RU2786386C1 - Тест-система "miR-M-SCREEN" для прогнозирования развития метастазов у больных колоректальным раком на основании уровня микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови - Google Patents
Тест-система "miR-M-SCREEN" для прогнозирования развития метастазов у больных колоректальным раком на основании уровня микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови Download PDFInfo
- Publication number
- RU2786386C1 RU2786386C1 RU2022101124A RU2022101124A RU2786386C1 RU 2786386 C1 RU2786386 C1 RU 2786386C1 RU 2022101124 A RU2022101124 A RU 2022101124A RU 2022101124 A RU2022101124 A RU 2022101124A RU 2786386 C1 RU2786386 C1 RU 2786386C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mir
- hsa
- seq
- test system
- metastases
- Prior art date
Links
- 206010027476 Metastasis Diseases 0.000 title claims abstract description 27
- 201000011231 colorectal cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 25
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 title claims abstract description 21
- 238000011161 development Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 229920001899 Mir-143 Polymers 0.000 title claims description 22
- 229920001239 microRNA Polymers 0.000 claims abstract description 38
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims abstract description 31
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 20
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 claims abstract description 19
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 claims abstract description 18
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000001402 polyadenylating Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 21
- 108020004388 MicroRNAs Proteins 0.000 claims description 20
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 3
- 101710027505 ywlE Proteins 0.000 claims description 3
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 claims description 2
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 claims description 2
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 claims description 2
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 claims description 2
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 claims description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 14
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 108020004417 Untranslated RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000009956 Adenocarcinoma Diseases 0.000 description 4
- 230000003187 abdominal Effects 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 201000002758 colorectal adenoma Diseases 0.000 description 4
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 229920001894 non-coding RNA Polymers 0.000 description 3
- 230000002980 postoperative Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 2
- 210000001072 Colon Anatomy 0.000 description 2
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 2
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 2
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N Diethylpyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N Guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 2
- 229920000320 RNA (poly(A)) Polymers 0.000 description 2
- 108020004412 RNA 3' Polyadenylation Signals Proteins 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 2
- 201000003825 sigmoid colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 2-[dodecanoyl(methyl)amino]acetic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035533 AUC Effects 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000565118 Cordylophora caspia Species 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 EC 2.7.7.49 Proteins 0.000 description 1
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N Isoamyl alcohol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 206010061529 Polyp Diseases 0.000 description 1
- 206010038038 Rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- BFDMCHRDSYTOLE-UHFFFAOYSA-N SC#N.NC(N)=N.ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 Chemical compound SC#N.NC(N)=N.ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 BFDMCHRDSYTOLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002151 Serous Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 1
- 230000000112 colonic Effects 0.000 description 1
- 238000002052 colonoscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000029578 entry into host Effects 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal Effects 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 1
- 210000001599 sigmoid colon Anatomy 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к молекулярной онкологии. Представлена тест-система. Тест-система содержит реагенты для получения кДНК на матрице тотальной РНК с помощью реакции обратной транскрипции, совмещенной с полиаденилированием, амплификации библиотеки кДНК в режиме реального времени. Тест-система содержит высокоспецифичные праймеры для hsa-miR-7-5p, hsa-miR-26a-5p и hsa-miR-143-3p. Обеспечивает получение первичных данных относительной экспрессии микро-РНК в плазме крови для расчёта прогностических коэффициентов КmiR-26a и КmiR-143, которые позволяют оценить вероятность течения заболевания с развитием отдаленных/регионарных метастазов или без. Тест-система обладает высокой чувствительностью и специфичностью, её использование возможно с плазмой крови. Тест-система позволяет осуществить малоинвазивную оценку вероятности развития метастазов у больных колоректальным раком, что дает возможность персонифицировать тактику лечения. 1 табл.
Description
Изобретение относится к молекулярной биологии, онкологии и биотехнологии, и может быть использовано для прогнозирования развития метастазов по уровню микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови у больных колоректальным раком.
Колоректальный рак (КРР) является гетерогенным многофакторным заболеванием, причем порядка 35% случаев обусловлено генетическими факторами, включая нестабильность генома, метилирование CpG-островков, мутации/полиморфизмы генов и изменения в экспрессии некодирующей РНК (см. M. Oines, L.M. Helsingen, M. Bretthauer, L. Emilsson. Epidemiology and risk factors of colorectal polyps. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 2017, 31, pp. 419-424; Tang X.J., Wang W., Hann S.S. Interactions among lncRNAs, miRNAs and mRNA in colorectal cancer. Biochimie. 2019;163:58-72).
Преобразование нормальной слизистой оболочки толстой кишки в аденокарциному происходит в несколько этапов, занимающих десятилетия (см. Tang XJ, Wang W, Hann SS. Interactions among lncRNAs, miRNAs and mRNA in colorectal cancer. Biochimie. 2019;163:58-72). Хотя многочисленные методы лечения, такие как хирургия, химиотерапия, лучевая терапия, таргетная терапия и иммунотерапия, показали способность уменьшать частоту рецидивов и улучшать выживаемость пациентов, 5-летняя выживаемость больных КРР все еще остается низкой (см. R.L. Siegel, K.D. Miller, A. Jemal. Cancer statistics. CA A Cancer J. Clin. 2019, 69, pp. 7-34; W. Wang, R. Kandimalla, H. Huang, L. Zhu, Y. Li, F. Gao, A. Goel, X. Wang Molecular subtyping of colorectal cancer: recent progress, new challenges and emerging opportunities. Semin. Canc. Biol., 2019, 55, pp. 37-52). Приблизительно у 60% больных КРР диагностируются локальные или отдаленные метастазы (IV стадия заболевания (см. Siegel R., Desantis C., Jemal A. Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J. Clin. 2014;64:104-117. doi: 10.3322/caac.21220). Эти факты подчеркивают необходимость поиска новых биомаркеров, которые могут быть использованы для ранней диагностики и прогнозировании течения этого заболевания. Большое количество исследований выявило, что нкРНК играют важную роль во многих биологических процессах, и нарушение их регуляции может привести к различным заболеваниям, включая рак толстой кишки (см. M. Weng, D. Wu, C. Yang, H. Peng, G. Wang, T. Wang, X. Li Noncoding RNAs in the development, diagnosis, and prognosis of colorectal cancer Transl. Res., 2017, 181, pp. 108-120). Хорошо изученными нкРНК являются микро-РНК.
Микро-РНК - это короткие некодирующие РНК, которые регулируют экспрессию генов катализируя разрушение мРНК, либо ингибируя трансляцию мРНК в белок. Зрелая микро-РНК представляет собой одноцепочечную РНК размером порядка 22 нуклеотидов, получающуюся из первичного транскрипта. Микро-РНК являются эпигенетическими регуляторами, специфичны для определенной ткани и модулируют экспрессию генов путем взаимодействия с комплементарными нуклеотидными последовательностями мРНК-мишеней (см. Димитриади Т.А., Бурцев Д.В., Дженкова Е.А., Кутилин Д.С. МикроРНК как маркеры прогрессирования предраковых заболеваний в рак шейки матки // Современные проблемы науки и образования. 2020. № 1.;URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=29529 (дата обращения: 04.03.2020)). МикроРНК вносят значительный вклад в инициацию и развитие различных молекулярных событий, включая инициацию онкогенеза, прогрессирование и метастазирование опухолей, что делает микро-РНК потенциальными биомаркерами для оценки прогрессирования и прогноза КРР (см. Z.M. Abdelsattar, S.L. Wong, S.E. Regenbogen, D.M. Jomaa, K.M. Hardiman, S. Hendren. Colorectal cancer outcomes and treatment patterns in patients too young for average-risk screening. Cancer, 2016, 122, pp. 929-934).
Результаты множественного параллельного секвенирования 160 образцов КРР, проведенного нами ранее (см. Новикова И.А., Тимошкина Н.Н., Кутилин Д.С. Дифференциальная экспрессия микроРНК в опухолевых и нормальных тканях толстой кишки. Якутский медицинский журнал. 2020, №4. С. 74-82), а также последующая валидация этих результатов методом РТ-ПЦР в образцах плазмы крови и математический анализ (для получения надежной диагностической модели использовали LASSO-пенализованную логистическую регрессию, оптимизированную при помощи множественных перевыборочных (bootstrap) наборов данных), показали большой потенциал пар микро-РНК hsa-miR-26a-5p/hsa-miR-143-3p в разделении больных КРР на группы без метастазов и группу с отдаленным/ регионарным метастазированием. При помощи такого сочетания микро-РНК достигалась чувствительность 95% и специфичность 90% (AUC 0,98).
Анализ патентных источников показал наличие только 1 близкого по тематике к нашему изобретения - «Определение микроРНК в плазме для обнаружения ранних стадий колоректального рака» (Заявка: 2015108970, 20.10.2012, Патент RU 2 662 975 C1, опубликовано: 31.07.2018 Бюл. № 22). Данный патент описывает способ обнаружения колоректальных аденом поздней стадии у человека, включающий этапы: измерения общего профиля или уровня экспрессии одной или нескольких микроРНК, полученных из одного или нескольких биологических образцов субъекта, где по меньшей мере одна из этих микроРНК является miR18a; и сравнение общего профиля экспрессии одной или нескольких микроРНК из биологического образца от субъекта с предполагаемыми колоректальными аденомами поздней стадии с общим профилем экспрессии одной или нескольких микроРНК из биологического образца из нормального субъекта, где нормальным субъектом является здоровый человек, не страдающий от колоректальных аденом поздней стадии, и где сверхэкспрессия miR18a свидетельствует о наличии колоректальных аденом поздней стадии.
Описанный способ использует схожие с нашим принципы, но направлен на раннюю диагностику и включает иной перечень биомаркеров микро-РНК.
Анализ патентных источников (www.fips.ru) также показал отсутствие действующих патентов и заявок на патент тест-системы для прогнозирования развития метастазов у больных колоректальным раком на основании уровня микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови.
Изобретение «Тест-система «miR-M-SCREEN» для прогнозирования развития метастазов у больных колоректальным раком на основании уровня микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови» является новым, так как относительная экспрессия данных микро-РНК ранее не использовалась для заявленной в тест-системе цели, также как последовательности праймеров в составе предлагаемой тест-системы.
Целью заявляемого изобретения является создание и внедрение новой, простой в исполнении, не дорогостоящей и точной тест-системы с уникальными высокоспецифичными последовательностями синтетических олигонуклеотидов для прогнозирования регионального и отдаленного метастазирования у пациентов с диагнозом рак толстой кишки.
Сущность тест-системы заключается в том, что используют библиотеку комплементарной ДНК (кДНК), полученную на матрице тотальной РНК с помощью реакции обратной транскрипции с RT-праймерами совмещённой с реакцией полиаденилирования РНК, проводят амплификацию библиотеки кДНК с высокоспецифичными праймерами для микро-РНК miR-26a , miR-143 и miR-7, анализируют первичные данные и вычисляют коэффициенты относительной экспрессии микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови (K) (соотношение относительной экспрессии miR-26a или miR-143 относительно miR-7), сравнивают полученные значения К с интервалом прогностического коэффициента, и при значении К miR-26a ≤2,56*10-3 и К miR-143 ≤10,02*10-3 прогнозируют развитие метастазов (чувствительность 95%), а при значении К miR-26a ≥3,89*10-3 и К miR-143 ≥17,11*10-3 прогнозируют течение заболевания без отдаленных и регионарных метастазов (чувствительность 95%). При значениях коэффициента K между указанными интервалами считают полученный результат неопределенным.
Заявленный анализ основан на определении относительной экспрессии miR-26a или miR-143 в плазме крови больных КРР и последующем вычислении соотношения экспрессии этих микро-РНК относительно референса (miR-7): К miR -26 a =E miR -26 a /E miR -7 или К miR-143 =E miR-143 /E miR-7 .
Заявленная тест-система включает следующие приёмы:
получение кДНК на матрице тотальной РНК с помощью реакции обратной транскрипции с RT-праймерами совмещённой с реакцией полиаденилирования РНК, амплификацию библиотеки кДНК с высокоспецифичными праймерами для микро-РНК miR-26a , miR-143 и miR-7, анализ первичных данных и вычисление коэффициентов относительной экспрессии микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови, сравнение их значений со значениями коэффициентов экспрессии, характерными для групп пациентов с течением заболевания с метастазами и без.
Заявленная тест-система, рассчитанная на 50 реакций, включает:
1.Смесь для ПЦР-РВ реакции (Mix_PCR) - 800 мкл, содержащую 1 мМ dNTPs, 6,6 мМ MgCl2, 4-х кратный ПЦР-буфер с 4-кратной концентрацией красителя EvaGreen Dye.
2. ДНК-полимеразу Thermus aquaticus 5ед/мкл (Taq) - 50 мкл
3. Смесь прямого и обратного праймеров с концентрацией 1500 нМ каждого для hsa-miR-26a-5p (miR26a_MixPCR) - 430 мкл
4. Смесь прямого и обратного праймеров с концентрацией 1500 нМ каждого для hsa-miR-143-3p (miR143_MixPCR) - 430 мкл
5. Смесь прямого и обратного праймеров с концентрацией 1500 нМ каждого для hsa-miR-7-5p (miR7_MixPCR) - 860 мкл
6. Контроль реакционной смеси (стандартная кДНК с концентрацией 2 нг/мкл) - 900 мкл
7. Смесь для реакции обратной транскрипции совмещенной с полиаденилированием РНК (PolyA-RT_Mix) - 1500 мкл, содержащую 2-кратный поли(А) буфер, 20 единиц/мкл M-MuLV, 0,2 мМ dNTPs , 2 мМ АТФ, 1 единицу/мкл Poly(A)-полимеразы.
8. RT-праймер для hsa-miR-7-5p 4 мкM (RT-R) - 300 мкл
9. RT-праймер для hsa-miR-143-3p 4 мкM (RT-143) - 300 мкл
10. RT-праймер для hsa-miR-26a-5p 4 мкM (RT-26) - 300 мкл
11. NTC (контроль без матрицы, Milli-Q вода обработанная DEPC) - 1000 мкл.
12. Milli-Q-DEPC-H2O (Milli-Q вода обработанная DEPC) - 2000 мкл
Из расчёта на одну ОТ-реакцию смесь должна содержать перечисленные выше компоненты в следующем соотношении:
10 мкл PolyA-RT_Mix + 5 мкл RT-праймера* + 5 мкл матрицы**
* - RT-праймер для miR-7, miR-143 или miR-26a
** РНК нормализованная до концентрации 200нг/мкл.
Из расчёта на одну ПЦР-РВ реакцию смесь должна содержать перечисленные выше компоненты в следующем соотношении:
6,1 мкл Mix_PCR + 0,2 мкл Taq +7,7 мкл miR26a_Mix (или miR143_MixPCR) + 6 мкл матрицы**
* - кДНК или РНК нормализованная до концентрации 2 нг/мкл, NTC или контроль реакционной смеси.
Для тест-системы были разработаны специфичные олигонуклеотидные прямые и обратные праймеры для hsa-miR-7-5p, hsa-miR-143-3p и hsa-miR-26a-5p. Дизайн специфичных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1) осуществлялся с использованием алгоритма Balcells I. (см. Balcells I, Cirera S, Busk PK. Specific and sensitive quantitative RT-PCR of miRNAs with DNA primers. BMC Biotechnol. 2011;11:70).
Таблица 1
Тест-система «miR-M-SCREEN» для прогнозирования развития метастазов у больных колоректальным раком на основании уровня микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови
| Наименование микро-РНК |
Последовательность микро-РНК |
Последовательность |
| hsa-miR-7-5p | TGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTT | F:CGCAGTGGAAGACTAGTGA (SEQ ID №1) R:GTCCAGT(15)AACAACA (SEQ ID №2) RT:CAGGTCCAGT(15)AA (SEQ ID №3) |
| hsa-miR-26a-5p | TTCAAGTAATCCAGGATAGGCT | F:GCAGTTCAAGTAATCCAGGATAG(SEQ ID №4) R:GGTCCAGT(15)AGC (SEQ ID №5) RT:CAGGTCCAGT(15)AG (SEQ ID №6) |
| hsa-miR-143-3p | TGAGATGAAGCACTGTAGCTC | F:CAGTGAGATGAAGCACTGTAG (SEQ ID №7) R:GGTCCAGT(15)GAG (SEQ ID №8) RT:CAGGTCCAGT(15)GA (SEQ ID №9) |
Работу с тест-системой, содержащей разработанные специфичные олигонуклеотидные праймеры, осуществляют следующим образом:
- На первом этапе образцы крови объемом 10 мл получают путем венепункции в вакутейнеры, содержащие K2ЭДТА. После взятия пробирки перемешивают переворачиванием в течение 10 сек. и хранят до обработки не более 30 минут при 4°C. Для получения плазмы кровь центрифугируют при 1500 об.мин. в течение 20 минут. Бесклеточную фракцию переносят в новую пробирку и центрифугируют при 3000 об.мин. в течение 20 минут, супернатант отбирают и хранят при -80°C.
- На втором этапе препараты РНК плазмы крови получают при помощи протокола, описанного Chomczynski и Sacchi (см. Chomczynski P., Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction : twenty-something years on // Nat. Protoc. 2006. Vol. 1, № 2. P. 581-585.). К 300 мкл плазмы последовательно прибавляют 400 мкл денатурирующего буфера (6М гуанидин-изотиоцианат, 15 мМ Трис-ацетат, рН 6,5, 1% Sarkosyl, 2% 2-меркаптоэтанол) и 70 мкл 2М ацетата натрия, pH 4.0, перемешивают. К полученной смеси добавляют 700 мкл насыщенного водой фенола и перемешивают. Для разделения водной и органической фаз прибавляют 200 мкл смеси хлороформ:изоамиловый спирт (49:1), перемешивают в течение 10 сек и инкубируют в течение 15 мин при 4°C. Затем полученную смесь центрифугируют при 10 000g в течение 15 мин при 2°С. Верхнюю водную фазу отбирают и переносят в новую пробирку. К водной фазе прибавляют равный объем этанола и наносят на колонку с фильтром из диоксида кремния (использовали колонки из набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия), РНК эффективно связывается с мембраной из диоксида кремния). Колонку дважды промывают буфером (4M гуанидин-изотиоцианат, 10 мМ трис-ацетат, 50% этанол, 1% 2-меркаптоэтанол) и центрифугируют. Затем колонку дважды промывают буфером (10 мМ трис-HCl, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 75% этанол), центрифугируют при 400g, 1 мин. Для элюции РНК в колонку добавляют 120 мкл деионизированной воды с ингибитором РНКаз. Элюат собирают центрифугированием при 400g, 10 мин.
- На третьем этапе для выявления зрелых микро-РНК выделенную суммарную РНК подвергают реакции обратной транскрипции, которая проводится одновременно с полиаденилированием РНК, с использованием специфичных RT-праймеров (обратный праймер, который содержит олиго(dT)-последовательность и адаптерную последовательность на 5'-конце). Для обратной транскрипции используют реакционную смесь (объемом 20 мкл), содержащую 1-кратный поли(А) буфер, 10 единиц/мкл M-MuLV, 0,1 мМ dNTPs, 1 мМ АТФ, 1 мкM RT-праймера, 0,5 единиц/мкл Poly(A)-полимераза и 0,2 мкг тотальной РНК. Реакцию проводят в течение 30 мин. при 20°C, 15 мин. при 42°C, затем обратную транскриптазу инактивируютв течение 5 минут при 85°C.
- На четвертом этапе полученную комплементарную ДНК (кДНК) использовуют в реакциях RT-qPCR. Амплификацию проводят в 20 мкл PCR-смеси, содержащей 1x PCR-буфер, 0,25 mМ dNTPs, 2 мM MgCl2, 1x EvaGreen, 1 ед.акт. Taq-DNA-полимеразы, по 500 нM прямого и обратного праймеров. Постановку RT-qPCR каждого образца проводят в трех повторах. Полученные смеси инкубируют в амплификаторе CFX 96 (Bio-Rad Laboratories, США) по следующей программе: 2 минуты 94°С, 50 циклов: денатурация при 95 °С 10 с., отжиг и элонгация - 64 °С 20 с. Результаты, соответствующие Ct>40 признаются отрицательными.
Реагенты для выделения РНК, определения концентрации РНК и кДНК, проведения электрофореза не входят в состав тест-системы.
Для выполнения анализа необходимо провести одну реакцию обратной тракскрипции (ОТ-реакцию) совмещенной с полиаденилированием РНК и две амплификации (реакции ПЦР-РВ). В ОТ-реакции происходит наработка необходимой для ПЦР-РВ кДНК. В первой амплификации проверяется качество кДНК и чистота препарата тотальной РНК. Реакция проводится с использование смеси праймеров для hsa-miR-7-5p. Дальнейшее использование кДНК в тест-системе возможно, если соблюдаются следующие условия:
1) Ct hsa-miR-7-5p для образца кДНК не превышает 28 цикла.
2) разница Ct hsa-miR-7-5p между образцом кДНК и РНК должна быть не меньше 5 циклов.
3) Ct hsa-miR-7-5p контроля реакционной смеси должно быть не выше 24 цикла
4) Ct hsa-miR-7-5p для NTC должен отсутствовать.
Во второй амплификации определяется уровень сигналов, продуцируемых амплификатами hsa-miR-26a-5p/hsa-miR-143-3p и референсной микро-РНК в плазме крови.
Относительная экспрессия микро-РНК вычисляется следующим образом:
- рассчитывают среднее геометрическое Ct по трём повторам для целевой и референсной микро-РНК,
- далее рассчитывают величину ΔCt =Ct(hsa-miR-26a-5p/hsa-miR-143-3p) - Ct(hsa-miR-7-5p)
- коэффициент относительной экспрессии (K) рассчитывают по формуле 1.9 - Δ Ct .
Далее сравнивают полученные значения К с интервалом прогностического коэффициента, и при значении К miR-26a ≤2,56*10-3 и К miR-143 ≤10,02*10-3 прогнозируют развитие метастазов (чувствительность 95%), а при значении К miR-26a ≥3,89*10-3 и К miR-143 ≥17,11*10-3 прогнозируют течение заболевания без отдаленных и регионарных метастазов (чувствительность 95%). При значениях коэффициента K между указанными интервалами считают полученный результат неопределенным.
Для доказательства прогностической ценности предлагаемой тест-системы приводится 2 выписки из историй болезни.
1) Больная С., 68 лет, госпитализирована в апреле 2020 г. в отделение абдоминальной онкологии №1 ФГБУ «НМИЦ онкологии» МЗ РФ с диагнозом рак толстой кишки, St III. Проведено УЗИ и СРКТ органов брюшной полости, обнаружены диффузные изменения паренхимы печени и опухоль толстой кишки.
Результаты молекулярного анализа образца плазмы крови (получена до лечения) К
miR-26a
=1,10*10
-3
и К
miR-143
=4,19*10
-3
соответствуют прогностическим коэффициентам развития метастазов.
Больной было выполнено хирургическое вмешательство согласно стандарту лечения. Послеоперационный гистологический анализ: T3aN0M0, G2 аденокарцинома, прорастанием всех слоев стенки кишки, с инвазией в серозную оболочку, линия резекции без признаков опухолевого роста. После консультации химиотерапевта показаны курсы АХТ. Состояние при выписке: удовлетворительное.
При повторном обращении через 4 месяца на СРКТ в левой доли печени подозрение на метастаз рака прямой кишки до 1 см, проведена биопсия печени. Ранее проведенный молекулярный анализ подтвержден результатами послеоперационного гистологического анализа - в печени метастаз аденокарциномы.
2) Больная Б., 63 года, госпитализирована в марте 2020 г. в отделение абдоминальной онкологии №1 ФГБУ «НМИЦ онкологии» МЗ РФ с диагнозом рак сигмовидной кишки, St II. Проведено УЗИ органов брюшной полости, обнаружены признаки кисты левой доли печени, диффузные изменения паренхимы печени. При колоноскопии рак сигмовидной кишки. На СРКТ киста левой доли печени до 1.5 см.
Результаты молекулярного анализа образца плазмы крови (получена до лечения) К
miR-26a
=5,47*10
-3
и К
miR-143
=21,09*10
-3
соответствуют прогностическим коэффициентам течения заболевания без отдаленных и регионарных метастазов.
Проведено хирургическое лечение - операция лапаротомия, резекция сигмовидной кишки с расширенной лимфаденэктомией. Молекулярный анализ подтвержден результатами послеоперационного гистологического анализа - T2N0M0. Гистологическое исследование: G2 аденокарцинома, метастазов нет. После консультации химиотерапевта курсы АХТ не показаны. Больная наблюдается по настоящее время без признаков рецидива и метастазов.
С помощью предлагаемой тест-системы было осуществлено прогнозирование течения заболевания у 50 пациентов с диагностированным КРР.
Технико-экономическая эффективность изобретения. «Тест-система «miR-M-SCREEN» для прогнозирования развития метастазов у больных колоректальным раком на основании уровня микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови» позволяет с высокой точностью прогнозировать исход такого заболевания как КРР. Заявляемая тест-система, включает разработанные нами праймеры и является экономически оправданной для уточнения особенностей течения заболевания и дает возможность скорректировать тактику лечения, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии (ПЦР), без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью и специфичностью, относится к малоинвазивной диагностике, осуществление анализа возможно с плазмой крови и занимает не более 8 часов (с учетом подготовительных этапов), и не более 4 часов (при непосредственном использовании тест-системы).
Claims (5)
- Тест-система, рассчитанная на 50 реакций, для прогнозирования развития метастазов у больных колоректальным раком на основании уровня микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови, включающая реагенты для получения кДНК на матрице тотальной РНК с помощью реакции обратной транскрипции, совмещенной с полиаденилированием, амплификации библиотеки кДНК в режиме реального времени (ПЦР-РВ) и контрольные смеси, отличающаяся тем, что используют смесь для ОТ-реакции: 2-х поли А-буфер, 20 ед./мкл M-MuLV, 0,2 мМ dNTPs, 2 мМ АТФ, 1 ед./мкл Poly(A)-полимеразы и ПЦР-РВ реакции: 1 мМ dNTPs, 6,6 мМ MgCl2, 4-х ПЦР-буфер с 4-х EvaGreen Dye, ДНК-полимеразу Thermus aquaticus 5 ед./мкл и высокоспецифичные праймеры для hsa-miR-7-5p: F:CGCAGTGGAAGACTAGTGA (SEQ ID №1); R:GTCCAGTТТТТТТТТТТТТТТAACAACA (SEQ ID №2); RT:CAGGTCCAGTТТТТТТТТТТТТТТAA (SEQ ID №3); для hsa-miR-26a-5p: F:GCAGTTCAAGTAATCCAGGATAG (SEQ ID №4); R:GGTCCAGTТТТТТТТТТТТТТТAGC (SEQ ID №5); RT:CAGGTCCAGTТТТТТТТТТТТТТТAG (SEQ ID №6) и для hsa-miR-143-3p: F:CAGTGAGATGAAGCACTGTAG (SEQ ID №7); R:GGTCCAGTТТТТТТТТТТТТТТGAG (SEQ ID №8); RT:CAGGTCCAGTТТТТТТТТТТТТТТGA (SEQ ID №9);
- проводят две амплификации: контрольную и основную, анализируют первичные данные и рассчитывают коэффициент (К) относительной экспрессии:
- - рассчитывают среднее геометрическое Ct по трём повторам для целевой и референсной микро-РНК,
- - далее рассчитывают величину ΔCt = Ct(hsa-miR-26a-5p/hsa-miR-143-3p) - Ct(hsa-miR-7-5p);
- - коэффициент относительной экспрессии (K) рассчитывают по формуле 1.9-ΔCt, сравнивают полученные значения К с интервалом прогностического коэффициента экспрессии, и при значении КmiR-26a≤2,56*10-3 и КmiR-143≤10,02*10-3 прогнозируют развитие метастазов, при значении КmiR-26a ≥3,89*10-3 и КmiR-143 ≥17,11*10-3 прогнозируют течение заболевания без отдаленных и регионарных метастазов, а при значениях коэффициента K между указанными интервалами считают полученный результат неопределенным.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2786386C1 true RU2786386C1 (ru) | 2022-12-20 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010139810A1 (en) * | 2009-06-05 | 2010-12-09 | Febit Holding Gmbh | Mirna fingerprint in the diagnosis of lung cancer |
| RU2662975C1 (ru) * | 2011-10-21 | 2018-07-31 | Оспиталь Клиник Де Барселона | Определение микрорнк в плазме для обнаружения ранних стадий колоректального рака |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010139810A1 (en) * | 2009-06-05 | 2010-12-09 | Febit Holding Gmbh | Mirna fingerprint in the diagnosis of lung cancer |
| RU2662975C1 (ru) * | 2011-10-21 | 2018-07-31 | Оспиталь Клиник Де Барселона | Определение микрорнк в плазме для обнаружения ранних стадий колоректального рака |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Д. В. РЕБРИКОВ и др., ПЦР в реальном времени, 6-е издание, БИНОМ, лаборатория знаний, Москва, 2015, стр. 85, 86. Основы полимеразной цепной реакции, методическое пособие, Москва, 2 января 2019, стр. 9, https://www.dna-technology.ru/sites/default/files/pcr_a5_083-4.pdf. ШУЛЕНИНА Л.В., Изучение экспрессии микро-РНК, модулирующих функциональную активность Р53-зависимой системы защиты генома, при формировании отдаленных последствий радиационного воздействия у экспериментальных животных и человека, Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Москва-2015, стр. 74-75. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhao et al. | Screening of microRNA in patients with esophageal cancer at same tumor node metastasis stage with different prognoses | |
| US20180346996A1 (en) | Method of treating colorectal cancer | |
| Giráldez et al. | Circulating microRNAs as biomarkers of colorectal cancer: results from a genome-wide profiling and validation study | |
| US8956817B2 (en) | Identification of microRNAs (miRNAs) in fecal samples as biomarkers for gastroenterological cancers | |
| Cai et al. | Serum miR-21 expression in human esophageal squamous cell carcinomas | |
| CN107674916B (zh) | 一种环状rna在结直肠癌生物标志物中的应用 | |
| CN106119393B (zh) | 一种与食管鳞癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用 | |
| WO2013038737A1 (ja) | 膀胱癌細胞の検出方法、膀胱癌細胞の検出方法に用いるプライマー及び膀胱癌マーカ | |
| CN105802964B (zh) | 一种用于肝细胞癌筛查的cRNA-FUT8的检测及其应用 | |
| CN102325902B (zh) | 对包括结肠直肠癌细胞的样品进行分型的方法和装置 | |
| CN107779504A (zh) | 结直肠癌microRNA分子标志物及其用途 | |
| Ghanbari et al. | Expression Analysis of Previously Verified Fecal and Plasma Down-regulated MicroRNAs (miR-4478, 1295-3p, 142-3p and 26a-5p), in FFPE Tissue Samples of CRC Patients. | |
| RU2324186C1 (ru) | Способ диагностики плоскоклеточного рака легких и набор для его осуществления | |
| CN109182507B (zh) | 用于诊断结直肠息肉的血浆miRNA分子标志物、试剂盒及其应用 | |
| RU2786386C1 (ru) | Тест-система "miR-M-SCREEN" для прогнозирования развития метастазов у больных колоректальным раком на основании уровня микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови | |
| CN109563548B (zh) | 用于鉴定胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤的体外方法 | |
| KR101381894B1 (ko) | 위암의 림프절 전이 진단 마커로서의 혈청 ｍｉＲＮＡ | |
| RU2800265C1 (ru) | Способ прогнозирования развития рецидива у больных с вирусом папилломы человека и немышечно-инвазивным раком мочевого пузыря | |
| CN107674915B (zh) | 一种环状rna在结直肠癌生物标志物中的应用 | |
| CN110777206B (zh) | Loc90024 rna的应用及诊断、预后评估和治疗肿瘤的产品 | |
| Ghanbari et al. | Analysis of Previously Verified Fecal and Plasma Dow-regulated MicroRNAs in FFPE Tissue Samples of CRC Patients | |
| WO2023115601A1 (zh) | 一种用于结直肠癌预后的miRNA检测试剂盒 | |
| Raad et al. | Aberrant methylation of miR-125b1 in gastric cancer: A case-control study. | |
| KR20190113108A (ko) | 대장암 진단 또는 재발 예측을 위한 마이크로rna-3656 및 이의 용도 | |
| RU2755651C1 (ru) | Аналитическая система для диагностики рака лёгкого при помощи свободных и ассоциированных с клетками крови циркулирующих микроРНК |