RU2786386C1 - TEST SYSTEM “miR-M-SCREEN” FOR PREDICTING THE DEVELOPMENT OF METASTASES IN PATIENTS WITH COLORECTAL CANCER BASED ON THE LEVEL OF miR-26a AND miR-143 MICRO-RNA IN BLOOD PLASMA - Google Patents
TEST SYSTEM “miR-M-SCREEN” FOR PREDICTING THE DEVELOPMENT OF METASTASES IN PATIENTS WITH COLORECTAL CANCER BASED ON THE LEVEL OF miR-26a AND miR-143 MICRO-RNA IN BLOOD PLASMA Download PDFInfo
- Publication number
- RU2786386C1 RU2786386C1 RU2022101124A RU2022101124A RU2786386C1 RU 2786386 C1 RU2786386 C1 RU 2786386C1 RU 2022101124 A RU2022101124 A RU 2022101124A RU 2022101124 A RU2022101124 A RU 2022101124A RU 2786386 C1 RU2786386 C1 RU 2786386C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mir
- hsa
- seq
- test system
- metastases
- Prior art date
Links
- 206010027476 Metastasis Diseases 0.000 title claims abstract description 27
- 201000011231 colorectal cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 25
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 title claims abstract description 21
- 238000011161 development Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 229920001899 Mir-143 Polymers 0.000 title claims description 22
- 229920001239 microRNA Polymers 0.000 claims abstract description 38
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims abstract description 31
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 20
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 claims abstract description 19
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 claims abstract description 18
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000001402 polyadenylating Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 21
- 108020004388 MicroRNAs Proteins 0.000 claims description 20
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 3
- 101710027505 ywlE Proteins 0.000 claims description 3
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 claims description 2
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 claims description 2
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 claims description 2
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 claims description 2
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 claims description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 14
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 108020004417 Untranslated RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000009956 Adenocarcinoma Diseases 0.000 description 4
- 230000003187 abdominal Effects 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 201000002758 colorectal adenoma Diseases 0.000 description 4
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 229920001894 non-coding RNA Polymers 0.000 description 3
- 230000002980 postoperative Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 2
- 210000001072 Colon Anatomy 0.000 description 2
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 2
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 2
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N Diethylpyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N Guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 2
- 229920000320 RNA (poly(A)) Polymers 0.000 description 2
- 108020004412 RNA 3' Polyadenylation Signals Proteins 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 2
- 201000003825 sigmoid colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 2-[dodecanoyl(methyl)amino]acetic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035533 AUC Effects 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000565118 Cordylophora caspia Species 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 EC 2.7.7.49 Proteins 0.000 description 1
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N Isoamyl alcohol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 206010061529 Polyp Diseases 0.000 description 1
- 206010038038 Rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- BFDMCHRDSYTOLE-UHFFFAOYSA-N SC#N.NC(N)=N.ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 Chemical compound SC#N.NC(N)=N.ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 BFDMCHRDSYTOLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002151 Serous Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 1
- 230000000112 colonic Effects 0.000 description 1
- 238000002052 colonoscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000029578 entry into host Effects 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal Effects 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 1
- 210000001599 sigmoid colon Anatomy 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к молекулярной биологии, онкологии и биотехнологии, и может быть использовано для прогнозирования развития метастазов по уровню микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови у больных колоректальным раком.The invention relates to molecular biology, oncology and biotechnology, and can be used to predict the development of metastases by the level of micro-RNA miR-26a and miR-143 in blood plasma in patients with colorectal cancer.
Колоректальный рак (КРР) является гетерогенным многофакторным заболеванием, причем порядка 35% случаев обусловлено генетическими факторами, включая нестабильность генома, метилирование CpG-островков, мутации/полиморфизмы генов и изменения в экспрессии некодирующей РНК (см. M. Oines, L.M. Helsingen, M. Bretthauer, L. Emilsson. Epidemiology and risk factors of colorectal polyps. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 2017, 31, pp. 419-424; Tang X.J., Wang W., Hann S.S. Interactions among lncRNAs, miRNAs and mRNA in colorectal cancer. Biochimie. 2019;163:58-72).Colorectal cancer (CRC) is a heterogeneous multifactorial disease, with about 35% of cases due to genetic factors, including genome instability, CpG island methylation, gene mutations/polymorphisms, and changes in non-coding RNA expression (see M. Oines, L.M. Helsingen, M. Brettauer, L. Emilsson. Epidemiology and risk factors of colorectal polyps. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 2017, 31, pp. 419-424; Tang X. J., Wang W., Hann S. S. Interactions among lncRNAs, miRNAs and mRNA in colorectal cancer Biochimie 2019;163:58-72).
Преобразование нормальной слизистой оболочки толстой кишки в аденокарциному происходит в несколько этапов, занимающих десятилетия (см. Tang XJ, Wang W, Hann SS. Interactions among lncRNAs, miRNAs and mRNA in colorectal cancer. Biochimie. 2019;163:58-72). Хотя многочисленные методы лечения, такие как хирургия, химиотерапия, лучевая терапия, таргетная терапия и иммунотерапия, показали способность уменьшать частоту рецидивов и улучшать выживаемость пациентов, 5-летняя выживаемость больных КРР все еще остается низкой (см. R.L. Siegel, K.D. Miller, A. Jemal. Cancer statistics. CA A Cancer J. Clin. 2019, 69, pp. 7-34; W. Wang, R. Kandimalla, H. Huang, L. Zhu, Y. Li, F. Gao, A. Goel, X. Wang Molecular subtyping of colorectal cancer: recent progress, new challenges and emerging opportunities. Semin. Canc. Biol., 2019, 55, pp. 37-52). Приблизительно у 60% больных КРР диагностируются локальные или отдаленные метастазы (IV стадия заболевания (см. Siegel R., Desantis C., Jemal A. Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J. Clin. 2014;64:104-117. doi: 10.3322/caac.21220). Эти факты подчеркивают необходимость поиска новых биомаркеров, которые могут быть использованы для ранней диагностики и прогнозировании течения этого заболевания. Большое количество исследований выявило, что нкРНК играют важную роль во многих биологических процессах, и нарушение их регуляции может привести к различным заболеваниям, включая рак толстой кишки (см. M. Weng, D. Wu, C. Yang, H. Peng, G. Wang, T. Wang, X. Li Noncoding RNAs in the development, diagnosis, and prognosis of colorectal cancer Transl. Res., 2017, 181, pp. 108-120). Хорошо изученными нкРНК являются микро-РНК. The transformation of the normal colonic mucosa into adenocarcinoma occurs in several stages over decades (see Tang XJ, Wang W, Hann SS. Interactions among lncRNAs, miRNAs and mRNA in colorectal cancer. Biochimie. 2019;163:58-72). Although numerous treatments such as surgery, chemotherapy, radiation therapy, targeted therapy, and immunotherapy have shown the ability to reduce recurrence rates and improve patient survival, the 5-year survival rate for CRC patients is still low (see R.L. Siegel, K.D. Miller, A. Jemal, Cancer statistics, CA A Cancer, J. Clin, 2019, 69, pp. 7-34, W. Wang, R. Kandimalla, H. Huang, L. Zhu, Y. Li, F. Gao, A. Goel, X Wang Molecular subtyping of colorectal cancer: recent progress, new challenges and emerging opportunities Semin Canc Biol 2019 55 pp 37-52 Approximately 60% of CRC patients are diagnosed with local or distant metastases (stage IV of the disease (see Siegel R., Desantis C., Jemal A. Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J. Clin. 2014;64:104-117. doi : 10.3322/caac.21220).These facts highlight the need to search for new biomarkers that can be used for early diagnosis and prediction of the course of this disease.A large number of studies have revealed that ncRNAs play an important role in many biological processes, and their dysregulation can lead to to various diseases, including colon cancer (see M. Weng, D. Wu, C. Yang, H. Peng, G. Wang, T. Wang, X. Li Noncoding RNAs in the development, diagnosis, and prognosis of colorectal cancer Transl. Res., 2017, 181, pp. 108-120) Well-studied ncRNAs are miRNAs.
Микро-РНК - это короткие некодирующие РНК, которые регулируют экспрессию генов катализируя разрушение мРНК, либо ингибируя трансляцию мРНК в белок. Зрелая микро-РНК представляет собой одноцепочечную РНК размером порядка 22 нуклеотидов, получающуюся из первичного транскрипта. Микро-РНК являются эпигенетическими регуляторами, специфичны для определенной ткани и модулируют экспрессию генов путем взаимодействия с комплементарными нуклеотидными последовательностями мРНК-мишеней (см. Димитриади Т.А., Бурцев Д.В., Дженкова Е.А., Кутилин Д.С. МикроРНК как маркеры прогрессирования предраковых заболеваний в рак шейки матки // Современные проблемы науки и образования. 2020. № 1.;URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=29529 (дата обращения: 04.03.2020)). МикроРНК вносят значительный вклад в инициацию и развитие различных молекулярных событий, включая инициацию онкогенеза, прогрессирование и метастазирование опухолей, что делает микро-РНК потенциальными биомаркерами для оценки прогрессирования и прогноза КРР (см. Z.M. Abdelsattar, S.L. Wong, S.E. Regenbogen, D.M. Jomaa, K.M. Hardiman, S. Hendren. Colorectal cancer outcomes and treatment patterns in patients too young for average-risk screening. Cancer, 2016, 122, pp. 929-934).Micro-RNAs are short non-coding RNAs that regulate gene expression by catalyzing the destruction of mRNA or by inhibiting the translation of mRNA into protein. Mature miRNA is a single-stranded RNA of the order of 22 nucleotides, derived from the primary transcript. MicroRNAs are epigenetic regulators, specific for a certain tissue, and modulate gene expression by interacting with complementary nucleotide sequences of mRNA targets (see Dimitriadi T.A., Burtsev D.V., Dzhenkova E.A., Kutilin D.S. MicroRNAs as markers of the progression of precancerous diseases to cervical cancer // Modern problems of science and education. 2020. No. 1.; .2020)). MicroRNAs make a significant contribution to the initiation and development of various molecular events, including the initiation of oncogenesis, tumor progression and metastasis, which makes microRNAs potential biomarkers for assessing the progression and prognosis of CRC (see Z.M. Abdelsattar, S.L. Wong, S.E. Regenbogen, D.M. Jomaa, K.M. Hardiman, S. Hendren, Colorectal cancer outcomes and treatment patterns in patients too young for average-risk screening, Cancer, 2016, 122, pp. 929-934.
Результаты множественного параллельного секвенирования 160 образцов КРР, проведенного нами ранее (см. Новикова И.А., Тимошкина Н.Н., Кутилин Д.С. Дифференциальная экспрессия микроРНК в опухолевых и нормальных тканях толстой кишки. Якутский медицинский журнал. 2020, №4. С. 74-82), а также последующая валидация этих результатов методом РТ-ПЦР в образцах плазмы крови и математический анализ (для получения надежной диагностической модели использовали LASSO-пенализованную логистическую регрессию, оптимизированную при помощи множественных перевыборочных (bootstrap) наборов данных), показали большой потенциал пар микро-РНК hsa-miR-26a-5p/hsa-miR-143-3p в разделении больных КРР на группы без метастазов и группу с отдаленным/ регионарным метастазированием. При помощи такого сочетания микро-РНК достигалась чувствительность 95% и специфичность 90% (AUC 0,98).The results of multiple parallel sequencing of 160 CRC samples, which we conducted earlier (see Novikova I.A., Timoshkina N.N., Kutilin D.S. Differential expression of microRNA in tumor and normal tissues of the colon. Yakut Medical Journal. 2020, No. 4 pp. 74-82), as well as subsequent validation of these results by RT-PCR in blood plasma samples and mathematical analysis (to obtain a reliable diagnostic model, LASSO-penalized logistic regression was used, optimized using multiple resampling (bootstrap) data sets), showed a great potential for hsa-miR-26a-5p/hsa-miR-143-3p microRNA pairs in dividing CRC patients into groups without metastases and a group with distant/regional metastasis. With this combination of miRNAs, a sensitivity of 95% and a specificity of 90% (AUC 0.98) was achieved.
Анализ патентных источников показал наличие только 1 близкого по тематике к нашему изобретения - «Определение микроРНК в плазме для обнаружения ранних стадий колоректального рака» (Заявка: 2015108970, 20.10.2012, Патент RU 2 662 975 C1, опубликовано: 31.07.2018 Бюл. № 22). Данный патент описывает способ обнаружения колоректальных аденом поздней стадии у человека, включающий этапы: измерения общего профиля или уровня экспрессии одной или нескольких микроРНК, полученных из одного или нескольких биологических образцов субъекта, где по меньшей мере одна из этих микроРНК является miR18a; и сравнение общего профиля экспрессии одной или нескольких микроРНК из биологического образца от субъекта с предполагаемыми колоректальными аденомами поздней стадии с общим профилем экспрессии одной или нескольких микроРНК из биологического образца из нормального субъекта, где нормальным субъектом является здоровый человек, не страдающий от колоректальных аденом поздней стадии, и где сверхэкспрессия miR18a свидетельствует о наличии колоректальных аденом поздней стадии. An analysis of patent sources showed the presence of only 1 subject close to our invention - "Determination of microRNA in plasma for the detection of early stages of colorectal cancer" (Application: 2015108970, 10/20/2012, Patent RU 2 662 975 C1, published: 07/31/2018 Bull. No. 22). This patent describes a method for detecting advanced colorectal adenomas in a human, comprising the steps of: measuring the overall profile or expression level of one or more microRNAs obtained from one or more biological samples of a subject, where at least one of these microRNAs is miR18a; and comparing the overall expression profile of one or more miRNAs from a biological sample from a subject with suspected late stage colorectal adenomas with the overall expression profile of one or more miRNAs from a biological sample from a normal subject, where the normal subject is a healthy person not suffering from advanced colorectal adenomas, and where overexpression of miR18a is indicative of the presence of advanced colorectal adenomas.
Описанный способ использует схожие с нашим принципы, но направлен на раннюю диагностику и включает иной перечень биомаркеров микро-РНК.The described method uses principles similar to ours, but is aimed at early diagnosis and includes a different list of miRNA biomarkers.
Анализ патентных источников (www.fips.ru) также показал отсутствие действующих патентов и заявок на патент тест-системы для прогнозирования развития метастазов у больных колоректальным раком на основании уровня микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови.An analysis of patent sources (www.fips.ru) also showed the absence of valid patents and patent applications for a test system for predicting the development of metastases in patients with colorectal cancer based on miR-26a and miR-143 microRNA levels in blood plasma.
Изобретение «Тест-система «miR-M-SCREEN» для прогнозирования развития метастазов у больных колоректальным раком на основании уровня микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови» является новым, так как относительная экспрессия данных микро-РНК ранее не использовалась для заявленной в тест-системе цели, также как последовательности праймеров в составе предлагаемой тест-системы.The invention "Test system "miR-M-SCREEN" for predicting the development of metastases in patients with colorectal cancer based on the level of miR-26a and miR-143 miR-26a and miR-143 microRNAs in blood plasma" is new, since the relative expression of these miRNAs has not previously been was used for the stated purpose in the test system, as well as the primer sequence in the composition the proposed test system.
Целью заявляемого изобретения является создание и внедрение новой, простой в исполнении, не дорогостоящей и точной тест-системы с уникальными высокоспецифичными последовательностями синтетических олигонуклеотидов для прогнозирования регионального и отдаленного метастазирования у пациентов с диагнозом рак толстой кишки. The purpose of the claimed invention is the creation and implementation of a new, easy to perform, inexpensive and accurate test system with unique highly specific synthetic oligonucleotide sequences for predicting regional and distant metastasis in patients diagnosed with colon cancer.
Сущность тест-системы заключается в том, что используют библиотеку комплементарной ДНК (кДНК), полученную на матрице тотальной РНК с помощью реакции обратной транскрипции с RT-праймерами совмещённой с реакцией полиаденилирования РНК, проводят амплификацию библиотеки кДНК с высокоспецифичными праймерами для микро-РНК miR-26a , miR-143 и miR-7, анализируют первичные данные и вычисляют коэффициенты относительной экспрессии микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови (K) (соотношение относительной экспрессии miR-26a или miR-143 относительно miR-7), сравнивают полученные значения К с интервалом прогностического коэффициента, и при значении К miR-26a ≤2,56*10-3 и К miR-143 ≤10,02*10-3 прогнозируют развитие метастазов (чувствительность 95%), а при значении К miR-26a ≥3,89*10-3 и К miR-143 ≥17,11*10-3 прогнозируют течение заболевания без отдаленных и регионарных метастазов (чувствительность 95%). При значениях коэффициента K между указанными интервалами считают полученный результат неопределенным.The essence of the test system lies in the fact that a complementary DNA (cDNA) library obtained on a total RNA matrix using a reverse transcription reaction with RT primers combined with an RNA polyadenylation reaction is used, the cDNA library is amplified with highly specific primers for microRNA miR- 26a , miR-143 and miR-7 , analyze the primary data and calculate the relative expression coefficients of miR-26a and miR-143 miRNA in blood plasma (K) (the ratio of the relative expression of miR-26a or miR-143 relative to miR-7) , compare the obtained values of K with the interval of the prognostic coefficient, and with a value of K miR-26a ≤ 2.56 * 10 -3 and K miR-143 ≤ 10.02 * 10 -3 , the development of metastases is predicted (95% sensitivity), and with a value K miR-26a ≥3.89*10 -3 and K miR-143 ≥17.11*10 -3 predict the course of the disease without distant and regional metastases (95% sensitivity). For values of the coefficient K between the indicated intervals, the result obtained is considered indeterminate.
Заявленный анализ основан на определении относительной экспрессии miR-26a или miR-143 в плазме крови больных КРР и последующем вычислении соотношения экспрессии этих микро-РНК относительно референса (miR-7): К miR -26 a =E miR -26 a /E miR -7 или К miR-143 =E miR-143 /E miR-7 . The claimed analysis is based on determining the relative expression of miR-26a or miR-143 in the blood plasma of patients with colorectal cancer and the subsequent calculation of the ratio of expression of these miRNAs relative to the reference (miR-7): K miR -26 a = E miR -26 a /E miR -7 or K miR-143 = E miR-143 / E miR-7 .
Заявленная тест-система включает следующие приёмы:The claimed test system includes the following methods:
получение кДНК на матрице тотальной РНК с помощью реакции обратной транскрипции с RT-праймерами совмещённой с реакцией полиаденилирования РНК, амплификацию библиотеки кДНК с высокоспецифичными праймерами для микро-РНК miR-26a , miR-143 и miR-7, анализ первичных данных и вычисление коэффициентов относительной экспрессии микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови, сравнение их значений со значениями коэффициентов экспрессии, характерными для групп пациентов с течением заболевания с метастазами и без.obtaining cDNA on a total RNA template using a reverse transcription reaction with RT primers combined with an RNA polyadenylation reaction; miR-26a and miR-143 microRNA expression in blood plasma, comparison of their values with expression coefficient values typical for groups of patients with the course of the disease with and without metastases.
Заявленная тест-система, рассчитанная на 50 реакций, включает: The claimed test system , designed for 50 reactions, includes:
1.Смесь для ПЦР-РВ реакции (Mix_PCR) - 800 мкл, содержащую 1 мМ dNTPs, 6,6 мМ MgCl2, 4-х кратный ПЦР-буфер с 4-кратной концентрацией красителя EvaGreen Dye.1. Mix for PCR-RT reaction (Mix_PCR) - 800 µl containing 1 mm dNTPs, 6.6 mm MgCl 2 , 4-fold PCR buffer with 4-fold concentration of EvaGreen Dye dye.
2. ДНК-полимеразу Thermus aquaticus 5ед/мкл (Taq) - 50 мкл2. Thermus aquaticus DNA polymerase 5 units/µl (Taq) - 50 µl
3. Смесь прямого и обратного праймеров с концентрацией 1500 нМ каждого для hsa-miR-26a-5p (miR26a_MixPCR) - 430 мкл3. A mixture of forward and reverse primers with a concentration of 1500 nM each for hsa-miR-26a-5p (miR26a_MixPCR) - 430 µl
4. Смесь прямого и обратного праймеров с концентрацией 1500 нМ каждого для hsa-miR-143-3p (miR143_MixPCR) - 430 мкл4. A mixture of forward and reverse primers with a concentration of 1500 nM each for hsa-miR-143-3p (miR143_MixPCR) - 430 µl
5. Смесь прямого и обратного праймеров с концентрацией 1500 нМ каждого для hsa-miR-7-5p (miR7_MixPCR) - 860 мкл5. A mixture of forward and reverse primers with a concentration of 1500 nM each for hsa-miR-7-5p (miR7_MixPCR) - 860 µl
6. Контроль реакционной смеси (стандартная кДНК с концентрацией 2 нг/мкл) - 900 мкл6. Control of the reaction mixture (standard cDNA with a concentration of 2 ng/µl) - 900 µl
7. Смесь для реакции обратной транскрипции совмещенной с полиаденилированием РНК (PolyA-RT_Mix) - 1500 мкл, содержащую 2-кратный поли(А) буфер, 20 единиц/мкл M-MuLV, 0,2 мМ dNTPs , 2 мМ АТФ, 1 единицу/мкл Poly(A)-полимеразы.7. Mix for reverse transcription reaction combined with RNA polyadenylation (PolyA-RT_Mix) - 1500 µl containing 2-fold poly(A) buffer, 20 units/µl M-MuLV, 0.2 mM dNTPs, 2 mM ATP, 1 unit /µl Poly(A)-polymerase.
8. RT-праймер для hsa-miR-7-5p 4 мкM (RT-R) - 300 мкл8. RT primer for hsa-miR-7-5p 4 µM (RT-R) - 300 µl
9. RT-праймер для hsa-miR-143-3p 4 мкM (RT-143) - 300 мкл9. RT primer for hsa-miR-143-3p 4 µM (RT-143) - 300 µl
10. RT-праймер для hsa-miR-26a-5p 4 мкM (RT-26) - 300 мкл10. RT primer for hsa-miR-26a-5p 4 µM (RT-26) - 300 µl
11. NTC (контроль без матрицы, Milli-Q вода обработанная DEPC) - 1000 мкл. 11. NTC (control without matrix, Milli-Q water treated with DEPC) - 1000 µl.
12. Milli-Q-DEPC-H2O (Milli-Q вода обработанная DEPC) - 2000 мкл12. Milli-Q-DEPC-H 2 O (Milli-Q water treated with DEPC) - 2000 µl
Из расчёта на одну ОТ-реакцию смесь должна содержать перечисленные выше компоненты в следующем соотношении:Based on one OT reaction, the mixture should contain the above components in the following ratio:
10 мкл PolyA-RT_Mix + 5 мкл RT-праймера* + 5 мкл матрицы**10 µl PolyA-RT_Mix + 5 µl RT primer* + 5 µl matrix**
* - RT-праймер для miR-7, miR-143 или miR-26a * - RT primer for miR-7, miR-143 or miR-26a
** РНК нормализованная до концентрации 200нг/мкл.** RNA normalized to a concentration of 200ng/µl.
Из расчёта на одну ПЦР-РВ реакцию смесь должна содержать перечисленные выше компоненты в следующем соотношении:Based on one RT-PCR reaction, the mixture should contain the components listed above in the following ratio:
6,1 мкл Mix_PCR + 0,2 мкл Taq +7,7 мкл miR26a_Mix (или miR143_MixPCR) + 6 мкл матрицы**6.1 µl Mix_PCR + 0.2 µl Taq + 7.7 µl miR26a_Mix (or miR143_MixPCR) + 6 µl matrix**
* - кДНК или РНК нормализованная до концентрации 2 нг/мкл, NTC или контроль реакционной смеси.* - cDNA or RNA normalized to a concentration of 2 ng/µl, NTC or control of the reaction mixture.
Для тест-системы были разработаны специфичные олигонуклеотидные прямые и обратные праймеры для hsa-miR-7-5p, hsa-miR-143-3p и hsa-miR-26a-5p. Дизайн специфичных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1) осуществлялся с использованием алгоритма Balcells I. (см. Balcells I, Cirera S, Busk PK. Specific and sensitive quantitative RT-PCR of miRNAs with DNA primers. BMC Biotechnol. 2011;11:70).For the test system, specific oligonucleotide forward and reverse primers for hsa-miR-7-5p, hsa-miR-143-3p and hsa-miR-26a-5p were developed . The design of specific oligonucleotide primers (Table 1) was carried out using the Balcells I algorithm (see Balcells I, Cirera S, Busk PK. Specific and sensitive quantitative RT-PCR of miRNAs with DNA primers. BMC Biotechnol. 2011;11:70).
Таблица 1Table 1
Тест-система «miR-M-SCREEN» для прогнозирования развития метастазов у больных колоректальным раком на основании уровня микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме кровиTest system "miR-M-SCREEN" for predicting the development of metastases in patients with colorectal cancer based on the level of micro-RNA miR-26a and miR-143 in blood plasma
микро-РНКName
micro-RNA
микро-РНКSubsequence
micro-RNA
R:GTCCAGT(15)AACAACA (SEQ ID №2)
RT:CAGGTCCAGT(15)AA (SEQ ID №3)F: CGCAGTGGAAGACTAGTGA (SEQ ID #1)
R:GTCCAGT(15)AACAACA (SEQ ID #2)
RT:CAGGTCCAGT(15)AA (SEQ ID #3)
R:GGTCCAGT(15)AGC (SEQ ID №5)
RT:CAGGTCCAGT(15)AG (SEQ ID №6)F:GCAGTTCAAGTAATCCAGGATAG(SEQ ID #4)
R:GGTCCAGT(15)AGC (SEQ ID #5)
RT:CAGGTCCAGT(15)AG (SEQ ID #6)
R:GGTCCAGT(15)GAG (SEQ ID №8)
RT:CAGGTCCAGT(15)GA (SEQ ID №9)F: CAGTGAGATGAAGCACTGTAG (SEQ ID No. 7)
R:GGTCCAGT(15)GAG (SEQ ID #8)
RT:CAGGTCCAGT(15)GA (SEQ ID #9)
Работу с тест-системой, содержащей разработанные специфичные олигонуклеотидные праймеры, осуществляют следующим образом:Work with the test system containing the developed specific oligonucleotide primers is carried out as follows:
- На первом этапе образцы крови объемом 10 мл получают путем венепункции в вакутейнеры, содержащие K2ЭДТА. После взятия пробирки перемешивают переворачиванием в течение 10 сек. и хранят до обработки не более 30 минут при 4°C. Для получения плазмы кровь центрифугируют при 1500 об.мин. в течение 20 минут. Бесклеточную фракцию переносят в новую пробирку и центрифугируют при 3000 об.мин. в течение 20 минут, супернатант отбирают и хранят при -80°C. - In the first step, 10 ml blood samples are obtained by venipuncture into vacutainers containing K 2 EDTA. After taking the tubes, mix by inverting for 10 seconds. and stored before processing no more than 30 minutes at 4°C. To obtain plasma, the blood is centrifuged at 1500 rpm. within 20 minutes. The cell-free fraction is transferred to a new tube and centrifuged at 3000 rpm. within 20 minutes, the supernatant is collected and stored at -80°C.
- На втором этапе препараты РНК плазмы крови получают при помощи протокола, описанного Chomczynski и Sacchi (см. Chomczynski P., Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction : twenty-something years on // Nat. Protoc. 2006. Vol. 1, № 2. P. 581-585.). К 300 мкл плазмы последовательно прибавляют 400 мкл денатурирующего буфера (6М гуанидин-изотиоцианат, 15 мМ Трис-ацетат, рН 6,5, 1% Sarkosyl, 2% 2-меркаптоэтанол) и 70 мкл 2М ацетата натрия, pH 4.0, перемешивают. К полученной смеси добавляют 700 мкл насыщенного водой фенола и перемешивают. Для разделения водной и органической фаз прибавляют 200 мкл смеси хлороформ:изоамиловый спирт (49:1), перемешивают в течение 10 сек и инкубируют в течение 15 мин при 4°C. Затем полученную смесь центрифугируют при 10 000g в течение 15 мин при 2°С. Верхнюю водную фазу отбирают и переносят в новую пробирку. К водной фазе прибавляют равный объем этанола и наносят на колонку с фильтром из диоксида кремния (использовали колонки из набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия), РНК эффективно связывается с мембраной из диоксида кремния). Колонку дважды промывают буфером (4M гуанидин-изотиоцианат, 10 мМ трис-ацетат, 50% этанол, 1% 2-меркаптоэтанол) и центрифугируют. Затем колонку дважды промывают буфером (10 мМ трис-HCl, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 75% этанол), центрифугируют при 400g, 1 мин. Для элюции РНК в колонку добавляют 120 мкл деионизированной воды с ингибитором РНКаз. Элюат собирают центрифугированием при 400g, 10 мин.- At the second stage, blood plasma RNA preparations are obtained using the protocol described by Chomczynski and Sacchi (see Chomczynski P., Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction : twenty-something years on // Nat. Protoc. 2006. Vol. 1, No. 2. P. 581-585.). To 300 µl of plasma, 400 µl of denaturing buffer (6M guanidine isothiocyanate, 15 mM Tris-acetate, pH 6.5, 1% Sarkosyl, 2% 2-mercaptoethanol) and 70 µl of 2M sodium acetate, pH 4.0 are successively added, mixed. 700 µl of water-saturated phenol was added to the resulting mixture and mixed. To separate the aqueous and organic phases, 200 μl of a mixture of chloroform:isoamyl alcohol (49:1) is added, stirred for 10 sec and incubated for 15 min at 4°C. Then the resulting mixture is centrifuged at 10,000g for 15 min at 2°C. The upper aqueous phase is removed and transferred to a new tube. An equal volume of ethanol is added to the aqueous phase and applied to a column with a silica filter (columns from the RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany) were used; RNA effectively binds to the silica membrane). The column was washed twice with buffer (4M guanidine isothiocyanate, 10 mM tris-acetate, 50% ethanol, 1% 2-mercaptoethanol) and centrifuged. The column is then washed twice with buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 M NaCl, 75% ethanol), centrifuged at 400g, 1 min. To elute the RNA, 120 μl of deionized water with an RNase inhibitor is added to the column. The eluate is collected by centrifugation at 400g, 10 min.
- На третьем этапе для выявления зрелых микро-РНК выделенную суммарную РНК подвергают реакции обратной транскрипции, которая проводится одновременно с полиаденилированием РНК, с использованием специфичных RT-праймеров (обратный праймер, который содержит олиго(dT)-последовательность и адаптерную последовательность на 5'-конце). Для обратной транскрипции используют реакционную смесь (объемом 20 мкл), содержащую 1-кратный поли(А) буфер, 10 единиц/мкл M-MuLV, 0,1 мМ dNTPs, 1 мМ АТФ, 1 мкM RT-праймера, 0,5 единиц/мкл Poly(A)-полимераза и 0,2 мкг тотальной РНК. Реакцию проводят в течение 30 мин. при 20°C, 15 мин. при 42°C, затем обратную транскриптазу инактивируютв течение 5 минут при 85°C.- At the third stage, to detect mature miRNAs, the isolated total RNA is subjected to a reverse transcription reaction, which is carried out simultaneously with RNA polyadenylation, using specific RT primers (a reverse primer that contains an oligo (dT) sequence and an adapter sequence at 5'- end). For reverse transcription, a reaction mixture (volume 20 µl) containing 1x poly(A) buffer, 10 units/µl M-MuLV, 0.1 mM dNTPs, 1 mM ATP, 1 µM RT primer, 0.5 units /µl Poly(A)-polymerase and 0.2 µg total RNA. The reaction is carried out for 30 min. at 20°C, 15 min. at 42°C, then the reverse transcriptase is inactivated for 5 minutes at 85°C.
- На четвертом этапе полученную комплементарную ДНК (кДНК) использовуют в реакциях RT-qPCR. Амплификацию проводят в 20 мкл PCR-смеси, содержащей 1x PCR-буфер, 0,25 mМ dNTPs, 2 мM MgCl2, 1x EvaGreen, 1 ед.акт. Taq-DNA-полимеразы, по 500 нM прямого и обратного праймеров. Постановку RT-qPCR каждого образца проводят в трех повторах. Полученные смеси инкубируют в амплификаторе CFX 96 (Bio-Rad Laboratories, США) по следующей программе: 2 минуты 94°С, 50 циклов: денатурация при 95 °С 10 с., отжиг и элонгация - 64 °С 20 с. Результаты, соответствующие Ct>40 признаются отрицательными.- In the fourth step, the resulting complementary DNA (cDNA) is used in RT-qPCR reactions. Amplification is carried out in 20 μl of a PCR mixture containing 1x PCR buffer, 0.25 mM dNTPs, 2 mM MgCl 2 , 1x EvaGreen, 1 unit act. Taq-DNA polymerase, 500 nM each of forward and reverse primers. Statement RT-qPCR of each sample is carried out in triplicate. The resulting mixtures are incubated in a CFX 96 amplifier (Bio-Rad Laboratories, USA) according to the following program: 2 minutes at 94°C, 50 cycles: denaturation at 95°C for 10 s, annealing and elongation at 64°C for 20 s. Results corresponding to Ct>40 are considered negative.
Реагенты для выделения РНК, определения концентрации РНК и кДНК, проведения электрофореза не входят в состав тест-системы.Reagents for RNA isolation, determination of RNA and cDNA concentrations, and electrophoresis are not included in the test system.
Для выполнения анализа необходимо провести одну реакцию обратной тракскрипции (ОТ-реакцию) совмещенной с полиаденилированием РНК и две амплификации (реакции ПЦР-РВ). В ОТ-реакции происходит наработка необходимой для ПЦР-РВ кДНК. В первой амплификации проверяется качество кДНК и чистота препарата тотальной РНК. Реакция проводится с использование смеси праймеров для hsa-miR-7-5p. Дальнейшее использование кДНК в тест-системе возможно, если соблюдаются следующие условия:To perform the analysis, it is necessary to carry out one reverse transcription reaction (RT reaction) combined with RNA polyadenylation and two amplifications (RT-PCR reactions). In the RT reaction, the cDNA necessary for PCR-RT is generated. The first amplification checks the quality of the cDNA and the purity of the total RNA preparation. The reaction is carried out using a mixture of primers for hsa-miR-7-5p. Further use of cDNA in the test system is possible if the following conditions are met:
1) Ct hsa-miR-7-5p для образца кДНК не превышает 28 цикла.1) Ct hsa-miR-7-5p for the cDNA sample does not exceed 28 cycles.
2) разница Ct hsa-miR-7-5p между образцом кДНК и РНК должна быть не меньше 5 циклов.2) the difference in Ct hsa-miR-7-5p between the cDNA and RNA sample should be at least 5 cycles.
3) Ct hsa-miR-7-5p контроля реакционной смеси должно быть не выше 24 цикла3) Ct hsa-miR-7-5p control of the reaction mixture should be no higher than 24 cycles
4) Ct hsa-miR-7-5p для NTC должен отсутствовать.4) Ct hsa-miR-7-5p for NTC should be absent.
Во второй амплификации определяется уровень сигналов, продуцируемых амплификатами hsa-miR-26a-5p/hsa-miR-143-3p и референсной микро-РНК в плазме крови.In the second amplification, the level of signals produced by the hsa-miR-26a-5p/hsa-miR-143-3p amplifications and the reference miRNA is determined in blood plasma.
Относительная экспрессия микро-РНК вычисляется следующим образом:The relative miRNA expression is calculated as follows:
- рассчитывают среднее геометрическое Ct по трём повторам для целевой и референсной микро-РНК,- calculate the geometric mean C t for three repetitions for the target and reference miRNA ,
- далее рассчитывают величину ΔCt =Ct(hsa-miR-26a-5p/hsa-miR-143-3p) - Ct(hsa-miR-7-5p)- then calculate the value of ΔC t =C t (hsa-miR-26a-5p/hsa-miR-143-3p) - C t ( hsa-miR-7-5p )
- коэффициент относительной экспрессии (K) рассчитывают по формуле 1.9 - Δ Ct .- coefficient of relative expression ( K ) is calculated by the formula 1.9 - Δ Ct .
Далее сравнивают полученные значения К с интервалом прогностического коэффициента, и при значении К miR-26a ≤2,56*10-3 и К miR-143 ≤10,02*10-3 прогнозируют развитие метастазов (чувствительность 95%), а при значении К miR-26a ≥3,89*10-3 и К miR-143 ≥17,11*10-3 прогнозируют течение заболевания без отдаленных и регионарных метастазов (чувствительность 95%). При значениях коэффициента K между указанными интервалами считают полученный результат неопределенным.Next, the obtained values of K are compared with the interval of the prognostic coefficient, and with a value of K miR-26a ≤2.56*10 -3 and K miR-143 ≤10.02*10 -3 , the development of metastases is predicted (95% sensitivity), and with a value K miR-26a ≥3.89*10 -3 and K miR-143 ≥17.11*10 -3 predict the course of the disease without distant and regional metastases (95% sensitivity). For values of the coefficient K between the indicated intervals, the result obtained is considered to be indeterminate.
Для доказательства прогностической ценности предлагаемой тест-системы приводится 2 выписки из историй болезни.To prove the prognostic value of the proposed test system, 2 extracts from the case histories are given.
1) Больная С., 68 лет, госпитализирована в апреле 2020 г. в отделение абдоминальной онкологии №1 ФГБУ «НМИЦ онкологии» МЗ РФ с диагнозом рак толстой кишки, St III. Проведено УЗИ и СРКТ органов брюшной полости, обнаружены диффузные изменения паренхимы печени и опухоль толстой кишки.1) Patient S., 68 years old, was hospitalized in April 2020 in the Department of Abdominal Oncology No. 1 of the National Medical Research Center of Oncology of the Ministry of Health of the Russian Federation with a diagnosis of colon cancer, St III. Ultrasound and CT scan of the abdominal organs were performed, diffuse changes in the liver parenchyma and a colon tumor were found.
Результаты молекулярного анализа образца плазмы крови (получена до лечения) КThe results of the molecular analysis of the blood plasma sample (obtained before treatment) K miR-26amiR-26a =1,10*10=1.10*10 -3-3 и К and K miR-143miR-143 =4,19*10\u003d 4.19 * 10 -3 -3 соответствуют прогностическим коэффициентам развития метастазов.correspond to the prognostic coefficients for the development of metastases.
Больной было выполнено хирургическое вмешательство согласно стандарту лечения. Послеоперационный гистологический анализ: T3aN0M0, G2 аденокарцинома, прорастанием всех слоев стенки кишки, с инвазией в серозную оболочку, линия резекции без признаков опухолевого роста. После консультации химиотерапевта показаны курсы АХТ. Состояние при выписке: удовлетворительное.The patient underwent surgery according to the standard of care. Postoperative histological analysis: T3aN0M0, G2 adenocarcinoma, germination of all layers of the intestinal wall, with invasion into the serous membrane, resection line without signs of tumor growth. After consultation with a chemotherapist, courses of AHT are indicated. Condition at discharge: satisfactory.
При повторном обращении через 4 месяца на СРКТ в левой доли печени подозрение на метастаз рака прямой кишки до 1 см, проведена биопсия печени. Ранее проведенный молекулярный анализ подтвержден результатами послеоперационного гистологического анализа - в печени метастаз аденокарциномы.Upon re-treatment after 4 months for SRCT in the left lobe of the liver, a suspicion of rectal cancer metastasis up to 1 cm was performed, a liver biopsy was performed. Previously performed molecular analysis was confirmed by the results of postoperative histological analysis - adenocarcinoma metastasis in the liver.
2) Больная Б., 63 года, госпитализирована в марте 2020 г. в отделение абдоминальной онкологии №1 ФГБУ «НМИЦ онкологии» МЗ РФ с диагнозом рак сигмовидной кишки, St II. Проведено УЗИ органов брюшной полости, обнаружены признаки кисты левой доли печени, диффузные изменения паренхимы печени. При колоноскопии рак сигмовидной кишки. На СРКТ киста левой доли печени до 1.5 см.2) Patient B. , aged 63, was hospitalized in March 2020 in the Department of Abdominal Oncology No. 1 of the National Medical Research Center of Oncology of the Ministry of Health of the Russian Federation with a diagnosis of sigmoid colon cancer, St II. Ultrasound of the abdominal organs was performed, signs of a cyst of the left lobe of the liver, diffuse changes in the liver parenchyma were found. Colonoscopy shows sigmoid colon cancer. On SRCT, a cyst of the left lobe of the liver is up to 1.5 cm.
Результаты молекулярного анализа образца плазмы крови (получена до лечения) КThe results of the molecular analysis of the blood plasma sample (obtained before treatment) K miR-26amiR-26a =5,47*10=5.47*10 -3-3 и К and K miR-143miR-143 =21,09*10\u003d 21.09 * 10 -3 -3 соответствуют прогностическим коэффициентам течения заболевания без отдаленных и регионарных метастазов.correspond to the prognostic coefficients of the course of the disease without distant and regional metastases.
Проведено хирургическое лечение - операция лапаротомия, резекция сигмовидной кишки с расширенной лимфаденэктомией. Молекулярный анализ подтвержден результатами послеоперационного гистологического анализа - T2N0M0. Гистологическое исследование: G2 аденокарцинома, метастазов нет. После консультации химиотерапевта курсы АХТ не показаны. Больная наблюдается по настоящее время без признаков рецидива и метастазов.Conducted surgical treatment - operation laparotomy, resection of the sigmoid colon with extended lymphadenectomy. Molecular analysis confirmed by the results of postoperative histological analysis - T2N0M0. Histological examination: G2 adenocarcinoma, no metastases. After consultation with a chemotherapist, AHT courses are not indicated. The patient is currently observed without signs of recurrence and metastases.
С помощью предлагаемой тест-системы было осуществлено прогнозирование течения заболевания у 50 пациентов с диагностированным КРР.Using the proposed test system, the course of the disease was predicted in 50 patients diagnosed with CRC.
Технико-экономическая эффективность изобретения. «Тест-система «miR-M-SCREEN» для прогнозирования развития метастазов у больных колоректальным раком на основании уровня микро-РНК miR-26a и miR-143 в плазме крови» позволяет с высокой точностью прогнозировать исход такого заболевания как КРР. Заявляемая тест-система, включает разработанные нами праймеры и является экономически оправданной для уточнения особенностей течения заболевания и дает возможность скорректировать тактику лечения, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии (ПЦР), без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью и специфичностью, относится к малоинвазивной диагностике, осуществление анализа возможно с плазмой крови и занимает не более 8 часов (с учетом подготовительных этапов), и не более 4 часов (при непосредственном использовании тест-системы). Technical and economic efficiency of the invention . “The miR-M-SCREEN test system for predicting the development of metastases in patients with colorectal cancer based on the level of micro-RNA miR-26a and miR-143 in blood plasma” makes it possible to predict the outcome of such a disease as CRC with high accuracy. The claimed test system includes the primers developed by us and is economically viable for clarifying the characteristics of the course of the disease and makes it possible to adjust the treatment tactics, is carried out in a standard molecular biology laboratory (PCR), without the use of special expensive equipment; has high sensitivity and specificity, refers to minimally invasive diagnostics, analysis is possible with blood plasma and takes no more than 8 hours (taking into account the preparatory stages), and no more than 4 hours (with the direct use of the test system).
Claims (5)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2786386C1 true RU2786386C1 (en) | 2022-12-20 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010139810A1 (en) * | 2009-06-05 | 2010-12-09 | Febit Holding Gmbh | Mirna fingerprint in the diagnosis of lung cancer |
| RU2662975C1 (en) * | 2011-10-21 | 2018-07-31 | Оспиталь Клиник Де Барселона | Determining microrna in plasma for detecting colorectal cancer in its early stages |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010139810A1 (en) * | 2009-06-05 | 2010-12-09 | Febit Holding Gmbh | Mirna fingerprint in the diagnosis of lung cancer |
| RU2662975C1 (en) * | 2011-10-21 | 2018-07-31 | Оспиталь Клиник Де Барселона | Determining microrna in plasma for detecting colorectal cancer in its early stages |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Д. В. РЕБРИКОВ и др., ПЦР в реальном времени, 6-е издание, БИНОМ, лаборатория знаний, Москва, 2015, стр. 85, 86. Основы полимеразной цепной реакции, методическое пособие, Москва, 2 января 2019, стр. 9, https://www.dna-technology.ru/sites/default/files/pcr_a5_083-4.pdf. ШУЛЕНИНА Л.В., Изучение экспрессии микро-РНК, модулирующих функциональную активность Р53-зависимой системы защиты генома, при формировании отдаленных последствий радиационного воздействия у экспериментальных животных и человека, Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Москва-2015, стр. 74-75. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhao et al. | Screening of microRNA in patients with esophageal cancer at same tumor node metastasis stage with different prognoses | |
| US20180355439A1 (en) | Method of treating advanced colorectal adenoma | |
| Giráldez et al. | Circulating microRNAs as biomarkers of colorectal cancer: results from a genome-wide profiling and validation study | |
| US8956817B2 (en) | Identification of microRNAs (miRNAs) in fecal samples as biomarkers for gastroenterological cancers | |
| Cai et al. | Serum miR-21 expression in human esophageal squamous cell carcinomas | |
| CN107674916B (en) | Application of circular RNA in colorectal cancer biomarker | |
| CN106119393B (en) | Plasma miRNA marker related to esophageal squamous carcinoma auxiliary diagnosis and application thereof | |
| WO2013038737A1 (en) | Method for detecting bladder cancer cells, primer used in method for detecting bladder cancer cells, and bladder cancer marker | |
| CN105802964B (en) | The detection and its application of a kind of cRNA-FUT8 for hepatocellular carcinoma examination | |
| CN102325902B (en) | The sample comprising colorectal cancer cell is carried out to the method and apparatus of somatotype | |
| CN107779504A (en) | Colorectal cancer microRNA molecule mark and application thereof | |
| Ghanbari et al. | Expression Analysis of Previously Verified Fecal and Plasma Down-regulated MicroRNAs (miR-4478, 1295-3p, 142-3p and 26a-5p), in FFPE Tissue Samples of CRC Patients. | |
| RU2324186C1 (en) | Method and tool for diagnostics of pulmonary epidermoid carcinoma | |
| CN109182507B (en) | Plasma miRNA molecular marker for diagnosing colorectal polyps, kit and application thereof | |
| RU2786386C1 (en) | TEST SYSTEM “miR-M-SCREEN” FOR PREDICTING THE DEVELOPMENT OF METASTASES IN PATIENTS WITH COLORECTAL CANCER BASED ON THE LEVEL OF miR-26a AND miR-143 MICRO-RNA IN BLOOD PLASMA | |
| CN109563548B (en) | In vitro method for identifying pancreatic cancer or intraductal papillary myxoma of pancreas | |
| KR101381894B1 (en) | Serum miRNA as a marker for the diagnosis of lymph node metastasis of gastric cancer | |
| RU2800265C1 (en) | Method of predicting the development of relapse in patients with human papillomavirus and non-muscle-invasive bladder cancer | |
| CN107674915B (en) | Application of circular RNA in colorectal cancer biomarker | |
| CN110777206B (en) | Application of LOC90024RNA and product for diagnosis, prognosis evaluation and tumor treatment | |
| Ghanbari et al. | Analysis of Previously Verified Fecal and Plasma Dow-regulated MicroRNAs in FFPE Tissue Samples of CRC Patients | |
| WO2023115601A1 (en) | Mirna detection kit for prognosis of colorectal cancer | |
| Raad et al. | Aberrant methylation of miR-125b1 in gastric cancer: A case-control study. | |
| KR20190113108A (en) | MicroRNA-3656 for diagnosing or predicting recurrence of colorectal cancer and use thereof | |
| AU2015201072B2 (en) | Plasma microRNAs for the detection of early colorectal cancer |