CN117187393A

CN117187393A - 一种检测胃癌相关miRNA基因的FISH探针、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN117187393A
Application number: CN202311311954.XA
Authority: CN
Inventors: 梁敏; 肖瑶; 蒋昭筠; 屈高文; 余桂芳; 周新科; 彭彬; 林映琳
Original assignee: Fifth Affiliated Hospital Of Guangzhou Medical University Guangdong Provincial Laboratory Affiliated Hospital Of Guangzhou Regenerative Medicine And Health
Current assignee: Fifth Affiliated Hospital Of Guangzhou Medical University Guangdong Provincial Laboratory Affiliated Hospital Of Guangzhou Regenerative Medicine And Health
Priority date: 2023-10-11
Filing date: 2023-10-11
Publication date: 2023-12-08

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于胃癌诊断/预后预测和治疗靶点识别的新的miRNA‑FISH探针、试剂盒及该探针与免疫细胞蛋白标志物的免疫荧光‑荧光原位杂交（IF‑FISH）检测方法。本发明的FISH探针，其包含有如SEQ ID NO.1所示的序列；本发明制备的试剂盒包含FISH探针溶液，anti‑CD4抗体、anti‑CD8抗体和4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚。本发明的试剂盒通过检测特异性miRNA、CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的共定位情况，可以达到对胃癌大规模诊断与筛查的目的。

Description

一种检测胃癌相关miRNA基因的FISH探针、试剂盒及应用

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种检测胃癌相关miRNA基因的FISH探针，同时涉及其制备的试剂盒及其应用。

背景技术

肿瘤的发生发展与基因密不可分，环境因素以及遗传等的因素都可以导致或者引起DNA的变化，从而激活原癌基因或引起肿瘤抑制基因的灭活，引起基因表达水平的异常，使靶细胞发生转化。研究发现，超过 50% 的miRNA基因位于原癌基因或抑癌基因的染色体脆性位点（fragile sites）或相关遗传区域。miRNA基因往往在肿瘤中发生异常表达，其在肿瘤的发生发展过程中能够作为致癌因子或抑癌因子参与肿瘤的各个过程，对比肿瘤细胞与正常组织细胞间来源的miRNA发现，其表达谱具有明显差异。研究表明miRNA 在细胞凋亡、增殖、分化、血管生成及肿瘤形成等方面均具有重要的调节作用，参与人体大约30％的基因调节，与心血管疾病、肿瘤、免疫紊乱及代谢紊乱等多种发病有关。已有研究发现若干miRNA 的负调控作用与白血病、乳腺癌、肺癌、肝癌和结肠癌等高度相关。

胃癌是人类消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其起源于胃粘膜上皮，确切发病机制尚不清楚。据统计报告，在全球范围内，胃癌的发病率（5.6%）和死亡率（7.7%）分别排在第五和第四位。我国是胃癌的高发地区，发病率和死亡率均排在第三位，且呈现逐年上升趋势。胃癌的治疗策略是外科手术治疗为主的综合性治疗，手术被认为是目前唯一的根治性治疗方法。随着手术技术的进步和放疗、化疗、新辅助治疗的实施，胃癌患者的5年生存率有所提高。但是，由于早期胃癌缺乏特异性症状，早期诊断率低，大多数患者在确诊时己是晚期。许多患者在确诊后无法手术、或在根治性胃切除术后复发，预后不良。有报道指出，胃癌的死亡原因与血运转移、淋巴浸润和腹膜播散有关。

因此，进一步研究胃癌发生发展的机制，明确调控靶点，特别是筛选预后相关免疫标志物，在早期阶段实行有效检测和预测，选择合适的治疗方案和指导临床诊治，是降低死亡率、改善预后不良的关键。miRNA 与胃癌的发生发展关系非常密切，通过研究在胃癌癌变组织中表达异常的miRNA，可进一步阐明胃癌的发病机制，并将有助于胃癌的早期检测诊断、治疗以及预后的判断。

肿瘤的发生发展过程，始终与机体的免疫系统密切相关。肿瘤浸润性淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocytes, TILs）由T细胞、B细胞和NK细胞组成，其中，T细胞亚群包括细胞毒性T细胞（CD8⁺）、辅助性T细胞（CD4⁺）、记忆T细胞等多种亚型。白细胞分化抗原（Cluster of Differentiation, CD）CD4⁺T细胞可进一步分化为不同亚群，通过不同转录因子，分泌细胞因子和趋化因子，招募不同的免疫细胞和协调不同的免疫效应机制。CD8⁺T细胞在人类肿瘤免疫微环境中高度增殖、克隆和动态分化，其被活化后成为细胞毒性T细胞(CytotoxicT Lymphocyte, CTL)，在识别肿瘤抗原后，可诱导肿瘤细胞死亡，直接杀伤肿瘤细胞，因此，在抗肿瘤细胞免疫中和决定患者临床预后方面起着相当重要的作用。正常情况下，机体内CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞保持一定比例，以维持机体免疫内环境的平衡状态。有研究发现，CD62L^lowCD4⁺T细胞与效应CD8⁺T细胞显著相关，并与效应CD8⁺T细胞表面的PD-1表达显著相关。

MicroRNAs（miRNAs）是近些年来发现的一类内源性的具有调控功能的非编码小分子RNA，其大小长约20-25个核苷酸。miRNA基因在细胞核内由RNA聚合酶II转录后形成初级转录产物（pri-RNAs），pri-RNA经过一系列加工处理后成为19-25bp左右的成熟miRNA。成熟的miRNA在细胞中可以与蛋白质结合形成RNA诱导沉默复合物（RNA induced silencingcomplex , RISC）。RISC与靶mRNA基因不完全配对时，可以阻断miRNA的翻译过程，降低表达；RISC与靶mRNA完全配对时，则可以导致mRNA的降解。miRNA通过阻断或者降解的mRNA表达来控制靶基因的表达，从而达到调控基因的分化、凋亡等一系列的过程。

在miRNA检测分析方面，目前国内外多采用基因芯片筛选，RT-PCR定量分析等方法。基因芯片可以直接测定一份标本的多种miRNA，但是此方法背景和杂信号干扰大，重复性差，不能区分差异小的miRNA。RT-PCR技术通过实时监测目标miRNA转录基因的扩增产物来推算目标基因的量，灵敏度高，精确度高，但是多了转录步骤，程序略复杂。同时，实验结果也受到实验条件差异的影响，例如：（1）标本离体时间、保存条件不同，导致组织样本中RNA的降解程度不同；（2）总RNA提取方法不同、试剂不同，影响核酸回收率，并最终影响定量；（3）不同的仪器、试剂对cDNA合成效率的影响也不同。由于以上实验条件没有统一标准，结果的重复性较差，甚至可能出现截然相反的结论，严重阻碍着胃癌组织miRNA检测的发展应用。

对于胃癌活检样本，目前多采用免疫组织化学（IHC）和RNA-荧光原位杂交（RNA-FISH）分别检测蛋白和RNA标志物，然而，单一指标检测也存在局限性，例如：（1）IHC受到传统染色方法限制只能进行单一染色，无法在同一样本中同时检测CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的组织浸润情况；（2）RNA-FISH也只能单一地检测RNA目的基因，无法联合蛋白类生物标志物进一步判断它们在组织原位的空间位置关系。

综上所述，现有技术中尚无明确的胃癌早期诊断和预后的预测标志物，并将其与免疫细胞蛋白标志物一并进行共定位分析的工具和方法。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种检测胃癌相关miRNA基因的FISH探针，同时提供了其制备的试剂盒及应用。

本发明研究发现在胃癌细胞中存在miR203-PIK3CA-AKT信号通路，判断信号通路在胃癌的发生发展中发挥重要作用，因此，将miR203作为胃癌早期诊断和预后的新的预测标志物，miR203指hsa_miR_203基因，该基因在胃癌组织中较正常组织下调。

本发明提供miR203作为胃癌早期诊断标志物在制备检测试剂中的应用，或者miR203作为胃癌预后的标志物在制备检测试剂中的应用。

本发明提供的上述miRNA基因的FISH探针，其核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.1：5’-CTAGTGGTCCTAAACATTTCAC-3’。

本发明的探针以hsa_miR_203基因为模板，通过设计筛选得到。

同时，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有浓度为40-60μmol/L的FISH探针溶液，优选的，FISH探针溶液的浓度为50μmol/L。

进一步的，所述FISH探针为荧光原位杂交探针；FISH探针溶液，通过溶解在1×TE缓冲液中得到，所述1×TE溶液是以Tris-HCl（10mM, pH8.0）5mL，EDTA（1mM, pH 8.0）1mL，去离子水496mL配制而成。

进一步的，上试剂盒中还包括anti-CD4抗体、anti-CD8抗体和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染液。

具体的，anti-CD4抗体的浓度为0.9-1.1mg/mL、anti-CD8抗体的浓度为0.9-1.1mg/mL、4',6-二脒基-2-苯基吲哚复染液的浓度为0.9-1.1μg/mL；

优选的，anti-CD4抗体的浓度为1mg/mL、anti-CD8抗体的浓度为1mg/mL、4',6-二脒基-2-苯基吲哚复染液的浓度为1μg/mL。

本发明的试剂盒可对与胃癌相关的hsa_miR_203基因及蛋白标志物进行共定位检测，实现非诊断目的。

本发明还提供该试剂盒的使用方法，即该试剂盒的非诊断目的的使用方法，所述使用方法包括如下步骤：

1）对已固定在防脱落载玻片上的待测胃癌组织样品进行预处理；

2）将FISH探针滴加于样品上，使探针和待测样品进行变性杂交；

3）杂交后，对玻片进行洗涤；

4）先后将封闭液、抗体滴加于样品上，使抗体和待测样品进行特异性结合；

5）使用复染液对玻片上的杂交区域进行复染；

6）使用荧光显微镜观察玻片的杂交区域。

上述方案中，步骤1）所述待测胃癌组织样品预处理具体为：

1）将玻片转移至预热的烘片机，56℃烘片30min；

2）将玻片浸没二甲苯脱蜡3次，每次5min；

3）将玻片依次经70%、80%、90%、100%乙醇进行梯度脱水，每个梯度5min；室温静置晾干；

4）滴加20μL预杂交液于样本上，盖膜后，37℃孵育封闭30min。

上述方案中，步骤2）所述将探针和待测样品进行变性杂交具体为：

1）分别取FISH探针试剂1μL和杂交液39μL，混合得到FISH探针混合液；

2）将上述混合液滴加于样品处，盖上封片膜，73℃共变性5min，随后37℃杂交过夜。

上述方案中，步骤3）所述玻片洗涤具体为：

1)去掉封片膜，53℃预热的25%甲酰胺/2×SSC洗涤玻片2次，每次5min；

2)42℃预热的0.1%NP-40/2×SSC洗涤玻片2次，每次5min；

3)42℃预热的0.5×SSC洗涤玻片1次，5min；42℃预热的0.2×SSC洗涤1次，5min。

上述方案中，步骤4）所述将抗体和待测样品进行特异性结合具体为：

1）向样品滴加5%BSA封闭液，室温孵育封闭30min，甩去多余液体，用滤纸吸干周边水分；

2）向样品滴加一抗工作液，4℃冰箱孵育过夜；1×PBST室温洗涤3次，每次5min；

3）向样品滴加二抗工作液，室温孵育30min；1×PBST室温洗涤3次，每次5min。

上述方案中，步骤5）所述复染具体为：

1）向样品滴加10-20μL DAPI，盖膜，避光染色10min；

2）1×PBS洗涤2次，每次5min，避光晾干。

相较于现有技术中，常采用免疫组织化学（IHC）或荧光原位杂交（FISH）对组织样本进行检测，无法判断所检组分在组织原位的空间位置关系，无法将两种方式联合进行判断；本发明提供的IF-FISH检测的技术方案对不同检测指标采用不同的激发光通道标记，可以解决上述短板；在胃癌组织样本中既能检测到hsa-miR-203，又能检测到CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的浸润情况，来共同监测胃癌的发生与发展。

此外，该IF-FISH方法还适用于胃癌组织芯片，能同时监测几十乃至上百例临床样本中特异性miRNA、CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的共定位情况，达到胃癌大规模诊断与筛查的目的。

本发明的有益效果：

本发明筛选出具有肿瘤表达相关性及对胃癌生长具有调控作用的hsa_miR_203基因，将miR203作为胃癌早期诊断和预后的预测标志物，并提供其FISH探针。同时，本发明还提供一种IF-FISH试剂盒，其包括FISH探针和免疫细胞蛋白标志物（CD4、CD8），用于检测胃癌组织样本中特定基因的表达，以及CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的组织浸润共定位情况，来共同监测胃癌的发生与发展。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是IF-FISH检测胃癌患者癌组织样本中hsa-miR-203基因、CD4蛋白、CD8蛋白的表达（A为 hsa-miR-203基因，B为CD4蛋白，C为CD8蛋白，D为三个颜色荧光信号的共定位，其中蓝色为细胞核区域）；

图2是IF-FISH检测胃癌患者癌旁组织样本中hsa-miR-203基因、CD4蛋白、CD8蛋白的表达（A为 hsa-miR-203基因，B为CD4蛋白，C为CD8蛋白，D为三个颜色荧光信号的共定位，其中蓝色为细胞核区域）；

图3是IF检测人正常胃组织样本中hsa-miR-203基因、CD4蛋白、CD8蛋白的表达（A为 hsa-miR-203基因，B为CD4蛋白，C为CD8蛋白，D为三个颜色荧光信号的共定位，其中蓝色为细胞核区域）。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

本发明实施例中所用的部分试剂来源如下：

anti-CD4抗体：proteintech；

anti-CD8抗体：bioss；

4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）：博士德；

一抗工作液：

Anti-CD4：市售，proteintech 67786-1-Ig（鼠抗）；

Anti-CD8：市售，Bioss bs-0648R（兔抗）；

二抗工作液：

对CD4：Cy3标记山羊抗小鼠，市售，碧云天 A0521；

对CD8：Alexa Fluor 647 标记山羊抗兔lgG（H+L），市售，碧云天 A0468；

5% BSA封闭液：市售，博士德 AR0004；

预杂交液：市售，博士德 AR0152。

实施例 1探针的设计与合成

通过对hsa-miR-203基因进行分析，设计18-25bp的特异性探针序列，并进行筛选，最终确定探针序列为：

5’-CTAGTGGTCCTAAACATTTCAC-3’。

用上述设计好的探针序列合成荧光素标记探针，具体荧光标记为：

5’-FAM（绿色）CTAGTGGTCCTAAACATTTCAC-3’。

实施例 2反应试剂的制备

免疫荧光-荧光原位杂交（IF-FISH）试剂盒中所用的FISH探针制成溶液，该溶液是通过将FISH探针溶解在1×TE缓冲液中得到，探针浓度为50μmol/L；所述1×TE溶液是以Tris-HCl（10mM, pH8.0）5mL，EDTA（1mM, pH 8.0）1mL，去离子水496mL配制而成。

另外，IF-FISH试剂盒中还包括anti-CD4抗体、anti-CD8抗体、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染液。

试剂盒中各溶液及浓度如下表所示：

	浓度
		FISH探针溶液	50μmol/L
anti-CD4抗体	1mg/mL
		anti-CD8抗体	1mg/mL
4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染液	1μg/mL

实施例 3IF-FISH检测胃癌组织芯片中hsa-miR-203基因表达阳性和免疫细胞蛋白标志物CD4/CD8表达阳性的实验

本实施例按如下步骤进行实验：

1、对已固定在防脱落载玻片上的待测胃癌组织样品进行预处理。具体操作如下：

1.1将玻片转移至预热的烘片机，56℃烘片30min；

1.2将玻片浸没二甲苯脱蜡3次，每次5min；

1.3将玻片依次经70%、80%、90%、100%乙醇进行梯度脱水，每个梯度5min；室温静置晾干；

1.4滴加20μL预杂交液于样本上，盖膜后，37℃孵育封闭30min。

2、将FISH探针滴加于样品上，使探针和待测样品进行变性杂交。具体操作如下：

2.1 分别取FISH探针试剂1μL和杂交液39μL，混合得到FISH探针混合液；其中，杂交液的配比如下：

2.2将上述混合液滴加于样品处，盖上封片膜，73℃共变性5min，随后37℃杂交过夜。

3、杂交后，对玻片进行洗涤。具体操作如下：

3.1 去掉封片膜，53℃预热的25%甲酰胺/2×SSC洗涤玻片2次，每次5min；

3.242℃预热的0.1%NP-40/2×SSC洗涤玻片2次，每次5min；

3.342℃预热的0.5×SSC洗涤玻片1次，5min；42℃预热的0.2×SSC洗涤1次，5min。

4、先后将封闭液、抗体滴加于样品上，使抗体和待测样品进行特异性结合。具体操作如下：

4.1 向样品滴加5%BSA封闭液，室温孵育封闭30min，甩去多余液体，用滤纸吸干周边水分；

4.2 向样品滴加一抗工作液，4℃冰箱孵育过夜；1×PBST室温洗涤3次，每次5min；

4.3 向样品滴加二抗工作液，室温孵育30min；1×PBST室温洗涤3次，每次5min。

5、使用复染液对玻片上的杂交区域进行复染。具体操作如下：

5.1 向样品滴加10-20μL DAPI，盖膜，避光染色10min；

5.21×PBS洗涤2次，每次5min，避光晾干。

6、使用荧光显微镜观察玻片的杂交区域。

实验结果如图1~图3所示。

结果分析：从图1~图3可见，hsa_miR_203基因（绿色）主要表达于细胞质；CD4（橙色）主要表达于细胞质、CD8（红色）主要表达于细胞质。相对于正常胃组织样本，胃癌患者的胃癌组织和癌旁组织样本中hsa_miR_203基因表达和CD4蛋白表达均下调，且呈现出胃癌<癌旁的趋势（绿色、橙色逐渐减弱）；相对于正常胃组织样本，胃癌患者的胃癌组织和癌旁组织样本中CD8蛋白表达上调，且呈现出胃癌>癌旁的趋势（红色逐渐增强）；同时，在三类样本中，CD4⁺T/CD8⁺T的比值呈现出胃癌<癌旁<正常的趋势。

以上结果说明hsa_miR_203基因绿色荧光探针可用于检测胃癌样品中hsa_miR_203基因的表达情况；同时对hsa_miR_203基因表达情况和免疫标志CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的组织浸润情况进行共定位联合检测，既可直接对样品进行原位定量，又可达到胃癌预后诊断与筛查的目的。

其中，原位定量指相对定量，即在相同的条件下（同时进行正常组和胃癌组的IF-FISH实验、荧光检测过程中保持参数一致等进行实验），然后以正常组为对照，检测胃癌组中各指标的表达情况；如胃癌组中指标的荧光亮度大于正常组，说明该指标在胃癌组中表达量上升，反之，表达量下降。

本实施例检测的胃癌组织芯片包括35例胃癌组织、35例癌旁组织和5例正常组织，均可以对上述特定基因表达情况和免疫标志CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的组织浸润情况进行共定位联合检测，结果不一一赘述。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种检测胃癌相关miRNA基因的FISH探针，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2. 一种包含权利要求1所述的一种检测胃癌相关miRNA基因的FISH探针的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含浓度为40-60μmol/L 的FISH探针溶液。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含anti-CD4抗体、anti-CD8抗体和4',6-二脒基-2-苯基吲哚复染液。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，anti-CD4抗体的浓度为0.9-1.1mg/mL、anti-CD8抗体的浓度为0.9-1.1mg/mL、4',6-二脒基-2-苯基吲哚复染液的浓度为0.9-1.1μg/mL。

5.一种权利要求2-4任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）对待测样品进行预处理；

2）将FISH探针滴加于待测样品上，使FISH探针和待测样品进行变性杂交；

3）对步骤2）杂交后的样品进行洗涤；

4）依次将封闭液、抗体滴加于步骤3）处理后的样品上，使抗体和样品进行特异性结合；

5）使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚复染液进行复染；

6）使用荧光显微镜观察结果。

6.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，步骤1）具体为：

（1-1）将载玻片烘片；

（1-2）将载玻片用二甲苯处理脱蜡；

（1-3）将载玻片依次经70%、80%、90%、100%乙醇进行梯度脱水，静置晾干；

（1-4）滴加预杂交液于样本上，盖膜后，37℃孵育封闭30min。

7.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，步骤2）具体为：

（2-1）将FISH探针溶液与预杂交液混合，得到FISH探针混合液；FISH探针溶液与预杂交液的体积比为1:39；

（2-2）将FISH探针混合液滴加于样品处，盖上封片膜，73℃共变性5min，随后37℃杂交过夜。

8.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，步骤3）具体为：

（3-1）用53℃预热的25%甲酰胺/2×SSC中洗涤玻片2次，每次5min；

（3-2）42℃预热的0.1%NP-40/2×SSC中洗涤防脱落载玻片2次，每次5min；

（3-3）42℃预热的0.5×SSC洗涤防脱落载玻片1次，5min；

（3-3）42℃预热的0.2×SSC洗涤防脱落载玻片1次，5min。

9.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，步骤4）具体为：

（4-1）在样本上滴加5%BSA封闭液，室温孵育封闭30min，甩去多余液体，吸干水分；

（4-2）在样本上滴加一抗工作液，4℃冰箱孵育过夜；用1×PBST室温洗涤3次，每次5min；

（4-3）在样本上滴加二抗工作液，室温孵育30min；1×PBST室温洗涤3次，每次5min。

10.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，步骤5）所述复染具体为：

（5-1）在样本上滴加 4',6-二脒基-2-苯基吲哚复染液，盖膜，避光染色10min；

（5-2）1×PBS洗涤2次，每次5min，避光晾干。