CN110923328A - 一种筛查前列腺癌的试剂盒及方法 - Google Patents

一种筛查前列腺癌的试剂盒及方法 Download PDF

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CN110923328A CN202010007400.0A CN202010007400A CN110923328A CN 110923328 A CN110923328 A CN 110923328A CN 202010007400 A CN202010007400 A CN 202010007400A CN 110923328 A CN110923328 A CN 110923328A
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，提供一种筛查前列腺癌的试剂盒及方法，用于解决前列腺癌的风险评估问题。本发明提供的一种筛查前列腺癌的试剂盒，包括：ERG引物及其探针、SPDF引物及其探针、MAX引物及其探针、IL32引物及其探针、PDGFA引物及其探针；内对照为SPK引物及其探针。采用无创手段收集标本，可以实时动态检测，检测准确率高。

Description

一种筛查前列腺癌的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种筛查前列腺癌的试剂盒及方法。
背景技术
现有的前列腺癌筛查方式包括蛋白标志物检测、DNA标志物检测、RNA标志物检测、基于miRNA的生物标志物检测等方式。
蛋白标志物检测：PSA具有组织特异性，只存在于人前列腺腺泡及导管上皮细胞胞浆中，不表达于其它细胞。但它并无肿瘤特异性，前列腺炎、良性前列腺增生和前列腺癌均可导致总PSA水平（游离PSA加复合PSA）升高。虽然PSA是最常用的检测前列腺癌的手段，但良性前列腺增生和前列腺炎也会出现PSA阳性的结果。血清前列腺特异抗原（PSA）正常值一般<4ng/mL，当前列腺癌发生时PSA>10ng/mL，具有辅助临床诊断的显著意义。
DNA标志物检测：GSTP1基因的表观遗传沉默是目前最常见 (>90%) 的基因改变，除了高级别前列腺上皮肉瘤变的患者，GSTP1甲基化还可见于活检阴性或可疑的患者，需进一步随访以证实这些病例是假阳性还是活检诊断不足的前列腺癌患者。
RNA生物标志物：PCA3是唯一一个获得美国食品药品管理局 (FDA) 批准的前列腺癌生物标志物。PCA3基因编码的一种非编码RNA在95%的原发性前列腺癌标本中过表达, 具有成为前列腺穿刺活检替代手段的潜在价值, 并可用于辅助判断是否需对血清PSA水平较高且历史活检阴性的男性再次行前列腺活检。
基于miRNA的生物标志物：miR-141、miR-138、miR-96等标志物一些低分化来源、不确定的肿瘤可根据miRNAs的表达进行分类，且miRNA非常稳定，在活检、血清以及尿液等其他体液中均可检测到。
传统的蛋白标志物，无肿瘤特异性，在前列腺炎等疾病中有显著升高，其升高也会导致前列腺癌过度的诊断和治疗；分子标志物：如GSTP1基因甲基化、PCA3基因过度表达等，PCA3检测的特异性和灵敏度不理想，分别为33.6%和90% ，GSTP1甲基化检测在国内做得并不是特别好，依赖技术的人员的实验技能，无法做到大幅度推广；miRNA标志物检测只可以用于检测一下低分化来源的，不确定肿瘤的患者可以用该种方法进行检测。
发明内容
本发明解决的技术问题为前列腺癌的风险评估问题，提供一种筛查前列腺癌的试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
一种筛查前列腺癌的试剂盒，包括：ERG引物及其探针、SPDF引物及其探针、MAX引物及其探针、IL32引物及其探针、PDGFA引物及其探针；内对照为SPK引物及其探针。
多标志物联合使用，使结果更加精准，引入外泌体内参，保证整个实验的准确性。
充分提高了筛查结果的准确性。
优选地，所述ERG引物及其探针为：
上游引物ERG-F GCGTCCTCAGTTAGATCCTTATCAG
下游引物ERG-R CTGGCCACTGCCTGGATT
探针：
Probe1 FAM-CTTGGACCA/ZEN/ACAAGTAGCCGCCTTGC-BHQ1
优选地，所述SPDEF引物及其探针为：
上游引物SPDEF-F CCACCTGGACATCTGGAAG
下游引物SPDEF-R CTGGCCACTGCCTGGATT
探针：Probe2 VIC-CGGCCTGGA/ZEN/TGAAAGAGCG -BHQ1
优选地，所述MAX引物及其探针为：
上游引物MAX-F AAGGGATGAGACTATGTG
下游引物MAX-R GGAGATAATGTTGAGTGC
探针：Probe3 CY5-CCTAACATCCACAGAGACATTGCTTG-BHQ2
优选地，所述IL32引物及其探针为：
上游引物IL32-F CTCTCTCGGGTAAGTCTC
下游引物IL32-R CCTGGCACAAATACTCAG
探针：Probe4 FAM-TCTCTGTCTGTCTCTGTCTCTGTCT-BHQ1
优选地，所述PDGFA引物及其探针为：
上游引物PDGFA -F TTGGGTAAAGATTTGTGATTA
下游引物PDGFA -R TCCTGTGGTTAGATTAGAC
探针：Probe5 CY5-CAAGAAGCATCCAACCTGAGCC-BHQ2。
优选地，所述SPK引物及其探针为：
上游引物SPK-F CCTTGAACCATTATGCTG
下游引物SPK-R CCGATACTTCTCACTCTC
探针：Probe6 VIC-ACCAATGAAGACCTCCTGACCAA-BHQ1。采用该内参引物及其探针，可以进一步提高筛查的准确性。
一种筛查前列腺癌的方法，包括：
S10.提取尿液样品的外泌体；
S20.提取外泌体的RNA，得到外泌体的mRNA；
S30.对mRNA进行RT-PCR，得到cDNA；
S40.对cDNA进行qPCR，采用权利要求1~3中任一项所述的试剂盒；
S50.获取SPK基因的及ERG、SPDEF、MAX、IL32、PDGFA的CT值，若SPK基因的CT值＜36，且其余5种基因中任一种基因的CT值＜36，则前列腺癌风险高。
优选地，所述提取尿液样品的外泌体的方法为：
S11.将样品在室温下2800~3200g离心10~20min；
S12.取上清液15~25ml，加入3~5ml外泌体提取试剂，充分混匀，4℃放置12~24h，得到混合液；
S13.将混合液在4℃下6000~8000g离心20~40min；
S14.去除上清液，残留物在4℃下6000~8000g离心3~7min，彻底去除上清液，得到的沉淀即为外泌体。
优选地，所述提取外泌体的RNA，得到外泌体的mRNA的方法为：
S201.在外泌体中加入1ml TRAzol，吹打数次后，将溶液转移至离心管；
S202.15~30℃下放置3~10min，至外泌体完全裂解；
S203.加入150~250μL氯仿，剧烈震荡10~20s，室温放置1~5min；
S204.放置结束后在4℃下以10000~15000rpm离心8~15min至样品分层，取水相，转移到另一离心管中；
S205.向水相中加入0.2~1倍量的无水乙醇，混匀后将溶液转入纯化柱，4℃下10000~15000rpm离心10~60s；
S206.向纯化柱中加入300~600μL的溶液RPI，4℃下10000~15000rpm离心10~60s；
S207.向纯化柱中加入300~600μL的溶液RW，室温静置1~5min，4℃下10000~15000rpm离心10~60s；
S208.再向纯化柱中加入300~600μL的溶液RW，室温静置1~5min，4℃下10000~15000rpm离心10~60s；
S209.将纯化柱转移到收集管中，4℃下10000~15000rpm离心10~60s；
S210.将纯化柱转移到新的离心管中，打开纯化柱管盖，在通风橱内放置3~10min，晾干；
S211.向纯化柱内加入50~100μL RNase-free ddH2O，室温放置1~5min，℃下10000~15000rpm离心1~5min，获取到mRNA。
优选地，所述对mRNA进行RT-PCR包括：
S31.取4 x gDNA wiper Mix 1~3μL，mRNA 1pg~1μg，加入RNase free ddH2O至体系为8Μl，混匀，去除气泡，放置于40~45℃下1~5min后，迅速至于冰上冷却，得到反应液；
S32.向反应液中加入5 x HiScript II qRT SuperMix1~3μL，混匀后去除气泡；
S33.进行逆转录，所述逆转录过程包括：45~55℃下，10~20min；80~90℃下1~10s，反应结束后冰上冷却3~10min，得到cDNA。
优选地，所述qPCR包括：
S41.取PCR mix20~30μL，5~15μM第一引物混合物3~6μL，5~15μM第一探针混合物0.3~3μL，NF水9~12μL，混匀得到第一反应液；取取PCR mix20~30μL，5~15μM第二引物混合物3~6μL，5~15μM第二探针混合物0.3~3μL，NF水9~12μL，混匀得到第二反应液；所述第一引物混合物包括ERG引物1~2μL、SPDEF引物1~2μL、MAX引物1~2μL，所述第一探针混合物包括ERG探针0.1~1μL、SPDEF探针0.1~1μL、MAX探针0.1~1μL的探针；所述第二引物混合物包括IL32引物1~2μL、PDGFA引物1~2μL、SPK引物1~2μL，所述第二探针混合物包括IL32探针0.1~1μL、PDGFA探针0.1~1μL、SPK探针0.1~1μL的探针
S42.将第一反应液、第二反应液注入不同的反应孔中，分别向第一、第二反应液中加入cDNA5~10μL，混匀；
S43.控制PCR条件为：在90~95℃下保持2~5min；再90~95℃3~10s，50~60℃10~20s，70~75℃20~40s，循环35~45次。
优选地，所述尿液样品为晨尿样品。晨尿样品可以进一步提高筛查结果的准确性。
优选地，所述提取外泌体RNA的方法还包括：
S212.离心后将收集管内的水溶液重新转入纯化柱中，室温放置1~5min，4℃下10000~15000rpm离心1~5min，得到mRNA。以提高RNA得率。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：采用无创手段收集标本，可以实时动态检测；多标志物联合使用，使结果更加精准；引入外泌体内参，保证整个实验的准确性；能够达到有效的不漏诊GS>7分的前列腺癌患者。
具体实施方式
以下实施列是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1
一种筛查前列腺癌的试剂盒，
所述ERG引物及其探针为：
上游引物ERG-F GCGTCCTCAGTTAGATCCTTATCAG
下游引物ERG-R CTGGCCACTGCCTGGATT
探针：
Probe1 FAM-CTTGGACCA/ZEN/ACAAGTAGCCGCCTTGC-BHQ1
所述SPDEF引物及其探针为：
上游引物SPDEF-F CCACCTGGACATCTGGAAG
下游引物SPDEF-R CTGGCCACTGCCTGGATT
探针：Probe2 VIC-CGGCCTGGA/ZEN/TGAAAGAGCG -BHQ1
所述MAX引物及其探针为：
上游引物MAX-F AAGGGATGAGACTATGTG
下游引物MAX-R GGAGATAATGTTGAGTGC
探针：Probe3 CY5-CCTAACATCCACAGAGACATTGCTTG-BHQ2
所述IL32引物及其探针为：
上游引物IL32-F CTCTCTCGGGTAAGTCTC
下游引物IL32-R CCTGGCACAAATACTCAG
探针：Probe4 FAM-TCTCTGTCTGTCTCTGTCTCTGTCT-BHQ1
所述PDGFA引物及其探针为：
上游引物PDGFA -F TTGGGTAAAGATTTGTGATTA
下游引物PDGFA -R TCCTGTGGTTAGATTAGAC
探针：Probe5 CY5-CAAGAAGCATCCAACCTGAGCC-BHQ2。所述SPK引物及其探针为：
上游引物SPK-F CCTTGAACCATTATGCTG
下游引物SPK-R CCGATACTTCTCACTCTC
探针：Probe6 VIC-ACCAATGAAGACCTCCTGACCAA-BHQ1。
多标志物联合使用，使结果更加精准，引入外泌体内参，保证整个实验的准确性。充分提高了筛查结果的准确性。以提高RNA得率。
实施例2
一种筛查前列腺癌的试剂盒， 包括：ERG引物及其探针、SPDF引物及其探针、MAX引物及其探针、IL32引物及其探针、PDGFA引物及其探针；内对照为SPK引物及其探针。所述SPK引物及其探针为：
上游引物SPK-F CCTTGAACCATTATGCTG
下游引物SPK-R CCGATACTTCTCACTCTC
探针：Probe6 VIC-ACCAATGAAGACCTCCTGACCAA-BHQ1。
实施例3
一种筛查前列腺癌的试剂盒， 包括：ERG引物及其探针、SPDF引物及其探针、MAX引物及其探针、IL32引物及其探针、PDGFA引物及其探针；内对照为SPK引物及其探针。
实施例4
一种筛查前列腺癌的方法，包括：
S11.将样品在室温下3000g离心15min；
S12.取上清液20ml，加入4ml外泌体提取试剂，充分混匀，4℃放置16h(过夜)，得到混合液；
S13.将混合液在4℃下7000g离心30min；
S14.去除上清液，残留物在4℃下7000g离心5min，彻底去除上清液，得到的沉淀即为外泌体。
S201.在外泌体中加入1ml TRAzol，吹打数次后，将溶液转移至离心管；
S202.15~30℃下放置5min，至外泌体完全裂解；
S203.加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min；
S204.放置结束后在4℃下以12000rpm离心10min至样品分层，取水相，转移到另一离心管中；
S205.向水相中加入0.5倍量的无水乙醇，混匀后将溶液转入纯化柱，4℃下12000rpm离心30s；
S206.向纯化柱中加入500μL的溶液RPI，4℃下12000rpm离心30s；
S207.向纯化柱中加入500μL的溶液RW，室温静置2min，4℃下12000rpm离心30s；
S208.再向纯化柱中加入500μL的溶液RW，室温静置2min，4℃下12000rpm离心30s；
S209.将纯化柱转移到收集管中，4℃下12000rpm离心30s；
S210.将纯化柱转移到新的离心管中，打开纯化柱管盖，在通风橱内放置5min，晾干；
S211.向纯化柱内加入80μL RNase-free ddH2O，室温放置2min，℃下12000rpm离心2min；
S212.离心后将收集管内的水溶液重新转入纯化柱中，室温放置2min，4℃下12000rpm离心2min，得到mRNA。
S31.取4 x gDNA wiper Mix 2μL，mRNA 1pg~1μg，加入RNase free ddH2O至体系为8mL，混匀，去除气泡，放置于42℃下2min后，迅速至于冰上冷却，得到反应液；
S32.向反应液中加入5 x HiScript II qRT SuperMix2μL，混匀后去除气泡；
S33.进行逆转录，所述逆转录过程包括：50℃下，15min；85℃下5s，反应结束后冰上冷却5min，得到cDNA。
S41.取PCR mix25μL，10μM第一引物混合物4.8μL，10μM第一探针混合物1.5μL，NF水10.7μL，混匀得到第一反应液；取取PCR mix25μL，10μM第二引物混合物4.7μL，10μM第二探针混合物1.5μL，NF水10.6μL，混匀得到第二反应液；所述第一引物混合物包括ERG引物1.5μL、SPDEF引物1.5μL、MAX引物1.8μL，所述第一探针混合物包括ERG探针0.5μL、SPDEF探针0.5μL、MAX探针0.5μL的探针；所述第二引物混合物包括IL32引物1.6μL、PDGFA引物1.5μL、SPK引物1.6μL，所述第二探针混合物包括IL32探针0.5μL、PDGFA探针0.5μL、SPK探针0.5μL的探针
S42.将第一反应液、第二反应液注入不同的反应孔中，分别向第一、第二反应液中加入cDNA8μL，混匀；
S43.控制PCR条件为：在94℃下保持3min；再94℃5s，59℃15s，72℃30s，循环40次。所述尿液样品为晨尿样品。
S50.获取SPK基因的及ERG、SPDEF、MAX、IL32、PDGFA的CT值，若SPK基因的CT值＜36，且其余5种基因中任一种基因的CT值＜36，则前列腺癌风险高。
应用本实施例的方法和实施例1中的试剂盒，征集了多名志愿者，发现前列腺癌风险高的志愿者，后期前列腺癌发病的概率也高，能够达到有效的不漏诊GS>7分的前列腺癌患者。
实施例1中除了引物和探针，当然包括癌症筛查试剂盒的其他必备药剂。
实施例5
一种筛查前列腺癌的方法，包括：
S11.将样品在室温下2800g离心10min；
S12.取上清液15ml，加入3ml外泌体提取试剂，充分混匀，4℃放置12h，得到混合液；
S13.将混合液在4℃下6000g离心20min；
S14.去除上清液，残留物在4℃下6000g离心3min，彻底去除上清液，得到的沉淀即为外泌体。
S201.在外泌体中加入1ml TRAzol，吹打数次后，将溶液转移至离心管；
S202.15~30℃下放置3min，至外泌体完全裂解；
S203.加入150μL氯仿，剧烈震荡10s，室温放置1min；
S204.放置结束后在4℃下以10000rpm离心8min至样品分层，取水相，转移到另一离心管中；
S205.向水相中加入0.2倍量的无水乙醇，混匀后将溶液转入纯化柱，4℃下10000rpm离心10s；
S206.向纯化柱中加入300μL的溶液RPI，4℃下10000rpm离心10s；
S207.向纯化柱中加入300μL的溶液RW，室温静置1min，4℃下10000rpm离心10s；
S208.再向纯化柱中加入300μL的溶液RW，室温静置1min，4℃下10000rpm离心10s；
S209.将纯化柱转移到收集管中，4℃下10000rpm离心10s；
S210.将纯化柱转移到新的离心管中，打开纯化柱管盖，在通风橱内放置3min，晾干；
S211.向纯化柱内加入50μL RNase-free ddH2O，室温放置1min，℃下10000rpm离心1min；
S212.离心后将收集管内的水溶液重新转入纯化柱中，室温放置1min，4℃下10000rpm离心1min，得到mRNA。
S31.取4 x gDNA wiper Mix 1μL，mRNA 1pg~1μg，加入RNase free ddH2O至体系为8Μl，混匀，去除气泡，放置于40℃下1min后，迅速至于冰上冷却，得到反应液；
S32.向反应液中加入5 x HiScript II qRT SuperMix2μL，混匀后去除气泡；
S33.进行逆转录，所述逆转录过程包括：45℃下，10min；80℃下1s，反应结束后冰上冷却3min，得到cDNA。
S41.取PCR mix20μL，5μM第一引物混合物3μL，5μM第一探针混合物0.3μL，NF水18.7μL，混匀得到第一反应液；取取PCR mix20μL，5μM第二引物混合物3μL，5μM第二探针混合物0.3μL，NF水18.7μL，混匀得到第二反应液；所述第一引物混合物包括ERG引物1μL、SPDEF引物1μL、MAX引物1μL，所述第一探针混合物包括ERG探针0.1μL、SPDEF探针0.1μL、MAX探针0.1μL的探针；所述第二引物混合物包括IL32引物1μL、PDGFA引物1μL、SPK引物1μL，所述第二探针混合物包括IL32探针0.1μL、PDGFA探针0.1μL、SPK探针0.1μL的探针
S42.将第一反应液、第二反应液注入不同的反应孔中，分别向第一、第二反应液中加入cDNA8μL，混匀；
S43.控制PCR条件为：在90℃下保持2min；再90~95℃3s，50℃10s，70℃20s，循环35次。所述尿液样品为晨尿样品。
S50.获取SPK基因的及ERG、SPDEF、MAX、IL32、PDGFA的CT值，若SPK基因的CT值＜36，且其余5种基因中任一种基因的CT值＜36，则前列腺癌风险高。
实施例6
一种筛查前列腺癌的方法，包括：
S11.将样品在室温下3200g离心20min；
S12.取上清液25ml，加入5ml外泌体提取试剂，充分混匀，4℃放置24h，得到混合液；
S13.将混合液在4℃下8000g离心40min；
S14.去除上清液，残留物在4℃下8000g离心7min，彻底去除上清液，得到的沉淀即为外泌体。
S201.在外泌体中加入1ml TRAzol，吹打数次后，将溶液转移至离心管；
S202.15~30℃下放置10min，至外泌体完全裂解；
S203.加入250μL氯仿，剧烈震荡20s，室温放置5min；
S204.放置结束后在4℃下以15000rpm离心15min至样品分层，取水相，转移到另一离心管中；
S205.向水相中加入1倍量的无水乙醇，混匀后将溶液转入纯化柱，4℃下15000rpm离心60s；
S206.向纯化柱中加入600μL的溶液RPI，4℃下15000rpm离心60s；
S207.向纯化柱中加入600μL的溶液RW，室温静置5min，4℃下15000rpm离心60s；
S208.再向纯化柱中加入600μL的溶液RW，室温静置5min，4℃下15000rpm离心60s；
S209.将纯化柱转移到收集管中，4℃下15000rpm离心60s；
S210.将纯化柱转移到新的离心管中，打开纯化柱管盖，在通风橱内放置10min，晾干；
S211.向纯化柱内加入100μL RNase-free ddH2O，室温放置5min，℃下15000rpm离心5min；
S212.离心后将收集管内的水溶液重新转入纯化柱中，室温放置5min，4℃下15000rpm离心5min，得到mRNA。
S31.取4 x gDNA wiper Mix 3μL，mRNA 1pg~1μg，加入RNase free ddH2O至体系为8Μl，混匀，去除气泡，放置于45℃下5min后，迅速至于冰上冷却，得到反应液；
S32.向反应液中加入5 x HiScript II qRT SuperMix2μL，混匀后去除气泡；
S33.进行逆转录，所述逆转录过程包括：55℃下，20min；90℃下10s，反应结束后冰上冷却10min，得到cDNA。
S41.取PCR mix30μL，15μM第一引物混合物6μL，15μM第一探针混合物3μL，NF水3μL，混匀得到第一反应液；取取PCR mix30μL，15μM第二引物混合物6μL，15μM第二探针混合物3μL，NF水3μL，混匀得到第二反应液；所述第一引物混合物包括ERG引物2μL、SPDEF引物2μL、MAX引物2μL，所述第一探针混合物包括ERG探针1μL、SPDEF探针1μL、MAX探针1μL的探针；所述第二引物混合物包括IL32引物2μL、PDGFA引物2μL、SPK引物2μL，所述第二探针混合物包括IL32探针1μL、PDGFA探针1μL、SPK探针1μL的探针
S42.将第一反应液、第二反应液注入不同的反应孔中，分别向第一、第二反应液中加入cDNA8μL，混匀；
S43.控制PCR条件为：在95℃下保持5min；再95℃10s，60℃20s，75℃40s，循环45次。所述尿液样品为晨尿样品。
S50.获取SPK基因的及ERG、SPDEF、MAX、IL32、PDGFA的CT值，若SPK基因的CT值＜36，且其余5种基因中任一种基因的CT值＜36，则前列腺癌风险高。
上列详细说明是针对本发明可行实施例的具体说明，以上实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。
序列表
<110> 广州中鑫医学检验科技有限公司
<120> 一种筛查前列腺癌的试剂盒及方法
<130> 20191224
<141> 2019-12-31
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成(ERG-F)
<400> 1
gcgtcctcag ttagatcctt atcag 25
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(ERG-R)
<400> 2
ctggccactg cctggatt 18
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成(Probe1)
<400> 3
cttggaccaa caagtagccg ccttgc 26
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(SPDEF-F)
<400> 4
ccacctggac atctggaag 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(SPDEF-R)
<400> 5
ctggccactg cctggatt 18
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Probe2)
<400> 6
cggcctggat gaaagagcg 19
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(MAX-F)
<400> 7
aagggatgag actatgtg 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(MAX-R)
<400> 8
ggagataatg ttgagtgc 18
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成(Probe3)
<400> 9
cctaacatcc acagagacat tgcttg 26
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(IL32-F)
<400> 10
ctctctcggg taagtctc 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(IL32-R)
<400> 11
cctggcacaa atactcag 18
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成(Probe4)
<400> 12
tctctgtctg tctctgtctc tgtct 25
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(PDGFA-F)
<400> 13
ttgggtaaag atttgtgatt a 21
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(PDGFA-R)
<400> 14
tcctgtggtt agattagac 19
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(Probe5)
<400> 15
caagaagcat ccaacctgag cc 22
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(SPK-F)
<400> 16
ccttgaacca ttatgctg 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(SPK-R)
<400> 17
ccgatacttc tcactctc 18
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(Probe6)
<400> 18
accaatgaag acctcctgac caa 23

Claims (10)

1.一种筛查前列腺癌的试剂盒，其特征在于，包括：ERG引物及其探针、SPDF引物及其探针、MAX引物及其探针、IL32引物及其探针、PDGFA引物及其探针；内对照为SPK引物及其探针。
2.根据权利要求1所述的一种筛查前列腺癌的试剂盒，其特征在于，所述ERG引物及其探针为：
上游引物ERG-F GCGTCCTCAGTTAGATCCTTATCAG
下游引物ERG-R CTGGCCACTGCCTGGATT
探针：
Probe1 FAM-CTTGGACCA/ZEN/ACAAGTAGCCGCCTTGC-BHQ1。
3.根据权利要求1所述的一种筛查前列腺癌的试剂盒，其特征在于，所述SPDEF引物及其探针为：
上游引物SPDEF-F CCACCTGGACATCTGGAAG
下游引物SPDEF-R CTGGCCACTGCCTGGATT
探针：Probe2 VIC-CGGCCTGGA/ZEN/TGAAAGAGCG -BHQ1。
4.根据权利要求1所述的一种筛查前列腺癌的试剂盒，其特征在于，所述MAX引物及其探针为：
上游引物MAX-F AAGGGATGAGACTATGTG
下游引物MAX-R GGAGATAATGTTGAGTGC
探针：Probe3 CY5-CCTAACATCCACAGAGACATTGCTTG-BHQ2。
5.根据权利要求1所述的一种筛查前列腺癌的试剂盒，其特征在于，所述IL32引物及其探针为：
上游引物IL32-F CTCTCTCGGGTAAGTCTC
下游引物IL32-R CCTGGCACAAATACTCAG
探针：Probe4 FAM-TCTCTGTCTGTCTCTGTCTCTGTCT-BHQ1。
6.根据权利要求1所述的一种筛查前列腺癌的试剂盒，其特征在于，所述PDGFA引物及其探针为：
上游引物PDGFA -F TTGGGTAAAGATTTGTGATTA
下游引物PDGFA -R TCCTGTGGTTAGATTAGAC
探针：Probe5 CY5-CAAGAAGCATCCAACCTGAGCC-BHQ2。
7.根据权利要求1所述的一种筛查前列腺癌的试剂盒，其特征在于，所述SPK引物及其探针为：
上游引物SPK-F CCTTGAACCATTATGCTG
下游引物SPK-R CCGATACTTCTCACTCTC
探针：Probe6 VIC-ACCAATGAAGACCTCCTGACCAA-BHQ1。
8.一种筛查前列腺癌的方法，其特征在于，
S10.提取尿液样品的外泌体；
S20.提取外泌体的RNA，得到外泌体的mRNA；
S30.对mRNA进行RT-PCR，得到cDNA；
S40.对cDNA进行qPCR，采用权利要求1~3中任一项所述的试剂盒；
S50.获取SPK基因的及ERG、SPDEF、MAX、IL32、PDGFA的CT值，若SPK基因的CT值＜36，且其余5种基因中任一种基因的CT值＜36，则前列腺癌风险高。
9.根据权利要求8所述的一种筛查前列腺癌的方法，其特征在于，所述提取尿液样品的外泌体的方法为：
S11.将样品在室温下2800~3200g离心10~20min；
S12.取上清液15~25ml，加入3~5ml外泌体提取试剂，充分混匀，4℃放置12~24h，得到混合液；
S13.将混合液在4℃下6000~8000g离心20~40min；
S14.去除上清液，残留物在4℃下6000~8000g离心3~7min，彻底去除上清液，得到的沉淀即为外泌体。
10.根据权利要求8所述的一种筛查前列腺癌的方法，其特征在于，所述qPCR包括：
S41.取PCR mix20~30μL，5~15μM第一引物混合物3~6μL，5~15μM第一探针混合物0.3~3μL，NF水9~12μL，混匀得到第一反应液；取取PCR mix20~30μL，5~15μM第二引物混合物3~6μL，5~15μM第二探针混合物0.3~3μL，NF水9~12μL，混匀得到第二反应液；所述第一引物混合物包括ERG引物1~2μL、SPDEF引物1~2μL、MAX引物1~2μL，所述第一探针混合物包括ERG探针0.1~1μL、SPDEF探针0.1~1μL、MAX探针0.1~1μL的探针；所述第二引物混合物包括IL32引物1~2μL、PDGFA引物1~2μL、SPK引物1~2μL，所述第二探针混合物包括IL32探针0.1~1μL、PDGFA探针0.1~1μL、SPK探针0.1~1μL的探针
S42.将第一反应液、第二反应液注入不同的反应孔中，分别向第一、第二反应液中加入cDNA5~10μL，混匀；
S43.控制PCR条件为：在90~95℃下保持2~5min；再90~95℃3~10s，50~60℃10~20s，70~75℃20~40s，循环35~45次。
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