CN109161597A - 一种用于前列腺癌早期诊断的外泌体源性基因mRNA标志物组及其应用 - Google Patents

一种用于前列腺癌早期诊断的外泌体源性基因mRNA标志物组及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于前列腺癌早期诊断的外泌体源性基因mRNA标志物组及其应用，所述标志物组包括：外泌体源性TXK基因mRNA、外泌体源性ATM基因mRNA、外泌体源性MAX基因mRNA、外泌体源性STK4基因mRNA、外泌体源性GRK5基因mRNA、外泌体源性PDGFA基因mRNA、外泌体源性IL32基因mRNA、外泌体源性RASSF5基因mRNA和外泌体源性TOX4基因mRNA。本发明所述标志物组、试剂/试剂盒、系统及应用能较准确地区分前列腺癌受试者与非前列腺癌受试者（包括良性前列腺增生、前列腺炎、正常人等），提高前列腺癌早期诊断的灵敏度、特异度和准确性，从而避免临床上不必要的前列腺穿刺活检。

Description

一种用于前列腺癌早期诊断的外泌体源性基因mRNA标志物组 及其应用
技术领域
本发明涉及医学诊断领域，具体而言，涉及一种用于前列腺癌早期诊断的外泌体源性基因mRNA标志物组及其应用。
背景技术
前列腺癌是威胁男性健康的常见肿瘤之一。在世界范围内，前列腺癌发病率位居男性恶性肿瘤第2位。前列腺癌在美国的发病率已经超过肺癌，成为第一位危害男性健康的肿瘤。我国前列腺癌发病率近年来也呈显著上升趋势，已成为泌尿系统发病率最高的恶性肿瘤。2017年中国前列腺癌确诊患者是122万，近五年的复合增长率在12%左右。前列腺癌早期不易被发现，约65%～75%的前列腺癌患者在确诊时病情已发展至晚期。早期前列腺癌进行根治手术或者放疗，5年的总生存率可以接近100%；而一旦到了晚期，5年的生存率只有28%。因此，前列腺癌的早期诊断对于前列腺癌患者的治疗、预后以及生存具有重要意义。
目前，血清PSA（前列腺特异性抗原）指标筛查是前列腺癌早期检测的最常用的方法。但是PSA的应用存在着以下问题：1）PSA具有器官特异性，但不具有癌症特异性，高假阳性率和低特异性导致大量不必要的前列腺穿刺活检，给患者带来巨大的心理和经济负担。2）PSA在诊断前列腺癌方面特异性较差，尤其是tPSA在4~10ng/mL时，PSA诊断指标不能区分非前列腺癌受试者（良性前列腺增生、前列腺炎、正常人等）与前列腺癌受试者。3）PSA在诊断前列腺癌方面敏感性差，在一般认为PSA处于正常值（小于4ng/mL）时，仍有约15%的前列腺癌患者漏诊，且在漏诊前列腺癌患者中有约15%的前列腺癌患者Gleason评分大于或等于7分。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供用于前列腺癌的早期诊断标志物组、所述标志物组的检测试剂在制备前列腺癌的早期诊断试剂或试剂盒中的应用、诊断试剂或试剂盒以及诊断系统，从而较好地通过非侵入的方式实现前列腺癌的早期诊断，提高诊断的灵敏度、特异度和准确性，避免临床上不必要的前列腺穿刺活检。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种用于前列腺癌的早期诊断标志物组，所述标志物组包括：
外泌体源性TXK基因mRNA、外泌体源性ATM基因mRNA、外泌体源性MAX基因mRNA、外泌体源性STK4基因mRNA、外泌体源性GRK5基因mRNA、外泌体源性PDGFA基因mRNA、外泌体源性IL32基因mRNA、外泌体源性RASSF5基因mRNA和外泌体源性TOX4基因mRNA。
在一些具体的实施方式中，所述外泌体源性TXK基因mRNA选自TXK基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子13、外显子14或外显子15；
所述外泌体源性ATM基因mRNA选自ATM基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子61、外显子62或外显子63；
所述外泌体源性MAX基因mRNA选自MAX基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5或外显子6；
所述外泌体源性STK4基因mRNA选自STK4基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子9、外显子10或外显子11；
所述外泌体源性GRK5基因mRNA选自GRK5基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子14、外显子15或外显子16；
所述外泌体源性PDGFA基因mRNA选自PDGFA基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子5、外显子6或外显子7；
所述外泌体源性IL32基因mRNA选自IL32基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子5、外显子6或外显子7；
所述外泌体源性RASSF5基因mRNA选自RASSF3基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5或外显子6；
所述外泌体源性TOX4基因mRNA选自TOX4基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子8、外显子9或外显子10。
在一些具体的实施方式中，所述外泌体为血液、血浆或血清外泌体。
本发明还提供前述标志物组的检测试剂在制备前列腺癌的早期诊断试剂或试剂盒中的应用。
在一些具体的实施方式中，所述检测试剂包括外泌体提取试剂、核酸提取试剂、核酸反转录试剂和针对所述标志物组的Ct值检测试剂。
在一些具体的实施方式中，所述Ct值检测试剂包括上游引物、下游引物和检测探针，所述检测探针的5’端标记荧光基团（可选地，FAM荧光基团），3’端标记MGB修饰基团。
在一些具体的实施方式中，优选地，所述Ct值检测试剂还包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、阴性对照品和阳性对照品中的一种或多种；更优选地，其中，所述阴性对照品为RNase-free和DNase-free的纯水，所述阳性对照品为人源RWPE1细胞系总RNA。
在一些具体的实施方式中，所述外泌体源性TXK基因mRNA的Ct值检测试剂包括：上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；检测探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述外泌体源性ATM基因mRNA的Ct值检测试剂包括：上游引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示；下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；检测探针，其核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示；
所述外泌体源性MAX基因mRNA的Ct值检测试剂包括：上游引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO：7所示；下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；检测探针，其核苷酸序列如SEQ IDNO：9所示；
所述外泌体源性STK4基因mRNA的Ct值检测试剂包括：上游引物，其核苷酸序列如SEQID NO：10所示；下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；检测探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；
所述外泌体源性GRK5基因mRNA的Ct值检测试剂包括：上游引物，其核苷酸序列如SEQID NO：13所示；下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；检测探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示；
所述外泌体源性PDGFA基因mRNA的Ct值检测试剂包括：上游引物，其核苷酸序列如SEQID NO：16所示；下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示；检测探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示；
所述外泌体源性IL32基因mRNA的Ct值检测试剂包括：上游引物，其核苷酸序列如SEQID NO：19所示；下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示；检测探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示；
所述外泌体源性RASSF5基因mRNA的Ct值检测试剂包括：上游引物，其核苷酸序列如SEQID NO：22所示；下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示；检测探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示；
和所述外泌体源性TOX4基因mRNA的Ct值检测试剂包括：上游引物，其核苷酸序列如SEQID NO：25所示；下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示；检测探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示。
本发明还提供根据前述应用制备得到的前列腺癌早期诊断试剂或试剂盒。
本发明还提供一种前列腺癌的早期诊断系统，所述系统包括信息获取模块、计算模块和诊断模块；
其中，所述信息获取模块用于执行获取受试者检测信息的操作，所述检测信息包括前述标志物组的Ct值信息；
所述计算模块用于执行将所述标志物组的Ct值信息代入基于标志物组的Ct值建立的诊断模型，计算SUMCT值的操作；
所述诊断模块用于执行根据所述SUMCT值判断所述受试者的健康状况的操作，如果所述受试者的所述SUMCT值小于第一预定值，则判断所述受试者为非前列腺癌，如果所述受试者的所述SUMCT值在第一预定值~第二预定值范围内，则判断所述受试者为前列腺癌患者。
在一些具体的实施方式中，所述诊断模型的计算公式如下所示：
所述诊断模型的计算公式如下所示：
SUMCT=k1×TXKCt－k2×ATMCt－k3×MAXCt－k4×STK4Ct＋k5×GRK5Ct－k6×PDGFACt－k7×IL32Ct－k8×RASSF5Ct－k9×TOX4Ct;
其中，基因系数k1取0.1~0.4，可选地，0.1, 0.2, 0.3, 0.4;
k2取0.1~0.4，可选地，0.1, 0.2, 0.3, 0.4，；
k3取0.2~0.6，可选地，0.2, 0.3, 0.4，0.5, 0.6；
k4取0.1~0.5，可选地，0.1，0.2, 0.3, 0.4，0.5；
k5取0.3~1，可选地，0.2, 0.3, 0.4，0.5, 0.6，0.7，0.8，0.9，1.0；
k6取0.3~1，可选地，0.2, 0.3, 0.4，0.5, 0.6，0.7，0.8，0.9，1.0；
k7取0.2~0.6，可选地，0.2, 0.3, 0.4，0.5, 0.6；
k8取0.6~1.5，可选地，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2, 1.3, 1.4，0.5；
k9取4.5~6.5，可选地，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0，5.1，5.2, 5.3, 5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2， 6.3，6.4，6.5;
TXKCt、ATMCt、MAXCt、STK4Ct、GRK5Ct、PDGFACt、IL32Ct、RASSF5Ct、TOX4Ct分别表示：基因TXK、ATM、MAX、STK4、GRK5、PDGFA、IL32、RASSF5、TOX4的外泌体mRNA的Ct值；
优选地，SUMCT=0.1×TXKCt－0.1×ATMCt－0.2×MAXCt－0.1×STK4Ct＋0.3×GRK5Ct－0.3×PDGFACt－0.2×IL32Ct－0.6-×RASSF5Ct－4.5×TOX4Ct。
在一些具体的实施方式中，所述预定值1为-230，所述预定值2为-130。
在一些具体的实施方式中，所述诊断系统还包括检测模块，所述检测模块用于执行前述标志物组的Ct值信息的检测。
在一些具体的实施方式中，所述诊断系统还包括结果显示模块，所述结果显示模块用于显示所述诊断模块得出的诊断结论，优选的，所述结果显示模块通过屏幕显示、声音播报或打印的方式显示诊断结果。
在一些具体的实施方式中，所述诊断系统还包括预判模块，所述预判模块用于获取PSA检测结果（可选地，血清PSA检测结果），并判断所述PSA检测结果与阈值之间的关系，根据判断结果决定是否启动所述信息获取模块、计算模块、诊断模块和/或检测模块；优选地，如果低于所述阈值，则启动所述信息获取模块、计算模块、诊断模块和/或检测模块，或者则不启动所述信息获取模块、计算模块、诊断模块和/或检测模块；更优选地，所述阈值为50ng PSA/mL样本。
术语定义
本发明所述“前列腺癌的早期诊断”是指将无明显症状的前列腺癌受试者与非前列腺癌受试者区分，其中，所述无明显症状的前列腺癌包括板不限于非转移性前列腺癌，所述非前列腺癌包括但不限于良性前列腺增生、前列腺炎、正常人；
本发明所述“Ct值”是指PCR反应过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，其中C代表Cycle，t代表threshold；
TXK基因是指TXK tyrosine kinase，共15个外显子；
ATM基因是指ATM serine/threonine kinase，共63个外显子；
MAX基因是指MYC associated factor X，共6个外显子；
STK4是指serine/threonine kinase 4，共11个外显子；
GRK5是指G protein-coupled receptor kinase 5，共16个外显子；
PDGFA是指platelet derived growth factor subunit A，共7个外显子；
IL32是指interleukin 32，共7个外显子；
RASSF5是指Ras association domain family member 5，共6个外显子；
TOX4是指TOX high mobility group box family member 4，共10个外显子。
SUMCT值是指根据诊断模型的公式计算得到的分值。
本发明所述“第一预定值”和“第二预定值”中的“第一”和“第二”仅用于区分两个预定值，而不能理解为指示或暗示相对重要性或任何顺序。
有益效果
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）与血清PSA指标相比，本发明所述标志物组、诊断试剂/试剂盒和诊断系统能更好地区分早期前列腺癌与非前列腺癌，显著提高前列腺癌早期诊断的灵敏度、特异度和准确性。
（2）本发明经研究发现，所述标志物组中每个基因前三个外显子和最后三个外显子在Ct值上明显小于其他外显子，且外显子之间得到的Ct值差异更小，而每个基因中间的外显子Ct值明显偏大，且重复性不够稳定。因此，本发明优选前三个外显子和最后三个外显子作为标志物组，从而进一步提高所述标志物组、诊断试剂或试剂盒、系统诊断前列腺癌的灵敏度、特异度和准确性。
（3）本发明经研究发现，诊断模型的基因系数取中位数时诊断效果最佳，有鉴于此，本发明进一步优选诊断模型的公式为SUMCT=0.25×TXKCt－0.25×ATMCt－0.35×MAXCt－0.3×STK4Ct＋0.65×GRK5Ct－0.65×PDGFACt－0.4×IL32Ct－1.05×RASSF5Ct－5.5×TOX4Ct。
（4）本发明所述标志物组、诊断试剂盒/诊断试剂、诊断系统能够在PSA检测结果偏低的情况下进行补充检测，减少PSA假阳性诊断结果，优选地，先检测PSA含量，再根据PSA是否低于阈值判断是否对本发明所述标志物组进行检测，能够尽可能减少检测项目，又防止漏检。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1~图9分别为TXK基因、ATM基因、MAX基因、STK4基因、GRK5基因、PDGFA基因、IL32基因、RASSF5基因和TOX4基因的不同外显子在外泌体中的Ct值；
图10为不同外显子组Ct值的ROC曲线图，其中横坐标为特异性，纵坐标为灵敏度，1为参考线，2为SUMCT（1号外显子）的ROC曲线，3为SUMCT（混合外显子）的ROC曲线；
图11为不同基因系数诊断模型的ROC曲线图，其中横坐标为特异性，纵坐标为灵敏度，1为参考线，2为SUMCT（中位数基因系数）的ROC曲线，3为SUMCT（最大基因系数）的ROC曲线，4为SUMCT（最小基因系数）的ROC曲线；
图12为PSA诊断指标和中位数基因系数诊断模型的ROC曲线图，其中横坐标为特异性，纵坐标为灵敏度，1为参考线，2为SUMCT（基因中位数系数）的ROC曲线，3为PSA的ROC曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种对血清外泌体mRNA进行定量分析的方法，所述方法具体包括：用外泌体提取试剂盒(QIAGEN公司：exoEasy Maxi Kit或者miRCURY Exosome Kits；Thermofisher公司：Total Exosome Isolation Reagent from serum)，将血清中的总外泌体提取出来。随后将提取的外泌体，利用核糖核酸抽提试剂盒(QIAGEN公司：miRNeasyMicro Kit)，将外泌体中全部的核糖核酸进行提取。提取后的核糖核酸，用反转录试剂盒(Takara公司：PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit)，将核糖核酸转化成cDNA。随后利用引物和检测探针对所述cDNA进行荧光定量PCR反应，获得所述cDNA的Ct值，PCR反应过程中使用的PCR仪为Thermofisher公司：AB7500荧光PCR仪。其中，在PCR反应过程中，PCR反应液为2×Taqpath ProAmp Mix(Thermofisher公司)，阴性对照品为RNase-free和DNase-free的纯水，阳性对照品为人源RWPE1细胞系提取的总RNA，引物工作浓度在100-500nM，探针工作浓度在100-400nM。
实施例2
本发明采用实施例1所述方法对大量临床样本的血清外泌体mRNA进行检测，获得相应的实验数据，并通过对所述实验数据的整理、分析和建模，获得一种前列腺癌早期诊断模型，其具体公式为：
所述诊断模型的计算公式如下所示：
SUMCT=k1×TXKCt－k2×ATMCt－k3×MAXCt－k4×STK4Ct＋k5×GRK5Ct－k6×PDGFACt－k7×IL32Ct－k8×RASSF5Ct－k9×TOX4Ct;
其中，基因系数k1取0.1~0.4，k2取0.1~0.4，k3取0.2~0.6，k4取0.1~0.5，k5取0.3~1，k6取0.3~1，k7取0.2~0.6，k8取0.6~1.5，k9取4.5~6.5;
TXKCt、ATMCt、MAXCt、STK4Ct、GRK5Ct、PDGFACt、IL32Ct、RASSF5Ct、TOX4Ct分别表示：基因TXK、ATM、MAX、STK4、GRK5、PDGFA、IL32、RASSF5、TOX4的外泌体mRNA的Ct值；
模型分析结果：如果受试者的SUMCT值低于-230，则所述受试者为非非前列腺癌，如果所述受试者的SUMCT值为-230~-130，则所述受试者为前列腺癌。
实施例3
基于实施例2所述诊断模型，本实施例提供一种用于早期诊断前列腺癌的标志物组，所述标志物包括：外泌体源性TXK基因mRNA、外泌体源性ATM基因mRNA、外泌体源性MAX基因mRNA、外泌体源性STK4基因mRNA、外泌体源性GRK5基因mRNA、外泌体源性PDGFA基因mRNA、外泌体源性IL32基因mRNA、外泌体源性RASSF5基因mRNA和外泌体源性TOX4基因mRNA。
基于实施例2所述的诊断模型和实施例3所述标志物组，本实施例还提供前述标志物组检测试剂在制备前列腺诊断试剂或试剂盒中的应用，以及根据所述应用制成的诊断试剂或试剂盒。
实施例4
基于实施例2所述的诊断模型，本实施例提供一种前列腺癌的早期诊断系统，所述系统包括信息获取模块、计算模块和诊断模块，其中：所述信息获取模块用于执行获取受试者检测信息的操作，所述检测信息包括前述标志物组的Ct值信息；
所述计算模块用于执行将所述标志物组的Ct值信息代入诊断模型的计算公式，计算SUMCT值的操作，所述计算公式如下所示：
所述诊断模型的计算公式如下所示：
SUMCT=k1×TXKCt－k2×ATMCt－k3×MAXCt－k4×STK4Ct＋k5×GRK5Ct－k6×PDGFACt－k7×IL32Ct－k8×RASSF5Ct－k9×TOX4Ct;
其中，基因系数k1取0.1~0.4，k2取0.1~0.4，k3取0.2~0.6，k4取0.1~0.5，k5取0.3~1，k6取0.3~1，k7取0.2~0.6，k8取0.6~1.5，k9取4.5~6.5;
TXKCt、ATMCt、MAXCt、STK4Ct、GRK5Ct、PDGFACt、IL32Ct、RASSF5Ct、TOX4Ct分别表示：基因TXK、ATM、MAX、STK4、GRK5、PDGFA、IL32、RASSF5、TOX4的外泌体mRNA的Ct值；
所述诊断模块用于执行根据所述SUMCT值判断所述受试者的健康状况的操作，如果所述受试者的所述SUMCT值小于-230，则判断所述受试者为非前列腺癌，如果所述受试者的所述SUMCT值在-230~-130之间，则判断所述受试者为前列腺癌。
所述诊断系统还包括检测模块，所述检测模块用于执行前述标志物组的Ct值信息的检测。
所述诊断系统还包括结果显示模块，所述结果显示模块用于显示所述诊断模块得出的诊断结论，优选的，所述结果显示模块通过屏幕显示、声音播报或打印的方式显示诊断结果。
实施例5
本实施例检测实施例3所述标志物组中同一基因不同外显子的外泌体表达情况，并评估不同外显子对诊断模型的影响，优化每个基因的检测片段，以获得理想的模型分析结果。
（1）针对每个基因设计引物：其中TXK覆盖1、2、3、4、6、9、11、13、14和15号外显子；ATM覆盖1、2、3、10、20、30、40、61、62和63号外显子；MAX覆盖1、2、3、4、5和6号外显子；STK4覆盖1、2、3、4、5、6、8、9、10和11号外显子；GRK5覆盖1、2、3、6、8、10、12、14、15和16号外显子；PDGFA覆盖1、2、3、4、5、6和7号外显子；IL32覆盖1、2、3、4、5、6和7号外显子；RASSF5覆盖1、2、3、4、5和6号外显子；TOX4覆盖1、2、3、4、5、6、7、8、9和10号外显子。
（2）检测10例血清样本中各外泌体-外显子的Ct值，具体检测方法参见实施例1。统计结果显示每个基因两端的外显子的Ct值上明显小于中间的外显子。当外显子靠近两端时，检测样本之间的Ct值差异更小，当外显子靠近中间，检测样本之间的Ct值差异更显著（具体检测结果参见图1~图9）。因此优选前三个外显子和最后三个外显子作为模型中检测的具体片段。
（3）比较在同一个基因系数体系下(模型中取每个基因的最小基因系数)，选择1号外显子组与混合外显子组在诊断上的差异。
分组信息：1号外显子组中每个基因都选择1号外显子（Ct值相对小）。混合外显子组中TXK基因用11号外显子、ATM基因用10号外显子、MAX基因用4号外显子、STK4基因用6号外显子、GRK5基因用10号外显子、PDGFA基因用4号外显子、IL32基因用5号外显子、RASSF5用5号外显子、TOX4基因用7号外显子（Ct值相对大）。
入组样本：50例临床诊断结论已确定的样本，由良性前列腺增生、前列腺炎、正常人和早期前列腺癌患者组成。
比较方式和比较结果：检测所述入组样本的1号外显子组和混合外显子组，并将所得外显子组Ct值代入实施例2所述诊断模型。根据入组样本的临床诊断结论，统计用同一基因系数模型中，每个基因不同外显子Ct值的ROC曲线（参见图10）。图10所示结果表明，当模型中是混合型外显子时，诊断模型的有效性有明显降低，AUC面积为0.596，低于选择1号外显子组的AUC面积（0.856），灵敏性和特异性都有显著下降。说明选择Ct值更小的基因外显子作为模型中检测的片段效果更好。
实施例6
本实施例比较基因系数的差异对诊断模型有效性的影响，优化基因系数以获得理想的模型分析结果。
（1）选择诊断模型中每个基因Ct值相对小的外显子作为检测片段，通过荧光定量PCR检测其Ct值：
检测片段：TXK选择15号外显子、ATM选择1号外显子、MAX选择1号外显子、STK4选择3号外显子、GRK5选择16号外显子、PDGFA选择1号外显子、IL32选择3号外显子、RASSF5选择6号外显子、TOX4选择10号外显子。荧光定量PCR的引物和探针信息如表1所示。
表1 引物和探针信息
（2）根据实施例2所述诊断模型，比较每个基因系数最小、中位数和最大时，三个模型的诊断效果。
基因系数最小模型为SUMCT=0.1×TXKCt－0.1×ATMCt－0.2×MAXCt－0.1×STK4Ct＋0.3×GRK5Ct－0.3×PDGFACt－0.2×IL32Ct－0.6-×RASSF5Ct－4.5×TOX4Ct。基因系数中位数模型为SUMCT=0.25×TXKCt－0.25×ATMCt－0.35×MAXCt－0.3×STK4Ct＋0.65×GRK5Ct－0.65×PDGFACt－0.4×IL32Ct－1.05×RASSF5Ct－5.5×TOX4Ct。基因系数最大模型为SUMCT=0.4×TXKCt－0.4×ATMCt－0.6×MAXCt－0.5×STK4Ct＋1×GRK5Ct－1×PDGFACt－0.6×IL32Ct－1.5×RASSF5Ct－6.5×TOX4Ct。
入组样本：50例临床诊断结论已确定的样本，由良性前列腺增生、前列腺炎、正常人和早期前列腺癌患者组成。
比较方式和比较结果：检测所述入组样本相应基因Ct值，根据入组样本的临床诊断结论，统计用三种基因系数模型得到的ROC曲线（具体参见图11）。根据图11所示结果可知，用中位基因系数模型得到AUC（0.912）大于最小基因系数模型（AUC面积为0.810)、最大基因系数模型（AUC面积为0.858），说明中位基因系数模型诊断效果优于使用最小基因系数或最大基因系数。
实施例7
本实施例比较本发明所述诊断模型和PSA诊断指标的效果。选择100例临床诊断结论已知的样本作为入组样本（参见表2），分别检测PSA值以及本发明所述标志物组的Ct值，根据诊断模型（基因系数为中位数，检测片段同实施例6）计算SUMCT值，最后根据入组样本的临床诊断结论，统计目前临床上PSA的诊断效果与本发明中SUMCT的效果。在PSA浓度小于50ng/mL血清样本下，绘制两种方法得到的ROC曲线（参见图12）。根据图12所示结果可知，PSA诊断指标的AUC面积为0.613，诊断模型的AUC面积为0.915，表明本发明所述诊断模型的诊断效果明显优于PSA。
表2入组样本信息
入组样本编号 诊断结论 PSA(ng/mL) SUMCT值
1 非前列腺癌 4 -246
2 非前列腺癌 4.02 -225
3 非前列腺癌 4.19 -234
4 非前列腺癌 4.4 -233
5 前列腺癌 4.63 -209
6 非前列腺癌 4.65 -275
7 非前列腺癌 4.73 -234
8 非前列腺癌 5.08 -213
9 非前列腺癌 5.11 -248
10 非前列腺癌 5.17 -292
11 非前列腺癌 5.34 -195
12 非前列腺癌 5.38 -240
13 前列腺癌 5.54 -205
14 非前列腺癌 5.55 -234
15 非前列腺癌 5.57 -189
16 非前列腺癌 5.59 -205
17 前列腺癌 5.61 -211
18 非前列腺癌 5.72 -230
19 前列腺癌 5.78 -216
20 非前列腺癌 5.82 -188
21 非前列腺癌 5.92 -224
22 非前列腺癌 5.94 -223
23 非前列腺癌 5.96 -219
24 非前列腺癌 6 -170
25 前列腺癌 6.19 -192
26 前列腺癌 6.22 -208
27 非前列腺癌 6.24 -235
28 前列腺癌 6.26 -227
29 前列腺癌 6.29 -203
30 非前列腺癌 6.33 -222
31 非前列腺癌 6.35 -221
32 前列腺癌 6.39 -220
33 非前列腺癌 6.4 -219
34 非前列腺癌 6.48 -268
35 非前列腺癌 6.49 -238
36 非前列腺癌 6.52 -251
37 非前列腺癌 6.53 -261
38 非前列腺癌 6.57 -275
39 非前列腺癌 6.63 -235
40 非前列腺癌 6.67 -228
41 非前列腺癌 6.69 -289
42 非前列腺癌 6.71 -233
43 非前列腺癌 6.74 -256
44 前列腺癌 6.86 -215
45 非前列腺癌 6.97 -234
46 前列腺癌 7.09 -233
47 前列腺癌 7.12 -233
48 非前列腺癌 7.37 -292
49 非前列腺癌 7.44 -215
50 非前列腺癌 7.46 -225
51 非前列腺癌 7.5 -244
52 非前列腺癌 8.83 -271
53 前列腺癌 8.91 -195
54 非前列腺癌 8.92 -241
55 非前列腺癌 9 -191
56 非前列腺癌 9.09 -246
57 前列腺癌 9.36 -195
58 前列腺癌 9.38 -194
59 非前列腺癌 9.5 -272
60 前列腺癌 9.74 -160
61 非前列腺癌 10.17 -222
62 非前列腺癌 10.19 -266
63 前列腺癌 10.27 -171
64 非前列腺癌 10.32 -225
65 前列腺癌 10.34 -194
66 非前列腺癌 10.44 -293
67 前列腺癌 10.5 -192
68 前列腺癌 10.52 -191
69 非前列腺癌 12.39 -259
70 前列腺癌 12.4 -156
71 非前列腺癌 12.46 -241
72 非前列腺癌 12.58 -266
73 非前列腺癌 13.6 -285
74 非前列腺癌 13.65 -241
75 前列腺癌 13.86 -160
76 前列腺癌 13.96 -173
77 前列腺癌 15.06 -196
78 前列腺癌 15.28 -189
79 非前列腺癌 15.3 -169
80 非前列腺癌 15.44 -262
81 前列腺癌 16.67 -184
82 前列腺癌 16.88 -183
83 前列腺癌 16.96 -182
84 非前列腺癌 17.3 -237
85 前列腺癌 18.01 -181
86 前列腺癌 18.2 -157
87 非前列腺癌 19.94 -253
88 前列腺癌 20.29 -146
89 非前列腺癌 21 -281
90 非前列腺癌 21.68 -239
91 非前列腺癌 22.11 -250
92 前列腺癌 22.81 -160
93 前列腺癌 24.25 -141
94 前列腺癌 25.09 -179
95 前列腺癌 25.76 -195
96 前列腺癌 29.58 -194
97 前列腺癌 31.95 -194
98 前列腺癌 33.12 -160
99 前列腺癌 36.74 -179
100 前列腺癌 40.21 -187
注，表2中的前列腺癌均为早期前列腺癌。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 上海晟燃生物科技有限公司
<120> 一种用于前列腺癌早期诊断的外泌体源性基因mRNA标志物组及其应用
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
cccttgaggt tcttct 16
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
ttatcccatg agttgg 16
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 3
tccttcttga agacga 16
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 4
ttggcgttgc ttcttcctc 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 5
cgcagatccc gactcctct 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 6
cagtcacgca gggtttga 18
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 7
actcggcttg ttgttgtcg 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 8
ttatcgctca tttcctacgg 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 9
tgcagtggcc gctccctg 18
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 10
cctatggcag cgtat 15
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 11
tcctggaggt ctgatt 16
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 12
accggccaga ttgtt 15
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 13
aatagcgtca taactagaac tg 22
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 14
acaccctcaa agtctcact 19
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 15
ctctactgtc tcagtttac 19
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 16
tactgaattt cgccgccaca g 21
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 17
gcagcaggca agccaaggt 19
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 18
cgagcagcca gcgcctc 17
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 19
aatggtaatg ctcctccc 18
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 20
ggtgtcccac agtgtcctc 19
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 21
tctcagcgtg tgacac 16
<210> 22
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 22
ggggagcctc caatt 15
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 23
tcgccctact cctatttc 18
<210> 24
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 24
ccaacttgga gtcct 15
<210> 25
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 25
gttctccaag ccagtg 16
<210> 26
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 26
aaacatgaac agccatc 17
<210> 27
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 27
tccaagagcc tgtt 14

Claims (10)

1.一种用于前列腺癌早期诊断的外泌体源性基因mRNA标志物组，其特征在于，所述标志物组包括：
外泌体源性TXK基因mRNA、外泌体源性ATM基因mRNA、外泌体源性MAX基因mRNA、外泌体源性STK4基因mRNA、外泌体源性GRK5基因mRNA、外泌体源性PDGFA基因mRNA、外泌体源性IL32基因mRNA、外泌体源性RASSF5基因mRNA和外泌体源性TOX4基因mRNA。
2.根据权利要求1所述的标志物组，其特征在于，所述外泌体源性TXK基因mRNA选自TXK基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子13、外显子14或外显子15；
所述外泌体源性ATM基因mRNA选自ATM基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子61、外显子62或外显子63；
所述外泌体源性MAX基因mRNA选自MAX基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5或外显子6；
所述外泌体源性STK4基因mRNA选自STK4基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子9、外显子10或外显子11；
所述外泌体源性GRK5基因mRNA选自GRK5基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子14、外显子15或外显子16；
所述外泌体源性PDGFA基因mRNA选自PDGFA基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子5、外显子6或外显子7；
所述外泌体源性IL32基因mRNA选自IL32基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子5、外显子6或外显子7；
所述外泌体源性RASSF5基因mRNA选自RASSF3基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5或外显子6；
所述外泌体源性TOX4基因mRNA选自TOX4基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子8、外显子9或外显子10。
3.根据权利要求1或2所述的标志物组，其特征在于，所述外泌体为血液、血浆或血清外泌体。
4.权利要求1~3任一项所述标志物组的检测试剂在制备前列腺癌的诊断试剂或试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测试剂包括外泌体提取试剂、核酸提取试剂、核酸反转录试剂和针对所述标志物组的Ct值检测试剂；
优选地，所述Ct值检测试剂包括上游引物、下游引物和检测探针，所述检测探针的5’端标记荧光基团（可选地，FAM荧光基团），3’端标记MGB修饰基团；
优选地，所述Ct值检测试剂还包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、阴性对照品和阳性对照品中的一种或多种；更优选地，其中，所述阴性对照品为RNase-free和DNase-free的纯水，所述阳性对照品为人源RWPE1细胞系总RNA。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述外泌体源性TXK基因mRNA的Ct值检测试剂包括：上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；下游引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示；检测探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述外泌体源性ATM基因mRNA的Ct值检测试剂包括：上游引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示；下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；检测探针，其核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示；
所述外泌体源性MAX基因mRNA的Ct值检测试剂包括：上游引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO：7所示；下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；检测探针，其核苷酸序列如SEQ IDNO：9所示；
所述外泌体源性STK4基因mRNA的Ct值检测试剂包括：上游引物，其核苷酸序列如SEQID NO：10所示；下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；检测探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；
所述外泌体源性GRK5基因mRNA的Ct值检测试剂包括：上游引物，其核苷酸序列如SEQID NO：13所示；下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；检测探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示；
所述外泌体源性PDGFA基因mRNA的Ct值检测试剂包括：上游引物，其核苷酸序列如SEQID NO：16所示；下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示；检测探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示；
所述外泌体源性IL32基因mRNA的Ct值检测试剂包括：上游引物，其核苷酸序列如SEQID NO：19所示；下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示；检测探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示；
所述外泌体源性RASSF5基因mRNA的Ct值检测试剂包括：上游引物，其核苷酸序列如SEQID NO：22所示；下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示；检测探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示；
和所述外泌体源性TOX4基因mRNA的Ct值检测试剂包括：上游引物，其核苷酸序列如SEQID NO：25所示；下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示；检测探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示。
7.根据权利要求4~6任一项所述应用制备得到的前列腺癌的诊断试剂或试剂盒。
8.一种前列腺癌的早期诊断系统，其特征在于，所述系统包括信息获取模块、计算模块和诊断模块；
其中，所述信息获取模块用于执行获取受试者检测信息的操作，所述检测信息包括权利要求1所述标志物组的Ct值信息；
所述计算模块用于执行将所述标志物组的Ct值信息代入基于标志物组的Ct值建立的诊断模型，计算SUMCT值的操作；
所述诊断模块用于执行根据所述SUMCT值判断所述受试者的健康状况的操作，如果所述受试者的所述SUMCT值小于第一预定值，则判断所述受试者为非前列腺癌，如果所述受试者的所述SUMCT值在第一预定值~第二预定值范围内，则判断所述受试者为前列腺癌；
优选地，所述第一预定值为-230，所述第二预定值为-130；
优选地，所述诊断模型的计算公式如下所示：
SUMCT=k1×TXKCt－k2×ATMCt－k3×MAXCt－k4×STK4Ct＋k5×GRK5Ct－k6×PDGFACt－k7×IL32Ct－k8×RASSF5Ct－k9×TOX4Ct;
其中，基因系数k1取0.1~0.4，k2取0.1~0.4，k3取0.2~0.6，k4取0.1~0.5，k5取0.3~1，k6取0.3~1，k7取0.2~0.6，k8取0.6~1.5，k9取4.5~6.5;
TXKCt、ATMCt、MAXCt、STK4Ct、GRK5Ct、PDGFACt、IL32Ct、RASSF5Ct、TOX4Ct分别表示：基因TXK、ATM、MAX、STK4、GRK5、PDGFA、IL32、RASSF5、TOX4的外泌体mRNA的Ct值；
更优选地，所述计算公式如下所示：SUMCT=0.1×TXKCt－0.1×ATMCt－0.2×MAXCt－0.1×STK4Ct＋0.3×GRK5Ct－0.3×PDGFACt－0.2×IL32Ct－0.6-×RASSF5Ct－4.5×TOX4Ct。
9.根据权利要求8所述的所述诊断系统，其特征在于，所述诊断系统还包括检测模块，所述检测模块用于执行权利要求1~3任一项所述标志物组的Ct值信息的检测；
所述诊断系统还包括结果显示模块，所述结果显示模块用于显示所述诊断模块得出的诊断结论，优选的，所述结果显示模块通过屏幕显示、声音播报或打印的方式显示诊断结果。
10.根据权利要求8或9所述的诊断系统，其特征在于，所述诊断系统还包括预判模块，所述预判模块用于获取PSA检测结果（可选地，血清PSA检测结果），并判断所述PSA检测结果与阈值之间的关系，根据判断结果决定是否启动所述信息获取模块、计算模块、诊断模块和/或检测模块；优选地，如果低于所述阈值，则启动所述信息获取模块、计算模块、诊断模块和/或检测模块，或者则不启动所述信息获取模块、计算模块、诊断模块和/或检测模块；更优选地，所述阈值为50ng PSA/mL样本。
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