癌症病人以及可能患病病人血清中AFP含量较高，因此我们将其稀释1000倍，将正常人血清稀释500 倍，进行检测。实验结果如表1所示，与电化学发光免疫检测结果接近，说明该方法能够用于实际样品检测。

表1 通过该方法和传统CLIA方法检测的人血清中的AFP含量

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种基于激光诱导荧光结合纸芯片检测血液中甲胎蛋白的技术

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttctccata cgcggaagtg aggtaaaaaa aaaa 34

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acctcacttc cgcgtatgga gaaaggttaa tttctccata cgcggaag 48

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tttctccata cgcggaagtg aggtcttccg cgtatggaga aattaacc 48

Claims

1.一种基于激光诱导荧光结合纸芯片检测血液中甲胎蛋白的技术，其特征在于，包括以下步骤：

（3）在疏水区域上滴加血液检测样本，在室温下完成孵育，用PBS进行多次反复冲洗，然后依次滴加二抗溶液，DNA-戊二醛溶液，室温条件下反应，用PBS反复洗涤，接着滴加H1 +H2 + SPSA缓冲液，室温条件下反应，重复滴加一次H1 + H2 + SPSA缓冲液，最后用PBS反复冲洗，完成后将μPAD放于检测界面进行检测。

2.根据权利要求1所述一种基于激光诱导荧光结合纸芯片检测血液中甲胎蛋白的方法，其特征在于，步骤（1）纸芯片的制备方法如下：首先通过喷蜡打印机，将设计图案打印至纸质基底之上，将蜡打印好的μPAD放置于烘箱加热，保证蜡完全融化在μPAD上形成疏水区域。

3.根据权利要求1所述一种基于激光诱导荧光结合纸芯片检测血液中甲胎蛋白的方法，其特征在于，步骤（3）所述DNA-戊二醛溶液的制备方法为：将1 × 10^-7M DNA、甲醇、冰醋酸、戊二醛按体积比1:1:1:1混合后，在40℃条件下反应1 反应制得；

所述DNA碱基序列为TTTCTCCATACGCGGAAGTGAGGT AAAAA AAAAA-NH2。

4.根据权利要求1所述一种基于激光诱导荧光结合纸芯片检测血液中甲胎蛋白的方法，其特征在于，步骤（3）所述H1 + H2 + SPSA缓冲液的制备方法为：将浓度为1.00 × 10^-5M的H1、H2和SPSC缓冲液按体积比1:1:8配制；

所述H1和H2碱基序列如下：

H1：ACCTCACTTCCGCGTATGGAGAAAGGTTAATTTCTCCATACGCGGAAG –FAM；

H2：FAM-TTTCTCCATACGCGGAAGTGAGGTCTTCCGCGTATGGAGAAATTAACC。

5.根据权利要求4所述一种基于激光诱导荧光结合纸芯片检测血液中甲胎蛋白的方法，其特征在于，所述SPSC缓冲液配制方法为：称取10.96 g的NaCl，4.48 g Na₂HPO₄·12H₂O的溶于250 mL容量瓶，然后用HCl调节至pH为7.4。

6.一种如权利要求1所述的方法在检测癌症中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，判定标准为：血液中检测到AFP浓度高于25ng/mL，则判定为患有肿瘤或者慢性疾病等。