CN108728543A - 检测肺癌脑转移的miRNA组合及含有该组合的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测肺癌脑转移的miRNA组合及含有该组合的试剂盒，所述miRNA组合包括miR‑10b‑3p、miR‑200c‑3p、miR‑145‑5p。所述试剂盒包括上述miRNA组合的正反向引物、外参U6 RNA的正反向引物、脑脊液RNA提取系统、逆转录试剂、PCR扩增试剂、cDNA混合阴对照品和cDNA混合阳对照品。本发明采用一组miRNA作为新的肺癌脑转移标记物，将改进单一的标记物所难以克服诊断低效能包括灵敏度和特异度等；也可避免单项检测及传统检测方法出现的漏检误判。本发明提供了采用上述miRNA组合用于肺癌预后脑转移情况辅助筛查试剂盒，不仅检测方便，且定量精确，大大提高疾病检测的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以对临床肺癌脑转移风险评估有辅助作用。

Description

检测肺癌脑转移的miRNA组合及含有该组合的试剂盒
技术领域
本发明属于医学分子生物学技术领域，具体涉及检测肺癌脑转移的miRNA组合及含有该组合的试剂盒。
背景技术
近年来，随着肺癌发病率上升，诊疗技术不断发展，使患者生存期延长，肺癌脑转移的发生和诊断率也逐年升高。肺癌脑转移发生率明显高于黑色素瘤、乳腺癌、肾癌及结直肠癌，20%-65%的肺癌患者在病程中会发生脑转移，是脑转移性肿瘤中最常见的类型，其中肺腺癌发生脑转移的几率更高，占颅内转移瘤的40％-70％，隐匿性极强，其早期症状大都不明显，首发症状复杂多样，可分为两种：一种是肺癌诊断治疗后一段时间发现颅内转移；另一种先出现颅内转移，而胸部无症状。通过病理学确诊时已错过最佳治疗时间窗，影响患者的预后，导致患者生存时间显著缩短。计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）等影像学技术进行诊断也难以发现脑转移早期微小病灶，且患者受经济条件制约等因素未能接受连续的影像学检查。另有研究指出，肺癌脑转移的误诊率可高达30％-50％。首先脑血管疾病发病率远高于肿瘤脑转移，有高血压、动脉硬化的患者，肿瘤脑转移往往被忽视；其次肺癌原发灶较小或者为周围型肺癌，往往不出现呼吸系统症状，以脑转移为首发症状的肺癌，其临床表现多与脑原发性肿瘤脑血管病及脑脓肿等病相似；最后颅内转移瘤影像学的表现也多样化。。另外，由于血脑屏障的存在，致使化疗对脑转移的作用有限，恶性程度高，发展迅速。脑转移风险也随着生存的提高而上升。研究显示：局部晚期肺癌患者的生存和脑转移率呈正相关，脑转移对肺癌患者生存的危害逐渐上升。因此，随着局部和颅外远处控制的改善，对早期的肺癌患者，脑转移的早期筛查和预警至关重要。
近年来，美国国家临床生化研究院临床实验应用指南也指出应针对不同肺癌病理类型选择相应的蛋白联合抗体标记物组合；欧洲放射学会，呼吸学会也推荐7种自身抗体联合检测早期肺癌。中国肺癌脑转移诊治专家共识（2017年版）指出：腰椎穿刺及脑脊液检查脑脊液压力及细胞学检查癌细胞，或利用血清肿瘤标记物来检查抗原抗体都可作为辅助检查手段。临床资料也证实，单靠某一种标志物去诊断疾病，影响因素太多，不如联合诊断的价值大。此外，随着RNA作为肿瘤标志物的出现，提示在肿瘤发生发展过程中，RNA比受体、蛋白等出现得更早；最后，就肿瘤脑转移而言，由于血浆/血清中的RNA表达来源不明，采用血清或者血浆不能进行准确判断，而这对寻找有效的预测恶性肿瘤脑转移的标志物尤为重要。
微小RNA（miRNA）是一种小核RNA，长约22个核苷酸，不编码蛋白质，但可以与mRNA结合并在基因调控中起重要作用。大量研究表明 miRNA在肿瘤中起着促癌基因或抑癌基因的作用，在不同的恶性肿瘤中，同一条miRNA的作用可能不同。越来越多的证据支持实体肿瘤有特异的miRNA标记。单条miRNA可调控不同通路的靶基因，而单个基因也可被多个不同的miRNA调控，进而参与肿瘤的发生发展。MiRNA不仅在组织中，也在体液（血液，尿液，脑脊液）中稳定存在。脑脊液直接与中枢相连，参与脑和脊髓的物质代谢，中枢神经系统发生病变时，miRNA可从病变组织释放入脑脊液，因此脑脊液中存在大量以脑和脊髓组织为来源的miRNA，其表达改变能充分反映中枢的病变情况并且脑脊液中所含蛋白的模式比血液简单的多，miRNA 检测的干扰因素相对较少，能更好筛选标志物，便于重复和统一。
发明内容
本发明是鉴于脑脊液中miRNA肿瘤标记物组合对肺癌脑转移的早期筛查可能大有帮助，发明人前期对肺癌脑转移进行了详细研究，在中国肺癌脑转移诊治专家共识（2017年版）的基础上，克服上述问题辅助检查手段的缺点的，提供一种制备方法简单、准确性高、适用性广，能够对肺癌病人是否脑转移情况进行风险评估的miRNA组合及试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供了检测肺癌脑转移的miRNA组合，包括miR-10b-3p、miR-200c-3p、miR-145-5p，所述miRNA分子的序列号、序列、表达趋势及外参基因见表3。
用于检测肺癌脑转移的试剂盒，包括上述miR-10b-3p、miR-200c-3p、miR-145-5p的正反向引物、外参U6 RNA的正反向引物、脑脊液RNA提取系统、逆转录试剂、PCR扩增试剂、cDNA混合阴性对照品和cDNA混合阳性对照品。
优选的，所述miR-10b-3p、miR-200c-3p、miR-145-5p和外参U6 RNA的正反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示（见表5）。
优选的，本发明所述肺癌主要类型为肺腺癌。
优选的，所述cDNA混合阴性对照品的制备方法为：将50例肺癌非脑转移患者及帕金森、癫痫、偏头痛、脊髓炎、痴呆、白血病患者的脑炎等非肿瘤性神经系统疾病患者脑脊液样本提取的总RNA混合后，逆转录并稀释，得到cDNA混合阴性对照品。
优选的，所述cDNA混合阳性对照品的制备方法为：将50例肺腺癌脑转移患者脑脊液样本提取的总RNA混合后，逆转录并稀释，得cDNA混合阳性对照品。
优选的，所述脑脊液RNA提取系统包括裂解液、HiBind RNA结合柱、RNA washbuffer I、RNA wash buffer II和收集管。
优选的，所述逆转录试剂包括5× iScript Reaction Mix、iScript ReverseTranscriptase和DEPC H2O。
优选的，所述PCR扩增试剂包括5× FastStartUniversalSYBR Green Master(ROX)和DEPC H2O。
上述试剂盒在使用时预测肺癌是否出现脑转移的miRNA表达情况分4类：（1） miR-10b-3p、miR-200c-3p均阳性表达，此时不必再检测miR-145-5p，说明患者出现脑转移；（2）miR-10b-3p阴性表达、miR-200c-3p阳性表达，此时检测miR-145-5p，当miR-145-5p阳性表达时说明患者出现脑转移；（3）miR-10b-3p阴性表达、miR-200c-3p阳性表达，此时检测miR-145-5p，当miR-145-5p阴性表达时说明患者可能出现脑转移，定期复查miR-10b-3p、miR-200c-3p的表达；（4）miR-10b-3p、miR-200c-3p和miR-145-5p均阴性表达，说明患者未出现脑转移，建议定期复查。
优选的，本发明试剂盒中还含有其使用说明书。
本发明的有益效果是：
1.从脑脊液中筛选的一组在肺癌脑转移及对照组患者之间差异表达的 miRNAs，筛选出的三条miRNA组合可有效评估肺癌患者癌细胞脑转移的增殖和侵袭能力，进一步指导临床治疗。
2. 采用一组 miRNA 作为新的肺癌脑转移标记物，将改进单一的标记物所难以克服诊断低效能包括灵敏度和特异度的等；也可避免单项检测及传统检测方法出现的漏检误判。
3. 联合检测可有效提高已诊断为肺癌的此类高危人群是否脑转移的检出率。
4. 用于肺癌预后脑转移情况辅助筛查的试剂盒的制作和操作流程是基于miRNA的荧光定量PCR技术。通过荧光定量PCR法检测miRNA的表达差异，再根据miRNA表达差异辅助评估肺癌预后是否出现脑转移，不仅检测方便，且定量精确，大大提高疾病检测的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以对临床肺癌脑转移风险评估有辅助作用。
附图说明
图1为脑脊液miR-10b-3p单独诊断脑转移与对照组的ROC(Receiver operationCharacterization)曲线；
图2为脑脊液miR-200c-3p单独诊断脑转移组与对照组的ROC曲线；
图3为脑脊液miR-145-5p单独诊断脑转移组与对照组的ROC曲线；
图4为3条miRNA联合诊断脑转移组与对照组的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
实施例1
miRNA小分子标志物组合对预示肺腺癌脑转移的准确性
一、材料和方法
1、入选、排除标准及一般资料
转移组经病理组织学或细胞学确诊为肺腺癌；确诊的肺腺癌脑转移(包括不同分期、不同亚型、不同性别及不同年龄段)、入组患者具有疗前的脑磁共振或CT检查。排除合并其他原发肿瘤后收集人群的临床资料及脑脊液样本；对照组经病理组织学或细胞学确诊为肺腺癌但非转移和非肿瘤性神经系统疾病患者（帕金森、癫痫、偏头痛、脊髓炎、痴呆、白血病患者的脑炎等），同样收集人群的临床资料及脑脊液样本。所有患者均签署知情同意书。
2、主要仪器设备
立式压力蒸汽灭菌器（LDZM-60KCS，上海申安医疗器械厂），低速离心机（安徽嘉文仪器有限公司），台式离心机(德国Eppendorf公司)，水浴锅（国华有限公司），PCR仪（Bio-Rad），荧光定量PCR仪（Bio-Rad-CFX-96），核酸蛋白检测仪（美国Thermo Science公司），电泳仪（DYY-BC型，北京市六一仪器厂），涡旋机（上海康华生化仪器制造有限公司）。
3、样品采集
进行腰椎穿刺，取脑脊液5mL，放入RNase free EP管内；在留取脑脊液样本后6h之内用微离心机以3000 rpm 离心10min，清除样品中细胞和碎片，抽取上层所有清亮液体分别放入RNase free EP管内，每个管中至少放200uL，保存至-80℃冰箱。在相同时间内抽取住院患者的脑脊液，进行上述处理。在使用玻璃器皿的情况下，请使用干热灭菌，或者在0.1%DEPC溶液中，37℃下浸泡12h，然后再进行高温高压湿热灭菌（121℃，30min）。
4、脑脊液总RNA提取
（1）预处理：在较少RNase干扰的清洁区（所有用具均用1%DEPC水擦拭），把脑脊液样品解冻；
（2）移取100-200ul的脑脊液到一个无菌的离心管中；
（3）加入1ml裂解液（RNA-Solv-Reagent），涡旋彻底混合，室温孵育3min；
（4）加入0.2ml chloroform(氯仿)，盖上盖涡旋15s，冰上孵育10min；
（5）然后在4℃，12000rpm离心15min，混合物分离，底部为苯酚，中间是氯仿，上边是水相，RNA全部在水相；
（6）转移不超过80％的水相至一个EP管中，加入相同体积的70％的乙醇，涡旋混合均匀；
（7）全部样品放入HiBind RNA结合柱，并组装到一个2ml的收集管中，10000rpm离心30s；
（8）舍弃收集管中的液体然后在HiBind RNA结合柱中加500ul的RWC缓冲洗涤液，以10000rpm离心30s；
（9）把HiBind RNA结合柱放入到一个新的收集管中，在HiBind RNA结合柱中加500ul乙醇稀释过的洗涤缓冲液Ⅱ(RNA wash buffer II)， 10000rpm离心30s；
（10）清空收集管，10000rpm离心2min，去掉HiBind RNA结合柱中的水分；
（11）将HiBind RNA结合柱放到一个新的EP管中，用30ul的DEPC-treated水洗脱RNA，10000rpm离心60s。
5、样品RNA质量检测
5.1用紫外吸收法测定RNA的浓度和纯度
用NanoDrop ND-1000型分光光度计去检测RNA浓度和纯度，首先使用DEPC(焦碳酸二乙酯)水进行背景调零，搽拭干后进行样本测定，歩骤如下：
(1)滴加RNA样品至测量基座的表面；
(2)滴加的RNA样品会自动在上下基座之间形成液柱并由仪器自动完成测定，然后在电脑中自动生成相关的各种参数文件；
(3)测定结束后，RNA浓度的计算方法：260nm处读值为1表示每μL样品中有40 ng RNA；样品RNA浓度计算公式为：260nm处读值×40ng/μLRNA；纯度判定方法：吸光度OD260/OD280比值法是一种普遍采用的RNA纯度检测方法，纯的RNA浓度其OD260/OD280的比值应介于1.8～2.1，越接近2.0纯度越高；OD260/OD280的比值小于1.8或是大于2.1，说明RNA已经被污染，OD（optical density，光密度）；
(4)用柔软的擦镜纸擦去上下基座表面上的样本液，便可进行下个样品的测试。
5.2 变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性
（1）凝胶制备：称取琼脂糖1g，加水72mL，微波炉中加热溶解，直至琼脂糖溶液澄清，无细小颗粒物，并降温至60℃，加入10×MOPS电泳缓冲液10mL和37%甲醛溶液18 mL，混合均匀；
（2）配制10×MOPS电泳缓冲液：0.4M MOPS，pH70.1M乙酸钠，0.01M EDTA；
（3）胶板制备：准备好干净的凝胶板和电泳槽，将冷却好的琼脂糖凝胶液倒入凝胶板，预加样孔至少可以加入25μL溶液，室温下静置，直至凝胶完全凝固，垂直轻拔子，将凝胶板放入电泳槽内，添加足量10×MOPS电泳缓冲液至没过胶板表面2mm左右；
（4）RNA样品准备：取3μg RNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终度为10μg/mL，加热至70℃孵育15min使样品变性；
（5）加样：将样品加入胶板的样品小槽内，加样时避免碰坏样品孔周围的凝胶面；
（6）电泳：5-6V/cni电压下电泳，当溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm处时，停止电泳；
（7）紫外透射光下观察并拍照，若最大的两条条带28s RNA和18s RNA的亮度大致比为2:1时，说明RNA 的完整性较好，未出现降解现象。
6、RNA的逆转录
第一链cDNA的合成：逆转录的反应体系如表1。样品充分混匀后短离心使液体至于管底，PCR仪中进行第一步反应，65℃ 5 min，4℃降温， 42℃ 60 min，70℃ 15 min，4℃保存。合成的第一条链cDNA取出后，-20℃长期保存备用。
表1逆转录反应体系
7、荧光定量PCR分析相关miRNA的表达差异
U6基因做内参，进行PCR扩增检测模板质量，反应体系见表2。荧光定量PCR反应检测仪为Bio-Rad公司的CFX96系统，反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性15 s，55℃退火30s，72℃延伸30 s，共40次循环，溶解曲线在65~95 ℃之间。荧光定量PCR采用相对定量法，基因表达分析软件为Bio-Rad CFX manager 2.0，每一样品重复三次，利用2−△△Ct方法进行分析。
表2 荧光定量PCR反应体系(10 µL)
8、统计学分析
使用Prism5.0统计软件进行分析并作图，两组间均数的比较使用t检验，计数资料的比较采用卡方检验。两组脑脊液miRNAs的表达水平采用均数±标准差进行表示，两组数据进行F检验。用受试者工作特征曲线(ROC)和曲线下的面积(AUC)来分析miRNA的诊断能力。建立Logistic回归模型来预测3种miRNA 对肺腺癌脑转移联合诊断能力。
二、结果
脑脊液中的候选 miRNA肺腺癌脑转移组（37例）和对照组（57例）患者脑脊液标本中3条miRNA（miR-10b-3p、miR-200c-3p、miR-145-5p）中的差异表达。
1、各组miR-10b-3p、miR-200c-3p、miR-145-5p的相对表达量
miRNA的相对表达量如表4所示，其中miR-10b-3p在脑转移组和对照组中的相对表达量分别为0.15±0.04和2.15±0.6，脑转移组miR-10b-3p表达水平显著高于对照组，差异有统计学意义(F=8.89，P=0．000)。miR-200c-3p在脑转移组和对照组中的相对表达量分别为0.1±0.03和3±1.5，脑转移组miR-200c-3p表达水平显著高于对照组，差异有统计学意义(F=11.32，P=0．000)。miR-145-5p在脑转移组和对照组中的相对表达量分别为2.3±0. 2和14±4.6，脑转移组miR-145-5p的表达水平显著低于对照组，差异有统计学意义 (F=2.67，P=0．001)。
表4患者脑脊液标本中3条miRNA的差异表达
2、脑脊液中miRNA组合的ROC曲线分析
ROC曲线分析中，ROC曲线下面积越大，其诊断价值越大。AUC为0.5时，即无诊断意义；AUC在0.5～0.7时，表示诊断准确率较低；AUC在0.7～0.9时，表示诊断准确性中等；AUC＞0.9时，表示诊断有较高的准确性。
基于脑转移组和对照组患者脑脊液中miR-10b-3p、miR-200c-3p、miR-145-5p的表达，（ROC）曲线分析分别为：(a) miR-10b-3p的曲线下面积（AUC）为0.9352（标准误为0.02520，95%CI，0.8858-0.9846）；(b) miR-200c-3p的AUC为0.8888（标准误为0.03240，95%CI，0.8253-0.9523）；（c）miR-135-3p的AUC为0.8952（标准误为0.03184，95%CI，0.8328 -0.9576），见图1-3。
在独立样品集中的进一步验证联合miR-10b-3p、miR-200c-3p、miR-145-5p用于诊断肺腺癌脑转移的准确度高达90％以上，具有较高的临床价值，见图4。
三、结论
本发明的试剂盒在使用时预测肺癌是否出现脑转移的miRNA表达情况分4类：（1） miR-10b-3p、miR-200c-3p均阳性表达，此时不必再检测miR-145-5p，说明患者出现脑转移；（2）miR-10b-3p阴性表达、miR-200c-3p阳性表达，此时检测miR-145-5p，当miR-145-5p阳性表达时说明患者出现脑转移；（3）miR-10b-3p阴性表达、miR-200c-3p阳性表达，此时检测miR-145-5p，当miR-145-5p阴性表达时说明患者可能出现脑转移，定期复查miR-10b-3p、miR-200c-3p的表达；（4）miR-10b-3p、miR-200c-3p和miR-145-5p均阴性表达，说明患者未出现脑转移，建议定期复查。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
表3 MiRNA组合的序列，表达趋势及参考基因
表5 miRNAs 荧光PCR引物序列

Claims (9)

1.检测肺癌脑转移的miRNA组合，其特征在于，包括miR-10b-3p、miR-200c-3p、miR-145-5p。
2. 用于检测肺癌脑转移的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的miR-10b-3p、miR-200c-3p、miR-145-5p的正反向引物、外参U6 RNA的正反向引物、脑脊液RNA提取系统、逆转录试剂、PCR扩增试剂、cDNA混合阴性对照品和cDNA混合阳性对照品。
3. 根据权利要求2所述用于检测肺癌脑转移的试剂盒，其特征在于，所述miR-10b-3p、miR-200c-3p、miR-145-5p和外参U6 RNA的正反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示。
4.根据权利要求2所述用于检测肺癌脑转移的试剂盒，其特征在于，所述cDNA混合阴性对照品的制备方法为：将肺癌非脑转移患者及非肿瘤性神经系统疾病脑脊液样本提取的总RNA混合后，逆转录并稀释，得到cDNA混合阴性对照品。
5.根据权利要求2所述用于检测肺癌脑转移的试剂盒，其特征在于，所述cDNA混合阳性对照品的制备方法为：将肺腺癌脑转移患者脑脊液样本提取的总RNA混合后，逆转录并稀释，得cDNA混合阳性对照品。
6. 根据权利要求2所述用于检测肺癌脑转移的试剂盒，其特征在于，所述脑脊液RNA提取系统包括裂解液、HiBind RNA结合柱、RNA wash buffer I、RNA wash buffer II和收集管。
7. 根据权利要求2所述用于检测肺癌脑转移的试剂盒，其特征在于，所述逆转录试剂包括5× iScript Reaction Mix、iScript Reverse Transcriptase和DEPC H2O。
8. 根据权利要求2所述用于检测肺癌脑转移的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂包括5× FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)和DEPC H2O。
9. 根据权利要求2-8任意一项所述用于检测肺癌脑转移的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒在使用时预测肺癌是否出现脑转移的miRNA表达情况分4种：（1） miR-10b-3p、miR-200c-3p均阳性表达，此时不必再检测miR-145-5p，说明患者出现脑转移；（2）miR-10b-3p阴性表达、miR-200c-3p阳性表达，此时检测miR-145-5p，当miR-145-5p阳性表达时说明患者出现脑转移；（3）miR-10b-3p阴性表达、miR-200c-3p阳性表达，此时检测miR-145-5p，当miR-145-5p阴性表达时说明患者可能出现脑转移，定期复查miR-10b-3p、miR-200c-3p的表达；（4）miR-10b-3p、miR-200c-3p和miR-145-5p均阴性表达，说明患者未出现脑转移，建议定期复查。
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