CN109837326A

CN109837326A - 基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测方法

Info

Publication number: CN109837326A
Application number: CN201910044245.7A
Authority: CN
Inventors: 周国宝; 李蕾; 卢星
Original assignee: Jiaxing University
Current assignee: Jiaxing University
Priority date: 2019-01-17
Filing date: 2019-01-17
Publication date: 2019-06-04
Anticipated expiration: 2039-01-17
Also published as: CN109837326B

Abstract

本发明公开了一种基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测方法，属于生物检测技术领域。所述检测方法包括：往待测溶液中加入识别探针，对目标生物靶标分子识别结合并释放引发序列，引发序列打开发夹探针发生杂交链式反应，再加入辅助探针，封闭未参与反应的发夹探针，然后将金界面上自组装有捕获探针的载体置于反应溶液中，将杂交链反应产物捕获到金片上，最后分析金界面上的信号标记变化，进而计算出待测样本中目标生物靶标分子的含量。本发明通过杂交链式反应形成多支杂交链式反应产物，再利用界面多价捕获，信号放大输出，进而实现靶标分子的检测；在辅助探针帮助下，提高传感界面捕获杂交链式反应产物的效率，提高检测灵敏度。

Description

基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测方法及用于液体活检中外泌体、药物/生物小分子、DNA、RNA、生物体内金属离子、抗原、抗体、酶和细胞中的精准分析检测。

背景技术

外泌体是细胞间通讯的重要载体，肿瘤细胞分泌的外泌体，与肿瘤的发生发展、逃逸免疫、建立微环境等方面密切相关。外泌体在肿瘤的治疗与诊断方面均扮演着重要的角色。外泌体的诊断研究仍处于临床早期，近年来，基于外泌体的富集检测研究已成为液体活检的重点领域之一，肿瘤组织分泌的外泌体携带了丰富的肿瘤标志物，特异性识别捕获外泌体的同时，分析外泌体内mRNA，DNA，蛋白等肿瘤标志物，对于肿瘤的早期诊断、个体化治疗反馈和病理学研究都具有十分重要的意义。在肿瘤发生发展早期，外泌体相比循环肿瘤细胞(10毫升血液只有几个到几十个循环肿瘤细胞)的丰度更高，更容易被准确检测。比如每个恶性胶质肿瘤细胞，在24小时内可以分泌3500-6500个外泌体。此外，外泌体中的肿瘤标志物mRNA，DNA等被磷脂膜保护，防止被DNA酶和RNA酶降解，在生物复杂环境中可以稳定存在，因此外泌体更加适合作为肿瘤早期诊断的标志物。但是，由于正常细胞、良性和恶性肿瘤细胞都可以分泌大量外泌体，从复杂的血清、血液样本中高效分离出高纯度的癌症关联外泌体仍面临极大的技术挑战，且当前对捕获的外泌体后续分析手段缺乏简单高效的检测方法。当前常用的超速离心、超滤等物理方法从复杂临床样本获得的外泌体存在的最大缺陷是纯度低，且外泌体来自多种细胞所分泌；而利用纳米技术等方法提高外泌体检测特异性时，存在检测方法需要复杂昂贵的设备，检测过程复杂繁琐等等。

此外，当前发展的外泌体检测方法应用到临床样本分析检测时，外泌体检测灵敏度显著降低甚至无法实现有效检测。分析复杂组分内的外泌体时需要预先除去其它大量干扰生物分子(如细胞，蛋白等)，或者需要将复杂组分用缓冲溶液稀释数倍，造成外泌体被极大的稀释，不利于简便、准确分析。直接分析复杂组分特别是临床血清、血液样本时仍存在以下几个方面的困难：

1.复杂组分中含有大量外泌体以外的生物分子，会干扰识别分子与外泌体间的相互作用，同时生物分子非特异性吸附在界面时进一步阻碍外泌体的识别，严重影响捕获外泌体的速率和效率。

2.生物分子非特异性吸附会干扰检测信号的输出，造成外泌体检测信号输出困难。

3.一些识别分子如核酸适配体，在复杂组分中容易被酶切逐步降解，失去外泌体识别捕获功能。

4.现有组装连接识别分子时不能很好的保持其生物活性，界面上识别探针仍存在很多缺陷，如识别探针间拥挤造成的空间位阻、识别分子自身的聚集、以及探针方向性差等等，最终导致识别探针活性位点被掩盖，极大的降低了识别外泌体的能力。

5.为了提高在复杂样品中外泌体检测的灵敏度，常采用酶催化和DNA纳米技术(如链式杂交反应放大，滚环放大等)等放大输出的检测信号，然而这些方法均存在检测步骤繁琐的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测方法，以解决传统杂交链式反应在靶标分析中的部分缺陷，如外泌体捕获效率和检测灵敏度相对较低、链式反应杂交效率差、实验步骤繁琐等。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测方法，包括以下步骤：

(1)合成识别探针：设计组成核酸框架的4条探针A、B、C、D，自组装形成核酸框架结构FNAs/apt，其中A包含特异性识别并结合目标生物靶标分子的核酸适配体序列apt，B包含与apt的部分序列互补的a序列；

(2)合成发夹探针、辅助探针及捕获探针：根据a序列设计发夹探针H1和H2，H1包括H1b、H1a’、H1c三个部分，其中H1a’的部分序列与H1c的部分序列互补成双链作为H1发夹结构的茎部，H1a’为a序列的互补序列；H2包括H2a和H2c’两个部分，其中H2a的部分序列和H2c’的部分序列互补成双链作为H2发夹结构的茎部，H2a与H1a’互补，H2c’与H1c互补，

根据H1序列设计辅助探针blocker，blocker包括b1和b2，b1与H1b的部分序列互补，b2与H1a’的部分序列互补，

根据H1序列设计捕获探针，设计组成核酸框架的4条探针E、F、G、H，自组装形成核酸框架结构，其中E包含与H1b互补的Eb’序列；

或者，H1包括H1a’和H1c两个部分，其中H1a’的部分序列与H1c的部分序列互补成双链作为H1发夹结构的茎部，H1a’为a序列的互补序列；H2包括H2b、H2a和H2c’三个部分，其中H2a的部分序列和H2c’的部分序列互补成双链作为H2发夹结构的茎部，H2a与H1a’互补，H2c’与H1c互补，

根据H2序列设计辅助探针blocker，blocker包括b1和b2，b1与H2b的部分序列互补，b2与H2a的部分序列互补，

根据H2序列设计捕获探针，设计组成核酸框架的4条探针E、F、G、H，自组装形成核酸框架结构，其中E包含与H2b互补的Eb’序列；

所述H1或H2上修饰有信号标记；

(3)基于杂交链式反应多价捕获进行生物靶标分子检测：往待测溶液中加入识别探针FNAs/apt、发夹探针H1、H2，混合，室温下反应，形成杂交链反应产物，再加入辅助探针blocker，然后将金界面上自组装有捕获探针的载体置于反应溶液中，将杂交链反应产物捕获到金片上，最后分析金界面上的信号标记变化，进而计算出待测样本中目标生物靶标分子的含量。

本发明检测方法的原理如下：

在目标生物靶标分子存在下，识别探针FNAs上的适配体序列apt识别结合生物靶标分子形成二级结构，与适配体序列互补的a序列释放，可以识别打开H1的发夹结构从而引发杂交链式反应，H1粘性末端方向延长10-16个碱基(H1b)，使杂交链式直链产物变为多支长链产物，通过多支单链与传感界面上组装的捕获探针杂交，可以高效的将连有多个HCR产物的生物靶标分子(生物靶标分子膜表面的特异性识别蛋白均可以引发HCR)多价捕获于界面。

由于未反应完全的H1也可以与传感界面探针杂交，与HCR多价杂交产生竞争，为了提高传感界面单步多价捕获效率，同时降低因捕获未反应H1而产生的背景信号，在此创新性的设计了一条blocker辅助探针，用于与H1粘性末端靠近茎部分的部分碱基杂交，在最优设计下，blocker与H1杂交后，完全阻止了未参与反应的H1被捕获于传感界面，而blocker与HCR产物中的H1互补部分序列杂交较为困难，这是因为H1中与blocker互补的部分碱基参与到了杂交链式反应中，形成了稳定的长双链。

在各发卡探针上修饰荧光信号标记或电化学信号标记，界面的信号增量与靶标的浓度正相关，根据荧光强度或电化学信号判断核酸浓度。通过构建标准检测曲线，实现未知样品靶标浓度检测。

由于杂交链式反应是在溶液体系中进行，使得链式反应杂交效率显著提升，再通过多价捕获方式高效地将杂交反应产物捕获到传感界面上，通过分析信号标记变化实现超灵敏外泌体检测。

针对发夹探针的设计，在传统发夹结构H1的粘性末端伸出了部分序列，并引入了传统HCR体系中没有的blocker辅助探针，具体地：H1包括H1b、H1a’、H1c三个部分，其中H1b部分序列与传感界面探针互补，H1a’的部分序列与H1c的部分序列互补成双链作为H1发夹结构的茎部，H1a’为a序列的互补序列；H2包括H2a和H2c’两个部分，其中H2a的部分序列和H2c’的部分序列互补成双链作为H2发夹结构的茎部，H2a与H1a’互补，H2c’与H1c互补；根据H1b、H1a’的部分序列设计辅助探针blocker，与H1b和H1a’部分碱基杂交；

识别探针与生物靶标分子结合后释放引发序列a，通过H1粘性末端链取代打开H1，打开H1后暴露出茎部的H1c打开H2，打开H2后暴露出茎部的H2a打开H1，如此循环反复引发HCR反应。在H1或H2修饰信号标记，在blocker辅助下，实现靶标单步多价捕获并放大检测。

同理，也可以在发夹结构H2的粘性末端伸出了部分序列，相应地调整H1、blocker辅助探针，同样能实现靶标单步多价捕获并放大检测。

基于上述发夹探针的设计，本发明提供的检测方法可以在一个反应体系中进行，只需与传感界面一步孵育即可实现靶标的识别、界面多价捕获及信号放大输出，相比传统使用HCR的靶标检测方法，大大简化了检测步骤，具有潜在的临床样品检测应用前景。本发明研究表明，在没有目标外泌体存在时，两个发夹探针在杂交溶液中能保持自身稳定性。

所述目标生物靶标分子为外泌体、DNA、RNA、药物/生物小分子、生物体内金属离子、抗原、抗体、酶或肿瘤细胞。本发明提供的检测方法除了检测外泌体，还可以检测其他生物靶标分子，识别探针通过核酸适配体或核酸酶与肿瘤细胞或生物体内金属离子识别结合后释放出引发序列，引发杂交链式反应。识别探针采用核酸框架结构可以提高识别分子在复杂生物环境中的稳定性和识别活性，提高目标生物靶标分子的捕获检测效率。本发明中构成核酸框架的四条探针A、B、C、D均包含相互杂交的序列，使其自组装成核酸框架。

识别探针(FNAs/apt)、发夹探针(H1、H2)、辅助探针(blocker)和捕获探针可以为DNA、RNA、肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)。

核酸框架探针也可以为单双链探针或其它纳米结构探针。

本领域技术人员可以根据具体情况对H1、H2、blocker序列进行替换、缺失或添加碱基等设计操作，同等达到上述单步多价捕获生物靶标并放大检测。

作为优选，a序列长度为20-28nt，H1a’、H1c、H2a、H2c’序列长度均为20-28nt，H1b或H2b、blocker序列长度均为10-16nt。

更为优选，H1b或H2b、blocker辅助探针的长度为12nt，H1a’、H1c、H2a、H2c’序列长度均为24nt，其中发卡结构的茎部序列长度为18bp。

作为优选，所述的信号标记为生物素或荧光基团。

检测方法中对于杂交溶液的缓冲体系没有特定要求，通常为高盐、中性稍偏碱性的缓冲条件，该条件有利于杂交反应。作为优选，步骤(1)中，所述的含有目标外泌体的溶液的缓冲体系为SPSC溶液。SPSC溶液组成为：50mM Na₂HSO₄/NaH₂SO₄，1M NaCl，pH 7.5。

作为优选，FNAs/apt、H1、H2的工作浓度为1nM-20μM。

当H1或H2上标记有生物素(biotin)时，杂交链反应结束，往反应溶液中加入过量辣根过氧化物酶修饰的链霉亲和素(SA-HRP)，与多支杂交链反应产物中的生物素结合，再将传感界面上自组装有FNAs-SH探针的金电极置于反应溶液中单步孵育多价捕获链式杂交反应产物，然后将金电极取出充分清洗后置于含双氧水的TMB底物溶液中，检测辣根过氧化物酶催化TMB还原而产生催化还原电流。催化还原电流与电极界面的辣根过氧化物酶数量正相关，同时辣根过氧化物酶数量与目标生物靶标分子正相关，因此可以通过检测催化还原电流变化定量分析待测溶液中目标生物靶标分子。具体地，绘制标准曲线，进而根据标准曲线进行定量分析。

作为优选，在100μL含有待测样本的SPSC溶液中加入100nM的FNAs/apt、H1和H2，室温下反应1h，接着在反应体系中加入100nM blocker与2.5μg/mL SA-HRP，然后室温下与传感界面捕获探针杂交0.5小时。在上述条件下，可获得最佳信噪比。

当H1或H2上标记有FAM荧光基团时，作为优选，在100μL含有待测样本的SPSC溶液中加入100nM的FNAs/apt、H1和H2，室温下反应1h，接着在反应体系中加入100nMblocker，室温与传感界面捕获探针杂交1小时。在上述条件下，可获得最佳信噪比。通过传感界面荧光信号强度实现目标生物靶标分子检测。

本发明还提供了一种基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测传感器，包括：

识别探针，由四条探针A、B、C、D自组装形成的核酸框架结构FNAs/apt，其中A包含特异性识别并结合目标生物靶标分子的核酸适配体序列apt，B包含与apt的部分序列互补的a序列；

发夹探针，包括H1和H2，H1包括H1b、H1a’、H1c三个部分，其中H1a’的部分序列与H1c的部分序列互补成双链作为H1发夹结构的茎部，H1a’为a序列的互补序列；H2包括H2a和H2c’两个部分，其中H2a的部分序列和H2c’的部分序列互补成双链作为H2发夹结构的茎部，H2a与H1a’互补，H2c’与H1c互补；

或者H1包括H1a’和H1c两个部分，其中H1a’的部分序列与H1c的部分序列互补成双链作为H1发夹结构的茎部，H1a’为a序列的互补序列；H2包括H2b、H2a和H2c’三个部分，其中H2a的部分序列和H2c’的部分序列互补成双链作为H2发夹结构的茎部，H2a与H1a’互补，H2c’与H1c互补；

所述H1或H2的5’端标记有生物素或荧光基团；

辅助探针，与H1b的部分序列以及H1a’的部分序列互补；或者与H2b的部分序列以及H2a的部分序列互补；

金界面上自组装有捕获探针的电极或芯片，所述捕获探针具有与H1b或H2b互补配对的序列。

杂交链式产物通过多价捕获到任意传感界面，除了上述的电化学传感器和荧光传感器，本发明提出的杂交链式反应技术也可以应用到其他传感领域，比如：SPR、微天平、表面荧光增强、拉曼等界面传感领域。

上述检测传感器的缓冲体系采用SPSC溶液。

作为优选，识别探针(FNAs/apt)、发夹探针(H1、H2)、辅助探针(blocker)和捕获探针(FNAs-SH)可以为DNA、RNA、肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)。

作为优选，所述捕获探针由四条探针E、F、G、H自组装形成核酸框架结构，其中E包含与H1b或H2b互补的Eb’序列，F、G、H均有巯基修饰。E、F、G、H均包含相互杂交的序列，可自组装成核酸框架。

具体地，当目标生物靶标分子为乳腺癌细胞分泌外泌体时，以外泌体膜表面上皮细胞粘附分子为特异性识别目标时，apt的序列如SEQ ID NO.1所示，H1的序列如SEQ IDNO.2所示，H2的序列如SEQ ID NO.3所示，辅助探针的序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明具备的有益效果：

(1)本发明提供的检测方法中杂交链式反应在溶液中进行，显著提高杂交链式反应效率；通过设计其中一条发夹探针，在其粘性末端方向延长10-16个碱基，形成多支杂交链式反应产物，通过多价杂交捕获的方式高效地将反应产物捕获到界面上，信号放大输出，通过分析信号标记实现超灵敏核酸检测。

(2)在blocker辅助探针帮助下，封闭未参与反应的发夹探针，提高传感界面捕获杂交链式反应产物的效率，提高检测灵敏度。

(3)识别探针采用核酸框架纳米材料，可以提高识别分子在复杂生物环境中的稳定性和识别活性，提高目标生物靶标分子的捕获检测效率。

(4)本发明提供的方法操作简便，可以应用到实时检测传感器，解决了传统方法步骤繁琐、费时费力的缺陷，该技术提供的生物靶标检测传感器具有市场商品化前景。

附图说明

图1为运用NUPACK软件模拟不同长度blocker与H1杂交情况，其中A为10nt、B为12nt、C为14nt。

图2为运用NUPACK软件模拟不同长度blocker与HCR产物上H1杂交情况，其中A为10nt、B为12nt、C为14nt。

图3为通过NUPACK软件模拟得到的blocker分别与H1和HCR产物上H1杂交百分比。

图4为单步多价捕获外泌体并放大检测电化学传感原理示意。

图5为分离提取外泌体透射电镜图。

图6为有无生物靶标存在时，链式反应杂交验证。

图7为电化学催化放大检测目标外泌体，(A)电化学催化检测0和10⁸个目标外泌体时的循环伏安曲线；(B)电化学催化检测0和10⁸个目标外泌体时的i-t曲线。

图8为blocker长度优化，获得最佳外泌体捕获效率和检测检测灵敏度。

图9为电化学催化放大检测外泌体标准曲线，稳定催化电流与外泌体数目在0-10000个间呈线性关系，外泌体个数与信号换算关系式为：Y＝0.094X+65.4，其中X为外泌体个数，Y为测得的电催化稳定电流值，单位nA。

图10为单步多价捕获外泌体并放大检测荧光传感原理示意。

图11为检测0(A)和10⁸(B)个目标外泌体时传感界面的荧光强度。

图12为利用单步电化学传感在50％血清中检测外泌体，稳定催化电流与外泌体数目在0-10000个间呈线性关系，外泌体个数与信号换算关系式为：Y＝0.083X+42.3，其中X为外泌体个数，Y为测得的电催化稳定电流值，单位nA。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明的特色和优点，所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

实施例1

基于单步多价捕获并放大检测外泌体

1、识别探针设计：设计组成核酸框架的4条探针A、B、C、D，其中A、B、C、D包含序列相互杂交形成核酸框架结构FNAs/apt；

根据检测目标乳腺癌关联外泌体膜表面含有上皮细胞粘附分子，A包括能特异性识别结合上皮细胞粘附分子的核酸适配体序列Aapt，B包括Ba，其中Ba全序列或部分序列能与Aapt杂交。核酸框架等DNA三维纳米结构在复杂生物环境中具有一定的抗酶降解能力，有利于提高所载带的识别探针在复杂生物样本中的稳定性，提高对生物靶标的识别结合能力。核酸框架上可以设计1个或多个识别分子，在此以设计两个识别分子为例。

2、发卡探针与辅助探针设计：在经典杂交链式反应序列基础上，根据检测目标外泌体膜表面特异性识别蛋白选择核酸适配体，根据与核酸适配体互补的Ba序列并结合NUPACK软件设计相关发卡探针，辅助探针根据H1或H2粘性末端伸出链设计，用于辅助实现单步多价杂交捕获。

3、捕获探针设计：设计组成核酸框架的4条探针E、F、G、H，F、G、H均有巯基(SH)修饰，其中E、F、G、H包含序列相互杂交形成核酸框架结构FNAs/SH；E包括Eb’，其中Eb’与H1b互补；

委托生工生物工程股份有限公司(上海)合成与修饰相关核酸序列

DNA探针浓度使用紫外分光光度计准确定量，A、B、C、D用TM缓冲液(20mM tris，50mM MgCl₂，pH 8.0)稀释成1μM用于合成FNAs/apt，E、F、G、H用TM缓冲液(20mM tris，50mMMgCl₂，pH 8.0)稀释成1μM用于合成FNAs-SH，发卡探针用SPSC缓冲液(50mMNa₂HSO₄/NaH₂SO₄，1M NaCl，pH 7.5)将所有发卡探针稀释成5μM，上述探针溶液在PCR中95℃保持10min，快速降温至4℃，形成核酸框架结构和稳定的发卡结构。

表1使用的DNA探针序列

图1用NUPACK软件分析了不同长度blocker与H1(blocker长度改变时，H1粘性末端伸出的碱基数也发生改变)发卡结构的杂交情况，当blocker碱基数目增加时，blocker与H1杂交效率逐渐增加。

图2用NUPACK软件分析了不同长度blocker与HCR产物中H1的杂交情况，当blocker碱基数目增加时，blocker与HCR产物中H1杂交效率逐渐增加。

图3根据图1和图2总结了不同长度blocker分别与H1和HCR产物中H1的杂交百分比，随着blocker长度的增加，blocker与H1和HCR产物H1伸出链的杂交能力逐渐增强，当blocker碱基数从12个增加到14个碱基时，与HCR产物H1伸出链的杂交效率太高阻止了HCR产物在界面的捕获，而blocker为10个碱基时，虽然与HCR产物H1伸出链的杂交效率最低，但是HCR产物H1伸出链中10碱基与传感界面的杂交效率低于blocker为12个碱基时，因此，对于所设计的序列模拟情况，blocker碱基数为12个时可获得最佳的单步多价捕获效率。

图4为单步多价捕获外泌体并电化学放大检测原理流程图，100μL含外泌体溶液中含有100nM的FNAs/apt，H1和H2-biotin，核酸框上核酸适体与外泌体膜表面的上皮细胞粘附分子特异性识别后，引发链释放而引发H1和H2发生链式杂交反应。为了实现与传感界面一步孵育和清洗即可达成外泌体捕获和检测，引入了一条12个碱基的Blocker(100nM)用于封闭过量的H1避免其被传感界面捕获。H2上生物素能够共价连接链霉亲和素修饰的辣根过氧化酶，当双氧水和TMB共同存在下，辣根过氧化酶可以在电极界面催化双氧水还原生成催化电流，从而输出相应电化学检测信号，电化学信号由外泌体数量决定，从而通过电化学信号定量分析外泌体。

图5用投射电镜对分离提取的外泌体进行了成像，其尺寸在外泌体(30-150nm)尺寸范围内。

在传感分析外泌体前，先使用凝胶电泳验证了有无生物靶标存在时，链式反应杂交情况，从图6可见，当有生物靶标存在时，可以高效的引发H1和H2进行链式杂交反应获得多支长链用于多价捕获外泌体和放大检测。

由图7可见，约10¹⁰个目标外泌体存在时，其循环伏安曲线中，相比无目标外泌体存在时有一个明显的还原峰(图7(A))，稳定催化还原电流(5565nA)远远大于背景信号(63.1nA)(图7(B))。

图8验证了最优blocker碱基数为12个，根据图4中外泌体检测步骤，blocker碱基数为12个时获得外泌体检测最佳信噪比。

图9验证了样品中外泌体数目与输出的电化学催化信号在1-10000个间呈正比，外泌体个数与信号换算关系式为：Y＝0.094X+65.4，其中X为外泌体个数，Y为测得的电催化稳定电流值，单位nA。

实施例2

基于单步多价捕获外泌体并放大荧光信号检测

检测探针的设计：将H2上生物素修饰改为荧光基团修饰，其余序列均保持一致。

图10为单步多价捕获外泌体并荧光放大检测原理流程图，使用荧光成像验证一步实现靶标识别，多价捕获与信号放大输出。浓度均为100nM(终浓度)的FNAs/apt，H1和H2-biotin加入到10¹⁰个目标外泌体(总体积为100μL)中，引发链式杂交反应后，每个链式产物上均有多支单链结构，在blocker探针辅助下，可以实现金片界面单步多价捕获外泌体，通过荧光显微镜对金片成像输出相应荧光信号，目标物浓度越高，金界面的荧光强度越强。

图11中荧光成像结果分别为0nM(A)和10¹⁰(B)个外泌体引发链式杂交反应，含有10¹⁰个目标物的金界面荧光强度显著增加。此处只是对提出方法的示范检测与验证，并没有通过此方法详细研究核酸的检测性能。若结合具有荧光增强的金芯片以及微阵列点样技术，可以进一步提高核酸检测的灵敏度并实现高通量分析测试。

实施例3

血清中基于单步多价捕获并放大检测外泌体

在血清中检测外泌体时，血清中的DNA酶会降解识别探针降低生物靶标检测效率，DNA纳米结构的使用，以及多个识别探针在同一DNA纳米结构上的设计有利于提高识别探针的稳定性以及与外泌体识别结合的效率。此外，由于大量非靶标以外的生物分子干扰，以及杂交所需的盐离子浓度降低，杂交链式反应的效率降低。为了提高血清中杂交链式反应效率，75μL血清中加入25μL 2*SPSC缓冲溶液。血清中有大量的白蛋白，可以起到封闭的作用，防止辣根过氧化物酶在电极界面的吸附，降低了背景信号，因此在75％血清中检测外泌体时获得了与在缓冲液中相当的检测灵敏度。

图12结果为血清中外泌体数目与输出的电化学催化信号在1-10000个间呈正比，外泌体个数与信号换算关系式为：Y＝0.083X+42.3，其中X为外泌体个数，Y为测得的电催化稳定电流值，单位nA。

序列表

<110> 嘉兴学院

<120> 基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cactacagag gttgcgtctg tcccacgttg tcatgggggg ttggcctg 48

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cactggatcg gttgcgtctg tcccacgttg tcatggcaaa gtccatgaca acgtgggaca 60

<210> 3

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccatgacaac gtgggacaga cgcatccttc ctcttccgac acgacctttg tcccacgttg 60

tcatggactt tg 72

<210> 4

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggttaaaccg at 12

<210> 5

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cactacagag gttgcgtctg tcccacgttg tcatgggggg ttggcctgtt ttttttttct 60

caactgcctg gtgatacgag gatgggcatg ctcttcccga cggtattgga ccctcgcatg 120

<210> 6

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccatgacaac gtgggacaga cgcatttttt tttttttttc gtgtagcaag ctgtaatcga 60

cgggaagagc atgcccatcc actactatgg cgggtgataa a 101

<210> 7

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cactacagag gttgcgtctg tcccacgttg tcatgggggg ttggcctgtt ttttttttcg 60

attacagctt gctacacgat tcagacttag gaatgttcga catgcgaggg tccaataccg 120

<210> 8

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccatgacaac gtgggacaga cgcatttttt tttttttttc gtatcaccag gcagttgaga 60

cgaacattcc taagtctgaa atttatcacc cgccatagta g 101

<210> 9

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

accgatccag tgtttttttt tttttttttt ctcaactgcc tggtgatacg aggatgggca 60

tgctcttccc gacggtattg gaccctcgca tg 92

<210> 10

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgtgtagcaa gctgtaatcg acgggaagag catgcccatc cactactatg gcgggtgata 60

aa 62

<210> 11

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgattacagc ttgctacacg attcagactt aggaatgttc gacatgcgag ggtccaatac 60

cg 62

<210> 12

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgtatcacca ggcagttgag acgaacattc ctaagtctga aatttatcac ccgccatagt 60

ag 62

Claims

1.一种基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述H1或H2上修饰有信号标记；

2.如权利要求1所述的基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测方法，其特征在于，所述目标生物靶标分子为外泌体、DNA、RNA、药物/生物小分子、生物体内金属离子、抗原、抗体、酶或肿瘤细胞。

3.如权利要求1所述的基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测方法，其特征在于，a序列长度为20-28nt，H1a’、H1c、H2a、H2c’序列长度均为20-28nt，H1b或H2b、blocker序列长度均为10-16nt。

4.如权利要求1所述的基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测方法，其特征在于，所述的信号标记为生物素或荧光基团。

5.如权利要求1所述的基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测方法，其特征在于，所述待测溶液的缓冲体系为SPSC缓冲溶液。

6.如权利要求1所述的基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测方法，其特征在于，步骤(3)中，FNAs/apt、H1、H2、blocker的工作浓度为1nM-20μM。

7.一种基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测传感器，其特征在于，包括：

所述H1或H2的5’端标记有生物素或荧光基团；

8.如权利要求7所述的基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测传感器，其特征在于，识别探针、发夹探针、辅助探针和捕获探针为DNA、RNA、肽核酸或锁核酸。

9.如权利要求7所述的基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测传感器，其特征在于，所述捕获探针由四条探针E、F、G、H自组装形成核酸框架结构，其中E包含与H1b或H2b互补的Eb’序列，F、G、H均有巯基修饰。

10.如权利要求7所述的基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测传感器，其特征在于，当目标生物靶标分子为乳腺癌细胞分泌外泌体时，以外泌体膜表面上皮细胞粘附分子为特异性识别目标，apt的序列如SEQ ID NO.1所示，H1的序列如SEQ ID NO.2所示，H2的序列如SEQ ID NO.3所示，辅助探针的序列如SEQ ID NO.4所示。