CN104661664A - 手性控制 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及手性控制的寡核苷酸、手性控制的寡核苷酸组合物以及其制备和使用方法。本发明具体来说涵盖鉴定用于制备手性寡核苷酸的现有方法的某些问题的来源，包括阻止制备完全手性控制的组合物、尤其是包含多种寡核苷酸类型的组合物的问题。在一些实施方案中，本发明提供手性控制的寡核苷酸组合物。在一些实施方案中，本发明提供制备手性控制的寡核苷酸和手性控制的寡核苷酸组合物的方法。

Description

手性控制
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年7月13日提交的美国临时申请续号61/671,655、2012年7月13日提交的美国临时申请续号61/671,656、2012年7月14日提交的美国临时申请续号61/671,722以及2012年7月14日提交的美国临时申请续号61/671,724的优先权，所述临时申请各自以引用的方式整体并入本文。
发明背景
寡核苷酸适用于治疗、诊断、研究以及纳米材料应用中。天然存在的核酸(例如未修饰的DNA或RNA)用于治疗的用途可例如由于它们针对细胞外和细胞内核酸酶的不稳定性和/或它们的不良细胞渗透性和分布而受限制。另外，体外研究已显示反义寡核苷酸的性质，如结合亲和力、结合互补RNA的序列特异性(Cosstick和Eckstein，1985；LaPlanche等，1986；Latimer等，1989；Hacia等，1994；Mesmaeker等，1995)和对核酸酶的稳定性可受磷原子的绝对立体化学构型影响(Cook等US005599797A)。因此，对新型和改进寡核苷酸组合物存在需要。
发明概述
本发明涵盖以下认识：对手性控制的寡核苷酸组合物和其合成的新方法存在需要。本发明明确涵盖鉴定用先前方法制备手性寡核苷酸的某些问题的来源，所述问题包括阻止制备完全手性控制的组合物，特别是包含多种寡核苷酸类型的组合物的问题。
在一些实施方案中，本发明提供手性控制的寡核苷酸组合物。
在一些实施方案中，本发明提供制备手性控制的寡核苷酸和手性控制的寡核苷酸组合物的方法。
在一些实施方案中，本发明提供使用手性控制的寡核苷酸和手性控制的寡核苷酸组合物的方法。
本申请中引用的所有出版物和专利文件都以引用的方式整体并入本文。
定义
脂族：如本文所用的术语“脂族”或“脂族基团”是指直链(即未分支)或分支、取代或未取代的完全饱和或含有一个或多个不饱和单元的烃链，或完全饱和或含有一个或多个不饱和单元、但不是芳族、与分子的其余部分具有单一连接点的单环烃或双环或多环烃(在本文中也称为“碳环”、“环脂族”或“环烷基”)。在一些实施方案中，脂族基团含有1-50个脂族碳原子。除非另外规定，否则脂族基团含有1-10个脂族碳原子。在一些实施方案中，脂族基团含有1-6个脂族碳原子。在一些实施方案中，脂族基团含有1-5个脂族碳原子。在其它实施方案中，脂族基团含有1-4个脂族碳原子。在其它实施方案中，脂族基团含有1-3个脂族碳原子，并且在其它实施方案中，脂族基团含有1-2个脂族碳原子。在一些实施方案中，“环脂族”(或“碳环”或“环烷基”)是指完全饱和或含有一个或多个不饱和单元、但不是芳族、与分子的其余部分具有单一连接点的单环或双环C3-C10烃。在一些实施方案中，“环脂族”(或“碳环”或“环烷基”)是指完全饱和或含有一个或多个不饱和单元、但不是芳族、与分子的其余部分具有单一连接点的单环C3-C6烃。适合的脂族基团包括但不限于直链或分支、取代或未取代的烷基、烯基、炔基以及其杂合物，如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。
亚烷基：术语“亚烷基”是指二价烷基。“亚烷基链”是聚亚甲基，即-(CH2)n-，其中n是正整数，优选是1至6、1至4、1至3、1至2、或2至3。取代的亚烷基链是其中一个或多个亚甲基氢原子被取代基置换的聚亚甲基。适合的取代基包括以下对于取代的脂族基团所述的那些。
亚烯基：术语“亚烯基”是指二价烯基。取代的亚烯基链是其中一个或多个氢原子被取代基置换的含有至少一个双键的聚亚甲基。适合的取代基包括以下对于取代的脂族基团所述的那些。
动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、乌、爬行动物、两栖动物、鱼和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可为转基因动物、遗传工程化动物和/或克隆。
近似：如本文所用，除非另外陈述或另外根据上下文显而易见，否则关于某一数值的术语“近似”或“约”通常视为包括在任一方向(大于或小于)上属于所述数值的5％、10％、15％或20％的范围内的数值(例外之处是当所述数值将小于可能值的0％或超过可能值的100％时)。在一些实施方案中，关于剂量使用术语“约”是指±5mg/kg/天。
芳基：单独使用或如在“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳基氧基烷基”中，作为较大部分的一部分使用的术语“芳基”是指具有总计5至14个环成员的单环和双环系统，其中系统中的至少一个环是芳族，并且其中系统中的各环含有3至7个环成员。术语“芳基”可与术语“芳基环”互换使用。在本发明的某些实施方案中，“芳基”是指可携带一个或多个取代基的芳族环系统，其包括但不限于苯基、联苯、萘基、蒽基等。在如本文所用的术语“芳基”的范围内也包括其中芳族环稠合于一个或多个非芳族环的基团，如茚满基、邻苯二甲酰亚胺基、萘酰亚胺基、菲啶基或四氢萘基等。
特征部分：如本文所用，短语蛋白质或多肽的“特征部分”是含有一段连续氨基酸或共同作为蛋白质或多肽的特征的多段连续氨基酸的集合的部分。各所述连续链段通常将含有至少两个氨基酸。此外，本领域普通技术人员将了解蛋白质的特征通常需要至少5、10、15、20个或更多个氨基酸。一般来说，特征部分是除以上指定的序列特性(sequence identity)之外，也与相关完整蛋白质共有至少一种功能特征的部分。
特征序列：“特征序列”是见于多肽或核酸家族的所有成员中的序列，并且因此可由本领域普通技术人员用于确定所述家族的成员。
特征结构元件：术语“特征结构元件”是指见于多肽、小分子或核酸家族的所有成员中的独特结构元件(例如核心结构、侧挂部分的集合、序列元件等)，并且因此可由本领域普通技术人员用于确定所述家族的成员。
可比：术语“可比”在本文中用于描述彼此足够类似以允许比较获得的结果或观察到的现象的两组(或更多组)条件或情况。在一些实施方案中，多组可比条件或情况的特征为多种大致上相同特征和一种或少数不同特征。本领域普通技术人员将了解多组条件在特征为以下时是彼此可比的：足够数目和类型的大致上相同特征以保证得出以下合理结论：在不同组条件或情况下获得的结果或观察到的现象的差异是由那些不同特征的变化引起或指示那些不同特征的变化。
给药方案：如本文所用，“给药方案”或“治疗方案”是指通常相隔多段时间来个别地向受试者施用的一组单位剂量(通常一个以上)。在一些实施方案中，给定治疗剂具有可涉及一个或多个剂量的推荐给药方案。在一些实施方案中，给药方案包括各自彼此相隔相同时长的一段时间的多个剂量；在一些实施方案中，给药方案包括多个剂量和分隔个别剂量的至少两个不同时间段。在一些实施方案中，给药方案内的所有剂量都具有相同单位给药量。在一些实施方案中，给药方案内的不同剂量具有不同量。在一些实施方案中，给药方案包括第一给药量的第一剂量，之后是一个或多个不同于所述第一给药量的第二给药量的其它剂量。在一些实施方案中，给药方案包括第一给药量的第一剂量，之后是一个或多个与所述第一给药量相同的第二给药量的其它剂量。
等效药剂：本领域普通技术人员在阅读本公开的情况下将了解在本发明的背景下，适用药剂的范围不限于本文明确提及或例示的那些。具体来说，本领域技术人员将认识到活性剂通常具有由核心部分和连接的侧挂部分组成的结构，并且此外将了解所述核心和/或侧挂部分的简单变化形式可不显著改变药剂的活性。例如，在一些实施方案中，用具有可比的三维结构和/或化学反应性特征的基团取代一个或多个侧挂部分可产生等效于母体参照化合物或部分的取代的化合物或部分。在一些实施方案中，添加或移除一个或多个侧挂部分可产生等效于母体参照化合物的取代的化合物。在一些实施方案中，例如通过添加或移除少数键(通常不超过5、4、3、2或1个键，并且常常仅单个键)来改变核心结构可产生等效于母体参照化合物的取代的化合物。在许多实施方案中，可使用可易于获得的起始材料、试剂和常规或提供的合成程序，通过如例如以下所述的一般性反应方案中说明的方法，或通过其修改形式来制备等效化合物。在这些反应中，也有可能利用自身已知，但未在本文中未提及的变体。
等效剂量：术语“等效剂量”在本文中用于比较实现相同生物学结果的不同药学活性剂的剂量。如果两种不同药剂的剂量达成可比的生物学结果水平或程度，那么根据本发明，所述剂量被视为彼此“等效”。在一些实施方案中，供根据本发明使用的不同药物制剂的等效剂量是使用如本文所述的体外和/或体内测定来确定。在一些实施方案中，供根据本发明使用的一种或多种溶酶体活化剂是在剂量等效于参照溶酶体活化剂的剂量下加以利用；在一些所述实施方案中，用于所述目的的参照溶酶体活化剂选自由以下组成的组：小分子变构活化剂(例如吡唑并嘧啶(pyrazolpyrimidine))、亚氨基糖(例如异法戈明(isofagomine))、抗氧化剂(例如n-乙酰基-半胱氨酸)和细胞转运调控剂(例如Rabla多肽)。
杂脂族：术语“杂脂族”是指其中一个或多个选自C、CH、CH2或CH3的单元独立地被杂原子置换的脂族基团。在一些实施方案中，杂脂族基团是杂烷基。在一些实施方案中，杂脂族基团是杂烯基。
杂芳基：单独使用或作为例如“杂芳烷基”或“杂芳烷氧基”的较大部分的一部分使用的术语“杂芳基”和“杂芳-”是指具有5至10个环原子，优选5、6或9个环原子；具有6、10或14个在环状阵列中共有的电子；并且除碳原子之外具有1至5个杂原子的基团。术语“杂原子”是指氮、氧或硫，并且包括氮或硫的任何氧化形式以及碱性氮的任何季铵化形式。杂芳基包括但不限于噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲哚嗪基、嘌呤基、萘啶基以及喋啶基。如本文所用的术语“杂芳基”和“杂芳-”也包括其中杂芳族环稠合于一个或多个芳基、环脂族或杂环基环的基团，其中连接基团或点是在杂芳族环上。非限制性实例包括吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H-喹嗪基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、啡噁嗪基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基以及吡啶并[2，3-b]-1，4-噁嗪-3(4H)-酮。杂芳基可为单环或双环。术语“杂芳基”可与术语“杂芳基环”、“杂芳基基团”或“杂芳族”互换使用，所述术语中的任一个都包括任选地被取代的环。术语“杂芳烷基”是指被杂芳基取代的烷基，其中烷基和杂芳基部分独立地任选地被取代。
杂原子：术语“杂原子”是指氧、硫、氮、磷或硅中的一个或多个(包括氮、硫、磷或硅的任何氧化形式；任何碱性氮的季铵化形式；或杂环的可取代氮，例如N(如在3，4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)或NR+(如在N-取代的吡咯烷基中))。
杂环：如本文所用，术语“杂环”、“杂环基”、“杂环基团”和“杂环环”可互换使用，并且是指饱和或部分不饱和并且除碳原子之外具有一个或多个、优选一至四个如上定义的杂原子的稳定3至7元单环或7-10元双环杂环部分。当关于杂环的环原子使用时，术语“氮”包括取代的氮。例如，在具有0-3个选自氧、硫或氮的杂原子的饱和或部分不饱和环中，氮可为N(如在3，4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)、或+NR(如在N-取代的吡咯烷基中)。
杂环可在产生稳定结构的任何杂原子或碳原子处连接于它的侧基，并且任何环原子都可任选地被取代。所述饱和或部分不饱和杂环基团的实例包括但不限于四氢呋喃基、四氢苯硫基、吡咯烷基、哌啶基、吡咯啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、噁唑烷基、哌嗪基、二噁烷基、二氧杂戊环烷基、二氮呯基、氧氮呯基、硫氮呯基、吗啉基和奎宁环基。术语“杂环”、“杂环基”、“杂环基环”、“杂环基团(heterocyclic group)”、“杂环部分”和“杂环基团(heterocyclicradical)”在本文中可互换使用，并且也包括其中杂环基环稠合于一个或多个芳基、杂芳基或环脂族环的基团，如吲哚啉基、3H-吲哚基、苯并二氢吡喃基、菲啶基或四氢喹啉基，其中连接基团或点在杂环基环上。杂环基可为单环或双环。术语“杂环基烷基”是指被杂环基取代的烷基，其中烷基和杂环基部分独立地任选地被取代。
腹膜内：如本文所用的短语“腹膜内施用(intraperitoneal administration)”和“腹膜内施用(administered intraperitonealy)”具有其在本领域中理解的含义，是指向受试者的腹膜中施用化合物或组合物。
体外：如本文所用，术语“体外”是指事件发生在人工环境中，例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中等，而非在生物体(例如动物、植物和/或微生物)内。
体内：如本文所用，术语“体内”是指事件发生在生物体(例如动物、植物和/或微生物)内。
低级烷基：术语“低级烷基”是指C1-4直链或分支烷基。示例性低级烷基是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。
低级卤烷基：术语“低级卤烷基”是指被一个或多个卤素原子取代的C1-4直链或分支烷基。
任选地取代：如本文所述，本发明化合物可含有“任选地取代的”部分。一般来说，术语“取代”无论之前是否是术语“任选地”都是指指定部分的一个或多个氢被适合的取代基置换。除非另外指示，否则“任选地取代的”基团可在基团的各可取代位置处具有适合的取代基，并且当任何给定结构中的一个以上位置可被一个以上选自指定组的取代基取代时，在每个位置处的取代基可相同或不同。由本发明设想的取代基的组合优选是导致形成稳定或化学可行化合物的那些。如本文所用的术语“稳定”是指化合物在经受允许其产生、检测以及在某些实施方案中其回收、纯化和出于本文公开的一个或多个目的使用的条件时不实质上改变。
“任选地取代的”基团的可取代碳原子上的适合的单价取代基独立地是卤素；-(CH2)0-4R○；-(CH2)0-4OR○；-O(CH2)0-4R○、-O-(CH2)0-4C(O)OR○；-(CH2)0-4CH(OR○)2；-(CH2)0-4SR○；-(CH2)0-4Ph，其可被R○取代；-(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph，其可被R○取代；-CH＝CHPh，其可被R○取代；-(CH2)0-4O(CH2)0-1-吡啶基，其可被R○取代；-NO2；-CN；-N3；-(CH2)0-4N(R○)2；-(CH2)0-4N(R○)C(O)R○；-N(R○)C(S)R○；-(CH2)0-4N(R○)C(O)NR○ 2；-N(R○)C(S)NR○ 2；-(CH2)0-4N(R○)C(O)OR○；-N(R○)N(R○)C(O)R○；-N(R○)N(R○)C(O)NR○ 2；-N(R○)N(R○)C(O)OR○；-(CH2)0-4C(O)R○；-C(S)R○；-(CH2)0-4C(O)OR○；-(CH2)0-4C(O)SR○；-(CH2)0-4C(O)OSiR○ 3；-(CH2)0-4OC(O)R○；-OC(O)(CH2)0-4SR-，SC(S)SR○；-(CH2)0-4SC(O)R○；-(CH2)0-4C(O)NR○ 2；-C(S)NR○ 2；-C(S)SR○；-SC(S)SR○，-(CH2)0-4OC(O)NR○ 2；-C(O)N(OR○)R○；-C(O)C(O)R○；-C(O)CH2C(O)R○；-C(NOR○)R○；-(CH2)0-4SSR○；-(CH2)0-4S(O)2R○；-(CH2)0-4S(O)2OR○；-(CH2)0-4OS(O)2R○；-S(O)2NR○ 2；-(CH2)0-4S(O)R○；-N(R○)S(O)2NR○ 2；-N(R○)S(O)2R○；-N(OR○)R○；-C(NH)NR○ 2；-P(O)2R○；-P(O)R○ 2；-OP(O)R○ 2；-OP(O)(OR○)2；-SiR○ 3；-(C1-4直链或分支亚烷基)O-N(R○)2；或-(C1-4直链或分支亚烷基)C(O)O-N(R○)2，其中各R○可如下所定义被取代，并且独立地是氢、C1-6脂族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph、-CH2-(5-6元杂芳基环)，或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和、部分不饱和或芳基环，或尽管具有以上定义，但两个独立出现的R○连同它们的一个或多个间插原子一起形成可如下所定义被取代的具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-12元饱和、部分不饱和或芳基单环或双环。
R○(或两个独立出现的R○连同它们的间插原子一起形成的环)上的适合的单价取代基独立地是卤素、-(CH2)0-2R●、-(卤代R●)、-(CH2)0-2OH、-(CH2)0-2OR●、-(CH2)0-2CH(OR●)2；-O(卤代R●)、-CN、-N3、-(CH2)0-2C(O)R●、-(CH2)0-2C(O)OH、-(CH2)0-2C(O)OR●、-(CH2)0-2SR●、-(CH2)0-2SH、-(CH2)0-2NH2、-(CH2)0-2NHR●、-(CH2)0-2NR● 2、-NO2、-SiR● 3、-OSiR● 3、-C(O)SR●、-(C1-4直链或分支亚烷基)C(O)OR●或-SSR●，其中各R●未被取代或当之前是“卤基”时仅被一个或多个卤素取代，并且独立地选自C1-4脂族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph，或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和、部分不饱和或芳基环。R○的饱和碳原子上的适合的二价取代基包括＝O和＝S。
“任选地取代的”基团的饱和碳原子上的适合的二价取代基包括以下：＝O、＝S、＝NNR* 2、＝NNHC(O)R*、＝NNHC(O)OR*、＝NNHS(O)2R*、＝NR*、＝NOR*、-O(C(R* 2))2-3O-或-S(C(R* 2))2-3S-，其中各独立出现的R*选自氢、可如下所定义被取代的C1-6脂族，或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的5-6元饱和、部分不饱和或芳基环。结合于“任选地取代的”基团的邻近可取代碳的适合的二价取代基包括：-O(CR* 2)2-3O-，其中各独立出现的R*选自氢、可如下所定义被取代的C1-6脂族，或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的5-6元饱和、部分不饱和或芳基环。
R*的脂族基团上的适合的取代基包括卤素、-R●、-(卤代R●)、-OH、-OR●、-O(卤代R●)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR●、-NH2、-NHR●、-NR● 2或-NO2，其中各R●未被取代或当之前是“卤基”时仅被一个或多个卤素取代，并且独立地是C1-4脂族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和、部分不饱和或芳基环。
“任选地取代的”基团的可取代氮上的适合的取代基包括 或其中各独立地是氢、可如下所定义被取代的C1-6脂族、未被取代的-OPh，或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未被取代的5-6元饱和、部分不饱和或芳基环，或尽管具有以上定义，但两个独立出现的连同它们的间插原子一起形成具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未被取代的3-12元饱和、部分不饱和或芳基单环或双环。
的脂族基团上的适合的取代基独立地是卤素、-R●、-(卤代R●)、-OH、-OR●、-O(卤代R●)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR●、-NH2、-NHR●、-NR● 2或-NO2，其中各R●未被取代或当之前是“卤基”时仅被一个或多个卤素取代，并且独立地是C1-4脂族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph，或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和、部分不饱和或芳基环。
经口：如本文所用的短语“经口施用(oral administration)”和“经口施用(administered orally)”具有它们的在本领域中理解的含义，是指通过口腔来施用化合物或组合物。
胃肠外：如本文所用的短语“胃肠外施用(parenteraladministration)”和“胃肠外施用(administered parenterally)”具有它们的在本领域中理解的含义，是指除经肠和表面施用以外的施用模式，通常通过注射来进行，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜、脊椎内和胸骨内注射和输注。
部分不饱和：如本文所用，术语“部分不饱和”是指环部分包括至少一个双键或三键。术语“部分不饱和”旨在涵盖环具有多个不饱和位点，但不旨在包括如本文定义的芳基或杂芳基部分。
药物组合物：如本文所用，术语“药物组合物”是指连同一种或多种药学上可接受的载体一起配制的活性剂。在一些实施方案中，活性剂是以适于在对相关群体施用时显示达成预定治疗作用的统计显著概率的治疗方案中施用的单位给药量存在。在一些实施方案中，药物组合物可被特别配制来以固体或液体形式施用，所述形式包括适合于以下的那些：经口施药，例如灌服剂(水性或非水性溶液或混悬液)、片剂(例如以经颊、舌下和全身性吸收为目标的那些)、大丸剂、粉末、颗粒剂、用于向舌用药的糊剂；胃肠外施药，例如通过以例如无菌溶液或混悬液、或持续释放制剂形式进行皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射；表面用药，例如以霜剂、软膏剂或控制释放贴片或向皮肤、肺或口腔用药的喷雾剂形式；阴道内或直肠内，例如以子宫托、霜剂或泡沫形式；舌下；经眼；经皮；或经鼻、经肺以及向其它粘膜表面。
药学上可接受：如本文所用，短语“药学上可接受”是指在合理医学判断的范围内适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
药学上可接受的载体：如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指将主题化合物自身体的一个器官或部分携带或运输至身体的另一器官或部分时涉及的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂囊封材料。各载体在可与制剂的其它成分相容、并且不损伤患者的意义上必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和它的衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽糖；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液(Ringer’s solution)；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；和其它用于药物制剂中的无毒可相容材料。
药学上可接受的盐：如本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指适用于药物背景下的所述化合物的盐，即在合理医学判断的范围内适用于与人和低等动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应等，并且与合理益处/风险比相称的盐。药学上可接受的盐在本领域中是熟知的。例如，S.M.Berge等在J.Pharmaceutical Sciences，66：1-19(1977)中详细描述了药学上可接受的盐。在一些实施方案中，药学上可接受的盐包括但不限于：无毒酸加成盐，其为氨基与无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或与有机酸(如乙酸、顺丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、丁二酸或丙二酸)或通过使用本领域中使用的其它方法(如离子交换)形成的盐。在一些实施方案中，药学上可接受的盐包括但不限于己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、甲酸盐、反丁烯二酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙烷磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、顺丁烯二酸盐、丙二酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟碱酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐(pamoate)、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、丁二酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。在一些实施方案中，适当时，药学上可接受的盐包括使用平衡离子，如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、具有1至6个碳原子的烷基、磺酸根和芳基磺酸根形成的无毒铵、季铵和胺阳离子。
前药：一般来说，如本文所用以及如本领域中所理解的术语“前药”是在向生物体施用时，在身体中被代谢以递送目标活性(例如治疗或诊断)剂的实体。通常，所述代谢涉及移除至少一个“前药部分”以形成活性剂。各种形式的“前药”在本领域中是已知的。对于所述前药部分的实例，参见：
a)Design of Prodrugs，H.Bundgaard编，(Elsevier，1985)以及Methods in Enzymology，42：309-396，K.Widder等编(Academic Press，1985)；
b)Prodrugs and Targeted Delivery，J.Rautio编(Wiley，2011)；
c)Prodrugs and Targeted Delivery，J.Rautio编(Wiley，2011)；
d)A Textbook of Drug Design and Development，Krogsgaard-Larsen编；
e)Bundgaard，第5章“Design and Application of Prodrugs”，H.Bundgaard，第113-191页(1991)；
f)Bundgaard，AdvancedDrugDelivery Reviews，8：1-38(1992)；
g)Bundgaard等，Journal of Pharmaceutical Sciences，77：285(1988)；以及
h)Kakeya等，Chem.Pharm.Bull.，32：692(1984)。
如同本文所述的其它化合物一样，前药可以多种形式中的任一个来提供，例如晶体形式、盐形式等。在一些实施方案中，前药是以其药学上可接受的盐形式提供。
保护基：如本文所用的术语“保护基”在本领域中是熟知的，并且包括详述于Protecting Groups in Organic Synthesis，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，第3版，John Wiley&Sons，1999中的那些，所述参考文献以引用的方式整体并入本文。也包括描述于Current Protocols inNucleic Acid Chemistry，Serge L.Beaucage等编06/2012中的特别适合于核苷和核苷酸化学的那些保护基，第2章以引用的方式整体并入本文。适合的氨基保护基包括氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、氨基甲酸9-芴基甲酯(Fmoc)、氨基甲酸9-(2-磺基)芴基甲酯、氨基甲酸9-(2，7-二溴)芴基甲酯、氨基甲酸2，7-二-叔丁基-[9-(10，10-二氧代-10，10，10，10-四氢噻吨基)]甲酯(DBD-Tmoc)、氨基甲酸4-甲氧基苯甲酰甲酯(Phenoc)、氨基甲酸2，2，2-三氯乙酯(Troc)、氨基甲酸2-三甲基硅烷基乙酯(Teoc)、氨基甲酸2-苯基乙酯(hZ)、氨基甲酸1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙酯(Adpoc)、氨基甲酸1，1-二甲基-2-卤代乙酯、氨基甲酸1，1-二甲基-2，2-二溴乙酯(DB-t-BOC)、氨基甲酸1，1-二甲基-2，2，2-三氯乙酯(TCBOC)、氨基甲酸1-甲基-1-(4-联苯基)乙酯(Bpoc)、氨基甲酸1-(3，5-二-叔丁基苯基)-1-甲基乙酯(t-Bumeoc)、氨基甲酸2-(2’-吡啶基和4’-吡啶基)乙酯(Pyoc)、氨基甲酸2-(N，N-二环己基甲酰氨基)乙酯、氨基甲酸叔丁酯(BOC)、氨基甲酸1-金刚烷酯(Adoc)、氨基甲酸乙烯酯(Voc)、氨基甲酸烯丙酯(Alloc)、氨基甲酸1-异丙基烯丙酯(Ipaoc)、氨基甲酸肉桂酯(Coc)、氨基甲酸4-硝基肉桂酯(Noc)、氨基甲酸8-喹啉酯、氨基甲酸N-羟基哌啶酯、氨基甲酸烷基二硫酯、氨基甲酸苯甲酯(Cbz)、氨基甲酸对甲氧基苯甲酯(Moz)、氨基甲酸对硝基苯甲酯、氨基甲酸对溴苯甲酯、氨基甲酸对氯苯甲酯、氨基甲酸2，4-二氯苯甲酯、氨基甲酸4-甲基亚磺酰基苯甲酯(Msz)、氨基甲酸9-蒽基甲酯、氨基甲酸二苯基甲酯、氨基甲酸2-甲硫基乙酯、氨基甲酸2-甲基磺酰基乙酯、氨基甲酸2-(对甲苯磺酰基)乙酯、氨基甲酸[2-(1，3-二硫杂环己基)]甲酯(Dmoc)、氨基甲酸4-甲硫基苯酯(Mtpc)、氨基甲酸2，4-二甲硫基苯酯(Bmpc)、氨基甲酸2-磷鎓基乙酯(Peoc)、氨基甲酸2-三苯基磷鎓基异丙酯(Ppoc)、氨基甲酸1，1-二甲基-2-氰基乙酯、氨基甲酸间氯-对酰基氧基苯甲酯、氨基甲酸对(二羟基硼烷基)苯甲酯、氨基甲酸5-苯并异噁唑基甲酯、氨基甲酸2-(三氟甲基)-6-色酮基甲酯(Tcroc)、氨基甲酸间硝基苯酯、氨基甲酸3，5-二甲氧基苯甲酯、氨基甲酸邻硝基苯甲酯、氨基甲酸3，4-二甲氧基-6-硝基苯甲酯、氨基甲酸苯基(邻硝基苯基)甲酯、吩噻嗪基-(10)-羰基衍生物、N’-对甲苯磺酰基氨基羰基衍生物、N’-苯基氨基硫羰基衍生物、氨基甲酸叔戊酯、硫代氨基甲酸S-苯甲酯、氨基甲酸对氰基苯甲酯、氨基甲酸环丁酯、氨基甲酸环己酯、氨基甲酸环戊酯、氨基甲酸环丙基甲酯、氨基甲酸对癸基氧基苯甲酯、氨基甲酸2，2-二甲氧基羰基乙烯酯、氨基甲酸邻(N，N-二甲基甲酰氨基)苯甲酯、氨基甲酸1，1-二甲基-3-(N，N-二甲基甲酰氨基)丙酯、氨基甲酸1，1-二甲基丙炔酯、氨基甲酸二(2-吡啶基)甲酯、氨基甲酸2-呋喃基甲酯、氨基甲酸2-碘乙酯、氨基甲酸异冰片酯、氨基甲酸异丁酯、氨基甲酸异烟碱酯、氨基甲酸对(对’-甲氧基苯基偶氮基)苯甲酯、氨基甲酸1-甲基环丁酯、氨基甲酸1-甲基环己酯、氨基甲酸1-甲基-1-环丙基甲酯、氨基甲酸1-甲基-1-(3，5-二甲氧基苯基)乙酯、氨基甲酸1-甲基-1-(对苯基偶氮基苯基)乙酯、氨基甲酸1-甲基-1-苯基乙酯、氨基甲酸1-甲基-1-(4-吡啶基)乙酯、氨基甲酸苯酯、氨基甲酸对(苯基偶氮基)苯甲酯、氨基甲酸2，4，6-三-叔丁基苯酯、氨基甲酸4-(三甲基铵)苯甲酯、氨基甲酸2，4，6-三甲基苯甲酯、甲酰胺、乙酰胺、氯乙酰胺、三氯乙酰胺、三氟乙酰胺、苯基乙酰胺、3-苯基丙酰胺、吡啶甲酰胺、3-吡啶基甲酰胺、N-苯甲酰基苯基丙氨酰基衍生物、苯甲酰胺、对苯基苯甲酰胺、邻硝基苯基乙酰胺、邻硝基苯氧基乙酰胺、乙酰乙酰胺、(N’-二硫基苯甲基氧基羰基氨基)乙酰胺、3-(对羟基苯基)丙酰胺、3-(邻硝基苯基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻硝基苯氧基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻苯基偶氮基苯氧基)丙酰胺、4-氯丁酰胺、3-甲基-3-硝基丁酰胺、邻硝基肉桂酰胺、N-乙酰基甲硫氨酸衍生物、邻硝基苯甲酰胺、邻(苯甲酰基氧基甲基)苯甲酰胺、4，5-二苯基-3-噁唑啉-2-酮、N-苯邻二甲酰亚胺、N-二噻丁二酰亚胺(Dts)、N-2，3-二苯基顺丁烯二酰亚胺、N-2，5-二甲基吡咯、N-1，1，4，4-四甲基二硅烷基氮杂环戊烷加合物(STABASE)、5-取代的1，3-二甲基-1，3，5-三氮杂环己-2-酮、5-取代的1，3-二苯甲基-1，3，5-三氮杂环己-2-酮、1-取代的3，5-二硝基-4-吡啶酮、N-甲胺、N-烯丙胺、N-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]甲胺(SEM)、N-3-乙酰氧基丙胺、N-(1-异丙基-4-硝基-2-氧代-3-吡咯啉-3-基)胺、季铵盐、N-苯甲胺、N-二(4-甲氧基苯基)甲胺、N-5-二苯并环庚胺、N-三苯基甲胺(Tr)、N-[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]胺(MMTr)、N-9-苯基芴基胺(PhF)、N-2，7-二氯-9-芴基亚甲胺、N-二茂铁基甲基氨基(Fcm)、N-2-吡啶甲基氨基N’-氧化物、N-1，1-二甲硫基亚甲胺、N-苯亚甲胺、N-对甲氧基苯亚甲胺、N-二苯基亚甲胺、N-[(2-吡啶基)均三甲苯基]亚甲胺、N-(N’，N’-二甲基氨基亚甲基)胺、N，N’-异亚丙二胺、N-对硝基苯亚甲胺、N-亚水杨基胺、N-5-氯亚水杨基胺、N-(5-氯-2-羟基苯基)苯基亚甲胺、N-亚环己胺、N-(5，5-二甲基-3-氧代-1-环己烯基)胺、N-硼烷衍生物、N-二苯基烃基硼酸衍生物、N-[苯基(五羰基铬-或钨)羰基]胺、N-铜螯合物、N-锌螯合物、N-硝基胺、N-亚硝基胺、胺N-氧化物、二苯基膦酰胺(Dpp)、二甲硫基膦酰胺(Mpt)、二苯硫基膦酰胺(Ppt)、氨基磷酸二烷酯、氨基磷酸二苯甲酯、氨基磷酸二苯酯、苯亚磺酰胺、邻硝基苯亚磺酰胺(Nps)、2，4-二硝基苯亚磺酰胺、五氯苯亚磺酰胺、2-硝基-4-甲氧基苯亚磺酰胺、三苯基甲基亚磺酰胺、3-硝基吡啶亚磺酰胺(Npys)、对甲苯磺酰胺(Ts)、苯磺酰胺、2，3，6，-三甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mtr)、2，4，6-三甲氧基苯磺酰胺(Mtb)、2，6-二甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Pme)、2，3，5，6-四甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mte)、4-甲氧基苯磺酰胺(Mbs)、2，4，6-三甲基苯磺酰胺(Mts)、2，6-二甲氧基-4-甲基苯磺酰胺(iMds)、2，2，5，7，8-五甲基色满-6-磺酰胺(Pmc)、甲烷磺酰胺(Ms)、β-三甲基硅烷基乙烷磺酰胺(SES)、9-蒽磺酰胺、4-(4’，8’-二甲氧基萘基甲基)苯磺酰胺(DNMBS)、苯甲基磺酰胺、三氟甲基磺酰胺和苯甲酰甲基磺酰胺。
适合保护的羧酸进一步包括但不限于硅烷基、烷基、烯基、芳基和芳基烷基保护的羧酸。适合的硅烷基的实例包括三甲基硅烷基、三乙基硅烷基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、三异丙基硅烷基等。适合的烷基的实例包括甲基、苯甲基、对甲氧基苯甲基、3，4-二甲氧基苯甲基、三苯甲基、叔丁基、四氢吡喃-2-基。适合的烯基的实例包括烯丙基。适合的芳基的实例包括任选地取代的苯基、联苯或萘基。适合的芳基烷基的实例包括任选地取代的苯甲基(例如对甲氧基苯甲基(MPM)、3，4-二甲氧基苯甲基、O-硝基苯甲基、对硝基苯甲基、对卤苯甲基、2，6-二氯苯甲基、对氰基苯甲基)以及2-吡啶甲基和4-吡啶甲基。
适合的羟基保护基包括甲基、甲氧基甲基(MOM)、甲硫基甲基(MTM)、叔丁基硫基甲基、(苯基二甲基硅烷基)甲氧基甲基(SMOM)、苯甲基氧基甲基(BOM)、对甲氧基苯甲基氧基甲基(PMBM)、(4-甲氧基苯氧基)甲基(p-AOM)、愈创木酚甲基(GUM)、叔丁氧基甲基、4-戊烯基氧基甲基(POM)、甲硅烷氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、2，2，2-三氯乙氧基甲基、双(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基硅烷基)乙氧基甲基(SEMOR)、四氢吡喃基(THP)、3-溴四氢吡喃基、四氢噻喃基、1-甲氧基环己基、4-甲氧基四氢吡喃基(MTHP)、4-甲氧基四氢噻喃基、4-甲氧基四氢噻喃基S，S-二氧化物、1-[(2-氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基(CTMP)、1，4-二噁烷-2-基、四氢呋喃基、四氢硫代呋喃基、2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢-7，8，8-三甲基-4，7-甲桥苯并呋喃-2-基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苯甲基氧基乙基、1-甲基-1-苯甲基氧基-2-氟乙基、2，2，2-三氯乙基、2-三甲基硅烷基乙基、2-(苯基氢硒基)乙基、叔丁基、烯丙基、对氯苯基、对甲氧基苯基、2，4-二硝基苯基、苯甲基、对甲氧基苯甲基、3，4-二甲氧基苯甲基、邻硝基苯甲基、对硝基苯甲基、对卤代苯甲基、2，6-二氯苯甲基、对氰基苯甲基、对苯基苯甲基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、3-甲基-2-吡啶甲基N-氧桥、二苯基甲基、p，p’-二硝基二苯甲基、5-二苯并环庚基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基、对甲氧基苯基二苯基甲基、二(对甲氧基苯基)苯基甲基、三(对甲氧基苯基)甲基、4-(4’-溴苯甲酰甲基氧基苯基)二苯基甲基、4，4’，4”-三(4，5-二氯苯二甲酰亚氨基苯基)甲基、4，4’，4”-三(乙酰丙酰基氧基苯基)甲基、4，4’，4”-三(苯甲酰基氧基苯基)甲基、3-(咪唑-1-基)双(4’，4”-二甲氧基苯基)甲基、1，1-双(4-甲氧基苯基)-1’-芘基甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)氧杂蒽基、9-(9-苯基-10-氧代)蒽基、1，3-苯并二硫戊环-2-基、苯并异噻唑基S，S-二氧桥、三甲基硅烷基(TMS)、三乙基硅烷基(TES)、三异丙基硅烷基(TIPS)、二甲基异丙基硅烷基(IPDMS)、二乙基异丙基硅烷基(DEIPS)、二甲基己基硅烷基、叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基硅烷基(TBDPS)、三苯甲基硅烷基、三-对二甲苯基硅烷基、三苯基硅烷基、二苯基甲基硅烷基(DPMS)、叔丁基甲氧基苯基硅烷基(TBMPS)、甲酸酯、苯甲酰基甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧代戊酸酯(乙酰丙酸酯)、4，4-(亚乙基二硫基)戊酸酯(乙酰丙酰基二硫基缩醛)、新戊酸酯、金刚烷酸酯、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯基苯甲酸酯、2，4，6-三甲基苯甲酸酯(三甲基苯甲酸酯)、甲基碳酸烷酯、9-芴基甲基碳酸酯(Fmoc)、乙基碳酸烷酯、2，2，2-三氯乙基碳酸烷酯(Troc)、2-(三甲基硅烷基)乙基碳酸酯(TMSEC)、2-(苯基磺酰基)乙基碳酸酯(Psec)、2-(三苯基磷鎓基)乙基碳酸酯(Peoc)、异丁基碳酸烷酯、乙烯基碳酸烷酯、烯丙基碳酸烷酯、对硝基苯基碳酸烷酯、苯甲基碳酸烷酯、对甲氧基苯甲基碳酸烷酯、3，4-二甲氧基苯甲基碳酸烷酯、邻硝基苯甲基碳酸烷酯、对硝基苯甲基碳酸烷酯、S-苯甲基硫代碳酸烷酯、4-乙氧基-1-萘基碳酸酯、甲基二硫代碳酸酯、2-碘苯甲酸酯、4-叠氮基丁酸酯、4-硝基-4-甲基戊酸酯、邻-(二溴甲基)苯甲酸酯、2-甲酰基苯磺酸酯、2-(甲硫基甲氧基)乙基、4-(甲硫基甲氧基)丁酸酯、2-(甲硫基甲氧基甲基)苯甲酸酯、2，6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯、2，6-二氯-4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2，4-双(1，1-二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯二苯基乙酸酯、异丁酸酯、单丁二酸酯、(E)-2-甲基-2-丁烯酸酯、邻-(甲氧基羰基)苯甲酸酯、α-萘甲酸酯、硝酸酯、烷基N，N，N’，N’-四甲基磷酰二胺、N-苯基氨基甲酸烷酯、硼酸酯、二甲基硫膦基、2，4-二硝基苯基次磺酸烷酯、硫酸酯、甲烷磺酸酯(甲磺酸酯)、苯甲基磺酸酯和甲苯磺酸酯(Ts)。对于保护1，2-二醇或1，3-二醇，保护基包括亚甲基缩醛、亚乙基缩醛、1-叔丁基亚乙基缩酮、1-苯基亚乙基缩酮、(4-甲氧基苯基)亚乙基缩醛、2，2，2-三氯亚乙基缩醛、丙酮化物、亚环戊基缩酮、亚环己基缩酮、亚环庚基缩酮、苯亚甲基缩醛、对甲氧基苯亚甲基缩醛、2，4-二甲氧基苯亚甲基缩酮、3，4-二甲氧基苯亚甲基缩醛、2-硝基苯亚甲基缩醛、甲氧基亚甲基缩醛、乙氧基亚甲基缩醛、二甲氧基亚甲基原酸酯、1-甲氧基亚乙基原酸酯、1-乙氧基次乙基原酸酯、1，2-二甲氧基亚乙基原酸酯、α-甲氧基苯亚甲基原酸酯、1-(N，N-二甲基氨基)亚乙基衍生物、α-(N，N’-二甲基氨基)苯亚甲基衍生物、2-氧杂亚环戊基原酸酯、二叔丁基亚硅烷基(DTBS)、1，3-(1，1，3，3-四异丙基二亚硅氧烷基)衍生物(TIPDS)、四-叔丁氧基二硅氧烷-1，3-二亚基衍生物(TBDS)、环状碳酸酯、环状硼酸酯、乙基硼酸酯和苯基硼酸酯。
在一些实施方案中，羟基保护基是乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基硅烷基乙基、对氯苯基、2，4-二硝基苯基、苯甲基、苯甲酰基、对苯基苯甲酰基、2，6-二氯苯甲基、二苯基甲基、对硝基苯甲基、三苯基甲基(三苯甲基)、4，4′-二甲氧基三苯甲基、三甲基硅烷基、三乙基硅烷基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、三苯基硅烷基、三异丙基硅烷基、苯甲酰基甲酸酯、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基、9-芴基甲基碳酸酯、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基(MMTr)、4，4′-二甲氧基三苯甲基(DMTr)和4，4′，4″-三甲氧基三苯甲基(TMTr)、2-氰基乙基(CE或Cne)、2-(三甲基硅烷基)乙基(TSE)、2-(2-硝基苯基)乙基、2-(4-氰基苯基)乙基、2-(4-硝基苯基)乙基(NPE)、2-(4-硝基苯基磺酰基)乙基、3，5-二氯苯基、2，4-二甲基苯基、2-硝基苯基、4-硝基苯基、2，4，6-三甲基苯基、2-(2-硝基苯基)乙基、丁基硫羰基、4，4′，4″-三(苯甲酰基氧基)三苯甲基、二苯基氨基甲酰基、乙酰丙酰基、2-(二溴甲基)苯甲酰基(Dbmb)、2-(异丙基硫基甲氧基甲基)苯甲酰基(Ptmt)、9-苯基氧杂蒽-9-基(pixyl)或9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。在一些实施方案中，各羟基保护基独立地选自乙酰基、苯甲基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基和4，4′-二甲氧基三苯甲基。在一些实施方案中，羟基保护基选自由三苯甲基、单甲氧基三苯甲基和4，4′-二甲氧基三苯甲基组成的组。
在一些实施方案中，磷保护基是在整个寡核苷酸合成期间连接于核苷酸间磷键联的基团。在一些实施方案中，磷保护基连接于核苷酸间硫代磷酸酯键联的硫原子。在一些实施方案中，磷保护基连接于核苷酸间硫代磷酸酯键联的氧原子。在一些实施方案中，磷保护基连接于核苷酸间磷酸酯键联的氧原子。在一些实施方案中，磷保护基是2-氰基乙基(CE或Cne)、2-三甲基硅烷基乙基、2-硝基乙基、2-磺酰基乙基、甲基、苯甲基、邻硝基苯甲基、2-(对硝基苯基)乙基(NPE或Npe)、2-苯基乙基、3-(N-叔丁基甲酰氨基)-1-丙基、4-氧代戊基、4-甲硫基-1-丁基、2-氰基-1，1-二甲基乙基、4-N-甲基氨基丁基、3-(2-吡啶基)-1-丙基、2-[N-甲基-N-(2-吡啶基)]氨基乙基、2-(N-甲酰基，N-甲基)氨基乙基、4-[N-甲基-N-(2，2，2-三氟乙酰基)氨基]丁基。
蛋白质：如本文所用，术语“蛋白质”是指多肽(即一串至少两个通过肽键彼此连接的氨基酸)。在一些实施方案中，蛋白质仅包括天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，蛋白质包括一个或多个非天然存在的氨基酸(例如与邻近氨基酸形成一个或多个肽键的部分)。在一些实施方案中，蛋白质链中的一个或多个残基含有非氨基酸部分(例如聚糖等)。在一些实施方案中，蛋白质包括一个以上例如通过一个或多个二硫键连接或通过其它手段缔合的多肽链。在一些实施方案中，蛋白质含有L-氨基酸、D-氨基酸或两者；在一些实施方案中，蛋白质含有一个或多个本领域中已知的氨基酸修饰或类似物。适用修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。术语“肽”通常用于指代长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸或小于10个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，蛋白质是抗体、抗体片段、其生物活性部分和/或其特征部分。
样本：如本文所用，术语“样本”是指自如本文所述的目标来源获得或源于所述来源的生物样本。在一些实施方案中，目标来源包括生物体，如动物或人。在一些实施方案中，生物样本包括生物组织或流体。在一些实施方案中，生物样本是或包括骨髓；血液；血细胞；腹水；组织或细针生检样本；含有细胞的体液；自由浮动的核酸；痰；唾液；尿；脑脊髓液；腹膜液；胸膜液；粪便；淋巴液；妇科流体；皮肤拭子；阴道拭子；口腔拭子；鼻拭子；洗涤物或灌洗物，如导管灌洗物或支气管肺泡灌洗物；抽吸物；刮屑；骨髓试样；组织生检试样；手术试样；粪便；其它体液、分泌物和/或排泄物；和/或其细胞等。在一些实施方案中，生物样本是或包括自个体获得的细胞。在一些实施方案中，样本是通过任何适当手段直接自目标来源获得的“初级样本”。例如，在一些实施方案中，初级生物样本是通过选自由生检(例如细针抽吸或组织生检)、手术、体液(例如血液、淋巴液、粪便等)收集等组成的组的方法获得。在一些实施方案中，如根据上下文将明确的是，术语“样本”是指通过处理(例如通过移除一种或多种组分和/或通过添加一种或多种试剂)初级样本获得的制备物。例如，使用半透膜进行过滤。所述“处理的样本”可包括例如自样本提取或通过使初级样本经受如扩增或反转录mRNA、分离和/或纯化某些组分等的技术获得的核酸或蛋白质。
立体化学异构形式：如本文所用的短语“立体化学异构形式”是指由按照相同键顺序键结的相同原子组成，但具有不可互换的不同三维结构的不同化合物。在本发明的一些实施方案中，提供的化学组合物可为或包括化合物的个别立体化学异构形式的纯制剂；在一些实施方案中，提供的化学组合物可为或包括所述化合物的两种或更多种立体化学异构形式的混合物。在某些实施方案中，所述混合物含有等量的不同立体化学异构形式；在某些实施方案中，所述混合物含有不同量的至少两种不同立体化学异构形式。在一些实施方案中，化学组合物可含有化合物的所有非对映异构体和/或对映异构体。在一些实施方案中，化学组合物可含有化合物的少于所有非对映异构体和/或对映异构体。在一些实施方案中，如果需要本发明化合物的特定对映异构体，那么它可例如通过不对称合成，或通过用手性助剂衍生来制备，其中分离所得非对映异构混合物，并且裂解辅助基团以提供纯的所需对映异构体。或者，当分子含有碱性官能团如氨基时，非对映异构盐是用适当光学活性酸形成，并且例如通过分段结晶来拆分。
受试者：如本文所用，术语“受试者”或“测试受试者”是指根据本发明，例如出于实验、诊断、防治和/或治疗目的向其施用提供的化合物或组合物的任何生物体。典型受试者包括动物(例如哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人；昆虫；蠕虫；等)和植物。在一些实施方案中，受试者可罹患和/或易感疾病、病症和/或病状。
大致上：如本文所用，术语“大致上”是指展现总体或接近总体范围或程度的目标特征或性质的定性情况。生物领域普通技术人员将了解如果曾发生，那么生物和化学现象很少达到完全和/或进行至完全或达成或避免绝对结果。因此，术语“大致上”在本文中用于获取许多生物和/或化学现象中固有的潜在完全性缺乏。
罹患：“罹患”疾病、病症和/或病状的个体已被诊断有和/或展现出疾病、病症和/或病状的一种或多种症状。
易感：“易感”疾病、病症和/或病状的个体是发展所述疾病、病症和/或病状的风险高于公众成员的个体。在一些实施方案中，易感疾病、病症和/或病状的个体可尚未被诊断有所述疾病、病症和/或病状。在一些实施方案中，易感疾病、病症和/或病状的个体可展现所述疾病、病症和/或病状的症状。在一些实施方案中，易感疾病、病症和/或病状的个体可不展现所述疾病、病症和/或病状的症状。在一些实施方案中，易感疾病、病症和/或病状的个体将发展所述疾病、病症和/或病状。在一些实施方案中，易感疾病、病症和/或病状的个体将不发展所述疾病、病症和/或病状。
全身性：如本文所用的短语“全身性施用(systemic administration)”、“全身性施用(administered systemically)”、“外周施用(peripheraladministration)”和“外周施用(administered peripherally)”具有它们的在本领域中理解的含义，是指施用化合物或组合物以使它进入接受者的系统。
互变异构形式：如本文所用的短语“互变异构形式”用于描述有机化合物的能够轻易相互转化的不同异构形式。互变异构体的特征可在于氢原子或质子进行形式迁移，伴有单键和邻近双键的转换。在一些实施方案中，互变异构体可由质子移变互变异构(即质子重新定位)产生。在一些实施方案中，互变异构体可由价位互变异构(即键结电子快速重构)产生。所有所述互变异构形式都旨在包括在本发明的范围内。在一些实施方案中，化合物的互变异构形式以彼此动态平衡存在，因此制备单独材料的尝试导致形成混合物。在一些实施方案中，化合物的互变异构形式是可分开以及可分离化合物。在本发明的一些实施方案中，可提供是或包括化合物的单一互变异构形式的纯制剂的化学组合物。在本发明的一些实施方案中，化学组合物可以化合物的两种或更多种互变异构形式的混合物形式提供。在某些实施方案中，所述混合物含有等量的不同互变异构形式；在某些实施方案中，所述混合物含有化合物的不同量的至少两种不同互变异构形式。在本发明的一些实施方案中，化学组合物可含有化合物的所有互变异构形式。在本发明的一些实施方案中，化学组合物可含有化合物的少于所有互变异构形式。在本发明的一些实施方案中，化学组合物可含有化合物的一种或多种互变异构形式，其数量由于相互转化而随时间变化。在本发明的一些实施方案中，互变异构是酮-烯醇互变异构。化学领域技术人员将认识到酮-烯醇互变异构体可使用化学领域中已知的任何适合试剂来“圈闭”(即化学改性以使它保持“烯醇”形式)，以提供可随后使用本领域中已知的一种或多种适合技术加以分离的烯醇衍生物。除非另外指示，否则本发明涵盖相关化合物的所有互变异构形式，无论呈纯净形式或呈彼此混合物形式。
治疗剂：如本文所用，短语“治疗剂”是指当向受试者施用时具有治疗作用和/或引发所需生物和/或药理学作用的任何药剂。在一些实施方案中，治疗剂是可用于减轻、改善、缓和、抑制、预防疾病、病症和/或病状、延迟其发作、减轻其严重性、和/或降低其一种或多种症状或特征的发生的任何物质。
治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”是指物质(例如治疗剂、组合物和/或制剂)在作为治疗方案的一部分施用时引发所需生物反应的量。在一些实施方案中，物质的治疗有效量是当向罹患或易感疾病、病症和/或病状的受试者施用时足以治疗、诊断、预防所述疾病、病症和/或病状和/或延迟其发作的量。如本领域普通技术人员将了解，物质的有效量可视如所需生物终点、待递送的材料、靶标细胞或组织等的因素而变化。例如，制剂中的化合物的用以治疗疾病、病症和/或病状的有效量是减轻、改善、缓和、抑制、预防所述疾病、病症和/或病状、延迟其发作、减轻其严重性和/或降低其一种或多种症状或特征的发生的量。在一些实施方案中，治疗有效量是以单次剂量施用；在一些实施方案中，递送治疗有效量需要多个单位剂量。
治疗：如本文所用，术语“治疗(treat、treatment或treating)”是指用于部分或完全减轻、改善、缓和、抑制、预防疾病、病症和/或病状、延迟其发作、减轻其严重性、和/或降低其一种或多种症状或特征的发生的任何方法。治疗可向未展现疾病、病症和/或病状的征象的受试者施用。在一些实施方案中，治疗可向仅展现疾病、病症和/或病状的早期征象的受试者施用例如以达成降低发展与所述疾病、病症和/或病状相关的病变的风险的目的。
不饱和：如本文所用的术语“不饱和”是指某一部分具有一个或多个不饱和单元。
单位剂量：如本文所用的表述“单位剂量”是指以单次剂量形式和/或以物理不连续单元的药物组合物形式施用的量。在许多实施方案中，单位剂量含有预定量的活性剂。在一些实施方案中，单位剂量含有药剂的整个单次剂量。在一些实施方案中，施用一个以上单位剂量以达成总体单次剂量。在一些实施方案中，需要或预期需要施用多个单位剂量以达成预定作用。单位剂量可为例如一定体积的含有预定量的一种或多种治疗剂的液体(例如可接受的载体)、预定量的一种或多种呈固体形式的治疗剂、含有预定量的一种或多种治疗剂的持续释放制剂或药物递送装置等。应了解单位剂量可存在于除一种或多种治疗剂之外也包括多种组分中的任一种的制剂中。例如，可接受的载体(例如药学上可接受的载体)、稀释剂、稳定剂、缓冲剂、防腐剂等可如下文所述加以包括。本领域技术人员应了解，在许多实施方案中，特定治疗剂的总体适当每日剂量可包括一部分单位剂量或多个单位剂量，并且可例如由主治医师在合理医学判断的范围内加以决定。在一些实施方案中，用于任何特定受试者或生物体的具体有效剂量水平可取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重性；所用具体活性化合物的活性；所用具体组合物；受试者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；所用具体活性化合物的施用时间和排泄速率；治疗的持续时间；与所用一种或多种具体化合物组合或同时使用的药物和/或其它疗法；以及医学领域中熟知的类似因素。
野生型：如本文所用，术语“野生型”具有它的在本领域中理解的含义，是指具有如在自然界中见于“正常”(与突变、患病、改变等相对照)状态或背景下的结构和/或活性的实体。本领域普通技术人员将了解野生型基因和多肽常以多种不同形式(例如等位基因)存在。
核酸：术语“核酸”包括任何核苷酸、其类似物以及其聚合物。如本文所用的术语“多核苷酸”是指任何长度的聚合形式的核苷酸(核糖核苷酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA))。这些术语是指分子的一级结构，并且因此包括双链和单链DNA以及双链和单链RNA。这些术语包括RNA或DNA的由核苷酸类似物和修饰的多核苷酸(如但不限于甲基化、保护的和/或加帽的核苷酸或多核苷酸)制得的类似物作为等效物。所述术语涵盖多核糖核苷酸或寡核糖核苷酸(RNA)和多脱氧核糖核苷酸或寡脱氧核糖核苷酸(DNA)；源于核苷碱基和/或修饰的核苷碱基的N-糖苷或C-糖苷的RNA或DNA；源于糖和/或修饰的糖的核酸；以及源于磷酸酯桥和/或修饰的磷原子桥(在本文中也称为“核苷酸间键联”)的核酸。所述术语涵盖含有核苷碱基、修饰的核苷碱基、糖、修饰的糖、磷酸酯桥或修饰的磷原子桥的任何组合的核酸。实例包括并且不限于含有核糖部分的核酸、含有脱氧核糖部分的核酸、含有核糖与脱氧核糖部分两者的核酸、含有核糖和修饰的核糖部分的核酸。前缀多是指核酸含有2至约10,000个核苷酸单体单元，并且其中前缀寡是指核酸含有2至约200个核苷酸单体单元。
核苷酸：如本文所用的术语“核苷酸”是指多核苷酸的由杂环碱基、糖和一个或多个磷酸酯基团或含磷核苷酸间键联组成的单体单元。天然存在的碱基(乌嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U))是嘌呤或嘧啶的衍生物，但应了解也包括天然和非天然存在的碱基类似物。天然存在的糖是戊糖(五碳糖)脱氧核糖(形成DNA)或核糖(形成RNA)，但应了解也包括天然和非天然存在的糖类似物。核苷酸是通过核苷酸间键联连接以形成核酸或多核苷酸。许多核苷酸间键联在本领域中是已知的(如但不限于磷酸酯、硫代磷酸酯、硼代磷酸酯等)。人工核酸包括PNA(肽核酸)、磷酸三酯、硫代磷酸酯、H-膦酸酯、氨基磷酸酯、硼代磷酸酯、甲基膦酸酯、膦酰基乙酸酯、硫代膦酰基乙酸酯和天然核酸的磷酸酯骨架的其它变体，如本文所述的那些。
核苷：术语“核苷”是指其中核苷碱基或修饰的核苷碱基共价结合于糖或修饰的糖的部分。
糖：术语“糖”是指呈闭合和/或打开形式的单糖。糖包括但不限于核糖、脱氧核糖、呋喃戊糖、吡喃戊糖和吡喃己糖部分。如本文所用，所述术语也涵盖替代常规糖分子使用的结构类似物，如二醇，其聚合物形成核酸类似物二醇核酸(“GNA”)的骨架。
修饰的糖：术语“修饰的糖”是指可替代糖的部分。修饰的糖模拟糖的空间排列、电子性质或某一其它物理化学性质。
核苷碱基：术语“核苷碱基”是指核酸的涉及于使一个核酸链以序列特异性方式结合于另一互补链的氢键结中的部分。最常见的天然存在的核苷碱基是腺嘌呤(A)、乌嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。在一些实施方案中，天然存在的核苷碱基是修饰的腺嘌呤、乌嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些实施方案中，天然存在的核苷碱基是甲基化腺嘌呤、乌嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些实施方案中，核苷碱基是“修饰的核苷碱基”，例如除腺嘌呤(A)、乌嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)以外的核苷碱基。在一些实施方案中，修饰的核苷碱基是甲基化腺嘌呤、乌嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些实施方案中，修饰的核苷碱基模拟核苷碱基的空间排列、电子性质或某一其它物理化学性质，并且保留使一个核酸链以序列特异性方式结合于另一核酸链的氢键结的性质。在一些实施方案中，修饰的核苷碱基可与全部五种天然存在的碱基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或乌嘌呤)配对，而不实质上影响解链行为、由细胞内酶的识别或寡核苷酸双链体的活性。
手性配体：术语“手性配体”或“手性助剂”是指具有手性，并且可并入反应中以使所述反应可以某一立体选择性进行的部分。
缩合试剂：在缩合反应中，术语“缩合试剂”是指使反应性较小的位点活化，并且致使它更易受另一试剂攻击的试剂。在一些实施方案中，所述另一试剂是亲核试剂。
封闭基团：术语“封闭基团”是指掩蔽官能团的反应性的基团。官能团可随后通过移除封闭基团来去掩蔽。在一些实施方案中，封闭基团是保护基。
部分：术语“部分”是指分子的特定区段或官能团。化学部分常被认定是包埋在分子中或附接于分子的化学实体。
固体载体：术语“固体载体”是指使得能够合成核酸的任何载体。在一些实施方案中，所述术语是指不溶于用于执行来合成核酸的反应步骤中的介质中，并且被衍生来包含反应性基团的玻璃或聚合物。在一些实施方案中，固体载体是高交联聚苯乙烯(HCP)或可控孔度玻璃(CPG)。在一些实施方案中，固体载体是可控孔度玻璃(CPG)。在一些实施方案中，固体载体是可控孔度玻璃(CPG)和高交联聚苯乙烯(HCP)的杂合载体。
连接部分：术语“连接部分”是指任选地位于末端核苷与固体载体之间或末端核苷与另一核苷、核苷酸或核酸之间的任何部分。
DNA分子：“DNA分子”是指脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、乌嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的呈其单链形式或双链螺旋形式的聚合形式。这个术语仅指分子的一级和二级结构，并且不将它限于任何特定三级形式。因此，这个术语包括尤其见于线性DNA分子(例如限制片段)、病毒、质粒和染色体中的双链DNA。在讨论特定双链DNA分子的结构时，在本文中可根据仅沿非转录DNA链(即具有与mRNA同源的序列的链)以5’至3’方向给出序列的正常惯例来描述序列。
编码序列：DNA“编码序列”或“编码区”是当置于适当表达控制序列的控制下时，在体内被转录和翻译成多肽的双链DNA序列。编码序列(“开放阅读框”或“ORF”)的边界是由在5′(氨基)末端的起始密码子和在3′(羧基)末端的翻译终止密码子来确定。编码序列可包括但不限于原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列，和合成DNA序列。聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3′。术语“非编码序列”或“非编码区”是指多核苷酸序列的不翻译成氨基酸的区域(例如5′和3′未翻译区域)。
阅读框：术语“阅读框”是指双链DNA分子的六个可能的阅读框(在各方向上有三个)中的一个。所用阅读框决定哪些密码子用于编码DNA分子的编码序列内的氨基酸。
反义：如本文所用，“反义”核酸分子包含互补于编码蛋白质的“有义”核酸，例如互补于双链cDNA分子的编码链、互补于mRNA序列或互补于基因的编码链的核苷酸序列。因此，反义核酸分子可通过氢键与有义核酸分子缔合。
摆动位置：如本文所用，“摆动位置”是指密码子的第三位置。在一些实施方案中，DNA分子中的在密码子的摆动位置内的突变在氨基酸层面上产生沉默或保守性突变。例如，存在四个编码甘氨酸的密码子，即GGU、GGC、GGA和GGG，因此任何摆动位置核苷酸突变成选自A、U、C和G的任何其它核苷酸都不导致编码的蛋白质在氨基酸层面上变化，并且因此是沉默取代。
沉默取代：“沉默取代”或“沉默突变”是其中密码子内的核苷酸被修饰，但不导致由所述密码子编码的氨基酸残基变化的取代或突变。实例包括密码子的第三位置中的突变以及某些密码子的第一位置中的突变，如在密码子“CGG”中，其在突变成AGG时仍然编码Arg。
基因：如本文所用的术语“基因”、“重组基因”和“基因构建体”是指编码蛋白质或其一部分的DNA分子或DNA分子的一部分。DNA分子可含有编码蛋白质的开放阅读框(如外显子序列)，并且还可包括内含子序列。如本文所用的术语“内含子”是指存在于给定基因中的不翻译成蛋白质，并且在一些而非所有情况下见于外显子之间的DNA序列。可合乎需要的是基因可操作地连接于(或它可包含)一个或多个启动子、增强子、阻遏子和/或其它调控序列以调节基因的活性或表达，如本领域中所熟知。
互补DNA：如本文所用，“互补DNA”或“cDNA”包括通过反转录mRNA合成，并且已自其移除间插序列(内含子)的重组多核苷酸。
同源性：“同源性”或“同一性”或“类似性”是指两个核酸分子之间的序列类似性。同源性和同一性可各自通过比较可出于比较目的而比对的各序列中的位置来确定。当比较的序列中的等效位置由相同碱基占据时，那么分子在那个位置是相同的；当等效位点由相同或类似核酸残基(例如在空间和/或电子性质方面类似)占据时，那么分子可称为在那个位置是同源的(类似的)。表述为同源性/类似性或同一性百分比是指在由比较的序列共有的位置处相同或类似核酸数目的函数。“无关”或“非同源”序列与本文所述的序列共有小于40％同一性、小于35％同一性、小于30％同一性、或小于25％同一性。在比较两个序列时，不存在残基(氨基酸或核酸)或存在额外残基也会降低同一性和同源性/类似性。
在一些实施方案中，术语“同源性”描述用于鉴定具有类似功能或基序的基因的基于数学的序列类似性比较。本文所述的核酸序列可用作“查询序列”来相对于公开数据库进行搜索，例如以鉴定其它家族成员、相关序列或同源物。在一些实施方案中，所述搜索可使用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。在一些实施方案中，BLAST核苷酸搜索可用NBLAST程序(计分＝100，字长＝12)来进行以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。在一些实施方案中，为出于比较目的获得空位比对，可如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述利用空位BLAST。当利用BLAST和空位BLAST程序时，可使用相应程序(例如XBLAST和BLAST)的缺省参数(参见www.ncbi.nlm.nih.gov)。
同一性：如本文所用，“同一性”是指当序列被对准以使序列匹配最大，即考虑空位和插入时，在两个或更多个序列中的相应位置处的相同核苷酸残基的百分比。同一性可易于通过已知方法计算，所述方法包括但不限于Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.编，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informaticsand Genome Projects，Smith，D.W.编，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis inMolecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；以及Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.编，M StocktonPress，New York，1991；和Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.AppliedMath.，48：1073(1988)中所述的那些。用以确定同一性的方法被设计来给与测试的序列之间的最大匹配。此外，用以确定同一性的方法被编纂在公开可用的电脑程序中。用以确定两个序列之间的同一性的电脑程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.等，Nucleic AcidsResearch 12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等，J.Molec.Biol.215：403-410(1990)以及Altschul等Nuc.AcidsRes.25：3389-3402(1997))。BLAST X程序可自NCBI和其它来源公开获得(BLAST Manual，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))。熟知SmithWaterman算法也可用于确定同一性。
异源：DNA序列的“异源”区域是较大DNA序列内在自然界中未发现与所述较大序列相关的可鉴定DNA区段。因此，当异源区域编码哺乳动物基因时，所述基因可通常由在来源生物体的基因组中不侧接哺乳动物基因组DNA的DNA侧接。异源编码序列的另一实例是其中编码序列自身不见于自然界中的序列(例如其中基因组编码序列含有内含子的cDNA或具有不同于未修饰的基因的密码子或基序的合成序列)。等位基因变化形式或天然存在的突变事件不产生如本文定义的异源DNA区域。
转换突变：术语“转换突变”是指DNA序列中的碱基变化，其中嘧啶(胞苷(C)或胸苷(T))被另一嘧啶置换，或嘌呤(腺苷(A)或乌苷(G))被另一嘌呤置换。
颠换突变：术语“颠换突变”是指DNA序列中的碱基变化，其中嘧啶(胞苷(C)或胸苷(T))被嘌呤(腺苷(A)或乌苷(G))置换，或嘌呤被嘧啶置换。
寡核苷酸：术语“寡核苷酸”是指含有核苷碱基、修饰的核苷碱基、糖、修饰的糖、磷酸酯桥或修饰的磷原子桥(在本文中也称为“核苷酸间键联”，其在本文进一步定义)的任何组合的核苷酸单体的聚合物或寡聚物。
寡核苷酸可为单链或双链。如本文所用，术语“寡核苷酸链”涵盖单链寡核苷酸。单链寡核苷酸可具有双链区域，并且双链寡核苷酸可具有单链区域。示例性寡核苷酸包括但不限于结构基因、包括控制和终止区域的基因、自我复制性系统(如病毒或质粒DNA)、单链和双链siRNA和其它RNA干扰试剂(RNAi剂或iRNA剂)、shRNA、反义寡核苷酸、核糖酶、微小RNA、微小RNA模拟物、超级微小RNA、适体、反义微小RNA、微小RNA拮抗剂、Ul衔接头、成三链体寡核苷酸、G四链体寡核苷酸、RNA活化剂、免疫刺激性寡核苷酸和诱饵寡核苷酸。
有效诱导RNA干扰的双链和单链寡核苷酸在本文中也称为siRNA、RNAi剂或iRNA剂。在一些实施方案中，这些RNA干扰诱导性寡核苷酸与称为RNAi诱导的沉默复合物(RISC)的细胞质多蛋白质复合物缔合。在许多实施方案中，单链和双链RNAi剂具有足够长度，以使它们可由内源性分子，例如由Dicer裂解，以产生可进入RISC机构，并且参与RISC介导的靶标序列(例如靶标mRNA)裂解的较小寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸可具有各种长度。在特定实施方案中，寡核苷酸的长度可在约2至约200个核苷酸的范围内。在各种相关实施方案中，单链、双链和三链寡核苷酸的长度可在约4至约10个核苷酸、约10至约50个核苷酸、约20至约50个核苷酸、约15至约30个核苷酸、约20至约30个核苷酸的范围内。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是约9至约39个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少4个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少5个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少6个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少7个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少8个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少9个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少10个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少11个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少12个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少15个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少20个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少25个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少30个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸是长度是至少18个核苷酸的互补链的双链体。在一些实施方案中，寡核苷酸是长度是至少21个核苷酸的互补链的双链体。
核苷酸间键联：如本文所用，短语“核苷酸间键联”大体上是指寡核苷酸的核苷酸单元之间的含磷键联，并且可与如以上以及本文中使用的“糖间键联”和“磷原子桥”互换。在一些实施方案中，核苷酸间键联是如见于天然存在的DNA和RNA分子中的磷酸二酯键联。在一些实施方案中，核苷酸间键联是“修饰的核苷酸间键联”，其中磷酸二酯键联的各氧原子任选地并独立地被有机或无机部分置换。在一些实施方案中，所述有机或无机部分选自但不限于＝S、＝Se、＝NR’、-SR’、-SeR’、-N(R’)2、B(R’)3、-S-、-Se-和-N(R’)-，其中各R’是独立地如下所定义和描述。在一些实施方案中，核苷酸间键联是磷酸三酯键联、硫代磷酸二酯键联或修饰的硫代磷酸三酯键联。本领域普通技术人员应了解由于在键联中存在酸或碱部分，在给定pH下，核苷酸间键联可以阴离子或阳离子形式存在。
除非另外规定，否则当与寡核苷酸序列一起使用时，s、s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7各自独立地表示如下表1中所说明的以下修饰的核苷酸间键联。
表1.示例性修饰的核苷酸间键联。
例如，(Rp，Sp)-ATsCs1GA具有1)T与C之间的硫代磷酸酯核苷酸间键联和2)C与G之间的具有结构的硫代磷酸三酯核苷酸间键联。除非另外规定，否则在寡核苷酸序列之前的Rp/Sp符号依序自寡核苷酸序列的5’至3’描述核苷酸间键联中的手性键联磷原子的构型。例如，在(Rp，Sp)-ATsCs1GA中，T与C之间的“s”键联中的磷具有Rp构型，并且C与G之间的“s1”键联中的磷具有Sp构型。在一些实施方案中，“全(Rp)”或“全(Sp)”用于指示寡核苷酸中的所有手性键联磷原子都分别具有相同Rp或Sp构型。例如，全(Rp)-GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC指示寡核苷酸中的所有手性键联磷原子都具有Rp构型；全(Sp)-GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC指示寡核苷酸中的所有手性键联磷原子都具有Sp构型。
寡核苷酸类型：如本文所用，短语“寡核苷酸类型”用于定义具有特定碱基序列、骨架键联样式(即核苷酸间键联类型样式，例如磷酸酯、硫代磷酸酯等)、骨架手性中心样式(即键联磷立体化学样式(Rp/Sp))和骨架磷修饰样式(例如式I中的“-XLR1”基团样式)的寡核苷酸。具有常见指定“类型”的寡核苷酸在结构上是彼此相同的。
本领域技术人员将了解本发明的合成方法在合成寡核苷酸链期间提供控制程度以使寡核苷酸链的各核苷酸单元可提前被设计和/或选择以具有在键联磷处的特定立体化学和/或在键联磷处的特定修饰、和/或特定碱基和/或特定糖。在一些实施方案中，提前设计和/或选择寡核苷酸链以在键联磷处具有立体中心的特定组合。在一些实施方案中，设计和/或确定寡核苷酸链以在键联磷处具有修饰的特定组合。在一些实施方案中，设计和/或选择寡核苷酸链以具有碱基的特定组合。在一些实施方案中，设计和/或选择寡核苷酸链以具有一种或多种以上结构特征的特定组合。本发明提供包含多种寡核苷酸分子或由多种寡核苷酸分子组成的组合物(例如手性控制的寡核苷酸组合物)。在一些实施方案中，所有所述分子都具有相同类型(即在结构上是彼此相同的)。然而，在许多实施方案中，提供的组合物通常以预定相对量包含多种不同类型的寡核苷酸。
手性控制：如本文所用，“手性控制”是指能够控制寡核苷酸链内每个手性键联磷的立体化学符号。短语“手性控制的寡核苷酸”是指关于手性键联磷以单一非对映异构形式存在的寡核苷酸。
手性控制的寡核苷酸组合物：如本文所用，短语“手性控制的寡核苷酸组合物”是指含有预定水平的个别寡核苷酸类型的寡核苷酸组合物。例如，在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸组合物包含一种寡核苷酸类型。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸组合物包含一种以上寡核苷酸类型。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸组合物包含多种寡核苷酸类型的混合物。本文进一步描述示例性手性控制的寡核苷酸组合物。
手性纯：如本文所用，短语“手性纯”用于描述手性控制的寡核苷酸组合物，其中所有寡核苷酸都关于键联磷以单一非对映异构形式存在。
手性均一：如本文所用，短语“手性均一”用于描述寡核苷酸分子或类型，其中所有核苷酸单元都在键联磷处具有相同立体化学。例如，核苷酸单元都在键联磷处具有Rp立体化学的寡核苷酸是手性均一的。同样，核苷酸单元都在键联磷处具有Sp立体化学的寡核苷酸是手性均一的。
预定：预定是指例如与随机发生或达成相反，蓄意地进行选择。本领域普通技术人员在阅读本说明书的情况下将了解，本发明提供允许选择特定寡核苷酸类型来制备提供的组合物和/或包括在提供的组合物中，并且进一步允许准确控制任选地以所选特定相对量进行所选特定类型的制备，以制备提供的组合物的新型和惊人技术。所述提供的组合物如本文所述是“预定的”。因为可含有某些个别寡核苷酸类型的组合物碰巧已通过不能被控制来有意产生特定寡核苷酸类型的过程产生，所以它们不是“预定”组合物。在一些实施方案中，预定组合物是可有意再产生(例如通过重复受控过程)的组合物。
键联磷：如本文所定义，短语“键联磷”用于指示所提及的特定磷原子是核苷酸间键联中存在的磷原子，所述磷原子对应于如存在于天然存在的DNA和RNA中的核苷酸间键联的磷酸二酯的磷原子。在一些实施方案中，键联磷原子在修饰的核苷酸间键联中，其中磷酸二酯键联的各氧原子任选地并独立地被有机或无机部分置换。在一些实施方案中，键联磷原子是式I的P*。在一些实施方案中，键联磷原子是手性的。在一些实施方案中，手性键联磷原子是式I的P*。
P修饰：如本文所用，术语“P修饰”是指在键联磷处的除立体化学修饰以外的任何修饰。在一些实施方案中，P修饰包含添加、取代或移除共价连接于键联磷的侧挂部分。在一些实施方案中，“P修饰”是-X-L-R1，其中X、L和R1各自独立地如本文以及以下所定义和描述。
嵌段聚体：如本文所用的术语“嵌段聚体”是指表征各个别核苷酸单元的结构特征样式的特征在于存在至少两个在核苷酸间磷键联处共有共同结构特征的连续核苷酸单元的寡核苷酸链。共同结构特征是指在键联磷处的共同立体化学或在键联磷处的共同修饰。在一些实施方案中，至少两个在核苷酸间磷键联处共有共同结构特征的连续核苷酸单元称为“嵌段”。
在一些实施方案中，嵌段聚体是“立体嵌段聚体”，例如至少两个连续核苷酸单元在键联磷处具有相同立体化学。所述至少两个连续核苷酸单元形成“立体嵌段”。例如，(Sp，Sp)-ATsCs1GA是立体嵌段聚体，因为至少两个连续核苷酸单元Ts和Cs1在键联磷处具有相同立体化学(均是Sp)。在相同寡核苷酸(Sp，Sp)-ATsCs1GA中，TsCs1形成嵌段，并且它是立体嵌段。
在一些实施方案中，嵌段聚体是“P修饰嵌段聚体”，例如至少两个连续核苷酸单元在键联磷处具有相同修饰。所述至少两个连续核苷酸单元形成“P修饰嵌段”。例如，(Rp，Sp)-ATsCsGA是P修饰嵌段聚体，因为至少两个连续核苷酸单元Ts和Cs具有相同P修饰(即两者均是硫代磷酸二酯)。在相同寡核苷酸(Rp，Sp)-ATsCsGA中，TsCs形成嵌段，并且它是P修饰嵌段。
在一些实施方案中，嵌段聚体是“键联嵌段聚体”，例如至少两个连续核苷酸单元在键联磷处具有相同立体化学和相同修饰。至少两个连续核苷酸单元形成“键联嵌段”。例如，(Rp，Rp)-ATsCsGA是键联嵌段聚体，因为至少两个连续核苷酸单元Ts和Cs具有相同立体化学(均是Rp)和P修饰(均是硫代磷酸酯)。在相同寡核苷酸(Rp，Rp)-ATsCsGA中，TsCs形成嵌段，并且它是键联嵌段。
在一些实施方案中，嵌段聚体包含一个或多个独立地选自立体嵌段、P修饰嵌段和键联嵌段的嵌段。在一些实施方案中，嵌段聚体关于一个嵌段是立体嵌段聚体，和/或关于另一嵌段是P修饰嵌段聚体，和/或关于另一嵌段是键联嵌段聚体。例如，(Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Sp，Sp，Sp)-AAsTsCsGsAs1Ts1Cs1Gs1ATCG关于立体嵌段AsTsCsGsAs1(在键联磷处都是Rp)或Ts1Cs1Gs1(在键联磷处都是Sp)是立体嵌段聚体，关于P修饰嵌段AsTsCsGs(都是s键联)或As1Ts1Cs1Gs1(都是s1键联)是P修饰嵌段聚体，或关于键联嵌段AsTsCsGs(在键联磷处都是Rp，并且都是s键联)或Ts1Cs1Gs1(在键联磷处都是Sp，并且都是s1键联)是键联嵌段聚体。
交替聚体：如本文所用的术语“交替聚体”是指表征各个别核苷酸单元的结构特征样式的特征在于寡核苷酸链的两个连续核苷酸单元在核苷酸间磷键联处不共有特定结构特征的寡核苷酸链。在一些实施方案中，设计交替聚体以使它包含重复样式。在一些实施方案中，设计交替聚体以使它不包含重复样式。
在一些实施方案中，交替聚体是“立体交替聚体”，例如两个连续核苷酸单元在键联磷处不具有相同立体化学。例如，(Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，SpRp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp)-GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC。
在一些实施方案中，交替聚体是“P修饰交替聚体”，例如两个连续核苷酸单元在键联磷处不具有相同修饰。例如，全(Sp)-CAs1GsT，其中各键联磷具有不同于其它键联磷的P修饰。
在一些实施方案中，交替聚体是“键联交替聚体”，例如两个连续核苷酸单元在键联磷处不具有相同立体化学或相同修饰。例如，(Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，SpRp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp)-GsCs1CsTs1CsAs1GsTs1CsTs1GsCs1TsTs2CsGs3CsAs4CsC。
单聚体：如本文所用的术语“单聚体”是指表征各个别核苷酸单元的结构特征样式使得链内所有核苷酸单元都在核苷酸间磷键联处共有至少一种共同结构特征的寡核苷酸链。共同结构特征是指在键联磷处的共同立体化学或在键联磷处的共同修饰。
在一些实施方案中，单聚体是“立体单聚体”，例如所有核苷酸单元都在键联磷处具有相同立体化学。例如，全(Sp)-CsAs1GsT，其中所有键联都具有Sp磷。
在一些实施方案中，单聚体是“P修饰单聚体”，例如所有核苷酸单元都在键联磷处具有相同修饰。例如，(Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp)-GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC，其中所有核苷酸间键联都是硫代磷酸二酯。
在一些实施方案中，单聚体是“键联单聚体”，例如所有核苷酸单元都在键联磷处具有相同立体化学和相同修饰。例如，全(Sp)-GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC，其中所有核苷酸间键联都是具有Sp键联磷的硫代磷酸二酯。
间隔聚体(gapmer)：如本文所用，术语“间隔聚体”是指特征在于寡核苷酸链的至少一个核苷酸间磷键联是磷酸二酯键联(例如像见于天然存在的DNA或RNA中的那些)的寡核苷酸链。在一些实施方案中，寡核苷酸链的一个以上核苷酸间磷键联是磷酸二酯键联，如见于天然存在的DNA或RNA中的那些。例如，全(Sp)-CAs1GsT，其中C与A之间的核苷酸间键联是磷酸二酯键联。
跳跃聚体(skipmer)：如本文所用，术语“跳跃聚体”是指一种类型的间隔聚体，其中寡核苷酸链的每隔一个核苷酸间磷键联是磷酸二酯键联，例如像见于天然存在的DNA或RNA中的那些，并且寡核苷酸链的每隔一个核苷酸间磷键联是修饰的核苷酸间键联。例如，全(Sp)-AsTCs1GAs2TCs3G。
出于本发明的目的，化学元素是根据Handbook of Chemistry andPhysics，第67版，1986-87内里封面的CAS版元素周期表来鉴定。
本文所述的关于本发明的化合物和组合物的方法和结构也适用于这些化合物和组合物的药学上可接受的酸或碱加成盐和所有立体异构形式。
附图简述
图1.手性控制的寡核苷酸相较于立体无规寡核苷酸在HPLC上具有显著不同的保留时间。A：粗手性控制的寡核苷酸(寡核苷酸101)；C：相应立体无规寡核苷酸(寡核苷酸118)。
图2.手性控制的寡核苷酸和立体无规寡核苷酸的HPLC。A：寡核苷酸101(全Rp)；B：寡核苷酸102(全Sp)；和C：寡核苷酸118(立体无规)。
图3.手性控制的寡核苷酸和立体无规寡核苷酸的Tm。
图4.代表性数据：靶标和内源性对照对产生单一扩增子的解链曲线分析。
图5.化合物的代表性数据和IC50曲线。
图6.粗(Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC]((RRS)6-R、立体嵌段聚体和P修饰单聚体(s-单聚体))的HPLC。
图7.纯化(Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC]((RRS)6-R、立体嵌段聚体和P修饰单聚体(s-单聚体))的HPLC。
图8.(Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC]((RRS)6-R、立体嵌段聚体和P修饰单聚体(s-单聚体))的LCMS。
图9.粗(Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC](S-(RRS)6、立体嵌段聚体和P修饰单聚体(s-单聚体))的HPLC。
图10.纯化(Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC](S-(RRS)6、立体嵌段聚体和P修饰单聚体(s-单聚体))的HPLC。
图11.(Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC](S-(RRS)6、立体嵌段聚体和P修饰单聚体(s-单聚体))的LCMS。
图12.粗(Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp)d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC](RS-(RRS)5-RR、立体嵌段聚体和P修饰单聚体(s-单聚体))的HPLC。
图13.纯化(Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp)d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC](RS-(RRS)5-RR、立体嵌段聚体和P修饰单聚体(s-单聚体))的HPLC。
图14.(Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC](RS-(RRS)5-RR、立体嵌段聚体和P修饰单聚体(s-单聚体))的LCMS。
图15.粗(Rp，Rp，Rp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Rp，Rp，Rp)-d[5mCs1As1Gs1Ts15mCs1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15mCs1G](3R-5S-3R、立体嵌段聚体和P修饰单聚体(s1-单聚体))的HPLC。
图16.纯化(Rp，Rp，Rp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Rp，Rp，Rp)-d[5mCs1As1Gs1Ts15mCs1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15mCs1G](3R-5S-3R、立体嵌段聚体和P修饰单聚体(s1-单聚体))的HPLC。
图17.(Rp，Rp，Rp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Rp，Rp，Rp)-d[5mCs1As1Gs1Ts15mCs1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15mCs1G](3R-5S-3R、立体嵌段聚体和P修饰单聚体(s1-单聚体))的LCMS。
图18.粗全(Rp)-d[Cs3As3Gs3T](P修饰单聚体(s3-单聚体)、立体单聚体和键联单聚体)的HPLC。
图19.全(Rp)-d[Cs3As3Gs3T](P修饰单聚体(s3-单聚体)、立体单聚体和键联单聚体)的LCMS。
图20.粗全(Rp)-d[Cs2As2Gs2T](P修饰单聚体(s2-单聚体)、立体单聚体和键联单聚体)的HPLC。
图21.全(Rp)-d[Cs2As2Gs2T](P修饰单聚体(s2-单聚体)、立体单聚体和键联单聚体)的LCMS。
图22.粗全(Sp)-d[Cs1AGs1T](间隔聚体、立体交替聚体、P修饰交替聚体和键联交替聚体)的HPLC。
图23.全(Sp)-d[Cs1AGs1T](间隔聚体、立体交替聚体、P修饰交替聚体和键联交替聚体)的LCMS。
图24.粗全(Rp)-d[TsCs1AsT](立体单聚体、P修饰交替聚体和键联交替聚体)。
图25.全(Rp)-d[TsCs1AsT](立体单聚体、P修饰交替聚体和键联交替聚体)的LCMS。
图26.WO2012/030683中所述，并且涵盖用于使用本发明方法合成的示例性寡核苷酸。
图27.WO2012/030683中所述，并且涵盖用于使用本发明方法合成的示例性寡核苷酸。
图28.WO2012/030683中所述，并且涵盖用于使用本发明方法合成的示例性寡核苷酸。
图29.WO2012/030683中所述，并且涵盖用于使用本发明方法合成的示例性寡核苷酸。
图30.WO2012/030683中所述，并且涵盖用于使用本发明方法合成的示例性寡核苷酸。
图31.WO2012/030683中所述的用于本发明方法中的示例性接头。
图32.WO2012/030683中所述的用于本发明方法中的示例性接头。
图33.WO2012/030683中所述的用于本发明方法中的示例性接头。
图34.WO2012/030683中所述的用于本发明方法中的示例性接头。
图35.粗DMT保护的寡核苷酸：ONT-75(图幅A)；ONT-80(图幅B)；ONT-77(图幅C)；ONT-81(图幅D)；ONT-87(图幅E)；ONT-88(图幅F)；ONT-89(图幅G)；ONT-82(图幅H)；ONT-84(图幅I)；ONT-85(图幅J)；ONT-86(图幅K)的RP-HPLC。
图36.纯化的DMT去除的寡核苷酸：ONT-75(图幅A)；ONT-80(图幅B)；ONT-77(图幅C)；ONT-81(图幅D)；ONT-87(图幅E)；ONT-88(图幅F)；ONT-89(图幅G)；ONT-82(图幅H)；ONT-84(图幅I)；ONT-85(图幅J)；ONT-86(图幅K)的RP-HPLC。
图37.纯化的DMT去除的寡核苷酸：ONT-75、ONT-77、ONT-80、ONT-81、ONT-87、ONT-88、ONT-89和ONT-41的RP-HPLC迹线的重叠图(图幅A)；ONT-75、ONT-77、ONT-80、ONT-81、ONT-87、ONT-88、ONT-89和ONT-41的扩展重叠视图(图幅B)。
图38.纯化的DMT去除的寡核苷酸：ONT-82、ONT-84、ONT-85、ONT-86和ONT-83的RP-HPLC迹线的重叠图(图幅A)；ONT-82、ONT-84、ONT-85、ONT-86和ONT-83的扩展重叠视图(图幅B)。
图39.手性控制的寡核苷酸ONT-81、ONT-41、ONT-75、ONT-77和ONT-80的Tm重叠图。
图40.对于ONT-41、ONT-75、ONT-80、ONT-77和ONT-81，在5mg/kg立体异构体或米泊美生IP给药之后，相对于PBS，huApoB小鼠中的血清人载脂蛋白B蛋白水平的时程的图解表示。向下箭头指示给药天数。
图41.对于米泊美生、“完全R”米泊美生、“完全S”米泊美生、“RSR”米泊美生和“SRS”米泊美生，在5mg/kg立体异构体或米泊美生IP给药之后，相对于PBS，huApoB小鼠中的血清人载脂蛋白B蛋白水平的时程的图解表示。向下箭头指示给药天数。
图42.对于米泊美生、“完全R”米泊美生、“完全S”米泊美生、“RSR”米泊美生和“SRS”米泊美生，在10mg/kg立体异构体或米泊美生IP给药之后，相对于PBS，huApoB小鼠中的血清人载脂蛋白B蛋白水平的时程的图解表示。向下箭头指示给药天数。
图43.对于米泊美生、ONT-87、ONT-88和ONT-89，在5mg/kg立体异构体或米泊美生IP给药之后，相对于PBS，huApoB小鼠中的血清人载脂蛋白B蛋白水平的时程的图解表示。向下箭头指示给药天数。
图44.对于ONT-87、ONT-88和ONT-89，在10mg/kg立体异构体或米泊美生IP给药之后，相对于PBS，huApoB小鼠中的血清人载脂蛋白B蛋白水平的时程的图解表示。向下箭头指示给药天数。
图45.在用siRNA双链体处理Hep3B之后剩余的PCSK-9mRNA％的图解表示。
图46.在用siRNA双链体处理Hep3B之后剩余的PCSK-9mRNA％曲线拟合的图解表示。
图47.在用siRNA双链体处理HeLa之后剩余的PCSK-9mRNA％的图解表示。
图48.在用siRNA双链体处理HeLa之后剩余的PCSK-9mRNA％曲线拟合的图解表示。
图49.在用含有3个硫代磷酸酯立体中心的siRNA双链体处理HeLa之后剩余的PCSK-9mRNA％的图解表示。
图50.在用含有3个硫代磷酸酯立体中心的siRNA双链体处理HeLa之后剩余的PCSK-9mRNA％曲线拟合的图解表示。
图51.纯化的DMT去除的寡核苷酸：ONT-108、ONT-109和ONT-114的RP-HPLC迹线的重叠图。
图52.纯化的DMT去除的寡核苷酸：ONT-106、ONT-107和ONT-114的RP-HPLC迹线的重叠图。
图53.在10mg/kg立体异构体或米泊美生IP给药之后，相对于PBS，huApoB小鼠中的血清人载脂蛋白B蛋白水平的时程的图解表示。向下箭头指示给药天数。
图54.在多次5mg/kg IP剂量的立体异构体或米泊美生之后，相对于PBS，huApoB小鼠中的血清人载脂蛋白B蛋白水平的时程的图解表示(n＝3-4)。向下箭头指示给药天数。
图55.在10mg/kg立体异构体(ONT-87、ONT-88或ONT-89)或米泊美生IP给药之后，相对于PBS，huApoB小鼠中的第17天血清人载脂蛋白B蛋白水平。
图56.在10mg/kg立体异构体(ONT-87、ONT-88或ONT-89)或米泊美生IP给药之后，相对于PBS，huApoB小鼠中的第24天血清人载脂蛋白B蛋白水平。
图57.在10mg/kg立体异构体(ONT-41、ONT-87、ONT-88或ONT-89)给药之后，相对于PBS，huApoB小鼠中的血清人载脂蛋白B蛋白水平。
图58.在10mg/kg立体异构体(ONT-87、ONT-88或ONT-89)给药之后，相对于PBS，huApoB小鼠中的血清人载脂蛋白B蛋白水平。
图59.用于寡核苷酸ONT-75、ONT-77、ONT-80、ONT-81、ONT-87、ONT-88、ONT-89和ONT-41的svPDE消化研究的IEX-HPLC定量分析的图。
图60.使用nP1对寡核苷酸ONT-75(全(Rp))-Gs5mCs5mCsTs5m CsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC进行的酶促消化研究的IEX-HPLC。
图61.使用nP1对寡核苷酸ONT-77(Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Rp，Rp，Rp，Rp)-Gs5mCs5mCsTs 5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC(5R-10S-4R)进行的酶促消化研究的IEX-HPLC。
图62.使用nP1对寡核苷酸ONT-80(全(Sp))-Gs5mCs5mCsTs5m CsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC进行的酶促消化研究的IEX-HPLC。
图63.使用nP1对寡核苷酸ONT-81(Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Sp，Sp，Sp，Sp)-Gs5mCs5mCsTs5 mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC(5S-10R-4S)进行的酶促消化研究的IEX-HPLC。
图64.使用nP1对寡核苷酸ONT-87(Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Sp，Sp，Rp，Sp，Sp，Rp，Sp，Sp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp)-Gs5mCs5mCsT s5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC(5R-(SSR)3-5R)进行的酶促消化研究的IEX-HPLC。
图65.使用nP1对寡核苷酸ONT-88(Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp)-Gs5mCs5mCsTs5 mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC(5S-(RRS)3-5S)进行的酶促消化研究的IEX-HPLC。
图66.使用nP1对寡核苷酸ONT-89(Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp)-Gs5mCs5mCsTs5 mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC((SR)9S)进行的酶促消化研究的IEX-HPLC。
图67.使用nP1对寡核苷酸ONT-41(非对映异构混合物)-Gs5mC s5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs 5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5m C进行的酶促消化研究的IEX-HPLC。
图68.手性纯寡核苷酸ONT-75和ONT-77与立体无规“母体”寡核苷酸ONT-41(米泊美生)在预孵育的大鼠完全肝组织均浆中的稳定性的比较。
图69.使用单体13b产生寡核苷酸衍生物的UPLC图谱。
图70.使用单体27产生寡核苷酸衍生物的UPLC图谱。
图71.在用立体异构体(ONT-82、ONT-83、ONT-84、ONT-85或ONT-86)转染原代小鼠肝细胞之后，相对于模拟和未处理的对照，小鼠载脂蛋白B/GAPDH mRNA水平。
图72.在用立体异构体(ONT-83、ONT-84、ONT-85或ONT-86)转染原代小鼠肝细胞之后，相对于模拟和未处理的对照，小鼠载脂蛋白B/GAPDH mRNA水平。
某些实施方案的详述
合成寡核苷酸提供在广泛多种应用中适用的分子工具。例如，寡核苷酸适用于治疗、诊断、研究和新型纳米材料应用中。天然存在的核酸(例如未修饰的DNA或RNA)的使用例如因它们易受核酸内切酶和核酸外切酶影响而受限制。因此，各种合成对应物已被开发来绕过这些缺点。这些包括含有致使这些分子较不易受降解影响的骨架修饰的合成寡核苷酸。从结构观点来看，对核苷酸间磷酸酯键联的所述修饰引入手性。已变得明确的是寡核苷酸的某些性质可受形成寡核苷酸的骨架的磷原子的构型影响。例如，体外研究已显示反义核苷酸的性质(如结合亲和力、结合互补RNA的序列特异性、对核酸酶的稳定性)尤其受骨架的手性(例如磷原子的构型)影响。因此，本发明涵盖认识到对包含磷原子修饰的核酸的手性控制的寡核苷酸以及相关组合物和方法存在需要。在一些实施方案中，本发明提供在结构上被优化以展现某些合乎体外和/或体内应用需要的特征，例如像稳定性增加和功效改进的手性控制的寡核苷酸。
已知其中核苷酸间磷酸酯的两个非桥接氧原子中的一个或两个被不同类型的原子或取代基置换的寡核苷酸适用作治疗剂和探针来阐明酶促反应机制。然而，所述寡核苷酸常展现阻止它们用于众多应用中的不合需要的性质(例如易受核酸酶降解、细胞膜渗透性不良)。因此，已开发各种类型的化学修饰来试图改进它们的性质和/或赋予新功能性。
修饰的寡核苷酸结构
如上所指示，鉴于寡核苷酸组合物适用于各种应用和适应症中，本领域技术人员已致力于开发寡核苷酸结构的相较于天然存在的寡核苷酸分子，可具有优选或合乎需要的特征或属性(例如如用于特定应用和适应症中)的修饰形式。以下描述示例性所述修饰。
WO2010/141471(在本文中是“Traversa I”)传授修饰来具有降低的净聚阴离子电荷的不同类型的核酸构建体的修饰。WO2010/039543(在本文中是“Travera II”)传授用于制备聚阴离子电荷降低的中性多核苷酸(NN)的组合物和方法。WO2008/008476(在本文中是“TraversaIII”)描述SATE(Imbach型)磷酸酯前药的合成。Traversa I、II和III未传授如由本发明所述的手性控制的寡核苷酸、其组合物以及制备和使用所述寡核苷酸和组合物的方法。
WO2010/072831(在本文中是“Girindus等”)也传授寡核苷酸的修饰。具体来说，Girindus等传授使用硫化试剂来产生硫代磷酸三酯作为前药。Girindus等未传授如由本发明所述的手性控制的寡核苷酸、其组合物以及制备和使用所述寡核苷酸和组合物的方法。
类似地，WO2004/085454(在本文中是“Avecia I”)传授通过例如使聚H-膦酸二酯短暂硅烷基化来制备硫代磷酸酯寡核苷酸。WO2001/027126(在本文中是“Avecia II”)传授用于通过使H-膦酸酯单体偶联于固体承载的5’-羟基寡核苷酸，并且进一步使所得H-膦酸二酯硫化成硫代磷酸三酯来固相合成磷酸三酯寡核苷酸的方法。WO2001/064702(在本文中是“Avecia III”)的公开内容类似于AveciaII，并且进一步描述在不同固体载体上进行固相合成。Avecia I、II和III未传授如由本发明所述的手性控制的寡核苷酸、其组合物以及制备和使用所述寡核苷酸和组合物的方法。
WO1997/006183(在本文中是“Chiron”)传授阳离子核苷酸间键联包含不对称磷的寡核苷酸，如立体纯酰胺化物。Chiron传授通过使非对映异构体的混合物结晶或通过使用例如柱色谱法进行拆分获得的立体纯寡核苷酸。Chiron未传授如由本发明所述的手性控制的寡核苷酸、其组合物以及制备和使用所述寡核苷酸和组合物的方法。
WO2009/146123(在本文中是“Spring Bank I”)传授用于使用取代的磷酸酯寡核苷酸和硫代磷酸三酯治疗病毒性感染的组合物和方法。WO2007/070598(在本文中是“Spring Bank II”)传授磷酸三酯前药作为抗病毒核酸，并且传授硫代磷酸酯前药的合成。Spring Bank I和II未传授如由本发明所述的手性控制的寡核苷酸、其组合物以及制备和使用所述寡核苷酸和组合物的方法。
EP0779893(在本文中是“Hybridon”)传授用于增加细胞对反义寡核苷酸的摄取的亲脂性前药，并且观察到Rp和Sp硫代磷酸酯和硫代磷酸三酯二聚体可具有不同酶稳定性性质。Hybridon未传授如由本发明所述的手性控制的寡核苷酸、其组合物以及制备和使用所述寡核苷酸和组合物的方法。
WO1997/047637(在本文中是“Imbach I”)大体上传授Imbach“SATE”(S-酰基硫代乙基)前药寡核苷酸组合物和方法。ImbachI描述例如生物可逆性磷酸三酯前药和使用合成后烷基化或含有前药基团的亚磷酰胺制备某些前药寡核苷酸。US 6,124,445(在本文中是“Imbach II”)传授修饰的反义和嵌合前药寡核苷酸。Imbach I和II未传授如由本发明所述的手性控制的寡核苷酸、其组合物以及制备和使用所述寡核苷酸和组合物的方法。
WO2006/065751(在本文中是“Beaucage”)传授包含热不稳定性取代基(所述取代基是通过亚磷酰胺单体引入)的CpG寡核苷酸硫代磷酸酯前药以及其应用。Beaucage未传授如由本发明所述的手性控制的寡核苷酸、其组合物以及制备和使用所述寡核苷酸和组合物的方法。
Takeshi Wada等开发用于使用亚酰胺化物手性助剂立体控制合成P手性核酸的新型方法(JP4348077、WO2005/014609、WO2005/092909和WO2010/064146，在本文中共同称为“Wada I”)。具体来说，WO2010/064146(在本文中称为“Wada II”)公开用于合成磷原子修饰的核酸的方法，其中控制在磷处的立体化学构型。然而，Wada II的方法受限制，因为它们不提供以控制和设计方式对各手性键联磷进行个别P修饰。即，Wada II的用于P修饰的键联的方法提供产生缩合的中间聚H-膦酸酯寡核苷酸链，其一旦被构建成所需长度，即在键联磷处被大量修饰以提供例如所需硫代磷酸二酯、氨基磷酸酯或硼代磷酸酯或其它所述磷原子修饰的核酸(在文献的第36页方案6中称为途径B)。此外，Wada II的H-膦酸酯寡核苷酸链具有较短长度(例如二聚体、三聚体或四聚体)。组合在途径B中不存在加帽步骤的事实(此通常由于“n-1”型副产物累积而呈现低粗纯度)，Wada II途径关于合成较长寡核苷酸含有局限性。尽管Wada II大体上涵盖特定寡核苷酸可被设想来在各键联磷处含有不同修饰，但Wada II未描述或表明如本文所述的用于将所述修饰进行受控迭代性安置的方法。就Wada II描绘不需要在于键联磷处修饰之前完全装配H-膦酸酯中间寡核苷酸的合成循环(在其中称为途径A，第35页，方案5“通过途径A合成包含式1的手性X磷酸酯部分的核酸(Synthesis of a nucleic acid comprising a chiral X-phosphonate moiety of Formula 1 via Route)A”)而言，这个一般性公开内容未传授如由本发明提供的为安置某些P修饰所需的某些关键步骤，并且尤其不具有任何程度的效率和多面性以使这个循环将适用于合成手性控制的P修饰的寡核苷酸，并且尤其是长度较长的寡核苷酸。
Wada II的至少一种所述低效性由Wada等在WO2012/039448(在本文中是“Wada III”)中指示。Wada III传授在Wada II方法中用于产生H-膦酸酯寡核苷酸的新型手性助剂，所述寡核苷酸一旦构建即可随后被修饰来尤其提供硫代磷酸酯等。Wada等在Wada III中观察到Wada II中公开的四种类型的手性助剂在键联磷处与磷形成强键，并且因此不允许高效移除。Wada III指示移除Wada II手性助剂需要严苛条件，所述条件倾向于损害产物寡核苷酸的完整性。Wada III观察到这在合成长链寡核苷酸时尤其成问题，原因至少是随着一个或多个降解反应进行，产生可进一步与产物寡核苷酸反应，并且降解产物寡核苷酸的其它副产物。因此，Wada III提供可在温和酸性条件下通过释放H-膦酸酯核苷酸间键联的SN1机制(途径B)，或在相对温和碱性条件下通过β-消除路径更高效地自寡核苷酸裂解的手性助剂。
化学和合成领域技术人员将立刻了解与产生手性控制的寡核苷酸(如由本发明提供的那些)相关的复杂性。例如，为合成和分离手性控制的寡核苷酸，用于各单体添加的条件必须设计成使(1)化学可与增长寡核苷酸的每个部分相容；(2)在各单体添加期间产生的副产物不损害增长寡核苷酸的结构和立体化学完整性；以及(3)粗最终产物组合物是允许分离所需手性控制的寡核苷酸产物的组合物。
寡核苷酸硫代磷酸酯已显示治疗潜力(Stein等，Science(1993)，261：1004-12；Agrawal等，Antisence Res.and Dev.(1992)，2：261-66；Bayever等，Antisense Res.and Dev.(1993)，3：383-390)。在不考虑硫代磷酸酯的立体化学下制备的寡核苷酸硫代磷酸酯以2n非对映异构体的混合物形式存在，其中n是核苷酸间硫代磷酸酯键联的数目。这些非对映异构硫代磷酸酯的化学和生物性质可不同。例如，Wada等(Nucleic Acids Symposium Series第51期第119-120页；doi：10.1093/nass/nrm060)发现立体确定的(Rp)-(Ups)9U/(Ap)9A双链体显示的Tm值高于天然(Up)9U/(Ap)9A，并且立体确定的(Sp)-(Ups)9U不形成双链体。在另一实例中，在由Tang等(Nucleosides Nucleotides(1995)，14：985-990)进行的研究中，发现立体纯Rp-寡脱氧核糖核苷硫代磷酸酯具有的对人血清内源性核酸酶的稳定性低于磷手性未确定的母体寡脱氧核糖核苷硫代磷酸酯。
手性控制的寡核苷酸和手性控制的寡核苷酸组合物
本发明提供具有高粗纯度和高非对映异构纯度的手性控制的寡核苷酸和手性控制的寡核苷酸组合物。在一些实施方案中，本发明提供具有高粗纯度的手性控制的寡核苷酸和手性控制的寡核苷酸组合物。在一些实施方案中，本发明提供具有高非对映异构纯度的手性控制的寡核苷酸和手性控制的寡核苷酸组合物。
在一些实施方案中，本发明提供包含多个具有至少一种类型的寡核苷酸的手性控制的组合物，其中各类型是由以下确定：1)碱基序列；2)骨架键联样式；3)骨架手性中心样式；和4)骨架P修饰样式。
在一些实施方案中，本发明提供包含多个具有相同类型的寡核苷酸的手性控制的组合物，其中各类型是由以下确定：1)碱基序列；2)骨架键联样式；3)骨架手性中心样式；和4)骨架P修饰样式。在一些实施方案中，本发明提供包含多个具有两种或更多种类型的寡核苷酸的手性控制的组合物，其中各类型是由以下确定：1)碱基序列；2)骨架键联样式；3)骨架手性中心样式；和4)骨架P修饰样式。
在一些实施方案中，本发明提供包含一个或多个关于手性键联磷是非对映异构纯的核苷酸间键联的寡核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供包含一个或多个具有式I结构的非对映异构纯核苷酸间键联的寡核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供包含一个或多个关于手性键联磷是非对映异构纯的核苷酸间键联以及一个或多个磷酸二酯键联的寡核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供包含一个或多个具有式I结构的非对映异构纯核苷酸间键联以及一个或多个磷酸二酯键联的寡核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供包含一个或多个具有式I-c结构的非对映异构纯核苷酸间键联以及一个或多个磷酸二酯键联的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸是通过使用如本申请中所述的立体选择性寡核苷酸合成来制备以形成预设计的关于手性键联磷是非对映异构纯的核苷酸间键联。例如，在一种示例性寡核苷酸(Rp/Sp，Rp/Sp，Rp/Sp，Rp，Rp，Sp，Sp，Sp，Sp，SpSp，Sp，Sp，Sp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGs1Cs1As1CsC]中，前三个核苷酸间键联是使用传统寡核苷酸合成方法构建，并且非对映异构纯核苷酸间键联是在如本申请中所述的立体化学控制下构建。以下进一步描述示例性核苷酸间键联，包括具有式I结构的那些。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含在本申请中进一步描述的序列，包括但不限于在表2和4以及附录A、B和C中描述的那些。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含关于在键联磷处的手性是立体纯和立体无规核苷酸间键联的组合。例如，在一些实施方案中，合乎需要的是在寡核苷酸内具有否则关于在键联磷处的手性是立体无规的一个或多个立体确定的核苷酸间键联的嵌段。在一些实施方案中，合乎需要的是在寡核苷酸内具有否则关于在键联磷处的手性是立体确定的一个或多个立体无规核苷酸间键联的嵌段。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的至少一个核苷酸单元是使用如本申请中所述的立体选择性寡核苷酸合成来安置以形成预设计的关于手性键联磷是非对映异构纯的核苷酸间键联。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的至少两个核苷酸单元是使用如本申请中所述的立体选择性寡核苷酸合成来安置以形成至少两个预设计的关于手性键联磷是非对映异构纯的核苷酸间键联。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的至少三个核苷酸单元是使用如本申请中所述的立体选择性寡核苷酸合成来安置以形成至少三个预设计的关于手性键联磷是非对映异构纯的核苷酸间键联。在一些实施方案中，至少一个、两个或三个预设计的非对映异构纯核苷酸间键联彼此邻近。在一些实施方案中，至少一个、两个或三个预设计的非对映异构纯核苷酸间键联不彼此邻近。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的核苷酸单元是使用如本申请中所述的立体选择性寡核苷酸合成来安置以形成预设计的关于手性键联磷是非对映异构纯的核苷酸间键联。如本文所述，在一些实施方案中，至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的核苷酸单元以一个或多个嵌段形式存在以提供嵌段聚体。在一些实施方案中，至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的核苷酸单元以交替样式存在以提供交替聚体。相关领域技术人员将认识到任何合乎需要的样式都可使用本发明方法达成，并且涵盖在本文中。
在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸内的至少两个个别核苷酸间键联具有相对于彼此不同的立体化学和/或不同的P修饰。在某些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸内的至少两个个别核苷酸间键联具有相对于彼此不同的P修饰。在某些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸内的至少两个个别核苷酸间键联具有相对于彼此不同的P修饰，并且其中所述手性控制的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联。在某些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸内的至少两个个别核苷酸间键联具有相对于彼此不同的P修饰，并且其中所述手性控制的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少一个硫代磷酸二酯核苷酸间键联。在某些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸内的至少两个个别核苷酸间键联具有相对于彼此不同的P修饰，并且其中所述手性控制的寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸三酯核苷酸间键联。在某些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸内的至少两个个别核苷酸间键联具有相对于彼此不同的P修饰，并且其中所述手性控制的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少一个硫代磷酸三酯核苷酸间键联。
在某些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含一个或多个独立地具有式I结构的修饰的核苷酸间键联：
其中各变量是如下所定义和描述。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含一个或多个式I修饰的核苷酸间键联，并且其中所述寡核苷酸内的个别式I核苷酸间键联具有相对于彼此不同的P修饰。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含一个或多个式I修饰的核苷酸间键联，并且其中所述寡核苷酸内的个别式I核苷酸间键联具有相对于彼此不同的-X-L-R1。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含一个或多个式I修饰的核苷酸间键联，并且其中所述寡核苷酸内的个别式I核苷酸间键联具有相对于彼此不同的X。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含一个或多个式I修饰的核苷酸间键联，并且其中所述寡核苷酸内的个别式I核苷酸间键联具有相对于彼此不同的-L-R1。
在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸内的至少两个个别核苷酸间键联具有相对于彼此不同的立体化学和/或不同的P修饰。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸内的至少两个个别核苷酸间键联具有相对于彼此不同的立体化学，并且其中所述手性控制的寡核苷酸的至少一部分结构的特征在于具有交替立体化学的重复样式。
在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸内的至少两个个别核苷酸间键联具有相对于彼此不同的P修饰，因为它们在-XLR1部分中具有不同X原子，和/或因为它们在-XLR1部分中具有不同L基团，和/或因为它们在-XLR1部分中具有不同R1原子。
在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸内的至少两个个别核苷酸间键联具有相对于彼此不同的立体化学和/或不同的P修饰，并且所述寡核苷酸具有由下式表示的结构：
[SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny]
其中：
各RB独立地表示在键联磷处具有R构型的核苷酸单元的嵌段；
各SB独立地表示在键联磷处具有S构型的核苷酸单元的嵌段；
n1-ny各自是零或整数，其中要求至少一个奇数n和至少一个偶数n必须是非零以使寡核苷酸包括至少两个相对于彼此具有不同立体化学的个别核苷酸间键联；并且
其中n1-ny的总和在2与200之间，并且在一些实施方案中，在选自由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或25以上组成的组的下限与选自由5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190和200组成的组的上限之间，其中所述上限大于所述下限。
在一些所述实施方案中，各n具有相同值；在一些实施方案中，各偶数n与各其它偶数n具有相同值；在一些实施方案中，各奇数n与各其它奇数n具有相同值；在一些实施方案中，至少两个偶数n彼此具有不同值；在一些实施方案中，至少两个奇数n彼此具有不同值。
在一些实施方案中，至少两个邻近n彼此相等，以使提供的寡核苷酸包括具有相等长度的S立体化学键联和R立体化学键联的邻近嵌段。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包括具有相等长度的S和R立体化学键联的重复嵌段。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包括S和R立体化学键联的重复嵌段，其中至少两个所述嵌段具有彼此不同的长度；在一些所述实施方案中，各S立体化学嵌段具有相同长度，并且具有不同于各R立体化学长度的长度，所述各R立体化学长度可任选地是彼此相同的长度。
在一些实施方案中，至少两个跳跃邻近n彼此相等，以使提供的寡核苷酸包括至少两个具有第一立体化学的键联嵌段，其在长度方面彼此相等，并且由具有另一立体化学的键联嵌段分隔，所述分隔嵌段与具有第一立体化学的嵌段可具有相同长度或不同长度。
在一些实施方案中，与提供的寡核苷酸的末端的键联嵌段相关的n具有相同长度。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸具有键联立体化学相同的末端嵌段。在一些所述实施方案中，末端嵌段是由具有另一键联立体化学的中间嵌段彼此分隔。
在一些实施方案中，提供的式[SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny]寡核苷酸是立体嵌段聚体。在一些实施方案中，提供的式[SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny]寡核苷酸是立体跳跃聚体。在一些实施方案中，提供的式[SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny]寡核苷酸是立体交替聚体。在一些实施方案中，提供的式[SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny]寡核苷酸是间隔聚体。
在一些实施方案中，提供的式[SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny]寡核苷酸具有任何上述样式，并且还包含P修饰样式。例如，在一些实施方案中，提供的式[SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny]寡核苷酸是立体跳跃聚体和P修饰跳跃聚体。在一些实施方案中，提供的式[SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny]寡核苷酸是立体嵌段聚体和P修饰交替聚体。在一些实施方案中，提供的式[SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny]寡核苷酸是立体交替聚体和P修饰嵌段聚体。
在一些实施方案中，提供的式[SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny]寡核苷酸是手性控制的寡核苷酸，其包含一个或多个独立地具有式I结构的修饰的核苷酸间键联：
其中：
P*是不对称磷原子，并且是Rp或Sp；
W是O、S或Se；
X、Y和Z各自独立地是-O-、-S-、-N(-L-R1)-或L；
L是共价键或任选地取代的直链或分支C1-C10亚烷基，其中L的一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-；
R1是卤素、R或任选地取代的C1-C50脂族，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-；
各R′独立地是-R、-C(O)R、-CO2R或-SO2R，或：
同一氮上的两个R′连同它们的间插原子一起形成任选地取代的杂环或杂芳基环，或
同一碳上的两个R′连同它们的间插原子一起形成任选地取代的芳基、碳环、杂环或杂芳基环；
-Cy-是选自亚苯基、亚碳环基、亚芳基、亚杂芳基或亚杂环基的任选地取代的二价环；
各R独立地是氢或选自C1-C6脂族、苯基、碳环基、芳基、杂芳基或杂环基的任选地取代的基团；并且
各独立地表示与核苷的连接。
在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷酸间磷键联。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸包含例如硫代磷酸酯或硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸包含硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸包含至少两个硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸包含至少三个硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸包含至少四个硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸包含至少五个硫代磷酸三酯键联。本文进一步描述示例性所述修饰的核苷酸间磷键联。
在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸包含不同核苷酸间磷键联。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少一个修饰的核苷酸间键联。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少一个硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少两个硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少三个硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少四个硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少五个硫代磷酸三酯键联。本文进一步描述示例性所述修饰的核苷酸间磷键联。
在一些实施方案中，硫代磷酸三酯键联包含例如用于控制反应的立体选择性的手性助剂。在一些实施方案中，硫代磷酸三酯键联不包含手性助剂。在一些实施方案中，有意维持硫代磷酸三酯键联直至向受试者施药，和/或在向受试者施药期间有意维持硫代磷酸三酯键联。
在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸连接于固体载体。在一些实施方案中，自固体载体裂解手性控制的寡核苷酸。
在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少两个连续修饰的核苷酸间键联。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少两个连续硫代磷酸三酯核苷酸间键联。
在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸是嵌段聚体。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸是立体嵌段聚体。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸是P修饰嵌段聚体。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸是键联嵌段聚体。
在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸是交替聚体。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸是立体交替聚体。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸是P修饰交替聚体。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸是键联交替聚体。
在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸是单聚体。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸是立体单聚体。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸是P修饰单聚体。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸是键联单聚体。
在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸是间隔聚体。
在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸是跳跃聚体。
在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含一个或多个独立地具有式I结构的修饰的核苷酸间键联：
其中：
P*是不对称磷原子，并且是Rp或Sp；
W是O、S或Se；
X、Y和Z各自独立地是-O-、-S-、-N(-L-R1)-或L；
L是共价键或任选地取代的直链或分支C1-C10亚烷基，其中L的一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-；
R1是卤素、R或任选地取代的C1-C50脂族，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-；
各R′独立地是-R、-C(O)R、-CO2R或-SO2R，或：
同一氮上的两个R′连同它们的间插原子一起形成任选地取代的杂环或杂芳基环，或
同一碳上的两个R′连同它们的间插原子一起形成任选地取代的芳基、碳环、杂环或杂芳基环；
-Cy-是选自亚苯基、亚碳环基、亚芳基、亚杂芳基或亚杂环基的任选地取代的二价环；
各R独立地是氢或选自C1-C6脂族、苯基、碳环基、芳基、杂芳基或杂环基的任选地取代的基团；并且
各独立地表示与核苷的连接。
如以上以及本文中所一般定义，P*是不对称磷原子，并且是Rp或Sp。在一些实施方案中，P*是Rp。在其它实施方案中，P*是Sp。在一些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个式I核苷酸间键联，其中各P*独立地是Rp或Sp。在一些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个式I核苷酸间键联，其中各P*是Rp。在一些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个式I核苷酸间键联，其中各P*是Sp。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联，其中P*是Rp。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联，其中P*是Sp。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联，其中P*是Rp，以及至少一个式I核苷酸间键联，其中P*是Sp。
如以上以及本文中所一般定义，W是O、S或Se。在一些实施方案中，W是O。在一些实施方案中，W是S。在一些实施方案中，W是Se。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联，其中W是O。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联，其中W是S。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联，其中W是Se。
如以上以及本文中所一般定义，各R独立地是氢或选自C1-C6脂族、苯基、碳环基、芳基、杂芳基或杂环基的任选地取代的基团。
在一些实施方案中，R是氢。在一些实施方案中，R是选自C1-C6脂族、苯基、碳环基、芳基、杂芳基或杂环基的任选地取代的基团。
在一些实施方案中，R是任选地取代的C1-C6脂族。在一些实施方案中，R是任选地取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，R是任选地取代的直链或分支己基。在一些实施方案中，R是任选地取代的直链或分支戊基。在一些实施方案中，R是任选地被取代的直链或分支丁基。在一些实施方案中，R是任选地取代的直链或分支丙基。在一些实施方案中，R是任选地取代的乙基。在一些实施方案中，R是任选地取代的甲基。
在一些实施方案中，R是任选地取代的苯基。在一些实施方案中，R是取代的苯基。在一些实施方案中，R是苯基。
在一些实施方案中，R是任选地取代的碳环基。在一些实施方案中，R是任选地取代的C3-C10碳环基。在一些实施方案中，R是任选地取代的单环碳环基。在一些实施方案中，R是任选地取代的环庚基。在一些实施方案中，R是任选地取代的环己基。在一些实施方案中，R是任选地取代的环戊基。在一些实施方案中，R是任选地取代的环丁基。在一些实施方案中，R是任选地取代的环丙基。在一些实施方案中，R是任选地取代的双环碳环基。
在一些实施方案中，R是任选地取代的芳基。在一些实施方案中，R是任选地取代的双环芳基环。
在一些实施方案中，R是任选地取代的杂芳基。在一些实施方案中，R是具有1-3个独立地选自氮、硫或氧的杂原子的任选地取代的5-6元单环杂芳基环。在一些实施方案中，R是具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的取代的5-6元单环杂芳基环。在一些实施方案中，R是具有1-3个独立地选自氮、硫或氧的杂原子的未取代的5-6元单环杂芳基环。
在一些实施方案中，R是具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的5元单环杂芳基环。在一些实施方案中，R是具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的6元单环杂芳基环。
在一些实施方案中，R是具有1个选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的5元单环杂芳基环。在一些实施方案中，R选自吡咯基、呋喃基或噻吩基。
在一些实施方案中，R是具有2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的5元杂芳基环。在某些实施方案中，R是具有1个氮原子和选自硫或氧的另一杂原子的任选地取代的5元杂芳基环。示例性R基团包括任选地取代的吡唑基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基或异噁唑基。
在一些实施方案中，R是具有1-3个氮原子的6元杂芳基环。在其它实施方案中，R是具有1-2个氮原子的任选地取代的6元杂芳基环。在一些实施方案中，R是具有2个氮原子的任选地取代的6元杂芳基环。在某些实施方案中，R是具有1个氮的任选地取代的6元杂芳基环。示例性R基团包括任选地取代的吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基或四嗪基。
在某些实施方案中，R是具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的8-10元双环杂芳基环。在一些实施方案中，R是具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的5，6-稠合杂芳基环。在其它实施方案中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的5，6-稠合杂芳基环。在某些实施方案中，R是具有1个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施方案中，R是任选地取代的吲哚基。在一些实施方案中，R是任选地取代的氮杂双环[3.2.1]辛烷基。在某些实施方案中，R是具有2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施方案中，R是任选地取代的氮杂吲哚基。在一些实施方案中，R是任选地取代的苯并咪唑基。在一些实施方案中，R是任选地取代的苯并噻唑基。在一些实施方案中，R是任选地取代的苯并噁唑基。在一些实施方案中，R是任选地取代的吲唑基。在某些实施方案中，R是具有3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的5，6-稠合杂芳基环。
在某些实施方案中，R是具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的6，6-稠合杂芳基环。在一些实施方案中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的6，6-稠合杂芳基环。在其它实施方案中，R是具有1个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的6，6-稠合杂芳基环。在一些实施方案中，R是任选地取代的喹啉基。在一些实施方案中，R是任选地取代的异喹啉基。根据一个方面，R是具有2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的6，6-稠合杂芳基环。在一些实施方案中，R是喹唑啉或喹喔啉。
在一些实施方案中，R是任选地取代的杂环基。在一些实施方案中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的3-7元饱和或部分不饱和杂环。在一些实施方案中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的取代的3-7元饱和或部分不饱和杂环。在一些实施方案中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的3-7元饱和或部分不饱和杂环。
在一些实施方案中，R是任选地取代的杂环基。在一些实施方案中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的6元饱和或部分不饱和杂环。在一些实施方案中，R是具有2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的6元部分不饱和杂环。在一些实施方案中，R是具有2个氧原子的任选地取代的6元部分不饱和杂环。
在某些实施方案中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元饱和或部分不饱和杂环。在某些实施方案中，R是环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、氧杂环庚烷基、氮丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、氮杂环庚烷基、硫杂环丙烷基、硫杂环丁烷基、四氢苯硫基、四氢噻喃基、硫杂环庚烷基、二氧杂戊环烷基、氧硫杂环戊烷基、噁唑烷基、咪唑烷基、噻唑烷基、二硫杂环戊烷基、二噁烷基、吗啉基、氧硫杂环己烷基、哌嗪基、硫代吗啉基、二硫杂环己基、二氧杂环庚烷基、氧杂氮杂环庚烷基、氧硫杂环庚烷基、二硫杂环庚烷基、二氮杂环庚烷基、二氢呋喃酮基、四氢吡喃酮基、氧杂环庚酮基、吡咯烷酮基、哌啶酮基、氮杂环庚酮基、二氢噻吩酮基、四氢噻喃酮基、硫杂环庚烷酮基、噁唑啶酮基、噁嗪烷酮基、氧杂氮杂环庚烷酮基、二氧杂戊环烷酮基、二噁烷酮基、二氧杂环庚烷酮基、氧硫杂啉酮基、氧硫杂环己烷酮基、氧硫杂环庚烷酮基、噻唑烷酮基、噻嗪烷酮基、硫杂氮杂环庚烷酮基、咪唑烷酮基、四氢嘧啶酮基、二氮杂环庚烷酮基、咪唑烷二酮基、噁唑烷二酮基、噻唑烷二酮基、二氧环戊烷二酮基、氧杂硫杂环戊烷二酮基、哌嗪二酮基、吗啉二酮基、硫代吗啉二酮基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、吗啉基、硫代吗啉基、哌啶基、哌嗪基、吡咯烷基、四氢苯硫基或四氢噻喃基。在一些实施方案中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的5元饱和或部分不饱和杂环。
在某些实施方案中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的5-6元部分不饱和单环。在某些实施方案中，R是任选地取代的四氢吡啶基、二氢噻唑基、二氢噁唑基或噁唑啉基。
在一些实施方案中，R是具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的8-10元双环饱和或部分不饱和杂环。在一些实施方案中，R是任选地取代的吲哚啉基。在一些实施方案中，R是任选地取代的异吲哚啉基。在一些实施方案中，R是任选地取代的1，2，3，4-四氢喹啉。在一些实施方案中，R是任选地被取代的1，2，3，4-四氢异喹啉。
如以上以及本文中所一般定义，各R′独立地是-R、-C(O)R、-CO2R或-SO2R，或：
同一氮上的两个R′连同它们的间插原子一起形成任选地取代的杂环或杂芳基环，或
同一碳上的两个R′连同它们的间插原子一起形成任选地取代的芳基、碳环、杂环或杂芳基环。
在一些实施方案中，R’是-R、-C(O)R、-CO2R或-SO2R，其中R是如上所定义并如本文所述。
在一些实施方案中，R’是-R，其中R是如以上以及本文中所定义和描述。在一些实施方案中，R’是氢。
在一些实施方案中，R’是-C(O)R，其中R是如上所定义并如本文所述。在一些实施方案中，R’是-CO2R，其中R是如上所定义并如本文所述。在一些实施方案中，R’是-SO2R，其中R是如上所定义并如本文所述。
在一些实施方案中，同一氮上的两个R′连同它们的间插原子一起形成任选地取代的杂环或杂芳基环。在一些实施方案中，同一碳上的两个R′连同它们的间插原子一起形成任选地取代的芳基、碳环、杂环或杂芳基环。
如以上以及本文中所一般定义，-Cy-是选自亚苯基、亚碳环基、亚芳基、亚杂芳基或亚杂环基的任选地取代的二价环。
在一些实施方案中，-Cy-是任选地取代的亚苯基。在一些实施方案中，-Cy-是任选地取代的亚碳环基。在一些实施方案中，-Cy-是任选地取代的亚芳基。在一些实施方案中，-Cy-是任选地取代的亚杂芳基。在一些实施方案中，-Cy-是任选地取代的亚杂环基。
如以上以及本文中所一般定义，X、Y和Z各自独立地是-O-、-S-、-N(-L-R1)-或L，其中L和R1各自是独立地如上所定义和如下所述。
在一些实施方案中，X是-O-。在一些实施方案中，X是-S-。在一些实施方案中，X是-O-或-S-。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联，其中X是-O-。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联，其中X是-S-。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联，其中X是-O-，以及至少一个式I核苷酸间键联，其中X是-S-。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联，其中X是-O-，以及至少一个式I核苷酸间键联，其中X是-S-，以及至少一个式I核苷酸间键联，其中L是任选地取代的直链或分支C1-C10亚烷基，其中L的一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-。
在一些实施方案中，X是-N(-L-R1)-。在一些实施方案中，X是-N(R1)-。在一些实施方案中，X是-N(R’)-。在一些实施方案中，X是-N(R)-。在一些实施方案中，X是-NH-。
在一些实施方案中，X是L。在一些实施方案中，X是共价键。在一些实施方案中，X是或任选地取代的直链或分支C1-C10亚烷基，其中L的一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-。在一些实施方案中，X是任选地取代的C1-C10亚烷基或C1-C10亚烯基。在一些实施方案中，X是亚甲基。
在一些实施方案中，Y是-O-。在一些实施方案中，Y是-S-。
在一些实施方案中，Y是-N(-L-R1)-。在一些实施方案中，Y是-N(R1)-。在一些实施方案中，Y是-N(R’)-。在一些实施方案中，Y是-N(R)-。在一些实施方案中，Y是-NH-。
在一些实施方案中，Y是L。在一些实施方案中，Y是共价键。在一些实施方案中，Y是或任选地取代的直链或分支C1-C10亚烷基，其中L的一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地被取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-。在一些实施方案中，Y是任选地取代的C1-C10亚烷基或C1-C10亚烯基。在一些实施方案中，Y是亚甲基。
在一些实施方案中，Z是-O-。在一些实施方案中，Z是-S-。
在一些实施方案中，Z是-N(-L-R1)-。在一些实施方案中，Z是-N(R1)-。在一些实施方案中，Z是-N(R’)-。在一些实施方案中，Z是-N(R)-。在一些实施方案中，Z是-NH-。
在一些实施方案中，Z是L。在一些实施方案中，Z是共价键。在一些实施方案中，Z是或任选地取代的直链或分支C1-C10亚烷基，其中L的一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-。在一些实施方案中，Z是任选地取代的C1-C10亚烷基或C1-C10亚烯基。在一些实施方案中，Z是亚甲基。
如以上以及本文中所一般定义，L是共价键或任选地取代的直链或分支C1-C10亚烷基，其中L的一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地被取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-。
在一些实施方案中，L是共价键。在一些实施方案中，L是任选地取代的直链或分支C1-C10亚烷基，其中L的一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-。
在一些实施方案中，L具有结构-L1-V-，其中：
L1是选自以下的任选地取代的基团： C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、亚碳环基、亚芳基、C1-C6亚杂烷基、亚杂环基和亚杂芳基；
V选自-O-、-S-、-NR’-、C(R’)2、-S-S-、-B-S-S-C-、或选自以下的任选地取代的基团：C1-C6亚烷基、亚芳基、C1-C6亚杂烷基、亚杂环基和亚杂芳基；
A是＝O、＝S、＝NR’或＝C(R’)2；
B和C各自独立地是-O-、-S-、-NR’-、-C(R’)2-或选自以下的任选地取代的基团：C1-C6亚烷基、亚碳环基、亚芳基、亚杂环基或亚杂芳基；并且
各R’是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，L1是
在一些实施方案中，L1是其中环Cy’是任选地取代的亚芳基、亚碳环基、亚杂芳基或亚杂环基。在一些实施方案中，L1是任选地取代的在一些实施方案中，L1是
在一些实施方案中，L1连接于X。在一些实施方案中，L1是选自以下的任选地取代的基团： 并且硫原子连接于V。在一些实施方案中，L1是选自以下的任选地取代的基团： 并且碳原子连接于X。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中：
E是-O-、-S-、-NR’-或-C(R’)2-；
是单键或双键；
两个RL1连同它们所结合的两个碳原子一起形成任选地取代的芳基、碳环、杂芳基或杂环；并且各R’是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中：
G是-O-、-S-或-NR’；
是单键或双键；并且
两个RL1连同它们所结合的两个碳原子一起形成任选地取代的芳基、C3-C10碳环、杂芳基或杂环。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中：
E是-O-、-S-、-NR’-或-C(R’)2-；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂族))-或＝C(CF3)-；并且
各R’是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中：
G是-O-、-S-或-NR’；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂族))-或＝C(CF3)-。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中：
E是-O-、-S-、-NR’-或-C(R’)2-；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂族))-或＝C(CF3)-；并且
各R’是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中：
G是-O-、-S-或-NR’；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂族))-或＝C(CF3)-。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中：
E是-O-、-S-、-NR’-或-C(R’)2-；
是单键或双键；
两个RL1连同它们所结合的两个碳原子一起形成任选地取代的芳基、C3-C10碳环、杂芳基或杂环；
并且各R’是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中：
G是-O-、-S-或-NR’；
是单键或双键；
两个RL1连同它们所结合的两个碳原子一起形成任选地取代的芳基、C3-C10碳环、杂芳基或杂环；
并且各R’是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中：
E是-O-、-S-、-NR’-或-C(R’)2-；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂族))-或＝C(CF3)-；并且
各R’是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中：
G是-O-、-S-或-NR’；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂族))-或＝C(CF3)-；并且
各R’是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中：
E是-O-、-S-、-NR’-或-C(R’)2-；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂族))-或＝C(CF3)-；并且
各R’是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中：
G是-O-、-S-或-NR’；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂族))-或＝C(CF3)-；并且
各R’是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中：
E是-O-、-S-、-NR’-或-C(R’)2-；
是单键或双键；
两个RL1连同它们所结合的两个碳原子一起形成任选地取代的芳基、C3-C10碳环、杂芳基或杂环；并且各R’是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中：
G是-O-、-S-或-NR’；
是单键或双键；
两个RL1连同它们所结合的两个碳原子一起形成任选地取代的芳基、C3-C10碳环、杂芳基或杂环；并且各R’是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中：
E是-O-、-S-、-NR’-或-C(R’)2-；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂族))-或＝C(CF3)-；并且
各R’是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中：
G是-O-、-S-或-NR’；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂族))-或＝C(CF3)-；并且
R’是如上所定义并如本文所述。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中：
E是-O-、-S-、-NR’-或-C(R’)2-；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂族))-或＝C(CF3)-；并且
各R’是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中：
G是-O-、-S-或-NR’；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂族))-或＝C(CF3)-；并且
R’是如上所定义并如本文所述。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中苯基环任选地被取代。在一些实施方案中，苯基环未被取代。在一些实施方案中，苯基环被取代。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中苯基环任选地被取代。在一些实施方案中，苯基环未被取代。在一些实施方案中，苯基环被取代。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中：
是单键或双键；并且
两个RL1连同它们所结合的两个碳原子一起形成任选地取代的芳基、C3-C10碳环、杂芳基或杂环。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中：
G是-O-、-S-或-NR’；
是单键或双键；并且
两个RL1连同它们所结合的两个碳原子一起形成任选地取代的芳基、C3-C10碳环、杂芳基或杂环。
如以上以及本文中所一般定义，E是-O-、-S-、-NR’-或-C(R’)2-，其中各R’独立地如上所定义和如本文所述。在一些实施方案中，E是-O-、-S-或-NR’。在一些实施方案中，E是-O-、-S-或-NH-。在一些实施方案中，E是-O-。在一些实施方案中，E是-S-。在一些实施方案中，E是-NH-。
如以上以及本文中所一般定义，G是-O-、-S-或-NR’，其中各R’独立地如上所定义和如本文所述。在一些实施方案中，G是-O-、-S-或-NH-。在一些实施方案中，G是-O-。在一些实施方案中，G是-S-。在一些实施方案中，G是-NH-。
在一些实施方案中，L是-L3-G-，其中：
L3是任选地取代的C1-C5亚烷基或亚烯基，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：-O-、-S-，-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-S(O)-、-S(O)2-或并且
其中G、R’和环Cy’各自是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，L是-L3-S-，其中L3是如上所定义并如本文所述。在一些实施方案中，L是-L3-O-，其中L3是如上所定义并如本文所述。在一些实施方案中，L是-L3-N(R’)-，其中L3和R’各自是独立地如上所定义和如本文所述。在一些实施方案中，L是-L3-NH-，其中L3和R’各自是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，L3是任选地取代的C5亚烷基或亚烯基，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：-O-、-S-，-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-S(O)-、-S(O)2-或并且R’和环Cy’各自是独立地如上所定义和如本文所述。在一些实施方案中，L3是任选地取代的C5亚烷基。在一些实施方案中，-L3-G-是
在一些实施方案中，L3是任选地取代的C4亚烷基或亚烯基，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：-O-、-S-，-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-S(O)-、-S(O)2-或并且R’和Cy’各自是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L3-G-是
在一些实施方案中，L3是任选地取代的C3亚烷基或亚烯基，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：-O-、-S-，-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-S(O)-、-S(O)2-或并且R’和Cy’各自是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L3-G-是
在一些实施方案中，L是在一些实施方案中，L是在一些实施方案中，L是
在一些实施方案中，L3是任选地取代的C2亚烷基或亚烯基，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：-O-、-S-，-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-S(O)-、-S(O)2-或并且R’和Cy’各自是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L3-G-是其中G和Cy’各自是独立地如上所定义和如本文所述。在一些实施方案中，L是
在一些实施方案中，L是-L4-G-，其中L4是任选地取代的C1-C2亚烷基；并且G是如上所定义并如本文所述。在一些实施方案中，L是-L4-G-，其中L4是任选地取代的C1-C2亚烷基；G是如上所定义和如本文所述；并且G连接于R1。在一些实施方案中，L是-L4-G-，其中L4是任选地取代的亚甲基；G是如上所定义和如本文所述；并且G连接于R1。在一些实施方案中，L是-L4-G-，其中L4是亚甲基；G是如上所定义和如本文所述；并且G连接于R1。在一些实施方案中，L是-L4-G-，其中L4是任选地取代的-(CH2)2-；G是如上所定义和如本文所述；并且G连接于R1。在一些实施方案中，L是-L4-G-，其中L4是-(CH2)2-；G是如上所定义和如本文所述；并且G连接于R1。
在一些实施方案中，L是其中G是如上所定义和如本文所述，并且G连接于R1。在一些实施方案中，L是其中G是如上所定义和如本文所述，并且G连接于R1。在一些实施方案中，L是其中G是如上所定义和如本文所述，并且G连接于R1。在一些实施方案中，L是其中硫原子连接于R1。在一些实施方案中，L是其中氧原子连接于R1。
在一些实施方案中，L是 其中G是如上所定义并如本文所述。
在一些实施方案中，L是-S-RL3-或-S-C(O)-RL3-，其中RL3是任选地取代的直链或分支C1-C9亚烷基，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地被取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-，其中R’和-Cy-各自是独立地如上所定义和如本文所述。在一些实施方案中，L是-S-RL3-或-S-C(O)-RL3-，其中RL3是任选地取代的C1-C6亚烷基。在一些实施方案中，L是-S-RL3-或-S-C(O)-RL3-，其中RL3是任选地取代的C1-C6亚烯基。在一些实施方案中，L是-S-RL3-或-S-C(O)-RL3-，其中RL3是任选地取代的C1-C6亚烷基，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地被取代的C1-C6亚烯基、亚芳基或亚杂芳基。在一些实施方案中，在一些实施方案中，RL3是任选地取代的-S-(C1-C6亚烯基)-、-S-(C1-C6亚烷基)-、-S-(C1-C6亚烷基)-亚芳基-(C1-C6亚烷基)-、-S-CO-亚芳基-(C1-C6亚烷基)-或-S-CO-(C1-C6亚烷基)-亚芳基-(C1-C6亚烷基)-。
在一些实施方案中，L是
在一些实施方案中，L是在一些实施方案中，L是在一些实施方案中，
在一些实施方案中，以上以及本文中所述的L实施方案中的硫原子连接于X。在一些实施方案中，以上以及本文中所述的L实施方案中的硫原子连接于R1。
如以上以及本文中所一般定义，R1是卤素、R或任选地取代的C1-C50脂族，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地被取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-，其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。在一些实施方案中，R1是卤素、R或任选地取代的C1-C10脂族，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地被取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-，其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，R1是氢。在一些实施方案中，R1是卤素。在一些实施方案中，R1是-F。在一些实施方案中，R1是-Cl。在一些实施方案中，R1是-Br。在一些实施方案中，R1是-I。
在一些实施方案中，R1是R，其中R是如上所定义并如本文所述。
在一些实施方案中，R1是氢。在一些实施方案中，R1是选自以下的任选地取代的基团：C1-C50脂族、苯基、碳环基、芳基、杂芳基或杂环基。
在一些实施方案中，R1是任选地取代的C1-C50脂族。在一些实施方案中，R1是任选地取代的C1-C10脂族。在一些实施方案中，R1是任选地取代的C1-C6脂族。在一些实施方案中，R1是任选地取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的直链或分支己基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的直链或分支戊基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的直链或分支丁基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的直链或分支丙基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的乙基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的甲基。
在一些实施方案中，R1是任选地取代的苯基。在一些实施方案中，R1是取代的苯基。在一些实施方案中，R1是苯基。
在一些实施方案中，R1是任选地取代的碳环基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的C3-C10碳环基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的单环碳环基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的环庚基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的环己基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的环戊基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的环丁基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的环丙基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的双环碳环基。
在一些实施方案中，R1是任选地取代的C1-C50多环烃。在一些实施方案中，R1是任选地取代的C1-C50多环烃，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-，其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。在一些实施方案中，R1是任选地取代的在一些实施方案中，R1是在一些实施方案中，R1是任选地取代的
在一些实施方案中，R1是包含一个或多个任选地取代的多环烃部分的任选地取代的C1-C50脂族。在一些实施方案中，R1是包含一个或多个任选地取代的多环烃部分的任选地取代的C1-C50脂族，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-，其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。在一些实施方案中，R1是包含一个或多个任选地取代的 的任选地取代的C1-C50脂族。在一些实施方案中，R1是在一些实施方案中，R1是在一些实施方案中，R1是在一些实施方案中，R1是在一些实施方案中，R1是
在一些实施方案中，R1是任选地取代的芳基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的双环芳基环。
在一些实施方案中，R1是任选地取代的杂芳基。在一些实施方案中，R1是具有1-3个独立地选自氮、硫或氧的杂原子的任选地取代的5-6元单环杂芳基环。在一些实施方案中，R1是具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的取代的5-6元单环杂芳基环。在一些实施方案中，R1是具有1-3个独立地选自氮、硫或氧的杂原子的未取代的5-6元单环杂芳基环。
在一些实施方案中，R1是具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的5元单环杂芳基环。在一些实施方案中，R1是具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的6元单环杂芳基环。
在一些实施方案中，R1是具有1个选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的5元单环杂芳基环。在一些实施方案中，R1选自吡咯基、呋喃基或噻吩基。
在一些实施方案中，R1是具有2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的5元杂芳基环。在某些实施方案中，R1是具有1个氮原子和选自硫或氧的另一杂原子的任选地取代的5元杂芳基环。示例性R1基团包括任选地取代的吡唑基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基或异噁唑基。
在一些实施方案中，R1是具有1-3个氮原子的6元杂芳基环。在其它实施方案中，R1是具有1-2个氮原子的任选地取代的6元杂芳基环。在一些实施方案中，R1是具有2个氮原子的任选地取代的6元杂芳基环。在某些实施方案中，R1是具有1个氮的任选地取代的6元杂芳基环。示例性R1基团包括任选地取代的吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基或四嗪基。
在某些实施方案中，R1是具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的8-10元双环杂芳基环。在一些实施方案中，R1是具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的5，6-稠合杂芳基环。在其它实施方案中，R1是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的5，6-稠合杂芳基环。在某些实施方案中，R1是具有1个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施方案中，R1是任选地取代的吲哚基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的氮杂双环[3.2.1]辛烷基。在某些实施方案中，R1是具有2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施方案中，R1是任选地取代的氮杂吲哚基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的苯并咪唑基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的苯并噻唑基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的苯并噁唑基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的吲唑基。在某些实施方案中，R1是具有3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的5，6-稠合杂芳基环。
在某些实施方案中，R1是具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的6，6-稠合杂芳基环。在一些实施方案中，R1是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的6，6-稠合杂芳基环。在其它实施方案中，R1是具有1个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的6，6-稠合杂芳基环。在一些实施方案中，R1是任选地取代的喹啉基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的异喹啉基。根据一个方面，R1是具有2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的6，6-稠合杂芳基环。在一些实施方案中，R1是喹唑啉或喹喔啉。
在一些实施方案中，R1是任选地取代的杂环基。在一些实施方案中，R1是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的3-7元饱和或部分不饱和杂环。在一些实施方案中，R1是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的取代的3-7元饱和或部分不饱和杂环。在一些实施方案中，R1是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的3-7元饱和或部分不饱和杂环。
在一些实施方案中，R1是任选地取代的杂环基。在一些实施方案中，R1是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的6元饱和或部分不饱和杂环。在一些实施方案中，R1是具有2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的6元部分不饱和杂环。在一些实施方案中，R1是具有2个氧原子的任选地取代的6元部分不饱和杂环。
在某些实施方案中，R1是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元饱和或部分不饱和杂环。在某些实施方案中，R1是环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、氧杂环庚烷基、氮丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、氮杂环庚烷基、硫杂环丙烷基、硫杂环丁烷基、四氢苯硫基、四氢噻喃基、硫杂环庚烷基、二氧杂戊环烷基、氧硫杂环戊烷基、噁唑烷基、咪唑烷基、噻唑烷基、二硫杂环戊烷基、二噁烷基、吗啉基、氧硫杂环己烷基、哌嗪基、硫代吗啉基、二硫杂环己基、二氧杂环庚烷基、氧杂氮杂环庚烷基、氧硫杂环庚烷基、二硫杂环庚烷基、二氮杂环庚烷基、二氢呋喃酮基、四氢吡喃酮基、氧杂环庚酮基、吡咯烷酮基、哌啶酮基、氮杂环庚酮基、二氢噻吩酮基、四氢噻喃酮基、硫杂环庚烷酮基、噁唑啶酮基、噁嗪烷酮基、氧杂氮杂环庚烷酮基、二氧杂戊环烷酮基、二噁烷酮基、二氧杂环庚烷酮基、氧硫杂啉酮基、氧硫杂环己烷酮基、氧硫杂环庚烷酮基、噻唑烷酮基、噻嗪烷酮基、硫杂氮杂环庚烷酮基、咪唑烷酮基、四氢嘧啶酮基、二氮杂环庚烷酮基、咪唑烷二酮基、噁唑烷二酮基、噻唑烷二酮基、二氧环戊烷二酮基、氧杂硫杂环戊烷二酮基、哌嗪二酮基、吗啉二酮基、硫代吗啉二酮基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、吗啉基、硫代吗啉基、哌啶基、哌嗪基、吡咯烷基、四氢苯硫基或四氢噻喃基。在一些实施方案中，R1是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的5元饱和或部分不饱和杂环。
在某些实施方案中，R1是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的5-6元部分不饱和单环。在某些实施方案中，R1是任选地取代的四氢吡啶基、二氢噻唑基、二氢噁唑基或噁唑啉基。
在一些实施方案中，R1是具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的8-10元双环饱和或部分不饱和杂环。在一些实施方案中，R1是任选地取代的吲哚啉基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的异吲哚啉基。在一些实施方案中，R1是任选地取代的1，2，3，4-四氢喹啉。在一些实施方案中，R1是任选地取代的1，2，3，4-四氢异喹啉。
在一些实施方案中，R1是任选地取代的C1-C10脂族，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地被取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-，其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。在一些实施方案中，R1是任选地取代的C1-C10脂族，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-OC(O)-或-C(O)O-，其中各R’是独立地如上所定义和如本文所述。在一些实施方案中，R1是任选地取代的C1-C10脂族，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-OC(O)-或-C(O)O-，其中各R’是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，R1是
在一些实施方案中，R1是CH3-、
在一些实施方案中，R1包含连接于L的末端任选地取代的-(CH2)2-部分。以下描绘示例性所述R1基团：
在一些实施方案中，R1包含连接于L的末端任选地取代的-(CH2)-部分。以下描绘示例性所述R1基团：
在一些实施方案中，R1是-S-RL2，其中RL2是任选地取代的C1-C9脂族，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地被取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-，并且R’和-Cy-各自是独立地如上所定义和如本文所述。在一些实施方案中，R1是-S-RL2，其中硫原子与L基团中的硫原子连接。
在一些实施方案中，R1是-C(O)-RL2，其中RL2是任选地取代的C1-C9脂族，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地被取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-，并且R’和-Cy-各自是独立地如上所定义和如本文所述。在一些实施方案中，R1是-C(O)-RL2，其中羰基与L基团中的G连接。在一些实施方案中，R1是-C(O)-RL2，其中羰基与L基团中的硫原子连接。
在一些实施方案中，RL2是任选地取代的C1-C9脂族。在一些实施方案中，RL2是任选地取代的C1-C9烷基。在一些实施方案中，RL2是任选地取代的C1-C9烯基。在一些实施方案中，RL2是任选地取代的C1-C9炔基。在一些实施方案中，RL2是任选地取代的C1-C9脂族，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：-Cy-或-C(O)-。在一些实施方案中，RL2是任选地取代的C1-C9脂族，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：-Cy-。在一些实施方案中，RL2是任选地取代的C1-C9脂族，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地取代的亚杂环基。在一些实施方案中，RL2是任选地取代的C1-C9脂族，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地取代的亚芳基。在一些实施方案中，RL2是任选地取代的C1-C9脂族，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地取代的亚杂芳基。在一些实施方案中，RL2是任选地取代的C1-C9脂族，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地取代的C3-C10亚碳环基。在一些实施方案中，RL2是任选地取代的C1-C9脂族，其中两个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：-Cy-或-C(O)-。在一些实施方案中，RL2是任选地取代的C1-C9脂族，其中两个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：-Cy-或-C(O)-。以下描绘示例性RL2基团：
在一些实施方案中，R1是氢或选自以下的任选地取代的基团： -S-(C1-C10脂族)、C1-C10脂族、芳基、C1-C6杂烷基、杂芳基和杂环基。在一些实施方案中，R1是 或-S-(C1-C10脂族)。在一些实施方案中，R1是
在一些实施方案中，R1是选自以下的任选地取代的基团：-S-(C1-C6脂族)、C1-C10脂族、C1-C6杂脂族、芳基、杂环基和杂芳基。
在一些实施方案中，R1是
在一些实施方案中，以上以及本文中所述的R1实施方案中的硫原子与以上以及本文中所述的L实施方案中的硫原子、G、E或-C(O)-部分连接。在一些实施方案中，以上以及本文中所述的R1实施方案中的-C(O)-部分与以上以及本文中所述的L实施方案中的硫原子、G、E或-C(O)-部分连接。
在一些实施方案中，-L-R1是以上以及本文中所述的L实施方案和R1实施方案的任何组合。
在一些实施方案中，-L-R1是-L3-G-R1，其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1是-L4-G-R1，其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1是-L3-G-S-RL2，其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1是-L3-G-C(O)-RL2，其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1是 其中RL2是任选地取代的C1-C9脂族，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-，并且各G是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1是-RL3-S-S-RL2，其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。在一些实施方案中，-L-R1是-RL3-C(O)-S-S-RL2，其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1具有以下结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1具有以下结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1具有以下结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1具有以下结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1具有以下结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1具有以下结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1具有以下结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1具有以下结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1具有以下结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1具有以下结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1具有以下结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1具有以下结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1具有以下结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1具有以下结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1具有以下结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1具有以下结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1具有以下结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1具有以下结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1具有以下结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1具有以下结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1具有以下结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，L具有以下结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-X-L-R1具有以下结构：
其中：
苯基环任选地被取代，并且
R1和X各自是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1是
在一些实施方案中，-L-R1是：
在一些实施方案中，-L-R1是CH3-、 在一些实施方案中，-L-R1是
在一些实施方案中，-L-R1包含连接于X的末端任选地取代的-(CH2)2-部分。在一些实施方案中，-L-R1包含连接于X的末端-(CH2)2-部分。以下描绘示例性所述-L-R1部分：
在一些实施方案中，-L-R1包含连接于X的末端任选地取代的-(CH2)-部分。在一些实施方案中，-L-R1包含连接于X的末端-(CH2)-部分。以下描绘示例性所述-L-R1部分：
在一些实施方案中，-L-R1是
在一些实施方案中，-L-R1是CH3-、 并且X是-S-。
在一些实施方案中，-L-R1是CH3-、 X是-S-，W是O，Y是-O-，并且Z是-O-。
在一些实施方案中，R1是 -S-(C1-C10脂族)。
在一些实施方案中，R1是
在一些实施方案中，X是-O-或-S-，并且R1是 或-S-(C1-C10脂族)。
在一些实施方案中，X是-O-或-S-，并且R1是 -S-(C1-C10脂族)或-S-(C1-C50脂族)。
在一些实施方案中，L是共价键，并且-L-R1是R1。
在一些实施方案中，-L-R1不是氢。
在一些实施方案中，-X-L-R1是R1是 -S-(C1-C10脂族)或-S-(C1-C50脂族)。
在一些实施方案中，-X-L-R1具有结构其中部分任选地被取代。在一些实施方案中，-X-L-R1是在一些实施方案中，-X-L-R1是在一些实施方案中，-X-L-R1是在一些实施方案中，-X-L-R1具有结构其中X’是O或S，Y’是-O-、-S-或-NR’-，并且部分任选地被取代。在一些实施方案中，Y’是-O-、-S-或-NH-。在一些实施方案中，是在一些实施方案中，是在一些实施方案中，是在一些实施方案中，-X-L-R1具有结构其中X，是O或S，并且部分任选地被取代。在一些实施方案中，是在一些实施方案中，-X-L-R1是其中任选地被取代。在一些实施方案中，-X-L-R1是其中被取代。在一些实施方案中，-X-L-R1是其中未被取代。
在一些实施方案中，-X-L-R1是R1-C(O)-S-LX-S-，其中LX是选自以下的任选地被取代的基团：和在一些实施方案中，LX是 和在一些实施方案中，-X-L-R1是(CH3)3C-S-S-LX-S-。在一些实施方案中，-X-L-R1是R1-C(＝X’)-Y’-C(R)2-S-LX-S-。在一些实施方案中，-X-L-R1是R-C(＝X’)-Y’-CH2-S-LX-S-。在一些实施方案中，-X-L-R1是
如本领域技术人员将了解，本文所述的许多-X-L-R1基团是可裂解的，并且在向受试者施用之后可转化成-X-。在一些实施方案中，-X-L-R1是可裂解的。在一些实施方案中，-X-L-R1是-S-L-R1，并且在向受试者施用之后转化成-S-。在一些实施方案中，转化是由受试者的酶促进。如本领域技术人员所了解，确定-S-L-R1基团在施用之后是否转化成-S-的方法在本领域中是广泛已知并实施的，包括用于研究药物代谢和药物动力学的那些。
在一些实施方案中，具有式I结构的核苷酸间键联是
在一些实施方案中，式I核苷酸间键联具有式I-a结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，式I核苷酸间键联具有式I-b结构：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，式I核苷酸间键联是具有式I-c结构的硫代磷酸三酯键联：
其中：
P*是不对称磷原子，并且是Rp或Sp；
L是共价键或任选地被取代的直链或分支C1-C10亚烷基，其中L的一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-；
R1是卤素、R或任选地取代的C1-C50脂族，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-；
各R′独立地是-R、-C(O)R、-CO2R或-SO2R，或：
同一氮上的两个R′连同它们的间插原子一起形成任选地取代的杂环或杂芳基环，或
同一碳上的两个R′连同它们的间插原子一起形成任选地取代的芳基、碳环、杂环或杂芳基环；
-Cy-是选自亚苯基、亚碳环基、亚芳基、亚杂芳基或亚杂环基的任选地取代的二价环；
各R独立地是氢或选自C1-C6脂族、苯基、碳环基、芳基、杂芳基或杂环基的任选地取代的基团；
各独立地表示与核苷的连接；并且
当L是共价键时，R1不是-H。
在一些实施方案中，具有式I结构的核苷酸间键联是
在一些实施方案中，具有式I-c结构的核苷酸间键联是
在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含一个或多个磷酸二酯键联和一个或多个具有式I-a、I-b或I-c的修饰的核苷酸间键联。
在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少一个具有式I-c结构的硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少两个具有式I-c结构的硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少三个具有式I-c结构的硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少四个具有式I-c结构的硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少五个具有式I-c结构的硫代磷酸三酯键联。
在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含见于本申请的任何附录中的序列。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含见于附录A中的序列。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含见于附录B中的序列。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含见于附录C中的序列。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有见于本申请的任何附录中的序列。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有见于附录A中的序列。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有见于附录B中的序列。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有见于附录C中的序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含见于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含见于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列，其中所述序列与GCCTCAGTCTGCTTCGCACC具有超过50％同一性。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含见于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列，其中所述序列与GCCTCAGTCTGCTTCGCACC具有超过60％同一性。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含见于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列，其中所述序列与GCCTCAGTCTGCTTCGCACC具有超过70％同一性。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含见于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列，其中所述序列与GCCTCAGTCTGCTTCGCACC具有超过80％同一性。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含见于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列，其中所述序列与GCCTCAGTCTGCTTCGCACC具有超过90％同一性。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含见于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列，其中所述序列与GCCTCAGTCTGCTTCGCACC具有超过95％同一性。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC。
在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含见于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列，其中至少一个核苷酸间键联具有手性键联磷。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含见于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列，其中至少一个核苷酸间键联具有式I结构。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含见于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列，其中各核苷酸间键联具有式I结构。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含见于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列，其中至少一个核苷酸间键联具有式I-c结构。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含见于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列，其中各核苷酸间键联具有式I-c结构。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含见于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列，其中至少一个核苷酸间键联是在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含见于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列，其中各核苷酸间键联是在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含见于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列，其中至少一个核苷酸间键联是在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含见于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列，其中各核苷酸间键联是
在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中至少一个核苷酸间键联具有手性键联磷。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中至少一个核苷酸间键联具有式I结构。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中各核苷酸间键联具有式I结构。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中至少一个核苷酸间键联具有式I-c结构。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中各核苷酸间键联具有式I-c结构。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中至少一个核苷酸间键联是在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中各核苷酸间键联是在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中至少一个核苷酸间键联是在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其包含序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中各核苷酸间键联是
在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中至少一个核苷酸间键联具有手性键联磷。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中至少一个核苷酸间键联具有式I结构。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中各核苷酸间键联具有式I结构。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中至少一个核苷酸间键联具有式I-c结构。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中各核苷酸间键联具有式I-c结构。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中至少一个核苷酸间键联是在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中各核苷酸间键联是在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中至少一个核苷酸间键联是在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中各核苷酸间键联是
在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中至少一个键联磷是Rp。本领域普通技术人员了解的是在其中手性控制的寡核苷酸包含RNA序列的某些实施方案中，各T独立地并任选地被U置换。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中各键联磷是Rp。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中至少一个键联磷是Sp。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中各键联磷是Sp。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中所述寡核苷酸是嵌段聚体。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中所述寡核苷酸是立体嵌段聚体。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中所述寡核苷酸是P修饰嵌段聚体。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中所述寡核苷酸是键联嵌段聚体。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中所述寡核苷酸是交替聚体。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中所述寡核苷酸是立体交替聚体。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中所述寡核苷酸是P修饰交替聚体。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中所述寡核苷酸是键联交替聚体。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中所述寡核苷酸是单聚体。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中所述寡核苷酸是立体单聚体。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中所述寡核苷酸是P修饰单聚体。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中所述寡核苷酸是键联单聚体。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中所述寡核苷酸是间隔聚体。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中所述寡核苷酸是跳跃聚体。
在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中各胞嘧啶任选地并独立地被5-甲基胞嘧啶置换。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中至少一个胞嘧啶任选地并独立地被5-甲基胞嘧啶置换。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC，其中各胞嘧啶任选地并独立地被5-甲基胞嘧啶置换。具有序列GCCTCAGTCTGCTTCGCACC的示例性手性控制的寡核苷酸描绘于下表2中：
表2.示例性手性控制的寡核苷酸。
在一些实施方案中，设计手性控制的寡核苷酸以使一个或多个核苷酸包含在某些条件下倾向于“自动释放”的磷修饰。即，在某些条件下，设计特定磷修饰以使它自寡核苷酸自我裂解来提供例如磷酸二酯，如见于天然存在的DNA和RNA中的那些。在一些实施方案中，所述磷修饰具有结构-O-L-R1，其中L和R1各自是独立地如上所定义和如本文所述。在一些实施方案中，自动释放基团包括吗啉代基团。在一些实施方案中，自动释放基团的特征在于能够将试剂递送至核苷酸间磷接头中，所述试剂有助于对磷原子的进一步修饰，例如脱硫。在一些实施方案中，试剂是水，并且进一步的修饰是水解以形成如见于天然存在的DNA和RNA中的磷酸二酯。
在一些实施方案中，设计手性控制的寡核苷酸以使通过在磷处的一个或多个特定修饰来改进所得药物性质。在本领域中用文件充分证明的是某些寡核苷酸由核酸酶快速降解，并且展现穿过细胞质细胞膜的不良细胞摄取(Poijarvi-Virta等，Curr.Med.Chem.(2006)，13(28)；3441-65；Wagner等，Med.Res.Rev.(2000)，20(6)：417-51；Peyrottes等，Mini Rev.Med.Chem.(2004)，4(4)：395-408；Gosselin等，(1996)，43(1)：196-208；Bologna等，(2002)，Antisense & Nucleic AcidDrug Development 12：33-41)。例如，Vives等(Nucleic Acids Research(1999)，27(20)：4071-76)发现叔丁基SATE前寡核苷酸相较于母体寡核苷酸显示细胞渗透显著增加。
在一些实施方案中，在键联磷处的修饰的特征在于它能够由一种或多种酯酶、核酸酶和/或细胞色素P450酶(包括但不限于下表3中所列的那些)转化成磷酸二酯，如天然存在的DNA和RNA中存在的那些。
表3.示例性酶。
在一些实施方案中，在磷处的修饰产生特征在于它充当前药的P修饰部分，例如在移除之前，P修饰部分有助于寡核苷酸递送至所需位置中。例如，在一些实施方案中，P修饰部分由在键联磷处进行PEG化产生。相关领域技术人员将了解各种PEG链长度是适用的，并且对链长度的选择将部分地由PEG化设法达成的结果决定。例如，在一些实施方案中，实现PEG化以降低RES摄取，并且延长寡核苷酸的体内循环寿命。
在一些实施方案中，根据本发明使用的PEG化试剂具有的分子量为约300g/mol至约100,000g/mol。在一些实施方案中，PEG化试剂具有的分子量为约300g/mol至约10,000g/mol。在一些实施方案中，PEG化试剂具有的分子量为约300g/mol至约5,000g/mol。在一些实施方案中，PEG化试剂具有的分子量为约500g/mol。在一些实施方案中，PEG化试剂具有的分子量为约1000g/mol。在一些实施方案中，PEG化试剂具有的分子量为约3000g/mol。在一些实施方案中，PEG化试剂具有的分子量为约5000g/mol。
在某些实施方案中，PEG化试剂是PEG500。在某些实施方案中，PEG化试剂是PEG1000。在某些实施方案中，PEG化试剂是PEG3000。在某些实施方案中，PEG化试剂是PEG5000。
在一些实施方案中，P修饰部分的特征在于它充当PK增强剂，例如脂质、PEG化脂质等。
在一些实施方案中，P修饰部分的特征在于它充当促进细胞进入和/或内体逃逸的试剂，如膜破坏性脂质或肽。
在一些实施方案中，P修饰部分的特征在于它充当靶向试剂。在一些实施方案中，P修饰部分是或包含靶向试剂。如本文所用的短语“靶向试剂”是以下实体：其与目标有效载荷(例如与寡核苷酸或寡核苷酸组合物)缔合，并且也与目标靶标位点相互作用以使当与所述靶向试剂缔合时，所述目标有效载荷靶向所述目标靶标位点的程度实质上大于当所述目标有效载荷不与所述靶向试剂缔合时，在另外类似条件下观察到的程度。靶向试剂可为或包含多种化学部分中的任一个，所述部分包括例如小分子部分、核酸、多肽、碳水化合物等。靶向试剂由Adarsh等“Organelle Specific Targeted Drug Delivery-A Review，”International Journal of Research in Pharmaceutical and BiomedicalSciences，2011，第895页进一步描述。
示例性所述靶向试剂包括但不限于蛋白质(例如转铁蛋白)、寡肽(例如环状和无环含RGD额寡肽)、抗体(单克隆和多克隆抗体，例如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE抗体)、糖/碳水化合物(例如单糖和/或寡糖(甘露糖、甘露糖-6-磷酸、半乳糖等))、维生素(例如叶酸盐)或其它小生物分子。在一些实施方案中，靶向部分是类固醇分子(例如胆汁酸，包括胆酸、脱氧胆酸、脱氢胆酸；可的松(cortisone)；地高辛(digoxigenin)；睪固酮(testosterone)；胆固醇；阳离子类固醇，如具有在可的松环的3位通过双键连接的三甲基氨基甲基酰肼基团的可的松等)。在一些实施方案中，靶向部分是亲脂性分子(例如脂环族烃、饱和和不饱和脂肪酸、蜡、萜烯和聚脂环族烃，如金刚烷胺和巴克敏斯特富勒烯(buckminsterfullerene))。在一些实施方案中，亲脂性分子是类萜，如维生素A、视黄酸、视黄醛或脱氢视黄醛。在一些实施方案中，靶向部分是肽。
在一些实施方案中，P修饰部分是式-X-L-R1靶向试剂，其中X、L和R1各自是如上式I中所定义。
在一些实施方案中，P修饰部分的特征在于它有助于细胞特异性递送。
在一些实施方案中，P修饰部分的特征在于它属于一个或多个上述种类。例如，在一些实施方案中，P修饰部分充当PK增强剂和靶向配体。在一些实施方案中，P修饰部分充当前药和内体逃逸试剂。相关领域技术人员将认识到众多其它所述组合是可能的，并且由本发明涵盖。
核苷碱基
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸中存在的核苷碱基是天然核苷碱基或自天然核苷碱基衍化的修饰的核苷碱基。实例包括但不限于它们的相应氨基由酰基保护基保护的尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤；2-氟尿嘧啶、2-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、氮杂胞嘧啶、嘧啶类似物(如假异胞嘧啶和假尿嘧啶)和其它修饰的核苷碱基，如8-取代的嘌呤、黄嘌呤或次黄嘌呤(后两个是天然降解产物)。示例性修饰的核苷碱基公开于Chiu和Rana，RNA，2003，9，1034-1048；Limbach等Nucleic Acid Research，1994，22，2183-2196以及Revankar和Rao，Comprehensive Natural ProductsChemistry，第7卷，313中。
由以下通式表示的化合物也被涵盖作为修饰的核苷碱基：
其中R8是选自具有1至15个碳原子的脂族、芳基、芳烷基、芳基氧基烷基、碳环基、杂环基或杂芳基的任选地取代的直链或分支基团，仅例如包括甲基、异丙基、苯基、苯甲基或苯氧基甲基；并且R9和R10各自独立地是选自直链或分支脂族、碳环基、芳基、杂环基和杂芳基的任选地取代的基团。
修饰的核苷碱基也包括尺寸扩大的核苷碱基，其中已添加一个或多个芳基环(如苯基环)。Glen Research目录(www.glenresearch.com)；Krueger AT等，Acc.Chem.Res.，2007，40，141-150；Kool，ET，Acc.Chem.Res.，2002，35，936-943；Benner S.A.等，Nat.Rev.Genet.，2005，6，553-543；Romesberg，F.E.等，Curr.Opin.Chem.Biol.，2003，7，723-733；Hirao，I.，Curr.Opin.Chem.Biol.，2006，10，622-627中所述的核酸碱基置换被涵盖作为适用于合成本文所述的核酸。以下显示这些尺寸扩大的核苷碱基的一些实例：
在本文中，修饰的核苷碱基也涵盖不被视为核苷碱基、而是其它部分的结构，如但不限于咕啉或卟啉源性环。卟啉源性碱基置换已描述于Morales-Rojas，H和Kool，ET，Org.Lett.，2002，4，4377-4380中。以下显示可用作碱基置换物的卟啉源性环的一实例：
在一些实施方案中，修饰的核苷碱基具有任一以下任选地取代的结构：
在一些实施方案中，修饰的核苷碱基具有荧光性。示例性所述荧光性修饰的核苷碱基包括菲、芘、芪、异黄嘌呤、异黄蝶呤、三联苯、三噻吩、苯并三噻吩、香豆素、2，4-二氧四氢蝶啶、栓系的芪、苯并尿嘧啶和萘并尿嘧啶，如下所示：
在一些实施方案中，修饰的核苷碱基未被取代。在一些实施方案中，修饰的核苷碱基被取代。在一些实施方案中，修饰的核苷碱基被取代以使它含有例如连接于荧光部分、生物素或抗生蛋白部分或其它蛋白质或肽的杂原子、烷基或连接部分。在一些实施方案中，修饰的核苷碱基是在最经典意义上不是核苷碱基、但与核苷碱基起类似作用的“通用碱基”。所述通用碱基的一个代表性实例是3-硝基吡咯。
在一些实施方案中，其它核苷也可用于本文公开的方法中，并且包括并有共价结合于修饰的糖的修饰的核苷碱基或核苷碱基的核苷。并有修饰的核苷碱基的核苷的一些实例包括4-乙酰基胞苷；5-(羧基羟甲基)尿苷；2′-O-甲基胞苷；5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；5-羧基甲基氨基甲基尿苷；二氢尿苷；2′-O-甲基假尿苷；β，D-半乳糖基Q核苷；2′-O-甲基鸟苷；N6-异戊烯基腺苷；1-甲基腺苷；1-甲基假尿苷；1-甲基鸟苷；1-甲基肌苷；2，2-二甲基鸟苷；2-甲基腺苷；2-甲基鸟苷；N7-甲基鸟苷；3-甲基-胞苷；5-甲基胞苷；5-羟甲基胞苷；5-甲酰基胞嘧啶；5-羧基胞嘧啶；N6-甲基腺苷；7-甲基鸟苷；5-甲基氨基乙基尿苷；5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿苷；β，D-甘露糖基Q核苷；5-甲氧基羰基甲基尿苷；5-甲氧基尿苷；2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷；N-((9-β，D-呋喃核糖基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨基甲酰基)苏氨酸；N-((9-β，D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)-N-甲基氨基甲酰基)苏氨酸；尿苷-5-氧基乙酸甲酯；尿苷-5-氧基乙酸(v)；假尿苷；Q核苷；2-硫代胞苷；5-甲基-2-硫代尿苷；2-硫代尿苷；4-硫代尿苷；5-甲基尿苷；2′-O-甲基-5-甲基尿苷；和2′-O-甲基尿苷。
在一些实施方案中，核苷包括在6′位具有(R)或(S)手性的6′-修饰的双环核苷类似物，并且包括美国专利号7,399,845中所述的类似物。在其它实施方案中，核苷包括在5′位具有(R)或(S)手性的5′-修饰的双环核苷类似物，并且包括美国专利申请公布号20070287831中所述的类似物。
在一些实施方案中，核苷碱基或修饰的核苷碱基包含一种或多种生物分子结合部分，例如像抗体、抗体片段、生物素、抗生蛋白、抗生蛋白链菌素、受体配体或螯合部分。在其它实施方案中，核苷碱基或修饰的核苷碱基是5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶或2，6-二氨基嘌呤。在一些实施方案中，核苷碱基或修饰的核苷碱基是通过用荧光或生物分子结合部分取代来修饰。在一些实施方案中，核苷碱基或修饰的核苷碱基上的取代基是荧光部分。在一些实施方案中，核苷碱基或修饰的核苷碱基上的取代基是生物素或抗生蛋白。
传授某些以上指示的修饰的核苷碱基以及其它修饰的核苷碱基的制备的代表性美国专利包括但不限于以上指示的美国专利号3,687,808以及美国专利号4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,457,191；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121，5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；和7,495,088，其各自以引用的方式整体并入本文。
糖
最常见的天然存在的核苷酸包含连接于核苷碱基腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)的核糖。也涵盖修饰的核苷酸，其中核苷酸中的磷酸酯基团或键联磷可连接于糖或修饰的糖的各种位置。作为非限制性实例，磷酸酯基团或键联磷可连接于糖或修饰的糖的2′、3′、4′或5′羟基部分。在此背景中，还涵盖并有如本文所述的修饰的核苷碱基的核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明方法使用包含未保护的-OH部分的核苷酸或修饰的核苷酸。
其它修饰的糖也可并于提供的寡核苷酸内。在一些实施方案中，修饰的糖在2′位含有一个或多个包括以下中的一个的取代基：-F；-CF3、-CN、-N3、-NO、-NO2、-OR’、-SR’或-N(R’)2，其中各R’是独立地如上所定义和如本文所述；-O-(C1-C10烷基)、-S-(C1-C10烷基)、-NH-(C1-C10烷基)或-N(C1-C10烷基)2；-O-(C2-C10烯基)、-S-(C2-C10烯基)、-NH-(C2-C10烯基)或-N(C2-C10烯基)2；-O-(C2-C10炔基)、-S-(C2-C10炔基)、-NH-(C2-C10炔基)或-N(C2-C10炔基)2；或-O--(C1-C10亚烷基)-O--(C1-C10烷基)、-O-(C1-C10亚烷基)-NH-(C1-C10烷基)或-O-(C1-C10亚烷基)-NH(C1-C10烷基)2、-NH-(C1-C10亚烷基)-O-(C1-C10烷基)或-N(C1-C10烷基)-(C1-C10亚烷基)-O-(C1-C10烷基)，其中所述烷基、亚烷基、烯基和炔基可被取代或未被取代。取代基的实例包括并不限于-O(CH2)nOCH3和-O(CH2)nNH2(其中n是1至约10)、MOE、DMAOE、DMAEOE。本文也涵盖WO 2001/088198；以及Martin等，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504中所述的修饰的糖。在一些实施方案中，修饰的糖包含一个或多个选自以下的基团：取代的硅烷基、RNA裂解基团、报道基团、荧光标记、嵌入剂、用于改进核酸的药物动力学性质的基团、用于改进核酸的药效学性质的基团、或具有类似性质的其它取代基。在一些实施方案中，修饰是在糖或修饰的糖的2′、3′、4′、5′或6′位中的一个或多个处进行，包括3′末端核苷酸上的糖的3′位或在5′末端核苷酸的5′位中。
在一些实施方案中，核糖的2’-OH是被包括以下中的一个的取代基置换：-H、-F；-CF3、-CN、-N3、-NO、-NO2、-OR’、-SR’或-N(R’)2，其中各R’是独立地如上所定义和如本文所述；-O-(C1-C10烷基)、-S-(C1-C10烷基)、-NH-(C1-C10烷基)或-N(C1-C10烷基)2；-O-(C2-C10烯基)、-S-(C2-C10烯基)、-NH-(C2-C10烯基)或-N(C2-C10烯基)2；-O-(C2-C10炔基)、-S-(C2-C10炔基)、-NH-(C2-C10炔基)或-N(C2-C10炔基)2；或-O--(C1-C10亚烷基)-O--(C1-C10烷基)、-O-(C1-C10亚烷基)-NH-(C1-C10烷基)或-O-(C1-C10亚烷基)-NH(C1-C10烷基)2、-NH-(C1-C10亚烷基)-O-(C1-C10烷基)或-N(C1-C10烷基)-(C1-C10亚烷基)-O-(C1-C10烷基)，其中所述烷基、亚烷基、烯基和炔基可被取代或未被取代。在一些实施方案中，2’-OH被-H置换(脱氧核糖)。在一些实施方案中，2’-OH被-F置换。在一些实施方案中，2’-OH被-OR’置换。在一些实施方案中，2’-OH被-OMe置换。在一些实施方案中，2’-OH被-OCH2CH2OMe置换。
修饰的糖也包括锁定核酸(LNA)。在一些实施方案中，锁定核酸具有以下指示的结构。指示具有以下结构的锁定核酸，其中Ba表示如本文所述的核苷碱基或修饰的核苷碱基，并且其中R2s是-OCH2C4’-。
在一些实施方案中，修饰的糖是ENA，如例如Seth等，J Am ChemSoc.2010年10月27日；132(42)：14942-14950中所述的那些。在一些实施方案中，修饰的糖是见于XNA(异核酸)中的那些中的任一个，例如阿拉伯糖、失水己糖醇、苏糖、2’氟阿拉伯糖或环己烯。
修饰的糖包括糖模拟物，如替代戊呋喃糖基糖的环丁基或环戊基部分。传授所述修饰的糖结构的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号：4,981,957；5,118,800；5,319,080；和5,359,044。涵盖的一些修饰的糖包括其中核糖环内的氧原子被氮、硫、硒或碳置换的糖。在一些实施方案中，修饰的糖是修饰的核糖，其中核糖环内的氧原子被氮置换，并且其中氮任选地被烷基(例如甲基、乙基、异丙基等)取代。
修饰的糖的非限制性实例包括形成甘油核酸(GNA)类似物的甘油。以下显示GNA类似物的一个实例，并且描述于Zhang，R等，J.Am.Chem.Soc.，2008，130，5846-5847；Zhang L等，J.Am.Chem.Soc.，2005，127，4174-4175以及Tsai CH等，PNAS，2007，14598-14603中(X＝O-)：
GNA衍化的类似物的另一实例，即基于甲酰基甘油的混合缩醛缩醛胺的柔性核酸(FNA)，描述于Joyce GF等，PNAS，1987，84，4398-4402以及Heuberger BD和Switzer C，J.Am.Chem.Soc.，2008，130，412-413中，并且以下加以显示：
修饰的糖的其它非限制性实例包括己吡喃糖基(6’至4’)、戊吡喃糖基(4’至2’)、戊吡喃糖基(4’至3’)或丁呋喃糖基(3’至2’)糖。在一些实施方案中，己吡喃糖基(6’至4’)糖具有任一下式：
其中Xs对应于本文所述的P修饰基团“-XLR1”，并且Ba是如本文所定义。
在一些实施方案中，戊吡喃糖基(4’至2’)糖具有任一下式：
其中Xs对应于本文所述的P修饰基团“-XLR1”，并且Ba是如本文所定义。
在一些实施方案中，戊吡喃糖基(4’至3’)糖具有任一下式：
其中Xs对应于本文所述的P修饰基团“-XLR1”，并且Ba是如本文所定义。
在一些实施方案中，丁呋喃糖基(3’至2’)糖具有任一下式：
其中Xs对应于本文所述的P修饰基团“-XLR1”，并且Ba是如本文所定义。
在一些实施方案中，修饰的糖具有任一下式：
其中Xs对应于本文所述的P修饰基团“-XLR1”，并且Ba是如本文所定义。
在一些实施方案中，糖部分中的一个或多个羟基任选地并独立地被以下置换：卤素、R’、-N(R’)2、-OR’或-SR’，其中各R’是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，糖模拟物是如下所说明，其中Xs对应于本文所述的P修饰基团“-XLR1”，Ba是如本文所定义，并且X1选自-S-、-Se-、-CH2-、-NMe-、-NEt-或-NiPr-。
在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸组合物中至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％或50％以上(例如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或95％以上)(包括端值)的糖被修饰。在一些实施方案中，仅嘌呤残基被修饰(例如约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％或50％以上[例如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或95％以上]的嘌呤残基被修饰)。在一些实施方案中，仅嘧啶残基被修饰(例如约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％或50％以上[例如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或95％以上]的嘌呤残基被修饰)。在一些实施方案中，嘌呤残基与嘧啶残基两者均被修饰。
修饰的糖和糖模拟物可通过本领域中已知的方法来制备，包括但不限于：A.Eschenmoser，Science(1999)，284：2118；M.Bohringer等，Helv.Chim.Acta(1992)，75：1416-1477；M.Egli等，J.Am.Chem.Soc.(2006)，128(33)：10847-56；A.Eschenmoser in Chemical Synthesis：Gnosis to Prognosis，C.Chatgilialoglu和V.Sniekus编，(KluwerAcademic，Netherlands，1996)，第293页；K.-U.Schoning等，Science(2000)，290：1347-1351；A.Eschenmoser等，Helv.Chim.Acta(1992)，75：218；J.Hunziker等，Helv.Chim.Acta(1993)，76：259；G.Otting等，Helv.Chim.Acta(1993)，76：2701；K.Groebke等，Helv.Chim.Acta(1998)，81：375；以及A.Eschenmoser，Science(1999)，284：2118。关于2′修饰的修饰可见于Verma，S.等Annu.Rev.Biochem.1998，67，99-134以及其中所有参考文献中。对核糖的特定修饰可见于以下参考文献中：2′-氟(Kawasaki等，J.Med.Chem.，1993，36，831-841)、2′-MOE(Martin，P.Helv.Chim.Acta 1996，79，1930-1938)、“LNA”(Wengel，J.Acc.Chem.Res.1999，32，301-310)。在一些实施方案中，修饰的糖是以引用的方式并入本文的PCT公布号WO2012/030683中所述，并且描绘于本申请的图26-30中的那些中的任一个。
寡核苷酸
在一些实施方案中，本发明提供手性控制的寡核苷酸和寡核苷酸组合物。例如，在一些实施方案中，提供的组合物含有预定水平的一种或多种个别寡核苷酸类型，其中寡核苷酸类型是由以下确定：1)碱基序列；2)骨架键联样式；3)骨架手性中心样式；和4)骨架P修饰样式。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是单聚体。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是P修饰单聚体。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是立体单聚体。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是具有构型Rp的立体单聚体。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是具有构型Sp的立体单聚体。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是交替聚体。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是P修饰交替聚体。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是立体交替聚体。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是嵌段聚体。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是P修饰嵌段聚体。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是立体嵌段聚体。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是间隔聚体。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是跳跃聚体。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是单聚体、交替聚体、嵌段聚体、间隔聚体和跳跃聚体中的一个或多个的组合。例如，在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是交替聚体与间隔聚体两者。在一些实施方案中，提供的核苷酸是间隔聚体与跳跃聚体两者。化学和合成领域技术人员将认识到众多其它样式组合是可用的，并且仅受限于为根据本发明方法合成提供的寡核苷酸所需的组成部分的商业可用性和/或合成可及性。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地被取代的核苷酸。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地被取代的核苷。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地被取代的LNA。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地取代的核苷碱基。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地取代的天然核苷碱基。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地取代的修饰的核苷碱基。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个5-甲基胞苷；5-羟甲基胞苷、5-甲酰基胞嘧啶或5-羧基胞嘧啶。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个5-甲基胞苷。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地取代的糖。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个见于天然存在的DNA和RNA中的任选地取代的糖。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地取代的核糖或脱氧核糖。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地取代的核糖或脱氧核糖，其中核糖或脱氧核糖部分的一个或多个羟基任选地并独立地被以下置换：卤素、R’、-N(R’)2、-OR’或-SR’，其中各R’是独立地如上所定义和如本文所述。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2’位任选地并独立地被以下取代：卤素、R’、-N(R’)2、-OR’或-SR’，其中各R’是独立地如上所定义和如本文所述。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2’位任选地并独立地被卤素取代。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地被取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2’位任选地并独立地被一个或多个-F卤素取代。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2’位任选地并独立地被-OR’取代，其中各R’是独立地如上所定义和如本文所述。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2’位任选地并独立地被-OR’取代，其中各R’独立地是任选地被取代的C1-C6脂族。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2’位任选地并独立地被-OR’取代，其中各R’独立地是任选地被取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2’位任选地并独立地被-OMe取代。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2’位任选地并独立地被-O-甲氧基乙基取代。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是单链寡核苷酸。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是杂交的寡核苷酸链。在某些实施方案中，提供的寡核苷酸是部分杂交的寡核苷酸链。在某些实施方案中，提供的寡核苷酸是完全杂交的寡核苷酸链。在某些实施方案中，提供的寡核苷酸是双链寡核苷酸。在某些实施方案中，提供的寡核苷酸是三链寡核苷酸(例如三链体)。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是嵌合的。例如，在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是DNA-RNA嵌合体、DNA-LNA嵌合体等。
在一些实施方案中，包含WO2012/030683中描绘的寡核苷酸的任一结构都可根据本发明方法来修饰以提供其手性控制的变体。例如，在一些实施方案中，手性控制的变体包含在任何一个或多个键联磷处的立体化学修饰和/或在任何一个或多个键联磷处的P修饰。例如，在一些实施方案中，预先选择WO2012/030683的寡核苷酸的特定核苷酸单元以在那个核苷酸单元的键联磷处进行立体化学修饰，和/或在那个核苷酸单元的键联磷处进行P修饰。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸具有图26-30中描绘的任一结构。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸是图26-30中描绘的任一结构的变体(例如修饰形式)。WO2012/030683的公开内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是治疗剂。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是反义寡核苷酸.
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是抗基因寡核苷酸。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是诱饵寡核苷酸。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是DNA疫苗的一部分。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是免疫调节性寡核苷酸，例如免疫刺激性寡核苷酸和免疫抑制性寡核苷酸。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是佐剂。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是适体。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是核糖酶。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是脱氧核糖酶(DNA酶(DNAzyme/DNA enzyme))。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是siRNA。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是微小RNA或miRNA。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是ncRNA(非编码RNA)，包括长非编码RNA(lncRNA)和小非编码RNA，如piwi相互作用性RNA(piRNA)。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸互补于结构RNA，例如tRNA。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是核酸类似物，例如GNA、LNA、PNA、TNA和吗啉代寡核苷酸。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是P修饰的前药。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是引物。在一些实施方案中，引物是用于基于聚合酶的链反应(即PCR)中来扩增核酸。在一些实施方案中，引物是用于PCR的任何已知变化形式，如反转录PCR(RT-PCR)和实时PCR中。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸被表征为能够调节RNA酶H活化。例如，在一些实施方案中，RNA酶H活化是通过存在立体控制的硫代磷酸酯核酸类似物来调节，其中天然DNA/RNA比Rp立体异构体更易受影响或同样易受影响，所述Rp立体异构体又比相应Sp立体异构体更易受影响。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸被表征为能够间接或直接增加或降低蛋白质的活性或抑制或促进蛋白质的表达。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的特征在于它适用于控制细胞增殖、病毒复制和/或任何其它细胞信号传导过程。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约200个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约180个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约160个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约140个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约120个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约100个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约90个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约80个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约70个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约60个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约50个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约40个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约30个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约29个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约28个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约27个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约26个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约25个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约24个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约23个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约22个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约21个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约2至约20个核苷酸单元。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约200个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约180个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约160个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约140个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约120个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约100个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约90个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约80个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约70个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约60个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约50个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约40个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约30个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约29个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约28个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约27个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约26个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约25个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约24个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约23个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约22个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约21个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约4至约20个核苷酸单元。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约5至约10个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约10至约30个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约15至约25个核苷酸单元。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的长度是约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸单元。
在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少2个核苷酸单元。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少3个核苷酸单元。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少4个核苷酸单元。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少5个核苷酸单元。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少6个核苷酸单元。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少7个核苷酸单元。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少8个核苷酸单元。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少9个核苷酸单元。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少10个核苷酸单元。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少11个核苷酸单元。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少12个核苷酸单元。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少15个核苷酸单元。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少20个核苷酸单元。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是至少25个核苷酸单元。在一些其它实施方案中，寡核苷酸的长度是至少30个核苷酸单元。在一些其它实施方案中，寡核苷酸是长度是至少18个核苷酸单元的互补链的双链体。在一些其它实施方案中，寡核苷酸是长度是至少21个核苷酸单元的互补链的双链体。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的5’末端和/或3’末端被修饰。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的5’末端和/或3’末端被末端帽部分修饰。在本文中以及在本领域中广泛描述示例性所述修饰，包括末端帽部分，例如但不限于美国专利申请公布US2009/0023675A1中所述的那些。
寡核苷酸的种类
在某些实施方案中，式I寡核苷酸具有上表2中所示的结构和实施例中所述的结构中的任一个。
在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸包含米泊美生(mipomersen)序列或米泊美生序列的一部分。米泊美生是基于以下碱基序列GCCT/UCAGT/UCT/UGCT/UT/UCGCACC。在一些实施方案中，一个或多个任何核苷酸或键联都可根据本发明加以修饰。在一些实施方案中，本发明提供一种手性控制的寡核苷酸，其具有序列G*-C*-C*-U*-C*-dA-dG-dT-dC-dT-dG-dmC-dT-dT-dmC-G*-C*-A*-C*-C*[d＝2′-脱氧基，*＝2′-O-(2-甲氧基乙基)]，所述序列具有3′→5′硫代磷酸酯键联。在整篇申请中描述示例性修饰的米泊美生序列，包括但不限于表4中的那些。
在某些实施方案中，提供的寡核苷酸是米泊美生单聚体。在某些实施方案中，提供的寡核苷酸是具有构型Rp的米泊美生单聚体。在某些实施方案中，提供的寡核苷酸是具有构型Sp的米泊美生单聚体。
下表4中描绘包含米泊美生序列或米泊美生序列的一部分的示例性手性控制的寡核苷酸。
表4.示例性米泊美生相关序列。
寡核苷酸组合物
本发明提供包含多种提供的寡核苷酸或由多种提供的寡核苷酸组成的组合物(例如手性控制的寡核苷酸组合物)。在一些实施方案中，所有所述提供的寡核苷酸都具有相同类型，即所有都具有相同碱基序列、骨架键联样式(即核苷酸间键联类型样式，例如磷酸酯、硫代磷酸酯等)、骨架手性中心样式(即键联磷立体化学样式(Rp/Sp))和骨架磷修饰样式(例如式I中的“-XLR1”基团样式)。然而，在许多实施方案中，提供的组合物通常以预定相对量包含多种寡核苷酸类型。
在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸组合物是手性纯米泊美生组合物。也就是说，在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸组合物提供关于键联磷的构型呈单一非对映异构体形式的米泊美生。
在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸组合物是手性均一米泊美生组合物。也就是说，在一些实施方案中，米泊美生的每个键联磷都呈Rp构型，或米泊美生的每个键联磷都呈Sp构型。
在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸组合物包含一种或多种提供的寡核苷酸类型的组合。化学和医学领域技术人员将认识到对提供的组合物中的一种或多种类型的提供的寡核苷酸的每一种的选择以及量将取决于那个组合物的预定用途。也就是说，相关领域技术人员将设计提供的手性控制的寡核苷酸组合物以使其中含有的提供的寡核苷酸的量和类型导致组合物总体上具有某些合乎需要的特征(例如生物合乎需要特征、治疗合乎需要特征等)。
在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸组合物包含两种或更多种提供的寡核苷酸类型的组合。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸组合物包含三种或更多种提供的寡核苷酸类型的组合。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸组合物包含四种或更多种提供的寡核苷酸类型的组合。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸组合物包含五种或更多种提供的寡核苷酸类型的组合。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸组合物包含六种或更多种提供的寡核苷酸类型的组合。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸组合物包含七种或更多种提供的寡核苷酸类型的组合。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸组合物包含八种或更多种提供的寡核苷酸类型的组合。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸组合物包含九种或更多种提供的寡核苷酸类型的组合。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸组合物包含十种或更多种提供的寡核苷酸类型的组合。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸组合物包含十五种或更多种提供的寡核苷酸类型的组合。
在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸组合物是一定量的具有Rp构型的手性均一米泊美生和一定量的具有Sp构型的手性均一米泊美生的组合。
在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸组合物是一定量的具有Rp构型的手性均一米泊美生、一定量的具有Sp构型的手性均一米泊美生和一定量的一种或多种具有所需非对映异构形式的手性纯米泊美生的组合。
用于制备手性控制的寡核苷酸及其组合物的方法
本发明提供用于制备包含一种或多种特定核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸和手性控制的组合物的方法。如上所指示，如本文所用的短语“寡核苷酸类型”定义具有特定碱基序列、骨架键联样式、骨架手性中心样式和骨架磷修饰样式(例如“-XLR1”基团)的寡核苷酸。具有常见指定“类型”的寡核苷酸在结构上关于碱基序列、骨架键联样式、骨架手性中心样式和骨架磷修饰样式是彼此相同的。
在一些实施方案中，本发明中提供的手性控制的寡核苷酸具有不同于相应立体无规寡核苷酸混合物的性质。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸具有不同于立体无规寡核苷酸混合物的亲脂性。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸在HPLC上具有不同保留时间。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸可具有显著不同于相应立体无规寡核苷酸混合物的峰保留时间。在如本领域中一般所实施来使用HPLC纯化寡核苷酸期间，某些手性控制的寡核苷酸即使不完全损失，也将大部分损失。在如本领域中一般所实施来使用HPLC纯化寡核苷酸期间，某些手性控制的寡核苷酸即使不完全损失，也将大部分损失。一个后果是立体无规寡核苷酸混合物的某些非对映异构体(某些手性控制的寡核苷酸)在测定中未被测试。另一后果是在各批次之间，由于不可避免的仪器和人为误差，假定“纯”立体无规寡核苷酸将具有不一致组成，因为组合物中的非对映异构体和它们的相对量和绝对量在各批次之间不同。本发明中提供的手性控制的寡核苷酸和手性控制的寡核苷酸组合物克服所述问题，因为手性控制的寡核苷酸是以手性控制的方式以单一非对映异构体形式合成，并且手性控制的寡核苷酸组合物包含预定水平的一种或多种个别寡核苷酸类型。
化学和合成领域技术人员将了解本发明的合成方法在合成提供的寡核苷酸的各步骤期间提供控制程度以使寡核苷酸的各核苷酸单元可提前被设计和/或选择以在键联磷处具有特定立体化学和/或在键联磷处具有特定修饰、和/或特定碱基和/或特定糖。在一些实施方案中，提前设计和/或选择提供的寡核苷酸以在核苷酸间键联的键联磷处具有立体中心的特定组合。
在一些实施方案中，使用本发明方法制备的提供的寡核苷酸被设计和/或测定来具有键联磷修饰的特定组合。在一些实施方案中，使用本发明方法制备的提供的寡核苷酸被设计和/或测定来具有碱基的特定组合。在一些实施方案中，使用本发明方法制备的提供的寡核苷酸被设计和/或测定来具有糖的特定组合。在一些实施方案中，使用本发明方法制备的提供的寡核苷酸被设计和/或测定来具有一种或多种以上结构特征的特定组合。
本发明方法展现高度手性控制。例如，本发明方法有助于控制提供的寡核苷酸内的每一单个键联磷的立体化学构型。在一些实施方案中，本发明方法提供一种寡核苷酸，其包含一个或多个独立地具有式I结构的修饰的核苷酸间键联。
在一些实施方案中，本发明方法提供一种寡核苷酸，其是米泊美生单聚体。在一些实施方案中，本发明方法提供一种寡核苷酸，其是具有构型Rp的米泊美生单聚体。在一些实施方案中，本发明方法提供一种寡核苷酸，其是具有构型Sp的米泊美生单聚体。
在一些实施方案中，本发明方法提供一种手性控制的寡核苷酸组合物，即含有预定水平的个别寡核苷酸类型的寡核苷酸组合物。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸组合物包含一种寡核苷酸类型。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸组合物包含一种以上寡核苷酸类型。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸组合物包含多种寡核苷酸类型。本文描述根据本发明制备的示例性手性控制的寡核苷酸组合物。
在一些实施方案中，本发明方法提供关于键联磷的构型是手性纯的米泊美生组合物。也就是说，在一些实施方案中，本发明方法提供米泊美生组合物，其中米泊美生关于键联磷的构型以单一非对映异构体形式存在于组合物中。
在一些实施方案中，本发明方法提供关于键联磷的构型是手性均一的米泊美生组合物。也就是说，在一些实施方案中，本发明方法提供米泊美生组合物，其中所有核苷酸单元关于键联磷的构型都具有相同立体化学，例如所有核苷酸单元在键联磷处都具有Rp构型，或所有核苷酸单元在键联磷处都具有Sp构型。
在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过50％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约55％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约60％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约65％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约70％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约75％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约80％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约85％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约90％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约91％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约92％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约93％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约94％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约95％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约96％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约97％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约98％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约99％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约99.5％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约99.6％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约99.7％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约99.8％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过约99.9％。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸的纯度超过至少约99％。
在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸组合物是被设计来包含单一寡核苷酸类型的组合物。在某些实施方案中，所述组合物是约50％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约50％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约50％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约55％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约60％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约65％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约70％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约75％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约80％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约85％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约90％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约91％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约92％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约93％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约94％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约95％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约96％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约97％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约98％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约99％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约99.5％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约99.6％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约99.7％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约99.8％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是约99.9％非对映异构纯。在一些实施方案中，所述组合物是至少约99％非对映异构纯。
在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸组合物是被设计来包含多种寡核苷酸类型的组合物。在一些实施方案中，本发明方法允许产生手性控制的寡核苷酸文库以使预先选择量的任何一种或多种手性控制的寡核苷酸类型可与任何一种或多种其它手性控制的寡核苷酸类型混合来产生手性控制的寡核苷酸组合物。在一些实施方案中，预先选择量的寡核苷酸类型是具有任一上述非对映异构纯度的组合物。
在一些实施方案中，本发明提供用于制备手性控制的寡核苷酸的方法，其包括以下步骤：
(1)偶联；
(2)加帽；
(3)修饰；
(4)去封闭；以及
(5)重复步骤(1)-(4)直至达成所需长度。
当描述提供的方法时，用词“循环”具有它的如由本领域普通技术人员所理解的普通含义。在一些实施方案中，一轮步骤(1)-(4)称为一个循环。
在一些实施方案中，本发明提供用于制备手性控制的寡核苷酸组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供一定量的第一手性控制的寡核苷酸；以及
(b)任选地提供一定量的一种或多种其它手性控制的寡核苷酸。
在一些实施方案中，第一手性控制的寡核苷酸是如本文所述的寡核苷酸类型。在一些实施方案中，一种或多种其它手性控制的寡核苷酸是一种或多种如本文所述的寡核苷酸类型。
相关化学和合成领域技术人员将认识到当使用本发明方法合成时，提供的寡核苷酸的结构变化和立体化学构型具有一定程度的多面性和控制性。例如，在第一循环完成之后，随后循环可使用为那个随后循环个别选择的核苷酸单元来进行，在一些实施方案中，所述核苷酸单元包含不同于第一循环核苷碱基和/或糖的核苷碱基和/或糖。同样，随后循环的偶联步骤中使用的手性助剂可不同于第一循环中使用的手性助剂，以使第二循环产生具有不同立体化学构型的磷键联。在一些实施方案中，新形成的核苷酸间键联中的键联磷的立体化学是通过使用立体化学纯亚磷酰胺来控制。另外，随后循环的修饰步骤中使用的修饰试剂可不同于第一循环或先前循环中使用的修饰试剂。这个迭代装配方法的累积作用是使得提供的寡核苷酸的各组分可在结构上和在构型上被高度定制。这个方法的另一优势是加帽步骤使“n-1”杂质的形成最少化，所述杂质否则将使得分离提供的寡核苷酸极具挑战，并且尤其是分离长度较长的寡核苷酸。
在一些实施方案中，用于制备手性控制的寡核苷酸的方法的示例性循环说明于方案I中。在方案I中，表示固体载体以及任选地一部分连接于固体载体的增长手性控制的寡核苷酸。例示的手性助剂具有式3-I的结构：
以下对其进一步描述。“帽”是通过加帽步骤引至氮原子的任何化学部分，并且在一些实施方案中，是氨基保护基。本领域普通技术人员了解在第一循环中，在开始时可仅有一个核苷连接于固体载体，并且可任选地在去封闭之前进行循环退出。如本领域技术人员所了解，BPRO是寡核苷酸合成中使用的受保护的碱基。以下进一步描述方案I的上述循环的各步骤。
方案I.合成手性控制的寡核苷酸。
在固体载体上合成
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸的合成是在固相上进行。在一些实施方案中，保护固体载体上存在的反应性基团。在一些实施方案中，未保护固体载体上存在的反应性基团。在寡核苷酸合成期间，在若干合成循环中用各种试剂处理固体载体以达成用个别核苷酸单元逐步延长增长寡核苷酸链。在链末端的直接连接于固体载体的核苷单元称为如本文所用的“第一核苷”。第一核苷是通过接头部分结合于固体载体，所述接头部分即在CPG、聚合物或其它固体载体与核苷之间具有共价键的二价基团。接头在被进行来装配寡核苷酸链的合成循环期间保持完整，并且在链装配之后被裂解以自载体释放寡核苷酸。
用于固相核酸合成的固体载体包括例如美国专利4,659,774、5,141,813、4,458,066；Caruthers美国专利号4,415,732、4,458,066、4,500,707、4,668,777、4,973,679和5,132,418；Andrus等美国专利号5,047,524、5,262,530；以及Koster美国专利号4,725,677(再颁布为Re34,069)中所述的载体。在一些实施方案中，固相是有机聚合物载体。在一些实施方案中，固相是无机聚合物载体。在一些实施方案中，有机聚合物载体是聚苯乙烯、氨基甲基聚苯乙烯、聚乙二醇-聚苯乙烯接枝共聚物、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、高度交联聚合物(HCP)、或其它合成聚合物、碳水化合物(如纤维素和淀粉或其它聚合碳水化合物)、或其它有机聚合物和任何共聚物、复合材料或以上无机或有机材料的组合。在一些实施方案中，无机聚合物载体是二氧化硅、氧化铝、作为硅胶载体的可控聚合玻璃(CPG)、或氨基丙基CPG。其它适用固体载体包括氟固体载体(参见例如WO/2005/070859)、长链烷基胺(LCAA)可控孔度玻璃(CPG)固体载体(参见例如S.P.Adams，K.S.Kavka，E.J.Wykes，S.B.Holder和G.R.Galluppi，J.Am.Chem.Soc.，1983，105，661-663；G.R.Gough，M.J.Bruden和P.T.Gilham，Tetrahedron Lett.，1981，22，4177-4180)。膜载体和聚合膜(参见例如Innovation and Perspectives in Solid PhaseSynthesis，Peptides，Proteins and Nucleic Acids，第21章第157-162页，1994 Roger Epton编以及美国专利号4,923,901)也适用于合成核酸。一旦形成，膜即可被化学官能化以用于核酸合成中。除官能团连接于膜之外，使用连接于膜的接头或间隔子基团也用于一些实施方案中来使膜与合成的链之间的空间位阻最小化。
其它适合的固体载体包括本领域中通常已知适用于固相方法中的那些，包括例如以PrimerTM 200载体销售的玻璃、可控孔度玻璃(CPG)、草酰基-可控孔度玻璃(参见例如Alul等，Nucleic Acid Research，1991，19，1527)、TentaGel载体-一种氨基聚乙二醇衍生化载体(参见例如Wright等，Tetrahedron Lett.，1993，34，3373)和Poros-一种聚苯乙烯/二乙烯苯共聚物。
表面活化的聚合物已被证明用于在若干固体载体介质上合成天然和修饰的核酸以及蛋白质。固体载体材料可为在孔隙性方面适合地均一，具有足够胺含量和足够柔性以经受任何伴随操作而不丧失完整性的任何聚合物。适合的所选材料的实例包括尼龙、聚丙烯、聚酯、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯和硝酸纤维素。视研究者的设计而定，其它材料可充当固体载体。考虑到一些设计，可选择例如包镀金属(特别是金或铂)(参见例如美国公布号20010055761)。在寡核苷酸合成的一个实施方案中，例如使核苷锚定于用羟基或氨基残基官能化的固体载体。或者，固体载体被衍生以提供酸不稳定性三烷氧基三苯甲基，如三甲氧基三苯甲基(TMT)。在不受理论束缚下，预期存在三烷氧基三苯甲基保护基将允许在通常在DNA合成仪上使用的条件下进行初始脱三苯甲基化。为用氨水较快释放溶液中的寡核苷酸材料，任选地将二乙醇酸酯接头引于载体上。
在一些实施方案中，或者，自5′至3′方向合成提供的寡核苷酸。在一些实施方案中，核酸是通过增长核酸的5′末端连接于固体载体，由此呈现它的3′基团用于反应，即使用5′-核苷亚磷酰胺或在酶促反应中(例如使用5′-三磷酸核苷进行连接和聚合)。当考虑5’至3’合成时，本发明的迭代步骤保持不变(即加帽和在手性磷上修饰)。
连接部分
连接部分或接头任选地用于使固体载体连接于包含游离亲核部分的化合物。适合的接头是已知的，如用于在固相合成技术中使固体载体连接于初始核苷分子的官能团(例如羟基)的短分子。在一些实施方案中，连接部分是丁二酰胺酸接头或丁二酸酯接头(-CO-CH2-CH2-CO-)或草酰基接头(-CO-CO-)。在一些实施方案中，连接部分和核苷是通过酯键键结在一起。在一些实施方案中，连接部分和核苷是通过酰胺键键结在一起。在一些实施方案中，连接部分使核苷连接于另一核苷酸或核酸。适合接头公开于例如OligonucleotidesAnd Analogues A Practical Approach，Ekstein，F.编，IRL Press，N.Y.，1991，第1章以及Solid-Phase Supports for Oligonucleotide Synthesis，Pon，R.T.，Curr.Prot.Nucleic Acid Chem.，2000，3.1.1-3.1.28中。
接头部分用于使包含游离亲核部分的化合物连接于另一核苷、核苷酸或核酸。在一些实施方案中，连接部分是磷酸二酯键联。在一些实施方案中，连接部分是H-膦酸酯部分。在一些实施方案中，连接部分是如本文所述的修饰的磷键联。在一些实施方案中，通用接头(UnyLinker)用于使寡核苷酸连接于固体载体(Ravikumar等，Org.Process Res.Dev.，2008，12(3)，399-410)。在一些实施方案中，使用其它通用接头(Pon，R.T.，Curr.Prot.Nucleic Acid Chem.，2000，3.1.1-3.1.28)。在一些实施方案中，使用各种正交接头(如二硫化物接头)(Pon，R.T.，Curr.Prot.Nucleic Acid Chem.，2000，3.1.1-3.1.28)。
一般性条件-用于合成的溶剂
提供的寡核苷酸的合成通常是在非质子性有机溶剂中进行。在一些实施方案中，溶剂是腈溶剂，例如像乙腈。在一些实施方案中，溶剂是碱性胺溶剂，例如像吡啶。在一些实施方案中，溶剂是醚溶剂，例如像四氢呋喃。在一些实施方案中，溶剂是卤化烃，例如像二氯甲烷。在一些实施方案中，使用溶剂的混合物。在某些实施方案中，溶剂是任何一种或多种上述类别的溶剂的混合物。
在一些实施方案中，当非质子性有机溶剂不是碱性的时，碱存在于反应步骤中。在其中存在碱的一些实施方案中，所述碱是胺碱，例如像吡啶、喹啉或N，N-二甲基苯胺。示例性其它胺碱包括吡咯烷、哌啶、N-甲基吡咯烷、吡啶、喹啉、N，N-二甲基氨基吡啶(DMAP)或N，N-二甲基苯胺。
在一些实施方案中，碱不是胺碱。
在一些实施方案中，非质子性有机溶剂是无水的。在一些实施方案中，无水非质子性有机溶剂是新鲜蒸馏的。在一些实施方案中，新鲜蒸馏的无水非质子性有机溶剂是碱性胺溶剂，例如像吡啶。在一些实施方案中，新鲜蒸馏的无水非质子性有机溶剂是醚溶剂，例如像四氢呋喃。在一些实施方案中，新鲜蒸馏的无水非质子性有机溶剂是腈溶剂，例如像乙腈。
手性试剂
在提供的方法中，手性试剂用于在产生手性控制的寡核苷酸时赋予立体选择性。许多不同手性试剂，也由本领域技术人员以及在本文中称为手性助剂，可根据本发明方法加以使用。示例性所述手性试剂在本文中以及在以上引用的Wada I、II和III中加以描述。在某些实施方案中，手性试剂是如由Wada I所述。在一些实施方案中，供根据本发明方法使用的手性试剂具有下式3-I：
其中W1和W2是-O-、-S-或-NG5-中的任一个，U1和U3是通过单键、双键或三键来键结于U2(如果存在)或键结于彼此(如果r是0)的碳原子。U2是-C-、-CG8-、-CG8G8-、-NG8-、-N-、-O-或-S-，其中r是整数0至5，并且至多两个杂原子是邻近的。当任一U2是C时，在第二例U2(其是C或键结于U1或U3中的一个)之间必须形成三键。类似地，当任一U2是CG8时，在第二例U2(其是-CG8-或-N-或键结于U1或U3中的一个)之间形成双键。
在一些实施方案中，-U1-(U2)r-U3-是-CG3G4-CG1G2-。在一些实施方案中，-U1-(U2)r-U3-是-CG3＝CG1-。在一些实施方案中，-U1-(U2)r-U3-是-C≡C-。在一些实施方案中，-U1-(U2)r-U3-是-CG3＝CG8-CG1G2-。在一些实施方案中，-U1-(U2)r-U3-是-CG3G4-O-CG1G2-。在一些实施方案中，-U1-(U2)r-U3-是-CG3G4-NG8-CG1G2-。在一些实施方案中，-U1-(U2)r-U3-是-CG3G4-N-CG2-。在一些实施方案中，-U1-(U2)r-U3-是-CG3G4-N＝C G8-CG1G2-。
如本文所定义，G1、G2、G3、G4、G5和G8独立地是氢或选自烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂芳基和芳基的任选地取代的基团；或G1、G2、G3、G4、G5中的两个是G6，其一起形成具有直至约20个环原子的任选地取代的单环或多环、以及稠合或未稠合的饱和、部分不饱和或不饱和碳环或含杂原子的环。在一些实施方案中，如此形成的环被氧代基、硫代基、烷基、烯基、炔基、杂芳基或芳基部分取代。在一些实施方案中，当通过使两个G6在一起形成的环被取代时，它是被足够庞大以在反应期间赋予立体选择性的部分取代。
在一些实施方案中，通过使两个G6在一起形成的环是任选地取代的环戊基、吡咯基、环丙基、环己烯基、环戊烯基、四氢吡喃基或哌嗪基。在一些实施方案中，通过使两个G6在一起形成的环是任选地取代的环戊基、吡咯基、环丙基、环己烯基、环戊烯基、四氢吡喃基、吡咯烷基或哌嗪基。
在一些实施方案中，G1是任选地取代的苯基。在一些实施方案中，G1是苯基。在一些实施方案中，G2是甲基或氢。在一些实施方案中，G1是任选地取代的苯基，并且G2是甲基。在一些实施方案中，G1是苯基，并且G2是甲基。
在一些实施方案中，r是0。
在一些实施方案中，W1是-NG5-。在一些实施方案中，G3和G4中的一个连同G5一起形成任选地取代的吡咯烷基环。在一些实施方案中，G3和G4中的一个连同G5一起形成吡咯烷基环。
在一些实施方案中，W2是-O-。
在一些实施方案中，手性试剂是式3-AA化合物：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在式3AA的一些实施方案中，W1和W2独立地是-NG5-、-O-或-S-；G1、G2、G3、G4和G5独立地是氢或选自烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂芳基或芳基的任选地取代的基团；或G1、G2、G3、G4和G5中的两个是G6，其一起形成具有直至约20个环原子的任选地取代的单环或多环、稠合或未稠合的饱和、部分不饱和或不饱和碳环或含杂原子的环，并且G1、G2、G3、G4和G5中的至多四个是G6。类似于式3-I化合物，G1、G2、G3、G4或G5中的任一个都任选地被氧代基、硫代基、烷基、烯基、炔基、杂芳基或芳基部分取代。在一些实施方案中，所述取代在手性控制的寡核苷酸产生中诱导立体选择性。
在一些实施方案中，手性试剂具有下式之一：
在一些实施方案中，手性试剂是氨基醇。在一些实施方案中，手性试剂是氨基硫醇。在一些实施方案中，手性试剂是氨基酚。在一些实施方案中，手性试剂是(S)-2-甲基氨基-1-苯基乙醇和(R)-2-甲基氨基-1-苯基乙醇、(1R，2S)-麻黄碱或(1R，2S)-2-甲基氨基-1，2-二苯基乙醇。
在本发明的一些实施方案中，手性试剂是具有下式中的一个的化合物：
选择手性试剂、例如由式Q表示的异构体或它的立体异构体式R，允许特异性控制在键联磷处的手性。因此，可选择各合成循环中的Rp或Sp构型，从而允许控制手性控制的寡核苷酸的总体三维结构。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸具有全部Rp立体中心。在本发明的一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸具有全部Sp立体中心。在本发明的一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸中的各键联磷独立地是Rp或Sp。在本发明的一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸中的各键联磷独立地是Rp或Sp，并且至少一个是Rp，并且至少一个是Sp。在一些实施方案中，对Rp和Sp中心进行选择以对手性控制的寡核苷酸赋予特定三维超结构。本文进一步详述示例性所述选择。
在一些实施方案中，选择能够在以上描绘的循环中的特定步骤被移除的供根据本发明使用的手性试剂。例如，在一些实施方案中，合乎需要的是在修饰键联磷的步骤期间移除手性试剂。在一些实施方案中，合乎需要的是在修饰键联磷的步骤之前移除手性试剂。在一些实施方案中，合乎需要的是在修饰键联磷的步骤之后移除手性试剂。在一些实施方案中，合乎需要的是在第一偶联步骤已发生之后、但在第二偶联步骤已发生之前移除手性试剂，以使手性试剂在第二偶联期间不存在于增长寡核苷酸上(并且同样对于其它随后偶联步骤而论)。在一些实施方案中，在修饰键联磷之后，但在随后循环开始之前发生的“去封闭”反应期间移除手性试剂。本文描述用于移除的示例性方法和试剂。
在一些实施方案中，移除手性助剂是在如方案I中所说明进行修饰和/或去封闭步骤时达成。可为有益的是将手性助剂移除与其它转化，如修饰和去封闭组合在一起。本领域普通技术人员将了解节省的步骤/转化可改进例如关于产率和产品纯度的总体合成效率，尤其对于较长寡核苷酸来说。方案I中说明一个实例，其中手性助剂是在修饰和/或去封闭期间移除。
在一些实施方案中，供根据本发明方法使用的手性试剂的特征在于它可在某些条件下移除。例如，在一些实施方案中，选择能够在酸性条件下移除的手性试剂。在某些实施方案中，选择能够在温和酸性条件下移除的手性试剂。在某些实施方案中，选择能够通过E1消除反应(例如由于在酸性条件下在手性试剂上形成阳离子中间体，从而导致手性试剂自寡核苷酸裂解而发生移除)移除的手性试剂。在一些实施方案中，手性试剂的特征在于它具有认定为能够适应或有助于E1消除反应的结构。相关领域技术人员将了解哪些结构将被设想为倾向于经受所述消除反应。
在一些实施方案中，选择能够用亲核试剂移除的手性试剂。在一些实施方案中，选择能够用胺亲核试剂移除的手性试剂。在一些实施方案中，选择能够用除胺以外的亲核试剂移除的手性试剂。
在一些实施方案中，选择能够用碱移除的手性试剂。在一些实施方案中，选择能够用胺移除的手性试剂。在一些实施方案中，选择能够用除胺以外的碱移除的手性试剂。
手性试剂的其它实施方案
在一些实施方案中，本发明涉及一种用于合成手性控制的寡核苷酸的手性试剂。
在一些实施方案中，本发明提供对以上以及本文中所述的偶联、加帽、修饰和去封闭步骤稳定的手性试剂。在一些实施方案中，本发明提供对以上以及本文中所述的修饰和去封闭步骤稳定的手性试剂。在一些实施方案中，本发明提供对以上以及本文中所述的硫化和去封闭步骤稳定的手性试剂。在一些实施方案中，本发明提供对以上以及本文中所述的氧化步骤稳定的手性试剂。在一些实施方案中，所述手性试剂具有式Z-I结构。
在一些实施方案中，本发明提供通过用碱和/或亲核试剂处理来移除的手性试剂。在一些实施方案中，本发明提供通过用碱和/或亲核试剂处理来移除，并且对以上以及本文中所述的偶联、加帽、修饰和去封闭步骤稳定的手性试剂。在一些实施方案中，本发明提供由包括胺的处理剂移除的手性试剂。在一些实施方案中，本发明提供由包括胺的处理剂移除，并且对以上以及本文中所述的偶联、加帽、修饰和去封闭步骤稳定的手性试剂。在一些实施方案中，本发明提供通过本申请中所述的脱保护/裂解条件移除，并且对以上以及本文中所述的偶联、加帽、修饰和去封闭步骤稳定的手性试剂。在一些实施方案中，所述手性试剂具有式Z-I结构。
在一些实施方案中，对偶联、加帽、修饰和去封闭步骤稳定的手性试剂用于合成以上以及本文中所述的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方案中，对偶联、加帽、修饰和去封闭步骤稳定的手性试剂用于合成以上以及本文中所述的手性控制的寡核苷酸，其中所述手性控制的寡核苷酸包含一个或多个磷酸二酯或硫代磷酸二酯键联。在一些实施方案中，对偶联、加帽、修饰和去封闭步骤稳定的手性试剂用于合成包含一个或多个磷酸二酯或硫代磷酸二酯键联的手性控制的寡核苷酸，并且直至已达成所需寡核苷酸长度才被移除。在一些实施方案中，对偶联、加帽、修饰和去封闭步骤稳定的手性试剂用于合成包含一个或多个磷酸二酯或硫代磷酸二酯键联的手性控制的寡核苷酸，并且直至在循环退出之后才被移除。在一些实施方案中，对偶联、加帽、修饰和去封闭步骤稳定的手性试剂用于合成包含一个或多个磷酸二酯或硫代磷酸二酯键联的手性控制的寡核苷酸，并且直至自固体载体裂解才被移除。在一些实施方案中，对偶联、加帽、修饰和去封闭步骤稳定的手性试剂用于合成包含一个或多个磷酸二酯或硫代磷酸二酯键联的手性控制的寡核苷酸，并且直至自固体载体裂解才被移除，并且移除是在与自固体载体裂解相同的步骤中进行。在一些实施方案中，所述手性试剂具有式Z-I结构。
在一些实施方案中，当对偶联、加帽、修饰和去封闭步骤稳定的手性试剂用于寡核苷酸合成时，具有准备用于偶联的5’-OH的寡核苷酸可来自任何合成循环，包括方案I、I-b、I-c、I-d、Z-1和Z-2中所述的那些。在一些实施方案中，具有用于偶联的5’-OH的寡核苷酸包含如以上以及本文中所述的各种类型的核苷酸间键联。在偶联之后，如本申请中所述的修饰步骤将所需修饰安置于键联磷。产物可在去封闭之前/之后退出循环，或在使5’-OH去封闭之后进入下一循环。本领域普通技术人员应了解的是下一循环可为本申请中所述的任何合成循环，包括但不限于方案I、I-b、I-c、I-d、Z-1和Z-2中的那些。
在一些实施方案中，供根据本发明使用的手性试剂或其盐具有化学式(Z-I)。
在式(Z-I)中，Gz1和Gz2独立地是氢原子、硝基(-NO2)、卤素原子、氰基(-CN)、式(Z-II)或(Z-III)基团，或G1与G2两者一起形成式(Z-IV)基团。
在一些实施方案中，式(Z-II)基团是如下所描绘：
其中G21至G23独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基或C1-3烷基。
在一些实施方案中，式(Z-III)基团是如下所描绘：
其中G31至G33独立地是C1-4烷基、C6-14芳基C1-4烷氧基、C7-14芳烷基、C1-4烷基C6-14芳基、C1-4烷氧基C6-14芳基或C6-14芳基C1-4烷基。
在一些实施方案中，式(Z-IV)基团是如下所描绘：
其中G41至G46独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基或C1-3烷基。
Gz3和Gz4独立地是氢原子、C1-3烷基、C6-14芳基，或Gz3与Gz4两者与式(Z-I)中的NH部分一起形成具有3至16个碳原子的含杂原子的环。
在一些实施方案中，手性试剂具有以下化学式(Z-I’)：
其中Gz1和Gz2与以上相同。即，Gz1和Gz2独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基、式(Z-II)或(Z-III)基团，或Gz1与Gz2两者一起形成式(Z-IV)基团。
在某些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I’)，并且Gz1和Gz2各自是式(Z-II)基团，其中G21至G23独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基或C1-3烷基。
在某些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I’)，并且Gz1和Gz2各自是式(Z-II)基团，并且G21至G23各自是氢原子。
在某些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I’)，并且Gz1是氢原子，Gz2是式(Z-II)基团，并且G21至G23独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基或C1-3烷基。
在某些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I’)，并且Gz1是氢原子，Gz2是式(Z-II)基团，G21和G22各自是氢原子，并且G23是硝基。
在某些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I’)，并且Gz1是氢原子，并且Gz2是式(III)基团，并且G31至G33独立地是C1-4烷基、C6-14芳基、C7-14芳烷基、C1-4烷基C6-14芳基、C1-4烷氧基C6-14芳基或C6-14芳基C1-4烷基。
在一些实施方案中，手性试剂具有化学式(I’)，并且G1是氢原子，并且G2是式(III)基团，并且G31至G33独立地是C1-4烷基、C6芳基、C7-10芳烷基、C1-4烷基C6芳基、C1-4烷氧基C6芳基或C6芳基C1-4烷基。
在某些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I’)，并且Gz1是氢原子，Gz2是式(Z-III)基团，并且G31至G33独立地是C1-4烷基或C6芳基。C1-4烷基的实例是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和叔丁基。
在某些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I’)，并且Gz1是氢原子，Gz2是式(Z-III)基团，并且G31至G33独立地是C1-4烷基。
在某些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I’)，并且Gz1是氢原子，Gz2是式(Z-III)基团，并且G31和G33是C6芳基，并且G32是C1-4烷基。
在某些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I’)，并且Gz1和Gz2一起形成式(Z-IV)基团，并且G41至G46独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基或C1-4烷基。
在某些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I’)，并且Gz1和Gz2一起形成式(Z-IV)基团，其中G41至G46各自是氢原子。
在某些实施方案中，手性试剂选自化学式3a、3b、5a、Z-5b、7a、7b、9a、9b、11a和11b中的一个：
在一些实施方案中，供根据本发明使用的核苷3’-亚磷酰胺衍生物是由式(Z-Va)或(Z-Vb)表示：
其中Gz1至Gz4与以上相同，Gz5是羟基保护基，并且Bs是选自由下式(Z-VI)至(Z-XI)表示的基团或其衍生物的基团。
Bs的实例是腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、乌嘌呤、尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶或其衍生物；
Rz2独立地是氢、-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-ORb或-SRb，其中Rb是封闭部分；
Y1是O、NRd、S或Se；
Rd独立地是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的硅烷基、氨基甲酸酯基、-P(O)(Re)2或-HP(O)(Re)；
Re独立地是氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y2-、烯基-Y2-、炔基-Y2-、芳基-Y2-或杂芳基-Y2-或是Na+、Li+或K+的阳离子或-O-；
Y2是O、NRd或S；
Rz3是由-CH2-、-(CH2)2-、-CH2NH-或-CH2N(CH3)-表示的基团。
G5的实例是三苯甲基、4-单甲氧基三苯甲基、4，4′-二甲氧基三苯甲基、4，4′，4″-三甲氧基三苯甲基、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。
在一些实施方案中，核苷3’-亚磷酰胺衍生物是由式(Z-Va’)或(Z-Vb’)表示：
其中Gz1、Gz2、Gz5、Bs、Rz2和Rz3各自是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，本发明涉及一种用于合成手性控制的寡核苷酸的方法。
在一些实施方案中，提供的方法包括使包含非手性H-膦酸酯部分的分子、第一活化试剂和手性试剂或其盐反应以形成单体的第一步骤。在一些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I)，并且单体可由式(Z-Va)、(Z-Vb)、(Z-Va’)或(Z-Vb’)表示。单体与第二活化试剂和核苷反应以形成缩合的中间体。在一些实施方案中，随后步骤包括使缩合的中间体转化成包含手性X-膦酸酯部分的核酸。
在一些实施方案中，本发明方法提供稳定和可商购获得的材料作为起始材料。在一些实施方案中，本发明方法使用非手性起始材料提供立体控制的磷原子修饰的寡核苷酸。
如工作实施例中所示，在一些实施方案中，本发明方法在脱保护步骤期间不导致降解。此外，方法不需要特殊加帽试剂来产生磷原子修饰的寡核苷酸衍生物。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于使用手性单体来合成立体控制的磷原子修饰的寡核苷酸衍生物的方法。在一些实施方案中，第一步骤是使由式(Z-Va)、(Z-Vb)、(Z-Va’)或(Z-Vb’)表示的核苷3′-亚磷酰胺衍生物与第二活化试剂和核苷反应以形成缩合的中间体。第二步骤是使缩合的中间体转化成包含手性X-膦酸酯部分的核酸。
在本文于本说明书中公开的所有出版物和专利申请都以引用的方式整体并入本文，所述引用的程度就如同已特定地和个别地指示将各个别出版物或专利申请以引用的方式并入一般。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，在缩合反应中，术语“活化试剂”是指使反应性较小的位点活化，并且致使它更易受亲核试剂攻击的试剂
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，“烷基”是指脂族烃基团。烷基部分可为饱和烷基(此是指它不含有任何不饱和单元，例如碳-碳双键或碳-碳三键)，或烷基部分可为不饱和烷基(此是指它含有至少一个不饱和单元)。烷基部分无论饱和或不饱和都可为分支、直链，或包括环状部分。烷基的连接点处于不是环的一部分的碳原子处。“烷基”部分可具有1至10个碳原子(无论何时它在本文中出现，如“1至10”的数值范围是指给定范围内的各整数；例如“1至10个碳原子”是指烷基可由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等组成，直至并包括10个碳原子，但本定义也涵盖术语“烷基”出现在未指定数值范围的情况下)。烷基包括分支烷基与直链烷基两者。本文所述的化合物的烷基可指定为“C1-C6烷基”或类似符号。仅举例来说，“C1-C6烷基”指示在烷基链中存在一个、两个、三个、四个、五个或六个碳原子，即烷基链选自例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。典型烷基包括但决不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、烯丙基、环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基等。在一个方面，烷基是C1-C6烷基。C1-3烷基是指具有1至3个碳原子的直链或分支烷基。C1-3烷基的实例是甲基、乙基、丙基和异丙基。C1-4烷基是指具有1至4个碳原子的直链或分支烷基。C1-4烷基的实例是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，术语“芳基”是指芳族环，其中形成环的各原子是碳原子。芳基环是由五个、六个、七个、八个、九个或九个以上碳原子形成。芳基是取代或未取代的。在一个方面，芳基是苯基或萘基。视结构而定，芳基可为单价基团或二价基团(即亚芳基)。在一个方面，芳基是C6-C10芳基。C6-14芳基是指具有6至14个碳原子的芳基。C6-14芳基的实例是苯基、联苯、萘基、蒽基、茚满基、邻苯二甲酰亚胺基、萘酰亚胺基、菲啶基和四氢萘基。
术语“芳烷基”是指被芳基取代的烷基。适合芳烷基包括苯甲基、吡啶甲基等，其全部可任选地被取代。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，“酰基部分”是指烷基(C＝O)、芳基(C＝O)或芳烷基(C＝O)。酰基部分可在羰基与烃基团之间具有间插部分(Y)，即氧基、氨基、硫基或硒基。例如，酰基可为烷基-Y-(C＝O)、芳基-Y-(C＝O)或芳烷基-Y-(C＝O)。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，“烯基”是含有至少一个碳-碳双键的直链、分支链和环状烃基团。烯基可被取代。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，“炔基”是含有至少一个碳-碳三键的直链、分支链和环状烃基团。炔基可被取代。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，“烷氧基”是指连接于氧的烷基，即(烷基)-O-基团，其中烷基是如本文所定义。实例包括甲氧基(-OCH3)或乙氧基(-OCH2CH3)。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，“烯基氧基”是指连接于氧的烯基，即(烯基)-O-基团，其中烯基是如本文所定义。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，“炔基氧基”是指连接于氧的炔基，即(炔基)-O-基团，其中炔基是如本文所定义。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，“芳基氧基”是指连接于氧的芳基，即(芳基)-O-基团，其中所述芳基是如本文所定义。实例包括苯氧基(-OC6H5)。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，术语“烷基硒基”是指具有连接于其的取代硒基的烷基，即(烷基)-Se-基团，其中烷基是在本文中所定义。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，术语“烯基硒基”是指具有连接于其的取代硒基的烯基，即(烯基)-Se-基团，其中烯基是在本文中所定义。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，术语“炔基硒基”是指具有连接于其的取代硒基的炔基，即(炔基)-Se-基团，其中烯基是在本文中所定义。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，术语“烷基硫基”是指连接于桥接硫原子的烷基，即(烷基)-S-基团，其中烷基是在本文中所定义。例如，烷基硫基是甲基硫基等。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，术语“烯基硫基”是指连接于桥接硫原子的烯基，即(烯基)-S-基团，其中烯基是在本文中所定义。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，术语“炔基硫基”是指连接于桥接硫原子的炔基，即(炔基)-S-基团，其中烯基是在本文中所定义。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，术语“烷基氨基”是指被至少一个烷基取代的氨基，即-NH(烷基)或-N(烷基)2，其中烷基是在本文中所定义。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，术语“烯基氨基”是指被至少一个烯基取代的氨基，即-NH(烯基)或-N(烯基)2，其中烯基是在本文中所定义。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，术语“炔基氨基”是指被至少一个炔基取代的氨基，即-NH(炔基)或-N(炔基)2，其中炔基是在本文中所定义。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，术语“卤素”旨在包括氟、氯、溴和碘。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，“荧光基团”是指当用具有所选波长的光激发时，发射不同波长的光的分子。荧光基团包括但不限于吲哚基团、荧光素、四甲基若丹明(tetramethylrhodamine)、得克萨斯红(Texas Red)、BODIPY、5-[(2-氨基乙基)氨基]萘-1-磺酸(EDANS)、香豆素和萤光黄(Lucifer yellow)。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，“铵离子”是具有化学式NH4 +的带正电荷的多原子阳离子。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，“烷基铵离子”是它的至少一个氢原子被烷基置换的铵离子，其中烷基是在本文中所定义。实例包括三乙基铵离子、N，N-二异丙基乙基铵离子。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，“亚铵离子”具有一般性结构(Rx)2C＝N(Rx)2 +。Rx基团是指如本文定义的烷基、烯基、炔基、芳基。“杂芳族亚铵离子”是指其中氮和它的连接的Rx基团形成杂芳族环的亚铵离子。“杂环亚铵离子”是指其中氮和它的连接的Rx基团形成杂环的亚铵离子。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，除非在说明书中另外明确陈述，否则术语“氨基”或“胺”是指-N(Rh)2基团，其中各Rh独立地是氢、烷基、氟烷基、碳环基、碳环基烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基或杂芳基烷基。当-N(Rh)2基团具有两个除氢以外的Rh时，它们可与氮原子组合以形成4、5、6或7元环。例如，-N(Rh)2意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。氢、烷基、氟烷基、碳环基、碳环基烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基或杂芳基烷基中的任何一个或多个任选地被一个或多个独立地是以下的取代基取代：烷基、杂烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羟基、卤基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、硝基、三甲基硅烷基、-ORi、-SRi、-OC(O)Ri、-N(Ri)2、-C(O)Ri、-C(O)ORi、-OC(O)N(Ri)2、-C(O)N(Ri)2、-N(Ri)C(O)OR、-N(Ri)C(O)Ri、-N(Ri)C(O)N(Ri)2、N(Ri)C(NRi)N(Ri)2、-N(Ri)S(O)tRi(其中t是1或2)、-S(O)或-S(O)tN(Ri)2(其中t是1或2)，其中各Ri独立地是氢、烷基、氟烷基、碳环基、碳环基烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基或杂芳基烷基。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，如本文所用的“氨基甲酸酯基”是指连接于氨基的具有式-C(O)OR的部分，其中R是烷基、氟烷基、碳环基、碳环基烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基或杂芳基烷基。实例包括但不限于Boc(叔丁基-OC(O)-)、CBz(苯甲基-OC(O)-)、Teoc(Me3SiCH2CH2OC(O)-)、alloc(烯丙基-OC(O)-)或Fmoc(9-芴基甲基-OC(O)-)基团
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，如本文所用的“取代的硅烷基”是指具有式Rx 3Si-的部分。实例包括但不限于TBDMS(叔丁基二甲基硅烷基)、TBDPS(叔丁基二苯基硅烷基)或TMS(三甲基硅烷基)。
如此“手性试剂的其它实施方案”部分中所用，术语“硫醇”是指-SH基团，并且包括取代的硫醇基团，即-SRJ基团，其中RJ各自独立地是如本文定义的取代或未取代的烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基芳烷基、杂环基或杂环基烷基。
在一些实施方案中，本发明提供一种手性试剂或其盐。在一些实施方案中，手性试剂具有以下化学式(Z-I)：
其中Gz1和Gz2独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基(-CN)、式(Z-II)或(Z-III)基团，或Gz1与Gz2两者一起形成式(Z-IV)基团。在一些实施方案中，术语“手性试剂”是用于产生立体控制的磷原子修饰的核苷酸或寡核苷酸衍生物的化学组合物。手性试剂与核苷反应以形成手性中间体。
在一些实施方案中，式(Z-II)基团具有下式：
其中G21至G23独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基或C1-3烷基。在一些实施方案中，G21至G23的实例是氢原子。
在一些实施方案中，式(Z-III)基团具有下式：
其中G31至G33独立地是C1-4烷基、C6-14芳基、C1-4烷氧基、C7-14芳烷基、C1-4烷基C6-14芳基、C1-4烷氧基C6-14芳基或C6-14芳基C1-4烷基。C1-4烷基C6-14芳基的实例是甲基苯基和乙基苯基。C1-4烷氧基C6-14芳基的实例是甲氧基苯基和乙氧基苯基。C6-14芳基C1-4烷基的实例是苯甲基和苯基乙基。在一些实施方案中，G31至G33的实例独立地是甲基和苯基。
在一些实施方案中，式(Z-IV)基团具有下式：
其中G41至G46独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基或C1-3烷基。在一些实施方案中，G41至G46的实例是氢原子。
Gz3和Gz4独立地是氢原子、C1-3烷基、C6-14芳基，或Gz3与Gz4两者一起形成具有3至16个碳原子的含杂原子的环。在一些实施方案中，G3和G4的实例是与式(I)中的NH部分一起形成具有3至16个碳原子的含杂原子的环。
在某些实施方案中，手性试剂具有以下化学式(Z-I’)。
在式(Z-I’)中，Gz1和Gz2与以上相同，并且Gz1和Gz2独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基、式(Z-II)或(Z-III)基团，或Gz1与Gz2两者一起形成式(Z-IV)基团
在某些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I’)，并且Gz1和Gz2各自是式(Z-II)基团，其中G21至G23独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基或C1-3烷基。
在某些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I’)，并且Gz1和Gz2各自是式(Z-II)基团，并且G21至G23各自是氢原子。
在某些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I’)，并且Gz1是氢原子，Gz2是式(Z-II)基团，并且G21至G23独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基或C1-3烷基。
在某些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I’)，并且Gz1是氢原子，Gz2是式(Z-II)基团，G21和G22各自是氢原子，并且G23是硝基(-NO2)。
在某些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I’)，并且Gz1是氢原子，并且Gz2是式(Z-III)基团，并且G31至G33独立地是C1-4烷基、C6-14芳基、C7-14芳烷基、C1-4烷基C6-14芳基、C1-4烷氧基C6-14芳基或C6-14芳基C1-4烷基。
在一些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I’)，并且Gz1是氢原子，Gz2是式(Z-III)基团，并且G31至G33独立地是C1-4烷基或C6芳基(苯基)。C1-4烷基的实例是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和叔丁基。
在某些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I’)，并且Gz1是氢原子，Gz2是式(Z-III)基团，并且G31至G33独立地是C1-2烷基(甲基或乙基)或C6芳基(苯基)。
在某些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I’)，并且Gz1是氢原子，Gz2是式(Z-III)基团，并且G31至G33独立地是C1-4烷基。
在某些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I’)，并且Gz1是氢原子，Gz2是式(Z-III)基团，并且G31和G33是C6芳基(苯基)，并且G32是C1-2烷基。
在某些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I’)，并且Gz1和Gz2一起形成式(Z-IV)基团，并且G41至G46独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基或C1-3烷基。
在某些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I’)，并且Gz1和Gz2一起形成式(Z-IV)基团，其中G41至G46各自是氢原子。
在某些实施方案中，手性试剂选自化学式3a、3b、5a、Z-5b、7a、7b、9a、9b、11a和11b中的一个：
即，在一些实施方案中，手性试剂选自：
(S)-2-(甲基二苯基硅烷基)-1-((S)-1-吡咯烷-2-基)乙醇(3a)，
(R)-2-(甲基二苯基硅烷基)-1-((R)-1-吡咯烷-2-基)乙醇(3b)，
(S)-2-(三甲基硅烷基)-1-((S)-1-吡咯烷-2-基)乙醇(5a)，
(R)-2-(三甲基硅烷基)-1-((R)-1-吡咯烷-2-基)乙醇(Z-5b)，
(R)-2，2-二苯基-1-((S)-吡咯烷-2-基)乙醇(7a)，
(S)-2，2-二苯基-1-((R)-吡咯烷-2-基)乙醇(7b)，
(R)-2-(4-硝基苯基)-1-((S)-吡咯烷-2-基)乙醇(9a)，
(S)-2-(4-硝基苯基)-1-((R)-吡咯烷-2-基)乙醇(9b)，
(R)-(9H-芴-9-基)((S)-吡咯烷-2-基)甲醇(11a)或
(S)-(9H-芴-9-基)((R)-吡咯烷-2-基)甲醇(11b)。
手性试剂与核酸或修饰的核酸反应以成为不对称助剂基团。作为制造立体控制的磷原子修饰的寡核苷酸衍生物的中间体的核苷3’-亚磷酰胺衍生物是通过手性试剂与核酸或修饰的核酸反应来获得。
在一些实施方案中，本发明提供一种由式(Z-Va)或(Z-Vb)表示的核苷3’-亚磷酰胺衍生物。式(Z-Va)和(Z-Vb)化合物称为用于合成寡核苷酸衍生物的单体。这些化合物也称为噁唑磷烷单体。由式(Z-Vb)表示的化合物的糖部分称为BNA和LNA(当Rz3是亚甲基时)。
在式(Z-Va)和(Z-Va)中，Gz1至Gz4与以上相同，Gz5是羟基保护基，并且Bs是选自由式(Z-VI)至(Z-XI)表示的基团或其衍生物的基团。
Bs的实例是腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、乌嘌呤、尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶或其衍生物；
Rz2独立地是氢、-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-ORb或-SRb，其中Rb是封闭部分；
Y1是O、NRd、S或Se；
Rd独立地是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的硅烷基、氨基甲酸酯基、-P(O)(Re)2或-HP(O)(Re)；
Re独立地是氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y2-、烯基-Y2-、炔基-Y2-、芳基-Y2-或杂芳基-Y2-或是Na+、Li+或K+的阳离子或-O-；
Y2是O、NRd或S；
Rz3是由-CH2-、-(CH2)2-、-CH2NH-或-CH2N(CH3)-表示的基团。
Gz5的实例是三苯甲基、4-单甲氧基三苯甲基、4，4′-二甲氧基三苯甲基、4，4′，4″-三甲氧基三苯甲基、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。
在一些实施方案中，Bs是腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、乌嘌呤或其衍生物。在一些实施方案中，Bs是核苷碱基或修饰的核苷碱基。示例性衍生物例如是JP 2005-89441 A中公开的那些，并且如下加以表示：
其中，在上式中，R8至R10各自独立地是C1-10烷基、C6-C10芳基、C6-C10芳烷基或C6-C10芳基氧基烷基。在一些实施方案中，R8是甲基、异丙基、苯基、苯甲基和苯氧基甲基。在一些实施方案中，R9和R10是C1-4烷基。
在一些实施方案中，核苷3’-亚磷酰胺衍生物是由式(Z-Va’)或(Z-Vb’)表示：
其中，在式(Z-Va’)和(Z-Vb’)中，Gz1、Gz2、Gz5、Bs、Rz2和Rz3各自与以上相同。在某些实施方案中，核苷3’-亚磷酰胺衍生物是用于产生立体控制的磷原子修饰的核苷酸和寡核苷酸的手性单体。核苷3′-亚磷酰胺衍生物的实例是由下式表示：12a、12b、13a、13b、14a、14b、15a、15b、16a、16b、17a、17b、18a、18b、19a、19b、20a、20b、21a、21b、22a、22b、23a、23b、24a、24b、25a、25b、26a、26b、27a、27b、28a、28b、29a、29b、30a、30b、31a、31b、32a、32b、33a、33b、34a、34b和35a。
DMTr表示4，4′-二甲氧基三苯甲基，并且TOM表示三异丙基硅烷氧基甲基。
使用核苷3’-亚磷酰胺衍生物的实施例公开于例如JP 2005-89441A中。通过重复缩合和脱保护步骤，本发明方法有助于延长如其中所公开的寡核苷酸链。
在一些实施方案中，寡核苷酸是如式(Z-X)中所示：
其中，在式(Z-X)中，Xz表示硫化物(＝S)、C1-3烷基、C1-3烷氧基、C1-3烷基硫基、C6-C10芳基、C6-C10芳烷基或C6-C10芳基氧基烷基。在一些实施方案中，Xz表示硫化物(＝S)。nz是表示1至150、1至100、1至50、或1至30的整数。在一些实施方案中，nz优选是2至100，优选是10至100，优选是10至50，并且更优选是15至30。
在一些实施方案中，本发明提供用于合成立体控制的磷原子修饰的寡核苷酸衍生物的方法。在一些实施方案中，第一步骤是使包含非手性H-膦酸酯部分的分子、第一活化试剂和手性试剂或其盐反应以形成单体的步骤。在一些实施方案中，手性试剂具有化学式(Z-I)或(Z-I’)，并且单体可由式(Z-Va)、(Z-Vb)、(Z-Va')或(Z-Vb’)表示。单体与第二活化试剂和核苷反应以形成缩合的中间体。下一步骤是使缩合的中间体转化成包含手性X-膦酸酯部分的核酸的步骤。在一些实施方案中，方法是如WO 2010/064146中所述。在一些实施方案中，步骤是如WO 2010/064146的途径A和途径B中所述。
在一些实施方案中，本发明提供一种如以下方案Z-1中所说明来合成手性控制的寡核苷酸的方法。
方案Z-1
活化
非手性H-膦酸酯部分用第一活化试剂处理以形成第一中间体。在一个实施方案中，在缩合步骤期间添加第一活化试剂至反应混合物中。第一活化试剂的使用取决于反应条件，如用于反应的溶剂。第一活化试剂的实例是光气、氯甲酸三氯甲酯、双(三氯甲基)碳酸酯(BTC)、草酰氯、Ph3PCl2、(PhO)3PCl2、N，N’-双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BopCl)、1，3-二甲基-2-(3-硝基-1，2，4-三唑-1-基)-2-吡咯烷-1-基-1，3，2-二氮杂磷杂环戊烷鎓六氟磷酸盐(MNTP)或3-硝基-1，2，4-三唑-1-基-三(吡咯烷-1-基)磷鎓六氟磷酸盐(PyNTP)。
非手性H-膦酸酯部分的实例是以上方案中所示的化合物。DBU表示1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯。H+DBU可为例如铵离子、烷基铵离子、杂芳族亚铵离子或杂环亚铵离子，其中任一个是伯、仲、叔或季或单价金属离子。
与手性试剂反应
在第一活化步骤之后，活化的非手性H-膦酸酯部分与由式(Z-I)或(Z-I’)表示的手性试剂反应以形成式(Z-Va)、(Z-Vb)、(Z-Va’)或(Z-Vb')手性中间体。
立体特异性缩合步骤
式Z-Va((Z-Vb)、(Z-Va’)或(Z-Vb'))手性中间体用第二活化试剂和核苷处理以形成缩合的中间体。核苷可在固体载体上。第二活化试剂的实例是4，5-二氰基咪唑(DCI)、4，5-二氯咪唑、1-苯基咪唑鎓三氟甲磺酸盐(PhIMT)、苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(BIT)、苯并三唑、3-硝基-1，2，4-三唑(NT)、四唑、5-乙基硫基四唑(ETT)、5-苯甲基硫代四唑(BTT)、5-(4-硝基苯基)四唑、N-氰基甲基吡咯烷鎓三氟甲磺酸盐(CMPT)、N-氰基甲基哌啶鎓三氟甲磺酸盐、三氟甲磺酸N-氰基甲基二甲基铵。式Z-Va((Z-Vb)、(Z-Va’)或(Z-Vb'))手性中间体可以单体形式分离。通常，手性中间体Z-Va((Z-Vb)、(Z-Va’)或(Z-Vb'))不被分离，并且在同一锅中经受与核苷或修饰的核苷的反应以提供作为缩合的中间体的手性亚磷酸酯化合物。在其它实施方案中，当方法是通过固相合成进行时，包含化合物的固体载体被过滤去除副产物、杂质和/或试剂。
加帽步骤
如果最终核酸大于二聚体，那么未反应的-OH部分用封闭基团加帽，并且化合物中的手性助剂也可用封闭基团加帽以形成加帽的缩合的中间体。如果最终核酸是二聚体，那么加帽步骤不必要。
修饰步骤
化合物是通过与亲电子试剂反应来修饰。加帽的缩合的中间体可执行修饰步骤。在一些实施方案中，修饰步骤是使用硫亲电子试剂、硒亲电子试剂或硼酸化试剂来进行。修饰步骤的实例是氧化和硫化步骤。
在方法的一些实施方案中，硫亲电子试剂是具有下式中的一个的化合物：
S8(式Z-B)、Zz1-S-S-Zz2或Zz1-S-Vz-Zz2；
其中Zz1和Zz2独立地是烷基、氨基烷基、环烷基、杂环、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、酰基、酰胺、酰亚胺或硫羰基，或Zz1和Zz2一起形成可被取代或未被取代的3至8元脂环族环或杂环；Vz是SO2、O或NRf；并且Rf是氢、烷基、烯基、炔基或芳基。
在方法的一些实施方案中，硫亲电子试剂是下式Z-A、Z-B、Z-C、Z-D、Z-E或Z-F化合物：
在一些实施方案中，硒亲电子试剂是具有下式中的一个的化合物：
Se(式Z-G)、Zz3-Se-Se-Zz4或Zz3-Se-Vz-Zz4；
其中Zz3和Zz4独立地是烷基、氨基烷基、环烷基、杂环、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、酰基、酰胺、酰亚胺或硫羰基，或Zz3和Zz4一起形成可被取代或未被取代的3至8元脂环族环或杂环；Vz是SO2、S、O或NRf；并且Rf是氢、烷基、烯基、炔基或芳基。
在一些实施方案中，硒亲电子试剂是式Z-G、Z-H、Z-I、Z-J、Z-K或Z-L化合物。
在一些实施方案中，硼酸化试剂是硼烷-N，N-二异丙基乙胺(BH3DIPEA)、硼烷-吡啶(BH3Py)、硼烷-2-氯吡啶(BH3CPy)、硼烷-苯胺(BH3An)、硼烷-四氢呋喃(BH3THF)或硼烷-二甲基硫化物(BH3Me2S)。
在方法的一些实施方案中，修饰步骤是氧化步骤。在方法的一些实施方案中，修饰步骤是使用如本申请中在以上所述的类似条件的氧化步骤。在一些实施方案中，氧化步骤是如例如JP 2010-265304 A和WO2010/064146中所公开。
链延长循环和脱保护步骤
将加帽的缩合的中间体去封闭以在增长核酸链的5′末端移除封闭基团来提供化合物。任选地使化合物再进入链延长循环以形成缩合的中间体、加帽的缩合的中间体、修饰的加帽的缩合的中间体和5′脱保护的修饰的加帽中间体。在至少一轮链延长循环之后，通过移除手性助剂配体和其它保护基，例如核苷碱基、修饰的核苷碱基、糖和修饰的糖保护基来进一步将5′脱保护的修饰的加帽中间体去封闭，以提供核酸。在其它实施方案中，包含5′-OH部分的核苷是来自如本文所述的先前链延长循环的中间体。在其它实施方案中，包含5′-OH部分的核苷是由另一已知核酸合成方法获得的中间体。在其中使用固体载体的实施方案中，接着自固体载体裂解磷原子修饰的核酸。在某些实施方案中，出于纯化目的使核酸连接在固体载体上，接着在纯化之后自固体载体裂解。
在其它实施方案中，包含5′-OH部分的核苷是由另一已知核酸合成方法获得的中间体。在其它实施方案中，包含5′-OH部分的核苷是由如本申请中所述的另一已知核酸合成方法获得的中间体。在其它实施方案中，包含5′-OH部分的核苷是由包括一个或多个在方案I中说明的循环的另一已知核酸合成方法获得的中间体。在其它实施方案中，包含5′-OH部分的核苷是由包括一个或多个在方案I-b、I-c或I-d中说明的循环的另一已知核酸合成方法获得的中间体。
在一些实施方案中，本发明提供使用稳定和可商购获得的材料作为起始材料的寡核苷酸合成方法。在一些实施方案中，本发明提供用以使用非手性起始材料产生立体控制的磷原子修饰的寡核苷酸衍生物的寡核苷酸合成方法。
在一些实施方案中，本发明方法在脱保护步骤下不导致降解。此外，方法不需要特殊加帽试剂来产生磷原子修饰的寡核苷酸衍生物。
在一些实施方案中，本发明提供用于使用手性单体来合成立体控制的磷原子修饰的寡核苷酸衍生物的方法。在一些实施方案中，第一步骤是使由式(Z-Va)、(Z-Vb)、(Z-Va’)或(Z-Vb’)表示的核苷3′-亚磷酰胺衍生物与第二活化试剂和核苷反应以形成缩合的中间体。第二步骤是使缩合的中间体转化成包含手性X-膦酸酯部分的核酸。示例性方法说明于以下方案Z-2中。
方案Z-2
方案Z-2的详细条件类似于方案Z-1的条件。式Z-Va(Z-Vb)起始材料，尤其式Z-Va’(或Z-Vb’)起始材料，在化学上是稳定的。如工作实施例中所示，本发明方法在脱保护步骤下不导致降解。此外，方法不需要特殊加帽试剂来产生磷原子修饰的寡核苷酸衍生物。
在一些实施方案中，用于移除助剂的机制是如以下方案Z-3中所说明来显示。
方案Z-3。
在方案Z-3中，Nu代表亲核试剂。在一些实施方案中，方案Z-3中的机制被认为不同于用于移除助剂的先前机制。
在一些实施方案中，本发明提供一种手性试剂或其盐，所述手性试剂具有以下化学式(Z-I)：
其中Gz1和Gz2独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基、式(Z-II)或(Z-III)基团，或Gz1与Gz2两者一起形成式(Z-IV)基团，
其中G21至G23独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基或C1-3烷基，
其中G31至G33独立地是C1-4烷基、C1-4烷氧基、C6-14芳基、C7-14芳烷基、C1-4烷基C6-14芳基、C1-4烷氧基C6-14芳基或C6-14芳基C1-4烷基，
其中G41至G46独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基或C1-3烷基，
Gz3和Gz4独立地是氢原子、C1-3烷基、C6-14芳基，或Gz3与Gz4两者一起形成具有3至16个碳原子的含杂原子环。
在一些实施方案中，本发明提供一种式Z-1手性试剂或其盐，其具有以下化学式(Z-I’)
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。在一些实施方案中，本发明提供一种式(Z-1’)手性试剂或其盐，其中Gz1和Gz2各自是式(Z-II)基团，其中G21至G23独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基或C1-3烷基。在一些实施方案中，本发明提供一种式(Z-1’)手性试剂或其盐，其中Gz1和Gz2各自是式(Z-II)基团，其中G21至G23各自是氢原子。在一些实施方案中，本发明提供一种式(Z-1’)手性试剂或其盐，其中Gz1是氢原子，并且Gz2是式(Z-II)基团，其中G21至G23独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基或C1-3烷基。在一些实施方案中，本发明提供一种式(Z-1’)手性试剂或其盐，其中Gz1是氢原子，并且Gz2是式(Z-II)基团，其中G21和G22各自是氢原子，并且G23是硝基。在一些实施方案中，本发明提供一种式(Z-1’)手性试剂或其盐，其中Gz1是氢原子，并且Gz2是式(Z-III)基团，其中G31至G33独立地是C1-4烷基、C6-14芳基、C7-14芳烷基、C1-4烷基C6-14芳基、C1-4烷氧基C6-14芳基或C6-14芳基C1-4烷基。在一些实施方案中，本发明提供一种式(Z-1’)手性试剂或其盐，其中Gz1是氢原子，并且Gz2是式(Z-III)基团，其中G31至G33独立地是C1-4烷基、C6芳基、C7-10芳烷基、C1-4烷基C6芳基、C1-4烷氧基C6芳基或C6芳基C1-4烷基。在一些实施方案中，本发明提供一种式(Z-1’)手性试剂或其盐，其中Gz1是氢原子，并且Gz2是式(Z-III)基团，其中G31至G33独立地是C1-4烷基或C6芳基。在一些实施方案中，本发明提供一种式(Z-1’)手性试剂或其盐，其中Gz1是氢原子，并且Gz2是式(Z-III)基团，其中G31和G33是C6芳基，并且G32是C1-2烷基。在一些实施方案中，本发明提供一种式(Z-1’)手性试剂或其盐，其中Gz1是氢原子，并且Gz2是式(Z-III)基团，其中G31至G33独立地是C1-4烷基。在一些实施方案中，本发明提供一种式(Z-1’)手性试剂或其盐，其中Gz1是氢原子，并且Gz2是式(Z-III)基团，其中G31和G33是C6芳基，并且G32是C1-4烷基。在一些实施方案中，本发明提供一种式(Z-1’)手性试剂或其盐，其中Gz1是氢原子，并且Gz2是式(Z-IV)基团，其中G41至G46独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基或C1-3烷基。在一些实施方案中，本发明提供一种式(Z-1’)手性试剂或其盐，其中Gz1和Gz2一起形成式(Z-IV)基团，其中G41至G46独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基或C1-3烷基。在一些实施方案中，本发明提供一种式(Z-1’)手性试剂或其盐，其中Gz1和Gz2一起形成式(Z-IV)基团，G41至G46各自是氢原子。
在一些实施方案中，手性试剂或其盐选自式3a、3b、5a、Z-5b、7a、7b、9a、9b、11a和11b。
在一些实施方案中，本发明提供一种由式Z-Va或Z-Vb表示的核苷3’-亚磷酰胺衍生物：
其中Gz1和Gz2独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基、式(Z-II)或(Z-III)基团，或Gz1与Gz2两者一起形成式(Z-IV)基团，
其中G21至G23独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基或C1-3烷基，
其中G31至G33独立地是C1-4烷基、C1-4烷氧基、C6-14芳基、C7-14芳烷基、C1-4烷基C6-14芳基、C1-4烷氧基C6-14芳基或C6-14芳基C1-4烷基，
其中G41至G46独立地是氢原子、硝基、卤素原子、氰基或C1-3烷基；
Gz3和Gz4独立地是氢原子、C1-3烷基、C6-14芳基，或Gz3与Gz4两者一起形成具有3至16个碳原子的含杂原子环；
Gz5是羟基保护基；
Rz2独立地是氢、-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-ORb或-SRb，其中Rb是封闭部分；
Y1是O、NRd、S或Se；
Rd独立地是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、被取代的硅烷基、氨基甲酸酯基、-P(O)(Re)2或-HP(O)(Re)；
Re独立地是氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y2-、烯基-Y2-、炔基-Y2-、芳基-Y2-或杂芳基-Y2-或是Na+、Li+或K+的阳离子或-O-；
Y2是O、NRd或S；
Rz3是由-CH2-、-(CH2)2-、-CH2NH-或-CH2N(CH3)-表示的基团；并且
Bs是选自由下式(Z-VI)至(Z-XI)表示的基团或其衍生物的基团。
在一些实施方案中，本发明提供一种式Z-Va或Z-Vb核苷3’-亚磷酰胺衍生物，其具有结构(Z-Va')或(Z-Vb')：
其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
在一些实施方案中，本发明提供一种选自式12a、12b、13a、13b、14a、14b、15a、15b、16a、16b、17a、17b、18a、18b、19a、19b、20a、20b、21a、21b、22a、22b、23a、23b、24a、24b、25a、25b、26a、26b、27a、27b、28a、28b、29a、29b、30a、30b、31a、31b、32a、32b、33a、33b、34a、34b和35a的核苷3’-亚磷酰胺衍生物。在一些实施方案中，本发明提供一种选自式12a、12b、13a、13b、14a、14b、15a、15b、16a、16b、17a、17b、18a、18b、19a、19b、20a、20b、21a、21b、22a、22b、23a、23b、24a、24b、25a、25b、26a或26b的核苷3’-亚磷酰胺衍生物。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于合成立体控制的磷原子修饰的寡核苷酸衍生物的方法，其包括以下步骤：
使包含非手性H-膦酸酯部分的分子、手性试剂或其盐反应以形成核苷3′-亚磷酰胺衍生物单体；
使所述单体和核苷反应以形成缩合的中间体；以及
使所述缩合的中间体转化成包含手性X-膦酸酯部分的核酸；
其中所述手性试剂具有以下化学式(Z-I)。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于合成立体控制的磷原子修饰的寡核苷酸衍生物的方法，其包括以下步骤：
使包含非手性H-膦酸酯部分的分子、手性试剂或其盐反应以形成核苷3′-亚磷酰胺衍生物单体；
使所述单体和核苷反应以形成缩合的中间体；以及
使所述缩合的中间体转化成包含手性X-膦酸酯部分的核酸；
其中所述手性试剂具有以下化学式(Z-I’)。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于合成立体控制的磷原子修饰的寡核苷酸衍生物的方法，其包括以下步骤：
使包含非手性H-膦酸酯部分的分子、手性试剂或其盐反应以形成核苷3′-亚磷酰胺衍生物单体；
使所述单体和核苷反应以形成缩合的中间体；以及
使所述缩合的中间体转化成包含手性X-膦酸酯部分的核酸；
其中所述手性试剂选自式3a、3b、5a、Z-5b、7a、7b、9a、9b、11a和11b。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于合成立体控制的磷原子修饰的寡核苷酸衍生物的方法，其包括以下步骤：使由式(Z-Va)或(Z-Vb)表示的核苷3′-亚磷酰胺衍生物与活化试剂和核苷反应以形成缩合的中间体；以及使所述缩合的中间体转化成包含手性X-膦酸酯部分的核酸。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于合成立体控制的磷原子修饰的寡核苷酸衍生物的方法，其包括以下步骤：
使由式(Z-Va)或(Z-Vb)表示的核苷3′-亚磷酰胺衍生物与活化试剂和核苷反应以形成缩合的中间体；以及使所述缩合的中间体转化成包含手性X-膦酸酯部分的核酸；并且其中由式(Z-Va)或(Z-Vb)表示的所述核苷3′-亚磷酰胺衍生物选自式12a、12b、13a、13b、14a、14b、15a、15b、16a、16b、17a、17b、18a、18b、19a、19b、20a、20b、21a、21b、22a、22b、23a、23b、24a、24b、25a、25b、26a、26b、27a、27b、28a、28b、29a、29b、30a、30b、31a、31b、32a、32b、33a、33b、34a、34b和35a。在一些实施方案中，本发明提供一种用于合成立体控制的磷原子修饰的寡核苷酸衍生物的方法，其包括以下步骤：
使由式(Z-Va)或(Z-Vb)表示的核苷3′-亚磷酰胺衍生物与活化试剂和核苷反应以形成缩合的中间体；以及使所述缩合的中间体转化成包含手性X-膦酸酯部分的核酸；并且
其中由式(Z-Va)或(Z-Vb)表示的所述核苷3′-亚磷酰胺衍生物选自式12a、12b、13a、13b、14a、14b、15a、15b、16a、16b、17a、17b、18a、18b、19a、19b、20a、20b、21a、21b、22a、22b、23a、23b、24a、24b、25a、25b、26a和26b。
制备和使用某些式Z-I手性助剂
缩写
ac：乙酰基
bz：苯甲酰基
CSO：(1S)-(+)-(10-樟脑磺酰基)氧氮杂环丙烷
DBU：1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯
DCA：二氯乙酸
DCM：二氯甲烷，CH2Cl2
Tr：三苯甲基，三苯基甲基
MeIm：N-甲基咪唑
NIS：N-碘代丁二酰亚胺
pac：苯氧基乙酰基
Ph：苯基
PhIMT：N-苯基咪唑鎓三氟甲磺酸盐
POS：3-苯基-1，2，4-二噻唑啉-5-酮
TBS：叔丁基二甲基硅烷基
TBDPS：叔丁基二苯基硅烷基
TOM：三异丙基硅烷氧基甲基
TFA：三氟乙酸
用于合成手性控制的寡核苷酸的一般性程序-1。
根据表Z-1中所示的循环进行手性控制的寡核苷酸的自动固相合成。
表Z-1.合成程序。
用于合成手性控制的寡核苷酸的一般性程序-2。
根据表Z-2中所示的循环进行手性控制的寡核苷酸的自动固相合成。
表Z-2.
*制备表Z-2的步骤2中的预活化的单体：
核苷-3′-H-膦酸单酯是通过与无水甲苯重复共蒸发来干燥，并且接着溶解于无水MeCN中。添加Ph3PCl2至溶液中，并且搅拌混合物5分钟。通过注射器向混合物中逐滴添加与无水甲苯重复共蒸发并溶解于无水MeCN中的手性试剂的溶液，并且在氩气下搅拌混合物5分钟。
在合成之后，在55℃下用25％NH3水溶液(1mL)处理树脂12小时。冷却混合物至室温，并且通过膜过滤来移除树脂。减压浓缩滤液至干燥。将残余物溶解于H2O(3mL)中，并且通过在50℃下在0.3mL/min的速率下用含乙腈(0-50％/30分钟)的0.1M乙酸三乙基铵缓冲液(pH 7.0)的线性梯度进行RP-UPLC-MS来分析。
实施例Z-1。
(S)-1-三苯甲基吡咯烷-2-甲醛(1a)。
根据文献(Guga，P.Curr.Top.Med.Chem.2007，7，695-713.)中所述的程序自L-脯氨酸合成化合物1a。
(R)-1-三苯甲基吡咯烷-2-甲醛(1b)。
以类似于化合物1a的方式自D-脯氨酸合成化合物1b。
(S)-2-(甲基二苯基硅烷基)-1-((S)-1-三苯甲基吡咯烷-2-基)乙醇(2a)。
在冰冷却下向自氯甲基二苯基甲基硅烷(4.02g，16.3mmol)和镁(402mg，16.3mmol)在THF(14mL)中制备的氯化甲基二苯基硅烷基甲基镁于THF中的溶液中添加1a(2.79g，8.14mmol)的THF(30mL)溶液。在冰冷却下搅拌1.5小时之后，使混合物升温至室温，并且继续搅拌30分钟。在0℃下添加饱和NH4Cl水溶液(100mL)至反应混合物中，并且用乙醚(100mL)进行三次萃取。合并的萃取物经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。在硅胶上对残余物进行色谱分离提供呈无色泡沫状的2a(3.91g，87％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.48-7.08(25H，m)，4.33-4.23(1H，m)，3.16-2.89(3H，m)，2.84(1H，brs)，1.70-1.54(1H，m)，1.35(1H，dd，J＝14.7，6.3Hz)，1.10(1H，dd，J＝14.7，8.1Hz)，1.18-1.05(1H，m)，1.04-0.90(1H，m)，0.34(3H，s)，-0.17--0.36(1H，m)。
(S)-2-(甲基二苯基硅烷基)-1-((S)-1-吡咯烷-2-基)乙醇(3a)。
将2a(3.91g，7.06mmol)溶解于含3％DCA的DCM(70mL)中，并且在室温下搅拌10分钟。向混合物中添加1M NaOH(200mL)，并且用DCM(100mL)进行三次萃取。合并的萃取物经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。在硅胶上对残余物进行色谱分离提供呈淡黄色油状的3a(1.99g，90％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.57-7.52(5H，m)，7.38-7.33(5H，m)，3.77(1H，ddd，J＝8.9，5.4，3.5Hz)，3.01(1H，dt，J＝7.4，3.6Hz)，2.97-2.79(2H，m)，2.27(2H，brs)，1.76-1.53(4H，m)，1.38(1H，dd，J＝15.0，9.0Hz)，1.24(1H，dd，J＝15.0，5.4Hz)，0.65(3H，s)；13C NMR(100.4MHz，CDCl3)δ137.4，137.1，134.6，134.5，129.1，127.8，69.5，64.1，47.0，25.8，24.0，19.6，-3.4。C19H26NOSi的MALDI TOF-MSm/z计算值：[M+H]+312.18；实测值：312.06。
实施例Z-2。
(R)-2-(甲基二苯基硅烷基)-1-((R)-1-三苯甲基吡咯烷-2-基)乙醇(2b)。
通过使用1b替代1a，以类似于化合物2a的方式获得化合物2b。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.48-7.12(25H，m)，4.33-4.24(1H，m)，3.16-2.89(3H，m)，2.86(1H，brs)，1.69-1.52(1H，m)，1.35(1H，dd，J＝14.4，6.0Hz)，1.10(1H，dd，J＝14.4，8.4Hz)，1.18-1.05(1H，m)，1.03-0.89(1H，m)，0.33(3H，s)，-0.19--0.39(1H，m)；13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ144.5，137.5，136.8，134.6，134.3，129.8，129.0，127.8，127.7，127.4，126.1，77.9，71.7，65.1，53.5，25.0，24.8，19.6，-4.0。C38H40NOSi的MALDI TOF-MS m/z计算值：[M+H]+554.29；实测值：554.09。
(R)-2-(甲基二苯基硅烷基)-1-((R)-1-吡咯烷-2-基)乙醇(3b)。
通过使用2b替代2a，以类似于化合物3a的方式获得化合物3b。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.58-7.52(5H，m)，7.38-7.33(5H，m)，3.78(1H，ddd，J＝9.0，5.1，3.6Hz)，3.00(1H，dt，J＝7.4，3.3Hz)，2.97-2.78(2H，m)，2.19(2H，brs)，1.76-1.53(4H，m)，1.38(1H，dd，J＝14.6，9.0Hz)，1.24(1H，dd，J＝14.6，5.1Hz)，0.66(3H，s)；13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ137.5，137.1，134.5，134.4，129.0，127.7，69.2，64.2，46.9，25.8，24.0，19.7，-3.4。C19H26NOSi的MALDI TOF-MSm/z计算值：[M+H]+312.18；实测值：312.09。
实施例Z-3。
(S)-2-(三甲基硅烷基)-1-((S)-1-三苯甲基吡咯烷-2-基)乙醇(4a)。
通过使用“氯甲基三甲基硅烷”替代“氯甲基二苯基甲基硅烷”，以类似于化合物2a的方式获得化合物4a。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.58-7.51(5H，m)，7.31-7.14(10H，m)，4.13(1H，dt，J＝7.5，3.0Hz)，3.39-3.31(1H，m)，3.20-2.99(2H，m)，2.84(1H，s)，1.74-1.57(1H，m)，1.29-1.10(2H，m)，0.74(1H，dd，J＝14.4，7.2Hz)，0.46(1H，dd，J＝14.4，7.2Hz)，-0.15(9H，s)。C28H36NOSi的MALDI TOF-MSm/z计算值：[M+H]+430.26；实测值：430.09。
(S)-2-(三甲基硅烷基)-1-((S)-1-吡咯烷-2-基)乙醇(5a)。
通过使用4a替代2a，以类似于化合物3a的方式获得化合物5a。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ3.76(1H，ddd，J＝8.8，5.7，3.3Hz)，3.08(1H，dt，J＝7.8，3.3Hz)，3.02-2.87(2H，m)，2.48(2H，brs)，1.81-1.58(4H，m)，0.83(1H，dd，J＝14.7，8.7Hz)，0.68(1H，dd，J＝14.7，6.0Hz)，0.05(9H，s)；13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ69.6，64.3，46.9，25.8，23.9，22.0，-0.8。C9H22NOSi的MALDI TOF-MSm/z计算值：[M+H]+188.15；实测值：188.00。
实施例Z-5。
(R)-2，2-二苯基-1-((S)-1-三苯甲基吡咯烷-2-基)乙醇(6a)。
在室温下向二苯基甲烷(6.7mL，40mmol)于无水THF(36mL)中的溶液中逐滴添加n-BuLi(1.67M的己烷溶液，24mL，40mmol)，并且搅拌1小时。在0℃下向混合物中缓慢添加含通过与甲苯重复共蒸发来干燥的1a(3.41g，10mmol)的无水THF(40mL)，并且继续搅拌45分钟。接着添加饱和NH4Cl水溶液(100mL)和Et2O(100mL)，并且分离有机层并用Et2O(2×100mL)萃取水层。合并有机层，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过硅胶色谱法纯化残余物以提供呈白色泡沫状的6a(1.41g，28％)。
(R)-2，2-二苯基-1-((S)-吡咯烷-2-基)乙醇(7a)。
将6a(650mg，1.27mmol)溶解于含3％DCA的DCM(13mL)中，并且在室温下搅拌10分钟。向混合物中添加1M NaOH(40mL)，并且用DCM(30mL)进行三次萃取。合并的萃取物经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。在硅胶上对残余物进行色谱分离提供呈淡黄色油状的7a(316mg，93％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.44-7.38(2H，m)，7.33-7.14(8H，m)，4.46(1H，dd，J＝9.9，3.3Hz)，3.91(1H，d，J＝9.9Hz)，3.02-2.88(2H，m)，2.81-2.69(1H，m)，2.52(2H，brs)，1.88-1.56(4H，m)；13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ142.3，142.0，128.6，128.5，128.4，128.2，126.5，126.4，73.5，60.1，55.8，46.6，25.8，23.4。C18H22NO的MALDITOF-MSm/z计算值：[M+H]+268.17；实测值：268.06。
实施例Z-6。
(S)-2，2-二苯基-1-((R)-1-三苯甲基吡咯烷-2-基)乙醇(6b)。
通过使用1b替代1a，以类似于化合物6a的方式获得化合物6b。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.44-7.37(6H，m)，7.30-7.01(17H，m)，6.66-6.61(2H，m)，4.80(1H，d，J＝10.8Hz)，3.63(1H，d，J＝10.8Hz)，3.36-3.28(1H，m)，3.22-3.09(1H，m)，3.01-2.89(1H，m)，2.66(1H，s)，1.90-1.75(1H，m)，1.29-1.04(2H，m)，0.00--0.19(1H，m)；13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ144.2，142.9，141.6，130.0，128.5，128.4，127.9，127.8，127.4，126.4，126.2，77.9，75.9，61.9，55.4，53.4，24.7，24.5。C37H36NO的MALDI TOF-MSm/z计算值：[M+H]+510.28；实测值：510.11。
(S)-2，2-二苯基-1-((R)-吡咯烷-2-基)乙醇(7b)。
通过使用6b替代6a，以类似于化合物7a的方式获得化合物7b。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.45-7.14(10H，m)，4.45(1H，dd，J＝9.9，3.3Hz)，3.91(1H，d，J＝9.9Hz)，3.00-2.89(2H，m)，2.82-2.71(1H，m)，2.40(2H，brs)，1.87-1.55(4H，m)；13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ142.3，142.0，128.5，128.3，128.1，126.3，126.2，73.4，60.1，55.9，46.5，25.8，23.5。C18H22NO的MALDI TOF-MS m/z计算值：[M+H]+268.17；实测值：268.03。
实施例Z-7。
(R)-2-(4-硝基苯基)-1-((S)-1-三苯甲基吡咯烷-2-基)乙醇(8a)。
通过使用“4-硝基苯甲基氯化物”替代“二苯基甲烷”，以类似于化合物6a的方式获得化合物8a。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.09-8.03(2H，m)，7.49-7.43(6H，m)，7.28-7.09(11H，m)，4.23(1H，ddd，J＝8.3，5.6，3.0Hz)，3.43-3.33(1H，m)，3.23-3.11(1H，m)，3.07-2.96(1H，m)，2.83(1H，brs)，2.74(1H，dd，J＝13.8，8.4Hz)，2.49(1H，dd，J＝13.8，5.1Hz)，1.83-1.67(1H，m)，1.41-1.17(2H，m)，0.27-0.08(1H，m)；13CNMR(75.5MHz，CDCl3)δ147.3，146.3，144.3，129.8，129.6，127.5，126.3，123.4，77.9，74.8，63.5，53.2，39.5，25.0，24.9。C31H31N2O3的MALDI TOF-MSm/z计算值：[M+H]-479.23；实测值：479.08。
(R)-2-(4-硝基苯基)-1-((S)-吡咯烷-2-基)乙醇(9a)。
通过使用8a替代6a，以类似于化合物7a的方式获得化合物9a。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.15(2H，d，J＝8.7Hz)，7.42(2H，d，J＝8.7Hz)，3.86-3.79(1H，m)，3.16-3.07(1H，m)，2.99-2.68(6H，m)，1.84-1.68(4H，m)；13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ147.4，146.2，129.9，123.2，72.4，62.0，46.6，40.4，25.7，24.4。C12H17N2O3的MALDI TOF-MSm/z计算值：[M+H]+237.12；实测值：237.01。
实施例Z-8。
(S)-2-(4-硝基苯基)-1-((R)-1-三苯甲基吡咯烷-2-基)乙醇(8b)。
通过使用1b替代1a，以类似于化合物8a的方式获得化合物8b。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.09-8.04(2H，m)，7.49-7.43(6H，m)，7.28-7.09(11H，m)，4.22(1H，ddd，J＝8.4，5.6，3.0Hz)，3.43-3.33(1H，m)，3.24-3.10(1H，m)，3.08-2.94(1H，m)，2.81(1H，brs)，2.75(1H，dd，J＝14.0，8.1Hz)，2.49(1H，dd，J＝14.0，5.1Hz)，1.81-1.67(1H，m)，1.40-1.16(2H，m)，0.26-0.09(1H，m)；13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ147.3，144.3，129.8，129.6，129.4，126.3，123.5，77.9，74.8，63.5，53.2，39.5，25.0，24.9。C31H31N2O3的MALDI TOF-MS m/z计算值：[M+H]+479.23；实测值：479.08。
(S)-2-(4-硝基苯基)-1-((R)-吡咯烷-2-基)乙醇(9b)。
通过使用8b替代8a，以类似于化合物9a的方式获得化合物9b。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.19-8.13(2H，m)，7.45-7.39(2H，m)，3.83(1H，ddd，J＝7.7，5.4，3.9Hz)，3.14(1H，dt，J＝7.7，3.9Hz)，3.01-2.87(2H，m)，2.83(1H，d，J＝3.3Hz)，2.81(1H，s)，2.62(2H，brs)，1.79-1.72(4H，m)；13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ147.3，146.5，130.0，123.5，72.7，61.7，46.7，40.1，25.8，24.2。C12H17N2O3的MALDI TOF-MSm/z计算值：[M+H]+237.12；实测值：237.02。
实施例Z-9。
(R)-(9H-芴-9-基)((S)-1-三苯甲基吡咯烷-2-基)甲醇(10a)。
通过使用“芴”替代“二苯基甲烷”，以类似于化合物6a的方式获得化合物10a。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.70(1H，d，J＝7.5Hz)，7.66(1H，d，J＝7.8Hz)，7.55(2H，d，J＝7.5Hz)，7.44-7.09(18H，m)，6.87-6.62(1H，m)，4.55-4.48(1H，m)，4.06(1H，d，J＝7.5Hz)，3.43-3.34(1H，m)，3.18-3.06(1H，m)，2.98-2.88(1H，m)，2.85(1H，brs)，1.42-1.24(1H，m)，1.18-1.04(1H，m)，0.53-0.39(1H，m)，-0.02--0.20(1H，m)；C37H34NO的MALDI TOF-MSm/z计算值：[M+H]+508.26；实测值：508.12。
(R)-(9H-芴-9-基)((S)-吡咯烷-2-基)甲醇(11a)。
通过使用10a替代6a，以类似于化合物7a的方式获得化合物11a。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.76(2H，d，J＝7.5Hz)，7.68(2H，t，J＝8.0Hz)，7.43-7.35(2H，m)，7.34-7.25(2H，m)，4.28(1H，d，J＝6.3Hz)，4.03(1H，dd，J＝6.5，4.2Hz)，3.19-3.11(1H，m)，2.97-2.88(1H，m)，2.86-2.76(1H，m)，2.02(2H，brs)，1.77-1.53(3H，m)，1.38-1.23(1H，m)；C18H20NO的MALDI TOF-MS m/z计算值：[M+H]+266.15；实测值：266.04。
(S)-2-甲苯磺酰基-1-((S)-1-三苯甲基吡咯烷-2-基)乙醇(12a′)。
通过使用“氯甲基对甲苯基砜”替代“氯甲基二苯基甲基硅烷”，以类似于化合物2a的方式获得化合物12a′。
1H NMR(600MHz，CDCl3)δ7.66(2H，d，J＝8.4Hz)，7.48-7.44(6H，m)，7.35(2H，d，J＝7.2Hz)，7.21-7.13(9H，m)，4.39-4.36(1H，m)，3.33(1H，s)，3.24-3.20(1H，m)，3.19-3.10(2H，m)，2.98-2.92(2H，m)，2.49(3H，s)，1.55-1.49(1H，m)，1.33-1.26(1H，m)，1.12-1.04(1H，m)，0.22-0.14(1H，m)；13C NMR(150.9MHz，CDCl3)δ144.6，144.5，136.3，129.9，129.5，128.1，127.5，126.2，78.0，69.1，63.9，60.2，52.6，25.5，24.7，21.7。
(S)-2-甲苯磺酰基-1-((S)-1-三苯甲基吡咯烷-2-基)乙醇(13a′)。
通过使用12a′替代2a，以类似于化合物3a的方式获得化合物13a′。
1H NMR(600MHz，CDCl3)δ7.82(2H，d，J＝8.4Hz)，7.37(2H，d，J＝8.4Hz)，4.01(1H，ddd，J＝12.0，5.1，3.0Hz)，3.32(1H，dd，J＝14.4，3.0Hz)，3.25(1H，dd，J＝14.4，9.0Hz)，3.16(1H，dt，J＝7.8，5.1Hz)，2.90-2.82(2H，m)，2.46(3H，s)，2.04(2H，brs)，1.78-1.63(3H，m)，1.62-1.55(1H，m)；13C NMR(150.9MHz，CDCl3)δ144.5，136.7，129.7，127.7，67.4，61.8，60.1，46.7，25.7，21.4。C13H20NO3S的MALDITOF-MS m/z计算值：[M+H]+270.12；实测值：270.04。
(R)-2-甲苯磺酰基-1-((R)-1-三苯甲基吡咯烷-2-基)乙醇(12b’)。
通过使用1b替代1a，以类似于化合物12a′的方式获得化合物12b’。
1H NMR(600MHz，CDCl3)δ7.66(2H，d，J＝8.4Hz)，7.47-7.44(6H，m)，7.35(2H，d，J＝7.8Hz)，7.21-7.13(9H，m)，4.37(1H，dt，J＝8.6，2.4Hz)，3.33(1H，s)，3.23-3.20(1H，m)，3.19-3.12(2H，m)，2.98-2.92(2H，m)，2.49(3H，s)，1.56-1.49(1H，m)，1.32-1.26(1H，m)，1.11-1.03(1H，m)，0.23-0.15(1H，m)；13C NMR(150.9MHz，CDCl3)δ144.6，144.5，136.3，129.9，129.6，128.1，127.6，126.2，78.0，69.1，63.9，60.2，52.6，25.5，24.7，21.7。
(R)-2-甲苯磺酰基-1-((R)-1-三苯甲基吡咯烷-2-基)乙醇(13b’)。
通过使用12b’替代12a′，以类似于化合物13a′的方式获得化合物13b’。
1H NMR(600MHz，CDCl3)δ7.82(2H，d，J＝8.4Hz)，7.37(2H，d，J＝8.4Hz)，4.01(1H，ddd，J＝9.0，5.1，3.0Hz)，3.32(1H，dd，J＝14.4，3.0Hz)，3.25(1H，dd，J＝14.4，9.0Hz)，3.17(1H，dt，J＝7.2，5.1Hz)，2.89-2.83(2H，m)，2.46(3H，s)，2.04(2H，brs)，1.79-1.64(3H，m)，1.62-1.55(1H，m)；13C NMR(150.9MHz，CDCl3)δ144.8，136.6，129.8，127.9，67.7，61.8，60.1，46.8，25.9，25.8，21.6。C13H20NO3S的MALDITOF-MS m/z计算值：[M+H]-270.12；实测值：270.05。
实施例Z-10。
噁唑磷烷单体12a。
通过与无水甲苯重复共蒸发来干燥3a(560mg，1.80mmol)，并且在氩气下溶解于无水乙醚(0.90mL)中。添加N-甲基吗啉(400μL，3.60mmol)至溶液中，并且在0℃下在氩气下在搅拌下逐滴添加所得溶液至PCl3(160μL，1.80mmo1)于无水乙醚(0.90mL)中的溶液中。接着使混合物升温至室温，并且搅拌30分钟。通过在氮气下过滤移除所得N-甲基吗啉盐酸盐，并且减压浓缩滤液至干燥以提供粗2-氯-1，3，2-噁唑磷烷衍生物。将粗材料溶解于新鲜蒸馏的THF(3.6mL)中以制备0.5M溶液，其不经进一步纯化即用于合成核苷3′-O-噁唑磷烷。
通过与无水甲苯重复共蒸发来干燥5′-O-(DMTr)-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷(636mg，0.84mmo1)，并且在氩气下溶解于新鲜蒸馏的THF(2.5mL)中。添加Et3N(0.58mL，4.2mmo1)，并且冷却混合物至-78℃。通过注射器逐滴添加相应粗2-氯-1，3，2-噁唑磷烷衍生物于新鲜蒸馏的THF中的0.5M溶液(3.6mL，1.80mmol)，并且在室温下搅拌混合物15分钟。接着添加饱和NaHCO3水溶液(70mL)和CHCl3(70mL)，并且分离有机层并用饱和NaHCO3水溶液(2×70mL)洗涤。合并的水层用CHCl3(70mL)反萃取。合并有机层，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过硅胶色谱法纯化残余物以提供呈白色泡沫状的12a(829mg，90％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.77(1H，brs)，7.99(1H，s)，7.54-6.98(24H，m)，6.81-6.73(4H，m)，6.35(1H，dd，J＝8.0，6.3Hz)，4.89-4.73(4H，m)，4.68(2H，brs)，4.05-3.98(1H，m)，3.75(6H，s)，3.62-3.46(1H，m)，3.41-3.20(3H，m)，3.18-3.04(1H，m)，3.08(2H，t，J＝6.6Hz)，2.58-2.36(2H，m)，1.94-1.59(2H，m)，1.56(1H，dd，J＝15.0，8.7Hz)，1.43(1H，dd，J＝15.0，5.7Hz)，1.33-1.16(2H，m)，0.62(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ153.5(1P，s)。
实施例Z-11。
噁唑磷烷单体12b。
通过使用3b替代3a，以类似于化合物12a的方式获得化合物12b。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.80(1H，brs)，7.96(1H，s)，7.54-6.96(24H，m)，6.79-6.71(4H，m)，6.19(1H，t，J＝6.6Hz)，4.90-4.73(4H，m)，4.66(2H，brs)，4.16-4.08(1H，m)，3.76(6H，s)，3.60-3.36(2H，m)，3.29(1H，d，J＝3.9Hz)，3.27-3.12(2H，m)，3.09(2H，t，J＝6.6Hz)，2.59-2.46(1H，m)，2.07-1.97(1H，m)，1.94-1.41(5H，m)，1.36-1.18(1H，m)，0.65(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ157.1(1P，s)。
实施例Z-12。
噁唑磷烷单体13a。
通过使用“5′-O-(DMTr)胸苷”替代“5′-O-(DMTr)-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”，以类似于化合物12a的方式获得化合物13a。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.58-7.23(21H，m)，6.86-6.79(4H，m)，6.35(1H，dd，J＝8.1，5.7Hz)，4.79-4.67(2H，m)，3.83-3.78(1H，m)，3.78(6H，s)，3.59-3.43(1H，m)，3.34(1H，dd，J＝10.5，2.4Hz)，3.35-3.24(1H，m)，3.20(1H，dd，J＝10.5，2.4Hz)，3.16-3.02(1H，m)，2.36-2.26(1H，m)，2.15-2.02(1H，m)，1.92-1.77(1H，m)，1.74-1.59(1H，m)，1.52(1H，dd，J＝14.7，9.0Hz)，1.40(3H，s)，1.45-1.15(3H，m)，0.60(3H，s)；31PNMR(121.5MHz，CDCl3)δ153.7(1P，s)。
实施例Z-13。
噁唑磷烷单体13b。
通过使用3b替代3a，以类似于化合物13a的方式获得化合物13b。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.46(1H，brs)，7.59-7.20(20H，m)，6.86-6.79(4H，m)，6.26(1H，t，J＝6.8Hz)，4.78-4.65(2H，m)，4.01-3.95(1H，m)，3.78(6H，s)，3.55-3.40(1H，m)，3.42(1H，dd，J＝10.5，2.7Hz)，3.40-3.28(1H，m)，3.22(1H，dd，J＝10.5，3.0Hz)，3.19-3.06(1H，m)，2.16-1.95(2H，m)，1.90-1.54(3H，m)，1.49-1.35(1H，m)，1.43(3H，s)，1.34-1.17(2H，m)，0.67(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ156.2(1P，s)。使用以上化合物13b，通过以上公开的一般性方法来合成寡聚物。
实施例Z-14。
噁唑磷烷单体14a。
通过使用“5′-O-(DMTr)-4-N-(异丁酰基)胞苷”替代“5′-O-(DMTr)-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”，以类似于化合物12a的方式获得化合物14a。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.33(1H，brs)，8.17(1H，d，J＝7.5Hz)，7.52-7.22(19H，m)，7.07(1H，d，J＝7.5Hz)，6.88-6.81(4H，m)，6.20(1H，t，J＝6.2Hz)，4.81-4.64(2H，m)，3.93-3.87(1H，m)，3.79(6H，s)，3.59-3.43(1H，m)，3.39-3.29(3H，m)，3.16-3.02(1H，m)，2.69-2.52(2H，m)，2.12-2.00(1H，m)，1.91-1.50(3H，m)，1.47-1.32(2H，m)，1.27-1.16(7H，m)，0.60(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)154.8(1P，s)。
实施例Z-16。
噁唑磷烷单体14b。
通过使用3b替代3a，以类似于化合物14a的方式获得化合物14b。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.33(1H，d，J＝7.5Hz)，8.23(1H，brs)，7.57-7.22(19H，m)，7.12(1H，d，J＝7.5Hz)，6.88-6.81(4H，m)，6.15(1H，dd，J＝6.6，4.2Hz)，4.82-4.63(2H，m)，4.03-3.97(1H，m)，3.80(6H，s)，3.55-3.26(4H，m)，3.19-3.05(1H，m)，2.59(1H，五重峰，J＝6.9Hz)，2.39-2.27(1H，m)，2.21-2.10(1H，m)，1.90-1.56(3H，m)，1.50-1.32(2H，m)，1.26-1.17(7H，m)，0.66(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)157.2(1P，s)。
实施例Z-17。
噁唑磷烷单体15a。
通过使用“5′-O-(DMTr)-6-N-(苯甲酰基)腺苷”替代“5′-O-(DMTr)-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”，以类似于化合物12a的方式获得化合物15a。
1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.71(1H，s)，8.12(1H，s)，8.04(2H，d，J＝7.8Hz)，7.62-7.15(23H，m)，6.80-6.75(4H，m)，6.37(1H，dd，J＝7.8，6.0Hz)，4.94-4.88(1H，m)，4.80(1H，ddd，J＝12.0，6.0，5.4Hz)，4.07-4.04(1H，m)，3.76(6H，s)，3.58-3.49(1H，m)，3.41-3.34(1H，m)，3.33(1H，dd，J＝10.8，4.8Hz)，3.25(1H，dd，J＝10.8，4.8Hz)，3.13-3.06(1H，m)，2.66-2.58(1H，m)，2.40-2.35(1H，m)，1.91-1.84(1H，m)，1.73-1.66(1H，m)，1.56(1H，dd，J＝15.0，9.0Hz)，1.44(1H，dd，J＝15.0，5.4Hz)，1.47-1.41(1H，m)，1.30-1.23(1H，m)，0.63(3H，s)；31P NMR(243.0MHz，CDCl3)δ151.8(1P，s)。
实施例Z-18。
噁唑磷烷单体15b。
通过使用3b替代3a，以类似于化合物15a的方式获得化合物15b。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.06(1H，brs)，8.76(1H，s)，8.12(1H，s)，8.07-7.99(2H，m)，7.64-7.14(22H，m)，6.83-6.75(4H，m)，6.25(1H，t，J＝6.6Hz)，4.86-4.75(2H，m)，4.20-4.15(1H，m)，3.77(6H，s)，3.61-3.38(2H，m)，3.36(1H，dd，J＝10.2，4.2Hz)，3.27(1H，dd，J＝10.2，4.2Hz)，3.27-3.13(1H，m)，2.71-2.59(1H，m)，2.12-2.01(1H，m)，1.94-1.42(5H，m)，1.36-1.20(1H，m)，0.67(3H，s))；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ157.3(1P，s)。
实施例Z-19。
噁唑磷烷单体16a。
通过使用7a替代3a，以类似于化合物13a的方式获得化合物16a。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.57(1H，d，J＝0.9Hz)，7.37-6.94(20H，m)，6.87-6.78(4H，m)，6.48(1H，dd，J＝8.6，5.7Hz)，5.42(1H，dd，J＝11.0，5.1Hz)，4.81-4.71(1H，m)，4.02(1H，d，J＝11.0Hz)，3.83(1H，d，J＝2.1Hz)，3.79(6H，s)，3.61-3.41(2H，m)，3.24-3.09(1H，m)，3.16(1H，dd，J＝10.8，2.4Hz)，3.02(1H，dd，J＝10.8，2.4Hz)，2.54-2.44(1H，m)，2.34-2.22(1H，m)，1.94-1.79(1H，m)，1.74-1.56(1H，m)，1.38(3H，s)，1.38-1.28(2H，m)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ160.9(1P，s)。
实施例Z-20。
噁唑磷烷单体16b。
通过使用3b替代3a，以类似于化合物16a的方式获得化合物16b。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.57(1H，d，J＝1.5Hz)，7.43-7.11(20H，m)，6.85-6.78(4H，m)，6.48(1H，dd，J＝7.5，5.7Hz)，5.58(1H，dd，J＝11.4，5.1Hz)，4.82-4.73(1H，m)，4.17-4.02(2H，m)，3.78(6H，s)，3.56-3.40(3H，m)，3.32(1H，dd，J＝10.7，2.4Hz)，3.22-3.07(1H，m)，2.26-2.04(2H，m)，1.95-1.81(1H，m)，1.74-1.56(1H，m)，1.40(3H，d，J＝1.5Hz)，1.44-1.34(2H，m)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ162.2(1P，s)。
实施例Z-21。
噁唑磷烷单体17a。
通过使用9a替代3a，以类似于化合物13a的方式获得化合物17a。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.22(1H，brs)，8.05-7.99(2H，m)，7.52(1H，d，J＝1.2Hz)，7.41-7.19(11H，m)，6.87-6.79(4H，m)，6.37(1H，dd，J＝8.4，5.7Hz)，4.88-4.75(2H，m)，3.86-3.80(1H，m)，3.79(6H，d，J＝1.2Hz)，3.64-3.49(2H，m)，3.27-3.12(3H，m)，2.97(2H，d，J＝6.6Hz)，2.51-2.41(1H，m)，2.33-2.20(1H，m)，2.03-1.75(2H，m)，1.72-1.59(1H，m)，1.46-1.36(1H，m)，1.40(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ157.5(1P，s)。
实施例Z-22。
噁唑磷烷单体17b。
通过使用9b替代9a，以类似于化合物17a的方式获得化合物17b。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.67(1H，brs)，8.18-8.11(2H，m)，7.57(1H，d，J＝1.2Hz)，7.47-7.22(11H，m)，6.86-6.79(4H，m)，6.29(1H，t，J＝6.6Hz)，4.87(1H，dt，J＝7.5，5.7Hz)，4.80-4.72(1H，m)，4.11-4.05(1H，m)，3.79(6H，s)，3.67-3.47(2H，m)，3.43(1H，dd，J＝10.8，2.7Hz)，3.27(1H，dd，J＝10.8，2.4Hz)，3.25-3.13(1H，m)，3.07-2.99(2H，m)，2.19-2.12(2H，m)，2.03-1.62(3H，m)，1.46-1.30(1H，m)，1.41(3H，s)；31PNMR(121.5MHz，CDCl3)δ158.1(1P，s)。
实施例Z-23。
噁唑磷烷单体18a。
通过使用“5′-O-(DMTr)-2′-O-TOM-6-N-(乙酰基)腺苷”替代“5′-O-(DMTr)-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”，以类似于化合物12a的方式获得化合物18a。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.82(1H，brs)，8.49(1H，s)，8.10(1H，s)，7.58-7.17(19H，m)，6.83-6.73(4H，m)，6.11(1H，d，J＝6.6Hz)，5.15(1H，dd，J＝6.6，5.4Hz)，4.98-4.77(4H，m)，4.18-4.11(1H，m)，3.76(6H，s)，3.59-3.25(4H，m)，3.16-3.02(1H，m)，2.62(3H，s)，1.91-1.53(3H，m)，1.49-1.18(3H，m)，0.96-0.80(3H，m)，0.90(18H，s)，0.62(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ156.7(1P，s)。
实施例Z-24。
噁唑磷烷单体18b。
通过使用3b替代3a，以类似于化合物18a的方式获得化合物18b。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.56(1H，brs)，8.55(1H，s)，8.13(1H，s)，7.57-7.17(19H，m)，6.82-6.73(4H，m)，6.16(1H，d，J＝5.7Hz)，5.06(1H，t，J＝5.6Hz)，4.93(1H，d，J＝5.1Hz)，4.83(1H，d，J＝5.1Hz)，4.81-4.69(2H，m)，4.27-4.19(1H，m)，3.76(6H，s)，3.55-3.40(2H，m)，3.33-3.16(2H，m)，3.12-2.97(1H，m)，2.63(3H，s)，1.88-1.52(3H，m)，1.45-1.16(3H，m)，0.91-0.79(3H，m)，0.86(18H，s)，0.64(3H，s)；31PNMR(121.5MHz，CDCl3)δ154.8(1P，s)。
实施例Z-25。
噁唑磷烷单体19a。
通过使用“5′-O-(DMTr)-2′-O-(甲基)尿苷”替代“5′-O-(DMTr)-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”，以类似于化合物12a的方式获得化合物19a。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.91(1H，d，J＝7.8Hz)，7.58-7.20(19H，m)，6.88-6.80(4H，m)，5.96(1H，d，J＝3.3Hz)，5.19(1H，d，J＝7.8Hz)，4.88-4.78(1H，m)，4.66-4.57(1H，m)，4.03-3.95(1H，m)，3.90-3.74(1H，m)，3.78(6H，s)，3.77-3.71(1H，m)，3.58-3.29(2H，m)，3.45(3H，s)，3.13-2.82(2H，m)，1.88-1.53(3H，m)，1.49-1.16(3H，m)，0.60(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ155.3(1P，s)。
实施例Z-26。
噁唑磷烷单体19b。
通过使用3b替代3a，以类似于化合物19a的方式获得化合物19b。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.10(1H，d，J＝8.4Hz)，7.58-7.20(19H，m)，6.87-6.79(4H，m)，5.89(1H，d，J＝1.5Hz)，5.21(1H，d，J＝8.4Hz)，4.92-4.82(1H，m)，4.73-4.63(1H，m)，4.15-4.08(1H，m)，3.89-3.73(1H，m)，3.78(6H，s)，3.66-3.62(1H，m)，3.57-3.27(2H，m)，3.30(3H，s)，3.17-2.82(2H，m)，1.89-1.55(3H，m)，1.55-1.40(1H，m)，1.35-1.15(2H，m)，0.66(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ157.5(1P，s)。
实施例Z-27。
噁唑磷烷单体20a。
通过使用“5′-O-(DMTr)-2′-脱氧基-2′-氟尿苷”替代“5′-O-(DMTr)-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”，以类似于化合物12a的方式获得化合物20a。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.85(1H，d，J＝8.1Hz)，7.58-7.20(19H，m)，6.87-6.79(4H，m)，5.98(1H，d，J＝16.5Hz)，5.23(1H，d，J＝8.1Hz)，4.86-4.61(3H，m)，3.99(1H，d，J＝6.9Hz)，3.76(6H，d，J＝3.0Hz)，3.56-3.34(4H，m)，3.10-2.96(1H，m)，1.88-1.74(1H，m)，1.72-1.52(2H，m)，1.48-1.16(3H，m)，0.61(3H，s)；31PNMR(121.5MHz，CDCl3)δ154.3(1P，d，J＝8.9Hz)。
实施例Z-28。
噁唑磷烷单体20b。
通过使用3b替代3a，以类似于化合物20a的方式获得化合物20b。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.01(1H，d，J＝8.4Hz)，7.58-7.20(19H，m)，6.87-6.79(4H，m)，6.03(1H，d，J＝16.2Hz)，5.29(1H，d，J＝8.4Hz)，4.96(1H，dd，J＝13.1，7.5Hz)，4.80-4.54(2H，m)，4.15(1H，d，J＝9.0Hz)，3.78(6H，s)，3.61-3.39(3H，m)，3.37-3.25(1H，m)，3.23-3.09(1H，m)，1.91-1.56(3H，m)，1.51-1.13(3H，m)，0.66(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ158.9(1P，d，J＝4.4Hz)。
实施例Z-29。
噁唑磷烷单体21a。
通过使用“5′-O-(DMTr)-2′-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷”替代“5′-O-(DMTr)-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”，以类似于化合物12a的方式获得化合物21a。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.62-7.18(21H，m)，6.84(4H，d，J＝8.7Hz)，6.07(1H，d，J＝5.7Hz)，4.86-4.76(1H，m)，4.63-4.54(1H，m)，4.20(1H，t，J＝5.4Hz)，3.95-3.89(1H，m)，3.78(6H，s)，3.78-3.71(2H，m)，3.60-3.48(2H，m)，3.44-3.02(5H，m)，3.31(3H，s)，1.88-1.15(6H，m)，1.35(3H，s)，0.58(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ156.3(1P，s)。
实施例Z-30。
噁唑磷烷单体21b。
通过使用3b替代3a，以类似于化合物21a的方式获得化合物21b。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.71(1H，d，J＝1.2Hz)，7.55-7.22(20H，m)，6.86-6.78(4H，m)，5.99(1H，d，J＝3.9Hz)，4.78-4.62(2H，m)，4.13-4.08(1H，m)，4.07-4.02(1H，m)，3.77(6H，s)，3.77-3.70(1H，m)，3.65-3.56(1H，m)，3.52-3.36(4H，m)，3.33-3.14(2H，m)，3.29(3H，s)，3.08-2.94(1H，m)，1.86-1.72(1H，m)，1.71-1.55(2H，m)，1.30(3H，d，J＝1.2Hz)，1.47-1.16(3H，m)0.64(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ155.6(1P，s)。
实施例Z-31。
噁唑磷烷单体22a。
通过使用“5′-O-(DMTr)-2′-O-甲基-4-N-(异丁酰基)胞苷”替代“5′-O-(DMTr)-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”，以类似于化合物12a的方式获得化合物22a。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.49(1H，d，J＝7.2Hz)，7.58-7.20(19H，m)，6.96(1H，d，J＝7.2Hz)，6.90-6.82(4H，m)，5.98(1H，s)，4.84(1H，dd，J＝13.1，7.5Hz)，4.59(1H，dt，J＝8.3，4.5Hz)，4.19-4.13(1H，m)，3.79(6H，s)，3.78-3.72(1H，m)，3.63-3.40(3H，m)，3.55(3H，s)，3.36-3.24(1H，m)，3.09-2.95(1H，m)，2.59(1H，七重峰，J＝6.9Hz)，1.85-1.53(5H，m)，1.48-1.37(1H，m)，1.24-1.17(6H，m)，0.59(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ155.2(1P，s)。
实施例Z-32。
噁唑磷烷单体22b。
通过使用3b替代3a，以类似于化合物22a的方式获得化合物22b。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.62(1H，d，J＝7.5Hz)，7.57-7.23(19H，m)，7.02(1H，d，J＝7.5Hz)，6.89-6.81(4H，m)，5.92(1H，s)，4.90(1H，dt，J＝9.0，5.7Hz)，4.61(1H，dt，J＝8.7，4.8Hz)，4.25-4.17(1H，m)，3.81(6H，s)，3.67(1H，d，J＝4.5Hz)，3.62-3.25(4H，m)，3.38(3H，s)，3.16-3.02(1H，m)，2.58(1H，七重峰，J＝6.9Hz)，1.87-1.40(6H，m)，1.26-1.14(6H，m)，0.64(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ158.2(1P，s)。
实施例Z-33。
噁唑磷烷单体23a。
通过使用“5′-O-(DMTr)-2′-O-甲基-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”替代“5′-O-(DMTr)-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”，以类似于化合物12a的方式获得化合物23a。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.67(1H，brs)，8.01(1H，s)，7.56-7.16(24H，m)，6.83-6.74(4H，m)，6.08(1H，d，J＝6.9Hz)，4.85-4.76(1H，m)，4.84(2H，t，J＝6.6Hz)，4.65-4.56(1H，m)，4.59(2H，brs)，4.48(1H，dd，J＝6.6，5.1Hz)，4.09-4.05(1H，m)，3.75(6H，s)，3.60-3.42(2H，m)，3.40-3.26(2H，m)，3.35(3H，s)，3.18-3.05(1H，m)，3.08(2H，t，J＝6.6Hz)，1.89-1.49(3H，m)，1.48-1.16(3H，m)，0.59(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ156.9(1P，s)。
实施例Z-34。
噁唑磷烷单体23b。
通过使用3b替代3a，以类似于化合物23a的方式获得化合物23b。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.74(1H，brs)，8.09(1H，s)，7.56-6.94(24H，m)，6.84-6.71(4H，m)，6.09(1H，d，J＝4.8Hz)，4.83-4.70(2H，m)，4.83(2H，t，J＝6.6Hz)，4.63(2H，brs)，4.35(1H，t，J＝5.0Hz)，4.23-4.16(1H，m)，3.75(6H，s)，3.58-3.19(4H，m)，3.32(3H，s)，3.16-3.04(1H，m)，3.07(2H，t，J＝6.6Hz)，1.90-1.55(3H，m)，1.48-1.15(3H，m)，0.64(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ154.6(1P，s)。
实施例Z-35。
噁唑磷烷单体24a。
通过使用“5′-O-(DMTr)-2′-脱氧基-2′-氟-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”替代“5′-O-(DMTr)-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”，以类似于化合物12a的方式获得化合物24a。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.74(1H，brs)，8.03(1H，s)，7.55-6.94(24H，m)，6.80-6.69(4H，m)，6.21(1H，dd，J＝14.9，3.6Hz)，5.34(1H，dt，J＝52.3，3.6Hz)，5.01-4.75(2H，m)，4.84(1H，t，J＝6.6Hz)，4.62(2H，brs)，4.15-4.07(1H，m)，3.73(6H，s)，3.59-3.29(4H，m)，3.15-3.00(1H，m)，3.07(2H，t，J＝6.6Hz)，1.90-1.49(3H，m)，1.47-1.12(3H，m)，0.58(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ155.6(1P，d，J＝10.9Hz)。
实施例Z-36。
噁唑磷烷单体24b。
通过使用3b替代3a，以类似于化合物24a的方式获得化合物24b。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.81(1H，brs)，8.06(1H，s)，7.55-6.95(24H，m)，6.77-6.69(4H，m)，6.06(1H，d，J＝17.1Hz)，5.24-5.08(1H，m)，5.04-4.80(2H，m)，4.87(1H，t，J＝6.6Hz)，4.62(2H，brs)，4.25-4.19(1H，m)，3.73(6H，s)，3.58-3.02(5H，m)，3.10(2H，t，J＝6.6Hz)，1.90-1.56(3H，m)，1.50-1.15(3H，m)，0.63(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ158.0(1P，d，J＝4.4Hz)。
实施例Z-37。
噁唑磷烷单体25a。
通过使用“5′-O-(DMTr)-2′-O-TOM-4-N-(乙酰基)胞苷”替代“5′-O-(DMTr)-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”，以类似于化合物12a的方式获得化合物25a。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ10.04(1H，brs)，8.30(1H，d，J＝7.5Hz)，7.51-7.21(19H，m)，6.99(1H，d，J＝7.5Hz)，6.89-6.81(4H，m)，6.12(1H，d，J＝3.3Hz)，5.07(1H，d，J＝4.8Hz)，5.05(1H，d，J＝4.8Hz)，4.84-4.75(1H，m)，4.62-4.52(1H，m)，4.31-4.25(1H，m)，4.08-4.01(1H，m)，3.78(6H，d，J＝3.0Hz)，3.55-3.23(4H，m)，3.10-2.96(1H，m)，2.24(3H，s)，1.84-1.49(3H，m)，1.46-0.96(24H，m)，0.58(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ156.5(1P，s)。
实施例Z-38。
噁唑磷烷单体25b。
通过使用3b替代3a，以类似于化合物25a的方式获得化合物25b。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ10.19(1H，brs)，8.46(1H，d，J＝7.5Hz)，7.54-7.23(19H，m)，7.01(1H，d，J＝7.5Hz)，6.88-6.79(4H，m)，6.19(1H，d，J＝1.8Hz)，5.11(1H，d，J＝4.8Hz)，5.07(1H，d，J＝4.8Hz)，4.81-4.71(1H，m)，4.60-4.51(1H，m)，4.26-4.18(2H，m)，3.79(6H，s)，3.63-3.55(1H，m)，3.48-3.28(2H，m)，3.21-2.94(2H，m)，2.26(3H，s)，1.81-1.49(3H，m)，1.43-0.96(24H，m)，0.62(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ156.4(1P，s)。
实施例Z-39。
噁唑磷烷单体26a。
通过使用“5′-O-(DMTr)-2′-脱氧基-2′-氟-4-N-(异丁酰基)胞苷”替代“5′-O-(DMTr)-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”，以类似于化合物12a的方式获得化合物26a。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.66(1H，brs)，8.41(1H，d，J＝7.5Hz)，7.55-7.20(19H，m)，7.01(1H，d，J＝7.5Hz)，6.89-6.81(4H，m)，6.06(1H，d，J＝15.9Hz)，4.85(1H，dd，J＝51.4，3.9Hz)，4.84(1H，dd，J＝12.9，7.5Hz)，4.77-4.59(1H，m)，4.15-4.08(1H，m)，3.79(6H，s)，3.63-3.29(4H，m)，3.10-2.96(1H，m)，2.65(1H，七重峰，J＝6.9Hz)，1.85-1.53(3H，m)，1.48-1.17(3H，m)，1.21(3H，d，J＝4.8Hz)，1.19(3H，d，J＝4.8Hz)，0.59(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ155.5(1P，d，J＝6.6Hz)。
实施例Z-40。
噁唑磷烷单体26b。
通过使用3b替代3a，以类似于化合物26a的方式获得化合物26b。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.53(1H，d，J＝7.5Hz)，7.57-7.23(20H，m)，7.10(1H，d，J＝7.5Hz)，6.89-6.81(4H，m)，6.10(1H，d，J＝15.9Hz)，5.00-4.92(1H，m)，4.84(1H，dd，J＝51.5，3.3Hz)，4.75-4.58(1H，m)，4.24(1H，d，J＝9.3Hz)，3.81(6H，s)，3.65-3.39(3H，m)，3.32-3.06(2H，m)，2.59(1H，七重峰，J＝6.9Hz)，1.88-1.53(4H，m)，1.49-1.34(2H，m)，1.27-1.18(6H，m)，0.65(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ159.0(1P，d，J＝4.4)。
噁唑磷烷单体27a
通过使用“5′-O-(DMTr)-2′-O-甲基-6-N-(苯甲酰基)腺苷”替代“5′-O-(DMTr)-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”，以类似于化合物12a的方式获得化合物27a。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.66(1H，s)，8.13(1H，s)，8.03(2H，d，J＝7.2Hz)，7.64-7.16(23H，m)，6.79(4H，d，J＝8.7Hz)，6.08(1H，d，J＝6.3Hz)，4.91-4.81(1H，m)，4.77-4.69(1H，m)，4.64-4.57(1H，m)，4.15-4.10(1H，m)，3.76(6H，s)，3.60-3.23(4H，m)，3.35(3H，s)，3.14-3.00(1H，m)，1.90-1.19(6H，m)，0.62(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ155.8(1P，s)。
噁唑磷烷单体27b。
通过使用3b替代3a，以类似于化合物27a的方式获得化合物27b。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.12(1H，brs)，8.73(1H，s)，8.24(1H，s)，8.07-8.01(2H，m)，7.62-7.17(22H，m)，6.83-6.77(4H，m)，6.12(1H，d，J＝4.8Hz)，4.84-4.73(2H，m)，4.43(1H，t，J＝4.8Hz)，4.25-4.19(1H，m)，3.77(6H，s)，3.55-3.20(4H，m)，3.28(3H，s)，3.16-3.03(1H，m)，1.90-1.17(6H，m)，0.65(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ155.0(1P，s)。
噁唑磷烷单体28a。
通过使用“5′-O-(DMTr)-2′-脱氧基-2′-氟-6-N-(苯甲酰基)腺苷”替代“5′-O-(DMTr)-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”，以类似于化合物12a的方式获得化合物28a。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.64(1H，s)，8.14(1H，s)，8.06-8.01(2H，m)，7.63-7.07(23H，m)，6.78-6.70(4H，m)，6.12(1H，dd，J＝18.0，2.4Hz)，5.24-5.01(2H，m)，4.94-4.84(1H，m)，4.17-4.06(1H，m)，3.73(6H，s)，3.55-3.40(3H，m)，3.30-3.22(1H，m)，3.03-2.88(1H，m)，1.92-1.19(6H，m)，0.62(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ150.5(1P，d，J＝7.7Hz)。
噁唑磷烷单体28b。
通过使用3b替代3a，以类似于化合物28a的方式获得化合物28b。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.07(1H，brs)，8.80(1H，s)，8.24(1H，s)，8.08-8.01(2H，m)，7.66-7.15(22H，m)，6.81-6.75(4H，m)，6.14(1H，dd，J＝18.0，1.8Hz)，5.16-4.91(3H，m)，4.28-4.21(1H，m)，3.76(6H，s)，3.57-3.11(5H，m)，1.82-1.16(6H，m)，0.65(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ157.8(1P，d，J＝5.6Hz)。
噁唑磷烷单体29a。
通过使用“5′-O-(DMTr)-2′-O-TOM-2-N-(乙酰基)鸟苷”替代“5′-O-(DMTr)-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”，以类似于化合物12a的方式获得化合物29a。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.70(1H，s)，7.63-7.13(21H，m)，6.84-6.76(4H，m)，5.77(1H，d，J＝8.4Hz)，5.41-5.33(1H，m)，4.90(2H，s)，4.78-4.68(2H，m)，3.86(1H，brs)，3.75(3H，s)，3.74(3H，s)，3.56-3.41(2H，m)，3.32-2.90(3H，m)，1.92-1.10(9H，m)，0.97-0.87(21H，m)，0.52(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ158.1(1P，s)。
噁唑磷烷单体29b。
通过使用3b替代3a，以类似于化合物29a的方式获得化合物29b。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.77(1H，s)，7.56-7.15(21H，m)，6.82-6.75(4H，m)，5.86(1H，d，J＝7.5Hz)，5.26-5.17(1H，m)，4.95(1H，d，J＝5.4Hz)，4.85(1H，d，J＝5.4Hz)，4.78-4.71(1H，m)，4.59-4.49(1H，m)，4.10-4.05(1H，m)，3.74(6H，s)，3.52-3.37(2H，m)，3.30-3.18(1H，m)，3.11-2.85(2H，m)，1.85-1.15(9H，m)，0.93-0.84(21H，m)，0.62(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ152.3(1P，s)。
噁唑磷烷单体30a。
通过使用“5′-O-(DMTr)-2′-O-TOM-尿苷”替代“5′-O-(DMTr)-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”，以类似于化合物12a的方式获得化合物30a。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.76(1H，d，J＝8.1Hz)，7.55-7.18(20H，m)，6.88-6.80(4H，m)，6.11(1H，d，J＝6.0Hz)，5.32(1H，d，J＝8.1Hz)，4.99(1H，d，J＝5.1Hz)，4.93(1H，d，J＝5.1Hz)，4.84-4.75(1H，m)，4.54-4.46(1H，m)，4.38(1H，t，J＝5.7Hz)，3.87-3.83(1H，m)，3.78(3H，s)，3.77(3H，s)，3.56-3.42(1H，m)，3.39-3.28(1H，m)，3.36(1H，dd，J＝11.0，2.7Hz)，3.25(1H，dd，J＝11.0，2.7Hz)，3.16-3.03(1H，m)，1.88-1.12(6H，m)，1.08-0.97(21H，m)，0.59(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ156.6(1P，s)。
噁唑磷烷单体30b。
通过使用3b替代3a，以类似于化合物30a的方式获得化合物30b。
1H NMR(600MHz，CDCl3)δ7.87(1H，d，J＝7.8Hz)，7.52-7.48(4H，m)，7.38-7.21(16H，m)，6.83-6.79(4H，m)，6.14(1H，d，J＝4.8Hz)，5.33(1H，d，J＝7.8Hz)，4.99(1H，d，J＝5.4Hz)，4.89(1H，d，J＝5.4Hz)，4.67(1H，dd，J＝13.8，7.2Hz)，4.52(1H，dt，J＝10.4，4.8Hz)，4.31(1H，t，J＝4.8Hz)，4.06-4.03(1H，m)，3.78(3H，s)，3.77(3H，s)，3.47(1H，dd，J＝10.4，2.4Hz)，3.47-3.39(1H，m)，3.22-3.17(2H，m)，3.00(1H，ddd，J＝19.5，10.4，4.8Hz)，1.82-1.74(1H，m)，1.68-1.58(1H，m)，1.56(1H，dd，J＝14.4，8.4Hz)，1.38(1H，dd，J＝14.4，7.2Hz)，1.31-1.25(1H，m)，1.26-1.17(1H，m)，1.08-0.98(21H，m)，0.63(3H，s)；31P NMR(243.0MHz，CDCl3)δ154.3(1P，s)。
噁唑磷烷单体31a。
通过使用“5′-O-(DMTr)-2′-O，4′-C-亚甲基-6-N-(苯甲酰基)腺苷”替代“5′-O-(DMTr)-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”，以类似于化合物12a的方式获得化合物31a。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.10(1H，brs)，8.76(1H，s)，8.32(1H，s)，8.04(2H，d，J＝7.2Hz)，7.64-7.18(22H，m)，6.84(4H，d，J＝8.7Hz)，6.10(1H，s)，4.76(1H，dJ＝6.9Hz)，4.58(1H，s)，4.61-4.51(1H，m)，3.91(1H，d，J＝7.8Hz)，3.77(1H，d，J＝7.8Hz)，3.75(6H，s)，3.50(1H，s)，3.47-3.33(1H，m)，3.31-3.19(1H，m)，3.03-2.88(1H，m)，1.84-1.09(6H，m)，0.51(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ152.9(1P，s)。
噁唑磷烷单体31b。
通过使用3b替代3a，以类似于化合物31a的方式获得化合物31b。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.81(1H，s)，8.30(1H，s)，8.07-8.00(2H，m)，7.64-7.17(22H，m)，6.86-6.79(4H，m)，6.12(1H，s)，4.81-4.72(1H，m)，4.62(1H，d J＝7.2Hz)，4.57(1H，s)，3.94(1H，d，J＝7.8Hz)，3.89(1H，d，J＝7.8Hz)，3.77(6H，s)，3.48(2H，s)，3.46-3.32(1H，m)，3.24-3.13(1H，m)，3.10-2.97(1H，m)，1.84-1.49(3H，m)，1.42-1.09(3H，m)，0.58(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ157.3(1P，s)。
噁唑磷烷单体32a。
通过使用“5′-O-(DMTr)-2′-O，4′-C-亚甲基-4-N-(异丁酰基)-5-甲基胞苷”替代“5′-O-(DMTr)-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”，以类似于化合物12a的方式获得化合物32a。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.88(1H，brs)，7.58-7.18(20H，m)，6.88-6.80(4H，m)，5.65(1H，s)，4.69-4.60(1H，m)，4.52(1H，d，J＝6.6Hz)，4.49(1H，s)，3.81-3.74(1H，m)，3.75(3H，s)，3.73(3H，s)，3.64(1H，d，J＝8.1Hz)，3.56(1H，d，J＝11.1Hz)，3.53(1H，d，J＝8.1Hz)，3.46(1H，d，J＝11.1Hz)，3.56-3.40(1H，m)，3.32-3.20(1H，m)，3.14-3.00(1H，m)，1.85-1.12(6H，m)，1.60(3H，s)，1.19(6H，d，J＝6.9Hz)，0.55(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ155.9(1P，s)。
噁唑磷烷单体32b。
通过使用3b替代3a，以类似于化合物32a的方式获得化合物32b。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.86(1H，brs)，7.56-7.19(20H，m)，6.88-6.79(4H，m)，5.69(1H，s)，4.86-4.76(1H，m)，4.46(1H，s)，4.45(1H，d，J＝7.5Hz)，3.80-3.75(1H，m)，3.79(6H，s)，3.74(1H，d，J＝8.1Hz)，3.69(1H，d，J＝8.1Hz)，3.51(1H，d，J＝11.1Hz)，3.44-3.30(1H，m)，3.39(1H，d，J＝11.1Hz)，3.29-3.17(1H，m)，3.11-2.97(1H，m)，1.86-1.52(3H，m)，1.64(3H，s)，1.45-1.10(3H，m)，1.21(6H，d，J＝6.6Hz)，0.62(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ158.2(1P，s)。
噁唑磷烷单体33a。
通过使用“5′-O-(DMTr)-2′-O，4′-C-亚甲基-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”替代“5′-O-(DMTr)-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”，以类似于化合物12a的方式获得化合物33a。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.71(1H，brs)，8.16(1H，s)，7.50-7.17(21H，m)，7.09-7.01(3H，m)，6.86-6.79(4H，m)，6.03(1H，s)，4.84(2H，t，J＝6.6Hz)，4.72(2H，s)，4.68(1H，d，J＝7.2Hz)，4.55-4.46(1H，m)，4.50(1H，s)，3.90(1H，d，J＝7.8Hz)，3.77(1H，d，J＝7.8Hz)，3.75(6H，s)，3.51(1H，d，J＝10.8Hz)，3.47(1H，d，J＝10.8Hz)，3.45-3.21(2H，m)，3.08(2H，t，J＝6.6Hz)，3.03-2.89(1H，m)，1.80-1.08(6H，m)，0.47(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ153.2(1P，s)。
噁唑磷烷单体33b。
通过使用3b替代3a，以类似于化合物33a的方式获得化合物33b。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.86(1H，brs)，8.13(1H，s)，7.55-7.17(21H，m)，7.08-6.98(3H，m)，6.95-6.78(4H，m)，6.01(1H，s)，4.86(2H，t，J＝6.6Hz)，4.82-4.73(1H，m)，4.70(2H，s)，4.64(1H，d，J＝7.5Hz)，4.49(1H，s)，3.94(1H，d，J＝7.8Hz)，3.89(1H，d，J＝7.8Hz)，3.77(6H，s)，3.46(2H，s)，3.45-3.30(1H，m)，3.24-3.12(1H，m)，3.09(2H，t，J＝6.6Hz)，3.09-2.96(1H，m)，1.81-1.50(3H，m)，1.41-1.06(3H，m)，0.58(3H，s)；31PNMR(121.5MHz，CDCl3)δ157.4(1P，s)。
噁唑磷烷单体34a。
通过使用“5′-O-(DMTr)-2′-O，4′-C-亚甲基-5-甲基尿苷”替代“5′-O-(DMTr)-2-N-(苯氧基乙酰基)-6-O-(氰基乙基)鸟苷”，以类似于化合物12a的方式获得化合物34a。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.71(1H，d，J＝0.9Hz)，7.50-7.17(20H，m)，6.87-6.80(4H，m)，5.61(1H，s)，4.69-4.60(1H，m)，4.55(1H，d，J＝6.9Hz)，4.41(1H，s)，3.74(3H，s)，3.73(3H，s)，3.64(1H，d，J＝7.8Hz)，3.55(1H，d，J＝7.8Hz)，3.53(1H，d，J＝10.8Hz)，3.46(1H，d，J＝10.8Hz)，3.56-3.42(1H，m)，3.35-3.24(1H，m)，3.13-3.00(1H，m)，1.85-1.45(3H，m)，1.55(3H，d，J＝0.9Hz)，1.41-1.12(3H，m)，0.56(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ155.1(1P，s)。
噁唑磷烷单体34b。
通过使用3b替代3a，以类似于化合物34a的方式获得化合物34b。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.69(1H，s)，7.56-7.19(20H，m)，6.88-6.79(4H，m)，5.66(1H，s)，4.87-4.77(1H，m)，4.47(1H，d，J＝7.8Hz)，4.40(1H，s)，3.78(6H，s)，3.74(1H，d，J＝7.8Hz)，3.68(1H，d，J＝7.8Hz)，3.50(1H，d，J＝10.8Hz)，3.46-3.32(1H，m)，3.39(1H，d，J＝10.8Hz)，3.30-3.19(1H，m)，3.12-2.98(1H，m)，1.85-1.56(3H，m)，1.59(3H，s)，1.46-1.12(3H，m)，0.63(3H，s)；31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ158.1(1P，s)。
噁唑磷烷单体35a。
通过使用13a′替代3a，以类似于化合物13a的方式获得化合物35a。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ7.76(2H，d，J＝9.0Hz)，7.62(1H，d，J＝1.2Hz)，7.40(2H，d，J＝7.2Hz)，7.32-7.23(10H，m)，6.85(4H，d，J＝8.4Hz)，6.41(1H，dd，J＝8.4，5.4Hz)，4.94(1H，dd，J＝12.3，5.4Hz)，4.84-4.79(1H，m)，4.03-4.01(1H，m)，3.79(6H，s)，3.59-3.53(1H，m)，3.52-3.44(2H，m)，3.41(1H，dd，J＝14.7，7.2Hz)，3.37-3.30(2H，m)，3.13(1H，ddd，J＝19.3，10.3，4.1Hz)，2.50-2.44(1H，m)，2.39(3H，s)，2.35-2.29(1H，m)，1.91-1.72(2H，m)，1.64-1.59(1H，m)，1.40(3H，s)，1.12-1.05(1H，m)；31P NMR(243.0MHz，CDCl3)δ154.2(1P，s)。
实施例Z-41。
表示常规单体的以上化合物Z-27用于产生寡聚物。图70显示通过比较实施例z-1获得的产物的图。如图69和70中所示，本单体提供更完全脱保护和较少副产物，此使得产物分离和/或纯化较容易。
在一些实施方案中，本发明提供化学稳定单体。示例性所述单体描绘于以上实施例中。在一些实施方案中，本发明提供具有高分离产率的单体。在一些实施方案中，本发明提供分离产率高于常规方法的单体。在一些实施方案中，分离产率大于80％。示例性所述单体描绘于以上实施例中。
缩合试剂
根据本发明方法适用的缩合试剂(CR)具有任一以下通式：
其中Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8和Z9独立地是选自烷基、氨基烷基、环烷基、杂环、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷基氧基、芳基氧基或杂芳基氧基的任选地取代的基团，或其中Z2和Z3、Z5和Z6、Z7和Z8、Z8和Z9、Z9和Z7、或Z7和Z8和Z9中的任一个一起形成3至20元脂环族环或杂环；Q-是反阴离子；并且LG是离去基团。
在一些实施方案中，缩合试剂CR的反离子是Cl-、Br-、BF4 -、PF6 -、TfO-、Tf2N-、AsF6 -、ClO4 -或SbF6 -，其中Tf是CF3SO2。在一些实施方案中，缩合试剂CR的离去基团是F、Cl、Br、I、3-硝基-1，2，4-三唑、咪唑、烷基三唑、四唑、五氟苯或1-羟基苯并三唑。
根据本发明方法使用的缩合试剂的实例包括但不限于五氟苯甲酰氯、羰基二咪唑(CDI)、1-均三甲苯磺酰基-3-硝基三唑(MSNT)、1-乙基-3-(3’-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI-HCl)、苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(PyBOP)、N，N’-双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BopCl)、2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)和O-苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、DIPCDI；N，N'-双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰溴(BopBr)、1，3-二甲基-2-(3-硝基-1，2，4-三唑-1-基)-2-吡咯烷-1-基-1，3，2-二氮杂磷杂环戊烷鎓六氟磷酸盐(MNTP)、3-硝基-1，2，4-三唑-1-基-三(吡咯烷-1-基)磷鎓六氟磷酸盐(PyNTP)、溴三吡咯烷子基磷鎓六氟磷酸盐(PyBrOP)；O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)；以及四甲基氟甲脒六氟磷酸盐(TFFH)。在某些实施方案中，缩合试剂CR的反离子是Cl-、Br-、BF4 -、PF6 -、TfO-、Tf2N-、AsF6 -、ClO4 -或SbF6 -，其中Tf是CF3SO2。
在一些实施方案中，缩合试剂是1-(2，4，6-三异丙基苯磺酰基)-5-(吡啶-2-基)四唑化物、特戊酰氯、溴三吡咯烷子基磷鎓六氟磷酸盐，N，N'-双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BopCl)或2-氯-5，5-二甲基-2-氧代-1，3，2-二氧杂磷杂环戊烷。在某一实施方案中，缩合试剂是N，N'-双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BopCl)。在一些实施方案中，缩合试剂选自WO/2006/066260中所述的那些。
在一些实施方案中，缩合试剂是1，3-二甲基-2-(3-硝基-1，2，4-三唑-1-基)-2-吡咯烷-1-基-1，3，2-二氮杂磷杂环戊烷鎓六氟磷酸盐(MNTP)或3-硝基-1，2，4-三唑-1-基-三(吡咯烷-1-基)磷鎓六氟磷酸盐(PyNTP)：
核苷偶联搭配物的碱基和糖的选择
如本文所述，供根据本发明方法使用的核苷偶联搭配物可彼此相同，或可彼此不同。在一些实施方案中，用于合成提供的寡核苷酸的核苷偶联搭配物彼此具有相同结构和/或立体化学构型。在一些实施方案中，用于合成提供的寡核苷酸的各核苷偶联搭配物与寡核苷酸的某些其它核苷偶联搭配物不具有相同结构和/或立体化学构型。本文描述供根据本发明方法使用的示例性核苷碱基和糖。相关化学和合成领域技术人员将认识到本文所述的核苷碱基和糖的任何组合都被预期供根据本发明方法使用。
偶联步骤：
供根据本发明使用的示例性偶联程序以及手性试剂和缩合试剂尤其概述于Wada I(JP4348077；WO2005/014609；WO2005/092909)、Wada II(WO2010/064146)和Wada III(WO2012/039448)中。供根据本发明使用的手性核苷偶联搭配物在本文中也称为“Wada 亚酰胺化物”。在一些实施方案中，偶联搭配物具有结构其中BPRO是受保护的核苷碱基。在一些实施方案中，偶联搭配物具有结构其中BPRO是受保护的核苷碱基。以下描绘作为偶联搭配物的示例性手性亚磷酰胺：
以下方案II中描绘一种用于合成偶联搭配物的方法。
方案II.偶联搭配物的示例性合成。
在一些实施方案中，偶联步骤包括使寡核苷酸的核苷酸单元的游离羟基与核苷偶联搭配物在适合条件下反应以实现偶联。在一些实施方案中，偶联步骤之前是去封闭步骤。例如，在一些实施方案中，增长寡核苷酸的5’羟基被封闭(即受保护)，并且必须被去封闭以随后与核苷偶联搭配物反应。
一旦增长寡核苷酸的适当羟基已被去封闭，即洗涤并干燥载体以为递送包含手性试剂的溶液和包含活化剂的溶液做准备。在一些实施方案中，手性试剂和活化剂是同时递送。在一些实施方案中，共递送包括递送一定量的呈溶液形式的手性试剂(例如亚磷酰胺溶液)和一定量的呈于如腈溶剂(例如乙腈)的极性非质子性溶剂中的溶液形式的活化剂(例如CMPT溶液)。
在一些实施方案中，偶联步骤提供粗产物组合物，其中手性亚磷酸酯产物以非对映异构过量＞95％存在。在一些实施方案中，手性亚磷酸酯产物以非对映异构过量＞96％存在。在一些实施方案中，手性亚磷酸酯产物以非对映异构过量＞97％存在。在一些实施方案中，手性亚磷酸酯产物以非对映异构过量＞98％存在。在一些实施方案中，手性亚磷酸酯产物以非对映异构过量＞99％存在。
加帽步骤：
提供的用于制备手性控制的寡核苷酸的方法包括加帽步骤。在一些实施方案中，加帽步骤是单一步骤。在一些实施方案中，加帽步骤是两个步骤。在一些实施方案中，加帽步骤超过两个步骤。
在一些实施方案中，加帽步骤包括对手性助剂的游离胺加帽以及对任何残余未反应的5’羟基加帽的步骤。在一些实施方案中，手性助剂的游离胺和未反应的5’羟基是用相同加帽基团来加帽。在一些实施方案中，手性助剂的游离胺和未反应的5’羟基是用不同加帽基团来加帽。在某些实施方案中，用不同加帽基团加帽允许在合成寡核苷酸期间移除一个加帽基团的选择性超过移除另一加帽基团。在一些实施方案中，两个基团的加帽同时发生。在一些实施方案中，两个基团的加帽迭代发生。
在某些实施方案中，加帽迭代发生，并且包括对游离胺加帽的第一步骤，继之是对游离5’羟基加帽的第二步骤，其中游离胺与5’羟基两者均用相同加帽基团加帽。例如，在一些实施方案中，手性助剂的游离胺是使用酸酐(例如苯氧基乙酸酐，即Pac2O)加帽，随后用相同酸酐对5’羟基加帽。在某些实施方案中，用相同酸酐对5’羟基加帽发生在不同条件下(例如在一种或多种其它试剂存在下)。在一些实施方案中，对5’羟基加帽在胺碱存在下在醚溶剂中(例如NMI(N-甲基咪唑)，在THF中)发生。短语“加帽基团”在本文中可与短语“保护基”和“封闭基团”互换使用。
在一些实施方案中，胺加帽基团的特征在于它有效地对胺加帽，因此它防止中间亚磷酸酯种类重排和/或分解。在一些实施方案中，选择能够保护手性助剂的胺以防止核苷酸间键联磷的分子内裂解的加帽基团。
在一些实施方案中，5’羟基加帽基团的特征在于它有效地对羟基加帽，因此它防止出现由于未能在第一循环中反应，但接着在一个或多个随后循环中反应的寡核苷酸链的反应而产生的“短聚体”，例如“n-m”(m和n是整数，并且m＜n；n是靶向的寡核苷酸中的碱基的数目)杂质。存在所述短聚体(尤其“n-1”)对粗寡核苷酸的纯度具有有害影响，并且使得寡核苷酸的最终纯化变得繁重，并且通常是低产率的。
在一些实施方案中，特定帽是基于它促进在特定条件下的特定类型的反应的趋势来选择。例如，在一些实施方案中，选择能够促进E1消除反应的加帽基团，所述反应自增长寡核苷酸裂解帽和/或助剂。在一些实施方案中，选择能够促进E2消除反应的加帽基团，所述反应自增长寡核苷酸裂解帽和/或助剂。在一些实施方案中，选择能够促进β-消除反应的加帽基团，所述反应自增长寡核苷酸裂解帽和/或助剂。
修饰步骤：
如本文所用，短语“修饰步骤”和“P修饰步骤”可互换使用，并且大体上是指用于安置修饰的核苷酸间键联的任何一个或多个步骤。在一些实施方案中，修饰的核苷酸间键联具有式I结构。本发明的P修饰步骤发生在装配提供的寡核苷酸期间而非在提供的寡核苷酸装配完成之后。因此，提供的寡核苷酸的各核苷酸单元可在安置核苷酸单元所处的循环期间在键联磷处被个别地修饰。
在一些实施方案中，适合P修饰试剂是硫亲电子试剂、硒亲电子试剂、氧亲电子试剂、硼酸化试剂或叠氮化物试剂。
例如，在一些实施方案中，硒试剂是元素硒、硒盐或取代的二硒化物。在一些实施方案中，氧亲电子试剂是元素氧、过氧化物或取代的过氧化物。在一些实施方案中，硼酸化试剂是硼烷-胺(例如N，N-二异丙基乙胺(BH3·DIPEA)、硼烷-吡啶(BH3·Py)、硼烷-2-氯吡啶(BH3·CPy)、硼烷-苯胺(BH3·An))、硼烷-醚试剂(例如硼烷-四氢呋喃(BH3·THF))、硼烷-二烷基硫化物试剂(例如BH3·Me2S)、苯胺-氰基硼烷或三苯基膦-烷氧羰基硼烷。在一些实施方案中，叠氮化物试剂包含能够经受随后还原以提供胺基团的叠氮化物基团。
在一些实施方案中，P修饰试剂是如本文所述的硫化试剂。在一些实施方案中，修饰步骤包括使磷硫化以提供硫代磷酸酯键联或硫代磷酸三酯键联。在一些实施方案中，修饰步骤提供具有式I核苷酸间键联的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本发明提供硫化试剂以及制备和使用所述硫化试剂的方法。
在一些实施方案中，所述硫化试剂是硫代磺酸酯试剂。在一些实施方案中，硫代磺酸酯试剂具有式S-I结构：
其中：
Rs1是R；并且
R、L和R1各自独立地是如以上以及本文中所定义和描述。
在一些实施方案中，硫化试剂是双(硫代磺酸酯)试剂。在一些实施方案中，双(硫代磺酸酯)试剂具有式S-II结构：
其中Rs1和L各自独立地是如以上以及本文中所定义和描述。
如以上所一般定义，Rs1是R，其中R是如以上以及本文中所定义和描述。在一些实施方案中，Rs1是任选地取代的脂族、芳基、杂环基或杂芳基。在一些实施方案中，Rs1是任选地取代的烷基。在一些实施方案中，Rs1是任选地取代的烷基。在一些实施方案中，Rs1是甲基。在一些实施方案中，Rs1是氰基甲基。在一些实施方案中，Rs1是硝基甲基。在一些实施方案中，Rs1是任选地取代的芳基。在一些实施方案中，Rs1是任选地取代的苯基。在一些实施方案中，Rs1是苯基。在一些实施方案中，Rs1是对硝基苯基。在一些实施方案中，Rs1是对甲基苯基。在一些实施方案中，Rs1是对氯苯基。在一些实施方案中，Rs1是邻氯苯基。在一些实施方案中，Rs1是2，4，6-三氯苯基。在一些实施方案中，Rs1是五氟苯基。在一些实施方案中，Rs1是任选地取代的杂环基。在一些实施方案中，Rs1是任选地取代的杂芳基。
在一些实施方案中，Rs1-S(O)2S-是在一些实施方案中，Rs1-S(O)2S-是在一些实施方案中，Rs1-S(O)2S-是在一些实施方案中，Rs1-S(O)2S-是在一些实施方案中，Rs1-S(O)2S-是在一些实施方案中，Rs1-S(O)2S-是在一些实施方案中，Rs1-S(O)2S-是在一些实施方案中，Rs1-S(O)2S-是在一些实施方案中，Rs1-S(O)2S-是在一些实施方案中，Rs1-S(O)2S-是在一些实施方案中，Rs1-S(O)2S-是在一些实施方案中，Rs1-S(O)2S-是在一些实施方案中，Rs1-S(O)2S-是在一些实施方案中，Rs1-S(O)2S-是
在一些实施方案中，硫化试剂具有结构S-I或S-II，其中L是-S-RL3-或-S-C(O)-RL3-。在一些实施方案中，L是-S-RL3-或-S-C(O)-RL3-，其中RL3是任选地取代的C1-C6亚烷基。在一些实施方案中，L是-S-RL3-或-S-C(O)-RL3-，其中RL3是任选地取代的C1-C6亚烯基。在一些实施方案中，L是-S-RL3-或-S-C(O)-RL3-，其中RL3是任选地取代的C1-C6亚烷基，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地取代的C1-C6亚烯基、亚芳基或亚杂芳基。在一些实施方案中，在一些实施方案中，RL3是任选地取代的-S-(C1-C6亚烯基)-、-S-(C1-C6亚烷基)-、-S-(C1-C6亚烷基)-亚芳基-(C1-C6亚烷基)-、-S-CO-亚芳基-(C1-C6亚烷基)-或-S-CO-(C1-C6亚烷基)-亚芳基-(C1-C6亚烷基)-。在一些实施方案中，硫化试剂具有结构S-I或S-II，其中L是-S-RL3-或-S-C(O)-RL3-，并且硫原子连接于R1。
在一些实施方案中，硫化试剂具有结构S-I或S-II，其中L是亚烷基、亚烯基、亚芳基或亚杂芳基。
在一些实施方案中，硫化试剂具有结构S-I或S-II，其中L是 在一些实施方案中，L是 其中硫原子连接于R1。
在一些实施方案中，硫化试剂具有结构S-I或S-II，其中R1是 在一些实施方案中，R1是 其中硫原子连接于L。
在一些实施方案中，硫化试剂具有结构S-I或S-II，其中L是 其中硫原子连接于R1；并且R1是 其中硫原子连接于L。
在一些实施方案中，硫化试剂具有结构S-I或S-II，其中R1是-S-RL2，其中RL2是如以上以及本文中所定义和描述。在一些实施方案中，RL2是选自以下的任选地取代的基团：-S-(C1-C6亚烷基)-杂环基、-S-(C1-C6亚烯基)-杂环基、-S-(C1-C6亚烷基)-N(R’)2、-S-(C1-C6亚烷基)-N(R’)3，其中各R’是如上所定义并如本文所述。
在一些实施方案中，-L-R1是-RL3-S-S-RL2，其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。在一些实施方案中，-L-R1是-RL3-C(O)-S-S-RL2，其中各变量是独立地如上所定义和如本文所述。
以下描绘示例性式S-II双(硫代磺酸酯)试剂：
在一些实施方案中，硫化试剂是具有下式中的一个的化合物：
S8、Rs2-S-S-Rs3或Rs2-S-Xs-Rs3，
其中：
Rs2和Rs3各自独立地是选自以下的任选地取代的基团：脂族、氨基烷基、碳环基、杂环基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、酰基、酰胺、酰亚胺或硫羰基；或
Rs2和Rs3连同它们所结合的原子一起形成任选地取代的杂环或杂芳基环；
Xs是-S(O)2-、-O-或-N(R’)-；并且
R’是如以上以及本文中所定义和描述。
在一些实施方案中，硫化试剂是S8、 在一些实施方案中，硫化试剂是S8、在一些实施方案中，硫化试剂是
下表5中描绘示例性硫化试剂。
表5.示例性硫化试剂。
在一些实施方案中，提供的硫化试剂用于修饰H-膦酸酯。例如，在一些实施方案中，H-膦酸酯寡核苷酸是使用例如Wada I或Wada II的方法合成，并且是使用式S-I或S-II硫化试剂修饰：
其中Rs1、L和R1各自是如以上以及本文中所述和定义。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于合成硫代磷酸三酯的方法，其包括以下步骤：
i)使具有以下结构的H-膦酸酯：
其中W、Y和Z各自是如以上以及本文中所述和定义，与硅烷基化试剂反应以提供硅烷基氧基膦酸酯；以及
ii)使所述硅烷基氧基膦酸酯与具有结构S-I或S-II的硫化试剂：
反应以提供硫代磷酸三酯。
在一些实施方案中，替代硫化试剂使用硒亲电子试剂以引入对核苷酸间键联的修饰。在一些实施方案中，硒亲电子试剂是具有下式中的一个的化合物：
Se、Rs2-Se-Se-Rs3或Rs2-Se-Xs-Rs3，
其中：
Rs2和Rs3各自独立地是选自以下的任选地取代的基团：脂族、氨基烷基、碳环基、杂环基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、酰基、酰胺、酰亚胺或硫羰基；或
Rs2和Rs3连同它们所结合的原子一起形成任选地取代的杂环或杂芳基环；
Xs是-S(O)2-、-O-或-N(R’)-；并且
R’是如以上以及本文中所定义和描述。
在其它实施方案中，硒亲电子试剂是化合物Se、KSeCN、在一些实施方案中，硒亲电子试剂是Se或
在一些实施方案中，供根据本发明使用的硫化试剂的特征在于与单一硫原子(例如-S-或＝S)相反，在硫化期间转移至磷的部分是取代的硫(例如-SR)。
在一些实施方案中，供根据本发明使用的硫化试剂的特征在于试剂的活性可通过用某一吸电子或供电子基团修饰试剂来调谐。
在一些实施方案中，供根据本发明使用的硫化试剂的特征在于它是结晶的。在一些实施方案中，供根据本发明使用的硫化试剂的特征在于它具有高度结晶性。在某些实施方案中，供根据本发明使用的硫化试剂的特征在于试剂通过例如重结晶易于纯化。在某些实施方案中，供根据本发明使用的硫化试剂的特征在于它大致上不含含硫杂质。在一些实施方案中，大致上不含含硫杂质的硫化试剂显示效率增加。
在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸包含一个或多个磷酸二酯键联。为合成所述手性控制的寡核苷酸，一个或多个修饰步骤任选地被氧化步骤替换以安置相应磷酸二酯键联。在一些实施方案中，氧化步骤是以类似于普通寡核苷酸合成的方式进行。在一些实施方案中，氧化步骤包括使用I2。在一些实施方案中，氧化步骤包括使用I2和吡啶。在一些实施方案中，氧化步骤包括使用含0.02M I2的THF/吡啶/水(70∶20∶10-v/v/v)共溶剂系统。方案I-c中描绘示例性循环。
在一些实施方案中，硫代磷酸酯前体用于合成包含硫代磷酸酯键联的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述硫代磷酸酯前体是在一些实施方案中，在循环退出之后在标准脱保护/释放程序期间被转化成硫代磷酸二酯键联。以下进一步描绘实例。
在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸包含一个或多个磷酸二酯键联和一个或多个硫代磷酸二酯键联。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸包含一个或多个磷酸二酯键联和一个或多个硫代磷酸二酯键联，其中至少一个磷酸二酯键联是当自3’至5’合成时安置在所有硫代磷酸二酯键联之后。为合成所述手性控制的寡核苷酸，在一些实施方案中，一个或多个修饰步骤任选地被氧化步骤替换以安置相应磷酸二酯键联，并且安置各硫代磷酸二酯键联的硫代磷酸酯前体。在一些实施方案中，硫代磷酸酯前体是在达成所需寡核苷酸长度之后被转化成硫代磷酸二酯键联。在一些实施方案中，在循环期间或在循环退出之后的脱保护/释放步骤使硫代磷酸酯前体转化成硫代磷酸二酯键联。在一些实施方案中，硫代磷酸酯前体的特征在于它能够通过β-消除路径来移除。在一些实施方案中，硫代磷酸酯前体是如本领域普通技术人员所了解，在合成期间使用例如的硫代磷酸酯前体的一个益处是在某些条件下，比硫代磷酸酯更稳定。
在一些实施方案中，硫代磷酸酯前体是如本文所述的磷保护基，例如2-氰基乙基(CE或Cne)、2-三甲基硅烷基乙基、2-硝基乙基、2-磺酰基乙基、甲基、苯甲基、邻硝基苯甲基、2-(对硝基苯基)乙基(NPE或Npe)、2-苯基乙基、3-(N-叔丁基甲酰胺基)-1-丙基、4-氧代戊基、4-甲基硫基-1-丁基、2-氰基-1，1-二甲基乙基、4-N-甲基氨基丁基、3-(2-吡啶基)-1-丙基、2-[N-甲基-N-(2-吡啶基)]氨基乙基、2-(N-甲酰基，N-甲基)氨基乙基、4-[N-甲基-N-(2，2，2-三氟乙酰基)氨基]丁基。以下进一步描绘实例。
在本文中以及在实施例部分中描述用于合成所需硫化试剂的方法。
如上所指示，在一些实施方案中，硫化发生在自增长寡核苷酸裂解手性试剂的条件下。在一些实施方案中，硫化发生在不自增长寡核苷酸裂解手性试剂的条件下。
在一些实施方案中，将硫化试剂溶解于适合溶剂中，并递送至管柱中。在某些实施方案中，溶剂是极性非质子性溶剂，如腈溶剂。在一些实施方案中，溶剂是乙腈。在一些实施方案中，硫化试剂的溶液是通过在腈溶剂(例如乙腈)中混合硫化试剂(例如如本文所述的硫代磺酸酯衍生物)与BSTFA(N，O-双-三甲基硅烷基-三氟乙酰胺)来制备。在一些实施方案中，不包括BSTFA。例如，本发明人已发现反应性相对更大的通式Rs2-S-S(O)2-Rs3硫化试剂可常在不存在BSTFA下成功参与硫化反应。仅给出一个实例，发明人已证明当Rs2是对硝基苯基，并且Rs3是甲基时，那么不需要BSTFA。鉴于本公开，本领域技术人员将易于能够确定不需要BSTFA的其它情况和/或硫化试剂。
在一些实施方案中，硫化步骤是在室温下进行。在一些实施方案中，硫化步骤是在较低温度，如约0℃、约5℃、约10℃或约15℃下进行。在一些实施方案中，硫化步骤是在大于约20℃的高温下进行。
在一些实施方案中，操作硫化反应约1分钟至约120分钟。在一些实施方案中，操作硫化反应约1分钟至约90分钟。在一些实施方案中，操作硫化反应约1分钟至约60分钟。在一些实施方案中，操作硫化反应约1分钟至约30分钟。在一些实施方案中，操作硫化反应约1分钟至约25分钟。在一些实施方案中，操作硫化反应约1分钟至约20分钟。在一些实施方案中，操作硫化反应约1分钟至约15分钟。在一些实施方案中，操作硫化反应约1分钟至约10分钟。在一些实施方案中，操作硫化反应约5分钟至约60分钟。
在一些实施方案中，操作硫化反应约5分钟。在一些实施方案中，操作硫化反应约10分钟。在一些实施方案中，操作硫化反应约15分钟。在一些实施方案中，操作硫化反应约20分钟。在一些实施方案中，操作硫化反应约25分钟。在一些实施方案中，操作硫化反应约30分钟。在一些实施方案中，操作硫化反应约35分钟。在一些实施方案中，操作硫化反应约40分钟。在一些实施方案中，操作硫化反应约45分钟。在一些实施方案中，操作硫化反应约50分钟。在一些实施方案中，操作硫化反应约55分钟。在一些实施方案中，操作硫化反应约60分钟。
出乎意料地发现根据本发明方法制备的某些硫化修饰产物出乎意料地稳定。在一些实施方案中，出乎意料地稳定的产物是硫代磷酸三酯。在一些实施方案中，出乎意料地稳定的产物是包含一个或多个具有式I-c结构的核苷酸间键联的手性控制的寡核苷酸。
相关领域技术人员将认识到本文所述的硫化方法和本文所述的硫化试剂也适用于修饰H-膦酸酯寡核苷酸，如Wada II(WO2010/064146)中所述的那些的背景下。
在一些实施方案中，硫化反应具有的逐步硫化效率为至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，硫化反应提供纯度是至少98％的粗二核苷酸产物组合物。在一些实施方案中，硫化反应提供纯度是至少90％的粗四核苷酸产物组合物。在一些实施方案中，硫化反应提供纯度是至少70％的粗十二核苷酸产物组合物。在一些实施方案中，硫化反应提供纯度是至少50％的粗二十核苷酸产物组合物。
一旦修饰键联磷的步骤完成，寡核苷酸即经受另一去封闭步骤以为再进入循环做准备。在一些实施方案中，手性助剂在硫化之后保持完整，并且在随后去封闭步骤期间去封闭，所述去封闭步骤必须发生在再进入循环之前。重复去封闭、偶联、加帽和修饰的过程直至增长寡核苷酸达到所需长度，此时寡核苷酸可立刻自固体载体裂解，或出于纯化目的保持连接于载体并稍后裂解。在一些实施方案中，一个或多个保护基存在于一个或多个核苷酸碱基上，并且自载体裂解寡核苷酸以及将碱基脱保护发生在单一步骤中。在一些实施方案中，一个或多个保护基存在于一个或多个核苷酸碱基上，并且自载体裂解寡核苷酸以及将碱基脱保护发生在一个以上步骤中。在一些实施方案中，脱保护以及自载体裂解发生在使用例如一种或多种胺碱的碱性条件下。在某些实施方案中，所述一种或多种胺碱包括丙胺。在某些实施方案中，一种或多种胺碱包括吡啶。
在一些实施方案中，自载体裂解和/或脱保护发生在约30℃至约90℃的高温下。在一些实施方案中，自载体裂解和/或脱保护发生在约40℃至约80℃的高温下。在一些实施方案中，自载体裂解和/或脱保护发生在约50℃至约70℃的高温下。在一些实施方案中，自载体裂解和/或脱保护发生在约60℃的高温下。在一些实施方案中，自载体裂解和/或脱保护发生在环境温度下。
本文描述和/或相关领域中通常已知示例性纯化程序。
值得注意的是，在各循环期间自增长寡核苷酸移除手性助剂至少因以下原因而有益：(1)当在磷上安置潜在敏感性官能团时，助剂将不必在寡核苷酸合成结束时在单独步骤中移除；以及(2)倾向于经受副反应和/或受随后化学过程干扰的不稳定磷-助剂中间体得以避免。因此，在各循环期间移除手性助剂使得总合成更高效。
尽管以上描述在循环的背景下的去封闭步骤，但以下包括其它一般性方法。
去封闭步骤
在一些实施方案中，偶联步骤之前是去封闭步骤。例如，在一些实施方案中，增长寡核苷酸的5’羟基被封闭(即受保护)，并且必须被去封闭以随后与核苷偶联搭配物反应。
在一些实施方案中，酸化用于移除封闭基团。在一些实施方案中，酸是布仑斯特酸或路易斯(Lewis)酸。适用布仑斯特酸是在有机溶剂或水(在80％乙酸的情况下)中，具有pKa(25℃，在水中)值-0.6(三氟乙酸)至4.76(乙酸)的羧酸、烷基磺酸、芳基磺酸、磷酸和它的衍生物、膦酸和它的衍生物、烷基膦酸和它们的衍生物、芳基膦酸和它们的衍生物、次膦酸、二烷基次膦酸和二芳基次膦酸。酸化步骤中使用的酸浓度(1至80％)取决于酸的酸性。必须考虑酸强度，因为强酸条件将导致脱嘌呤/脱嘧啶，其中嘌呤基或嘧啶基碱基自核糖环和/或其它糖环裂解。在一些实施方案中，酸选自Ra1COOH、Ra1SO3H、Ra3SO3H、其中Ra1和Ra2各自独立地是氢或任选地取代的烷基或芳基，并且Ra3是任选地取代的烷基或芳基。
在一些实施方案中，酸化是通过路易斯酸在有机溶剂中达成。示例性所述适用路易斯酸是Zn(Xa)2，其中Xa是Cl、Br、I或CF3SO3。
在一些实施方案中，酸化步骤包括添加自缩合的中间体有效移除封闭基团而不移除嘌呤部分的一定量的布仑斯特酸或路易斯酸。
适用于酸化步骤中的酸也包括但不限于于有机溶剂中的10％磷酸、于有机溶剂中的10％盐酸、于有机溶剂中的1％三氟乙酸、于有机溶剂中的3％二氯乙酸或三氯乙酸或于水中的80％乙酸。选择这个步骤中使用的任何布仑斯特酸或路易斯酸的浓度以使酸浓度不超过导致自糖部分裂解核苷碱基的浓度。
在一些实施方案中，酸化包括添加于有机溶剂中的1％三氟乙酸。在一些实施方案中，酸化包括添加于有机溶剂中的约0.1％至约8％三氟乙酸。在一些实施方案中，酸化包括添加于有机溶剂中的3％二氯乙酸或三氯乙酸。在一些实施方案中，酸化包括添加于有机溶剂中的约0.1％至约10％二氯乙酸或三氯乙酸。在一些实施方案中，酸化包括添加于有机溶剂中的3％三氯乙酸。在一些实施方案中，酸化包括添加于有机溶剂中的约0.1％至约10％三氯乙酸。在一些实施方案中，酸化包括添加于水中的80％乙酸。在一些实施方案中，酸化包括添加于水中的约50％至约90％、或约50％至约80％、约50％至约70％、约50％至约60％、约70％至约90％乙酸。在一些实施方案中，酸化包括进一步添加阳离子清除剂至酸性溶剂中。在某些实施方案中，阳离子清除剂可为三乙基硅烷或三异丙基硅烷。在一些实施方案中，封闭基团是通过包括添加于有机溶剂中的1％三氟乙酸的酸化来去封闭。在一些实施方案中，封闭基团是通过包括添加于有机溶剂中的3％二氯乙酸的酸化来去封闭。在一些实施方案中，封闭基团是通过包括添加于有机溶剂中的3％三氯乙酸的酸化来去封闭。在一些实施方案中，封闭基团是通过包括添加于二氯甲烷中的3％三氯乙酸的酸化来去封闭。
在某些实施方案中，本发明方法是在合成仪上完成，并且将增长寡核苷酸的羟基去封闭的步骤包括递送一定量的溶剂至合成仪管柱中，所述管柱含有寡核苷酸所连接的固体载体。在一些实施方案中，溶剂是卤素化溶剂(例如二氯甲烷)。在某些实施方案中，溶剂包含一定量的酸。在一些实施方案中，溶剂包含一定量的有机酸，例如像三氯乙酸。在某些实施方案中，酸是以约1％至约20w/v％的量存在。在某些实施方案中，酸是以约1％至约10w/v％的量存在。在某些实施方案中，酸是以约1％至约5w/v％的量存在。在某些实施方案中，酸是以约1至约3w/v％的量存在。在某些实施方案中，酸是以约3w/v％的量存在。本文进一步描述用于将羟基去封闭的方法。在一些实施方案中，酸是以3w/v％存在于二氯甲烷中。
在一些实施方案中，手性助剂是在去封闭步骤之前移除。在一些实施方案中，手性助剂是在去封闭步骤期间移除。
在一些实施方案中，循环退出是在去封闭步骤之前进行。在一些实施方案中，循环退出是在去封闭步骤之后进行。
用于移除封闭基团/保护基的一般性条件
位于核苷碱基或糖部分上的官能团(如羟基或氨基部分)通常是在合成期间用封闭(保护)基团(部分)封闭，并且随后去封闭。一般来说，封闭基团致使分子的化学官能基对特定反应条件呈惰性，并且可稍后自分子中的所述官能基移除而不实质上损害分子的其余部分(参见例如Green和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第2版，John Wiley & Sons，New York，1991)。例如，氨基可用氮封闭基团封闭，所述封闭基团如苯二甲酰亚氨基、9-芴基甲氧基羰基(FMOC)、三苯基甲基亚磺酰基、t-BOC、4，4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)、4-甲氧基三苯甲基(MMTr)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)、三苯甲基(Tr)或9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。羧基可被保护为乙酰基。羟基可被保护，如四氢吡喃基(THP)、叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)、1-[(2-氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基(Ctmp)、1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(Fpmp)、1-(2-氯乙氧基)乙基、3-甲氧基-1，5-二甲氧甲酰基戊-3-基(MDP)、双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、三异丙基硅烷基氧基甲基(TOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)、[4-(N-二氯乙酰基-N-甲基氨基)苯甲基氧基]甲基、2-氰基乙基(CN)、特戊酰基氧基甲基(PivOM)、乙酰丙酰基氧基甲基(ALE)。已描述其它代表性羟基封闭基团(参见例如Beaucage等，Tetrahedron，1992，46，2223)。在一些实施方案中，羟基封闭基团是酸不稳定性基团，如三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。化学官能团也可通过以前体形式包括它们来封闭。因此，叠氮基可被视为胺的封闭形式，因为叠氮基易于转化成胺。核酸合成中利用的其它代表性保护基是已知的(参见例如Agrawal等编，Protocols forOligonucleotide Conjugates，Humana Press，New Jersey，1994，第26卷，第1-72页)。
各种方法是已知的，并且用于自核酸移除封闭基团。在一些实施方案中，移除所有封闭基团。在一些实施方案中，移除一部分封闭基团。在一些实施方案中，可调整反应条件以选择性移除某些封闭基团。
在一些实施方案中，如果存在，那么核苷碱基封闭基团可在提供的寡核苷酸装配之后用酸性试剂裂解。在某一实施方案中，如果存在，那么核苷碱基封闭基团可在既不是酸性，也不是碱性的条件下裂解，例如可用氟化物盐或氢氟酸络合物裂解。在一些实施方案中，如果存在，那么核苷碱基封闭基团可在提供的寡核苷酸装配之后在碱或碱性溶剂存在下裂解。在某些实施方案中，一个或多个核苷碱基封闭基团的特征在于它们可在提供的寡核苷酸装配之后在碱或碱性溶剂存在下裂解，但对在提供的寡核苷酸装配期间发生的一个或多个早先脱保护步骤的特定条件稳定。
在一些实施方案中，不需要核苷碱基的封闭基团。在一些实施方案中，需要核苷碱基的封闭基团。在一些实施方案中，某些核苷碱基需要一个或多个封闭基团，而其它核苷碱基不需要一个或多个封闭基团。
在一些实施方案中，寡核苷酸是在合成之后自固体载体裂解。在一些实施方案中，自固体载体裂解包括使用丙胺。在一些实施方案中，自固体载体裂解包括使用于吡啶中的丙胺。在一些实施方案中，自固体载体裂解包括使用于吡啶中的20％丙胺。在一些实施方案中，自固体载体裂解包括使用于无水吡啶中的丙胺。在一些实施方案中，自固体载体裂解包括使用于无水吡啶中的20％丙胺。在一些实施方案中，自固体载体裂解包括使用极性非质子性溶剂，如乙腈、NMP、DMSO、砜和/或二甲基吡啶。在一些实施方案中，自固体载体裂解包括使用溶剂(例如极性非质子性溶剂)和一种或多种伯胺(例如C1-10胺)、和/或甲氧基胺、肼和纯无水氨中的一个或多个。
在一些实施方案中，将寡核苷酸脱保护包括使用丙胺。在一些实施方案中，将寡核苷酸脱保护包括使用于吡啶中的丙胺。在一些实施方案中，将寡核苷酸脱保护包括使用于吡啶中的20％丙胺。在一些实施方案中，将寡核苷酸脱保护包括使用于无水吡啶中的丙胺。在一些实施方案中，将寡核苷酸脱保护包括使用于无水吡啶中的20％丙胺。
在一些实施方案中，寡核苷酸是在裂解期间脱保护。
在一些实施方案中，自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是在约室温下进行。在一些实施方案中，自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是在高温下进行。在一些实施方案中，自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是在高于约30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃或100℃下进行。在一些实施方案中，自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是在约30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃或100℃下进行。在一些实施方案中，自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是在约40-80℃下进行。在一些实施方案中，自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是在约50-70℃下进行。在一些实施方案中，自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是在约60℃下进行。
在一些实施方案中，进行自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护超过0.1小时、1小时、2小时、5小时、10小时、15小时、20小时、24小时、30小时或40小时。在一些实施方案中，进行自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约0.1-5小时。在一些实施方案中，进行自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约3-10小时。在一些实施方案中，进行自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约5-15小时。在一些实施方案中，进行自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约10-20小时。在一些实施方案中，进行自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约15-25小时。在一些实施方案中，进行自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约20-40小时。在一些实施方案中，进行自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约2小时。在一些实施方案中，进行自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约5小时。在一些实施方案中，进行自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约10小时。在一些实施方案中，进行自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约15小时。在一些实施方案中，进行自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约18小时。在一些实施方案中，进行自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护约24小时。
在一些实施方案中，自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是在室温下进行超过0.1小时、1小时、2小时、5小时、10小时、15小时、20小时、24小时、30小时或40小时。在一些实施方案中，自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是在室温下进行约5-48小时。在一些实施方案中，自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是在室温下进行约10-24小时。在一些实施方案中，自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是在室温下进行约18小时。在一些实施方案中，自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是在高温下进行超过0.1小时、1小时、2小时、5小时、10小时、15小时、20小时、24小时、30小时或40小时。在一些实施方案中，自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是在高温下进行约0.5-5小时。在一些实施方案中，自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是在约60℃下进行约0.5-5小时。在一些实施方案中，自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护是在约60℃下进行约2小时。
在一些实施方案中，自固体载体裂解寡核苷酸或将寡核苷酸脱保护包括使用丙胺，并且在室温或高温下进行超过0.1小时、1小时、2小时、5小时、10小时、15小时、20小时、24小时、30小时或40小时。示例性条件是于吡啶中的20％丙胺在室温下约18小时，以及于吡啶中的20％丙胺在60℃下约18小时。
在一些实施方案中，本发明提供用于制备手性控制的寡核苷酸的方法，其包括以下步骤：
(1)偶联；
(2)加帽；
(3)修饰；
(4)去封闭；以及
(5)重复步骤(1)-(4)直至达成所需长度；
其中所述手性控制的寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸二酯键联或至少一个具有式I-c结构的核苷酸间键联。
在一些实施方案中，本发明提供用于制备手性控制的寡核苷酸的方法，其包括以下步骤：
(1)偶联；
(2)加帽；
(3)修饰；
(4)去封闭；以及
(5)重复步骤(1)-(4)直至达成所需长度；
其中：
(1)至(4)的至少一个循环形成硫代磷酸二酯键联。
在一些实施方案中，本发明提供用于制备手性控制的寡核苷酸的方法，其包括以下步骤：
(1)偶联；
(2)加帽；
(3)修饰；
(4)去封闭；以及
(5)重复步骤(1)-(4)直至达成所需长度；
其中：
(1)至(4)的至少一个循环形成具有式I-c结构的核苷酸间键联。
在一些实施方案中，本发明提供用于制备手性控制的寡核苷酸的方法，其包括以下步骤：
(1)偶联；
(2)加帽；
(3)修饰；
(4)去封闭；以及
(5)重复步骤(1)-(4)直至达成所需长度；
其中：
所述偶联步骤包括使用活化基团和 其中BPRO是受保护的核苷碱基；
所述加帽步骤包括对手性助剂中的氨基加帽以及对未反应的5’-OH加帽；
所述修饰步骤包括将-S-L-R1基团安置于键联磷，其中L和R1各自是独立地如上所定义和如本文所述；
所述去封闭步骤包括使用酸。
在一些实施方案中，本发明提供用于制备手性控制的寡核苷酸的方法，其包括以下步骤：
(1)偶联；
(2)加帽；
(3)修饰；
(4)去封闭；以及
(5)重复步骤(1)-(4)直至达成所需长度；
其中：
所述偶联步骤包括使用CMPT和 其中BPRO是受保护的核苷碱基；
所述加帽步骤包括对手性助剂中的氨基加帽以及对未反应的5’-OH加帽；
所述修饰步骤包括将-S-L-R1基团安置于键联磷，其中L和R1各自是独立地如上所定义和如本文所述；
所述去封闭步骤包括使用酸。
在一些实施方案中，活化剂是“Wada”活化剂，即所述活化剂来自以上引用的Wada I、II或III文件中的任一个。
以下描绘示例性活化基团：
方案I-b中描绘示例性循环。
方案I-b.安置硫代磷酸酯键联。
在一些实施方案中，本发明提供用于制备手性控制的寡核苷酸的方法，其包括以下步骤：
(1)偶联；
(2)加帽；
(3)修饰；
(4)去封闭；以及
(5)重复步骤(1)-(4)直至达成所需长度；
其中：
所述手性控制的寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸二酯键联或至少一个式I-c核苷酸间键联和至少一个磷酸二酯核苷酸间键联；并且
至少一个修饰步骤被氧化步骤替换。
在一些实施方案中，本发明提供用于制备手性控制的寡核苷酸的方法，其包括以下步骤：
(1)偶联；
(2)加帽；
(3)修饰；
(4)去封闭；以及
(5)重复步骤(1)-(4)直至达成所需长度；
其中：
所述手性控制的寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸二酯键联或至少一个式I-c核苷酸间键联和至少一个磷酸二酯核苷酸间键联；并且
至少一个修饰步骤被包括使用I2的氧化步骤替换。
方案I-c中说明一示例性循环。
方案I-c.在手性控制的寡核苷酸中安置磷酸二酯键联与修饰的核苷酸间键联两者。
在方案I-c中，使固体载体上的寡核苷酸(或核苷酸或具有修饰的核苷酸间键联的寡核苷酸)(C-1)与亚磷酰胺C-2偶联。在偶联和加帽之后，进行氧化步骤。在去封闭之后，形成磷酸二酯键联。循环产物C-3可再进入循环C以安置更多磷酸二酯键联，或进入其它循环以安置其它类型的核苷酸间键联，或去到循环出口。
在一些实施方案中，在方案I-c中，可替代C-2使用非手性纯亚磷酰胺。在一些实施方案中，使用用DMTr保护的β-氰基乙基亚磷酰胺。在一些实施方案中，所用亚磷酰胺具有结构
在一些实施方案中，本发明提供用于制备手性控制的寡核苷酸的方法，其包括以下步骤：
(1)偶联；
(2)加帽；
(3)修饰；
(4)去封闭；以及
(5)重复步骤(1)-(4)直至达成所需长度；
其中：
所述手性控制的寡核苷酸包含一个或多个硫代磷酸二酯键联；并且
针对各相应硫代磷酸二酯键联，形成一种或多种硫代磷酸二酯前体。
在一些实施方案中，本发明提供用于制备手性控制的寡核苷酸的方法，其包括以下步骤：
(1)偶联；
(2)加帽；
(3)修饰；
(4)去封闭；以及
(5)重复步骤(1)-(4)直至达成所需长度；
其中：
所述手性控制的寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸二酯键联；
针对各相应硫代磷酸二酯键联，形成一种或多种硫代磷酸二酯前体；并且
在达成所需长度之后，各硫代磷酸二酯前体转化成硫代磷酸二酯键联。
在一些实施方案中，本发明提供用于制备手性控制的寡核苷酸的方法，其包括以下步骤：
(1)偶联；
(2)加帽；
(3)修饰；
(4)去封闭；以及
(5)重复步骤(1)-(4)直至达成所需长度；
其中：
所述手性控制的寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸二酯键联和至少一个磷酸二酯核苷酸间键联；
至少一个修饰步骤被氧化步骤替换；并且
进行至少一个修饰步骤以安置各硫代磷酸二酯键联的硫代磷酸二酯前体；并且
在达成所需长度之后，各硫代磷酸二酯前体转化成硫代磷酸二酯键联。
在一些实施方案中，使用硫代磷酸二酯前体会增加寡核苷酸在合成期间的稳定性。在一些实施方案中，使用硫代磷酸二酯前体会改进手性控制的寡核苷酸合成的效率。在一些实施方案中，使用硫代磷酸二酯前体会改进手性控制的寡核苷酸合成的产率。在一些实施方案中，使用硫代磷酸二酯前体会改进手性控制的寡核苷酸合成的产物纯度。
在一些实施方案中，以上提及的方法中的硫代磷酸二酯前体是在一些实施方案中，是在脱保护/释放期间转化成硫代磷酸二酯键联。方案I-d中描绘示例性循环。以下描绘更多实例。
方案I-d.手性控制的寡核苷酸合成中的硫代磷酸二酯前体。
如方案I-d中所说明，硫代磷酸酯键联与磷酸二酯键联两者均可并入同一手性控制的寡核苷酸中。如本领域普通技术人员所了解，提供的方法不需要硫代磷酸二酯和磷酸二酯是连续的-使用如上所述的循环，在它们之间可形成其它核苷酸间键联。在方案I-d中，替代硫代磷酸二酯键联安置硫代磷酸二酯前体在一些实施方案中，所述替代提供在某些步骤，例如氧化步骤期间的增加的合成效率。在一些实施方案中，使用硫代磷酸二酯前体通常会改进手性控制的寡核苷酸在合成和/或储存期间的稳定性。在循环退出之后，在脱保护/释放期间，硫代磷酸二酯前体转化成硫代磷酸二酯键联。在一些实施方案中，使用硫代磷酸二酯前体是有益的，甚至当磷酸二酯键联不存在于手性控制的寡核苷酸中，或在合成期间不需要氧化步骤时。
如方案I-c中，在一些实施方案中，非手性纯亚磷酰胺可用于包含氧化步骤的循环。在一些实施方案中，使用用DMTr保护的β-氰基乙基亚磷酰胺。在一些实施方案中，所用亚磷酰胺具有结构
在一些实施方案中，本发明方法提供富含特定寡核苷酸类型的手性控制的寡核苷酸组合物。
在一些实施方案中，至少约10％的提供的粗组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约20％的提供的粗组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约30％的提供的粗组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约40％的提供的粗组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约50％的提供的粗组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约60％的提供的粗组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约70％的提供的粗组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约80％的提供的粗组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约90％的提供的粗组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约95％的提供的粗组合物具有特定寡核苷酸类型。
在一些实施方案中，至少约1％的提供的组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约2％的提供的组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约3％的提供的组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约4％的提供的组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约5％的提供的组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约10％的提供的组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约20％的提供的组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约30％的提供的组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约40％的提供的组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约50％的提供的组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约60％的提供的组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约70％的提供的组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约80％的提供的组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约90％的提供的组合物具有特定寡核苷酸类型。在一些实施方案中，至少约95％的提供的组合物具有特定寡核苷酸类型。
生物应用
如本文详细讨论，本发明尤其提供一种手性控制的寡核苷酸组合物，这是指所述组合物含有多个至少一种类型的寡核苷酸。特定“类型”的各寡核苷酸分子包含预先选择的(例如预定的)关于以下的结构元件：(1)碱基序列；(2)骨架键联样式；(3)骨架手性中心样式；和(4)骨架P修饰部分样式。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸组合物含有在单一合成过程中制备的寡核苷酸。在一些实施方案中，提供的组合物含有在单一寡核苷酸分子内具有一种以上手性构型的寡核苷酸(例如其中沿寡核苷酸的不同残基具有不同立体化学)；在一些所述实施方案中，所述寡核苷酸可在单一合成过程中获得，而无需次级缀合步骤来产生具有一种以上手性构型的个别寡核苷酸分子。
如本文提供的寡核苷酸组合物可用作用于调节许多细胞过程和机构，包括但不限于转录、翻译、免疫反应、表观遗传等的试剂。此外，如本文提供的寡核苷酸组合物可出于研究和/或诊断目的用作试剂。本领域普通技术人员将易于认识到本文中的本发明公开内容不限于特定用途，而是可适用于其中使用合成寡核苷酸是合乎需要的任何情况。提供的组合物尤其适用于多种治疗、诊断、农业和/或研究应用中。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸组合物包含包括一种或多种如本文详述的结构修饰的寡核苷酸和/或其残基。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸组合物包含含有一种或多种核酸类似物的寡核苷酸。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸组合物包含含有一种或多种包括但不限于以下的人工核酸或残基的寡核苷酸：肽核酸(PNA)、吗啉代寡核苷酸和锁定核酸(LNA)、糖基核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、异核酸(ZNA)及其任何组合。
在任何实施方案中，本发明适用于基于寡核苷酸来调节基因表达、免疫反应等。因此，本发明的含有预定类型的寡核苷酸(即其是手性控制的，并且任选地是手性纯的)的立体确定的寡核苷酸组合物可替代常规立体无规或手性不纯对应物加以使用。在一些实施方案中，提供的组合物显示预定作用增强和/或非所要副作用降低。以下明确讨论本发明的生物和临床/治疗应用的某些实施方案。
各种给药方案可用于施用提供的手性控制的寡核苷酸组合物。在一些实施方案中，施用多个相隔各种时期的单位剂量。在一些实施方案中，给定组合物具有推荐的给药方案，其可涉及一个或多个剂量。在一些实施方案中，给药方案包括多个剂量，其各自彼此相隔时长相同的时期；在一些实施方案中，给药方案包括多个剂量，并且个别剂量相隔至少两种不同时期。在一些实施方案中，给药方案内的所有剂量都具有相同单位给药量。在一些实施方案中，给药方案内的不同剂量具有不同量。在一些实施方案中，给药方案包括以第一给药量施用的第一剂量，继之以一个或多个以不同于所述第一给药量的第二给药量施用的其它剂量。在一些实施方案中，给药方案包括以第一给药量施用的第一剂量，继之以一个或多个以与所述第一给药(或另一先前给药)量相同或不同的第二(或随后)给药量施用的其它剂量。在一些实施方案中，给药方案包括施用至少一个单位剂量至少一天。在一些实施方案中，给药方案包括历经至少一天，并且有时超过一天的时期施用一个以上剂量。在一些实施方案中，给药方案包括历经至少一周的时期施用多个剂量。在一些实施方案中，时期是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、2324、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40周或40周以上(例如约45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100周或100周以上)。在一些实施方案中，给药方案包括每周施用一个剂量，持续一周以上。在一些实施方案中，给药方案包括每周施用一个剂量，持续2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、2324、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40周或40周以上(例如约45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100周或100周以上)。在一些实施方案中，给药方案包括每两周施用一个剂量，持续两周时期以上。在一些实施方案中，给药方案包括每两周施用一个剂量，历经2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、2324、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40周或40周以上(例如约45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100周或100周以上)的时期。在一些实施方案中，给药方案包括每个月施用一个剂量，持续一个月。在一些实施方案中，给药方案包括每个月施用一个剂量，持续一个月以上。在一些实施方案中，给药方案包括每个月施用一个剂量，持续2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或12个月以上。在一些实施方案中，给药方案包括每周施用一个剂量，持续约10周。在一些实施方案中，给药方案包括每周施用一个剂量，持续约20周。在一些实施方案中，给药方案包括每周施用一个剂量，持续约30周。在一些实施方案中，给药方案包括每周施用一个剂量，持续26周。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸组合物是根据不同于用于具有相同序列的未手性控制的(例如立体无规的)寡核苷酸组合物和/或具有相同序列的不同手性控制的寡核苷酸组合物的给药方案的给药方案施用。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸组合物是根据相较于具有相同序列的未手性控制的(例如立体无规的)寡核苷酸组合物的给药方案减量的给药方案施用，因为它历经给定时间单位达成较低总暴露水平，涉及一个或多个较低单位剂量，和/或历经给定时间单位包括较小数目的剂量。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸组合物是根据延续的时期长于具有相同序列的未手性控制的(例如立体无规的)寡核苷酸组合物的给药方案所延续的时期的给药方案施用。在不希望受理论限制下，申请人注意到在一些实施方案中，较短给药方案和/或各剂量之间的较长时期可归因于手性控制的寡核苷酸组合物的稳定性、生物可用度和/或功效改进。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸组合物相较于相应未手性控制的寡核苷酸组合物具有较长给药方案。在一些实施方案中，相较于相应未手性控制的寡核苷酸组合物，手性控制的寡核苷酸组合物在至少两个剂量之间的时期较短。在不希望受理论限制下，申请人注意到在一些实施方案中，较长给药方案和/或各剂量之间的较短时期可归因于手性控制的寡核苷酸组合物的安全性改进。
单次剂量可含有如由应用所需的合适的各种量的某一类型的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方案中，单次剂量含有约1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300mg或300mg以上(例如约350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000mg或1000mg以上)某一类型的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方案中，单次剂量含有约1mg某一类型的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方案中，单次剂量含有约5mg某一类型的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方案中，单次剂量含有约10mg某一类型的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方案中，单次剂量含有约15mg某一类型的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方案中，单次剂量含有约20mg某一类型的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方案中，单次剂量含有约50mg某一类型的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方案中，单次剂量含有约100mg某一类型的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方案中，单次剂量含有约150mg某一类型的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方案中，单次剂量含有约200mg某一类型的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方案中，单次剂量含有约250mg某一类型的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方案中，单次剂量含有约300mg某一类型的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸是以单次剂量和/或以总剂量在低于未手性控制的寡核苷酸的量下施用。在一些实施方案中，由于功效改进，手性控制的寡核苷酸是以单次剂量和/或以总剂量在低于未手性控制的寡核苷酸的量下施用。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸是以单次剂量和/或以总剂量在高于未手性控制的寡核苷酸的量下施用。在一些实施方案中，归因于安全性改进，手性控制的寡核苷酸是以单次剂量和/或以总剂量在高于未手性控制的寡核苷酸的量下施用。
生物活性寡核苷酸
如本文所用的提供的寡核苷酸组合物可包含单链和/或多链寡核苷酸。在一些实施方案中，单链寡核苷酸含有可在相关条件下杂交以使如所用，甚至单链寡核苷酸也可具有至少部分双链特征的自身互补部分。在一些实施方案中，提供的组合物中包括的寡核苷酸是单链、双链或三链。在一些实施方案中，提供的组合物中包括的寡核苷酸在寡核苷酸内包含单链部分和多链部分。在一些实施方案中，如上所指示，个别单链寡核苷酸可具有双链区域和单链区域。
在一些实施方案中，提供的组合物包括一种或多种完全或部分互补于以下各物的链的寡核苷酸：结构基因、基因控制和/或终止区域、和/或自我复制系统，如病毒或质粒DNA。在一些实施方案中，提供的组合物包括一种或多种是或充当以下的寡核苷酸：siRNA或其它RNA干扰试剂(RNAi剂或iRNA剂)、shRNA、反义寡核苷酸、自我裂解RNA、核糖酶、其片段和/或其变体(如肽基转移酶23S rRNA、RNA酶P、I组和II组内含子、GIR1分支核糖酶、先导酶、发夹核糖酶、锤头核糖酶、HDV核糖酶、哺乳动物CPEB3核糖酶、VS核糖酶、glmS核糖酶、CoTC核糖酶等)、微小RNA、微小RNA模拟物、超级微小RNA、适体、反义微小RNA、微小RNA拮抗剂、Ul衔接头、成三链体寡核苷酸、RNA活化剂、长非编码RNA、短非编码RNA(例如piRNA)、免疫调节性寡核苷酸(如免疫刺激性寡核苷酸、免疫抑制性寡核苷酸)、GNA、LNA、ENA、PNA、TNA、吗啉代寡核苷酸、G四链体(RNA和DNA)、抗病毒寡核苷酸和诱饵寡核苷酸。
在一些实施方案中，提供的组合物包括一种或多种杂交(例如嵌合)寡核苷酸。在本公开的背景下，术语“杂交物”广泛指代寡核苷酸的混合结构组分。杂交寡核苷酸可指例如(1)在单一分子内具有混合类别的核苷酸，例如部分DNA和部分RNA的寡核苷酸分子(例如DNA-RNA)；(2)不同类别的核酸的互补对，以使DNA：RNA碱基配对发生在分子内或分子间；或两者；(3)具有两个或更多个种类的骨架或核苷酸间键联的寡核苷酸。
在一些实施方案中，提供的组合物包括一种或多种在单一分子内包含一个以上类别的核酸残基的寡核苷酸。例如，在本文所述的任何实施方案中，寡核苷酸可包含DNA部分和RNA部分。在一些实施方案中，寡核苷酸可包含未修饰的部分和修饰的部分。
提供的寡核苷酸组合物可包括含有例如如本文所述的多种修饰中的任一个的寡核苷酸。在一些实施方案中，例如根据预定用途来选择特定修饰。在一些实施方案中，合乎需要的是修饰双链寡核苷酸(或单链寡核苷酸的双链部分)的一个或两个链。在一些实施方案中，两个链(或部分)包括不同修饰。在一些实施方案中，两个链包括相同修饰。本领域技术人员将了解由本发明方法所能够达成的修饰程度和类型允许进行众多修饰排列。本文描述示例性所述修饰，并且不旨在具有限制性。
RNA干扰
提供的寡核苷酸组合物尤其适用于在RNA干扰方面的应用。
RNA干扰(RNAi)是指由RNA分子抑制基因表达。通常，这些是小双链RNA分子。因为基因表达控制大多数细胞过程，所以能够抑制基因表达提供一种用于调节生物状况，包括治疗人和/或动物(例如家畜或宠物)疾病的潜在强力工具。已进行许多研究来证明RNAi在调控或控制疾病相关的基因表达方面的用途。参见例如：Cullen，K.A.，Hall，M.J.和Golosinskiv，A.Ambulatory surgery in the United States，2006.Natl Health Stat Report 2009；1-25；Elbashir S，Harborth J，Lendeckel W，Yalcin A，Weber K，Tuschl T.Duplexes of 21-nucleotideRNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.Nature2001；411：494-498；Fire A，Xu S，Montgomery MK，Kostas SA，DriveriSE和Mello C.Potent and specific RNA interference by double-strandedRNA in Caenorhadbditis elegans.Nature 1998；391(6669)：806-811；Gauglitz，G.G.，Kortin，H.C.，Pavicic，T.，Ruzicka，T.和Jeschke，M.G.Hypertrophic scarring and keloids：pathomechanisms and currentemerging treatment strategies.MolMed 2011；17(1-2)：113-125；Li-Tsang，C.W.，Lau，J.C.和Chan，C.C.Prevalence of hypertrophic scarformation and its characteristics among the Chinese population.Burns2005；31，610-616；Wang H，Ghosh A，Baigude H，Yang C，Qui L，Xia L等Therapeutic gene silencing delivered by a chemically modifiedsiRNA against mutant SOD1 sloWs ALS progression.JBC 2008；283(23)：15845-15852；Weiser，T.G.，Regenbogen，S.E.，Thompson，K.D.，Haynes，A.B.，Lipsitz，S.R.，Berry，W.R.和Gawande，A.A.An estimationof the global volume of surgery：a modeling strategy based on availabledata.Lancet 2008；372(9633)：139-44。
RNA干扰的现象最初证明于秀丽隐杆线虫(C.elegans)中，其中注射dsRNA分子抑制互补基因表达。尽管使用siRNA已成为一种用于下调基因表达的广泛使用的工具，但已充分描述真核生物中存在天然存在的路径。内源性siRNA(或miRNA)的来源可为转座子、病毒、重复序列和基因。产生有效内源性siRNA的过程受三种酶调控。RNA依赖性RNA聚合酶使单链RNA转化成双链RNA。或者，DNA依赖性RNA聚合酶通过转录反向DNA重复序列来产生dsRNA。所得大RNA分子经受由核糖核酸酶III(Dicer)消化以产生短双链siRNA分子。接着需要Argonaute蛋白来结合siRNA分子以形成称为RISC(RNA诱导的沉默复合物)的复合物。RISC识别双链RNA片段，并且将双链分裂开，从而保留RISC复合物中的一个链。RISC可接着通过RNA引导的DNA甲基化或通过靶标RNA裂解来促进表观遗传沉默。尽管蛋白质翻译可被显著敲低，但siRNA通常不完全消除基因靶标的表达。因此，RISC可帮助RNA的引导链结合并破坏它的相应细胞信使RNA靶标。因此，RNAi提供一种潜在阻断导致疾病的蛋白质的产生的方法。
siRNA技术代表一种适用分子工具。使用RNA干扰来人工操纵基因表达最初受细胞抗病毒机制的活化限制。细胞暴露于长于30个核苷酸的序列已显示会诱导干扰素基因表达，从而导致非特异性RNA降解和蛋白质合成降低。然而，这个问题可通过设计短(例如19至22个核苷酸)siRNA序列来规避。用于将siRNA递送至细胞中的方法包括但不限于基于脂质体来添加纯化核糖核苷酸至培养基中，或转染被设计来表达siRNA分子的质粒载体。质粒载体依赖于使用两种RNA聚合酶III启动子(U6和H1)来驱动siRNA分子的转录。靶标序列(19至29个核苷酸)是以与在之间(短发夹RNA或shRNA)的小间隔子基团成有义和反义定向来放置。一旦转录，即形成可由Dicer识别和裂解的发夹结构。或者，RNA双链体可在无发夹结构下转录，并且由RISC直接处理。当前，存在利用类似概念来产生siRNA、shRNA或单链siRNA(ss-siRNA)分子的多种质粒和病毒载体(参见例如2012Cell-150-883Walt Lima等ssRNAi activate RNAi in animals)。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸或寡核苷酸组合物适用作ss-siRNA或GalNAc缀合的siRNA。
本领域熟识影响siRNA作为工具的某些结构特征。在发现siRNA之后，若干研究试图鉴定为siRNA设计所需的最优特征。一些要求包括使用短于30个核苷酸的序列以避免PKR活化；相对于3′末端，在反义链的5′末端具有序列稳定性；以及插入TT突出部分。基于像这些的研究，许多算法已由学术和工业实验室开发来预测给定基因的最有效靶标序列。尽管这些程序中的大多数并不完美，但获得预测序列的可能性优于在不考虑推荐的特征下设计序列。可需要合成和测试多个序列。siRNA实验设计可含有一些潜在缺陷，因此设计应被进行来包括适当对照和可测量终点。阴性对照可包括热力学性质类似于有效siRNA序列的非互补序列。当转染质粒载体以引入siRNA或shRNA时，脂质与核酸的比率可相等，并且对照载体可含有在细胞内转录和加工的序列。也可通过测量RNA表达与蛋白质表达两者来进行siRNA作用验证。
在一些实施方案中，如本文所用的提供的寡核苷酸是双链。通常，包含具有20个与23个之间，但具体来说21个碱基对的双链体结构的双链寡核苷酸已被认作特别有效诱导RNA干扰(Elbashir等，EMBO2001，20：6877-6888)。然而，其他人已发现较短或较长双链寡核苷酸也可为有效的。
在一些实施方案中，根据本发明利用的双链寡核苷酸包含充分互补以杂交来形成双链体结构的两个寡核苷酸链。在一些实施方案中，双链体结构的长度在约12至约45个碱基对之间。在一些实施方案中，双链体结构的长度在约18至约25个碱基对之间。在一些实施方案中，双链体结构的长度在约19至约24个碱基对之间。在一些实施方案中，双链体结构的长度在约19至约21个碱基对之间。在一些实施方案中，双链体结构是长度在约25至约30个碱基对之间的双链寡核苷酸。在一些实施方案中，双链体结构是长度在约10至约15个碱基对之间的双链寡核苷酸。在一些实施方案中，双链寡核苷酸的长度是至少约21个核苷酸。
在一些实施方案中，根据本发明利用的双链寡核苷酸包含有义链和反义链，其中反义RNA链具有互补于至少一部分靶标序列的互补性区域，并且双链体区域的长度是约14至约30个核苷酸。在一些实施方案中，与靶标序列具有互补性的区域的长度在约14至约30个核苷酸之间。在一些实施方案中，与靶标序列具有互补性的区域的长度在约18至约25个核苷酸之间。在一些实施方案中，与靶标序列具有互补性的区域的长度在约19至约24个核苷酸之间。在一些实施方案中，与靶标序列具有互补性的区域的长度是约19至约21个核苷酸。
如本文所用的短语“反义链”是指大致上或100％互补于目标靶标序列的寡核苷酸。短语“反义链”包括由两个单独链形成的两个寡核苷酸的反义区域，以及能够形成发夹或哑铃型结构的单分子寡核苷酸。术语“反义链”与“引导链”在本文中可互换使用。
短语“有义链”是指完全或部分与如信使RNA或DNA序列的靶标序列具有相同核苷序列的寡核苷酸。术语“有义链”与“过客链”在本文中可互换使用。
“靶标序列”是指表达或活性待调节的任何核酸序列。靶标核酸可为DNA或RNA，如内源性DNA或RNA、病毒DNA或病毒RNA、或由基因、病毒、细菌、真菌、哺乳动物或植物编码的其它RNA。在一些实施方案中，靶标序列与疾病或病症相关。
“可特异性杂交”和“互补”是指核酸可通过传统沃森-克里克(Watson-Crick)类型或其它非传统类型与另一核酸序列形成一个或多个氢键。关于本发明的核酸分子，核酸分子与它的互补序列的结合自由能足以使核酸的相关功能发生，例如RNAi活性。测定核酸分子的结合自由能在本领域中是熟知的(参见例如Turner等，1987，CSH Symp.Quant.Biol.LIT第123-133页；Frier等，1986，Proc.Nat.Acad.Sci.USA83：9373-9377；Turner等，1987，/.Ain.Chem.Soc.109：3783-3785)。
互补性百分比指示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如沃森-克里克碱基配对)的连续残基的百分比(例如10个中的5、6、7、8、9、10个是50％、60％、70％、80％、90％和100％互补的)。“完全互补”或100％互补性是指核酸序列的所有连续残基都将与第二核酸序列中的相同数目的连续残基进行氢键结。小于完全互补性是指其中两个链的一些而非所有核苷单元可彼此进行氢键结的情形。“大致上互补性”是指将多核苷酸链的被选择以是非互补性的区域，如突出部分除外，多核苷酸链展现90％或90％以上互补性。特异性结合需要足够互补性程度以避免寡聚化合物与非靶标序列在需要特异性结合所处的条件下，例如在体内测定或治疗性治疗的情况下的生理条件下，或在体外测定的情况下在进行测定所处的条件下，进行非特异性结合。在一些实施方案中，非靶标序列与相应靶标序列有至少5个核苷酸不同。
双链寡核苷酸
在一些实施方案中，根据本发明利用的双链寡核苷酸是足够大的，以使它可由内源性分子，例如由Dicer裂解来产生较小双链寡核苷酸，例如RNAi剂。在一些实施方案中，提供的双链寡核苷酸通过RISC介导的靶标序列裂解来调节靶标基因的表达。
在一些实施方案中，双链寡核苷酸的双链区域的长度等于或是至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸对。
在一些实施方案中，双链寡核苷酸的反义链的长度等于或是至少14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
在一些实施方案中，双链寡核苷酸的有义链的长度等于或是至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
在一些实施方案中，一个链在双链区域中具有至少一个具有1-5个单链核苷酸的链段。“双链区域中的单链核苷酸链段”是指在单链链段的两端存在至少一个核苷酸碱基对。在一些实施方案中，两个链在双链区域中均具有至少一个具有1-5(例如1、2、3、4或5)个单链核苷酸的链段。当两个链在双链区域中均具有一段1-5(例如1、2、3、4或5)个单链核苷酸时，所述单链核苷酸可彼此相对(例如一段错配)，或它们可被定位以使第二链不具有与第一链的单链寡核苷酸相对的单链核苷酸，并且反过来也是一样(例如单链环)。在一些实施方案中，单链核苷酸存在于来自在两个链之间具有互补性的区域的任一末端的8个核苷酸，例如来自5′或3′末端的8、7、6、5、4、3或2个核苷酸内。
在一些实施方案中，根据本发明利用的双链寡核苷酸的各链具有如2004年3月8日提交的国际申请号PCT/US2004/07070中所述的ZXY结构，所述申请的内容据此整体并入本文。
发夹和哑铃
在一些实施方案中，根据本发明利用的双链寡核苷酸是包含自身互补区域的单一分子；因此双链区域的两个“链”实际上彼此共价连接。所述两个链可在两端或仅在一个末端彼此连接。在一个末端连接是指第一链的5′末端连接于第二链的3′末端，或第一链的3′末端连接于第二链的5′末端。当两个链在两端彼此连接时，第一链的5′末端连接于第二链的3′末端，并且第一链的3′末端连接于第二链的5′末端。在一些实施方案中，两个链是由包括但不限于(N)n的寡核苷酸接头连接在一起；其中N独立地是修饰或未修饰的核苷酸，并且n是3-23。在一些实施方案中，n是3-10，例如3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，寡核苷酸接头选自由GNRA、(G)4、(U)4和(dT)4组成的组，其中N是修饰或未修饰的核苷酸，并且R是修饰或未修饰的嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，接头中的一些核苷酸涉及于与接头中的其它核苷酸的碱基对相互作用中。在一些实施方案中，两个链是由例如非核苷酸接头连接在一起。
在一些实施方案中，发夹和哑铃型RNAi剂具有等于或是至少14、15、15、16、17、18、19、29、21、22、23、24或25个核苷酸对的双链体区域。在一些实施方案中，双链体区域的长度等于或少于200、100或50个核苷酸对。在一些实施方案中，双链体区域的范围的长度是约15至约30、约17至约23、约19至约23和约19至约21个核苷酸对。在一些实施方案中，发夹寡核苷酸模拟微小RNA的天然前体。
在一些实施方案中，发夹RNAi剂可例如在发夹的反义侧上的3′末端等处具有单链突出部分或末端未配对区域。在一些实施方案中，突出部分的长度是约1至约4个核苷酸。在一些实施方案中，突出部分的长度是约2至约3个核苷酸。
在一些实施方案中，发夹RNAi剂的特征在于反义链的3′末端连接于有义链的5′末端。在一些实施方案中，发夹RNAi剂的特征在于反义链的5′末端连接于有义链的3′末端。提供的发夹寡核苷酸在本文中也称为“shRNA”。
单链寡核苷酸
在一些实施方案中，根据本发明利用的单链寡核苷酸包含大致上互补于编码基因表达产物的“有义”核酸，例如互补于双链cDNA分子的编码链或互补于RNA序列，例如前mRNA、mRNA、miRNA或前miRNA的核苷酸序列。提供的单链寡核苷酸包括但不限于反义寡核苷酸和单链RNAi剂。在一些实施方案中，互补性区域的长度小于约30个核苷酸。在一些实施方案中，互补性区域的长度是至少约15个核苷酸。在一些实施方案中，提供的单链寡核苷酸的长度是约10至约25个核苷酸(例如长度是约11、12、13、14、15、16、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸)。在一些实施方案中，提供的单链寡核苷酸的长度是约25至约30个核苷酸。在一些实施方案中，提供的单链寡核苷酸的长度是约15至约29个核苷酸。在一些实施方案中，提供的单链寡核苷酸被表征为与mRNA、RNA或DNA构造具有小于100％互补性。在一些实施方案中，提供的单链寡核苷酸具有如2004年3月8日提交的国际申请号PCT/US2004/07070中所述的ZXY结构。
在一些实施方案中，利用的单链寡核苷酸可杂交于互补RNA，例如mRNA、前mRNA，并且防止翻译机构进入靶标RNA转录物，由此阻止蛋白质合成。在一些实施方案中，提供的单链寡核苷酸可杂交于互补RNA，并且RNA靶标可随后由如RNA酶H的酶裂解，由此阻止靶标RNA的翻译。在一些实施方案中，提供的单链寡核苷酸通过RISC介导的靶标序列裂解来调节靶标基因的表达。
如本文所用的“单链RNAi剂”是由单一分子构成的RNAi剂。在一些实施方案中，单链RNAi剂包括通过链内配对形成的双链体区域，例如它是或它包括发夹或锅手柄结构。在一些实施方案中，单链RNAi剂关于靶标分子是反义的。在一些实施方案中，单链RNAi剂是足够长的，以使它们能够进入RISC，并且参与RISC介导的靶标mRNA裂解。示例性单链siRNA(ss siRNA)是已知的，并且例如描述于美国专利公布号2006/0166901中，所述公布的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，单链RNAi剂的长度是至少约12个核苷酸。在一些实施方案中，单链RNAi剂的长度是至少约15个核苷酸。在一些实施方案中，单链RNAi剂的长度是至少约20个核苷酸。在一些实施方案中，单链RNAi剂的长度是至少约25个核苷酸。在一些实施方案中，单链RNAi剂的长度是至少约29个核苷酸。在一些实施方案中，单链RNAi剂的长度是至少约30个核苷酸。在一些实施方案中，单链RNAi剂的长度是至少约35个核苷酸。在一些实施方案中，单链RNAi剂的长度是至少约40个核苷酸。在一些实施方案中，单链RNAi剂的长度是至少约50个核苷酸。
在一些实施方案中，单链RNAi剂的长度小于200个核苷酸。在一些实施方案中，单链RNAi剂的长度小于100个核苷酸。在一些实施方案中，单链RNAi剂的长度小于60个核苷酸。
在一些实施方案中，单链RNAi剂是5′磷酸化的。在一些实施方案中，单链RNAi剂在5′末端包括磷酰基类似物。在某些实施方案中，单链RNAi剂的长度是约15至约29个核苷酸。
可用作靶标或可充当用于设计本发明的寡核苷酸的模板的单链寡核苷酸，包括描述为和/或鉴定为单链siRNA、微小RNA或mir的那些，传授于例如Esau等的题为“Oligonucleotides and compositions foruse in modulation small non-coding RNAs”的美国公布号20050261218(USSN：10/909125)中，所述公布的整个内容以引用的方式并入本文。
本发明涵盖包含单链寡核苷酸的研究和/或诊断试剂。在一些实施方案中，根据本发明利用的单链寡核苷酸是和/或充当引物。在一些实施方案中，引物用于基于聚合酶的链反应(即PCR)中来扩增核酸。这些应用包括PCR的任何已知变化形式，如反转录PCR(RT-PCR)和实时PCR。
微小RNA
在一些实施方案中，提供的组合物包含一种或多种是或充当微小RNA的寡核苷酸。
微小RNA(miRNA或mir)是一类自植物和动物基因组中的DNA转录，但不翻译成蛋白质的高度保守的小RNA分子。前微小RNA被加工成miRNA。加工的微小RNA是单链17-25个核苷酸(nt)的RNA分子，其变为并入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，并且已被鉴定为发育、细胞增殖、细胞凋亡和分化的关键调控子。据信它们通过结合特定mRNA的3′未翻译区域来在调控基因表达中起作用。RISC通过翻译抑制、转录物裂解或两者来介导基因表达下调。RISC也牵涉于广泛范围的真核生物的核中的转录沉默中。
微小RNA也已牵涉于宿主中的病原体的调节中。例如参见Jopling，C.L.等，Science(2005)第309卷，第1577-1581页。在不希望受理论束缚下，施用微小RNA、微小RNA模拟物和/或抗微小RNA寡核苷酸会导致对病原体活力、生长、发育和/或复制的调节。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是微小RNA、微小RNA模拟物和/或抗微小RNA，其中微小RNA是宿主微小RNA。迄今为止鉴定的miRNA序列的数目是广大的以及日益增长的，其说明性实例可例如见于以下中：″miRBase：microRIVA sequences，targets and genenomenclature″Griffiths-Jones S，Grocock RJ，van Dongen S，Bateman A，Enright AJ.NAR，2006，34，Database Issue，D140-D144；″The microRNARegistry″Griffiths-Jones S.NAR，2004，32，Database Issue，D109-D111。适用miRNA序列的非限制性实例也提供于随附附录(C)中。
核糖酶
在一些实施方案中，提供的组合物包括一种或多种是或充当核糖酶的寡核苷酸。
核糖酶是具有特定催化结构域的寡核苷酸，所述结构域具有核酸内切酶活性(Kim和Cech，Proc Natl Acad Sci U S A.1987年12月；84(24)：8788-92；Forster和Symons，Cell.1987年4月24日；49(2)：211-20)。目前已知至少六个基本种类的天然存在的酶性RNA。一般来说，酶性核酸通过首先结合于靶标RNA来起作用。所述结合通过酶性核酸的靶标结合部分来发生，所述部分被保持紧密邻近于分子的起裂解靶标RNA作用的酶性部分。因此，酶性核酸首先通过互补碱基配对来识别并接着结合靶标RNA，并且一旦结合于恰当位点，即以酶促方式起切割靶标RNA作用。策略性裂解所述靶标RNA将破坏它的引导编码蛋白质的合成的能力。在酶性核酸已结合并裂解它的RNA靶标之后，它自那个RNA释放以搜索另一靶标，并且可重复结合并裂解新靶标。
产生靶向任何靶标序列的核糖酶的方法在本领域中是已知的。核糖酶可尤其如各自以引用的方式明确并入本文的国际专利申请公布号WO 93/23569和国际专利申请公布号WO 94/02595中所述来设计，并且合成以如其中所述在体外以及在体内加以测试。
适体
在一些实施方案中，提供的组合物包括一种或多种是或充当适体的寡核苷酸。
适体是以高亲和力和特异性结合特定目标分子的核酸或肽分子(Tuerk和Gold，Science 249：505(1990)；Ellington和Szostak，Nature346：818(1990))。已成功产生结合从大型蛋白质至小型有机分子的许多不同实体的DNA或RNA适体。参见Eaton，Curr.Opin.Chem.Biol.1：10-16(1997)；Famulok，Curr.Opin.Struct.Biol.9：324-9(1999)以及Hermann和Patel，Science 287：820-5(2000)。适体可基于RNA或DNA。
通常，适体是通过重复多轮体外选择，或等效地进行SELEX(通过指数富集来达成配体的系统进化)来加以工程化以结合各种分子靶标，如小分子、蛋白质、核酸以及甚至细胞、组织和生物体。SELEX程序是其中基于对靶标蛋白质或其它分子的结合亲和力来自广大序列文库选择单链寡核苷酸的方案(C.Tuerk，L.Gold，Science，249(1990)，第505-510页；R.Green，A.D.Ellington，D.P.Bartel，J.W.Szostak，Methods Enzymol.，2(1991)，第75-86页；L.Gold，B.Polisky，O.Uhlenbeck，M.Yarus，Annu.Rev.Biochem.，64(1995)，第763-797页)。SELEX程序通常用由某些1014-1015个随机寡核苷酸序列组成的RNA或DNA文库启始。在完全随机化寡核苷酸文库中，各分子将展现将取决于那个分子的核苷酸序列的独特三级结构。寡核苷酸对靶标蛋白质的结合亲和力将由寡核苷酸的表面上的部分与靶标蛋白质上的表位之间的配合来确定。由于自具有广大多样性的文库起始，所以常有可能鉴定对靶标蛋白质具有nM或低于nM亲和力，以及对那个靶标蛋白质的选择性超过对具有高度结构同源性的其它蛋白质的选择性的适体(K.W.Uphoff，S.D.Bell，A.D.Ellington，Curr.Opin.Struct.Biol.，6(1996)，第281-288页)。使用SELEX方法，已针对以下产生RNA或DNA适体：许多蛋白质、肽和小分子，包括多巴胺(C.Mannironi，A.Di Nardo，P.Fruscoloni，G.P.Tocchini-Valentini，Biochemistry，36(1997)，第9726-9734页)、P物质(D.Nieuwlandt，M.Wecker，Biochemistry，34(1995)，第5651-5659页)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)(H.Takeno，S.Yamamoto，T.Tanaka，Y.Sakano，Y.Kikuchi，J.Biochem.，125(1999)，第1115-1119页)、血小板衍化生长因子(L.S.Green，D.Jellinek，R.Jenison，A.Ostman，C-H.Heldin，N.JanjicBiochemistry，35(1996)，第14413-14424页)、血管内皮生长因子(L.S.Green，D.Jellinek，C.Bell，L.A.Bebe，B.D.Feistner，S.C.Gill，F.M.Jucker，N.Janjic Chem.Biol.，2(1995)，第683-695页)、凝血酶(L.C.Bock，L.C.Griffen，J.A.Latham，E.H.Vermaas，J.J.Toole，Nature，355(1992)，第564-566页)和L-选择素(D.O℃onnell，A.Koenig，S.Jennings，B.Hicke，H.L.Han，T.Fitzwater，Y.F.Chang，N.Varki，D.Parma Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93(1996)，第5883-5887页)。
如Dua等(2008)Recent Patents on DNA&Gene Sequences，2：172-186(以引用的方式并入本文)中更详细所综述，多年来，已开发许多改进SELEX方案。改进SELEX方法的非限制性实例描述于以下公布中：反向SELEX(US5580737)、流式细胞SELEX(WO9833941)、截短SELEX(WO0056930)、掺合SELEX(US5683867)、无转录SELEX(US20026387620)、溶液SELEX(US5567588)、嵌合SELEX(WO9604403)、组织SELEX(US20026376474)、光SELEX(US6001577)、切换SELEX(US20077312325)、共价SELEX/化学SELEX(US5763595)、基因组SELEX(US20016261774)、无纯化蛋白质的SELEX(WO0224954)、CE-SELEX(WO03102212)、镜像SELEX-镜像异构体(EP1386972)和激光SELEX、DeSELEX(WO07035532)，其各自以引用的方式整体并入本文。由本发明包括的立体确定的寡核苷酸可用于SELEX方法的任何一种或多种变化形式中。
适体可通过任何已知方法，包括合成、重组和纯化方法来制备，并且可单独或与特异于相同靶标的其它适体组合使用。此外，如本文更充分所述，术语“适体”明确包括含有由比较给定靶标的两种或更多种已知适体获得的共有序列的“次级适体”。适体具有使得它们成为有吸引力的治疗剂的若干特征。DNA适体与RNA适体两者均已显示结合它们的靶标的解离常数(Kd)在低皮摩尔浓度至低纳摩尔浓度的范围内。适体的结合是一种可甚至在共有共同结构域的相关蛋白质之间加以区分的高度特异性相互作用。尽管适体与抗体两者的结合亲和力在相同范围内，但适体具有在许多情况下胜过其对手的许多其它特征。不同于抗体，适体可甚至靶向非免疫原性靶标。在合成期间，它们可易于经受改进它们的稳定性和药物动力学的化学修饰。由于它们与内源性分子的相似性，在治疗剂量下，它们显示零至可忽略水平的免疫原性。
在一些实施方案中，根据本发明利用的寡核苷酸适用作抗病原剂，例如抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂等。已报道适于多种感染剂，如病毒和细菌的靶标。参见例如美国专利5726017、美国专利5654151、美国专利5496938、美国专利5503978、美国专利5587468、美国专利5527894、US2005233317、美国专利5496938、WO08 066231、JP2002165594、WO02081494、美国专利5861501、WO9720072、美国专利5475096、美国专利6569630、CN101109013和WO03106476，其各自以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，根据本发明利用的寡核苷酸是或充当抗癌剂。适体可靶向任何已知癌症或肿瘤相关因子，如细胞分裂或增殖、细胞周期进展、细胞凋亡、细胞迁移、DNA修复等的调控中涉及的蛋白质，包括结构蛋白质和信号转导分子。实例包括但不限于参见例如澳大利亚专利775412、美国专利6232071、WO 08/028534、美国专利6933114、WO 04/081574、澳大利亚专利242462、美国专利6995249、美国专利5668264、美国专利6699843、WO 04/094614和美国专利5846713，其各自以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，根据本发明利用的寡核苷酸是或充当抗血管生成剂。抗血管生成靶标的非限制性实例包括VEGF和相关受体以及细胞外基质或粘着分子。参见例如美国专利6051698、US 2003175703、WO 95/21853和美国专利7094535，其各自以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，根据本发明利用的寡核苷酸是或充当抗凝血剂。关于凝血因子和它们的功能以及所述过程的蛋白质调控了解许多。适体适用于在治疗病状，如心血管疾病和凝血病症时靶向所述因子中的一个或多个。参见例如WO 06/033854、美国专利5543293、WO 07/025049、美国专利6774118、WO 07/140000，其各自以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，根据本发明利用的寡核苷酸是或充当免疫调节剂。已产生适体来靶向自体免疫性病症中涉及的免疫调节分子。本发明可适用于靶向在免疫细胞，如T细胞和抗原递呈细胞(APC)上表达的分子。参见例如美国专利5869641、WO 01/09160，其各自以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，适体可靶向补体系统中涉及的分子，如C1、C4、C2、C3和C5。补体系统已牵涉于众多肾、风湿病学、神经学、皮肤学、血液学、过敏性、感染性和其它疾病中。参见例如WO 97/28178和WO 07/103549，其各自以引用的方式整体并入本文。其它免疫相关靶标包括但不限于IL-12、IL-23和IL-28(参见例如WO 07/035922，其以引用的方式并入本文)、IgE(参见例如WO 05/113813，其以引用的方式并入本文)、Sp-1和Sp1-、CD28、IL-2、GMCSF(参见例如美国专利6994959，其以引用的方式并入本文)、SDF-1、CXCR4(参见例如WO 08/009437，其以引用的方式并入本文)、IL-6、IL-12、IFNγ(参见例如美国专利6589940和US2003125279，其各自以引用的方式并入本文)和TLR。立体确定的适体可引发针对所述疾病的功效改进。
在一些实施方案中，根据本发明利用的寡核苷酸是或充当消炎剂。如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、败血性休克、肺气肿、囊性纤维化、类风湿性关节炎和慢性支气管炎的炎症性疾病在它们的发病机制中涉及嗜中性白细胞弹性蛋白酶。因此，人弹性蛋白酶是用于使用调控炎症的适体治疗所述病症的靶标。其它适合靶标包括但不限于磷酸脂酶A2(如非胰腺分泌PLA2(参见例如WO 96/27604，其以引用的方式并入本文))、E-选择素、P-选择素和L-选择素(参见例如美国专利5780228，其以引用的方式并入本文)、三种同源C型凝集素、在如白细胞、内皮细胞和血小板的细胞中表达的其它细胞粘着分子；MCP-1(参见例如WO 07/093409，其以引用的方式并入本文)、NF-κB和NF-IL6(参见例如WO 00/24404，其以引用的方式并入本文)。立体确定的适体可引发针对所述疾病的功效改进。
在一些实施方案中，根据本发明利用的寡核苷酸适用于治疗某些脑疾病，包括但不限于：传染性海绵状脑病变(TSE)和阿兹海默氏病(Alzheimer’s disease)。已知靶标描述于包括WO 2006/138676和DE19916417以及WO 08/008884的公布中，所述公布各自以引用的方式并入本文。立体确定的适体可引发针对所述疾病的功效改进。
诱饵寡核苷酸
在一些实施方案中，提供的组合物包括一种或多种是或充当诱饵寡核苷酸的寡核苷酸。
因为转录因子甚至在不存在环绕基因组DNA下识别它们的相对较短的结合序列，所以携带特定转录因子的共有结合序列的短寡核苷酸可用作用于操纵活细胞中的基因表达的工具。这个策略涉及细胞内递送所述“诱饵寡核苷酸”，其接着由靶标因子识别并结合。诱饵占据转录因子的DNA结合位点致使转录因子不能随后结合靶标基因的启动子区域。诱饵可用作治疗剂来抑制由转录因子活化的基因的表达，或上调因转录因子的结合而受遏制的基因。利用诱饵寡核苷酸的实例可见于Mann等，J.Clin.Invest.，2000，106：1071-1075中，所述文献以引用的方式整体明确并入本文。
miRNA模拟物
在一些实施方案中，提供的组合物包括一种或多种是或充当miRNA模拟物的寡核苷酸。
miRNA模拟物代表一类可用于模拟一种或多种miRNA的基因调节活性的分子。因此，术语“微小RNA模拟物”是指能够进入RNAi路径并调控基因表达的合成非编码RNA(即miRNA不是通过自内源性miRNA的来源纯化来获得)。miRNA模拟物可被设计成成熟分子(例如单链)或模拟前体(例如预miRNA或前miRNA)。
在一些实施方案中，miRNA模拟物是双链分子(例如具有长度在约16与约31个核苷酸之间的双链体区域)，并且含有一个或多个与给定miRNA的成熟链具有同一性的序列。
在一些实施方案中，miRNA模拟物包含具有约16个与约31个之间的核苷酸的双链体区域。在一些实施方案中，提供的miRNA模拟物可含有一种或多种以下化学修饰样式：有义链含有核苷酸1和2(自有义寡核苷酸的5′末端开始计数)以及所有C和U的2′-O-甲基修饰；反义链修饰可包括所有C和U的2′F修饰、寡核苷酸的5′末端的磷酸化以及与2核苷酸3′突出部分相关的稳定化核苷酸间键联。
超级微小RNA
在一些实施方案中，提供的组合物包括一种或多种是或充当超级微小RNA的寡核苷酸。
超级微小RNA是指核苷酸序列大致上与miRNA相同，并且是关于它的靶标的反义的例如单链、双链或部分双链寡核苷酸。这个术语包括包含至少一个起类似作用的非天然存在的部分的寡核苷酸。在一些实施方案中，超级微小RNA不包括有义链。在一些实施方案中，超级微小RNA不在显著程度上自我杂交。在一些实施方案中，超级微小RNA具有二级结构，但在生理条件下大致上是单链。大致上是单链的超级微小RNA在小于约50％(例如小于约40％、30％、20％、10％或5％)的超级微小RNA与它自身成双链体的程度上是单链。超级微小RNA可包括发夹区段，例如优选在3′末端的序列可自我杂交并形成双链体区域，例如具有至少1、2、3或4个核苷酸，并且优选小于8、7、6或5个核苷酸，例如具有5个核苷酸的双链体区域。双链体区域可由接头，例如核苷酸接头，例如3、4、5或6个dT，例如修饰的dT连接。在一些实施方案中，超级微小RNA例如在3′和5′末端中的一个或两个处，或在一个末端以及在超级微小RNA的非末端或中间与例如长度是5、6、7、8、9或10个核苷酸的较短寡核苷酸成双链体。
反义聚体或miRNA抑制剂
在一些实施方案中，提供的组合物包括一种或多种是或充当反义聚体或miRNA抑制剂的寡核苷酸。
术语“反义微小RNA”、“微小RNA抑制剂”或“miR抑制剂”是同义的，并且是指干扰特定miRNA的活性的寡核苷酸或修饰的寡核苷酸。抑制剂可采用多种构型，包括单链、双链(RNA/RNA或RNA/DNA双链体)和发夹设计。在一些实施方案中，微小RNA抑制剂包含一个或多个与待靶向的miRNA的成熟链(或多个链)互补或部分互补的序列或序列部分。在一些实施方案中，miRNA抑制剂包含位于是成熟miRNA的反向互补体的序列的5′和3′的其它序列。其它序列可为邻近于自其获得成熟miRNA的预miRNA中的成熟miRNA的序列的反向补体，或其它序列可为任意序列(具有A、G、C、U或dT的混合物)。在一些实施方案中，一个或两个其它序列是能够形成发夹的任意序列。因此，在一些实施方案中，是miRNA的反向补体的序列是通过发夹结构侧接在5′侧上和3′侧上。在一些实施方案中，微小RNA抑制剂是双链。在一些实施方案中，微小RNA抑制剂是双链，并且包括相对链上的核苷酸之间的错配。在一些实施方案中，微小RNA抑制剂连接于缀合部分以有助于抑制剂摄取至细胞中。
包括发夹miRNA抑制剂的微小RNA抑制剂详述于Vermeulen等，″Double-Stranded Regions Are Essential Design Components OfPotent Inhibitors of RISC Function，″RNA 13：723-730(2007)以及W02007/095387和WO 2008/036825中，所述文献和专利各自以引用的方式整体并入本文。
基于miRNA的疗法的示例性应用描述于Pan等(2007)World JGastroenterol 13(33)：4431-36，“New therapeutic opportunities forHepatitis C based on small RNA”中，所述文献的内容以引用的方式并入本文。简要来说，作者描述由hcr基因的非编码性聚腺苷酸化RNA转录物获得的作为肝特异性发育调控子的22个核苷酸的成熟miR-122。因为miR-122是HCV病毒复制中涉及的肝特异性miRNA，所以使miR-122沉默可适用于治疗HCV。
微小RNA拮抗剂
在一些实施方案中，提供的组合物包括一种或多种是或充当微小RNA拮抗剂的寡核苷酸。
微小RNA拮抗剂是具有各种修饰以达成RNA酶保护和药理学性质，如组织和细胞摄取增强的RNA样寡核苷酸。它们与正常RNA的不同之处在于例如糖被完全2′-0-甲基化，具有硫代磷酸酯糖间键联，以及例如在3’末端具有胆固醇部分。在一些实施方案中，微小RNA拮抗剂包含在所有核苷酸处的2′-O-甲基修饰、在3′末端的胆固醇部分、在5’末端的前两个位置处的两个硫代磷酸酯糖间键联以及在分子的3’末端的四个硫代磷酸酯键联。微小RNA拮抗剂可用于通过形成包含微小RNA拮抗剂和内源性miRNA的双链体，由此阻止miRNA诱导的基因沉默来使内源性miRNA有效沉默。微小RNA拮抗剂介导的miRNA沉默的实例是Krutzfeldt等，Nature，2005，438：685-689中所述的使miR-122沉默，所述文献以引用的方式整体并入本文。
修饰的单一寡核苷酸变化形式
通常，发觉活化RNAi机构需要两种组分——RNAi相关蛋白质识别所需的双链核酸基序和在RISC的Argonaute催化蛋白中充当mRNA结合辅因子的引导链。最近，已开发一种新型RNAi分子，其主要由能够自我二聚化成部分互补双链体的单一短(25-28nt)寡聚物组成。这些分子被证明高效活化RISC，并且产生的靶标mRNA沉默与用强力常规RNAi分子获得的靶标mRNA沉默可比。参见：Lapierre等，“Potent and systematic RNAi mediated silencing with singleoligonucleotide compounds.”RNA 2011；17：00，其内容据此以引用的方式并入本文。也参见：WO 2010/090762“RNA DUPLEXES WITH SINGLE STRANDED PHOSPHOROTHIOATE NUCLEOTIDE REGIONS FOR ADDITIONAL FUNCTIONALITY”(PCT/US2010/00348)，其内容据此以引用的方式并入本文。
因此，本发明包括含有硫代磷酸酯修饰的核苷酸的单链区域的RNAi构建体，以及所述构建体在基因沉默中的用途。
在一些实施方案中，本发明利用包括引导链和过客链的分离的双链核酸分子，其中所述过客链是通过可裂解接头连接于至少八个硫代磷酸酯修饰的核苷酸的单链区域。在一些实施方案中，本发明是具有引导链和过客链的分离的双链核酸分子，其中所述引导链和所述过客链中的至少一个是通过可裂解接头连接于至少六个硫代磷酸酯修饰的核苷酸的单链区域。
在一些实施方案中，本发明利用具有引导链和过客链的分离的双链核酸分子，其中所述引导链和所述过客链中的至少一个是通过可裂解接头连接于至少三个硫代磷酸酯修饰的核苷酸的单链区域。在一些实施方案中，双链核酸分子包括至少一种以下性质。过客链的长度可为8-18个核苷酸。核酸可具有至少一个2′O甲基或2′氟修饰。可裂解键联可不同于核苷酸键联。核酸可包括亲脂性基团。引导链的长度可为16-18个核苷酸或26-28个核苷酸。在一些实施方案中，单链区域连接于引导链。
在一些实施方案中，可裂解接头包括一个或多个未修饰的核苷酸。在其它实施方案中，可裂解接头是磷酸二酯键。在某些实施方案中，可裂解接头是S-S。在一些实施方案中，可裂解接头是DNA或RNA。至少八个硫代磷酸酯修饰的核苷酸的单链区域可在过客链的3′或5′末端。在一些实施方案中，至少八个硫代磷酸酯修饰的核苷酸的单链区域是DNA，而在其它实施方案中，它是RNA。
在一些实施方案中，核酸分子的双链区域是完全双链体。在其它实施方案中，双链区域含有至少一个突起区域。在一些实施方案中，过客链在分子的双链区域内包含切口。双链区域可含有至少一个硫代磷酸酯修饰的核苷酸。
根据本发明利用的核酸分子可被化学修饰。在某些实施方案中，化学修饰是2′O甲基和/或2′氟。在一些实施方案中，同一分子中存在一个以上化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰增加稳定性，增加免疫调控的逃避，和/或防止脱靶基因沉默。化学修饰可存在于过客链和/或引导链上。在一些实施方案中，至少八个硫代磷酸酯修饰的核苷酸的单链区域在细胞中自核酸分子的双链区域裂解。在一些实施方案中，至少八个硫代磷酸酯修饰的核苷酸的单链区域与哺乳动物基因具有互补性。在某些实施方案中，至少八个硫代磷酸酯修饰的核苷酸的单链区域充当反义分子。双链区域的长度可为至少19个核苷酸。在一些实施方案中，单链区域的长度是至少12个核苷酸。
在一些实施方案中，本发明利用双功能性核酸分子，其包括以RNA干扰方式起作用的双链区域和以反义方式起作用的单链区域，其中所述双链区域包含引导链和过客链，并且其中所述双链区域和所述单链区域是通过可裂解接头连接。在一些实施方案中，可裂解接头包括一个或多个未修饰的核苷酸。在其它实施方案中，可裂解接头是磷酸二酯键。在某些实施方案中，可裂解接头是S-S。在一些实施方案中，可裂解接头是DNA或RNA。
在一些实施方案中，本发明涉及用于抑制靶标基因在哺乳动物细胞中的表达的方法，其包括使所述哺乳动物细胞与包含引导链和过客链的分离的双链核酸分子接触，其中所述过客链是通过可裂解接头连接于至少八个硫代磷酸酯修饰的核苷酸的单链区域。在一些实施方案中，可裂解接头包括一个或多个未修饰的核苷酸。在其它实施方案中，可裂解接头是磷酸二酯键。在某些实施方案中，可裂解接头是S-S。在一些实施方案中，可裂解接头是DNA或RNA。
在一些实施方案中，单链区域包含至少八个硫代磷酸酯修饰的核苷酸，并且可在过客链的3′或5′末端。在一些实施方案中，至少八个硫代磷酸酯修饰的核苷酸的单链区域是DNA，而在其它实施方案中，它是RNA。在一些实施方案中，核酸分子的双链区域是完全双链体。在其它实施方案中，双链区域含有至少一个突起区域。在一些实施方案中，过客链在分子的双链区域内包含切口。双链区域可含有至少一个硫代磷酸酯修饰的核苷酸。
根据本发明利用的核酸分子可被化学修饰。在某些实施方案中，化学修饰是2′O甲基和/或2′氟。在一些实施方案中，同一分子中存在一个以上化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰增加稳定性，增加免疫调控的逃避，和/或防止脱靶基因沉默。化学修饰可存在于过客链和/或引导链上。
在一些实施方案中，至少八个硫代磷酸酯修饰的核苷酸的单链区域在细胞中自核酸分子的双链区域裂解。在一些实施方案中，至少八个硫代磷酸酯修饰的核苷酸的单链区域与哺乳动物基因具有互补性。在某些实施方案中，至少八个硫代磷酸酯修饰的核苷酸的单链区域充当反义分子。双链区域的长度可为至少19个核苷酸。在一些实施方案中，单链区域的长度是至少12个核苷酸。
在一些实施方案中，本发明涉及用于抑制靶标基因在哺乳动物细胞中的表达的方法，其包括使所述哺乳动物细胞与包含引导链和过客链的分离的双链核酸分子接触，其中所述引导链是通过可裂解接头连接于至少八个硫代磷酸酯修饰的核苷酸的单链区域。在一些实施方案中，可裂解接头包括一个或多个未修饰的核苷酸。在其它实施方案中，可裂解接头是磷酸二酯键。在某些实施方案中，可裂解接头是S-S。在一些实施方案中，可裂解接头是DNA或RNA。
在一些实施方案中，本发明涉及用于抑制靶标基因在哺乳动物细胞中的表达的方法，其包括使所述哺乳动物细胞与双功能性核酸分子接触，所述双功能性核酸分子包括以RNA干扰方式起作用的双链区域和以反义方式起作用的单链区域，其中所述双链区域包括引导链和过客链，并且其中所述双链区域和所述单链区域是通过可裂解接头连接。在其它方面，提供一种用于抑制靶标基因在哺乳动物细胞中的表达的方法。所述方法涉及使哺乳动物细胞与本文所述的任何分离的双链核酸分子接触。
在一些实施方案中，根据本发明利用的分离的双链核酸分子包括增加稳定性的化学修饰。在一些实施方案中，分离的双链核酸分子包括增加免疫调控的逃避的化学修饰。在一些实施方案中，分离的双链核酸分子包括防止脱靶基因沉默的化学修饰。
在一些实施方案中，如本文所讨论，利用的寡核苷酸是能够自我二聚化成部分互补双链体的单一寡核苷酸分子。在一些实施方案中，所述单一寡核苷酸的长度是约23-30个核苷酸，例如23、24、25、26、27、28、29和30个核苷酸。在一些实施方案中，能够自我二聚化成部分互补双链体的单一寡核苷酸含有约14-18个核苷酸的mRNA靶向区域，例如14、15、16、17和18个核苷酸。在一些实施方案中，能够自我二聚化成部分互补双链体的单一寡核苷酸含有额外7-11个，例如7、8、9、10和11个核苷酸来使得能够自我二聚化成部分互补双链体。在一些实施方案中，能够自我二聚化成部分互补双链体的单一寡核苷酸可高效进入并活化RNA诱导的沉默复合物(RISC)。
Ul衔接头
在一些实施方案中，提供的组合物包括一种或多种是或充当Ul衔接头的寡核苷酸。
Ul衔接头抑制聚腺苷酸(polyA)位点，并且是双功能性寡核苷酸，其具有互补于靶标基因的末端外显子中的位点的靶标结构域和结合Ul snRNP的Ul较小核RNA组分的“Ul结构域”。参见例如国际专利申请公布号WO2008/121963以及Goraczniak等，2008，NatureBiotechnology，27(3)，257-263，其各自以引用的方式整体并入本文。Ul snRNP是通过结合前mRNA外显子-内含子边界来主要起引导剪接体形成中的早期步骤的作用的核糖核蛋白复合物，Brown和Simpson，1998，Annu Rev Plant Physiol Plant MoI Biol 49：77-95。
在一些实施方案中，利用的寡核苷酸是Ul衔接头，其中所述寡核苷酸包含至少一个连接于至少一个效应子结构域(Ul结构域)的退火结构域(靶向结构域)，其中所述退火结构域杂交于靶标基因序列，而所述效应子结构域杂交于Ul snRNP的Ul snRNA。在一些实施方案中，Ul衔接头包含一个退火结构域。在一些实施方案中，Ul衔接头包含一个效应子结构域。
在不希望受理论束缚下，退火结构域的长度将通常是约10至约50个核苷酸，更通常是约10至约30个核苷酸或约10至约20个核苷酸。在一些实施方案中，退火结构域的长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个核苷酸。退火结构域可至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少约100％互补于靶标基因。在一些实施方案中，退火结构域与包括末端编码区以及3′UTR和聚腺苷酸化信号序列的前MRNA的Y末端外显子内的靶标位点杂交(例如通过聚腺苷酸化位点)。在一些实施方案中，靶标序列在前mRNA的聚(腺苷酸)信号序列的约500个碱基对、约250个碱基对、约100个碱基对或约50个碱基对内。在一些实施方案中，退火结构域包含靶标基因序列内的1、2、3或4个错配。
在一些实施方案中，效应子结构域的长度是约8个核苷酸至约30个核苷酸。在一些实施方案中，效应子结构域的长度是约10个核苷酸至约20个核苷酸。在一些实施方案中，效应子结构域的长度是约10个核苷酸至约15个核苷酸。Ul结构域可与UI snRNA，特别是5’末端，并且更具体来说是核苷酸2-11杂交。在一些实施方案中，Ul结构域完全互补于内源性Ul snRNA的核苷酸2-11。在一些实施方案中，Ul结构域包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ.ID NO：1(5′-GCCAGGIL1AAGUAU-3′)、SEQ.1D NO：2(5″-CCAGGLIAA.GUAII-3″)、SEQ 11D NO：4(5″-CAGGUAAGUAU-3′)、SEQ ID NO：5(52-CAGGLIAAGU-3′)、SEQ ID NO：6(5′--CM.16ITAAC1-3′)和SEQ ID NO：7(5′-CAGG1IA2＝′，，3′)。在一些实施方案中；III结构域包含核苷酸序列SEQ ID NO：8(5″-CAGGUAAGUA-3″)。在不希望受理论束缚下，增加Ul结构域的长度以包括与茎1进行碱基配对和/或与Ul snRNA的1位进行碱基配对会改进Ul衔接头对Ul snRNA的亲和力。
可连接Ul衔接头的退火结构域和效应子结构域以使效应子结构域在退火结构域的5′末端和/或3′末端。两个结构域可通过以下方式连接：一个结构域的3′末端连接于另一结构域的5′末端，或一个结构域的3′末端连接于另一结构域的3’末端，或一个结构域的5′末端连接于另一结构域的5′末端。退火结构域和效应子结构域可彼此直接连接，或通过基于核苷酸的接头或基于非核苷酸的接头连接。在一些实施方案中，接头是基于核苷酸的，并且包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、多达15、多达20或多达25个核苷酸。
在一些实施方案中，退火结构域与效应子结构域之间的接头是多价的，例如三价、四价、五价。在不希望受理论束缚下，多价接头可用于将单一退火结构域与多个衔接头结构域连接在一起。
在一些实施方案中，Ul衔接头包含本文所述的任何寡核苷酸修饰。示例性所述修饰包括增加退火亲和力、特异性、在细胞和生物体中的生物可用度、细胞和/或核转运、稳定性和/或对降解的抗性的那些。在一些实施方案中，Ul衔接头可与至少一种其它RNAi试剂组合施用。
RNA活化剂
在一些实施方案中，提供的组合物包括一种或多种是或充当RNA活化剂的寡核苷酸。
新近研究已发现dsRNA也可活化基因表达，这是一种已称为“小RNA诱导的基因活化”或RNAa的机制。参见例如Li，L.C.等Proc NatiAuld Sci U SA.(2006)，103(46)：17337-42以及Li L.C.(2008).″SmallRNAMediated Gene Activation″.RNA and the Regulation of GeneExpression：A Hidden Layer of Complexity.Caister Academic Press.ISBN 978-1-904455-25-7。已显示靶向基因启动子的dsRNA诱导相关基因的强力转录活化。导致RNAa的内源性miRNA也已在人中被发现。Check E.Nature(2007).448(7156)：855-858。
另一观察结果是由RNAa达成的基因活化是长久持续的。已观察到基因表达受诱导持续超过十天。延长的RNAa作用可归因于在dsRNA靶标位点处的表观遗传变化。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸是RNA活化剂，其中提供的寡核苷酸增加基因表达。在一些实施方案中，基因表达增加会抑制活力、生长发育和/或繁殖。
非编码RNA(ncRNA)
本发明涵盖非编码RNA，如长非编码RNA(lncRNA)和短非编码RNA(sncRNA)。
因此，本发明的提供的寡核苷酸组合物可适用于调节疾病相关长非编码RNA。在一些实施方案中，根据本文提供的方法合成的寡核苷酸用于特异性阻断转录阻遏子复合物与靶标lncRNA区域的结合，由此诱导相关靶标基因的表达。在一些实施方案中，转录阻遏子复合物是沉默性因子。在一些实施方案中，转录阻遏子复合物具有组蛋白甲基转移酶活性。在一些实施方案中，转录阻遏子复合物使组蛋白H3甲基化。在一些实施方案中，转录阻遏子复合物是PRC2(多梳蛋白阻遏性复合物2)。
已报道某些PRC2相关lncRNA是潜在治疗靶标和/或生物标记(Zhao等，2010.“Genome-wide Identification of Polycomb-AssociatedRNAs by RIP-seq”Molelcular Cell 40：939-53)。PCR2蛋白的过度表达已与各种类型的癌症相关联，所述癌症包括转移性前列腺癌和乳癌，以及结肠癌、乳癌和肝癌。发现药理学抑制PRC2介导的基因阻遏会在体外诱导若干癌细胞系而非各种类型的正常细胞的细胞凋亡。在这个系统中诱导细胞凋亡取决于已由PRC2阻遏的基因的再活化。也有证据表明PRC2介导的基因阻遏可与癌症干细胞的干细胞性质的维持相关联。这些结果表明至少在一些情况下，抑制PRC2介导的基因阻遏-包括通过靶向使PRC2募集至关键基因的lncRNA-是一种用于治疗各种类型的癌症的潜在策略。可根据本文提供的方法制备的核酸的非限制性序列可例如见于题为“Polycomb-associated non-codingRNAs”的国际专利公布WO 2012/065143(PCT/US2011/60493)中，所述公布的内容以引用的方式并入本文。
本发明的提供的寡核苷酸组合物可为或充当小非编码RNA，如piwi相互作用性RNA(piRNA)。piRNA代表在动物细胞中表达的最大类别的小非编码RNA分子，并且成群见于整个基因组中。已知piRNA通过与piwi蛋白相互作用来形成RNA-蛋白质复合物。piRNA复合物已牵涉于反转座子和生殖细胞中的其它遗传元件的表观遗传基因沉默与转录后基因沉默两者中，包括牵涉于精子发生中。通常，piRNA的长度是26-31个核苷酸，并且相较于典型miRNA，它们缺乏序列保守性，并且展现较高复杂性。在一些实施方案中，根据本发明利用的寡核苷酸组合物包含5’尿苷。在一些实施方案中，根据本发明利用的寡核苷酸组合物包含5’单膦酸酯和起封闭2’或3’氧作用的3’修饰。在一些实施方案中，3’修饰是2’-O-甲基化。
成三链体寡核苷酸
在一些实施方案中，提供的组合物包括一种或多种是或充当成三链体寡核苷酸的寡核苷酸。
新近研究已显示可设计可以序列特异性方式识别并结合双链螺旋DNA中的多嘌呤/多嘧啶区域的成三链体寡核苷酸(TFO)。这些识别规则由Maher III，L.J.等，Science(1989)第245卷，第725-730页；Moser，H.E.等，Science(1987)第238卷，第645-630页；Beal，P.A.等，Science(1992)第251卷，第1360-1363页；Conney，M.等，Science(1988)第241卷，第456-459页以及Hogan，M.E等，欧洲公布375408概述。修饰寡核苷酸(如引入嵌入剂和糖间键联取代)和优化结合条件(pH和阳离子浓度)已有助于克服TFO活性的固有阻碍，如电荷排斥和不稳定性，并且近来显示可使寡核苷酸靶向特定序列(对于新近综述，参见Seidman和Glazer，Clin Invest 20032.：487-94)。一般来说，成三链体寡核苷酸具有序列对应性：
寡聚物3′-A G G T
双链体5’-A G C T
双链体3′-T C G A
然而，已显示A-AT和G-GC三联体具有最大三螺旋稳定性(Reither和Jeltsch，BMC Biochem，2002年9月12日，电子发表)。同一作者已证明根据A-AT和G-GC规则设计的TFO不形成非特异性三链体，从而指示三链体形成实际上是序列特异性的。因此，对于任何给定序列，都可设计成三链体序列。在一些实施方案中，成三链体寡核苷酸的长度是至少约15、约25或约30个或30个以上核苷酸。在一些实施方案中，成三链体寡核苷酸的长度是多达约50或约100个核苷酸。
与靶标DNA形成三螺旋结构会诱导立体和功能性变化，封闭转录启始和延伸，允许在内源性DNA中引入所需序列变化，以及导致基因表达特异性下调。用TFO处理的细胞中的基因表达的所述遏制的实例包括剔除哺乳动物细胞中的游离supFGI和内源性HPRT基因(Vasquez等，Nucl Acids Res.1999；27：1176-81以及Puri，等，J BiolChem，2001；276：28991-98)，以及序列特异性和靶标特异性下调在前列腺癌病因学中重要的Ets2转录因子(Carbone，等，Nucl Acid Res.2003；31：833-43)、和促炎症性ICAM-I基因(Besch等，J Biol Chem，2002；277：32473-79)的表达。此外，Vuyisich和Beal近来已显示序列特异性TFO可结合dsRNA，从而抑制dsRNA依赖性酶，如RNA依赖性激酶的活性(Vuyisich和Beal，Nuc，Acids Res 2000；28：2369-74)。
另外，根据以上提及的原则设计的TF0可诱导能够影响DNA修复的定向突变，由此提供内源性基因的表达下调与上调两者(Seidman和Glazer，Jlnvest 2003；112：487-94)。设计、合成和施用有效TFO的详细描述可见于以下中：Froehier等的美国专利申请号2003 017068和2003 0096980、以及Emanude等的美国专利申请号2002 012821/8和2002 0123476、以及Lawn的美国专利号5,721,138，其内容整体并入本文。
缀合物/接头
本发明也涵盖在一些实施方案中，利用的寡核苷酸是针对细胞摄取加以优化。在由本发明包括的任何利用的寡核苷酸中，引导链和/或过客链可连接于缀合物。在一些实施方案中，缀合物是疏水性的。疏水性缀合物可为分配系数高于10的小分子。缀合物可为固醇型分子(如胆固醇)或连接于C17的具有长度增加的多碳链的分子，并且缀合物的存在可影响RNA分子在有或无脂质转染试剂下被带入细胞中的能力。缀合物可通过疏水性接头连接于过客链或引导链。在一些实施方案中，疏水性接头的长度是5-12C，和/或是基于羟基吡咯烷的。在一些实施方案中，疏水性缀合物连接于过客链，并且过客链和/或引导链的CU残基被修饰。在一些实施方案中，过客链和/或引导链上的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％CU残基被修饰。在一些方面，与本发明相关的分子具有自我递送性(sd)。如本文所用，“自我递送”是指分子能够无需另一递送载体(如转染试剂)而递送至细胞中。本发明的各方面涉及选择用于RNAi中的分子。
在本文包括的任何实施方案中，利用的寡核苷酸可与疏水性部分缔合以使分子靶向细胞和/或将分子递送至细胞中。在一些实施方案中，疏水性部分通过接头与核酸分子缔合。在一些实施方案中，缔合是通过非共价相互作用来达成。在其它一些情况下，缔合是通过共价键来达成。本领域中已知的任何接头都可用于使核酸与疏水性部分缔合。本领域中已知的接头描述于以下中：公开的国际PCT申请WO92/03464、WO 95/23162、WO 2008/021157、WO 2009/021157、WO2009/134487、WO 2009/126933、美国专利申请公布2005/0107325、美国专利5,414,077、美国专利5,419,966、美国专利5,512,667、美国专利5,646,126和美国专利5,652,359，其以引用的方式并入本文。接头可简单成共价键至多原子接头。接头可为环状的或无环的。接头可任选地被取代。在一些实施方案中，接头能够自核酸裂解。在某些实施方案中，接头能够在生理条件下水解。在一些实施方案中，接头能够由酶(例如酯酶或磷酸二酯酶)裂解。在一些实施方案中，接头包含间隔子元件以使核酸与疏水性部分分隔。间隔子元件可包括一至三十个碳或杂原子。在某些实施方案中，接头和/或间隔子元件包含可质子化官能团。所述可质子化官能团可促进核酸分子的内体逃逸。可质子化官能团也可有助于核酸递送至细胞中，例如从而中和分子的总电荷。在一些实施方案中，接头和/或间隔子元件是生物惰性的(即，它不对所得核酸分子赋予生物活性或功能)。
疏水性分子可通过接头部分连接于多核苷酸。接头部分任选地是非核苷酸接头部分。非核苷酸接头是例如无碱基残基(dSpacer)、寡乙二醇(如三乙二醇(间隔子9)或六乙二醇(间隔子18))或烷二醇(如丁二醇)。间隔子单元优选是由磷酸二酯或硫代磷酸酯键连接。接头单元可在分子中仅出现一次，或可例如通过磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或酰胺键联并入数次。
典型缀合方案涉及合成在序列的一个或多个位置处携带氨基接头的多核苷酸，然而，接头并非是需要的。接着使用适当偶联或活化试剂使氨基与所缀合的分子反应。缀合反应可用仍然结合于固体载体的多核苷酸进行，或在于溶液相中裂解多核苷酸之后进行。通过HPLC纯化修饰的多核苷酸通常产生纯材料。
在一些实施方案中，连接基团可连接于核单体，并且转运肽可共价连接于接头。在一些实施方案中，接头可充当转运肽的连接位点，并且可提供相对于核酸酶的稳定性。适合接头的实例包括取代或未取代的C1-C20烷基链、C2-C20烯基链、C2-C20炔基链、肽和杂原子(例如S、O、NH等)。其它示例性接头包括双官能交联剂，如磺基丁二酰亚胺基-4-(顺丁烯二酰亚胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)(参见例如Smith等Biochem J 1991.276：417-2)。
在一些实施方案中，本发明的提供的寡核苷酸被合成为分子缀合物，其利用受体介导的内吞机制来将基因递送至细胞中(参见例如Bunnell等1992.Somatic Cell and Molecular Genetics.18：559以及其中引用的参考文献)。
靶向剂
在一些实施方案中，提供的组合物包括一种或多种与组合物和/或与其中个别寡核苷酸缔合的靶向试剂。以上以及在本文中进一步描述示例性所述靶向试剂。短语“靶向试剂”和“靶向部分”在本文中可互换使用。
寡核苷酸和/或其组合物的递送可常通过使寡核苷酸靶向细胞受体来改进。靶向部分可缀合于寡核苷酸或连接于与寡核苷酸连接的载体基团(即聚(L-赖氨酸)或脂质体)。这个方法充分适合于显示特异性受体介导的胞吞作用的细胞。
例如，寡核苷酸与6-磷酸甘露糖基化蛋白质的缀合物由表达6-磷酸甘露糖特异性受体的细胞内化的效率比游离寡核苷酸高20倍。寡核苷酸也可使用生物可降解接头偶联于细胞受体的配体。在另一实例中，递送构建体是与生物素化寡核苷酸形成紧密复合物的甘露糖基化抗生蛋白链菌素。发现甘露糖基化抗生蛋白链菌素使生物素化寡核苷酸的内化增加20倍(Vlassov等1994.Biochimica et Biophysica Acta1197：95-108)。
RNA干扰领域已使对生物过程的研究发生变革。这些工具包括小抑制性RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)和核糖酶。随着RNA干扰技术发展，验证的RNA靶标序列和供使用的试剂的清单也已增长。由本申请包括的提供的组合物和方法可易于应用于各所述靶标序列。对于验证的siRNA靶标序列的数据库以及可用于RNA干扰实验的试剂盒和试剂的链接，参见例如http：//www.rnainterference.org/index.html。适用于本发明的示例性siRNA靶标序列提供于附录(A)中。
免疫调节性寡核苷酸
在一些实施方案中，提供的组合物包括一种或多种是或充当免疫调节性寡核苷酸的寡核苷酸。
根据本发明利用的寡核苷酸可为免疫调节剂，即当向受试者施用时能够调节或调控免疫反应的试剂。由所述试剂引发的免疫反应可为先天性和/或适应性免疫反应。免疫系统分成更具先天性的免疫系统和脊椎动物的获得的适应性免疫系统，其中后者进一步分成体液细胞组分。在一些实施方案中，免疫反应可为粘膜性的。本文所述的免疫调节基序可用于先前所述类别的免疫调节性寡核苷酸的情形下，所述类别包括ODN类别，如A类、B类、C类、E类、T类和P类。
在本发明的一些实施方案中，根据本发明利用的免疫调节性寡核苷酸包括一个或多个免疫刺激性基序。在一些实施方案中，根据本发明利用的寡核苷酸包括一个或多个“CpG二核苷酸”。CpG二核苷酸可为甲基化的或未甲基化的。含有至少一个未甲基化CpG二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸是含有未甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(即未甲基化5′胞苷继之以3′鸟苷，并且由磷酸酯键连接)，并且活化免疫系统的寡核苷酸分子；所述免疫刺激性寡核苷酸是CpG寡核苷酸。CpG寡核苷酸已描述于许多授予的专利、公开的专利申请和其它公布中，包括：美国专利号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；和6,339,068，其内容以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，利用的寡核苷酸是或充当钟样受体的激动剂。在一些实施方案中，利用的寡核苷酸是或充当钟样受体9(TLR9)的激动剂。在一些实施方案中，利用的寡核苷酸是或充当钟样受体的拮抗剂。在一些实施方案中，利用的寡核苷酸是或充当钟样受体9(TLR9)的拮抗剂。在一些实施方案中，由本发明包括的立体确定的寡核苷酸相较于立体无规对应物展现对相应受体/靶标的更大亲和力。在一些实施方案中，相较于立体无规对应物，由本发明包括的立体确定的寡核苷酸在向满足某些临床标准的受试者施用时引发一种或多种免疫反应，其在群体之中的可变程度较小。在一些实施方案中，相较于立体无规对应物，由本发明包括的立体确定的寡核苷酸在向满足某些临床标准的受试者施用时导致较小程度的毒副作用或较少副作用。
在一些实施方案中，根据本发明利用的免疫刺激性寡核苷酸不含CpG二核苷酸基序。不含CpG二核苷酸的这些寡核苷酸称为非CpG寡核苷酸，并且它们具有非CpG免疫刺激性基序。在一些实施方案中，这些是富含T的免疫刺激性寡核苷酸，如具有至少80％T的寡核苷酸。
在一些实施方案中，根据本发明利用的免疫刺激性寡核苷酸是B类免疫调节性寡核苷酸。
“B类”ODN在活化B细胞方面是强力的，但在诱导IFN-α和NK细胞活化方面是相对微弱的。B类CpG寡核苷酸通常是完全稳定化的，并且在某些优选碱基背景内包括未甲基化CpG二核苷酸。参见例如美国专利号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；和6,339,068。
另一类别强力诱导IFN-α和NK细胞活化，但在刺激B细胞方面是相对微弱的；这个类别已称为“A类”。在一些实施方案中，根据本发明利用的免疫刺激性寡核苷酸是A类免疫调节性寡核苷酸。A类CpG寡核苷酸通常具有在5′和3’末端的稳定化多G序列以及含有回文磷酸二酯CpG二核苷酸的具有至少6个核苷酸的序列。参见例如公开的专利申请PCT/US00/26527(WO 01/22990)。
另一类别的CpG寡核苷酸活化B细胞和NK细胞，并且诱导IFN-α；这个类别已称为C类。在一些实施方案中，根据本发明利用的免疫刺激性寡核苷酸是C类免疫调节性寡核苷酸。“C类”免疫刺激性寡核苷酸含有至少两个对免疫系统的细胞具有独特和合乎需要的刺激作用的不同基序。这些ODN中的一些具有传统“刺激性”CpG序列与“富含GC的”基序或“B细胞中和性”基序两者。这些组合基序寡核苷酸具有落在和传统“B类”CpG ODN(其是B细胞活化和树突细胞(DC)活化的强诱导剂)相关的那些作用与和更新近所述类别的免疫刺激性寡核苷酸(“A类”CpG ODN)(其是IFN-α和自然杀伤(NK)细胞活化的强诱导剂，但为B细胞和DC活化的相对不良诱导剂)相关的那些作用之间的某处的免疫刺激作用。Krieg AM等(1995)Nature374：546-9；Ballas ZK等(1996)J Immunol 157：1840-5；Yamamoto S等(1992)J Immunol 48：4072-6。尽管优选的B类CpG ODN常具有硫代磷酸酯骨架，并且优选A类CpG ODN具有混合或嵌合骨架，但C类组合基序免疫刺激性寡核苷酸可具有稳定化例如硫代磷酸酯、嵌合或磷酸二酯骨架，并且在一些优选实施方案中，它们具有半软性骨架。这个类别已描述于2002年8月19日提交的美国专利申请USI0/224,523中，所述申请的整个内容以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，根据本发明利用的免疫刺激性寡核苷酸是E类免疫调节性寡核苷酸。“E类”寡核苷酸具有增强的诱导IFN-α分泌的能力。这些ODN具有YGZ基序的亲脂性被取代的核苷酸类似物5′和/或3′。具有E类结构式的化合物可为例如任何以下亲脂性取代的核苷酸类似物：取代的嘧啶、取代的尿嘧啶、疏水性T类似物、取代的甲苯、取代的咪唑或吡唑、取代的三唑、5-氯-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-碘-尿嘧啶、5-乙基-尿嘧啶、5-丙基-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、(E)-5-(2-溴乙烯基)-尿嘧啶或2.4-二氟-甲苯。E类寡核苷酸至少描述于临时专利申请US 60/847,811中。
在一些实施方案中，根据本发明利用的免疫刺激性寡核苷酸是T类免疫调节性寡核苷酸。当不像本发明的ODN中那样加以修饰时，“T类”寡核苷酸相较于B类或C类寡核苷酸诱导较低水平的IFN-α以及IFN相关细胞因子和趋化因子分泌，同时保留与B类寡核苷酸类似的诱导各种水平的IL-10的能力。T类寡核苷酸至少描述于美国专利申请号1I/099,683中，所述申请的整个内容据此以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，根据本发明利用的免疫刺激性寡核苷酸是P类免疫调节性寡核苷酸。“P类”免疫刺激性寡核苷酸具有若干结构域，包括5TLR活化结构域、2个成双链体区域以及任选地间隔子和3′尾部。这个类别的寡核苷酸在一些情况下能够比C类诱导高得多的IFN-α分泌水平。P类寡核苷酸能够在体外和/或在体内自发自我装配成多联体。在不受这些分子的作用方法的任何特定理论束缚下，一个潜在假设是这个性质赋予P类寡核苷酸更高度交联某些免疫细胞内部的TLR9的能力，从而相较于先前所述类别的CpG寡核苷酸，诱导不同免疫活化样式。交联TLR9受体可诱导通过浆细胞样树突细胞中的I型IFNR反馈环路来活化更强IFN-α分泌。P类寡核苷酸至少描述于美国申请序列号11/706,561中。
在一些实施方案中，根据本发明利用的免疫刺激性寡核苷酸是S类免疫调节性寡核苷酸。本发明的免疫调节性寡核苷酸可为免疫遏制性寡核苷酸。上述免疫调节基序可用于先前所述类别的免疫遏制性寡核苷酸的背景下，所述类别包括ODN类别，如“S类”。每当抑制免疫刺激是合乎需要的时，抑制性ODN或S类ODN都是适用的。抑制性ODN可用于预防和治疗败血性休克、炎症、过敏、哮喘、移植物排斥、移植物抗宿主疾病(GvHD)、自体免疫性疾病、Th1或Th2介导的疾病、细菌性感染、寄生虫性感染、自发性流产和肿瘤。抑制性ODN可通常用于抑制表达相关TLR的所有细胞的活化，并且更具体来说，抑制抗原递呈细胞、B细胞、浆细胞样树突细胞(pDC)、单核细胞、单核细胞源性细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性白细胞的活化。S类ODN至少进一步描述于美国申请序列号10/977,560中。
根据本发明，除一种或多种稳定性FANA嘌呤核苷酸之外，免疫调节性寡核苷酸也可具有稳定化核苷酸间键联的骨架，或具有稳定化核苷酸键联和磷酸二酯核苷酸键联的嵌合骨架。“稳定化核苷酸间键联”将指相较于磷酸二酯核苷酸间键联，对体内降解(例如通过核酸外切酶或核酸内切酶)具有相对抗性的核苷酸间键联。在一些实施方案中，稳定化核苷酸间键联包括但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、膦酰基乙酸酯、Rp--硫代磷酸酯、Sp-硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或3′-硫代甲缩醛或其组合。其它稳定化寡核苷酸包括：非离子DNA类似物，如烷基磷酸酯和芳基磷酸酯(其中带电荷的膦酸酯氧被烷基或芳基置换)、磷酸二酯和烷基磷酸三酯，其中带电荷的氧部分被烷基化。在任一或两个末端含有二醇(如四乙二醇或六乙二醇)的寡核苷酸也已显示大致上对核酸酶降解具有抗性。
如本文更详细所述，根据本发明，这些和其它修饰可选择性地引入在寡核苷酸内的一个或多个预定位置/一个或多个样式处以获得立体特异性寡核苷酸分子。此外，根据本发明，可获得包含多种处于极高度纯度(例如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、基本上100％)下的所述寡核苷酸的组合物。因此，包含具有一种或多种预定类型的寡核苷酸的提供的寡核苷酸组合物适于体内施用。预期由于组合物中的寡核苷酸具有高度结构纯度(以使组合物包含单一指定类型的寡核苷酸)，提供的组合物在向受试者施用时可引发改进的生物活性、增加的功效、降低的反应可变性和/或降低的非所要副作用。
因此，当配制成药物组合物时，本发明的利用的寡核苷酸特别适用作治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂是免疫调节剂。在一些实施方案中，提供的免疫调节剂是免疫刺激剂。在一些实施方案中，提供的免疫调节剂是免疫抑制(或免疫遏制)剂。在一些实施方案中，提供的免疫调节剂充当佐剂。在一些实施方案中，提供的免疫调节剂可通过诱导可遏制炎症性Th2反应的Th1型细胞因子来使Th2型免疫反应移动至Th1型免疫反应。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸组合物适用作调控基因表达的试剂。例如，在一些实施方案中，提供的寡核苷酸组合物适用作能够使目标基因(例如与疾病或病症相关的基因)沉默的试剂。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸组合物适用作用以调控RNA剪接的试剂。
例如，所述寡核苷酸的一些实施方案包括包含至少一个CpG二核苷酸基序的那些。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含至少一个未甲基化CpG二核苷酸基序。在一些实施方案中，适用于本发明的含有CpG的寡核苷酸被分类为A类(D型)寡核苷酸。在一些实施方案中，适用于本发明的含有CpG的寡核苷酸被分类为B类(K型)寡核苷酸。在一些实施方案中，适用于本发明的含有CpG的寡核苷酸被分类为C类寡核苷酸。在一些实施方案中，适用于本发明的含有CpG的寡核苷酸被分类为P类寡核苷酸。在一些实施方案中，适用于本发明的含有CpG的寡核苷酸含有至少一个回文序列。在一些实施方案中，适用于本发明的含有CpG的寡核苷酸可形成“哑铃样”结构。在一些实施方案中，适用于本发明的含有CpG的寡核苷酸可形成“Y”形结构或其多聚体。在一些实施方案中，适用于本发明的含有CpG的寡核苷酸可形成四面体结构。对于综述，参见例如：Bode等(2011)Expert Rev.Vaccines 10(4)：499-511；Hanagata(2012)Int.J.Nanomedicine 7：2181-95。
在一些实施方案中，根据本发明利用的寡核苷酸引发对表达钟样受体的细胞的免疫调节作用。在一些实施方案中，对所述寡核苷酸起反应的靶标细胞包括但不限于抗原递呈细胞(APC)、抗原特异性T细胞和B细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、自然杀伤(NK)细胞和树突细胞(DC)。在一些实施方案中，免疫调节作用是由表达一种或多种识别所述寡核苷酸的受体的细胞引发的直接作用。在一些实施方案中，所述寡核苷酸作为配体引发对表达钟样受体9(TLR9)的细胞的免疫调节作用。例如，本发明的一些实施方案包括充当一种或多种钟样受体的激动剂的CpG寡核苷酸。本发明的一些实施方案包括充当一种或多种钟样受体的拮抗剂的CpG寡核苷酸。在一些实施方案中，免疫调节作用是发生在下游，涉及不必直接对所述寡核苷酸起反应或不表达所述受体的细胞的间接作用。
在一些实施方案中，适用于本发明的CpG寡核苷酸的特征在于它们通过TLR-9直接活化人B细胞和浆细胞样树突细胞。在一些实施方案中，适用于本发明的CpG寡脱氧核苷酸的特征在于间接支持自然杀伤细胞、T细胞和单核细胞/巨噬细胞的成熟和增殖。
在一些实施方案中，适用于本发明的CpG寡核苷酸触发特征在于产生Th1型和促炎性细胞因子、趋化因子和多反应性IgM的免疫反应。
在一些实施方案中，适用于本发明的CpG寡核苷酸的特征在于常规蛋白质抗原和肽基疫苗的免疫原性由所述寡核苷酸增强。在不希望受特定理论束缚下，据信所述佐剂作用是通过专门抗原递呈细胞的功能改进以及作为结果而发生的体液和细胞疫苗特异性免疫反应的产生来介导。
在一些实施方案中，适用于本发明的CpG寡核苷酸的特征在于CpG寡核苷酸增加疫苗诱导的反应的量值，并且加速疫苗诱导的反应的进展。它们也改进对记忆的诱导，由此延长体液和细胞免疫性的持续时间。
在一些实施方案中，适用于本发明的CpG寡核苷酸的特征在于它们加强各组免疫功能降低的受试者(例如患者群体)，如老年人和免疫系统受遏制者的免疫性。它们在全身性或经粘膜施用时是有效的。使用具有混合手性(例如非手性纯)的CpG寡核苷酸进行的临床前和临床试验证明CpG寡核苷酸可加强靶向感染性疾病和癌症的疫苗的免疫原性。此外，临床试验指示CpG寡核苷酸在作为疫苗佐剂施用时相当安全。
根据本公开制备的免疫调节性寡核苷酸适用于许多治疗应用。因此，利用的免疫调节性寡核苷酸可配制成适合药物组合物。所述药物组合物可通过适合施用途径以如本文进一步详细所述的有效治疗疾病、病症或病状的量向受试者施用。根据本发明，有效量的免疫刺激性寡核苷酸可向可能受益于加强免疫系统(例如免疫反应增强)的受试者施用。在一些实施方案中，临床益处是由免疫调节性寡核苷酸作用于它的靶标免疫细胞，例如通过配体结合它的钟样受体蛋白质来直接赋予。在一些实施方案中，临床益处是通过使受试者的免疫系统总体加强来至少部分地间接达成。
如本文所用，术语“有效量”和“有效剂量”是指化合物或组合物足以实现它的一个或多个预定目的，即在可接受的益处/风险比率下在组织或受试者中实现所需生物或医学反应的任何量或剂量。相关预定目的可为客观的(即可通过某一测试或标记测量)或主观的(即受试者指示或感受某一作用)。在一些实施方案中，治疗有效量是在向满足疾病或病症的某些临床标准(例如如通过显现的症状、疾病进展/阶段、遗传谱等来确定)的受试者的群体施用时，在所述群体之中获得统计显著治疗反应的量。治疗有效量通常是以可包括多个单位剂量的给药方案施用。对于任何特定药物制剂，治疗有效量(和/或有效给药方案内的适当单位剂量)可例如视施用途径、与其它药物制剂的组合而变化。在一些实施方案中，用于任何特定患者的具体治疗有效量(和/或单位剂量)可取决于多种因素，包括所治疗病症和病症的严重性；所用具体药物制剂的活性；所用具体组合物；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和/或所用具体药物制剂的排泄或代谢速率；治疗的持续时间；以及如医学领域中所熟知的类似因素。本领域普通技术人员将了解在本发明的一些实施方案中，如果单位剂量含有适于在与正性结果相关的剂量方案的背景下施用的量，那么它可被考虑来含有有效量。在一些实施方案中，根据本发明制备的CpG寡脱氧核苷酸因此可由于它们的手性纯度而施加改进的功效和免疫调节作用。在一些实施方案中，提供的免疫调节性寡核苷酸的有效量小于纯度较小的对应物的有效量。
在一些实施方案中，免疫调节性寡核苷酸组合物是向健康受试者施用。在一些实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸组合物是作为疫苗的一部分向受试者施用，其中免疫刺激性寡核苷酸充当佐剂。在一些实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸组合物是向免疫系统受遏制(例如损害)的受试者施用。在一些实施方案中，免疫系统受遏制，并且不对常规疫苗充分起反应的受试者对包含由本发明包括的免疫刺激性寡核苷酸的疫苗起反应。在一些实施方案中，可受益于所述疫苗的受试者具有与感染(如病毒性感染，例如HIV、HBV、HCV等)相关的受遏制的免疫系统。
本发明涵盖本文涵盖的免疫调节性寡核苷酸用于治疗患有可通过刺激或遏制免疫反应来治疗的病状的受试者的用途。因此，提供的免疫调节性寡核苷酸组合物适用于治疗疾病或病状，包括但不限于感染、癌症、过敏、哮喘、炎症性病状、自体免疫性疾病及其任何组合。
在一些实施方案中，提供的免疫调节性寡核苷酸组合物在本发明的一些方面适用于治疗处于发展临床病状的风险下的受试者。非限制性临床病状包括过敏、哮喘、受感染性生物体感染、癌症、炎症和自体免疫性疾病。如本文所用的处于风险下的受试者是具有暴露于致感染病原体或癌症或过敏原的任何风险或显现癌症的风险的受试者。例如，处于风险下的受试者可为计划至发现特定类型的感染物所处的区域旅行的受试者，或可为通过生活方式或医学程序暴露于可含有感染性生物体的体液或直接暴露于生物体的受试者，或甚至生活在已鉴定感染性生物体或过敏原所处的区域中的任何受试者。处于显现感染的风险下的受试者也包括医学机构向其推荐用特定感染性生物体抗原进行疫苗接种的一般群体。如果抗原是过敏原，并且受试者对那个特定抗原显现过敏反应，并且受试者可能暴露于抗原，即在花粉季节期间暴露于抗原，那么那个受试者处于暴露于抗原的风险下。处于显现过敏或哮喘的风险下的受试者包括已被鉴定为患有过敏或哮喘，但在免疫调节性寡核苷酸治疗期间不患有活动性疾病的那些受试者，以及被视为由于遗传或环境因素而处于显现这些疾病的风险下的受试者。处于显现癌症的风险下的受试者是显现癌症的概率较高者。这些受试者包括例如具有其存在已被证明与显现癌症的可能性较高具有相关关系的遗传异常性的受试者，以及暴露于致癌剂，如烟草、石棉或其它化学毒素的受试者，或先前已治疗癌症并处于明显缓解状态下的受试者。当处于显现癌症的风险下的受试者用特异于受试者处于显现其风险下的癌症类型的抗原以及CpG免疫刺激性寡核苷酸治疗时，受试者可能够当癌细胞显现时杀死它们。如果肿瘤开始在受试者中形成，那么受试者将产生针对肿瘤抗原的特异性免疫反应。
在一些实施方案中，提供的免疫调节性寡核苷酸组合物适用于治疗患有免疫疾病或病症，包括哮喘、过敏和相关病状的受试者。
患有过敏的受试者是具有显现反应于过敏原的过敏反应的风险或处于所述风险下的受试者。过敏是指对某一物质(过敏原)的获得性过敏性。过敏病状包括但不限于湿疹、过敏性鼻炎或鼻炎、枯草热、结膜炎、支气管哮喘、荨麻疹(麻疹)和食物过敏以及其它异位性病状。
过敏通常是由针对无害过敏原产生IgE抗体引起。由全身性或经粘膜施用免疫调节性寡核苷酸诱导的细胞因子主要是称为Th1的类别(实例是IL-12、IP-10、IFN-α和IFN-γ)，并且这些细胞因子诱导体液免疫反应与细胞免疫反应两者。与IL-4和IL-5细胞因子的产生相关的另一主要类型的免疫反应称为Th2免疫反应。一般来说，过敏疾病似乎是由Th2型免疫反应介导。基于免疫调节性寡核苷酸能够使受试者的免疫反应自主要Th2(其与IgE抗体和过敏的产生相关)移动至平衡的Th2/Th1反应(其具有针对过敏反应的保护性)，可向受试者施用有效用于诱导免疫反应的剂量的免疫调节性寡核苷酸以治疗或预防哮喘和过敏。
因此，提供的免疫调节性寡核苷酸组合物在治疗过敏和非过敏病状(如哮喘)方面具有显著治疗效用。Th2细胞因子，尤其是IL-4和IL-5在哮喘受试者的气道中升高。这些细胞因子促进哮喘炎症性反应的重要方面，包括IgE同位素转换、嗜酸性粒细胞趋化性和活化以及肥大细胞生长。Th1细胞因子，尤其是IFN-γ和IL-12可遏制Th2克隆的形成以及Th2细胞因子的产生。哮喘是指特征在于炎症、气道狭窄以及气道对吸入物的反应性增加的呼吸系统病症。哮喘常常但非仅与异位性症状或过敏症状相关。
提供的免疫调节性寡核苷酸组合物也可连同抗过敏疗法一起施用。用于治疗或预防过敏的常规方法已涉及使用过敏药剂或脱敏疗法。用于治疗或预防过敏的一些进展性疗法包括使用中和抗1gE抗体。抗组胺剂和封闭过敏反应的化学介体的作用的其它药物有助于调控过敏症状的严重性，但不预防过敏反应，并且对随后过敏反应不具有作用。脱敏疗法是通过通常通过在皮肤下注射给与小剂量的过敏原以诱导针对过敏原的IgG型反应来进行。据信IgG抗体的存在有助于中和由诱导IgE抗体所致的介体的产生。最初，受试者用极低剂量的过敏原处理以避免诱导重度反应，并且缓慢增加剂量。这个类型的疗法是危险的，因为受试者实际上被施用导致过敏反应的化合物，并且可导致重度过敏反应。抗过敏药剂包括但不限于抗组胺剂、皮质类固醇和前列腺素诱导剂。抗组胺剂是抵抗由肥大细胞或嗜碱性粒细胞释放的组胺的化合物。这些化合物在本领域中是熟知的，并且通常用于治疗过敏。抗组胺剂包括但不限于阿伐斯汀(acrivastine)、阿司咪唑(astemizole)、阿扎他定(azatadine)、氮卓斯汀(azelastine)、贝他斯汀(betatastine)、溴非尼拉敏(brompheniramine)、布克立嗪(buclizine)、西替利嗪(cetirizine)、西替利嗪类似物、氯非尼拉敏(chlorpheniramine)、氯马斯汀(clemastine)、CS 560、赛庚啶(cyproheptadine)、地氯雷他定(desloratadine)、右氯非尼拉敏(dexchlorpheniramine)、依巴斯汀(ebastine)、依匹斯汀(epinastine)、非索非那定(fexofenadine)、HSR 609、羟嗪(hydroxyzine)、左卡巴斯汀(levocabastine)、氯雷他定(loratidine)、甲基东茛菪碱(methscopolamine)、咪唑斯汀(mizolastine)、诺阿司咪唑(norastemizole)、苯茚胺(phenindamine)、异丙嗪(promethazine)、吡拉明(pyrilamine)、特非那定(terfenadine)和曲尼司特(tranilast)。皮质类固醇包括但不限于甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、倍氯米松(beclomethasone)、布地缩松(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、氟尼缩松(flunisolide)、氟替卡松丙酸盐(fluticasone propionate)和曲安奈德(triamcinolone)。尽管地塞米松是一种具有消炎作用的皮质类固醇，但它不经常用于以吸入形式治疗过敏或哮喘，因为它被高度吸收，并且它在有效剂量下具有长期遏制性副作用。然而，地塞米松可根据本发明用于治疗过敏或哮喘，因为当与本发明的组合物组合施用时，它可在低剂量下施用以降低副作用。与皮质类固醇使用相关的一些副作用包括咳嗽、发声困难、口部鹅口疮(念珠菌病)、以及在较高剂量下的如以下的全身性作用：肾上腺遏制、葡萄糖不耐受性、骨质疏松、无菌性骨坏死、白内障形成、生长遏制、高血压、肌肉无力、皮肤变薄和容易瘀伤。Barnes和Peterson(1993)Am Rev Respir Dis 148：S1-S26；以及Kamada AK等(1996)Am J Respir Crit Care Med 153：1739-48。
根据本发明的提供的寡核苷酸组合物和方法可单独或连同适用于治疗哮喘的其它药剂和方法一起使用。在一个方面，本发明提供一种治疗患有哮喘的受试者的方法。根据本发明的这个方面的方法包括向患有哮喘的受试者施用有效量的本发明的组合物以治疗所述受试者的步骤。
在一些实施方案中，本发明提供一种治疗患有哮喘的受试者的方法。根据本发明的这个方面的方法包括向患有哮喘的受试者施用有效量的本发明的组合物和抗哮喘疗法以治疗所述受试者的步骤。
如本文所用的“哮喘”是指特征在于炎症和气道狭窄以及气道对吸入物的反应性增加的呼吸系统病症。哮喘常常但非仅与异位性病状或过敏病状相关。哮喘的症状包括由气流阻塞所致的喘息、气喘、胸部发紧和咳嗽的复发性发作。与哮喘相关的气道炎症可通过观察许多生理变化来检测，所述生理变化如气道上皮剥脱、胶原蛋白沉积在基底膜下方、水肿、肥大细胞活化、炎症性细胞浸润，包括嗜中性白细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞。由于气道炎症，哮喘患者常经受气道高反应性、气流限制、呼吸道症状和疾病慢性。气流限制包括急性支气管收缩、气道水肿、粘液栓形成和气道重塑，这些是常导致支气管阻塞的特征。在哮喘的一些情况下，可发生基底膜下纤维化，从而导致肺功能持续异常。
过去若干年的研究已揭示哮喘可能由炎症性细胞、介体和驻留在气道中的其它细胞和组织之间的复杂相互作用所致。肥大细胞、嗜酸性粒细胞、上皮细胞、巨噬细胞和活化的T细胞都在与哮喘相关的炎症性过程中起重要作用。Djukanovic R等(1990)Am Rev Respir Dis142：434-457。据信这些细胞可通过分泌预形成和新合成的可直接或间接作用于局部组织的介体来影响气道功能。也已认识到T淋巴细胞的子群体(Th2)通过释放选择性细胞因子以及建立疾病慢性来在调控气道中的过敏炎症方面起重要作用。Robinson DS等(1992)N Engl JMed 326：298-304。
哮喘是一种在发育中的不同阶段出现的复杂病症，并且可基于症状的程度分类成急性、亚急性或慢性。急性炎症性反应与细胞早期募集至气道中相关。亚急性炎症性反应涉及募集细胞以及活化驻留细胞，从而导致更持续样式的炎症。慢性炎症性反应的特征在于具有持续细胞损害水平和进行中的修复过程，此可导致永久气道异常。
“患有哮喘的受试者”是患有特征在于炎症和气道狭窄以及气道对吸入物的反应性增加的呼吸系统病症的受试者。与哮喘的引发相关的因素包括但不限于过敏原、冷温度、运动、病毒性感染和SO2。
如上所提及，哮喘可与Th2型免疫反应相关，所述免疫反应至少部分由Th2细胞因子IL-4和IL-5以及抗体同种型转换成IgE表征。Th1和Th2免疫反应具有互相相反调控性，以致免疫反应向Th1型免疫反应偏斜可阻止或改善Th2型免疫反应，包括过敏。因此，本发明的提供的免疫调节性寡核苷酸组合物独自适用于治疗患有哮喘的受试者，因为类似物可使免疫反应向Th1型免疫反应偏斜。
本发明的提供的免疫调节性寡核苷酸组合物也可连同哮喘疗法一起施用。用于治疗或预防哮喘的常规方法已涉及使用抗过敏疗法(上述)和许多其它药剂，包括吸入的药剂。
用于治疗哮喘的药物通常被分成两个种类，即快速减轻药物和长期控制药物。哮喘患者每日采用长期控制药物以达成和维持对持续哮喘的控制。长期控制药物包括消炎剂，如皮质类固醇、色甘酸钠(chromolyn sodium)和奈多罗米(nedocromil)；长效支气管扩张剂，如长效β2-激动剂和甲基黄嘌呤；以及白三烯(leukotriene)调节剂。快速减轻药物包括短效β2激动剂、抗胆碱能剂和全身性皮质类固醇。存在与这些药物中的各个相关的许多副作用，并且单独或组合的药物都不能够预防或完全治疗哮喘。
抗哮喘药剂包括但不限于PDE-4抑制剂、支气管扩张剂/β-2激动剂、K+通道打开剂、VLA-4拮抗剂、烯丙异戊酰脲(neurokin)拮抗剂、血栓烷(thromboxane)A2(TXA2)合成抑制剂、黄嘌呤、花生四烯酸拮抗剂、5脂肪加氧酶抑制剂、TXA2受体拮抗剂、TXA2拮抗剂、5-脂氧合酶活化蛋白的抑制剂、和蛋白酶抑制剂。
支气管扩张剂/β2激动剂是一类导致支气管扩张或平滑肌松弛的化合物。支气管扩张剂/β2激动剂包括但不限于沙美特罗(salmeterol)、柳丁氨醇(salbutamol)、沙丁胺醇(albuterol)、特布他林(terbutaline)、D2522/福莫特罗(formoterol)、非诺特罗(fenoterol)、比托特罗(bitolterol)、吡布特罗(pirbuerol)甲基黄嘌呤和奥西那林(orciprenaline)。除消炎疗法之外，长效β2激动剂和支气管扩张剂也是用于长期预防症状的化合物。长效β2激动剂包括但不限于沙美特罗和沙丁胺醇。这些化合物通常与皮质类固醇组合使用，并且通常不在无任何炎症性疗法下使用。它们已与如心动过速、骨骼肌震颤、低钾血症和在过度剂量下的QTc间隔延长的副作用相关联。
包括例如茶碱(theophylline)的甲基黄嘌呤已用于长期控制和预防症状。这些化合物导致由磷酸二酯酶抑制和可能腺苷拮抗所致的支气管扩张。剂量相关的急性毒性是这些类型的化合物的特定问题。因此，必须监测常规血清浓度以虑及由个体代谢清除率差异引起的毒性和狭窄治疗范围。副作用包括心动过速、快速性心律不整、恶心和呕吐、中枢神经系统刺激、头痛、癫痫发作、吐血、高血糖和低钾血症。短效β2激动剂包括但不限于沙丁胺醇、比托特罗、吡布特罗和特布他林。与施用短效β2激动剂相关的一些不利作用包括心动过速、骨骼肌震颤、低钾血症、乳酸增加、头痛和高血糖。
色甘酸钠和奈多罗米用作用于主要预防由运动引起的哮喘症状或由过敏原引起的过敏症状的长期控制药物。据信这些化合物通过干扰氯离子通道功能来封闭针对过敏原的早期和晚期反应。它们也使肥大细胞膜稳定，并且抑制介体的活化以及自嗜酸性粒细胞和上皮细胞的释放。通常需要施用四至六周时期来达成最大益处。
抗胆碱能剂通常用于减轻急性支气管痉挛。据信这些化合物通过竞争性抑制蕈毒碱胆碱能受体来起作用。抗胆碱能剂包括但不限于异丙托溴铵(ipratropium bromide)。这些化合物仅逆转以胆碱能方式介导的支气管痉挛，并且不改进与抗原的任何反应。副作用包括口部和呼吸道分泌物变干、在一些个体中喘息增加以及视力模糊(如果喷雾在眼中)。
在一些实施方案中，提供的免疫调节性寡核苷酸组合物也可适用于治疗气道重塑。气道重塑由气道中的平滑肌细胞增殖和/或粘膜下增厚所致，并且最终导致气道狭窄，从而导致气流受限制。本发明的免疫调节性寡核苷酸可防止进一步重塑，并且可能甚至降低由重塑过程所致的组织累积。
在一些实施方案中，提供的免疫调节性寡核苷酸组合物适用于治疗患有炎症性病症的受试者。如本文所用，术语“炎症性病症”是指与先天性免疫系统的抗原非特异性反应相关的病状，所述反应涉及白细胞和血浆蛋白质在感染、毒素暴露或细胞损伤的部位处累积和活化。作为炎症的特征的细胞因子包括肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素1(IL-1)、IL-6、IL-12、干扰素α(IFN-α)、干扰素β(IFN-β)和趋化因子。因此，某些类型的哮喘、过敏和自体免疫性病症可具有炎症性病症的特征。炎症性病症也包括例如心血管疾病、慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管扩张、慢性胆囊炎、结核、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′sthyroiditis)、败血症、类肉瘤病、硅肺病和其它尘肺病以及伤口中植入的异物，但并不如此限制炎症性病症。如本文所用，术语“败血症”是指一种与宿主的对微生物侵袭的全身炎症性反应相关的充分认识的临床综合征。如本文所用的术语“败血症”是指通常以发热或低温、心动过速和呼吸急促作为信号，并且在重度情况下可进展成低血压、器官功能障碍以及甚至死亡的病状。
在一些实施方案中，提供的免疫调节性寡核苷酸组合物适用于治疗患有感染的受试者。在一些实施方案中，提供的免疫调节性寡核苷酸组合物适用于治疗易感感染的受试者，包括可能暴露于一种或多种病原体的那些。在一些方面，根据本发明利用的免疫调节性寡核苷酸也可用于治疗或预防由病毒、细菌、真菌或寄生虫所致的感染。患有感染的受试者是已暴露于感染性病原体，并且在体内具有急性或慢性可检测水平的病原体的受试者。免疫调节性寡核苷酸可与或不与抗原一起用于发动能够降低感染性病原体的水平或根除感染性病原体的抗原特异性全身性或粘膜性免疫反应。如本文所用的感染性疾病是由在体内存在外来微生物引起的疾病。特别重要的是开发有效疫苗策略和治疗剂来保护身体的作为病原体进入的主要部位的粘膜表面。
病毒是通常含有核酸核心和蛋白质衣壳，但不独立地是活生物体的小感染剂。病毒也可采用缺乏蛋白质的感染性核酸的形式。病毒不能在不存在它可在其内部复制的活细胞下存活。病毒通过胞吞或直接注射DNA(噬菌体)来进入特定活细胞并繁殖，从而导致疾病。繁殖的病毒可接着被释放，并且感染其它细胞。一些病毒是含DNA病毒，而其它病毒是含RNA病毒。DNA病毒包括痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、乳多空病毒、细小病毒和嗜肝DNA病毒。RNA病毒包括微小RNA病毒、萼状病毒、星状病毒、外衣病毒、黄病毒、冠状病毒、副粘病毒、正粘病毒、布尼亚病毒(Bunyavirus)、沙粒病毒、弹状病毒、丝状病毒、博尔纳病毒(Bornavirus)、呼肠孤病毒和逆转录病毒。在一些方面，本发明也旨在治疗其中朊病毒牵涉于疾病进展中的疾病，例如像牛海绵状脑病变(即疯牛病，BSE)或动物中的瘙痒病感染或人中的克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)。
病毒包括但不限于肠病毒(包括但不限于小核糖核酸病毒科病毒，如脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒(Coxsackie virus)、埃可病毒(echovirus))、轮状病毒、腺病毒和肝炎病毒，如甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎。已见于人中的病毒的具体实例包括但不限于：逆转录病毒科(例如人免疫缺陷病毒，如HIV-1(也称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV或HIV-III；和其它分离株，如HIV-LP))；小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；嵌杯状病毒科(例如导致胃肠炎的病毒株)；披盖病毒科(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(例如登革热病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(例如冠状病毒)；弹状病毒科(例如水泡性口膜炎病毒、狂犬病病毒)；纤丝病毒科(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道融合性病毒)；正粘病毒科(例如流感病毒)；本扬病毒科(例如汉坦病毒、布尼亚病毒、白蛉病毒和纳伊罗病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(例如呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双核糖核酸病毒科；肝脱氧核糖核酸病毒科(乙型肝炎病毒)；微小病毒科(细小病毒)；乳多空病毒科(乳头状瘤病毒、多形瘤病毒)；腺病毒科(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV))；痘病毒科(开花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；虹彩病毒科(例如非洲猪瘟病毒)；和其它病毒，即急性哮吼伴随病毒、α病毒、卡波西氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma)相关的疱疹病毒、新城鸡瘟病毒、尼帕病毒、诺瓦克病毒、乳头状瘤病毒、副流感病毒、禽流感、SAR病毒、西尼罗病毒(West Nile virus)。感染植物的病毒包括例如苜蓿花叶病毒属和/或苜蓿花叶病毒科的病毒：雀麦花叶病毒科，α隐藏病毒：分体病毒科、杆菌状病毒，β隐藏病毒：分体病毒科，斑病毒：联体病毒科，雀麦花叶病毒：雀麦花叶病毒科，大麦黄化花叶病毒：马铃薯Y病毒科、线形病毒、香石竹潜隐病毒、香石竹斑驳病毒：蕃茄丛矮病毒科、花椰菜花叶病毒、长线形病毒，豇豆花叶病毒：豇豆花叶病毒科，南瓜花叶病毒：雀麦花叶病毒科，质型弹状病毒：弹状病毒科、香石竹病毒、碗豆耳突花叶病毒，蚕豆萎蔫病毒：豇豆花叶病毒科，斐济病毒：呼肠孤病毒科、真菌传杆状病毒、大麦病毒，甜菜卷毛顶病毒(Hybrigeminivirus)：联体病毒科、悬钩子病毒，等径易变病毒：雀麦花叶病毒科，番薯属病毒：马铃薯Y病毒科、大麦黄矮病毒、玉蜀黍萎黄斑点病毒、柘树属病毒、玉米雷亚朵非罗病毒，单双粒病毒：联体病毒科、矮缩病毒、坏死病毒，线虫传多面体病毒：豇豆花叶病毒科，核型弹状病毒：弹状病毒科，水稻病毒：呼肠孤病毒科、欧尔密病毒，植物呼肠病毒：呼肠孤病毒科、马铃薯X病毒，马铃薯Y病毒：马铃薯Y病毒科，黑麦草花叶病毒：马铃薯Y病毒科、卫星RNA、卫星病毒，欧防风黄点病毒：欧防风黄点病毒科、南方菜豆花叶病毒、水稻条纹叶枯病毒、烟草花叶病毒、烟草脆裂病毒，番茄丛矮病毒：蕃茄丛矮病毒科，番茄斑萎病毒：本扬病毒科、苹果退绿叶斑病毒、芜菁黄花叶病毒、伞形植物病毒，未指定的马铃薯Y病毒：马铃薯Y病毒科，未指定的弹状病毒：弹状病毒科、巨脉病毒，矮化病毒：欧防风黄点病毒科，未归类的病毒、雀麦花叶病毒科、马铃薯Y病毒科和芜菁黄花叶病毒科；特别相关植物病毒包括例如烟草花叶病毒(TMV)、番茄斑萎病毒、番茄黄叶卷曲病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒、花椰菜花叶病毒、非洲木薯花叶病毒、李痘病毒、雀麦花叶病毒、马铃薯X病毒、柑橘衰退病毒、大麦黄矮病毒、马铃薯卷叶病毒和番茄丛矮病毒。
病毒性肝炎是可产生肿胀、触痛以及有时永久性肝损伤的肝脏炎症。如果肝脏炎症持续至少六个月或六个月以上，那么它称为慢性肝炎。存在至少五种已知会导致病毒性肝炎的不同病毒，包括甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎。甲型肝炎通常通过被人粪便污染的食物或饮用水来传递。乙型肝炎通常通过如血液的体液来传播。例如，它可通过性接触、污染的血液输注和针头来自母体传播至出生的儿童。丙型肝炎十分常见，并且如同乙型肝炎一样，常通过血液输注和污染的针头来传播。丁型肝炎最常见于作为它与之共同相伴的乙型肝炎病毒的载体的IV药物使用者中。戊型肝炎类似于甲型病毒性肝炎，并且通常与卫生措施不良相关。
革兰氏阴性细菌与革兰氏阳性细菌两者均充当脊椎动物中的抗原。所述革兰氏阳性细菌包括但不限于巴斯德氏菌属、葡萄球菌属和链球菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌、假单胞菌属和沙门氏菌属。感染性细菌的具体实例包括但不限于幽门螺旋杆菌(Helicobacter pyloris)、伯氏疏螺旋体(Borelia burgdorferi)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、分枝杆菌属(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、细胞内分枝杆菌(M.intracellular)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、单核细胞增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌属)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(B组链球菌属)、链球菌属(绿色组)、粪链球菌(Streptococcusfaecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌属(厌氧属)、肺炎链球菌、病原性弯曲杆菌属(pathogenic Campylobacter sp.)、肠球菌属、流感嗜血杆菌、炭疽杆菌(Bacillus antracis)、白喉棒杆菌(corynebacterium diphtheriae)、棒杆菌属、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、多杀巴斯德氏杆菌(Pasturella multocida)、拟杆菌属、核粒梭形杆菌(Fusobacterium nucleatum)、
念珠状链杆菌、梅毒密螺旋体(Treponema pallidium)、细弱密螺旋体、钩端螺旋体属、立克次氏体属和伊氏放线菌(Actinomycesisraelii)。
真菌的实例包括新型隐球菌(Cryptococcυsneoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatυm)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、白色念珠菌(Candida albicans)。
其它感染性生物体(即原生生物)包括疟原虫属，如恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫以及间日疟原虫和鼠弓形虫(Toxoplasmagondii)。血液携带和/或组织寄生虫包括疟原虫属、果氏巴贝虫(Babesia microti)、分歧巴贝虫(Babesia divergens)、热带利什曼虫、利什曼原虫属、巴西利什曼虫、杜氏利什曼虫、冈比亚锥虫(Trypanosomagambiense)以及罗德西亚锥虫(非洲昏睡病)、克氏锥虫(恰加斯氏病(Chagas′disease))和鼠弓形虫。
其它医学相关微生物已广泛描述于文献中，例如参见C.G.AThomas，Medical Microbiology，Bailliere Tindall，Great Britain 1983，其整个内容据此以引用的方式并入本文。也已知农业相关微生物(例如感染作物和/或家畜的那些)，例如但不限于例如以下中所述的那些：George N.Agrios，Plant Pathology，Elsevier Academic Press，第5版，2005；John Lucas，Plant Pathology and Plant Pathogens，Wiley-Blackwell；第3版，1998；Dwight C.Hirsh，N.James MacLachlan，Richard L.Walker，Veterinary Microbiology，Wiley-Blackwell；第2版，2004；以及P.J.Quinn，等，Veterinary Microbiology and Microbial Disease，Wiley-Blackwell；第2版，2011。
本发明的提供的寡核苷酸组合物可与抗微生物剂一起向受试者(包括例如人受试者，或在一些实施方案中，动物[例如家畜或宠物]或植物[例如作物]受试者)施用。如本文所用的抗微生物剂是指能够杀死或抑制感染性微生物的天然存在的化合物或合成化合物。根据本发明适用的抗微生物剂的类型将取决于受试者被其感染或处于变得被其感染的风险下的微生物的类型。抗微生物剂包括但不限于抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗寄生虫剂。如“抗感染剂”、“抗细菌剂”、“抗病毒剂”、“抗真菌剂”、“抗寄生虫剂”和“杀寄生虫剂”的短语具有为本领域普通技术人员所明确确定的含义，并且在标准医学教科书中加以定义。简要来说，抗细菌剂杀死或抑制细菌，并且包括抗生素以及具有类似功能的其它合成或天然化合物。抗生素是由如微生物的细胞作为次级代谢物产生的低分子量分子。一般来说，抗生素干扰一种或多种为微生物所特有，并且不存在于宿主细胞中的细菌功能或结构。抗病毒剂可自天然来源分离，或合成，并且适用于杀死或抑制病毒。抗真菌剂用于治疗浅表真菌感染以及机会性和原发性全身真菌感染。抗寄生虫剂杀死或抑制寄生虫。
适用于人施用的也称为杀寄生虫剂的抗寄生虫剂的实例包括但不限于丙硫咪唑、两性霉素B、苄硝唑、硫双二氯酚、氯喹盐酸盐、氯喹磷酸盐、克林达霉素、脱氢吐根碱、乙胺嗪、二氯尼特糠酸盐(diloxanide furoate)、依氟鸟氨酸、呋喃唑酮、糖皮质素、卤泛群(halofantrine)、双碘喹啉(iodoquinol)、伊维菌素(ivermectin)、甲苯咪唑(mebendazole)、甲氟喹、葡甲胺、锑酸盐、米拉索普、美曲膦酯(metrifonate)、甲硝哒唑、氯硝柳胺、硝呋噻氧、羟胺硝喹、巴龙霉素、戊烷脒羟乙基磺酸盐、哌嗪、吡喹酮、伯氨喹啉磷酸盐、氯胍、喹嘧啶双羟萘酸盐、乙胺嘧啶-磺酰胺、乙胺嘧啶-磺胺多辛、奎纳克林盐酸盐、奎宁硫酸盐、奎尼丁葡萄糖酸盐、螺旋霉素、葡萄糖酸锑钠(stibogluconate sodium/sodium antimony gluconate)、苏拉明、四环素、多西环素、噻苯咪唑、磺甲硝咪唑、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲噁唑和锥虫胂胺，其中一些是单独或与其它组合使用。
抗细菌剂杀死细菌或抑制细菌的生长或功能。一大类抗细菌剂是抗生素。有效杀死或抑制广泛范围的细菌的抗生素称为广谱抗生素。其它类型的抗生素主要有效针对革兰氏阳性或革兰氏阴性类别的细菌。这些类型的抗生素称为窄谱抗生素。有效针对单一生物体或疾病，而不针对其它类型的细菌的其它抗生素称为有限谱抗生素。抗细菌剂有时是基于它们的主要作用模式来分类。一般来说，抗细菌剂是细胞壁合成抑制剂、细胞膜抑制剂、蛋白质合成抑制剂、核酸合成或功能抑制剂以及竞争性抑制剂。
抗病毒剂是防止由病毒感染细胞或防止病毒在细胞内复制的化合物。存在的抗病毒药物比抗细菌药物少许多，因为病毒复制过程与宿主细胞内的DNA复制如此密切相关，以致非特异性抗病毒剂将常对宿主具有毒性。在病毒性感染过程内存在可由抗病毒剂封闭或抑制的若干阶段。这些阶段包括病毒附着于宿主细胞(免疫球蛋白或结合肽)、病毒脱衣壳(例如金刚烷胺)、病毒mRNA合成或翻译(例如干扰素)、病毒RNA或DNA复制(例如核苷酸类似物)、新病毒蛋白质成熟(例如蛋白酶抑制剂)以及病毒发芽和释放。
核苷酸类似物是类似于核苷酸，但具有不完全或异常脱氧核糖或核糖基团的合成化合物。一旦核苷酸类似物处于细胞中，它们即被磷酸化，从而产生与正常核苷酸竞争并入病毒DNA或RNA中的所形成的三磷酸酯。一旦三磷酸酯形式的核苷酸类似物并入增长的核酸链中，它即导致与病毒聚合酶不可逆缔合，并且由此导致链终止。核苷酸类似物包括但不限于阿昔洛韦(用于治疗单纯疱疹病毒和水痘-带状疱疹病毒)、丙氧鸟苷(适用于治疗巨细胞病毒)、碘苷、病毒唑(适用于治疗呼吸道融合性病毒)、二脱氧肌苷、二脱氧胞苷、齐多夫定(叠氮胸苷)、咪喹莫特和雷西莫特(resimiquimod)。
干扰素是由病毒感染的细胞以及免疫细胞分泌的细胞因子。干扰素通过结合邻近于受感染细胞的细胞上的特定受体来起作用，从而导致细胞发生变化，此保护所述细胞免遭病毒感染，α和β干扰素也诱导受感染细胞的表面上的I类和I1类MHC分子的表达，从而导致用于宿主免疫细胞识别的抗原递呈增加，α和β干扰素可以重组形式获得，并且已用于治疗慢性乙型和丙型肝炎感染。在有效用于抗病毒疗法的剂量下，干扰素具有严重副作用，如发热、不适和重量减轻。
适用于本发明中的抗病毒剂包括但不限于免疫球蛋白、金刚烷胺、干扰素、核苷酸类似物和蛋白酶抑制剂。抗病毒剂的具体实例包括但不限于醋孟南(Acemannan)；阿昔洛韦；阿昔洛韦钠；阿德福韦(Adefovir)；阿洛夫定(Alovudine)；阿韦舒托(Alvircept Sudotox)；金刚烷胺盐酸盐；阿拉诺丁(Aranotin)；阿立酮(Arildone)；阿替韦啶甲磺酸盐(Atevirdine Mesylate)；阿夫立定(Avridine)；昔多福韦(Cidofovir)；西潘茶碱(Cipamfylline)；阿糖胞苷盐酸盐；德拉韦定甲磺酸盐(Delavirdine Mesylate)；地昔洛韦(Desciclovir)；地达诺新(Didanosine)；二沙利(Disoxaril)；依度尿苷(Edoxudine)；恩韦拉登(Enviradene)；恩韦肟(Enviroxime)；泛昔洛韦(Famciclovir)；法莫丁盐酸盐(Famotine Hydrochloride)；非西他滨(Fiacitabine)；非阿尿苷(Fialuridine)；膦利酯(Fosarilate)；膦甲酸钠(Foscarnet Sodium)；膦乙醇钠(Fosfonet Sodium)；更昔洛韦(Ganciclovir)；更昔洛韦钠；碘苷；乙氧二羟丁酮(Kethoxal)；拉米夫定(Lamivudine)；洛布卡韦(Lobucavir)；美莫汀盐酸盐(Memotine Hydrochloride)；甲吲噻腙(Methisazone)；奈韦拉平(Nevirapine)；喷昔洛韦(Penciclovir)；吡罗达韦(Pirodavir)；病毒唑；金刚乙胺盐酸盐(RimantadineHydrochloride)；沙奎那韦甲磺酸盐(Saquinavir Mesylate)；索金刚胺盐酸盐(Somantadine Hydrochloride)；索立夫定(Sorivudine)；匐支青霉菌素(Statolon)；司他呋啶(Stavudine)；替洛隆盐酸盐(TiloroneHydrochloride)；三氟胸腺嘧啶核苷(Trifluridine)；伐昔洛韦盐酸盐(Valacyclovir Hydrochloride)；阿糖腺苷(Vidarabine)；阿糖腺苷磷酸盐；阿糖腺苷磷酸二钠；韦罗肟(Viroxime)；扎西他滨(Zalcitabine)；齐多夫定；和净韦肟(Zinviroxime)。
抗真菌剂适用于治疗和预防感染性真菌。抗真菌剂有时根据它们的作用机制加以分类。一些抗真菌剂通过抑制葡萄糖合成酶来充当细胞壁抑制剂。
这些包括但不限于巴司金(basiungin)/ECB。其它抗真菌剂通过使膜完整性去稳定来起作用。这些包括但不限于咪唑，如克霉唑(clotrimazole)、瑟他康唑(sertaconzole)、氟康唑(fluconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoconazole)、咪康唑(miconazole)和伏立康唑(voriconacole)以及FK 463、两性霉素B、BAY 38-9502、MK 991、帕地霉素(pradimicin)、UK 292、布替萘芬(butenafine)和特比萘芬(terbinafine)。其它抗真菌剂通过分解几丁质(例如几丁质酶)或免疫抑制(501霜剂)来起作用。
在一些实施方案中，提供的免疫调节性寡核苷酸组合物适用于治疗患有细胞增殖疾病，如癌症的受试者。患有癌症的受试者是具有可检测癌性细胞的受试者。癌症可为恶性或非恶性癌症。癌症或肿瘤包括但不限于胆道癌；脑癌；乳癌；子宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌；上皮内赘瘤；淋巴瘤；肝癌；肺癌(例如小细胞和非小细胞)；黑素瘤；成神经细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤；皮肤癌；睾丸癌；甲状腺癌；和肾癌以及其它癌瘤和肉瘤。在一个实施方案中，癌症是毛细胞白血病、慢性骨髓性白血病、皮肤性T细胞白血病、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、恶性黑素瘤、鳞状细胞癌、肾细胞癌、前列腺癌、膀胱细胞癌或结肠癌。
提供的免疫调节性寡核苷酸组合物可单独或连同抗癌疗法一起施用。抗癌疗法包括但不限于放射疗法、化学疗法、免疫疗法、癌症疫苗、激素疗法、生物反应调节剂和手术程序。癌症药剂是指出于治疗癌症的目的向受试者施用的药剂。如本文所用，“治疗癌症”包括防止癌症发展、减轻癌症症状和/或抑制产生的癌症生长。在其它方面，癌症药剂是出于降低显现癌症的风险的目的向处于显现癌症的风险下的受试者施用。本文描述用于治疗癌症的各种类型的药剂。出于本说明书的目的，癌症药剂分类为化学治疗剂、免疫治疗剂、癌症疫苗、激素疗法和生物反应调节剂。
另外，本发明方法旨在包括连同提供的免疫调节性寡核苷酸组合物一起使用一种以上癌症药剂。例如，当适当时，提供的免疫调节性寡核苷酸组合物可和化学治疗剂与免疫治疗剂两者一起施用。或者，癌症药剂可包括全都出于治疗患有癌症或处于显现癌症的风险下的受试者的目的向一个受试者施用的免疫治疗剂和癌症疫苗、或化学治疗剂和癌症疫苗、或化学治疗剂、免疫治疗剂和癌症疫苗。
化学治疗剂可选自由以下组成的组：甲氨蝶呤(methotrexate)、长春新碱(vincristine)、阿霉素(adriamycin)、顺铂(cisplatin)、不含糖的氯乙基亚硝基脲、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C(mitomycin C)、博莱霉素(bleomycin)、小红莓(doxorubicin)、达卡巴嗪(dacarbazine)、泰素(taxol)、福吉林(fragyline)、甲葡胺GLA(Meglamine GLA)、戊柔比星(valrubicin)、卡莫司汀(carmustaine)和聚苯丙生(poliferposan)、MMI270、BAY 12-9566、RAS法尼基转移酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂、MMP、MTA/LY231514、LY264618/洛美曲索(Lometexol)、格拉莫克(Glamolec)、CI-994、TNP-470、癌康定(Hycamtin)/拓朴替康(Topotecan)、PKC412、伐司扑达(Valspodar)/PSC833、诺凡特龙(Novantrone)/米曲特龙(Mitroxantrone)、美他特(Metaret)/苏拉明(Suramin)、巴马司他(Batimastat)、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、因塞尔(lncel)/VX-710、VX-853、ZD0101、ISI641、ODN 698、TA 2516/玛米司他(Marmistat)、BB2516/玛米司他、CDP845、D2163、PD183805、DX8951f、柠檬醛(Lemonal)DP 2202、FK317、匹西巴尼(Picibanil)/OK-432、AD 32/戊柔比星(Valrubicin)、美他特龙(Metastron)/锶衍生物、泰道(Temodal)/替莫唑胺(Temozolomide)、依伐克(Evacet)/脂质体小红莓(liposomaldoxorubicin)、耶万他仙(Yewtaxan)/太平洋紫杉醇(Paclitaxel)、泰素/太平洋紫杉醇、希罗得(Xeload)/卡培他滨(Capecitabine)、氟铁龙(Furtulon)/脱氧氟尿苷、赛罗帕(cyclopax)/口服太平洋紫杉醇、口服类紫杉烷、SPU-077/顺铂、HMR 1275/黄酮吡醇(Flavopiridol)、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS致癌基因抑制剂、BMS-182751/口服铂、UFT(替加氟(TegafUr)/尿嘧啶)、尔吉咪唑(Ergamisol)/左旋咪唑(Levamisole)、恩尿嘧啶(Eniluracil)/776C85/5FU增强剂、开普拓(Campto)/左旋咪唑、开普拓沙(Camptosar)/伊立替康(lrinotecan)、土莫德(Tumodex)/雷替曲塞(Ralitrexed)、乐司他丁(Leustatin)/克拉屈滨(Cladribine)、帕克斯(Paxex)/太平洋紫杉醇、都可喜(Doxil)/脂质体小红莓、楷莱(Caelyx)/脂质体小红莓、福达华(Fludara)/氟达拉滨(Fludarabine)、表阿霉素(Pharmarubicin)/表柔比星(Epirubicin)、地泊赛特(DepoCyt)、ZD1839、LU 79553/双-萘二甲酰亚胺、LU 103793/多拉司他丁(Dolastain)、楷莱/脂质体小红莓、健择(Gemzar)/吉西他滨(Gemcitabine)、ZD 0473/阿诺美德(Anormed)、YM 116、碘粒子(Iodineseed)、CDK4和CDK2抑制剂、PARP抑制剂、D4809/德西氟萨米得(Dexifosamide)、依非斯(Ifes)/美斯纳(Mesnex)/异环磷酰胺(Ifosamide)、威猛(Vumon)/替尼泊苷(Teniposide)、铂尔定(Paraplatin)/卡铂(Carboplatin)、顺氯氨铂(Plantinol)/顺铂、凡毕士(Vepeside)/依托泊苷(Etoposide)、ZD 9331、泰索帝(Taxotere)/多西他赛(Docetaxel)、鸟嘌呤阿拉伯糖苷(guanine arabinoside)的前药、紫杉烷(Taxane)类似物、亚硝基脲、烷基化剂(如美法仑(melphelan)和环磷酰胺(cyclophosphamide))、胺鲁米特(Aminoglutethimide)、天冬酰胺酶、白消安(Busulfan)、卡铂、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、阿糖胞苷盐酸盐、放线菌素D(Dactinomycin)、柔红霉素盐酸盐(Daunorubicin HC1)、雌氮芥磷酸钠(Estramustine phosphate sodium)、依托泊苷(VP16-213)、氟尿苷(Floxuridine)、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他胺(Flutamide)、羟基脲(Hydroxyurea/hydroxycarbamide)、异环磷酰胺、干扰素α-2a、α-2b、亮丙瑞林乙酸盐(Leuprolide acetate)(LHRH释放因子类似物)、洛莫司汀(Lomustine)(CCNU)、二氯甲基二乙胺盐酸盐(Mechlorethamine HCl)(氮芥)、巯基嘌呤(Mercaptopurine)、美斯纳(Mesna)、米托坦(Mitotane)(o.p′-DDD)、米托蒽醌盐酸盐(Mitoxantrone HCl)、奥曲肽(Octreotide)、光神霉素(Plicamycin)、丙卡巴肼盐酸盐(ProcarbazineHCl)、链脲霉素(Streptozocin)、他莫昔芬柠檬酸盐(Tamoxifen citrate)、硫鸟嘌呤(Thioguanine)、噻替派(Thiotepa)、长春花碱硫酸盐(Vinblastine sulfate)、安吖啶(Amsacrine)(m-AMSA)、阿扎胞苷(Azacitidine)、红血球生成素(Erthropoietin)、六甲蜜胺(Hexamethylmelamine，HMM)、介白素2、米托胍腙(Mitoguazone)(甲基-GAG；甲基乙二醛双-脒基腙；MGBG)、喷司他汀(Pentostatin)(2′脱氧柯福霉素(deoxycoformycin))、司莫司汀(Semustine)(甲基-CCNU)、替尼泊苷(VM-26)和长春地辛硫酸盐(Vindesine sulfate)，但化学治疗剂并不受限于此。
免疫治疗剂可选自由以下组成的组：利比他辛(Ributaxin)、赫赛汀(Herceptin)、奎曲美(Quadramet)、帕诺瑞(Panorex)、IDEC-Y2B8、BEC2、C225、安可临(Oncolym)、SMART M195、ATRAGEN、欧伐瑞(Ovarex)、百克沙(Bexxar)、LDP-03、ior tβ、MDX-210、MDX-11、MDX-22、OV 103、3622W94、抗VEGF、赛尼哌(Zenapax)、MDX-220、MDX-447、MELIMMUNE-2、MELIMMUNE-1、CEACIDE、普雷他格(Pretarget)、NovoMAb-G2、TNT、Gliomab-H、GNI-250、EMD-72000、利姆普西(LymphoCide)、CMA 676、莫那伐-C(Monopharm-C)、4B5、ior egf.r3、ior c5、BABS、抗FLK-2、MDX-260、ANA Ab、SMART1D10Ab、SMART ABL 364Ab和ImmuRAIT-CEA，但免疫治疗剂并不受限于此。
癌症疫苗可选自由以下组成的组：EGF、抗个体基因型癌症疫苗、Gp75抗原、GMK黑素瘤疫苗、MGV神经节苷脂缀合物疫苗、Her2/neu、欧伐瑞、M-Vax、O-Vax、L-Vax、STn-KHL舍雷托普(theratope)、BLP25(MUC-1)、脂质体个体基因型疫苗、美拉辛(Melacine)、肽抗原疫苗、毒素/抗原疫苗、基于MVA的疫苗、PACIS、BCG疫苗、TA-HPV、TA-CIN、DISC-病毒和ImmuCyst/TheraCys，但癌症疫苗并不受限于此。
如本文所用，术语“癌症抗原”和“肿瘤抗原”可互换用于指代由癌细胞差异性表达，并且可由此加以开发来靶向癌细胞的抗原。癌症抗原是可潜在明显刺激肿瘤特异性免疫反应的抗原。这些抗原中的一些是由正常细胞编码，但未必由正常细胞表达。这些抗原可表征为通常在正常细胞中沉默(即不表达)的那些、仅在某些分化阶段表达的那些和暂时表达的那些，如胚胎和胎儿抗原。其它癌症抗原是由突变细胞基因，如致癌基因(例如活化的ras致癌基因)、阻遏基因(例如突变p53)、由内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白编码。其它癌症抗原还可由病毒基因，如RNA和DNA肿瘤病毒上携带的那些编码。
在一些实施方案中，提供的免疫调节性寡核苷酸组合物也可适用于治疗和预防自体免疫性疾病。自体免疫性疾病是一类疾病，其中受试者的自身抗体与宿主组织反应，或其中免疫效应T细胞与内源性自身肽具有自体反应性，并且导致组织破坏。因此，免疫反应是针对受试者的自身抗原(称为自体抗原)来发动。自体免疫性疾病包括但不限于斑形脱发、后天性血友病、僵直性脊椎炎、抗磷脂综合征、自体免疫相关的不育症、自体免疫性脑脊髓炎、自体免疫性肝炎、自体免疫性溶血性贫血、自体免疫性糖尿病、自身免疫性血小板减少性紫癜、贝切特氏综合征(Behget′s syndrome)、大疱性类天疱疮、心肌病、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘多发性神经病变、车格-施特劳斯综合征(Churg-Strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素疾病、皮肤肌炎、盘状狼疮、原发性混合冷球蛋白血症、纤维肌痛、纤维肌炎、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、肾小球性肾炎(例如新月体性肾小球性肾炎、增生性肾小球性肾炎)、葛瑞夫氏病(Grave′s disease)、移植物抗宿主疾病、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture′s syndrome)、天疱疮(例如寻常天疱疮)、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜、胰岛素抗性、特发性阿狄森氏病(idiopathic Addison′s disease)、IgA肾病变、炎症性肠病(包括克罗恩氏病(Crohn′s disease)和溃疡性结肠炎)、青少年关节炎、扁平苔癣、重症肌无力、多发性硬化症、混合结缔组织疾病、多发性肌炎、恶性贫血、多发性结节性动脉炎、多软骨炎、多腺综合征、风湿性多肌痛、原发性无γ球蛋白血症、原发性胆汁性硬化、牛皮癣、雷诺氏现象(Raynaud′s phenomena)、莱特氏综合征(Reite^s syndrome)、青少年和成人类风湿性关节炎、休格连氏综合征(SJorgen′s syndrome)、伴有抗胶原蛋白抗体的硬皮病、类肉瘤病、僵人综合征(stiff-man syndrome)、全身性红斑狼疮(SLE)、高安关节炎(Takayasu arthritis)、移植器官排斥、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、葡萄膜炎、溃疡性结肠炎、血管炎和白癜风。
如本文所用的“自体抗原”是指正常宿主组织的抗原。正常宿主组织不包括癌细胞。因此，在自体免疫性疾病的背景下，针对自体抗原发动的免疫反应是不合需要的免疫反应，并且促进对正常组织的破坏和损害，而针对癌症抗原发动的免疫反应是合乎需要的免疫反应，并且促进对肿瘤或癌症的破坏。因此，在本发明的旨在治疗自体免疫性病症的一些方面，不推荐免疫调节性寡核苷酸与自体抗原，特别是作为自体免疫性病症的靶标的那些一起施用。
在其它情况下，根据本发明使用的免疫调节性寡核苷酸可与低剂量的自体抗原一起递送。许多动物研究已证明经粘膜施用低剂量的抗原可产生免疫低反应性或“耐受性”状态。主动机制似乎是细胞因子介导的自Th1反应向主要Th2和Th3(即TGF-β占优势)反应进行免疫偏离。在低剂量抗原递送下进行的主动遏制也可遏制无关免疫反应(旁观者遏制)，此在例如类风湿性关节炎和SLE的自体免疫性疾病的疗法中具有极大重要性。旁观者遏制涉及在促炎性和Th1细胞因子以抗原特异性或抗原非特异性方式释放所处的局部环境中分泌Th1相反调控性遏制细胞因子。如本文所用的“耐受性”用于指代这个现象。实际上，经口耐受性已有效治疗动物的许多自体免疫性疾病，包括：实验性自体免疫性脑脊髓炎(EAE)、实验性自体免疫性重症肌无力、胶原蛋白诱发的关节炎(CIA)和胰岛素依赖性糖尿病。在这些模型中，预防和遏制自体免疫性疾病与抗原特异性体液和细胞反应自Th1反应向Th2/Th3反应移动相关。
可根据本发明利用的适用免疫调节性寡核苷酸的非限制性实例提供于随附附录(B)中。
RIPtide
在一些实施方案中，根据本发明利用的寡核苷酸是或充当RNA相互作用性多核苷酸(“RIPtide”)。RIPtide是一类旨在通过使牵涉于疾病中的结构RNA失活来打开“不可用药”靶标的空间的治疗剂。RIPtide通常是结合结构化RNA并破坏其作用的小核苷酸链段(约8个核苷酸)。归因于它们的尺寸，这些分子可易于穿过细胞膜。参见例如美国专利6,080,585。
RIPtide可适用于许多临床应用。在癌症疗法的背景下，至少一种靶标是存在于约90％癌细胞中的端粒酶。因此，在一些实施方案中，本发明的立体确定的寡核苷酸可用于靶向端粒酶来治疗各种癌症。此外，RIPtide可适用于治疗感染性疾病。如HIV和丙型肝炎的病毒必须能够借用宿主细胞来复制；因此，结构RNA可在许多病毒的成熟和复制中起重要作用。因此，在一些实施方案中，本发明的立体确定的寡核苷酸可用于靶向病毒成熟和/或复制中涉及的DNA或RNA的各部分。
因此，本发明适用于治疗各种病毒性感染。病毒包括但不限于肠病毒(包括但不限于小核糖核酸病毒科病毒，如脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒)、轮状病毒、腺病毒和肝炎病毒，如甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎。已见于人中的病毒的具体实例包括但不限于：逆转录病毒科(例如人免疫缺陷病毒，如HIV-1(也称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV或HIV-III；和其它分离株，如HIV-LP))；小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；嵌杯状病毒科(例如导致胃肠炎的病毒株)；披盖病毒科(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(例如登革热病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(例如冠状病毒)；弹状病毒科(例如水泡性口膜炎病毒、狂犬病病毒)；纤丝病毒科(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道融合性病毒)；正粘病毒科(例如流感病毒)；本扬病毒科(例如汉坦病毒、布尼亚病毒、白蛉病毒和纳伊罗病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(例如呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双核糖核酸病毒科；肝脱氧核糖核酸病毒科(乙型肝炎病毒)；微小病毒科(细小病毒)；乳多空病毒科(乳头状瘤病毒、多形瘤病毒)；腺病毒科(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV))；痘病毒科(开花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；虹彩病毒科(例如非洲猪瘟病毒)；和其它病毒，即急性哮吼伴随病毒、α病毒、卡波西氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma)相关的疱疹病毒、新城鸡瘟病毒、尼帕病毒、诺瓦克病毒、乳头状瘤病毒、副流感病毒、家禽流行性感冒、SAR病毒、西尼罗病毒。
反义药物
本发明也涵盖多种基于反义的治疗剂。通常，反义药物是被化学修饰来使有利药物性质工程化的小(12-21个核苷酸)DNA或RNA样化合物。本领域中可用的一些反义试剂包括硫代磷酸酯或脱氧寡核苷酸，并且在这个情况下，硫基团被交换成磷酸酯骨架上的非桥接氧。这增加对RNA酶降解的抗性，并且改进药理学稳定性。但在所谓“下一代反义分子”的其它试剂中，寡核苷酸的骨架被进行2′-O-甲氧基乙基修饰，此可增加这些寡核苷酸对靶标RNA的亲和力。然而，在一些情况下，这些试剂中的许多伴有副作用，如非所要免疫反应。至少在一些情况下，这些试剂的所述不合需要的性质可至少部分归因于它们的立体无规性质。本发明提供具有优选性质，如改进的亲脂性和增加的RNA结合性的立体确定的对应物。
许多基于反义的治疗剂已被开发或处于开发中。以下提供反义疗法的非限制性实例。可制备如本文所述的立体确定的(例如手性纯)寡核苷酸以达成相对于本领域中当前可用的反义药物，功效改进、对靶标的亲和力增加、副作用降低、药物动力学改进、稳定性增强和/或生物可用度增加。在一些实施方案中，反义治疗剂包括吗啉代寡核苷酸药物。参见例如：Morcos，PA(2007).″Achieving targeted andquantifiable alteration of mRNA splicing with Morpholino oligos″.Biochem Biophys Res Commun 358(2)：521-7。
巨细胞病毒视网膜炎：福米韦生(Fomivirsen)(销售为维曲维尼(Vitravene))由美国FDA在1998年8月核准作为巨细胞病毒视网膜炎的治疗剂。
出血热病毒：在2006年初，在USAMRIID研究埃博拉出血热病毒的科学家宣布在感染四只恒河猴，并且接着用由AVI BioPharma(一家美国生物技术公司)开发的反义吗啉代药物治疗它们之后，恢复率是75％。[U.S.Army Medical Research Institute of Infectious Diseases，Fort Detrick，Maryland.News Release：Gene-Specific Ebola TherapiesProtect Nonhuman Primates from Lethal Disease.2006年1月13日]。被埃博拉病毒感染的猴的通常死亡率是100％。在2008年末，AVIBioPharma向FDA成功提交关于它的两种用于马尔堡(Marburg)和埃博拉病毒的先导产品的研究性新药(IND)申请。这些药物AVI-6002(Lu，X；Yu，Q；Binder，GK；Chen，Z；Slepushkina，T；Rossi，J；Dropulic，B(2004).″Antisense-Mediated Inhibition of Human ImmunodeficiencyVirus(HIV)Replication by Use of an HIV Type 1-Based Vector Resultsin Severely Attenuated Mutants Incapable of Developing Resistance″.Journal of Virology 78(13)：7079-88)和AVI-6003是基于AVI的PMO反义化学的新型类似物，其中通过添加带正电荷的组分至吗啉代寡聚物链中来增强抗病毒效能。AVI-6002和AVI-6003的临床前结果证明在分别以埃博拉病毒和马尔堡病毒进行致死性感染加以激发的非人灵长类动物中具有可复现并且较高存活率(Medical News Today.AVIBioPharma Announces FDA Clears IND Applications For Clinical TrialsOf RNA Therapeutic Agents For Treatment Of Ebola And MarburgViruses.2008年12月30日)。
癌症：也在2006年，德国医师报道在患有高级神经胶质瘤的患者中进行的化合物AP 12009(一种特异于人转化生长因子TGF-β2的mRNA的硫代磷酸酯反义寡脱氧核苷酸)的剂量逐步升高研究。在报道时，尚未获得中值总体存活率，并且作者暗示潜在治愈(Results ofG004，a phase IIb actiVely controlled clinical trial with the TGF-b2targeted compound AP 12009for recurrent anaplastic astrocytoma-Hau等24(18增刊)：1566-ASCO会议摘要)。
例如，曲贝德生(trabedersen)(AP 12009-P001)被开发为用于治疗患有晚期胰腺癌、恶性黑素瘤、脑肿瘤、退行性星形细胞瘤和结肠直肠癌的患者的单药疗法。AP 12009-P001已在开放标签、多中心、I/II期剂量逐步升高试验中评估以评估在61名患有已知过度产生TGF-b2的晚期实体肿瘤的患者中静脉内施用曲贝德生的安全性和可耐受性，所述患者未或不再经受确定形式的疗法。
靶向在癌症中过度表达的蛋白质的反义药物的其它实例包括：成簇蛋白(Clusterin)(OGX-011/TV01011)，其调控前列腺癌细胞中由生长因子TGFβ和转录因子TWIST1诱导的上皮-间质转化；前列腺癌治疗中的ATL1101(胰岛素样生长因子-I受体(IGF-IR)的第二代反义抑制剂)；用于治疗慢性淋巴细胞性白血病的奥利默森(oblimersen)(商标名：简纳森(Genasense))；用于治疗CML、黑素瘤、成神经细胞瘤以及乳癌、胰腺癌和结肠癌的G4460和LR3001(c-myb的抑制剂)；用于治疗肾细胞癌的MG98(DNA甲基转移酶I的抑制剂)；ISIS 5132(c-Raf反义序列)；LY900003(蛋白质激酶C-α反义序列)；G3139(Bc1-2反义序列)等。
HIV/AIDS：起始于2004年，美国研究者已对使用反义技术来抗击HIV进行研究。已知通过使用基于1型HIV的载体进行反义介导的对人免疫缺陷病毒(HIV)复制的抑制会产生不能产生抗性的严重减弱的突变株。在2010年2月，研究者报道在使用患者T细胞降低HIV病毒载量方面取得成功，所述T细胞已被收集，用HIV病毒包膜蛋白的RNA反义链修饰，并且在逆转录病毒药物疗法中在计划的时间推移期间再输注至患者中。
高胆固醇：在2010年，米泊美生(先前是ISIS 301012，商标名奇纳罗(Kynamro))成功完成针对某些类型的高胆固醇的3期试验。米泊美生是降胆固醇药物候选物。它是一种靶向载脂蛋白B的信使RNA的反义治疗剂。参见：Merki E，Graham MJ，Mullick AE等(2008年8月).″Antisense oligonucleotide directed to human apolipoproteinB-100reduces lipoprotein(a)levels and oxidized phospholipids onhuman apolipoprotein B-100particles in lipoprotein(a)transgenic mice″.Circulation 118(7)：743-53；El Harchaoui K，Akdim F，StroesES，Trip MD，Kastelein JJ(2008).″Current and future pharmacologic options for the management of patients unable to achieve low-density lipoprotein-cholesterol goals with statins″.Am J Cardiovasc Drugs 8(4)：233-42；Athyros VG，Kakafika AI，Tziomalos K，Karagiannis A，Mikhailidis DP(2008年7月).″Antisense technology for the prevention or the treatment of cardiovascular disease：the next blockbuster？″.Expert Opin Investig Drugs 17(7)：969-72。它是以每周注射液形式施用。所述化合物是“第二代”反义寡核苷酸；核苷酸是与硫代磷酸酯键联而非RNA和DNA的磷酸二酯键联连接，并且糖部分在分子的中间部分中是脱氧核糖，而在两个末端是2′-O-甲氧基乙基修饰的核糖。这些修饰使得药物对核酸酶降解具有抗性，从而允许它每周进行施用。药物在肝中累积，此是适宜的，因为载脂蛋白B主要在那里起作用。完整序列是G*-C*-C*-U*-C*-dA-dG-dT-dC-dT-dG-dmC-dT-dT-dmC-G*-C*-A*-C*-C*[d＝2′-脱氧基，*＝2′-O-(2-甲氧基乙基)]，所述序列具有3′→5′硫代磷酸酯键联。3期试验在患有家族性高胆固醇血症(FH)(纯合(ho)与杂合(he)两者)的患者中进行。FH是一种导致低密度脂蛋白胆固醇的水平格外较高的遗传病症。两个试验均显示卓越性能，其中获得迄今为止在那两个患者群体中所观察到的最高功效，并且相较于其它可注射药物，具有相对较低的退出率。
杜兴(Duchenne)肌营养不良：杜兴肌营养不良(DMD)，即患者的肌细胞分解并损失，从而导致进行性肌无力和死亡。AVI-4658是一种用以恢复肌营养不良蛋白(dystrophin)的表达的靶向反义疗法，所述肌营养不良蛋白是一种杜兴肌营养不良患者缺乏的关键蛋白质。用19名患者进行的开放标签、2期剂量逐步升高研究的结果显示当完成治疗时，自各患者获取肌肉生检体。研究团队发现在使用AVI-4658下，患者通过“外显子跳跃”产生功能性mRNA的能力得以修复，从而最终允许他们制造功能性肌营养不良蛋白。
肌强直性营养不良：肌强直性营养不良是成人中最常见的肌肉疾病，其主要影响骨骼肌、心脏和中枢神经系统。它是由于在称为DMPK的基因中产生三字母遗传密码(CTG)的众多重复序列的突变而发生。自突变基因产生的信使RNA也含有导致RNA在细胞的核中累积的异常长重复序列。在那里，它螯合称为盲肌样1的蛋白质并封闭其功能，并且活化称为CELF1的另一蛋白质。这些蛋白质彼此拮抗，并且结果是自成人组织中的许多其它基因进行的蛋白质表达异常，从而导致疾病。为抵抗这个，Cooper和他的同事产生仅是找出异常RNA重复序列的各部分，并且使RNA酶H靶向毒性RNA，从而导致它的降解的遗传材料链的反义寡核苷酸。也报道将所述反义寡核苷酸与帮助释放螯合的盲肌样1的其它反义寡核苷酸组合可增强作用。
糖尿病：SGLT2(ISIS 388626)是一种用以达成2型钠依赖性葡萄糖共转运体(SGLT2)水平降低的反义药物，其导致糖尿病患者中的血液葡萄糖水平显著降低。
肝炎：持续丙型肝炎病毒(HCV)感染是肝疾病的主要病因。反义寡核苷酸代表一类有前途的抗病毒剂。在开发中的所述药物包括ISIS14803，其是抑制HCV复制和蛋白质表达的20个单元的硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸。
治疗方法
本文所述的提供的寡核苷酸及其组合物适用作针对各种疾病病况的治疗剂，包括用作抗病毒剂。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸可用作用于通过调节DNA和/或RNA活性来治疗疾病的药剂。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸可用于抑制特定基因表达。例如，提供的寡核苷酸可互补于特定靶标信使RNA(mRNA)序列。它可用于抑制数万种病毒的病毒复制。示例性病毒家族包括正粘病毒、痘病毒、疱疹病毒、乳头状瘤病毒、微小RNA病毒、黄病毒、逆转录病毒、肝炎病毒、副粘病毒、呼肠孤病毒、细小病毒、丝状病毒、冠状病毒、沙粒病毒、弹状病毒和腺病毒。其它病毒家族是已知的，并且也涵盖于本文中。其它实例包括用作针对HIV RNA或其它逆转录病毒RNA，或用于杂交于编码tat蛋白的HIV mRNA或杂交于HIV mRNA的TAR区域的反义化合物。在一些实施方案中，核酸模拟HIV mRNA的TAR区域的二级结构，并且通过这样做来结合tat蛋白。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸用于通过使细胞与提供的寡核苷酸接触来抑制靶标蛋白质的表达，其中所述细胞中的其它蛋白质的表达不受抑制，或最低限度受抑制。在某一实施方案中，靶标蛋白质抑制体内发生于哺乳动物中。在一些实施方案中，施用治疗有效量的提供的寡核苷酸来抑制靶标蛋白质的表达。
其中表达可被调节的蛋白质的其它实例包括Jun N末端激酶(JNK)蛋白、二酰基甘油酰基转移酶I、载脂蛋白B、升糖素受体、Aurora B、酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶-2、c-反应性蛋白质、STAT(信号转导子和转录活化子)蛋白家族和MDR P-糖蛋白。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸可用于抑制蛋白质磷酸酶1B(PTP1B)表达、RNA依赖性RNA病毒聚合酶。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸可用于诱导如癌细胞的细胞凋亡的事件，或可用于使细胞更易受细胞凋亡。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸可用于调节蛋白质的活性。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸可帮助调节靶向多药物抗性(MDR)RNA分子的RNA酶H活性。
在一些实施方案中，本发明提供治疗需要所述治疗的受试者(例如哺乳动物，如人)的由非所需基因表达介导的疾病的方法。“疾病”是指疾病或疾病症状。方法包括例如向受试者施用有效量的提供的寡核苷酸。
由非所需基因表达介导的疾病的实例包括癌症(例如白血病、肿瘤和转移癌)、过敏、哮喘、肥胖症、炎症(例如炎症性疾病，如炎症性气道疾病)、高胆固醇血症、血液学病症、重度急性呼吸道综合征(SARS)、阻塞性气道疾病、哮喘、自体免疫性疾病、逆转录病毒疾病(如AIDS或HIV)、其它病毒性感染、子宫内感染、代谢疾病、感染(例如细菌、病毒、酵母、真菌)、CNS疾病、脑肿瘤、退行性神经疾病、心血管疾病以及与血管生成、新血管化和血管发生相关的疾病。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸适用于治疗癌症，包括胰腺癌和涉及异常细胞增殖的其它疾病或病症。
胰腺位于上腹部中(在腹膜后腔中)，是消化和内分泌系统的双功能腺体。在某些情况下，胰腺充当内分泌腺(例如产生若干重要激素)。在某些情况下，胰腺充当外分泌腺(例如分泌含有传至小肠中的消化酶的流体)。
胰腺癌是美国第四大最常见的癌症死亡病因(排在肺癌、结肠癌和乳癌之后)，占所有癌症相关死亡的6％。在2008年，估计37,680例新胰腺癌将在美国被诊断出，其中死亡34,290例。所述疾病的发生率在50岁之后直线上升，其中唯一明确的风险因素是吸烟(吸烟者比非吸烟者显现所述疾病的可能性大四倍)。侵袭性胰腺癌几乎始终是致命性的。所有患者的集体中值存活时间是4-6个月。相对1年存活率是24％；总体5年存活率＜5％。
胰腺癌在它的早期是无症状的，并且常保持未诊断出持续数月(小于三分之一患者在症状发作2个月内被诊断出)。在某些情况下，诊断延迟导致(部分或完全)癌性细胞转移至肝或淋巴结中。
当前，手术(切除胰腺)是主要和唯一针对胰腺癌的治愈性疗法。然而，在诊断时，仅15-25％的肿瘤可切除，并且仅10-20％的经受手术的患者存活超过两年。一旦发生肿瘤浸润以及其它组织已被影响，手术即不再可能。
在某些情况下，糖尿病或胰腺炎使个体倾向于显现多种胰腺细胞的增生性病症。在某些情况下，由于选自由遗传性非多发性息肉结肠直肠癌(HNPCC)和家族性腺瘤多发性息肉(FAP)组成的组的遗传性综合征，个体处于显现多种胰腺细胞的增生性病症的风险增加下。在某些情况下，由于选自由MSH2、MSH6、MLH1和APC组成的组的基因的突变，个体处于显现多种胰腺细胞的增生性病症的风险增加下。
在理想情况下，胰腺癌的有效治疗应(i)最初和随后控制原发性肿瘤块，以及(ii)治疗转移性肿瘤细胞。化学预防(施用如药物、生物制剂、营养物等的药剂)会减缓癌发生的进行，逆转或抑制癌发生，由此降低显现侵袭性或临床重大疾病的风险。
在某些实施方案中，本文公开治疗胰腺癌的方法。如本文所用，“胰腺癌”包括各种形式的胰腺癌。在一些实施方案中，胰腺癌是转移性胰腺癌。在一些实施方案中，胰腺癌是癌瘤、肉瘤、癌症或其组合。在一些实施方案中，待治疗的胰腺癌包括散发性和遗传性胰腺癌。在一些实施方案中，胰腺癌是导管细胞癌、腺泡细胞癌、乳头状粘液癌、印戒癌、腺鳞癌、未分化癌、粘液癌、巨细胞癌、小细胞癌、囊肿癌、浆液性囊肿癌、粘液囊肿癌、未分类胰腺癌、成胰细胞瘤或其组合。
在一些实施方案中，需要治疗胰腺癌的个体呈现有局部胰腺肿瘤。在一些实施方案中，需要治疗胰腺癌的个体呈现有阴性区域性淋巴结生检体。在一些实施方案中，需要治疗胰腺癌的个体呈现有阳性区域性淋巴结生检体。在一些实施方案中，需要治疗胰腺癌的个体呈现有结节性阴性胰腺肿瘤(例如结节阴性)。在一些实施方案中，需要治疗胰腺癌的个体呈现有结节性阳性肿瘤(例如结节阳性)。
在一些实施方案中，需要治疗胰腺癌的个体的胰腺癌已转移至体内其它位置。在一些实施方案中，胰腺癌已转移至选自由淋巴结、胃、胆管、肝、骨、卵巢、腹膜和脑组成的组的位置。
在一些实施方案中，癌细胞或癌症前期细胞是通过对组织样本(例如生检体样本)进行组织学分型或分级来鉴定。在一些实施方案中，癌细胞或癌症前期细胞是通过使用适当分子标记来鉴定。
在一些实施方案中，需要治疗胰腺癌的个体的胰腺癌是根据美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)TNM分类系统来分期，其中肿瘤(T)已被指定Tx、T1、T2、T3、T4期；并且其中区域性淋巴结(N)已被指定NX、N0、N1期；并且其中远端转移(M)已被指定MX、M0或M1期。在一些实施方案中，需要治疗胰腺癌的个体的胰腺癌被分期为0、I、IA、IB、II、IIA、IIB、III和IV期胰腺癌。在一些实施方案中，需要治疗胰腺癌的个体的胰腺癌被分期为GX级(例如等级不能被评估)、1级、2级、3级或4级。
用提供的寡核苷酸治疗的癌症的更具体实例包括乳癌、肺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、鳞状细胞癌、成胶质细胞瘤、卡波西氏肉瘤、多发性骨髓瘤和白血病。
评估和治疗癌症
术语“肿瘤细胞抗原”在本文中定义为以高于无关肿瘤细胞、正常细胞或正常体液中的量存在于肿瘤细胞上或体液中的抗原。抗原存在性可通过为本领域技术人员所知的许多测定来测试，并且包括但不限于用抗体进行负性和/或正性选择，如ELISA测定、放射免疫测定或通过蛋白质印迹。
“细胞凋亡诱导剂”在本文中定义来诱导细胞凋亡/程序化细胞死亡，并且包括例如抗癌剂和其中细胞(例如肿瘤细胞)被诱导来经受程序化细胞死亡的治疗剂。以下更详细描述示例性细胞凋亡诱导剂。
术语“细胞凋亡”或“程序化细胞死亡”是指在发育和其它正常生物过程期间通过其来消除非所要或无用细胞的生理过程。细胞凋亡是一种在正常生理条件下发生的细胞死亡模式，并且细胞是它自身死亡的主动参与者(“细胞自杀”)。它最常见于正常细胞转换和组织体内平衡、胚胎发生、免疫耐受性诱导和维持、神经系统发育和内分泌依赖性组织萎缩期间。经受细胞凋亡的细胞显示特征性形态学和生物化学特征。这些特征包括染色质聚集、核和细胞质紧缩、细胞质和核分配至膜结合囊泡(细胞凋亡体)中，所述囊泡含有核糖体、形态完整的线粒体和核材料。在体内，这些细胞凋亡体由巨噬细胞、树突细胞或邻近上皮细胞快速识别和吞噬。归因于用于体内移除凋亡细胞的这个高效机制，不引发炎症性反应。在体外，细胞凋亡体以及剩余细胞片段最终膨胀并最后溶解。体外细胞死亡的这个终末期已被称为“次级坏死”。细胞凋亡可通过为本领域技术人员所知的方法来测量，所述方法如DNA断裂、暴露膜联蛋白(Annexin)V、活化卡斯蛋白酶(caspase)、释放细胞色素c等。已被诱导来死亡的细胞在本文中称为“凋亡细胞”。也可使用标准膜联蛋白V细胞凋亡测定来测试细胞凋亡：使NIH：OVCAR-3细胞在6孔板(NUNC)中生长，并且照射或用拮抗剂(或与另一抗癌药物组合)处理4-48小时，洗涤并用膜联蛋白V-FITC(BD-Pharmingen)染色1小时。通过流动式细胞测量术(Becton-Dickinson，CellQuest)来分析细胞，用碘化丙啶复染，并且再次在流式细胞仪中分析。
可在一个或多个时间点关于症状来评估患者，所述时间点包括在治疗方案之前、期间以及之后。治疗可导致改善受试者的病状，并且可通过确定是否已出现一种或多种以下因素来评估：肿瘤尺寸降低、细胞增殖降低、细胞数目降低、新血管化降低、细胞凋亡增加、或至少一部分肿瘤细胞的存活降低。在一些情况下，这些事件中的一个或多个可导致部分或总体消除癌症以及延长患者的存活。或者，对于末期癌症，治疗可导致疾病停滞、生活质量更好和/或存活延长。
测定细胞迁移的方法
细胞迁移测定已描述于文献中，例如由Brooks等，J.Clin.Invest1997，99：1390-1398描述，并且用于测量细胞迁移的方法为本领域技术人员所知。在本文所述的一种用于测量细胞迁移的方法中，来自跨孔迁移室的膜用底物涂布，洗涤跨孔，并且用BSA封闭非特异性结合位点。收集来自亚汇合培养物的肿瘤细胞，洗涤，并且在存在或不存在测定抗体下再悬浮于迁移缓冲液中。在使肿瘤细胞迁移至涂布的跨孔膜的下侧之后，移除剩余在膜的上侧上的细胞，并且用结晶紫染色迁移至下侧的细胞。接着通过直接计数每个显微镜视野的细胞来定量细胞迁移。
测定肿瘤生长的方法
可通过为本领域技术人员所知的方法来测定肿瘤生长，所述方法例如是SCID小鼠模型、裸小鼠模型和具有同基因肿瘤的BALB/c小鼠。如下进行针对肿瘤生长的SCID小鼠模型：收集亚汇合人M21黑素瘤细胞(或任何所需肿瘤细胞类型)，洗涤，并且再悬浮于无菌PBS中(每毫升20×106个细胞)。SCID小鼠用100μL M21人黑素瘤细胞(2×106)悬浮液皮下注射。在肿瘤细胞注射之后三天，小鼠不经处理或用所需剂量范围内的拮抗剂腹膜内处理。小鼠持续24天进行每日治疗。肿瘤尺寸是用测径规测量，并且使用公式V＝(LxW2)/2估计体积，其中V等于体积，L等于长度，并且W等于宽度。
或者，裸小鼠模型、SCID小鼠模型和/或BALB/c同基因小鼠模型也可用于通过本文所述的人源化抗内皮糖蛋白(endoglin)抗体或抗原结合片段来评估肿瘤生长及其抑制。
测定细胞增殖的方法
可通过为本领域技术人员所知的方法来测定细胞增殖。如本文所述，可在存在或不存在来自ECV或ECVL细胞的CM(25μL)下将亚汇合人内皮细胞(HUVEC)再悬浮于含有低(5.0％)血清的增殖缓冲液中，并且使内皮细胞增殖24小时。可通过使用可商购获得的WST-1测定试剂盒(Chemicon)测量线粒体脱氢酶活性来定量增殖。此外，如本文所述，可通过使用标准方法测量3H并入来定量增殖。(She等，Int.J.Cancer，108：251-257(2004))。
评估细胞增殖的其它方法在本领域中是已知的，并且涵盖于本文中。在实施例中更详细描述其它非限制性实例。
将了解的是本文所述的分类和分期系统代表一种用以评估本文所述的癌症治疗的手段；另外，其它分期方案在本领域中是已知的，并且可与本文所述的方法结合使用。仅举例来说，恶性肿瘤的TNM分类法可用作用以描述患者体内的癌症程度的癌症分期系统。T描述肿瘤尺寸以及它是否已侵袭附近组织，N描述涉及的区域性淋巴结，并且M描述远端转移。TNM是由国际抗癌联盟(International UnionAgainst Cancer，UICC)主张，并且由美国癌症联合委员会(AJCC)和国际妇科学和产科学联盟(International Federation of Gynecology andObstetrics，FIGO)使用。将了解的是并非所有肿瘤都具有TNM分类，例如像脑肿瘤。通常，T(a为(0)、1-4)测量为原发性肿瘤的尺寸或直接程度。N(0-3)是指扩散至区域性淋巴结的程度：N0是指肿瘤细胞不存在于区域性淋巴结中，N1是指肿瘤细胞扩散至最靠近或少数区域性淋巴结，N2是指肿瘤细胞扩散程度在N1与N3之间；N3是指肿瘤细胞扩散至大多数远端或众多区域性淋巴结。M(0/1)是指转移的存在性：M0是指不存在远端转移；M1是指转移已向远端器官发生(超出区域性淋巴结)。也可评估其它参数。G(1-4)是指癌细胞的等级(即如果它们类似于正常细胞而出现，那么它们是低等级的，并且如果它们分化不良地出现，那么它们是高等级的)。R(0/1/2)是指手术的完成性(即切除-边界不含癌细胞或并非不含癌细胞)。L(0/1)是指侵袭至淋巴管中。V(0/1)是指侵袭至静脉中。C(1-4)是指V的确定性(等级)的修正因子。
本文提供用于降解癌细胞、抑制癌细胞的生长或杀死癌细胞的方法，其包括使所述细胞与有效降解癌细胞、抑制癌细胞的生长或杀死癌细胞的一定量的本文所述的化合物接触。
本文提供在个体中抑制肿瘤尺寸增加，降低肿瘤尺寸，降低肿瘤增殖或防止肿瘤增殖的方法，其包括向所述个体施用有效量的本文所述的化合物来抑制肿瘤尺寸增加，降低肿瘤尺寸，降低肿瘤增殖或防止肿瘤增殖。在一些情况下，治疗肿瘤包括使症状停滞，即，通过治疗患者，癌症不恶化，并且患者的存活得以延长。
可在一个或多个时间点关于症状来评估患者，所述时间点包括在治疗方案之前、期间以及之后。治疗可导致改善受试者的病状，并且可通过确定是否已发生一种或多种以下事件来评估：肿瘤尺寸降低、肿瘤细胞增殖降低、细胞数目降低、新血管化降低和/或细胞凋亡增加。在一些情况下，这些事件中的一个或多个可导致部分或总体消除癌症以及延长患者的存活。或者，对于末期癌症，治疗可导致疾病停滞、生活质量更好和/或存活延长。
评估治疗的其它方法在本领域中是已知的，并且涵盖于本文中。在示例性实施方案中，向罹患特征在于存在一类非所要细胞的医学病症(例如癌症或非恶性病状)的受试者(如哺乳动物(例如人))施用本发明的前寡核苷酸化合物。
可评估使用本文所述的方法治疗的患者的主要结果量度，并且包括例如无进展存活。在一个实施方案中，无进展存活增加是以相较于缺乏治疗，存活增加约2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或50倍以上的量观察到。在另一实施方案中，无进展存活增加是相较于缺乏治疗，存活增加约3个月、约6个月、约9个月、约12个月、约18个月、约2年、约3年、约4年、约5年或5年以上。
也可评估次要结果量度，并且包括反应持续时间、达到肿瘤进展的时间、总体存活、严重和非严重不利事件。例如，治疗可防止疾病进展(即停滞)，或可导致改善。或者或此外，可关于以下一个或多个来量度其它目标：肿瘤负担降低、新血管化降低、副作用降低、不利反应降低和/或患者顺应性增加。
通过本发明的化合物或组合物进行的治疗所适用于治疗或预防的疾病或病症的其它具体实例包括但不限于移植排斥(例如肾、肝、心脏、肺、胰岛细胞、胰腺、骨髓、角膜、小肠、皮肤同种异体移植物或异种移植物和其它移植物)、移植物抗宿主疾病、骨关节炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、糖尿病、糖尿病性视网膜病变、炎症性肠病(例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和其它肠病)、肾病、恶病质、败血性休克、狼疮、重症肌无力、牛皮癣、皮炎、湿疹、皮脂溢、阿兹海默氏病、帕金森氏病(Parkinson′s disease)、在化学疗法期间的干细胞保护、自体或同种异基因骨髓移植的离体选择或离体净化、眼病、视网膜病变(例如黄斑部变性、糖尿病性视网膜病变和其它视网膜病变)、角膜疾病、青光眼、感染(例如细菌、病毒或真菌)、心脏病，包括但不限于再狭窄。
RNA酶L的活化
2′-5′寡腺苷酸(2-5A)/RNA酶L路径是一种由干扰素诱导的酶路径。RNA酶L在结合于2’-5’腺苷酸的5’-磷酸化片段之后被活化。2’-5’腺苷酸(2-5A)的这些片段是在2’-5’寡(A)合成酶的控制下产生。这个路径是先天性免疫系统的一部分，并且在防止病毒性感染方面具有重要作用。2-5A诱导的单链RNA裂解导致细胞凋亡。2-5A的生物稳定硫代磷酸酯类似物已显示是RNA酶L的强力活化剂(Xianh等，Cancer Research(2003)，63：6795-6801)。在这个研究中，2-5A类似物在晚期转移性人前列腺癌细胞系DUi45、PC3和LNCaP的培养物中诱导RNA酶L活性，并且导致细胞凋亡。
持续活化RNA酶L会触发消除病毒感染的细胞以及癌性细胞/肿瘤细胞的线粒体细胞凋亡路径。RNA酶L可抑制纤维肉瘤生长、前列腺癌生长、结肠直肠癌生长和胰腺癌生长。鉴于RNA酶L在不同癌症中的共同作用，预期本文所述的本发明可用于治疗任何类型的癌症。Silverman，RH，Cytokine Growth Factor Rev，18(5-6)：381-388(2007)；Bisbal，C.和Silverman，RH，Biochimie.89(6-7)：789-798(2007)。例如，RNA酶L的下调是指相较于示例性健康群体中的预定RNA酶L水平，编码RNA酶L的一种或多种基因的表达水平的任何降低、编码RNA酶L的一种或多种基因的沉默、包含RNA酶L的蛋白质的表达/翻译水平降低、细胞内存在的RNA酶L的量降低、和/或RNA酶L活性的任何降低。或者，如本文所述的RNA酶L水平的任何降低可指示RNA酶L的下调。
在一些实施方案中，提供的寡核苷酸适用于治疗具有下调的RNA酶L的疾病。在某一实施方案中，与下调的RNA酶L相关的疾病是癌症。在一些实施方案中，癌症是胰腺癌、前列腺癌或结肠直肠癌。或者，本文所述的提供的寡核苷酸适用于治疗具有上调的RNA酶L的疾病。在一些实施方案中，具有上调的RNA酶L的疾病是慢性疲劳综合征。具有上调的RNA酶L的其它疾病在本领域中是已知的，并且涵盖于本文中。
当用作治疗剂时，提供的寡核苷酸是以药物组合物形式施用。在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的提供的寡核苷酸或其药学上可接受的盐以及至少一种选自药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的载体的药学上可接受的非活性成分。在另一实施方案中，药物组合物被配制来用于静脉内注射、经口施用、经颊施用、吸入、经鼻施用、表面施用、经眼施用或经耳施用。在其它实施方案中，药物组合物是片剂、丸剂、胶囊、液体、吸入剂、鼻喷雾溶液、栓剂、混悬液、凝胶剂、胶体、分散液、混悬液、溶液、乳液、软膏剂、洗剂、滴眼剂或滴耳剂。
药物组合物
当用作治疗剂时，本文所述的提供的寡核苷酸或寡核苷酸组合物是以药物组合物形式施用。在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的提供的寡核苷酸或其药学上可接受的盐以及至少一种选自药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的载体的药学上可接受的非活性成分。在一些实施方案中，药物组合物被配制来用于静脉内注射、经口施用、经颊施用、吸入、经鼻施用、表面施用、经眼施用或经耳施用。在一些实施方案中，药物组合物是片剂、丸剂、胶囊、液体、吸入剂、鼻喷雾溶液、栓剂、混悬液、凝胶剂、胶体、分散液、混悬液、溶液、乳液、软膏剂、洗剂、滴眼剂或滴耳剂。
在一些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含手性控制的寡核苷酸或其组合物与药学上可接受的赋形剂的混合物。本领域技术人员将认识到药物组合物包括上述手性控制的寡核苷酸的药学上可接受的盐或其组合物。
用于增强和靶向递送的化合物
如本文所述的提供的寡核苷酸可使用多种递送策略来递送，所述策略包括核酸与各种配体的缀合物以及使用纳米载体方法。任何核酸递送策略都被涵盖与本文所述的提供的寡核苷酸一起使用。在包括但不限于化学缀合物、阳离子脂质/脂质体转移囊泡和超分子纳米载体的示例性递送策略之间进行选择取决于治疗情形，并且用于确定最优递送模态的方法在本领域中是已知的，并且进一步涵盖于本文中。
细胞渗透性化合物(“CPC”)
已知众多化合物充当如核酸的货物(cargo)的载体，并且在体内环境中有助于核酸进入细胞。示例性载体描述于Dietz等，Molecular&Cellular Neuroscience，27(2)：85-131(2004)中，所述文献以引用的方式并入本文。源于Tat的原型CPC和触角转录调控子已由许多新型部分接合。例如，作为肽的CPC可为富含精氨酸和赖氨酸的相对较短(9-30个氨基酸)的聚阳离子肽或膜相互作用性疏水性序列。CPC可通过重组DNA技术连接于或化学偶联于肽、寡核苷酸或纳米载体，所述载体于是包含CPC的“货物”。
细胞靶向配体(“CTL”)
另一策略在于通过使用以高亲和力结合能够经受高效内化的细胞表面受体的CTL来递送寡核苷酸。潜在配体包括抗体、源于噬菌体展示文库的多肽、和小有机分子。其它细胞靶向配体在本领域中是已知的，或将被开发，并且预期与本文所述的本发明一起使用(对于ASGPR-GalNAc缀合的siRNA和寡核苷酸，例如WO2012037254A1)。因为各种受体常优先在特定细胞类型上表达，所以这个方法提供改进寡核苷酸试剂的选择性的可能性。示例性受体靶标包括但不限于脂蛋白受体(如肝中的那些)、整合素、受体酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体(GPCR)超家族。
纳米载体
多种超分子纳米载体可用于递送核酸。示例性纳米载体包括但不限于脂质体、阳离子聚合物复合物和各种聚合物。核酸与各种聚阳离子复合是用于细胞内递送的另一方法；这包括使用PEG化聚阳离子、聚乙烯胺(PEI)复合物、阳离子嵌段共聚物和树枝状聚合物。包括PEI和聚酰氨基胺树枝状聚合物的若干阳离子纳米载体有助于自内体释放内含物。其它方法包括使用聚合纳米粒子、聚合物胶束、量子点和脂质复合物。
除本文所述的示例性递送策略之外，其它核酸递送策略也是已知的。
在治疗和/或诊断应用中，本发明化合物可被配制来用于多种施用模式，包括全身性和表面或局部施用。技术和制剂通常可见于Remington，The Science and Practice of Pharmacy，(第20版2000)中。
提供的寡核苷酸及其组合物在广泛剂量范围内有效。例如，在治疗成人时，每天约0.01至约1000mg、约0.5至约100mg、约1至约50mg和约5至约100mg的剂量是可使用的剂量的实例。精确剂量将取决于施用途径、施用化合物所采用的形式、待治疗的受试者、待治疗的受试者的体重以及主治医师的偏好和经验。
药学上可接受的盐通常为本领域普通技术人员所熟知，并且可例如包括但不限于乙酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate)、苯磺酸盐(besylate)、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、乙二胺四乙酸钙盐、右旋樟脑磺酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、反丁烯二酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、对羟乙酰胺基苯胂酸盐、己基间苯二酚盐、海卓胺、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、顺丁烯二酸盐、杏仁酸盐、甲磺酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐(pamoate/embonate)、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、次乙酸盐、丁二酸盐、硫酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐或茶氯酸盐。其它药学上可接受的盐可见于例如Remington，The Science and Practice ofPharmacy(第20版2000)中。优选药学上可接受的盐包括例如乙酸盐、苯甲酸盐、溴化物、碳酸盐、柠檬酸盐、葡萄糖酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、顺丁烯二酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐、水杨酸盐、丁二酸盐、硫酸盐或酒石酸盐。
视所治疗的特定病状而定，所述药剂可被配制成液体或固体剂型，并且全身性或局部施用。药剂可例如以如为本领域技术人员所知的定时或持续低释放形式递送。用于配制和施用的技术可见于Remington，The Science and Practice of Pharmacy(第20版2000)中。适合途径可包括经口、经颊、通过吸入喷雾剂、舌下、经直肠、经皮、经阴道、经粘膜、经鼻或经肠施用；胃肠外递送，包括肌肉内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接室内、静脉内、关节内、胸骨内、滑膜内、肝内、病变内、颅内、腹膜内、鼻内或眼内注射或其它递送模式。
对于注射，本发明的药剂可于水溶液中，如于生理可相容缓冲液，如亨克氏溶液(Hank′s solution)、林格氏溶液(Ringer′s solution)或生理盐水缓冲液中配制和稀释。对于所述经粘膜施用，适合于待渗透的屏障的渗透剂用于制剂中。所述渗透剂通常在本领域中是已知的。
使用药学上可接受的惰性载体来将本文公开的用于实施本发明的化合物配制成适于全身性施用的剂量在本发明的范围内。在适当选择载体和适合制造规范下，可胃肠外施用，如通过静脉内注射来施用本发明的组合物，特别是配制成溶液的那些。
使用本领域中熟知的药学上可接受的载体，可易于将化合物配制成适于经口施用的剂量。所述载体使得本发明化合物能够被配制成供待治疗的受试者(例如患者)经口摄取的片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆、浆液、混悬液等。
对于经鼻或吸入递送，本发明的药剂也可通过为本领域技术人员所知的方法来配制，并且可包括例如但不限于溶解、稀释或分散如盐水、防腐剂(如苯甲醇)、吸收促进剂和氟碳化合物的物质的实例。
适用于本发明中的药物组合物包括其中以有效量含有活性成分以达成它的预定目的的组合物。确定有效量完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其鉴于本文提供的详细公开内容。
除活性成分之外，这些药物组合物可含有有助于将活性化合物加工成可在药学上使用的制剂的适合药学上可接受的载体，包括赋形剂和助剂。被配制来供经口施用的制剂可呈片剂、糖衣片、胶囊或溶液形式。
供经口使用的药物制剂可通过以下方式来获得：组合活性化合物与固体赋形剂，任选地研磨所得混合物，以及必要时在添加适合助剂之后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣片核心。适合赋形剂特别是填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠(CMC)和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP：聚维酮)。必要时，可添加崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，如海藻酸钠。
糖衣片核心具有适合包衣。出于这个目的，可使用浓缩糖溶液，其可任选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡伯波凝胶(carbopol gel)、聚乙二醇(PEG)和/或二氧化钛、漆溶液和适合有机溶剂或溶剂混合物。染料或颜料可添加至片剂或糖衣片包衣中以鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。
可经口使用的药物制剂包括由明胶制得的推入-配合型胶囊以及由明胶和塑化剂(如甘油或山梨糖醇)制得的软质密封胶囊。推入-配合型胶囊可含有活性成分与填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)和/或润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)以及任选地稳定剂的混合物。在软质胶囊中，活性化合物可溶解或混悬于适合液体，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇(PEG)中。此外，可添加稳定剂。
视待治疗或预防的特定病状或疾病病况而定，通常被施用来治疗或预防那个病状的其它治疗剂可连同本发明的抑制剂一起施用。例如，化学治疗剂或其它抗增生剂可与本发明的抑制剂组合来治疗增生性疾病和癌症。已知化学治疗剂的实例包括但不限于阿霉素、地塞米松、长春新碱、环磷酰胺、氟尿嘧啶、拓扑替康、泰素、干扰素和铂衍生物。
本发明的非外消旋前寡核苷酸也可与之组合的药剂的其它实例包括但不限于消炎剂，如皮质类固醇、TNF封闭剂、IL-1 RA、咪唑硫嘌呤、环磷酰胺和硫氮磺胺吡啶；免疫调节和免疫遏制剂，如环孢菌素、他克莫司、雷帕霉素、霉酚酸吗啉乙酯、干扰素、皮质类固醇、环磷酰胺、咪唑硫嘌呤和硫氮磺胺吡啶；神经营养因子，如乙酰基胆碱酯酶抑制剂、MAO抑制剂、干扰素、抗惊厥剂、离子通道封闭剂、利鲁唑和抗帕金森病药剂；用于治疗心血管疾病的药剂，如β-封闭剂、ACE抑制剂、利尿剂、硝酸盐、钙通道封闭剂和士他汀；用于治疗肝病的药剂，如皮质类固醇、消胆胺、干扰素和抗病毒剂；用于治疗血液病症的药剂，如皮质类固醇、抗白血病药剂和生长因子；用于治疗糖尿病的药剂，如胰岛素、胰岛素类似物、α葡萄糖苷酶抑制剂、双胍和胰岛素敏化剂；以及用于治疗免疫缺陷病症的药剂，如γ球蛋白。
这些其它药剂可作为多剂量方案的一部分与提供的手性控制的寡核苷酸及其组合物分开施用。或者，这些药剂可为单一剂型的一部分，与提供的手性控制的寡核苷酸及其组合物一起混合成单一组合物。
以下提供的实施例和制备进一步说明和例示提供的寡核苷酸及其组合物以及其制备方法。应了解本发明的范围不以任何方式受限于以下实施例和制备的范围。
根据下述实施例，将更充分了解本发明的这些和其它实施方案的功能和优势。以下实施例旨在说明本发明的益处，但不例示本发明的完全范围。
分析寡核苷酸组合物的方法
在一些实施方案中，本发明提供用于分析寡核苷酸组合物的方法。在一些实施方案中，提供的方法检测、测定和/或定量例如一种或多种寡核苷酸的身份、纯度、量和/或品质。在一些实施方案中，本发明提供一种方法，其包括以下步骤：
a)对第一组合物进行第一分析，所述第一组合物包含多种不同类型的寡核苷酸；以及
b)比较所进行的第一分析与在类似于所述第一分析的条件下对第二组合物的第二分析，所述第二组合物是所述寡核苷酸的手性控制的组合物，其中所述第一分析与所述第二分析之间的差异反映相较于所述第二组合物，所述第一组合物中的至少一种类型的寡核苷酸的存在性或水平的差异。
在一些实施方案中，第二组合物仅含有单一类型的寡核苷酸。在一些实施方案中，第二组合物含有一种以上类型的寡核苷酸。在一些实施方案中，提供的方法用于对寡核苷酸组合物进行品质控制，例如如实施例17和48中所说明。如本领域技术人员将了解，实施例48中呈现的数据确认描绘的比较组合物的分析显示如通过非手性控制的寡核苷酸合成制备的无规寡核苷酸组合物(第一组合物)包含极低水平的某些寡核苷酸类型，如手性控制的组合物(第二组合物)的完全Rp或Sp类型。
例证
前述是对本发明的某些非限制性实施方案的描述。因此，应了解本文所述的本发明的实施方案仅说明本发明的原理的应用。本文提及说明的实施方案的细节不旨在限制权利要求的范围。
寡核苷酸合成的一般性描述
如以上以及本文中所述，在一些实施方案中，本发明提供寡核苷酸以及其制备方法。在一些实施方案中，寡核苷酸的合成是使用固体载体来进行。在一些实施方案中，寡核苷酸的合成是在溶液中进行。在一些实施方案中，寡核苷酸的合成包括使用固体载体的步骤和在溶液相中的步骤。在一些实施方案中，使用固体载体的步骤是在寡核苷酸合成仪上进行。
制备固体载体：载体(高交联聚苯乙烯(HCP)或可控孔度玻璃(CPG))用于装载寡核苷酸序列中含有的第一5′-O-DMTr保护的核苷。在一些实施方案中，草酰基用于使第一核苷的3′-OH基团连接于固体载体上的胺基团，如Alul等，Oxalyl-CPG：a labile support for synthesisof sensitive oligonucleotide derivatives，Nucleic Acid Research 1991，19(7)，1527中所述。在一些实施方案中，标准丁二酰基用作接头。
固体载体上的核苷酸的脱三苯甲基化：将3％TCA(三氯乙酸)于二氯甲烷(DCM，CH2Cl2)中的溶液递送至安置在合成仪上的含有载体的管柱中以对5′-O-DMTr去封闭。
CMPT介导的手性亚磷酰胺偶联：在用无水乙腈(ACN)洗涤固体载体，并且通过用干燥氩气逆向吹扫来干燥之后，使游离5′-OH与寡核苷酸序列中的下一核苷酸偶联，从而导致自3′末端向5′末端增长。这使得必须向固体载体共递送手性亚磷酰胺以及CMPT(以下)的溶液，此导致在高度非对映异构过量(通常＞99％)下高效偶联以得到手性亚磷酸二酯产物，如由Wada等J.Am.Chem.Soc.，2008，130，16031-1603；Angew.Chem.Intern.Ed.2009，48，496-499所述。溶剂通常是乙腈(ACN)，但也可使用其它溶剂。
用于这些研究中的手性亚磷酰胺：
其它亚磷酰胺：
加帽：在一些实施方案中，以两步进行加帽步骤。在一些实施方案中，以上提及的两个加帽步骤被组合成一个步骤，并且以一锅方式进行。除非另外规定，否则两步加帽用于本文所述的实例的合成中。
对于两步加帽，在用无水ACN洗涤固体载体，并且通过用干燥氩气逆向吹扫来干燥之后，首先将通常包含5％Pac2O的2，6-二甲基吡啶/THF-1∶4(v/v)溶液的“帽A”试剂引入固体载体中。在不旨在受理论限制下，帽A具有足够反应性以对手性助剂的游离胺有效加帽(酰化)。在一些实施方案中，所述保护防止中间亚磷酸酯重排/分解。在这个处理之后立刻将“帽A”和“帽B”试剂的1∶1混合物传送至含有固体载体的管柱中。“帽B”是16％N-甲基咪唑(NMI)于THF中的溶液，其在与“帽A”混合时实现对例如结合于固体载体的未反应5′-OH寡核苷酸的加帽。在不希望受理论限制下，加帽步骤极其重要，因为在不对手性助剂的氨基加帽下，例如归因于助剂的游离胺对磷原子的非所需分子间亲核攻击，循环内的随后硫化步骤诱导核苷酸间键联裂解和寡核苷酸分解。此外，就获得高纯度粗全长寡核苷酸，避免归因于延长的不合格序列的累积所致的低产率以及如果可能，那么繁重和困难的最终纯化而言，对流失的、未偶联的、固体支撑的寡核苷酸短聚体的5′-OH基团加帽是至关重要的。
硫化：在用无水ACN洗涤固体载体，并且通过用干燥氩气逆向吹扫来干燥之后，使所得加帽的亚磷酸三酯中间体经受氧化硫化。通过在ACN中混合硫化试剂，例如硫代磺酸烷基酯衍生物(300mM)与N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)(100mM)来制备硫化试剂的溶液。接着将这个溶液递送至含有固体载体的管柱中，并且使其反应某一时间量(通常5-60分钟)。在一些实施方案中，硫化性硫代磺酸酯试剂以不添加BSTFA的300mM的无水ACN溶液形式加以使用。在一些实施方案中，有和无BSTFA的试剂溶液产生类似结果。
氧化：在一些实施方案中，替代硫化步骤来进行使磷酸二酯氧化。通过递送0.02M I2于THF/吡啶/水(70∶20∶10-v/v/v)共溶剂系统中的溶液来达成氧化，从而形成非手性磷酸二酯键联。
对DMTr基团的5′去封闭：使用含3％TCA的DCM实现DMTr移除。在去封闭之后，循环可接着向前进行其它迭代轮的偶联、加帽、硫化/氧化(对于各下一循环，用相同硫化剂进行硫化，或用不同硫化剂进行硫化，或替代硫化进行氧化)和去封闭。或者，如果达到预先设计的长度，那么使寡核苷酸经受循环退出，并且任选进行合成后处理。在一些实施方案中，在对末端5′-O-DMTr基团去封闭之前移除寡核苷酸。
手性助剂的自发性移除：在硫化、氧化、对DMTr基团去封闭或其组合期间达成手性助剂的自发性移除。不需要特定步骤来移除手性助剂。
裂解和脱保护：所需长度的寡核苷酸通过裂解相应接头(草酰基或丁二酰基连接的HCP或CPG)来自它的固体载体移除，同时，脱除寡核苷酸上的保护基。在一些实施方案中，固体支撑的寡核苷酸首先用1，5-二氮杂双环(4.3.0)壬-5-烯(DBN)或1，8-二氮杂双环十一-7-烯(DBU)于无水ACN-三甲基硅烷基氯化物16∶1(v/v)中的无水1M溶液在室温下处理10分钟，并且接着用无水ACN洗涤，如由Reese和Yan，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1，2002，2619所述。在一些实施方案中，材料用无水丙胺于无水吡啶(通常以1∶4比率)中的溶液在室温下处理18小时的时期，或在60℃下处理2小时。在一些实施方案中，任一条件都提供具有类似品质的粗化合物。在一些实施方案中，自载体裂解粗寡核苷酸，并且通过用28％氨水在室温下处理18小时的时期，或在60℃下处理5小时来脱保护。在一些实施方案中，任一条件都提供具有类似品质的粗化合物。接着蒸发溶剂，并且用pH约1.5的具有0-50％DMSO的水溶液(必要时可改变pH)处理残余物，并且使粗产物经受HPLC和UPLC/MS的组合分析。产物通过反相HPLC(RP-HPLC)、正相HPLC、离子交换HPLC(IE-HPLC)或尺寸排阻色谱法中的一个或组合来纯化。在一些实施方案中，自固体载体移除寡核苷酸，脱保护并纯化，随后对DMTr基团去封闭。
实施例1：合成硫化试剂以及合成亚磷酰胺
在一些实施方案中，本发明提供硫化试剂以及其制备方法。在一些实施方案中，提供的硫化试剂用于合成本申请中所述的寡核苷酸。示例性硫化试剂和它们的合成说明于方案E-1中
方案E-1.合成硫化试剂。
(i)MsCl、NEt3；(ii)NaMTS；(iii)PivCl、NEt3；(iv)NaMTS、NaI；(v)化合物4；(vi)TMSCl、NEt3；(vii)化合物35、DEAD、PPh3；(viii)TBAF；(ix)TsCl、吡啶；(x)Ac2O、吡啶；(xi)KTTS；(xii)(COCl)2；(xiii)Fmoc-OSu、Py；(xiv)NaOH(aq)；(xv)Na-p-ClPheTS；4-硝基苯亚磺酸钠、Br2；(xvii)H2O2、NaI
合成化合物5
化合物2：以逐滴方式添加(Z)-丁-2-烯-1，4-二醇(0.93ml，11.3mmol)和三乙胺(3.3ml，24mmol)于二氯甲烷(DCM，50mL)中的溶液至甲烷磺酰氯(1.9ml，24mmol)于DCM(50mL)中的搅拌冰冷溶液中。在室温下搅拌0.5小时之后，将混合物倾于冰上并萃取。收集有机层，干燥(MgSO4)并过滤。在移除溶剂之后，获得2.66g化合物2(96％)，其由NMR判定足够纯净以直接用于反应的下一步骤中。1HNMR(399MHz，CDCl3)δ5.94(ddd，J＝5.4，4.1，1.3Hz，2H)，4.83(dd，J＝4.1，1.3Hz，4H)，3.04(s，6H)；13C NMR 128.34，64.38，38.27；MS(ESI+ve)：(M+NH4)+计算值：262.04；实测值：262.05；Rf＝0.3(1∶1EtOAc/己烷)。
化合物3：在室温下，用纯(Z)-二甲烷磺酸丁-2-烯-1，4-二基酯(1.25g，5.12mmol)处理甲烷硫代磺酸钠(1.51g，11.3mmol)于MeOH(20ml)中的溶液。在5分钟之后，观察到发生沉淀。在36小时之后，将混合物分配于水与DCM之间。分离有机层，干燥(MgSO4)并过滤。移除溶剂提供无色油状物。柱色谱法(ISCO)得到呈无色油状的纯化合物3(0.89g，63％)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ5.84(ddd，J＝6.6，5.1，1.5Hz，2H)，3.92(dd，J＝5.1，1.5HZ，4H)，3.33(s，6H)；13C NMR 128.1，51.47，33.13；MS(ESI+ve)：(M+NH4)+计算值：294.00；实测值：294.04；Rf＝0.4(1∶1EtOAc/己烷)。
化合物4：在氩气氛围下，添加吗啉(10g，115mmol)至圆底烧瓶中的环硫乙烷(15g，250mmol)中。搅拌反应7小时，并且直接装载于硅胶柱上。管柱首先用DCM洗涤，并且接着使用2％MeOH/DCM来获得呈无色油状的化合物4(15.3g，91％)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ3.67-3.59(m，4H)，2.63-2.52(m，2H)，2.51-2.45(m，2H)，2.44-2.34(m，4H)；MS(ESI+ve)：(M+H)+计算值＝148.07；实测值：148.1。
化合物5：在室温下通过注射器来逐滴添加2-吗啉代乙烷硫醇(0.21g，1.44mmol)的DCM溶液(1mL)至化合物3(0.40g，1.44mmol)于DCM(10mL)中的搅拌溶液中。在添加之后立刻，通过TLC来检查反应，显示快速形成产物和某一二聚体。在0.5小时之后，通过添加水来分配混合物。在萃取后，分离有机层，干燥(MgSO4)并过滤。在真空移除溶剂之后，柱色谱法得到呈无色油状的化合物5(0.29g，58％)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ5.78(m，2H)，3.92(d，J＝7.3Hz，2H)，3.70(t，J＝4.7Hz，4H)，3.46(d，J＝5.5Hz，2H)，3.31(s，3H)，2.84(dd，J＝7.8，6.7Hz，2H)，2.66(dd，J＝7.8，6.7，2H)，2.48(t，J＝4.6Hz，4H)；13C NMR 130.35，126.27，66.97，58.20，53.67，51.52，36.22，35.16，33.67；MS(ESI+ve)：(M+H)+计算值：344.05；实测值：344.06；Rf＝0.3(EtOAc)。
化合物5b：在室温下通过注射器来逐滴添加化合物4b(395mg，1.085mmol)的DCM溶液(1mL)至化合物3(300mg，1.085mmol)的搅拌DCM(15mL)溶液中。在1小时之后，通过添加水来分配所得溶液。在萃取后，分离有机层，干燥(MgSO4)并过滤。在真空移除溶剂之后，柱色谱法得到呈无色油状的化合物5b(0.35g，58％)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ5.83-5.70(m，2H)，5.35-5.21(dt，J＝26.0，9.3Hz，2H)，5.16-5.07(m，1H)，4.59-4.54(d，J＝9.5Hz，1H)，4.29-4.23(m，1H)，4.23-4.18(m，1H)，3.99-3.88(dd，J＝6.7，1.2Hz，2H)，3.80-3.72(ddd，J＝10.1，4.6，2.6Hz，1H)，3.64-3.56(m，1H)，3.50-3.43(m，1H)，3.31(s，3H)，2.09(s，3H)，2.03(s，6H)，2.00(s，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ170.68，170.30，169.51，169.30，129.43，127.14，87.73，76.49，73.89，69.16，67.99，61.99，51.64，35.89，33.58，20.95，20.80，20.74，20.71；MS(ESI+ve)：(M+NH4)+计算值：578.07；实测值：577.96；Rf＝0.5(1∶1EtOAc/己烷)。
合成化合物7
化合物6：通过注射器历经2分钟用特戊酰氯(1.4ml，11.4mmol)逐滴处理(Z)-丁-2-烯-1，4-二醇(0.93ml，11.3mmol)和三乙胺(1.6mL，11.5mmol)于DCM(50ml)中的冰冷溶液。在1小时之后，TLC显示良好反应结果。通过添加水来分配所得混合物。在萃取后，分离有机层，干燥(MgSO4)并真空浓缩。通过TLC(Rf＝0.6，1∶1EtOAc/己烷)发现这个粗化合物不含有起始二醇，并且以粗制形式用于制备甲磺酸酯。将粗材料溶解于含有三乙胺(1.7mL，12mmol)的DCM(50ml)中，并且在冰浴上冷却。通过注射器历经2分钟来逐滴添加甲烷磺酰氯(0.98ml，12.66mmol)。在添加之后立刻，TLC指示起始材料完全消耗。通过添加水来分配所得混合物。在萃取后，分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。柱色谱法得到呈无色油状的纯化合物6(1.48g，52％)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ5.89-5.75(m，2H)，4.89-4.84(d，J＝5.7Hz，2H)，4.68-4.63(d，J＝5.9Hz，2H)，3.03(s，3H)，1.19(s，9H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ178.28，130.61，126.11，65.08，59.65，38.84，38.21，27.25；MS(ESI+ve)：(M+NH4)+计算值：268.12；实测值：268.20；Rf＝0.3(20％EtOAc/己烷)。
化合物7：在室温下搅拌甲烷硫代磺酸钠(0.63g，4.70mmol)和(Z)-特戊酸4-(甲基磺酰基氧基)丁-2-烯酯(1.00g，4.00mmol)的MeOH(10ml)溶液18小时，伴有白色沉淀形成(在10分钟之后)。通过添加水和DCM来分配所得混合物。在萃取至DCM中后，分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。柱色谱法得到呈无色油状的化合物7(0.83g，78％)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ5.82-5.73(m，2H)，4.73-4.66(m，2H)，3.95-3.87(m，2H)，3.32(s，3H)，1.19(s，9H)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ178.35，129.37，127.32，59.50，51.44，38.84，33.61，27.28；MS(ESI+ve)：(M+NH4)+计算值：284.10；实测值：284.19；Rf＝0.4(20％EtOAc/己烷)。
合成化合物9
化合物9：以逐滴方式添加特戊酰氯(0.60g，5.0mmol)至S-甲烷硫代磺酸2-羟基乙酯(0.65g，4.16mmol)于DCM(20ml)中的搅拌溶液中。在室温下2小时之后，用水分配具有白色沉淀的所得混合物。分离有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，浓缩以得到油状物。柱色谱法得到呈无色油状的化合物9(0.45g，45％)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ4.39-4.34(t，J＝6.3Hz，2H)，3.44-3.39(t，J＝6.3Hz，2H)，3.36(s，3H)，1.20(s，9H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ62.10，51.11，38.96，35.19，27.24；MS(ESI+ve)：(M+NH4)+计算值：158.08；实测值：158.04；Rf＝0.3(20％EtOAc/己烷)。
合成化合物12
化合物11：通过注射器来逐滴添加特戊酰氯(4.96ml，40.3mmol)至2-(羟甲基)苯酚(5g，40.3mmol)和三乙胺(5.61ml，40.3mmol)的冰冷DCM溶液(50mL)中。粗特戊酸酯的冰冷溶液用三乙胺(6.74ml，48.4mmol)和50mL DCM处理。接着通过注射器来缓慢添加(5分钟)甲烷磺酰氯(3.43ml，44.3mmol)，并且使所得混合物升温至室温。将混合物倾于冰上，并且分离有机层，接着用饱和NaHCO3(水溶液)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩以提供10.5g粗浅黄色油状物。柱色谱法(ISCO)得到纯11(5.45g，47％)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ7.53-7.46(dd，7.7，1.8Hz，1H)，7.46-7.40(dt，7.7，1.8Hz，1H)，7.32-7.24(t，7.7Hz，1H)，7.13-7.06(d，7.7Hz，1H)，5.21(s，2H)，2.79(s，3H)，1.40(s，9H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ177.05，150.06，131.18，131.07，126.35，125.94，123.21，66.88，39.48，38.82，27.30，27.26.MS(ESI+ve)：(M+NH4)+计算值：304.12；实测值：303.99；Rf＝0.4(20％EtOAc/己烷)。
化合物12：在室温下用特戊酸2-((甲基磺酰基氧基)甲基)苯酯(1.76g，6.15mmol)处理甲烷硫代磺酸钠(0.825g，6.15mmol)的MeOH(20mL)溶液，并且使其搅拌18小时。将混合物分配于水与DCM之间。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩以提供无色油状物。柱色谱法得到呈灰白无色油状的纯化合物12(0.754g，41％)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ7.48-7.44(dd，J＝7.7，1.7Hz，1H)，7.39-7.34(td，J＝7.8，1.7Hz，1H)，7.25-7.20(td，J＝7.6，1.2Hz，1H)，7.10-7.06(dd，J＝8.2，1.2Hz，1H)，4.29(s，2H)，2.90(s，3H)，1.39(s，9H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ176.69，149.59，131.17，129.85，127.41，126.18，123.40，51.43，39.47，36.01，27.30；MS(ESI+ve)：(M+NH4)+计算值：320.10；实测值：320.09；Rf＝0.4(20％EtOAc/己烷)。
合成化合物14
化合物14：在室温下添加特戊酸氯甲酯(0.478ml，3.32mmol)至碘化钠(0.050g，0.33mmol)和甲烷硫代磺酸钠(0.445g，3.32mmol)于丙酮(7ml)中的搅拌混合物中。在24小时之后，TLC显示向产物良好转化。移除溶剂，并且将残余物分配于水与DCM之间。分离有机层并干燥(MgSO4)，过滤并浓缩以提供无色油状物。柱色谱法得到呈微粉红色固体状的纯14(0.41g，55％)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ5.67(s，2H)，3.39(s，3H)，1.24(s，9H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ177.35，67.84，52.20，38.93，27.05；Rf＝0.5(20％EtOAc/己烷)。
合成化合物16
化合物16：如先前于US 3,484,473中所述，自15和NaMTS制备。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ4.86(s，2H)，3.45(s，6H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ52.15，41.50。
合成化合物18和19
化合物18：如Chem.Pharm.Bull.第12卷(11)第1271页，1964先前所述自17和NaMTS制备。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ3.55(s，4H)，3.40(s，6H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ50.67，35.96。
化合物19：在室温下通过注射器来逐滴添加2-吗啉代乙烷硫醇(0.17g，1.2mmol)的DCM溶液(1mL)至化合物18(300mg，1.2mmol)于DCM(10mL)中的搅拌溶液中。在添加之后立刻，TLC显示快速形成产物和某一二聚体。在0.5小时之后，通过添加NaHCO3溶液来分配混合物。在萃取后，分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。柱色谱法得到呈无色油状的纯19(0.20g，53％)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ3.73-3.67(t，J＝4.7Hz，4H)，3.51-3.46(m，2H)，3.35(s，3H)，3.07-3.01(m，2H)，2.88-2.83(m，2H)，2.69-2.63(m，2H)，2.52-2.43(t，J＝4.6Hz，4H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ66.96，57.91，53.58，50.79，37.66，36.10，35.52；MS(ESI+ve)：(M+H)+计算值：318.03；实测值：318.04；Rf＝0.3(EtOAc)。
合成化合物22
化合物21：通过与对于化合物11所述的程序类似的程序来使化合物20转化成化合物21。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ7.45-7.36(m，4H)，5.37(s，2H)，5.21(s，2H)，2.93(s，3H)，1.21(s，9H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ178.20，135.65，131.92，130.48，129.98，129.78，128.88，69.05，63.39，38.94，38.36，27.27；MS(ESI+ve)：(M+NH4)+计算值：318.24；实测值：318.14；Rf＝0.4(20％EtOAc/己烷)。
化合物22：通过与对于化合物12所述的程序类似的程序来使化合物21转化成化合物22。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ7.46-7.32，(m，4H)，5.21(s，2H)，4.50(s，2H)，3.03(s，3H)，1.21(s，9H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ178.24，135.10，133.15，130.93，130.32，129.05，129.00，63.61，51.07，38.97，38.03，27.30；MS(ESI+ve)：(M+NH4)+计算值：334.11；实测值：334.13；Rf＝0.4(20％EtOAc/己烷)。
合成化合物25
化合物23：根据文献方法(Journal of Medicinal Chemistry，50(23)，5568-5570，2007)制备化合物23。
化合物24：以逐滴方式，用乙酰氯(1mmol)，接着在5分钟之后用MsCl(1.1mmol)连续处理化合物23(1mmol)的冰冷吡啶溶液(10mL)。使溶液升温至室温，接着移除溶剂。将残余物溶解于EtOAc中，用水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。通过柱色谱法纯化提供纯化合物24。
化合物25：通过与对于化合物12所述的程序类似的程序来使化合物24转化成化合物25。
合成化合物27
化合物27：通过与对于化合物14所述的程序类似的程序来使化合物26转化成化合物27。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ3.97(s，2H)，3.79(s，3H)，3.48(s，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ168.84，53.35，51.53，37.83；MS(ESI+ve)：(M+NH4)+计算值：202.02；实测值：201.96；Rf＝0.2(20％EtOAc/己烷)。
合成化合物29
化合物29：通过与对于化合物14所述的程序类似的程序来使化合物28转化成化合物29。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ3.72(s，3H)，3.39(t，J＝6.8Hz，2H)，3.34(s，3H)，2.85(t，J＝6.8Hz，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ171.53，52.29，50.66，34.51，31.20；MS(ESI+ve)：(M+NH4)+计算值：216.10；实测值：216.04；Rf＝0.2(20％EtOAc/己烷)。
合成化合物31
化合物30：根据文献方法(Tetrahedron，42(2)，601-607；1986)制备化合物30。
化合物31：根据专利程序(US 20090181444)自化合物30制备化合物31。
合成化合物33
化合物33：根据专利程序(US 20090181444)自化合物32制备化合物33。
合成化合物38
化合物36：用NEt3(1mmol)处理化合物34(1mmol)的冰冷DCM(20mL)溶液，随后逐滴添加TMS-C1(1.1mmol)。在1小时之后，溶液用水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。将粗TMS保护的材料再溶解于THF(10mL)中，在其上连续添加PPh3(1.2mmol)、化合物35(1.2mmol)和DEAD(1.2mmol，逐滴)。在室温下搅拌18小时之后，真空移除溶剂，将残余物再溶解于DCM中，其溶液用水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。通过柱色谱法纯化提供纯化合物36。
化合物37：用TBAF(1mmol l M THF溶液)处理化合物36(0.5mmol)的THF(10mL)溶液，其中通过TLC来监测。在TMS裂解完成后，真空移除溶剂，并且将残余物再溶解于DCM中，其溶液用水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空减小体积。将粗醇再溶解于吡啶(5mL)中，并且添加TsCl(0.55mmol)。在室温下18小时之后，移除溶剂，并且将残余物再溶解于DCM中，其溶液用水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空减小体积。通过柱色谱法纯化提供纯化合物37。
化合物38：通过与对于化合物12所述的程序类似的程序来使化合物37转化成化合物38。
合成化合物41
化合物40：用NEt3(1mmol)处理化合物39(1mmol)的冰冷DCM(20mL)溶液，随后逐滴添加TMS-C1(1.1mmol)。在1小时之后，溶液用水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。将粗TMS保护的材料再溶解于THF(10mL)中，在其上连续添加PPh3(1.2mmol)、对甲苯硫代磺酸钾(KTTS，1.2mmol)、无水ZnCl2(1mmol)和DEAD(1.2mmol，逐滴)。在室温下搅拌18小时之后，真空移除溶剂，并且将残余物再溶解于DCM中，其溶液用水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。通过柱色谱法纯化提供纯化合物40.
化合物41：用TBAF(1mmol 1M THF溶液)处理化合物40(0.5mmol)的THF(10mL)溶液，其中通过TLC来监测。在TMS裂解完成后，真空移除溶剂，并且将残余物再溶解于DCM中，其溶液用水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。将粗醇再溶解于THF(10mL)中，在其上连续添加PPh3(1.2mmol)、化合物35(1.2mmol)和DEAD(1.2mmol，逐滴)。在室温下搅拌18小时之后，真空移除溶剂，并且将残余物再溶解于DCM中，其溶液用水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。通过柱色谱法纯化提供纯化合物41。
合成化合物43
化合物43：通过与对于化合物14所述的程序类似的程序来使化合物42转化成化合物43。
合成化合物45a、45b、47a和47b
化合物45a：在MeOH(200ml)中搅拌4-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐(化合物44)(50g，269mmol)、碘化钠(4.03g，26.9mmol)和4-甲基苯硫代磺酸钾(73.0g，322mmol)的混合物，并且在60℃下历经72小时进行加热。冷却浅黄色混合物，并且用200mL水稀释，搅拌0.5小时，接着通过过滤收集白色固体，用水(100mL)、IPA(200mL)、EtOAc(200mL)和乙醚(200mL)洗涤。干燥质量＝68g。自90℃水(200mL)重结晶这个微晶粉末，并且在室温下静置过夜之后通过过滤收集结晶块(64g，71％)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.83(d，J＝8.4Hz，2H)，7.36(d，J＝8.4Hz，2H)，3.67(t，J＝4.7Hz，4H)，3.16(t，J＝6.9Hz，2H)，2.64(t，J＝6.9Hz，2H)，2.47(s，3H)，2.41(t，J＝4.4Hz，4H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ144.82，141.99，129.95，127.14，66.85，56.54，53.18，33.44，21.78；MS(ESI+ve)：(M+H)+计算值：302.08；实测值：302.22。
化合物45b：用4-氯苯硫代磺酸钾替代4-甲基苯硫代磺酸钾，通过与对于化合物45a所述的方法类似的方法来合成化合物45b。(ESI+ve)：(M+H)+计算值：324.03，322.04；实测值：324.22，322.20(37Cl，35Cl同位素样式)。
化合物47a：用4-(2-溴乙基)-N-甲基哌嗪氢溴酸盐(化合物46)替代4-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，通过与对于化合物45a所述的方法类似的方法来合成化合物47a。MS(ESI+ve)：(M+H)+计算值：315.12；实测值：315.07。
化合物47b：用4-(2-溴乙基)-N-甲基哌嗪氢溴酸盐替代4-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，并且用4-氯苯硫代磺酸钾替代4-甲基苯硫代磺酸钾，通过与对于化合物45a所述的方法类似的方法来合成化合物47b。
合成化合物50
化合物49：将化合物48(500mg，1.894mmol)和甲烷硫代磺酸钠(534mg，3.98mmol)的混合物溶解于丙酮(10ml)中，并且在室温下搅拌4小时。TLC指示完成反应。移除溶剂，接着通过添加水和DCM来分配混合物。在萃取后，分离有机层，接着干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。柱色谱法提供呈无色固体状的纯产物(0.60g，97％)。1HNMR(399MHz，CDCl3)δ7.47(dd，J＝5.5，3.5Hz，2H)，7.38(dd，J＝5.5，3.5Hz，2H)，4.55(s，4H)，3.13(s，6H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ133.41，131.75，129.51，51.02，37.09；MS(ESI+ve)：(M+NH4)+计算值：344.01；实测值：344.01；Rf＝0.5(1∶1EtOAc/己烷)。
化合物50：在室温下通过注射器来逐滴添加化合物4(180mg，1.225mmol)的DCM溶液(2mL)至化合物49(400mg，1.225mmol)于DCM(20mL)中的搅拌溶液中。在0.5小时之后，通过添加NaHCO3来分配混合物。在萃取后，分离有机层，接着干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。柱色谱法得到呈无色油状的产物(170mg，35％)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ7.43-7.39(m，1H)，7.35-7.27(m，3H)，4.54(s，2H)，4.03(s，2H)，3.67(t，J＝4.6Hz，4H)，3.05(s，3H)，2.58-2.50(m，4H)，2.38(t，J＝4.6Hz，4H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ136.09，133.20，131.87，131.21，128.86，128.54，66.95，57.95，53.52，51.04，40.81，38.18，35.82；MS(ESI+ve)：(M+H)计算值：394.06；实测值：394.23；Rf＝0.5(EtOAc)。
合成化合物55
化合物54：在室温下以逐滴方式历经0.5小时添加含溴(0.246ml，4.78mmol)的DCM(50mL)至4-硝基苯亚磺酸钠(2g，9.56mmol)和2-羟乙基二硫化物(0.585ml，4.78mmol)于DCM(50mL)中的搅拌混合物中。在室温下2小时之后，过滤混合物以移除盐。移除溶剂，接着通过柱色谱法进行管柱纯化得到呈无色油状的产物(2.1g，83％)。Rf＝0.4(1∶1EA/己烷)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ8.41(d，J＝8.8Hz，2H)，8.13(d，J＝8.8Hz，2H)，3.89(t，J＝5.8Hz，2H)，3.23(t，J＝5.8Hz，2H)，2.02-1.94(s，br，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ149.73，128.40，124.82，60.94，39.28。
化合物55：用草酰二氯(0.527ml，6.15mmol)逐滴处理含化合物51(1g，3.07mmol)的DCM(50mL)，并且在室温下搅拌。在反应期间，形成无色均质溶液。在室温下1小时之后，减压移除溶剂。将白色残余物(粗酰氯，化合物52)再溶解于DCM(20mL)中，并且添加至化合物54(0.48g，3.1mmol)于吡啶(20mL)中的搅拌溶液中。在18小时之后，判定反应完成。移除溶剂。将残余物再溶解于甲苯中，并且用水分配。收集甲苯萃取物，用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。柱色谱法提供呈无色固体状的纯化合物55(0.86g，60％)。1HNMR(399MHz，CDCl3)δ8.31(d，J＝8.9Hz，2H)，8.03(d，J＝8.9Hz，2H)，7.7(d，J＝7.5Hz，2H)，7.58(d，J＝7.5Hz，2H)，7.42(t，J＝7.5Hz，2H)，7.32(dt，J＝7.5，1.2Hz，2H)，5.22(s，br，1H)，4.34(s，br，4H)，4.19(t，J＝6.8Hz，1H)，3.23(t，J＝6.0Hz，2H)，4.17(s，br，6H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ173.91，155.10，150.60，149.53，143.85，141.42，128.27，128.20，127.91，127.22，127.18，125.12，124.84，120.17，66.81，62.60，56.40，47.25，34.76，25.37；MS(ESI+ve)：(M+H)+计算值：571.11；实测值：571.00；Rf＝0.5(EtOAc)。
合成化合物59
化合物57：通过在室温下与1.5当量Fmoc-OSu在吡啶中反应18小时来自化合物56(1mmol)制备化合物57。依次进行水性处理和柱色谱法提供纯化合物57。
化合物59：通过与对于化合物55所述的程序类似的程序来自化合物57制备化合物59。
合成化合物63
化合物61：通过与对于化合物57所述的程序类似的程序来自化合物60制备化合物61。
化合物63：通过与对于化合物55所述的程序类似的程序来自化合物61制备化合物63。
合成化合物69
化合物65：历经0.5小时添加异丁酸乙酯(11.6g，100mmol)至LDA于THF中的冷却(-78℃)溶液(53mL，2M)中。接着使橙色混合物短暂升温至0℃，随后再冷却至-78℃。接着历经0.5小时添加1，2-二溴乙烷(20g，106mmol)至溶液中，使所述溶液逐渐升温至室温并搅拌过夜。通过添加水和EA来分配所得混合物。在萃取至EA中，并且用盐水洗涤后，分离有机层，接着干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。柱色谱法得到呈无色油状的纯产物(6.0g，25％)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ4.15(q，J＝7.1Hz，2H)，3.35(t，J＝8.4Hz，2H)，2.16(t，J＝8.4Hz，2H)，1.27(t，J＝7.1Hz，3H)，1.22(s，6H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ176.78，60.83，43.83，42.89，28.45，25.20，14.32；Rf＝0.5(5％EtOAc/己烷)。
化合物66：在50℃下历经72小时在玻璃压力瓶中加热化合物65(3.4g，15.24mmol)和吗啉(13.28g，152mmol)于THF(20ml)中的混合物。观察到形成白色沉淀。在水与EA之间分离混合物。干燥(MgSO4)EA萃取物，过滤并浓缩。柱色谱法得到呈无色液体状的产物(3.5g，100％)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ4.11(q，J＝7.1Hz，2H)，3.67(t，J＝4.7Hz，4H)，2.41(t，br，J＝4.0Hz，4H)，2.30-2.26(m，2H)，1.74-1.70(m，2H)，1.23(t，J＝7.1Hz，3H)，1.17(s，6H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ177.69，67.11，55.15，54.02，41.10，37.04，25.49，14.35；MS(ESI+ve)：(M+H)+计算值：230.18；实测值：230.33；Rf＝0.5(5％EtOAc/己烷)。
化合物67：在1∶1EtOH/H2O(10mL)中一起搅拌化合物66(120mg，0.523mmol)和氢氧化钠(120mg，3.00mmol)。在36小时之后，通过添加浓HCl来调整溶液的pH至约2，接着添加NEt3直至pH达到约10。添加SiO2(2g)，并且蒸发溶剂/水。在无水装载下进行的柱色谱法(MeOH/DCM，其中DCM中具有2％NEt3)得到呈部分(约1/3摩尔当量)HNEt3盐形式的产物。调整的产量是103mg，84％。1H NMR(399MHz，CDCl3加3滴DMSO-d6)δ3.62(t，J＝4.7Hz，4H)，2.51-2.46(br，4H)，2.40(t，J＝7.1Hz，2H)，1.62(J＝7.1Hz，2H)，1.08(s，6H)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ179.91，65.91，54.29，52.87，45.44，41.37，35.09，25.93，8.56；MS(ESI-ve)：(M-H)-计算值：200.13；实测值：200.16；Rf＝0.5(2％NEt3/10％MeOH/DCM)。
化合物69a：用草酰氯(9.42ml，110mmol)处理化合物67(11g，54.9mmol)于DCM(200mL)中的悬浮液，并且在室温下搅拌。在反应期间，形成无色均质溶液。在室温下1小时之后，减压移除溶剂。将黄色残余物悬浮于DCM(200mL)和Py(100mL)的混合物中，接着一次性添加S-2-羟乙基化合物54(15.91g，60.4mmo1)(DB-7-5)，并且通过HPLC/MS来监测反应。在18小时之后，由MS和TLC判定反应实际上完成。移除溶剂，接着将残余物再溶解于DCM/碳酸氢盐中。干燥(MgSO4)合并的有机物，过滤并减小体积。通过柱色谱法进行纯化得到12.5g，51％的呈黄色油状的化合物69a，其在静置时结晶。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ8.41(d，J＝8.5Hz，2H)，8.13(d，J＝8.5Hz，2H)，4.27(t，J＝6.3Hz，2H)，3.65(t，J＝4.6Hz，4H)，3.28(t，J＝6.3Hz，2H)，2.40(s，br，4H)，2.27(t，J＝7.7Hz，2H)，1.71(t，J＝7.7Hz，2H)，1.14(s，6H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ177.11，150.71，149.69，128.34，124.92，66.96，61.66，54.95，53.92，41.25，46.81，35.11，25.36；MS(ESI+ve)：(M+H)+计算值：447.12；实测值：446.98。
化合物69b：用草酰氯(545μl，6.36mmo1)逐滴处理化合物67(128mg，0.636mmo1)于DCM(12mL)中的悬浮液，并且在室温下搅拌。在反应期间，形成无色均质溶液，其很快产生无色沉淀。HPLC/MS指示向酰氯(化合物68)良好转化，如由向N-丙基酰胺的转化所示。减压移除溶剂。在冰浴上冷却白色残余物，并且用S-甲烷硫代磺酸2-羟乙酯(化合物54)(99mg，0.636mmo1)的DCM(12mL)溶液处理，随后在搅拌下逐滴添加许尼希氏碱(Hunig′s base)(0.34g，2.6mmol，4当量)。在1.5小时之后，溶液用稀NaHCO3(水溶液)洗涤。干燥(MgSO4)合并的萃取物，过滤并浓缩。柱色谱法得到呈无色油状的产物(84mg，39％)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ4.40(t，J＝6.2Hz，2H)，3.70(t，J＝4.6Hz，4H)，3.44(t，J＝6.2Hz，2H)，3.39(s，3H)，2.47-2.43(br，4H)，2.32(t，J＝7.7Hz，2H)，1.77(t，J＝7.7Hz，2H)，1.64-1.58(br，4H)，1.22(s，6H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ177.30，67.08，62.27，55.03，54.01，51.07，41.32，36.99，35.14，25.44；MS(ESI+ve)：(M+H)-计算值：340.13；实测值：340.27；Rf＝0.2(EtOAc)。
合成化合物73
化合物70：通过与对于化合物66所述的程序类似的程序，使N-甲基哌嗪与化合物65反应来制备化合物70。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ4.10(q，J＝7.1Hz，2H)，2.3-2.6(br，8H)，2.28(t，J＝8.0Hz，2H)，2.26(s，3H)，1.72(t，J＝8.0Hz，2H)，1.23(t，J＝7.1Hz，3H)，1.15(s，6H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ177.71，60.44，55.27，54.64，53.50，46.18，41.15，37.36，25.47，14.34；MS(ESI+ve)：(M+H)+计算值：243.20；实测值：243.31。
化合物71：使用与对于化合物67所述的程序类似的程序，通过水解化合物70来制备化合物71。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ12-10(vbr，1H)，3.2-2.2(vbr，8H)，2.44(t，J＝8.0Hz，2H)，2.36(s，3H)，1.71(t，J＝8.0Hz，2H)，1.17(s，6H)，13C NMR(100MHz，CDCl3)δ181.36，55.18，53.51，52.18，44.31，41.57，37.19，26.28；MS(ESI+ve)：(M+H)+计算值：215.17；实测值：215.19。
化合物83：在室温下以逐滴方式历经0.5小时添加含溴(2.58ml，50.0mmol)的DCM(50mL)至苯亚磺酸钠(16.4g，100mmol)和2-羟乙基二硫化物(6.11ml，49.9mmol)于DCM(50mL)中的搅拌混合物中。在室温下2小时之后，TLC显示良好反应(Rf＝0.4(1∶1EA/己烷))，因此过滤混合物以移除盐。移除溶剂，接着柱色谱法得到呈无色油状的产物(17.4g，80％)。
化合物73：用草酰氯(1.079ml，12.58mmol)处理含化合物71(1.342g，6.29mmol)的DCM(20mL)，并且在室温下搅拌。在反应期间，观察到形成浅黄色沉淀。在室温下0.5小时之后，减压移除溶剂。将浅黄色残余物悬浮于DCM(20mL)和Py(20mL)的混合物中，接着一次性添加化合物83(2.060g，9.44mmol)。在18小时之后，由TLC判定反应完成。移除溶剂，接着将残余物再溶解于水中，并且用乙醚洗涤。使水层减小体积以得到棕色固体。自沸腾EtOH(10mL)重结晶得到略微不纯的HCl盐，其用游离碱(含NEt3的DCM)处理，接着直接装载于硅胶上。柱色谱法得到0.95g，36％的纯化合物73。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ7.96(d，J＝8.0Hz，2H)，7.68(t，J＝7.2Hz，1H)，7.59(t，J＝7.7Hz，2H)，4.25(t，J＝6.3Hz，2H)，3.25(t，J＝6.3Hz，2H)，2.8-2.3(vbr，8H)，2.36(s，3H)，2.33(t，J＝7.7Hz，2H)，1.74(t，J＝7.7Hz，2H)，1.16(s，6H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ177.13，144.68，134.09，129.59，127.09，61.99，54.86，54.35，52.84，45.95，45.71，41.26，37.05，34.66，25.39；MS(ESI+ve)：(M+H)+计算值：415.17；实测值：415.09。
合成化合物76
化合物75：通过与对于化合物2所述的程序类似的程序来使化合物74转化成化合物75。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ6.49-6.41(br，d，J＝6.3Hz，1H)，4.91(dt，J＝6.3，2.7Hz，1H)，4.59(ddd，J＝31.4，10.6，3.0Hz，2H)，3.84(s，3H)，3.04(s，3H)，2.09(s，3H)；170.27，169.05，68.90，53.33，52.03，37.63，23.16；MS(ESI+ve)：(M+H)+计算值：240.06；实测值：240.24。
化合物76：通过与对于化合物3所述的程序类似的程序来使化合物75转化成化合物76。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ6.56-6.40(br，d，J＝6.2Hz，1H)，4.93(q，J＝5.9Hz，1H)，3.81(s，3H)，43.74(dd，J＝14.6，4.8Hz，1H)，3.57(dd，J＝14.6，5.6Hz，1H)，3.38(s，3H)，2.07(s，3H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ170.44，170.19，53.23，52.02，50.73，37.77，23.12；MS(ESI+ve)：(M+H)+计算值：256.03；实测值：256.21。
合成化合物78
在丙酮(80ml)中历经6小时搅拌化合物77(2.49ml，32.8mmol)和甲烷硫代磺酸钠(4.4g，32.8mmol)的混合物。通过旋转蒸发来移除丙酮，并且混合物用DCM湿磨。在过滤之后，通过蒸发来移除DCM(5g粗产量)，并且使混合物经受柱色谱法纯化。纯化合物78的产量是2.8g，55％，无色油状物，Rf＝0.3(20％EA/己烷)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ5.30(s，2H)，3.48(s，3H)，3.38(s，3H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ80.07，57.40，22.71。
合成化合物80
历经2分钟用甲烷磺酰氯(5.59ml，72.3mmol)处理化合物79(5g，65.7mmol)和三乙胺(11ml，79mmol)于DCM(150mL)中的冰冷溶液。在1小时之后，由TLC判定反应完成。添加水，并且依序用稀HCl、饱和碳酸氢钠、盐水洗涤有机萃取物，接着干燥(MgSO4)，过滤并减小体积。将产物甲磺酸酯(9.4g，61mmol，96％)溶解于丙酮(200ml)中，接着添加甲苯硫代亚磺酸的钾盐(61mmol)，并且在50℃下历经18小时搅拌溶液。观察到形成稠密白色沉淀。过滤混合物，减小体积以得到油状物，接着萃取至DCM/水中。干燥(MgSO4)有机萃取物，过滤并减小体积。柱色谱法得到呈无色油状的纯化合物80，其在静置时结晶，Rf＝0.3(20％EA/己烷)。
合成化合物82
在MeOH(50ml)中搅拌2-氯-N，N-二甲基乙胺盐酸盐(10g，69.4mmol)、碘化钠(1.041g，6.94mmol)和4-甲基苯硫代磺酸钾(18.86g，83mmol)的混合物，并且在60℃下历经72小时进行加热。水性处理，接着柱色谱法得到呈无色油状的纯化合物82(8.5g，47％)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ7.81(d，J＝8.4Hz，2H)，7.33(dd，J＝8.4，0.6Hz，2H)，3.09(t，J＝6.8Hz，2H)，2.53(t，J＝6.8Hz，2H)，2.44(s，3H)，2.17(s，6H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ144.76，142.03，129.92，127.18，57.51，45.14，34.29，21.77；MS(ESI+ve)：(M+H)+计算值：260.07；实测值：260.16。
合成化合物85
将甲烷磺酸钠(11.5g，86mmol)放置在干燥50mL单颈烧瓶中。使用干燥玻璃注射器添加30mL无水DMF(Aldrich)。使用干燥玻璃注射器添加5mL 3-溴丙腈(化合物84)(8.2g，61.2mmol)。在氩气下闭合反应烧瓶，密封，并且在50℃下搅拌24小时。使用TLC(系统：己烷/乙酸乙酯-5∶5-v/v)监测反应。反应混合物用100mL乙酸乙酯稀释，并且用水(5×100mL)洗涤5次。有机层经硫酸钠干燥，过滤，并且蒸发至干燥。将残余物溶解于5mL二氯甲烷中，并且通过使用含乙酸乙酯的己烷的线性梯度进行的硅胶色谱法(CombiFlash)纯化。获得呈无色油状的纯化合物85(7.2g，52％)。1H-NMR(CDCl3，399MHz)。δ3.43(s，3H)，3.41(t，2H，J＝2.5Hz)，2.93(t，2H，J＝2.5Hz)；13C-NMR(CDCl3，100MHz)δ117.7，51.2，31.7，19.6。
合成化合物87
化合物87：在DCM(12.5mL)中添加化合物86(1.11mL，12.5mmol)和4-硝基苯亚磺酸钠(5.23g，25.0mmol)以得到白色悬浮液。添加二溴(0.64ml，12.5mmol)至搅拌溶液中。在室温下搅拌溶液30分钟并过滤以移除盐，接着减压蒸发滤液。添加粗产物至硅胶柱中，并且用己烷-EtOAc洗脱以得到纯化合物87(4.80g，20.6mmol，82％产率)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ8.44-8.40(m，2H)，8.15-8.10(m，2H)，2.58(s，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ149.00，128.54，124.87，94.61，18.55；Rr＝0.60(1∶1EtOAc/己烷)。
合成化合物90
化合物89：在1L圆底烧瓶中，将N-(2-巯基乙基)乙酰胺88(11.92g，100mmol)溶解于EtOAc(300mL)中以得到无色溶液。添加含碘化钠(0.150g，1.000mmol)和30％过氧化氢(3.40g，100mmol)的H2O(11.3mL)至溶液中，在室温下搅拌所述溶液45分钟。添加饱和Na2S2O3至溶液中。水层用EtOAc(3×300mL)萃取。合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤，并且通过旋转蒸发来浓缩。使粗产物经受柱色谱法，并且用MeOH/DCM梯度洗脱以得到纯化合物89(4.94g，20.90mmol，41.8％产率)，其由TLC判定足够纯净以直接用于反应的下一步骤中。Rf＝0.35(9∶1DCM/甲醇)
化合物90：在100mL圆底烧瓶中，将化合物89(2.364g，10.00mmol)和4-硝基苯亚磺酸钠(4.18g，20mmol)溶解于CH2Cl2(20mL)中以得到白色悬浮液。添加二溴(0.516ml，10.00mmol)至搅拌溶液中。在室温下搅拌溶液30分钟并过滤以移除盐，接着减压蒸发滤液。添加粗产物至硅胶柱中，并且用己烷-EtOAc洗脱以得到纯化合物90(2.37g，7.79mmol，39％产率)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ8.45-8.40(m，2H)，8.17-8.12(m，2H)，3.60-3.54(dt，2H)，3.21-3.16(t，2H)，2.00(s，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ130.35，126.27，66.97，58.20，53.67，51.52，36.22，35.16，33.67；Rf＝0.40(EtOAc)。
合成化合物93和94
化合物92：在250mL圆底烧瓶中，将4-氯苯硫代磺酸钠(14.5g，63.0mmol)溶解于MeOH中。添加顺-1，4-二氯-2-丁烯91(3.16g，30.0mmol)和碘化钠(450mg，3.0mmol)至搅拌溶液中。在室温下搅拌溶液3小时，接着加热至50℃。在50℃下搅拌18小时之后，减压移除溶剂。所得粗材料用DCM(300mL)稀释，并且用水(1×100mL)洗涤。水层用DCM(1×100mL)萃取。合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。使粗产物经受柱色谱法，并且用EtOAc/己烷梯度洗脱以得到化合物92(5.99g，12.8mmol，43％产率)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ7.87-7.84(m，4H)，7.56-7.51(m，4H)，5.56-5.50(m，2H)，3.72-3.68(m，4H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)130.35，126.27，66.97，58.20，53.67，51.52，36.22，35.16，33.67；Rf＝0.35(1∶3EtOAc/己烷)。
化合物93：在100mL圆底烧瓶中，在0℃下将化合物92(3.09g，6.58mmol)溶解于THF中。在0℃下添加三乙胺(459μL，3.29mmol)和2-甲基-2-丙烷硫醇(742μL，6.58mmol)至搅拌溶液中。在0℃下搅拌溶液20分钟，接着在0℃下添加三乙胺(230μL，1.65mmol)至搅拌溶液中。在0℃下搅拌40分钟之后，减压移除溶剂。使所得物经受柱色谱法，并且用EtOAc/己烷梯度洗脱以得到化合物93(1.77g，4.62mmol，70％产率)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ7.90-7.85(m，2H)，7.56-7.52(m，2H)，5.73-5.65(m，1H)，5.55-5.48(m，1H)，3.78-3.75(d，2H)，3.36-3.32(d，2H)，1.32(s，9H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ143.54，140.60，130.90，129.83，128.66，124.56，48.29，37.05，33.35，30.16；Rf＝0.60(1∶3EtOAc/己烷)。
化合物94：使用与对于化合物93所述的程序类似的程序，并且用2-丙烷硫醇替代2-甲基-2-丙烷硫醇，获得纯化合物94(1.13g，3.06mmol，72％产率)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ7.90-7.82(m，2H)，7.56-7.48(m，2H)，5.72-5.64(m，1H)，5.57-5.47(m，1H)，3.79-3.72(d，2H)，3.33-3.26(d，2H)，3.61-2.92(m，1H)，1.27(d，6H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ143.28，140.36，131.37，125.63，124.55，124.56，41.32，38.02，35.81，33.08，22.54；Rf＝0.55(1∶3EtOAc/己烷)。
合成化合物96
化合物96：组合化合物9(1.81g，5.50mmol)和54(2.17g，8.25mmol)，并且通过与无水甲苯(3×2mL)共蒸发来干燥。将混合物溶解于无水1，2-二氯乙烷(16.5mL)中。添加4A分子筛至溶液中，并且在室温下搅拌混合物30分钟。添加三氟甲磺酸三甲基硅烷酯(497μL，2.75mmol)至搅拌溶液中。在室温下搅拌溶液9小时，接着添加额外54(0.723g，2.75mmol)至搅拌溶液中。在室温下搅拌16小时之后，溶液用DCM(100mL)稀释，并且用饱和NaHCO3(1×100mL)洗涤。水层用DCM(1×50mL)萃取。合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤，并且通过旋转蒸发来浓缩。使所得粗材料经受柱色谱法，并且用EtOAc/己烷梯度洗脱以得到化合物96(2.21g，3.73mmol，68％产率)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ8.42-8.36(d，2H)，8.128.06(d，2H)，6.07-6.00(d，1H)，5.33-5.30(d，1H)，5.23-5.15(dd，1H)，4.69-4.63(d，1H)，4.15-4.04(m，3H)，4.04-3.87(m，2H)，3.84-3.73(m，1H)，3.22-3.12(t，2H)，2.12-1.92(m，12H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)179.95，170.74，170.48，150.77，149.59，128.47，125.03，101.40，71.08，70.02，67.39，66.92，61.76，51.12，36.51，23.72，20.92；Rf＝0.25(1∶9MeOH/DCM)。
合成化合物100
化合物98：化合物97(4.87g，22.0mmol)于无水吡啶(70mL)中的冰冷溶液用苯氧基乙酸酐(37.8g，132.0mmol)和4-二甲基氨基吡啶(26.9mg，220μmol)处理。在室温下搅拌12小时之后，浓缩混合物并与甲苯真空共蒸发。所得物用DCM(400mL)稀释，并且用饱和NaHCO3(1×400mL)洗涤。在萃取后，分离有机层，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。使所得物经受柱色谱法，并且用EtOAc/己烷梯度洗脱以得到纯化合物98(16.7g，22.0mmol，100％产率)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ7.36-6.75(m，20H)，6.27-6.20(d，1H)，5.43-5.36(m，1H)，5.22-5.06(m，2H)，4.81-4.65(m，3H)，4.60-4.52(m，2H)，4.45-4.29(m，2H)，4.17-4.02(m，2H)，3.97-3.87(m，1H)，1.85和1.74(d，3H，旋转异构体)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ170.20，168.78，168.70，168.36，167.52，157.56，157.48，157.40，130.09，129.70，129.66，129.60，122.32，122.01，121.94，114.61，114.58，114.58，114.39，91.93，68.37，68.25，67.30，64.54，61.25，46.43，22.95；Rf＝0.35(1∶1EtOAc/己烷)。
化合物99：将化合物98(15.15g，20.0mmol)溶解于ClCH2CH2Cl(40mL)中，并且在室温下添加三氟甲烷磺酸三甲基硅烷酯(5.43mL，30.0mmol)至搅拌溶液中。在50℃下搅拌溶液24小时，添加三乙胺(12.6mL，90.0mmol)，并且真空浓缩混合物。所得物通过硅胶柱色谱法(EtOAc(2.5％Et3N)-己烷)加以纯化以得到含有少量苯氧基乙酸的略微不纯的化合物99。这个材料不经进一步纯化即用于反应方案的下一步骤中。
化合物100：将化合物99(3.63g，6mmol)和S-2-羟乙基-4-硝基苯硫代磺酸酯54(2.76g，10.5mmol)溶解于ClCH2CH2Cl(18mL)中以得到无色溶液。在室温下添加4A分子筛至搅拌溶液中。在室温下搅拌溶液30分钟，接着添加三氟甲烷磺酸三甲基硅烷酯(0.543ml，3.00mmol)。在室温下搅拌混合物24小时，并且TLC显示约90％反应完成。添加额外54(237.0mg，0.90mmol)至混合物中，并且再将它搅拌36小时以完成反应。混合物用DCM(100mL)稀释，并且用饱和NaHCO3(1×100mL)洗涤。水层用CH2Cl2(1×50mL)反萃取。合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤，浓缩，并且溶解于120mL Ac2O-吡啶(1∶9，v/v)中。搅拌混合物12小时，接着减压浓缩。所得物用CH2Cl2(100mL)稀释，并且用饱和NaHCO3(1×100mL)洗涤。水层用CH2Cl2(1×50mL)反萃取。合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。所得物通过硅胶柱色谱法(EtOAc-己烷梯度)加以纯化以得到纯化合物100(2.56g，2.94mmol，49.0％产率)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ8.70-8.62(d，2H)，8.41-8.33(d，2H)，7.65-7.03(m，15H)，6.35-6.27(d，1H)，5.81-5.72(m，2H)，5.06-4.97(m，3H)，4.92-4.85(m，2H)，4.83-4.62(m，2H)，4.58-4.44(m，2H)，4.34-4.26(m，2H)，4.26-4.15(m，1H)，4.06-3.95(m，1H)，3.51-3.40(m，2H)，2.22和2.18(d，3H，旋转异构体)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ171.17，169.13，169.05，168.92，157.86，157.80，157.76，150.82，149.63，130.01，129.96，128.47，125.06，122.27，122.23，114.93，114.74，100.86，70.64，70.54，65.36，64.90，62.21，51.30，36.54，23.74；Rf＝0.60(1∶1EtOAc/己烷)。
合成化合物104
化合物102：使用与对于化合物98所述的程序类似的程序，并且用化合物101替代化合物97，获得纯化合物102。
化合物103使用与对于化合物99所述的程序类似的程序，并且用化合物102替代化合物98，获得纯化合物103。
化合物104使用与对于化合物100所述的程序类似的程序，并且用化合物103替代化合物99，获得纯化合物103。
合成化合物109和111
化合物106：通过注射器历经2分钟用TiCl4(110mmol)逐滴处理化合物105(100mmol)于无水1，2-二氯乙烷(300mL)中的溶液。在回流16小时之后，TLC显示完成反应。粗材料用DCM稀释，并且用饱和NaHCO3洗涤。合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤，浓缩，并且不经进一步纯化即用于下一反应。
化合物107：在Ar下将硫脲(150mmol)和化合物106(100mmol)溶解于丙酮(200mL)中。加热反应混合物至60℃并搅拌。在2小时之后，通过过滤移除白色固体沉淀。将沉淀重结晶。添加过滤的晶体和Na2S2O5(140mmol)至DCM(500mL)和H2O(250mL)的搅拌混合物中。在Ar下加热反应混合物至回流。在3小时之后，冷却反应混合物至室温，并且分离各相。水层用DCM反萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩以得到化合物107。
化合物108：在Ar下将1-溴-2-氯乙烷(100mmol)、三乙胺(200mmol)和化合物107(100mmol)溶解于乙腈(200mL)中。加热反应混合物至60℃并搅拌。TLC显示完成反应。混合物用DCM(500mL)稀释，并且用NaHCO3(250mL)洗涤。有机层经Na2SO4干燥，过滤，浓缩并纯化以得到化合物108。
化合物109：在Ar下将化合物112(120mmol)、碘化钠(10.0mmol)和化合物108(100mmol)溶解于MeOH(200mL)中。加热反应混合物至60℃并搅拌。TLC显示完成反应。混合物用DCM(500mL)稀释，并且用NaHCO3(250mL)洗涤。有机层经Na2SO4干燥，过滤，浓缩并纯化以得到化合物109。
化合物110：在Ar下将1-溴-4-氯-2，3-顺-丁烯(100mmol)、三乙胺(200mmol)和化合物107(100mmol)溶解于乙腈(200mL)中。加热反应混合物至60℃。TLC显示反应完成。混合物用DCM(500mL)稀释，并且用NaHCO3(250mL)洗涤。有机层经Na2SO4干燥，过滤，浓缩并纯化以得到化合物110。
化合物111：在Ar下将化合物112(120mmol)、碘化钠(10.0mmol)和化合物110(100mmol)溶解于MeOH(200mL)中。加热反应混合物至60℃。TLC显示完成反应。混合物用DCM(500mL)稀释，并且用NaHCO3(250mL)洗涤。有机层经Na2SO4干燥，过滤，浓缩并纯化以得到化合物111。
合成化合物115
化合物113：遵循Sammes的程序(如专利GBl252903中所述)制备2-氯磺酰基乙腈(113)。
化合物114：将硫化钠单水合物(65mmol)溶解于100mL水中。将烧瓶保持在水浴中。在搅拌并且使水浴温和升温下逐滴添加化合物113(50mmol)至溶液中。观察到烧瓶中出现硫，接着消失。真空蒸发溶剂，并且自乙醇重结晶残余物。由此获得呈无色结晶固体状的氰基甲烷硫代磺酸钠(化合物114)。
化合物115：在100mL圆底烧瓶中，在搅拌下将化合物114(13.69g，86mmol)溶解于无水DMF(30mL)中。接着，添加3-溴丙腈(5mL，8.2g，61.2mmol)，并且在50℃下搅拌所得混合物18小时，其中通过TLC来监测。在反应完成(3-溴丙腈完全消耗)后，反应混合物用EtOAc(100mL)稀释，并且有机层用5×20mL H2O洗涤。接着干燥(MgSO4)有机分离的有机层，过滤，并且通过旋转蒸发来减小体积以得到油状物。粗油状物通过使用EtOAc/己烷梯度进行的柱色谱法加以纯化，并且收集含有纯物质的洗脱份，并且通过旋转蒸发来移除溶剂，接着进一步真空干燥以提供呈无色油状的纯化合物115。
合成化合物118
化合物116：依次用草酰二氯(0.53ml，6.15mmol)和DMF(10μL)逐滴处理含化合物51(2.9g，8.91mmol)的DCM(50mL)，并且在室温下搅拌。在反应期间，形成无色均质溶液。在室温下2小时之后，减压移除溶剂。将白色残余物再溶解于DCM(20mL)中，接着逐滴添加至乙烷-1，2-二硫醇(8.40g，89mmol)的搅拌吡啶(10mL)溶液中，其中通过UPLC/MS来监测。在18小时之后，断定反应完成。移除溶剂，并且通过逐阱蒸馏来移除剩余乙烷硫醇，接着使残余物经受用DCM进行的柱色谱法纯化以提供呈无色固体状的纯化合物116。产量是1.82g，51％。MS(ESI+)：(M+Na)+计算值：424.10；实测值：424.06。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.79(d，J＝7.5Hz，2H)，7.63(d，J＝5.7Hz，2H)，7.43(t，J＝7.5Hz，2H)，7.34(t，J＝7.4Hz，2H)，5.40-5.15(br，1H)，4.60-4.35(br，2H)，4.31-4.19(m，1H)，3.15-3.04(br，2H)，2.95-2.80(m，1H)，2.75-2.60(br，2H)，1.72-1.43(m，6H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ203.14，154.75，143.92，141.49，127.84，127.19，125.17，120.13，66.81，62.69，47.41，33.01，25.78，24.60。
化合物117：向化合物116(1.7g，4.23mmol)于EtOAc(12mL)中的搅拌溶液中添加碘化钠(6.35mg，0.042mmol)和过氧化氢(0.144g，4.23mmol)(0.45mL 30％水溶液)，并且在室温下搅拌混合物15分钟。TLC显示起始材料完全消耗。添加硫代硫酸钠水溶液直至溶液变为无色。溶液用水洗涤，干燥(MgSO4)，接着进行柱色谱法(EtOAc/己烷)，得到呈无色固体泡沫状的纯化合物117(1.45g，86％)。MS(ESI+)：(M+H)+计算值：802.07；实测值：802.08。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.78(d，J＝7.6Hz，4H)，7.63(d，J＝5.8Hz，4H)，7.42(t，J＝7.5Hz，4H)，7.33(t，J＝7.5Hz，4H)，5.42-5.25(br，2H)，4.55-4.35(br，4H)，4.30-4.18(br，2H)，3.25-3.10(br，4H)，2.95-2.70(br，4H)，1.65-1.45(br，12H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ203.19，154.71，143.90，141.45，127.80，127.17，125.16，120.10，66.76，62.65，47.37，37.90，28.56，25.73。
化合物118：在室温下以逐滴方式历经2分钟添加二溴(0.091ml，1.77mmol)至4-硝基苯亚磺酸钠(0.742g，3.55mmol)和化合物117(1.42g，1.773mmol)于DCM(10mL)中的搅拌混合物中。在室温下搅拌30分钟之后，过滤混合物，并且在真空中使滤液减小体积以得到橙色固体泡沫状物。柱色谱法(DCM/己烷)得到呈浅黄色固体泡沫状的纯化合物118(1.26g，60％)。MS(ESI+)：(M+H)+计算值：587.71；实测值：802.08。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.36(d，J＝8.2Hz，2H)，8.14(d，J＝7.3Hz，2H)，7.79(d，J＝7.0Hz，2H)，7.63(s，2H)，7.43(t，J＝6.7Hz，2H)，7.35(d，J＝6.8Hz，2H)，5.35-5.15(br，1H)，4.55-4.35(br，2H)，4.30-4.20(br，1H)，3.30-3.00(br，4H)，1.70-1.25(br，6H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ202.71，154.66，150.60，149.63，143.78，141.46，128.40，127.91，127.21，125.12，124.81，120.18，66.86，62.59，47.35，35.84，28.42，25.61。
合成化合物120
化合物120：在室温下历经5天在MeOH(10mL)中搅拌可商购获得的化合物119(1g，7.04mmol)和4-甲基苯硫代磺酸钾(1.753g，7.75mmol)，接着在40℃下历经24小时进行搅拌。TLC显示向产物良好转化。蒸发MeOH，并且将残余物溶解于DCM(30mL)中，并且添加Boc2O(1.54g，7.04mmol)。在室温下以逐滴方式历经10分钟用三乙胺(1.030ml，7.39mmol)处理混合物直至溶液变得实际上均质。用水(50mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤和蒸发得到粗产物，其通过柱色谱法进一步纯化以得到呈无色固体状的纯化合物120(1.64g，65％)。MS(ESI+)：(M+Na)+计算值：380.10；实测值：380.11。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ7.80(d，J＝8.2Hz，2H)，7.34(dd，J＝8.5，0.8Hz，2H)，5.54(ddt，J＝24.7，16.6，7.9Hz，2H)，4.65(s，1H)，3.77-3.66(m，4H)，2.45(s，3H)，1.43(s，9H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ155.83，145.05，142.06，131.80，130.01，127.15，124.55，79.72，37.29，32.75，28.51，21.79。
合成化合物122
化合物122：用六氟磷酸钾(0.662g，3.59mmol)于水(10mL)中的溶液一次性处理可商购获得的化合物121(1g，3.59mmol)于水(1mL)中的溶液，并且在室温下通过振荡来搅拌5分钟。通过过滤收集所得固体，用2×3mL水洗涤，并且经KOH真空干燥以得到呈无色固体状的纯化合物122(1.01g，82％)。1H NMR(300MHz，CD3CN)δ3.67-3.60(m，2H)，3.49(s，3H)，3.53-3.45(m，2H)，3.10(s，9H)；13CNMR(126MHz，CD3CN)δ65.98，54.05(q，J＝4.1Hz)，51.11，28.99；13F NMR(376MHz，CD3CN)δ-73.15(d，J＝706.5Hz)；13P NMR(162MHz，CD3CN)δ-143.50(七重峰，J＝706.6Hz)。
合成化合物125
化合物124：用2-氨基乙酸叔丁酯(22mmol)、二-异丙基乙胺(50mmol)和HBTU(24mmol)连续处理可商购获得的化合物123(10mmol)的DMF(50mL)溶液。在室温下搅拌1小时之后，添加水(100mL)，并且所得溶液用EtOAc(2×50mL)萃取，并且依次用5％NaHCO3(2×25mL)和稀盐水(2×25mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，并且通过旋转蒸发来减小体积。过柱色谱法纯化提供纯化合物124。
化合物125：在室温下以逐滴方式历经2分钟添加二溴(0.091ml，1.77mmol)至4-硝基苯亚磺酸钠(0.742g，3.55mmol)和2，2′-((4，4′-二硫烷二基-双(丁酰基))双(氮烷二基))二乙酸二-叔丁酯(824mg，1.77mmol)于DCM(10mL)中的搅拌混合物中。在室温下搅拌30分钟之后，过滤混合物，并且在真空中使滤液减小体积以得到固体泡沫状物。柱色谱法得到呈固体泡沫状的纯产物。
合成化合物129
化合物127：用可商购获得的化合物126(0.89g，9.99mmol)一次性处理乙烷-1，2-二硫醇(1.130g，12mmol)于TFA(10mL)中的溶液。溶液变得温热。在室温下搅拌1小时之后，移除挥发物，并且使残余物经受柱色谱法以得到呈无色油状的纯化合物127(0.95g，48％)。Rf＝0.6(5％MeOH/DCM)；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ6.09-5.93(br，1H)，4.41(d，J＝6.4Hz，2H)，2.87-2.83(m，2H)，2.79(ddd，J＝9.7，7.3，3.5Hz，2H)，2.04(s，3H)，1.71(t，J＝8.0Hz，1H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ170.25，40.89，35.22，24.91，23.44。
化合物129：历经5分钟以逐滴方式用化合物127(250mg，1.513mmol)的DCM(5mL)溶液处理可商购获得的化合物128(939mg，3.0mmol)的温热(35℃)DMF(10mL)溶液。在检查性TLC之后，通过在高真空下旋转蒸发来移除溶剂，接着残余物用DCM(50mL)湿磨，过滤，并且滤液用5×5％NaHCO3洗涤，接着干燥(MgSO4)，过滤并减小体积以得到浅黄色固体。柱色谱法得到呈浅黄色固体状的纯化合物129。MS(ESI+)：(M+H)+计算值：320.02；实测值：320.34；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ9.28(dd，J＝2.7，0.7Hz，1H)，8.43(dd，J＝8.9，2.6Hz，1H)，7.93(dd，J＝8.9，0.7Hz，1H)，6.10-5.90(br，1H)，4.41(d，J＝6.5Hz，2H)，3.13(dd，J＝8.6，6.3Hz，2H)，2.93(dd，J＝8.6，6.4Hz，2H)，2.00(s，3H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ170.18，168.57，145.22，142.22，131.81，119.59，40.65，38.59，30.07，23.39。
合成化合物134
化合物130：通过先前所述的方法(Heterocycles，第54卷，第139页，2001)来制备化合物130。
化合物132：使用先前对于化合物126的合成所述的类似程序(Organic Syntceses，Coll。第6卷，第5页(1988))，通过在含有K2CO3的甲醛水溶液存在下温和加热来使化合物131(Tetrahedron Letters，48(39)，7038-7041；2007)转化成化合物132。
化合物133：使用与对于化合物127的合成所述的程序类似的程序，并且用化合物132替代化合物126，以及用化合物130替代乙烷-1，2-二硫醇，由此获得纯化合物133。
化合物134：使用与对于化合物129的合成所述的程序类似的程序，并且用化合物133替代化合物127，由此获得纯化合物134。
合成化合物140
化合物136：历经10分钟用硫酸(3.36g，34.2mmol)逐滴处理可商购获得的化合物135(50g，342mmol)和甲醇(277mL)的冰冷溶液，接着逐渐升温至室温，过夜。通过旋转蒸发来移除大多数溶剂，接着小心添加饱和NaHCO3水溶液。通过添加1M HCl来调整溶液的pH至1.9，接着萃取至EtOAc(200mL)中，用稀盐水(50mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并减小体积以得到29g无色油状物。柱色谱法得到呈无色固体状的纯化合物136(12.5g，23％)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ12.5-10.5(vbr，1H)，3.69(s，3H)，2.63(s，2H)，1.32(s，6H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ183.32，171.76，51.72，43.88，40.60，25.34。
合成化合物138：依次用草酰二氯(10mmol)和DMF(10μL)逐滴处理含化合物136(10mmol)的DCM(50mL)，并且在室温下搅拌。在反应期间，形成无色均质溶液。在室温下2小时之后，减压移除溶剂。将白色残余物再溶解于DCM(20mL)中，接着逐滴添加至化合物137(10mmol)的搅拌吡啶(10mL)溶液中，其中通过TLC来监测。在18小时之后，移除溶剂，并且使残余物经受用DCM进行的柱色谱法纯化以提供纯化合物137。
化合物139：添加呈于THF(20mL)中的溶液形式的化合物138(5mmol)至LiBH4(5mmol)于THF(20mL)中的冰冷溶液中。由TLC判定在室温下的反应进展。在反应完成(起始材料完全消耗)之后，小心添加水(100mL)至冰冷溶液中，所述溶液随后用EtOAc(2×100mL)萃取。干燥(MgSO4)合并的有机萃取物，过滤，并且通过旋转蒸发来移除溶剂。使残余物经受柱色谱法，由此获得纯化合物139。
化合物140：使用与对于化合物80的合成所述的程序类似的程序，并且用化合物139替代化合物79，由此获得纯化合物140。
合成化合物143
化合物139：使用与对于化合物139的合成所述的程序类似的程序，并且用化合物136替代化合物138，由此获得纯化合物141。
化合物142：在0℃下历经30分钟用(重氮基甲基)三甲基硅烷(1.05g，9.23mmol)于乙醚中的2M溶液逐滴处理化合物141(8.39mmol)于DCM/MeOH(12/3mL)中的溶液。在用AcOH淬灭过量试剂之后，用水(2×5mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，通过旋转蒸发来移除溶剂，接着进行柱色谱法，获得纯化合物142。
化合物143：使用与对于化合物80的合成所述的程序类似的程序，并且用化合物142替代化合物79，由此获得纯化合物143。
合成化合物147
化合物144：使用与对于化合物69a的合成所述的程序类似的程序，并且用化合物136替代化合物67，以及用化合物54替代NH4Cl加iPr2NEt，由此获得纯化合物144。
化合物145：以逐滴方式添加LiAlH4(100mL 2M THF溶液)至化合物144(86mmol)的冰冷THF(500mL)溶液中。使混合物升温至室温，接着回流0.5小时。通过小心添加饱和Na2SO4至冰冷溶液中直至形成颗粒状沉淀来破坏残余LiAlH4。过滤混合物并减小体积，接着再溶解于EtOAc中，干燥(MgSO4)，过滤并真空减小体积以提供化合物145，其足够纯净以直接用于反应的下一步骤中。
化合物146：使用与对于化合物124的合成所述的程序类似的程序，并且用化合物145替代化合物123，以及用Leu-Fmoc-OH替代2-氨基乙酸叔丁酯，由此获得纯化合物146。
化合物147：使用与对于化合物80的合成所述的程序类似的程序，并且用化合物146替代化合物79，以及用化合物114替代4-甲基苯硫代磺酸钾，由此获得纯化合物147。
合成化合物150
化合物148：在Ar下以逐滴方式添加可商购获得的特戊酸氯甲酯(10mmol)至化合物130(20mmol)于1，2-二氯乙烷(100mL)中的搅拌溶液中。加热所得溶液以迫使完成(由TLC根据特戊酸氯甲酯材料消失来指示)。通过旋转蒸发来移除溶剂，接着使残余物经受柱色谱法以提供纯化合物148。
化合物149：使用与对于化合物89的合成所述的程序类似的程序，并且用化合物148替代化合物88，由此获得纯化合物149。
化合物150：使用与对于化合物87的合成所述的程序类似的程序，并且用化合物149替代化合物86，由此获得纯化合物150。
其它硫化试剂：
其中Sa表示任何以下结构：
合成亚磷酰胺
在一些实施方案中，本发明提供亚磷酰胺及其制备方法。在一些实施方案中，提供的亚磷酰胺用于合成本申请中所述的寡核苷酸。以下描述示例性亚磷酰胺和它们的合成。
合成化合物203
化合物202：在60℃下用含2M氨的2-丙醇(Aldrich，无水，45mL)和吡啶(22.5mL)处理N4-Bz-5′-O-DMTr-2′-O-MOE-5-甲基胞苷(201)(2.00g，2.77mmol)5小时，接着在室温下过夜，其中通过TLC和UPLC/MS来监测。移除溶剂(与甲苯进行3次共沸)，接着进行柱色谱法(0-10％MeOH/DCM)得到呈无色固体状的纯化合物202(1.62g，95％)，其根据TLC和HPLC是均质的。(ESI+)：(M+H)+计算值：618.28；实测值：618.53。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ7.82(d，J＝1.3Hz，1H)，7.47-7.40(m，2H)，7.37-7.18(m，8H)，6.83(dd，J＝8.9，1.7Hz，4H)，5.93(d，J＝1.1Hz，1H)，4.43(td，J＝8.3，4.9Hz，1H)，4.24(ddd，J＝11.7，5.1，3.0Hz，1H)，4.07(dt，J＝8.6，2.4Hz，1H)，4.03-3.98(m，1H)，3.90(ddd，J＝11.7，6.3，3.3Hz，1H)，3.79(d，J＝1.0Hz，6H)，3.63-3.52(m，3H)，3.44(dd，J＝11.0，3.0Hz，1H)，3.37(s，3H)，3.32(d，J＝9.4Hz，1H)，1.80-1.64(s，br，1H)，1.13(s，3H)。
化合物203：在室温下逐滴添加异丁酸酐(0.48ml，2.9mmol)至化合物202(1.61g，2.61mmol)于DMF(13ml)中的溶液中。使溶液在室温下历经24小时进行搅拌，接着在35℃下真空移除溶剂。萃取至乙醚/碳酸氢盐中，接着干燥(MgSO4)，过滤并移除溶剂得到呈无色固体泡沫状的粗产物。柱色谱法(0-4％MeOH/DCM)得到呈无色固体泡沫状的纯产物(1.75g，98％)，其根据TLC和HPLC是均质的。(ESI+)：(M+H)+计算值：688.32；实测值：688.56。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ8.00-7.75(br，1H)，7.45-7.39(m，2H)，7.34-7.20(m，8H)，6.84(dd，J＝9.0，1.2Hz，4H)，5.97(s，1H)，4.43(d，J＝6.1Hz，1H)，4.20-4.04(m，3H)，3.79(d，J＝0.9Hz，6H)，3.64-3.58(m，1H)，3.64-3.52(m，2H)，3.47-3.40(m，2H)，3.38(s，3H)，1.70-1.55(br，1H)，1.39(d，J＝1.0Hz，3H)，1.18(d，J＝6.9Hz，6H)。
合成化合物205
化合物205：通过与甲苯(3×3mL)共沸蒸馏来干燥(R)-1-苯基-1-((S)-吡咯烷-2-基)乙醇(4)。添加干燥化合物4(0.725g，3.79mmol)和4-甲基吗啉(0.833ml，7.58mmol)于甲苯(5mL)中的溶液至三氯膦(0.331ml，3.79mmol)于甲苯(5mL)中的冰冷溶液中，接着使其升温至室温，持续1小时，接着在Ar下过滤并减小体积以得到油状物，其不经进一步纯化即用于反应的下一步骤中。
合成化合物207
化合物207：使用与对于化合物205的合成所述的程序类似的程序，并且用化合物206替代化合物204，获得呈粗棕色油状的化合物207，并且不经进一步纯化即用于反应的下一步骤中。
合成化合物208
化合物208：通过依次与吡啶(3×5mL)和甲苯(5×5mL)共蒸发来干燥化合物203(1.74g，2.53mmol)。将所得干燥203溶解于THF(15mL)中，接着添加三乙胺(2.47ml，17.7mmol)，并且借助于CO2/丙酮冷却浴使溶液冷却至-78℃。历经0.5小时逐滴添加粗化合物205(3.79mmol)的THF溶液(15mL)，接着逐渐升温至室温。在室温下1小时之后，TLC指示化合物203完全转化成产物。用氯仿(100mL)将混合物洗涤至分液漏斗中，接着用NaHCO3(饱和水溶液，50mL，接着2×25mL)萃取。在各次萃取时，萃取物水溶液用额外1×10mL氯仿洗涤。干燥(MgSO4)合并的氯仿萃取物，过滤，并且通过在32℃下旋转蒸发来浓缩。将由此获得的粗固体再溶解于含有几滴三乙胺的DCM中，接着经受用含有稳定浓度的2％三乙胺的己烷/EtOAc梯度进行的柱色谱法以得到呈白色固体泡沫状的纯化合物208。1H NMR(399MHz，CD3CN)δ7.92-7.80(s，1H)，7.52-7.47(m，2H)，7.40-7.24(m，12H)，6.88(dd，J＝9.0，1.1Hz，4H)，5.94(d，J＝3.9Hz，1H)，4.79(dt，J＝9.6，5.6Hz，1H)，4.31-4.27(m，1H)，4.27-4.22(m，1H)，3.87(t，J＝4.7Hz，2H)，3.75(d，J＝2.0Hz，6H)，3.66(td，J＝5.9，5.5，2.2Hz，1H)，3.58-3.53(m，2H)，3.50(dd，J＝11.1，2.4Hz，1H)，3.38(dd，J＝11.0，3.3Hz，1H)，3.31(s，3H)，2.85(dq，J＝10.5，7.4，6.9Hz，2H)，1.73(s，3H)，1.52(d，J＝1.0Hz，3H)，1.47-1.32(m，2H)，1.17(dd，J＝6.9，0.7Hz，6H)，1.05-0.90(m，2H)；31P NMR(162MHz，CD3CN)δ155.35。
合成化合物210
化合物210：使用与对于化合物208所述的程序类似的程序，并且用化合物209替代化合物203，以及用化合物207替代化合物205，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物210。1H NMR(399MHz，CD3CN)δ8.31-8.27(m，2H)，7.86(d，J＝1.2Hz，1H)，7.62-7.55(m，1H)，7.55-7.45(m，5H)，7.44-7.24(m，12H)，6.94-6.90(m，4H)，5.96(d，J＝3.7Hz，1H)，4.86-4.76(m，1H)，4.29(dd，J＝5.0，3.8Hz，1H)，4.23(dt，J＝5.8，2.8Hz，1H)，3.92-3.80(m，2H)，3.78(s，6H)，3.74(ddd，J＝7.1，5.3，2.1Hz，1H)，3.55(t，J＝4.7Hz，2H)，3.51(d，J＝2.3Hz，1H)，3.41(dd，J＝11.1，3.4Hz，1H)，3.30(s，3H)，3.26(ddd，J＝10.3，6.1，2.2Hz，1H)，2.86(ddt，J＝10.1，8.2，7.2Hz，1H)，1.72(d，J＝0.7Hz，3H)，1.62(d，J＝1.1Hz，3H)，1.56-1.41(m，2H)，1.09-0.87(m，2H)，31P NMR(162MHz，CD3CN)δ155.22。
合成化合物212
化合物212：使用与对于化合物208所述的程序类似的程序，并且用化合物211替代化合物203，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物212。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ9.25-8.70(br，1H)，7.69(d，J＝1.3Hz，1H)，7.46-7.40(m，2H)，7.40-7.17(m，12H)，6.81(dd，J＝9.0，2.5Hz，4H)，6.09(d，J＝4.3Hz，1H)，4.78(dt，J＝9.6，5.2Hz，1H)，4.36-4.26(m，2H)，3.94-3.88(m，2H)，3.74(dd，J＝4.0，0.9Hz，6H)，3.69(td，J＝6.4，2.9Hz，1H)，3.64-3.56(m，3H)，3.44-3.37(m，2H)，3.36(d，J＝0.9Hz，3H)，3.00(dtd，J＝10.3，7.9，6.4Hz，1H)，1.72(s，3H)，1.54-1.44(m，1H)，1.38(dd，J＝6.8，5.4Hz，1H)，1.34(d，J＝1.2Hz，3H)，1.23-1.13(m，1H)，0.97-0.87(m，1H)，31P NMR(162MHz，CDCl3)δ158.18。
合成化合物213
化合物213：使用与对于化合物210所述的程序类似的程序，并且用化合物211替代化合物209，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物213。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ9.55-9.10(br，1H)，8.09(d，J＝1.5Hz，1H)，7.80-7.71(m，2H)，7.69-7.47(m，12H)，7.20-7.08(m，4H)，6.32(d，J＝2.9Hz，1H)，5.20-5.11(m，1H)，4.66-4.59(m，1H)，4.49-4.39(m，1H)，4.33-4.24(m，1H)，4.16-4.02(m，8H)，4.00-3.93(m，1H)，3.91-3.84(m，2H)，3.73(dd，J＝11.0，2.5Hz，1H)，3.65-3.52(m，4H)，3.27-3.16(m，1H)，2.15(s，3H)，1.88-1.76(m，1H)，1.76-1.65(m，1H)，1.63-1.49(m，4H)，1.29-1.18(m，1H)，31P NMR(162MHz，CDCl3)δ160.08。
合成化合物215
(i)TMSCl、NEt3，0℃；(ii)2，4，6-三甲基苯-1-磺酰氯、DMAP；(iii)1-甲基吡咯烷、3-羟基丙腈、DBU，0℃；(iv)MeOH/H2O，4天，室温
化合物215：(i)短暂TMS保护：将N2-异丁酰基-5′-O-DMTr-2′-O-MOE-鸟苷(化合物214)(15.04g，21.1mmol)和三乙胺(11.8ml，85mmol)的溶液溶解于ACN(200mL)中，接着逐滴添加氯三甲基硅烷(10.4ml，82mmol)至冰冷溶液中，在室温下将其搅拌1小时，其中通过TLC来监测。过滤并移除溶剂，接着萃取(DCM/NaHCO3 500mL/200mL)，干燥(MgSO4)，过滤以及移除溶剂得到粗化合物，其不经进一步纯化即用于反应的下一步骤中。根据TLC(Rf＝0.6，(5％MeOH/DCM))，化合物是均质的。(ii)活化O 6 位以 达成氰基乙基保护：将残余物再溶解于DCM(500mL)中，接着依次添加三乙胺(13.1ml，94mmol)、2，4，6-三甲基苯-1-磺酰氯(6.15g，28.1mmol)和DMAP(0.14g，1.146mmol)。在室温下搅拌混合物3小时，其中通过TLC来监测，直至根据TLC(Rf＝0.9，(5％MeOH/DCM))，起始材料完全消失以及出现新斑点。(iii)氰基乙基保护：在0℃下历经1小时伴随进一步反应以逐滴方式缓慢添加1-甲基吡咯烷(22.43ml，211mmol)至冰冷溶液中，通过TLC来监测(新斑点，Rf＝0.2，条痕，(5％MeOH/DCM))。以逐滴方式依次连续添加3-羟基丙腈(14.40ml，211.0mmol)和DBU(6.32mL，42.1mmol)至静止冰冷溶液中，并且再继续搅拌90分钟，通过TLC来监测(新斑点，Rf＝0.6，(5％MeOH/DCM))。为迫使反应几乎完成，再逐滴添加1.6mL DBU，其中通过TLC来仔细监测。将混合物倾于NaH2PO4(50g于400mL水中)上，分离有机物，并且用稀NaH2PO4(10g于200mL水中)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，并且通过旋转蒸发来减小体积。(iv)TMS脱保 护：将由此在先前步骤中获得的残余物再溶解于MeOH(250mL)中，接着以逐滴方式添加水，注意不要诱导沉淀。历经4天继续逐滴添加，其中通过TLC来监测。移除大多数溶剂，并且萃取残余物(DCM/NaHCO3(500/200mL))，过滤并减小体积。使残余物经受管柱纯化(0-5％MeOH/DCM)以得到呈白色泡沫状的纯化合物215，其根据TLC和HPLC是均质的。(ESI+)：(M+H)-计算值：767.34；实测值：767.03。1H NMR(300MHz，CD3CN)δ8.63(s，1H)，8.07(s，1H)，7.44-7.36(m，2H)，7.33-7.18(m，7H)，6.84-6.72(m，4H)，6.02(d，J＝3.2Hz，1H)，4.74(td，J＝6.2，0.9Hz，2H)，4.71-4.64(m，2H)，4.14-4.06(m，1H)，3.88-3.73(m，8H)，3.57-3.41(m，4H)，3.32-3.23(m，3H)，3.08(t，J＝6.2Hz，2H)，2.77(dt，J＝13.7，6.9Hz，1H)，1.14(dd，J＝6.9，1.2Hz，6H)。
合成化合物216
化合物216：使用与对于化合物208所述的程序类似的程序，并且用化合物215替代化合物203，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物216。1H NMR(399MHz，CD3CN)δ8.41(s，1H)，8.12(s，1H)，7.50-7.44(m，2H)，7.40-7.19(m，12H)，6.80(dd，J＝8.9，5.2Hz，4H)，6.04(d，J＝5.7Hz，1H)，4.99(t，J＝5.5Hz，1H)，4.94(ddd，J＝9.9，5.2，3.7Hz，1H)，4.75(t，J＝6.2Hz，2H)，4.29(q，J＝3.8Hz，1H)，3.89-3.82(m，1H)，3.76-3.68(m，7H)，3.64(ddd，J＝6.8，5.5，2.3Hz，1H)，3.50-3.46(m，2H)，3.42(s，2H)，3.38-3.28(m，1H)，3.21(s，3H)，3.09(t，J＝6.2Hz，2H)，2.84(dq，J＝10.2，7.3Hz，1H)，2.70-2.58(m，1H)，1.76(s，3H)，1.46-1.27(m，2H)，1.12(d，J＝6.8Hz，3H)，1.07(d，J＝6.8Hz，3H)，1.04-0.89(m，2H)，31P NMR(162MHz，CD3CN)δ154.40。
合成化合物217
化合物217：使用与对于化合物210所述的程序类似的程序，并且用化合物215替代化合物209，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物217。1H NMR(399MHz，CD3CN)δ8.56(s，1H)，8.13(s，1H)，7.44(dd，J＝8.2，1.5Hz，2H)，7.39-7.19(m，12H)，6.81(dd，J＝10.4，8.9Hz，4H)，6.06(d，J＝4.5Hz，1H)，4.96-4.86(m，2H)，4.75(t，J＝6.2Hz，2H)，4.30(td，J＝5.1，4.7，2.4Hz，1H)，3.83(dt，J＝11.2，4.3Hz，1H)，3.79-3.70(m，7H)，3.67(ddd，J＝7.1，5.2，2.0Hz，1H)，3.52-3.45(m，3H)，3.41(dd，J＝10.8，2.7Hz，1H)，3.34-3.24(m，1H)，3.21(s，3H)，3.08(t，J＝6.1Hz，2H)，2.89-2.72(m，2H)，1.68(s，3H)，1.54-1.38(m，2H)，1.14(dd，J＝6.8，5.4Hz，6H)，1.09-1.00(m，1H)，0.95-0.83(m，1H)，31P NMR(162MHz，CD3CN)δ154.93。
合成化合物219
化合物219：使用与对于化合物208所述的程序类似的程序，并且用化合物218替代化合物203，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物219。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ9.31(s，1H)，8.72(s，1H)，8.26(s，1H)，8.07-7.98(m，2H)，7.60-7.53(m，1H)，7.52-7.43(m，4H)，7.38-7.15(m，12H)，6.83-6.74(m，4H)，6.24(d，J＝5.2Hz，1H)，5.03-4.92(m，2H)，4.45(q，J＝3.8Hz，1H)，3.93(dt，J＝11.4，4.2Hz，1H)，3.77(ddd，J＝7.5，5.8，3.2Hz，2H)，3.73(s，6H)，3.60-3.49(m，3H)，3.47-3.37(m，2H)，3.26(s，3H)，3.02-2.92(m，1H)，1.81(s，3H)，1.56-1.43(m，1H)，1.37(dq，J＝13.2，6.5Hz，1H)，1.22-1.09(m，1H)，0.96(ddt，J＝13.1，7.9，6.8Hz，1H)；31P NMR(162MHz，CDCl3)δ157.73。
合成化合物220
化合物220：使用与对于化合物210所述的程序类似的程序，并且用化合物218替代化合物209，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物220。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ9.26(s，1H)，8.73(s，1H)，8.31(s，1H)，8.02(d，J＝7.6Hz，2H)，7.60-7.53(m，1H)，7.52-7.40(m，4H)，7.39-7.13(m，12H)，6.84-6.76(m，4H)，6.24(d，J＝4.5Hz，1H)，4.99(dt，J＝10.0，5.0Hz，1H)，4.84(t，J＝4.7Hz，1H)，4.46(q，J＝4.0Hz，1H)，3.91(dt，J＝11.1，4.2Hz，1H)，3.85-3.69(m，8H)，3.63-3.50(m，3H)，3.42(dd，J＝10.7，4.0Hz，1H)，3.40-3.31(m，1H)，3.27(s，3H)，3.00-2.89(m，1H)，1.82(s，3H)，1.58-1.38(m，2H)，1.20-1.09(m，1H)，1.00(ddt，J＝12.3，8.8，5.9Hz，1H)，31P NMR(162MHz，CDCl3)δ158.98。
合成化合物222
化合物222：使用与对于化合物208所述的程序类似的程序，并且用化合物221替代化合物203，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物222。1H NMR(499MHz，CDCl3)δ10.46(s，br，1H)，8.62(d，J＝7.5Hz，1H)，7.42(d，J＝7.1Hz，2H)，7.36-7.21(m，12H)，7.00(d，J＝7.5Hz，1H)，6.82(dd，J＝9.0，7.1Hz，4H)，6.03(s，1H)，4.77(td，J＝8.7，4.8Hz，1H)，4.34(dt，J＝9.4，2.3Hz，1H)，3.97(d，J＝4.8Hz，1H)，3.78(dd，J＝6.7，3.4Hz，1H)，3.74(s，3H)，3.71(s，6H)，3.68-3.58(m，2H)，3.48-3.38(m，1H)，3.01(p，J＝7.8Hz，1H)，2.27(s，3H)，1.72(s，3H)，1.49(tt，J＝12.3，7.0Hz，1H)，1.40(dq，J＝13.2，6.6Hz，1H)，1.18(dq，J＝13.9，7.0Hz，1H)，1.02-0.90(m，1H)，31P NMR(202MHz，CDCl3)δ158.71。
合成化合物223
化合物223：使用与对于化合物210所述的程序类似的程序，并且用化合物221替代化合物209，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物223。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ9.76(s，1H)，8.70(d，J＝7.4Hz，1H)，7.48-7.41(m，2H)，7.41-7.18(m，12H)，7.06(d，J＝7.4Hz，1H)，6.87(dd，J＝8.9，1.9Hz，4H)，6.00(s，1H)，4.80(td，J＝9.2，4.7Hz，1H)，4.33(d，J＝9.5Hz，1H)，3.84(d，J＝4.7Hz，1H)，3.81(s，3H)，3.80(s，3H)，3.72(td，J＝6.6，3.4Hz，1H)，3.70-3.62(m，4H)，3.53(dd，J＝11.3，2.2Hz，1H)，3.34(tdd，J＝10.7，7.8，4.9Hz，1H)，2.96(dq，J＝10.3，7.6Hz，1H)，2.25(s，3H)，1.83(s，3H)，1.56-1.48(m，1H)，1.43(dq，J＝13.1，6.4Hz，1H)，1.24-1.16(m，1H)，1.00-0.91(m，1H)。31PNMR(202MHz，CDCl3)δ157.17。
合成化合物225
化合物225：使用与对于化合物208所述的程序类似的程序，并且用化合物224替代化合物203，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物225。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ9.76(s，br，1H)，8.70(d，J＝7.4Hz，1H)，7.48-7.41(m，2H)，7.41-7.18(m，12H)，7.06(d，J＝7.4Hz，1H)，6.87(dd，J＝8.9，1.9Hz，4H)，6.00(s，1H)，4.80(td，J＝9.2，4.7Hz，1H)，4.33(d，J＝9.5Hz，1H)，3.84(d，J＝4.7Hz，1H)，3.81(s，3H)，3.80(s，3H)，3.72(td，J＝6.6，3.4Hz，1H)，3.69-3.62(m，4H)，3.53(dd，J＝11.3，2.2Hz，1H)，3.34(tdd，J＝10.7，7.8，4.9Hz，1H)，2.96(dq，J＝10.3，7.6Hz，1H)，2.25(s，3H)，1.83(s，3H)，1.56-1.48(m，1H)，1.43(dq，J＝13.1，6.4Hz，1H)，1.24-1.16(m，1H)，1.00-0.91(m，1H)，31P NMR(202MHz，CDCl3)δ158.97。
合成化合物226
化合物226：使用与对于化合物210所述的程序类似的程序，并且用化合物224替代化合物209，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物226。1H NMR(499MHz，CDCl3)δ9.8-9.0(br，1H)，8.09(d，J＝8.2Hz，1H)，7.40(d，J＝7.4Hz，2H)，7.36-7.19(m，12H)，6.80(dd，J＝11.4，8.8Hz，4H)，6.02(d，J＝2.2Hz，1H)，5.22(d，J＝8.1Hz，1H)，4.82(td，J＝8.1，4.9Hz，1H)，4.27(d，J＝7.4Hz，1H)，3.96(dd，J＝5.0，2.2Hz，1H)，3.81-3.76(m，1H)，3.74(s，3H)，3.70(s，3H)，3.62(s，3H)，3.61-3.54(m，2H)，3.50-3.41(m，1H)，3.04(dtd，J＝10.2，8.0，6.3Hz，1H)，1.75(s，3H)，1.56-1.47(m，1H)，1.44-1.35(m，1H)，1.26-1.18(m，1H)，0.95(dq，J＝12.3，7.5Hz，1H)，31P NMR(202MHz，CDCl3)δ158.96。
合成化合物228
化合物228：使用与对于化合物208所述的程序类似的程序，并且用化合物227替代化合物203，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物228。31P NMR(202MHz，CDCl3)δ158.16。
合成化合物229
化合物229：使用与对于化合物210所述的程序类似的程序，并且用化合物227替代化合物209，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物229。31P NMR(202MHz，CDCl3)δ158.84。
合成化合物231
化合物231：使用与对于化合物208所述的程序类似的程序，并且用化合物230替代化合物203，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物231。1H NMR(499MHz，CDCl3)δ9.6-9.3(s，1H)，8.73(s，1H)，8.32(s，1H)，7.50-7.41(m，2H)，7.39-7.16(m，14H)，7.10-7.01(m，3H)，6.82(d，J＝8.8Hz，4H)，6.21(d，J＝4.1Hz，1H)，4.96(dt，J＝10.1，5.1Hz，1H)，4.86(s，2H)，4.54(t，J＝4.5Hz，1H)，4.43(q，J＝3.9Hz，1H)，3.81-3.75(m，7H)，3.62(dd，J＝10.8，3.3Hz，1H)，3.54(s，3H)，3.46-3.42(m，1H)，3.41-3.33(m，1H)，3.01-2.93(m，1H)，1.82(s，3H)，1.56-1.47(m，1H)，1.44(dq，J＝13.2，6.5Hz，1H)，1.22-1.11(m，1H)，1.03-0.94(m，1H)，31PNMR(202MHz，CDCl3)δ158.11。
合成化合物232
化合物232：使用与对于化合物210所述的程序类似的程序，并且用化合物230替代化合物209，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物232。1H NMR(499MHz，CDCl3)δ9.8-9.2(br，1H)，8.71(s，1H)，8.23(s，1H)，7.49-7.43(m，2H)，7.40-7.15(m，14H)，7.09-7.02(m，3H)，6.79(d，J＝8.9Hz，4H)，6.20(d，J＝5.6Hz，1H)，4.93(ddd，J＝9.3，5.0，3.8Hz，1H)，4.86(s，2H)，4.73(t，J＝5.3Hz，1H)，4.43(q，J＝3.9Hz，1H)，3.79-3.75(m，1H)，3.74(s，3H)，3.74(s，3H)，3.57(dt，J＝6.8，3.8Hz，1H)，3.52(s，3H)，3.46-3.36(m，2H)，2.99(dtd，J＝10.1，7.9，6.5Hz，1H)，1.80(s，3H)，1.54-1.45(m，1H)，1.39-1.31(m，1H)，1.23-1.13(m，1H)，0.99-0.90(m，1H)，31PNMR(202MHz，CDCl3)δ158.13。
合成化合物234
化合物234：使用与对于化合物208所述的程序类似的程序，并且用化合物233替代化合物203，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物234。
合成化合物235
化合物235：使用与对于化合物210所述的程序类似的程序，并且用化合物233替代化合物209，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物235。31P NMR(202MHz，CDCl3)δ158.75。
合成化合物237
化合物237：使用与对于化合物208所述的程序类似的程序，并且用化合物236替代化合物203，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物237。31P NMR(202MHz，氯仿-d)δ159.51(d，JP-F＝9.5Hz)。
合成化合物238
化合物238：使用与对于化合物210所述的程序类似的程序，并且用化合物236替代化合物209，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物238。31P NMR(202MHz，氯仿-d)δ159.48。
合成化合物240
化合物240：使用与对于化合物208所述的程序类似的程序，并且用化合物239替代化合物203，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物240。31P NMR(202MHz，CDCl3)δ160.20(d，JP-F＝11.0Hz)。
合成化合物241
化合物241：使用与对于化合物210所述的程序类似的程序，并且用化合物239替代化合物209，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物241。31P NMR(202MHz，CDCl3)δ159.66(d，JP-F＝8.4Hz)。
合成化合物243
化合物243：使用与对于化合物208所述的程序类似的程序，并且用化合物242替代化合物203，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物243。31P NMR(202MHz，CDCl3)δ160.20(d，J＝11.0Hz)。
合成化合物244
化合物244：使用与对于化合物210所述的程序类似的程序，并且用化合物242替代化合物209，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物244。31P NMR(202MHz，CDCl3)δ156.52(d，JP-F＝8.5Hz)。
合成化合物246
化合物246：使用与对于化合物208所述的程序类似的程序，并且用化合物245替代化合物203，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物246。
合成化合物247
化合物247：使用与对于化合物210所述的程序类似的程序，并且用化合物245替代化合物209，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物247。
合成化合物249
化合物249：使用与对于化合物208所述的程序类似的程序，并且用化合物248替代化合物203，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物249。
合成化合物250
化合物250：使用与对于化合物210所述的程序类似的程序，并且用化合物248替代化合物209，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物250。
合成化合物252
化合物252：使用与对于化合物208所述的程序类似的程序，并且用化合物251替代化合物203，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物252。
合成化合物253
化合物253：使用与对于化合物210所述的程序类似的程序，并且用化合物251替代化合物209，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物253。
合成化合物255
化合物255：使用与对于化合物208所述的程序类似的程序，并且用化合物254替代化合物203，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物255。
合成化合物256
化合物256：使用与对于化合物210所述的程序类似的程序，并且用化合物254替代化合物209，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物256。
合成化合物258
化合物258：使用与对于化合物208所述的程序类似的程序，并且用化合物257替代化合物203，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物258。
合成化合物259
化合物259：使用与对于化合物210所述的程序类似的程序，并且用化合物257替代化合物209，获得呈无色固体泡沫状的纯化合物259。
实施例2-16。
以下在表E-1中概述在DNA/RNA合成仪ABI-394上合成实施例2-16的程序。
表E-1.在DNA/RNA合成仪ABI-394上进行的用于合成实施例2-16的寡核苷酸合成的概述。
实施例2-9：根据表E-1中概述的循环，使用10μmol合成管柱和CPG上的6.5μmol丁二酰基连接的dC，在ABI-394DNA/RNA合成仪上合成含有立体确定的硫代磷酸二酯核苷酸问键联的寡核苷酸。伴随末端5′-O-DMTr基团的移除(DMT去除)来进行合成循环。固体载体用无水ACN洗涤，并且在氩气流下干燥。接着在室温下用1，8-二氮杂双环十一-7-烯(DBU)于无水ACN-三甲基硅烷基氯化物-16：1(v/v)中的5mL 1M无水溶液处理干燥固体载体10分钟，在所述时间期间，借助于固定于管柱出口的塑料鲁尔(luer)注射器来使溶液缓慢推进穿过管柱。载体接着用无水ACN洗涤，并且在真空下干燥。将干燥CPG放置在塑料小瓶中，并且接着在室温下用3mL 28％氨水处理18小时的时期。蒸发溶剂至干燥，将残余物再悬浮于10％DMSO水溶液中，并且滤除固体载体。粗产物通过阴离子交换制备型HPLC(含0.25至1.75M NaCl的20mM NaOH梯度)纯化。汇合纯度高于95％的洗脱份，浓缩，并且通过反相HPLC(0至80％ACN的梯度)来脱盐。自水冻干最终脱盐产物。
实施例10-16：根据表E-1中概述的循环，使用1μmol合成管柱和CPG上的3μmol丁二酰基连接的dC，在ABI-394DNA/RNA合成仪上合成含有立体确定的硫代磷酸二酯核苷酸问键联的寡核苷酸。伴随末端5′-O-DMTr基团的移除(DMT去除)来进行合成循环。固体载体用无水ACN洗涤，并且在氩气流下干燥。接着在室温下用1，5-二氮杂双环(4.3.0)壬-5-烯(DBN)于无水ACN-三甲基硅烷基氯化物-16：1(v/v)中的5mL 1M无水溶液处理干燥固体载体10分钟。借助于固定于管柱出口的塑料鲁尔注射器来使DBN溶液缓慢推进穿过管柱。载体接着用无水ACN洗涤，并且在真空下干燥。将干燥CPG放置在塑料小瓶中，并且在室温下用2mL 28％氨水溶液处理18小时的时期。蒸发溶剂至干燥，将残余物再悬浮于10％DMSO水溶液中，并且滤除固体载体。
实施例2-16的纯化和脱盐：
粗产物通过配备有2487双波长检测器以及FCO和Flex注射器的Waters 2525BGM HPLC系统加以纯化。来自Waters的10×200mmAP-1玻璃柱用Source 15Q载体(GE Healthcare，零件号17-0947-01)填充，并且以流速4mL/min加以使用。在所有纯化期间都使用TL600移动相加热器加热管柱，并且将TL150温度控制器(TimberlineInstruments)设置在75℃下。以自30％B起始直至70％B的阶跃梯度使用缓冲液A：20mM NaOH和缓冲液B：20mM NaOH，2.5M NaCl。汇合纯度高于95％的洗脱份，浓缩，并且在相同HPLC系统上通过反相管柱(XBridge Semi Prep，250×10mm，C18，5μm)，以水至80％ACN的梯度以及4mL/min流速来脱盐。在speedvac中浓缩最终脱盐产物，随后自水冻干。
纯化寡核苷酸的HPLC分析：使用DNA Pac 100(10×250mm)以及使用以下条件来测定寡核苷酸的品质：
缓冲液A：10mM Tris HCl，50％HCl，pH＝8.0
缓冲液B：A+0.8M NaClO4，pH＝8.0
管柱温度：60℃
梯度方法：
LCMS分析方法：
洗脱剂A：15mM TEA，400mM HFIP，水
洗脱剂B：50：50缓冲液A/甲醇
管柱：UPLCOST C18 1.7μm，2.1×500mm
管柱温度＝50℃
梯度方法：
实施例2.合成寡核苷酸101(全(Rp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsT sGsCsTsTsCsGsCsAsCsC])
如上所述来合成寡核苷酸101。IEX-HPLC中的RT：14.70分钟。C191H246N67O102P19S19的UPLC/ESI-MS计算值：6310.2；实测值：6310.4。
实施例3.合成寡核苷酸102(全(Sp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsT sGsCsTsTsCsGsCsAsCsC])
如上所述来合成寡核苷酸102。IEX-HPLC中的RT：15.49分钟。C191H246N67O102P19S19的UPLC/ESI-MS计算值：6310.2；实测值：6310.2。
实施例4.合成寡核苷酸103((Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Sp，Sp，S p，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp)-d[GsCsCsTsCsA sGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC](5R-9S-5R))
如上所述来合成寡核苷酸103。IEX-HPLC中的RT：15.10分钟。
C191H246N67O102P19S19的UPLC/ESI-MS计算值：6310.2；实测值：6310.3。
实施例5.合成寡核苷酸104((Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Rp，Rp，R p，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp)-d[GsCsCsTsCsA sGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC](5S-9R-5S))
如上所述来合成寡核苷酸104。IEX-HPLC中的RT：15.04分钟。C191H246N67O102P19S19的UPLC/ESI-MS计算值：6310.2；实测值：6307.2。
实施例6.合成寡核苷酸105((Sp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，R p，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Sp)-d[GsCsCsTsCs AsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC](1S-17R-1S))
如上所述来合成寡核苷酸105。IEX-HPLC中的RT：14.75分钟。C191H246N67O102P19S19的UPLC/ESI-MS计算值：6310.2；实测值：6310.2。
实施例7，合成寡核苷酸106((Rp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp， Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Rp)-d[GsCsCsTsCsAsG sTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC](1R-17S-1R))
如上所述来合成寡核苷酸106。IEX-HPLC中的RT：15.43分钟。C191H246N67O102P19S19的UPLC/ESI-MS计算值：6310.2；实测值：6309.6。
实施例8.合成寡核苷酸107((Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，S p，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp)-d[GsCsCsTsCsA sGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC]((R/S) 9 R))
如上所述来合成寡核苷酸107。IEX-HPLC中的RT：15.02分钟。C191H246N67O102P19S19的UPLC/ESI-MS计算值：6310.2；实测值：6310.7。
实施例9，合成寡核苷酸108((Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，R p，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp)-d[GsCsCsTsCsA sGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC]((S/R) 9 S))
如上所述来合成寡核苷酸108。IEX-HPLC中的RT：15.10分钟。C191H246N67O102P19S19的UPLC/ESI-MS计算值：6310.2；实测值：6307.9。
实施例10.合成寡核苷酸109((Sp，Sp，Sp，Rp，Rp，Rp，Rp， Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Sp，Sp，Sp)d[GsCsCsTsCs AsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC](3S-13R-3S))
如上所述来合成寡核苷酸109。IEX-HPLC中的RT：14.91分钟。C191H246N67O102P19S19的UPLC/ESI-MS计算值：6310.2；实测值：6309.5。
实施例11.合成寡核苷酸110((Rp，Rp，Rp，Sp，Sp，Sp，Sp，S p，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Rp，Rp，Rp)-d[GsCsCsTsCsAs GsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC](3R-13S-3R))
如上所述来合成寡核苷酸110。IEX-HPLC中的RT：15.24分钟。C191H246N67O102P19S19的UPLC/ESI-MS计算值：6310.2；实测值：6309.3。
实施例12.合成寡核苷酸111((Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，S p，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Rp)-d[GsCsCsTsCsAs GsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC]((18S/R 19 ))
如上所述来合成寡核苷酸111。IEX-HPLC中的RT：15.69分钟。C191H246N67O102P19S19的UPLC/ESI-MS计算值：6310.2；实测值：6309.4。
实施例13.合成寡核苷酸113((Sp，Rp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，S p，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp)-d[GsCsCsTsCsAs GsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC](18S/R 2 ))
如上所述来合成寡核苷酸113。IEX-HPLC中的RT：15.72分钟。C191H246N67O102P19S19的UPLC/ESI-MS计算值：6310.2；实测值：6311.0。
实施例14.合成寡核苷酸114((Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp， Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp)-d[GsCsCsTsCs AsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC]((RRS) 6 -R))
如上所述来合成寡核苷酸114。IEX-HPLC中的RT：14.14分钟。C191H246N67O102P19S19的UPLC/ESI-MS计算值：6310.2；实测值：6313.7。
实施例15.合成寡核苷酸115((Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp， Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp)-d[GsCsCsTsCs AsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC](S-(RRS) 6 ))
如上所述来合成寡核苷酸115。IEX-HPLC中的RT：14.30分钟。C191H246N67O102P19S19的UPLC/ESI-MS计算值：6310.2；实测值：6313.7。
实施例16.合成寡核苷酸116((Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp， Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp)d[GsCsCsTsCs AsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC](RS-(RRS) 5 -RR))
如上所述来合成寡核苷酸116。IEX-HPLC中的RT：14.17分钟。C191H246N67O102P19S19的UPLC/ESI-MS计算值：6310.2；实测值：6312.4。
实施例2-16的结果概述于下表E-2中：
表E-2.实施例2-16的概述。
实施例17.合成对照寡核苷酸
使用用于自动固相寡核苷酸合成的标准化学方法(Beaucage，S.L.和Iyer，R.P.，Tetrahedron，1992，48，2223-2311)来合成对照寡核苷酸(参见表E-3)。更具体来说，使用标准DNA亚磷酰胺(ChemGenes Co.)、作为活化剂的乙基硫基四唑(ETT，Muang等，Tetrahedron Lett.，2004，45，6497-6499)(Glen Research)和作为硫化试剂的N，N-二甲基N′-(3-二硫代-3H-1，2，4-二噻唑-5-基)甲亚胺酰胺(DDTT，AM Chemicals)(Guzaev，A.；Tetrahedron Lett.，2011，52，434-437)来合成立体无规DNA。亚磷酰胺偶联时间是2分钟，并且硫化时间是10分钟。使用标准方法来将寡核苷酸脱保护和纯化。使用标准DNA亚磷酰胺、作为活化剂的ETT和作为氧化试剂的碘/吡啶/水来合成DNA磷酸二酯。使用内部制备的2′-O-甲氧基乙基(MOE)亚磷酰胺(Martin，P.；Helv.Chim.Acta.1995，78，486-504；Ross，B.；Song，Q.；2004，美国专利公布号20040082775)、作为活化剂的ETT和作为硫化试剂的DDTT来合成2′-O-甲氧基乙基(MOE)DNA。偶联时间是10分钟，并且硫化时间是10分钟。使用标准RNA亚磷酰胺(ChemGenes Co.)、作为活化剂的ETT和作为氧化试剂的碘/吡啶/水来合成RNA。偶联时间是10分钟。
使用标准方法来将所有寡核苷酸脱保护和纯化。
RNA(寡核苷酸117)的纯化：
Waters 2525 BGM，2487双波长检测器，配备有FCO和Flex注射器
缓冲液A：20mM磷酸钠，pH＝8.5
缓冲液B：20mM磷酸钠，1M NaBr，pH＝8.5
管柱：来自Waters的AP-1玻璃柱，10×200mm，用来自TOSOH的Super Q-5PW(20)、TSK凝胶(阴离子交换)填充
管柱温度：70℃(Timberline Instruments，TL600移动相加热器和TLl50温度控制器)
使用的梯度：
如图1中所示，手性控制的硫代磷酸二酯20聚体寡核苷酸(全(Rp)，寡核苷酸101，图1A)具有不同于硫代磷酸二酯20聚体标准立体无规寡核苷酸(寡核苷酸118，图1C)的保留时间的保留时间，并且具有更尖锐的峰。本领域技术人员了解在纯化立体无规寡核苷酸108期间，有可能将损失大多数全(Rp)寡核苷酸(101，以混合物立体无规寡核苷酸108的洗脱份的约1/219存在)。
实施例17的结果概述于下表E-3中。
表E-3.实施例17的概述。
用于实施例18-21的程序：根据表E-4中概述的循环，使用1μmol合成管柱和HCP上的0.8μmol草酰基连接的dC，在ABI-394DNA/RNA合成仪上合成含有立体确定的吗啉代乙基硫代磷酸三酯核苷酸问键联的寡核苷酸。伴随末端5′-O-DMTr基团的移除(DMT去除)来进行合成循环。固体载体用无水ACN洗涤，并且在氩气流下干燥。将干燥HCP放置在塑料小瓶中，并且在室温下用1mL含无水丙胺的无水吡啶(以1∶4比率)处理18小时的时期。接着蒸发溶剂，并且用pH约1.5的含有10％DMSO的水溶液再悬浮残余物，并且滤除HCP载体。粗产物通过反相制备型HPLC加以纯化。汇合纯度高于95％的洗脱份，浓缩，并且通过反相HPLC(0至80％ACN的梯度)来脱盐。自水冻干最终脱盐产物。
表E-4.在DNA/RNA合成仪ABI-394上进行的用于合成实施例18-21的寡核苷酸合成的概述。
用于实施例18-21的一般性纯化方法：
缓冲液A：20mM磷酸盐，pH＝6.0(用磷酸调整)
缓冲液B：ACN
管柱：XBridge Prep C18，5μm，C18，250×10mm，零件号186003256
缓冲液加热器设置温度＝50℃
在254和280nm下监测信号
使用的梯度：
用于寡核苷酸的分析型HPLC方法。
HPLC方法1：
缓冲液A：20mM磷酸盐，pH＝6.0(用磷酸调整)
缓冲液B：ACN
管柱：XBridge C18，3.5μm，C18，4.6×50mm，零件号186003034
缓冲液加热器设置温度＝35℃
在254和280nm下监测信号
使用的梯度：
HPLC方法2：
缓冲液A：50mM TEAA，pH 7.8
缓冲液B：ACN
管柱：XBridge C18，3.5μm，C18，4.6×50mm，零件号186003034
缓冲液加热器设置温度＝60℃
在254和280nm下监测信号
使用的梯度：
HPLC方法3：
HPLC方法4：
实施例18.合成寡核苷酸122(全(Rp)-d[Gs1Cs1Cs1Ts1Cs1As1 Gs1Ts1Cs1Ts1Gs1Cs1Ts1Ts1Cs1Gs1Cs1As1Cs1C] )
如上所述来合成寡核苷酸122。RP-HPLC中的RT：(HPLC方法1)：15.2分钟。C305H455N86O121P19S19的UPLC/ESI-MS计算值：8460.25；实测值：8462.0。
实施例19.合成寡核苷酸123((Sp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Sp)-d[Gs1Cs1Cs1 Ts1Cs1As1Gs1Ts1Cs1Ts1Gs1Cs1Ts1Ts1Cs1Gs1Cs1As1Cs1C]((1S-1 7R-1S)
如上所述来合成寡核苷酸123。RP-HPLC(HPLC方法1)中的RT：16.2分钟。C305H455N86O121P19S19的UPLC/ESI-MS计算值：8460.3；实测值：8461.5。
实施例20.合成寡核苷酸124(全(Sp)-d[Gs1Cs1Cs1Ts1Cs1As1 Gs1Ts1Cs1Ts1Gs1Cs1Ts1Ts1Cs1Gs1Cs1As1Cs1C])
如上所述来合成寡核苷酸124。RP-HPLC(HPLC方法1)中的RT：18.3分钟。C305H455N86O121P19S19的UPLC/ESI-MS计算值：8460.3；实测值：8461.8。
实施例21.合成寡核苷酸125(全(Rp)-d[5mCs1As1Ts1G])
如上所述来合成寡核苷酸125。RP-HPLC(HPLC方法2)中的RT：16.32分钟。C58H85N18O22P3S3的UPLC/ESI-MS计算值：1575.5；实测值：1575.2。
在实施例22和42中，根据表E-5中概述的循环，使用1μmol合成管柱和HCP上的0.8μmol草酰基连接的dC，在ABI-394DNA/RNA合成仪上合成含有立体确定的甲氧基乙基硫代磷酸三酯核苷酸问键联的寡核苷酸。伴随末端5′-O-DMTr基团的移除(DMT去除)来进行合成循环。固体载体用无水ACN洗涤，并且在氩气流下干燥。将干燥HCP放置在塑料小瓶中，并且在室温下用1mL含无水丙胺的无水吡啶(以1∶4比率)处理18小时的时期。接着蒸发溶剂，并且用pH约1.5的含有10％DMSO的水溶液再悬浮残余物，并且滤除HCP载体。粗产物通过反相制备型HPLC(含5至65％ACN的20mM磷酸钠缓冲液梯度，pH＝6.0)加以纯化。汇合纯度高于95％的洗脱份，浓缩，并且通过反相HPLC(0至80％ACN的梯度)来脱盐。自水冻干最终脱盐产物。
表E-5.在DNA/RNA合成仪ABI-394上进行的用于合成实施例22和42的寡核苷酸合成的概述。
实施例22.合成寡核苷酸126(全(Rp)-d[Cs2As2Gs2T] )
如上所述来合成寡核苷酸126。RP-HPLC(HPLC方法2)中的RT：16.23分钟。C48H68N15O22P3S3的UPLC/ESI-MS计算值：1396.2；实测值：1395.2。
实施例23：根据表E-6中概述的循环，使用1μmol合成管柱和HCP上的1.5μmol草酰基连接的dT，在ABI-394DNA/RNA合成仪上合成含有立体确定的N-甲基哌嗪子基庞大酯硫代磷酸三酯核苷酸问键联的寡核苷酸。伴随末端5′-O-DMTr基团的移除(DMT去除)来进行合成循环。固体载体用无水ACN洗涤，并且在氩气流下干燥。将干燥HCP放置在塑料小瓶中，并且在室温下用1mL含无水丙胺的无水吡啶(以1∶4比率)处理18小时的时期。接着蒸发溶剂，并且用pH约1.5的含有10％DMSO的水溶液再悬浮残余物，并且滤除HCP载体。粗产物通过反相制备型HPLC(含5至65％ACN的20mM磷酸钠缓冲液梯度，pH＝6.0)加以纯化。汇合纯度高于95％的洗脱份，浓缩，并且通过反相HPLC(0至80％ACN的梯度)来脱盐。自水冻干最终脱盐产物。
表E-6.在DNA/RNA合成仪ABI-394上进行的用于合成实施例23的寡核苷酸合成的概述。
实施例23.合成寡核苷酸127(全(Rp)-d[Cs3As3Gs3T] )
如上所述来合成寡核苷酸127。RP-HPLC(HPLC方法2)中的RT：20.24分钟。C78H122N21O25P3S3的UPLC/ESI-MS计算值：1943.1；实测值：1941.0。
实施例24和43根据表E-7中概述的循环，使用1μmol合成管柱和HCP上的1.5μmol草酰基连接的dT，在ABI-394DNA/RNA合成仪上合成含有立体确定的吗啉代庞大酯硫代磷酸三酯核苷酸问键联的寡核苷酸。伴随末端5′-O-DMTr基团的移除(DMT去除)来进行合成循环。固体载体用无水ACN洗涤，并且在氩气流下干燥。将干燥HCP放置在塑料小瓶中，并且在室温下用1mL含无水丙胺的无水吡啶(以1∶4比率)处理18小时的时期。接着蒸发溶剂，并且用pH约1.5的含有10％DMSO的水溶液再悬浮残余物，并且滤除HCP载体。粗产物通过反相制备型HPLC(含5至65％ACN的20mM磷酸钠缓冲液梯度，pH＝6.0)加以纯化。汇合纯度高于95％的洗脱份，浓缩，并且通过反相HPLC(0至80％ACN的梯度)来脱盐。自水冻干最终脱盐产物。
表E-7.在DNA/RNA合成仪ABI-394上进行的用于合成实施例24和43的寡核苷酸合成的概述。
实施例24.合成寡核苷酸128(全(Sp)-d[Cs4As4Gs4T] )
如上所述来合成寡核苷酸128。RP-HPLC(HPLC方法3)中的RT：19.75分钟。C75H113N18O28P3S3的UPLC/ESI-MS计算值：1902.9；实测值：1904.0。
实施例25：根据表E-8中概述的循环，使用1μmol合成管柱和HCP上的1.5μmol草酰基连接的dT，在ABI-394DNA/RNA合成仪上合成含有立体确定的二甲基氨基乙基硫代磷酸三酯核苷酸问键联的寡核苷酸。伴随末端5′-O-DMTr基团的移除(DMT去除)来进行合成循环。固体载体用无水ACN洗涤，并且在氩气流下干燥。将干燥HCP放置在塑料小瓶中，并且在室温下用1mL含无水丙胺的无水吡啶(以1∶4比率)处理18小时的时期。接着蒸发溶剂，并且用pH约1.5的含有10％DMSO的水溶液再悬浮残余物，并且滤除HCP载体。粗产物通过反相制备型HPLC(含5至65％ACN的20mM磷酸钠缓冲液梯度，pH＝6.0)加以纯化。汇合纯度高于95％的洗脱份，浓缩，并且通过反相HPLC(0至80％ACN的梯度)来脱盐。自水冻干最终脱盐产物。
表E-8.在DNA/RNA合成仪ABI-394上进行的用于合成实施例25的寡核苷酸合成的概述。
实施例25.合成寡核苷酸129(全(Sp)-d[Cs5As5Gs5T] )
如上所述来合成寡核苷酸129。RP-HPLC(HPLC方法2)中的RT：17.25分钟。C51H77N18O19P3S3的UPLC/ESI-MS计算值：1435.4；实测值：1435.0。
实施例26：根据表E-9中概述的循环，使用1μmol合成管柱和HCP上的1.5μmol草酰基连接的dT，在ABI-394 DNA/RNA合成仪上合成含有立体确定的二甲基丙氨酸酯硫代磷酸三酯核苷酸问键联的寡核苷酸。伴随末端5′-O-DMTr基团的移除(DMT去除)来进行合成循环。固体载体用无水ACN洗涤，并且在氩气流下干燥。将干燥HCP放置在塑料小瓶中，并且在室温下用1mL含无水丙胺的无水吡啶(以1∶4比率)处理18小时的时期。接着蒸发溶剂，并且用pH约1.5的含有10％DMSO的水溶液再悬浮残余物，并且滤除HCP载体。粗产物通过反相制备型HPLC(含5至65％ACN的20mM磷酸钠缓冲液梯度，pH＝6.0)加以纯化。汇合纯度高于95％的洗脱份，浓缩，并且通过反相HPLC(0至80％ACN的梯度)来脱盐。自水冻干最终脱盐产物。
表E-9.在DNA/RNA合成仪ABI-394上进行的用于合成实施例26的寡核苷酸合成的概述。
实施例26.合成寡核苷酸130(全(Sp)-d[Cs6As6Gs6T] )
如上所述来合成寡核苷酸130。RP-HPLC(HPLC方法2)中的RT：16.45分钟。C57H83N18O25P3S3的UPLC/ESI-MS计算值：1609.5；实测值：1609.6。
实施例27和28：根据表E-10中概述的循环，使用1μmol合成管柱和HCP上的0.8μmol草酰基连接的dC，在ABI-394DNA/RNA合成仪上合成含有立体确定的S-甲基硫代磷酸三酯核苷酸问键联的寡核苷酸。伴随末端5′-O-DMTr基团的移除(DMT去除)来进行合成循环。固体载体用无水ACN洗涤，并且在氩气流下干燥。将干燥HCP放置在塑料小瓶中，并且在室温下用1mL具有50％DMSO的含无水丙胺的无水吡啶(以1∶4比率)处理18小时的时期。接着蒸发溶剂，并且用pH约1.5的含有10％DMSO的水溶液再悬浮残余物，并且滤除HCP载体。粗产物通过反相制备型HPLC(含5至65％ACN的20mM磷酸钠缓冲液梯度，pH＝6.0)加以纯化。汇合纯度高于95％的洗脱份，浓缩，并且通过反相HPLC(0至80％ACN的梯度)来脱盐。自水冻干最终脱盐产物。
表E-10.在DNA/RNA合成仪ABI-394上进行的用于合成实施例27和28的寡核苷酸合成的概述。
实施例27.合成寡核苷酸131(全 (Rp)-d[Gs7Cs7Cs7Ts7Cs7As7Gs7Ts7Cs7Ts7Gs7Cs7Ts7Ts7Cs7Gs7C s7As7Cs7C] )
如上所述来合成寡核苷酸131。RP-HPLC中的RT：27.65分钟。C210H284N67O102P19S19的UPLC/ESI-MS计算值：6576.71；实测值：6575.6。
实施例28.合成寡核苷酸132(全 (Sp)-d[Gs7Cs7Cs7Ts7Cs7As7Gs7Ts7Cs7Ts7Gs7Cs7Ts7Ts7Cs7Gs7C s7As7Cs7C] )
如上所述来合成寡核苷酸132。RP-HPLC中的RT：32.65分钟。C210H284N67O102P19S19的UPLC/ESI-MS计算值：6576.71；实测值：6574.8。
合成包含修饰的核苷碱基的手性控制的寡核苷酸
如以上以及本文中一般所述，在一些实施方案中，本发明提供包含除A、T、C和G以外的寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述手性控制的寡核苷酸包含5-甲基胞嘧啶(5mC)。非限制性实例呈现于实施例21和下文中。
根据表E-11概述的合成循环，使用1μmol合成管柱和HCP上的1.75μmol草酰基连接的dG，利用自动合成在ABI-394DNA/RNA合成仪上合成实施例29-41。伴随末端5′-O-DMTr基团的移除(DMT去除)来进行合成循环。在完成自动寡核苷酸合成之后，HCP载体用无水ACN洗涤，并且在真空下干燥。将干燥HCP放置在塑料小瓶中，并且在室温下用1mL含无水丙胺的无水吡啶(以1∶4比率)处理18小时的时期。接着蒸发溶剂，并且用pH约1.5的含有10％DMSO的水溶液再悬浮残余物，并且滤除HCP载体。粗产物通过反相制备型HPLC加以纯化(根据下述程序)。汇合纯度高于95％的洗脱份，浓缩，并且通过反相HPLC(0至30％ACN的梯度)来脱盐。自水冻干最终脱盐产物。
表E-11.在DNA/RNA合成仪ABI-394上进行的用于合成实施例29-41的寡核苷酸合成的概述。
用于实施例29-41的一般性纯化方法：
缓冲液A：20mM磷酸盐，pH＝6.0(用磷酸调整)
缓冲液B：ACN
管柱：XBridge Prep C18，5μm，C18，250×10mm，零件号186003256
缓冲液加热器设置温度＝50℃
在254和280nm下监测信号
使用的梯度：
实施例29.合成寡核苷酸135(全(Rp)-d[5mCs1As1Gs1Ts15mC s1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15mCs1G])
如上所述来合成寡核苷酸135。RP-HPLC(HPLC方法1)中的RT：17.50分钟。C186H278N51O73P11S11的UPLC/ESI-MS计算值：5090.0；实测值：5091.9。
实施例30.合成寡核苷酸136(全(Sp)-d[5mCs1As1Gs1Ts15mCs 1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15mCs1G])
如上所述来合成寡核苷酸136。RP-HPLC(HPLC方法1)中的RT：19.25分钟。C186H278N51O73P11S11的UPLC/ESI-MS计算值：5090.0；实测值：5090.8。
实施例31.合成寡核苷酸137((Sp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp， Rp，Rp，Rp，Sp)-d[5mCs1As1Gs1Ts15mCs1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15 mCs1G](1S-9R-1S))
如上所述来合成寡核苷酸137。RP-HPLC(HPLC方法1)中的RT：17.85分钟。C186H278N51O73P11S11的UPLC/ESI-MS计算值：5090.0；实测值：5091.9。
实施例32.合成寡核苷酸138((Sp，Sp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp， Rp，Rp，Sp，Sp)-d[5mCs1As1Gs1Ts15mCs1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15 mCs1G](2S-7R-2S))
如上所述来合成寡核苷酸138。RP-HPLC(HPLC方法1)中的RT：18.10分钟。C186H278N51O73P11S11的UPLC/ESI-MS计算值：5090.0；实测值：5091.9。
实施例33.合成寡核苷酸139((Rp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp， Sp，Rp)-d[5mCs1As1Gs1Ts15mCs1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15mCs1G] (1R-9S-1R))
如上所述来合成寡核苷酸139。RP-HPLC(HPLC方法1)中的RT：18.75分钟。C186H278N51O73P11S11的UPLC/ESI-MS计算值：5090.0；实测值：5088.9。
实施例34.合成寡核苷酸140((Rp，Rp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，S p，Sp，Rp，Rp)-d[5mCs1As1Gs1Ts15mCs1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15m Cs1G](2R-7S-2R))
如上所述来合成寡核苷酸140。RP-HPLC(HPLC方法1)中的RT：18.72分钟。C186H278N51O73P11S11的UPLC/ESI-MS计算值：5090.0；实测值：5091.3。
实施例35.合成寡核苷酸141((Sp，Sp，Sp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp， Sp，Sp，Sp)-d[5mCs1As1Gs1Ts15mCs1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15mCs1G] (3S-5R-3S))
如上所述来合成寡核苷酸141。RP-HPLC(HPLC方法1)中的RT：18.09分钟。C186H278N51O73P11S11的UPLC/ESI-MS计算值：5090.0；实测值：5090.9。
实施例36.合成寡核苷酸142((Rp，Rp，Rp，Sp，Sp，Sp，Sp，S p，Rp，Rp，Rp)-d[5mCs1As1Gs1Ts15mCs1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15m Cs1G](3R-5S-3R))
如上所述来合成寡核苷酸142。RP-HPLC中的RT：18.35分钟。C186H278N51O73P11S11的UPLC/ESI-MS(HPLC方法1)计算值：5090.0；实测值：5088.9。
实施例37.合成寡核苷酸143((Sp，Sp，Rp，Sp，Sp，Rp，Sp，S p，Rp，Sp，Sp)-d[5mCs1As1Gs1Ts15mCs1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15m Cs1G]((SSR) 3 -SS))
如上所述来合成寡核苷酸143。RP-HPLC(HPLC方法1)中的RT：18.48分钟。C186H278N51O73P11S11的UPLC/ESI-MS计算值：5090.0；实测值：5092.0。
实施例38.合成寡核苷酸144((Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp， Rp，Sp，Rp，Rp)-d[5mCs1As1Gs1Ts15mCs1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15 mCs1G]((RRS) 3 -RR))
如上所述来合成寡核苷酸144。RP-HPLC(HPLC方法1)中的RT：18.02分钟。C186H278N51O73P11S11的UPLC/ESI-MS计算值：5090.0；实测值：5091.4。
实施例39.合成寡核苷酸145(全(Rp)-d[5mCs1Ts15mCs1As1Gs 1Ts15mCs1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15mCs1Gs15mC])
如上所述来合成寡核苷酸145。RP-HPLC(HPLC方法1)中的RT：17.30分钟。C234H352N62O92P14S14的UPLC/ESI-MS计算值：6388.3；实测值：6390.6。
实施例40.合成寡核苷酸146(全(Rp)-d[Gs15mCs1Ts1G])
如上所述来合成寡核苷酸146。RP-HPLC(HPLC方法2)中的RT：15.89分钟。C58H85N18O23P3S3的UPLC/ESI-MS计算值：1591.5；实测值：1590.8。
实施例41.合成寡核苷酸147(全(Rp)-d[5mCs1As1Gs1T])
如上所述来合成寡核苷酸147。RP-HPLC(HPLC方法2)中的RT：16.30分钟。C58H85N18O22P3S3的UPLC/ESI-MS计算值：1575.5；实测值：1575.2。
实施例42.合成寡核苷酸148(全(Rp)-d[5mCs2As2Gs2Ts25mCs 2Ts2Gs25mCs2Ts2Ts25mCs2G])
使用实施例22中的硫化试剂，如上所述来合成寡核苷酸148。RP-HPLC(HPLC方法3)中的RT：16.51分钟。C153H223N40O73P11S11的UPLC/ESI-MS计算值：4484.1；实测值：4483.0。
实施例43.合成寡核苷酸149(全(Rp)-d[5mCs4As4Gs4Ts45mCs 4Ts4Gs45mCs4Ts4Ts45mCs4G])
使用实施例24中的硫化试剂，如上所述来合成寡核苷酸149。RP-HPLC(HPLC方法4)中的RT：17.87分钟。C252H388N51O95P11S11的UPLC/ESI-MS计算值：6345.6；实测值：6346.5。
合成包含不同核苷酸间键联的手性控制的嵌合寡核苷酸
如以上以及本文中一般所述，在一些实施方案中，本发明提供包含不同核苷酸问键联的手性控制的寡核苷酸。以下非限制性实例说明所述手性控制的寡核苷酸以及其合成方法。
实施例44-45说明包含不同核苷酸问键联的手性控制的嵌合寡核苷酸的合成。根据表E-12中概述的循环，使用1μmol合成管柱和HCP上的1.5μmol草酰基连接的dT，在ABI-394DNA/RNA合成仪上合成含有混合非对映异构纯吗啉代乙基硫代磷酸三酯/硫代磷酸二酯核苷酸间键联的寡核苷酸。因为各迭代循环允许不同硫化试剂进行反应，所以使用两种不同硫代磺酸酯。伴随末端5′-O-DMTr基团的移除(DMT去除)来进行合成。固体载体用无水ACN洗涤，并且在氩气流下干燥。接着在室温下用1，5-二氮杂双环(4.3.0)壬-5-烯(DBN)于无水ACN-三甲基硅烷基氯化物-16：1(v/v)中的5mL 1M无水溶液处理干燥固体载体10分钟。借助于固定于管柱出口的塑料鲁尔注射器来使DBN溶液缓慢推进穿过管柱。载体接着用无水ACN洗涤，并且在真空下干燥。将干燥HCP放置在塑料小瓶中，并且在室温下用1mL含无水丙胺的无水吡啶(以1∶4比率)处理18小时的时期。接着蒸发溶剂，并且用pH约1.5的含有10％DMSO的水溶液再悬浮残余物，并且滤除HCP载体。粗产物通过反相制备型HPLC(含5至65％ACN的20mM磷酸钠缓冲液梯度，pH＝6.0)加以纯化。汇合纯度高于95％的洗脱份，浓缩，并且通过反相HPLC(0至80％ACN的梯度)来脱盐。自水冻干最终脱盐产物。
表E-12.在DNA/RNA合成仪ABI-394上进行的用于合成实施例44-45的寡核苷酸合成的概述。
实施例44.合成寡核苷酸150(全(Rp)-d[TsCs1AsT])
如上所述来合成寡核苷酸150。RP-HPLC(HPLC方法2)中的RT：12.72分钟。C45H62N13O21P3S3的UPLC/ESI-MS计算值：1310.2；实测值：1309.2
实施例45.合成寡核苷酸151(全(Sp)-d[Cs1AsGs1T])
如上所述来合成寡核苷酸151。RP-HPLC(HPLC方法2)中的RT：14.71分钟。C51H72N17O21P3S3的UPLC/ESI-MS计算值：1448.4；实测值：1446.9。
实施例46描述包含磷酸二酯核苷酸问键联与修饰的核苷酸问键联两者的手性控制的嵌合寡核苷酸的合成。根据表E-13中概述的循环，使用1μmol合成管柱和HCP上的1.5μmol草酰基连接的dT，在ABI-394DNA/RNA合成仪上合成含有混合吗啉代乙基硫代磷酸三酯/磷酸二酯核苷酸问键联的示例性寡核苷酸。因为各迭代循环允许不同硫化或氧化试剂进行反应，所以一种硫代磺酸酯试剂用于在一个循环中进行硫化，并且碘促进的氧化用于另一循环中。伴随末端5′-O-DMTr基团的移除(DMT去除)来进行合成。固体载体用无水ACN洗涤，并且在氩气流下干燥。将干燥HCP放置在塑料小瓶中，并且在室温下用1mL含无水丙胺的无水吡啶(以1∶4比率)处理18小时的时期。接着蒸发溶剂，并且用pH约1.5的含有10％DMSO的水溶液再悬浮残余物，并且滤除HCP载体。粗产物通过反相制备型HPLC(含5至65％ACN的20mM磷酸钠缓冲液梯度，pH＝6.0)加以纯化。汇合纯度高于95％的洗脱份，浓缩，并且通过反相HPLC(0至80％ACN的梯度)来脱盐。自水冻干最终脱盐产物。
表E-13.在DNA/RNA合成仪ABI-394上进行的用于合成实施例46的寡核苷酸合成的概述。
实施例46.合成寡核苷酸152(全(Sp)-d[Cs1AGs1T])
如上所述来合成寡核苷酸152。RP-HPLC(HPLC方法2)中的RT：13.42分钟。C51H72N17O22P3S2的UPLC/ESI-MS计算值：1432.3；实测值：1431.7。
实施例47描述包含磷酸二酯核苷酸问键联以及修饰的手性纯磷酸三酯与磷酸二酯核苷酸问键联两者的手性控制的嵌合寡核苷酸的合成。根据表E-14中概述的循环，使用1μmol合成管柱和HCP上的1.5μmol草酰基连接的dT，在ABI-394DNA/RNA合成仪上合成含有混合吗啉代乙基硫代磷酸三酯/磷酸二酯/硫代磷酸二酯键联的手性控制的寡核苷酸。因为各迭代循环允许不同硫化或氧化试剂进行反应，所以两种不同硫代磺酸酯试剂用于两个不同硫化循环，并且碘促进的氧化用于另一循环。伴随末端5′-O-DMTr基团的移除(DMT去除)来进行合成。固体载体用无水ACN洗涤，并且在氩气流下干燥。接着在室温下用1，5-二氮杂双环(4.3.0)壬-5-烯(DBN)于无水ACN-三甲基硅烷基氯化物-16∶1(v/v)中的5mL 1M无水溶液处理干燥固体载体10分钟。借助于固定于管柱出口的塑料鲁尔注射器来使DBN溶液缓慢推进穿过管柱。载体接着用无水ACN洗涤，并且在真空下干燥。将干燥HCP放置在塑料小瓶中，并且在室温下用1mL含无水丙胺的无水吡啶(以1∶4比率)处理18小时的时期。接着蒸发溶剂，并且用pH约1.5的含有10％DMSO的水溶液再悬浮残余物，并且滤除HCP载体。粗产物通过反相制备型HPLC(含5至65％ACN的20mM磷酸钠缓冲液梯度，pH＝6.0)加以纯化。汇合纯度高于95％的洗脱份，浓缩，并且通过反相HPLC(0至80％ACN的梯度)来脱盐。自水冻干最终脱盐产物。
表E-14.在DNA/RNA合成仪ABI-394上进行的用于合成实施例47的寡核苷酸合成的概述。
实施例47.合成寡核苷酸153(全(Sp)-d[CAs1GsT])。
如上所述来合成寡核苷酸153。RP-HPLC(HPLC方法2)中的RT：11.48分钟。C45H61N16O21P3S2的UPLC/ESI-MS计算值：1318.1；实测值：1318.1。
如本领域技术人员将了解，遵循实施例46和47以及本文所述的其它实施例和方法，可制备较长嵌合手性控制的寡核苷酸。
手性纯寡核苷酸具有不同于由非立体特异性合成获得的非对映异构体的混合物的性质
如以上以及本文中所述，在一些实施方案中，本申请提供具有不同于具有相同碱基序列，但通过非立体特异性寡核苷酸合成加以合成的非对映异构体的混合物的化学和生物性质的手性纯寡核苷酸。
实施例48.手性纯寡核苷酸以及由非立体特异性合成获得的非 对映异构体的混合物的HPLC图谱。
利用相同RP-HPLC条件来分析手性纯硫代磷酸二酯寡核苷酸A(完全RP，寡核苷酸101)和B(完全SP，寡核苷酸102)以及通过标准非立体特异性寡核苷酸合成制备的非立体特异性C(立体无规硫代磷酸二酯核苷酸间键联)，并且在图2上表示相应HPLC迹线。
如图2中所明确证明，硫代磷酸二酯20聚体寡核苷酸的立体化学影响它们的行为，如通过RP-HPLC和IEX-HPLC所确定。在不意图受理论限制下，观察到通过RP-HPLC和IEX-HPLC获得的保留时间(RT)之间的关联，因为RT趋势是保守的。完全RP立体异构体(A)的保留短于完全SP立体异构体(B)，而作为所有219种立体异构体的混合物的立体无规硫代磷酸二酯寡核苷酸(C)具有在极端完全RP和完全SP非对映异构体之间洗脱的宽HPLC峰。
如本领域技术人员将了解，于此呈现的数据确认描绘的比较具有相同序列的不同手性控制或未手性控制(立体无规)的寡核苷酸组合物的分析显示例示的未手性控制的寡核苷酸组合物(即如通过非手性控制的寡核苷酸合成来制备)仅包括极低水平的某些寡核苷酸类型，如完全Rp或Sp类型。
实施例49.热变性实验(Tm)。
将各DNA链与互补RNA以于1×PBS中0.5μM的等摩尔浓度进行混合。制备各双链体的总计2.5mL溶液，并且在90℃下加热混合物2分钟，并且历经数小时的过程使其冷却。接着将混合物在4℃下储存2小时。使用配备有珀耳帖元件(Peltier unit)的Perkin Elmer UV分光光度计，以每分钟升高0.5℃使温度梯度自15℃起始直至90℃，在0.5分钟间隔下记录254nm下的吸光度。相对于温度将254nm吸光度绘图，并且由各曲线的相应一阶导数计算Tm值。
图3说明两种立体纯非对映异构体硫代磷酸酯寡核苷酸(完全RP20聚体A和完全SP20聚体B)与立体无规硫代磷酸酯寡核苷酸(C)之间的Tm差异。当相较于相对完全SP非对映异构体与立体无规20聚体两者时，完全RP硫代磷酸酯DNA显示对互补RNA的亲和力较高。
下表E-15概述手性控制的寡核苷酸与立体无规寡核苷酸之间的差异。
表E-15.手性控制的寡核苷酸与立体无规寡核苷酸之间的差异。
实施例50.手性纯寡核苷酸的生物活性
在检查OD之后，将所有寡核苷酸候选分子稀释至起始浓度20μM。使用Hep3B细胞(目录号HB-8064TM)，利用转脂胺2000(Life Technologies，目录号11668-019)转染试剂在96孔板中建立多剂量正向转染实验。
转染方案：
每孔接种2×104个Hep3B细胞，并且在37℃下在CO2孵育器中于100μl含有10％FBS和1％Glutamax I(Life Technologies，目录号35050061)的无抗生素MEM培养基(Life Technologies，目录号11095098)中孵育24小时。在不含核酸酶的水中建立12个稀释度(表E-16)。
表E-16.寡核苷酸转染储备物板的浓度。
稀释度 1 2 3 4 5 6
以μM计 20 10 3.33333 1.11111 0.37037 0.12346
稀释度 7 8 9 10 11 12
以μM计 0.04115 0.01372 0.00457 0.00152 0.00051 0.00017
对于各孔，将0.5μL转脂胺2000与9.5μL Opti MEM I降血清培养基(Life Technologies，目录号31985062)混合，并且孵育5分钟。在孵育之后，通过温和吸移来将10μL各候选物在报道的浓度下与稀释的转脂胺2000混合。接着在室温下孵育混合物20分钟以使复合物形成。在这个时间期间，用80μL如先前所述的新鲜无抗生素MEM替换细胞生长培养基。将20μL脂质-寡聚物复合物温和混合至各孔中，从而使得总体积达到100μL。接着在37℃下在CO2孵育器中孵育细胞24小时。
RNA提取：
在孵育24小时之后，移除细胞生长培养基移除，并且不加修改地根据试剂盒手册中提供的说明书，使用Dynabeads mRNA Direct试剂盒(Life Technologies，目录号61012)提取RNA。这个磁性寡聚物(dT)25珠粒系统允许在绕过DNA酶处理下对(聚腺苷酸)RNA进行成本有效以及强力高通量提取。将RNA洗脱于不含核酸酶的水中，并且储存在-80℃下。
cDNA合成：
使用用RNA酶抑制剂进行的试剂盒方案，10μL RNA用于利用高容量cDNA反转录试剂盒(Life Technologies，目录号4374967)进行的20μL cDNA合成反应中。以96孔形式在C1000 Touch热循环仪(Biorad，目录号185-1196EDU)上进行反转录。
基因表达分析：
通过使用480SYBR Green I Master(Roche，目录号04707516001)在LightCycler 480实时PCR仪器上进行定量PCR来测量基因表达。设计靶标脂蛋白元B(Apo B)(NM_000384)和内源性对照甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(NM_002046)的智人序列的引物，并且自IDT订购(表E-17)。
表E-17.用于基因表达定量的HPLC纯化引物的序列。
使用来自同一cDNA模板的材料，在单独孔中对靶标和内源性对照进行测量。如SYBR Green I Master方案中所述来建立SYBR green测定PCR条件(表E-18)。
表E-18：用于SYBR green测定的实时PCR条件。
解链曲线分析显示各引物对的单一扩增子峰(图4)。
数据是3个生物平行测定的结果。所有样本都与天然未转染对照进行比较。当通过使用SYBR green进行实时PCR来评估基因表达时，观察到以下结果(表E-19，图5)。
表E-19.通过SYBR green评估的完整IC50数据。
在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸显示IC50低于8nM。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸显示IC50低于7nM。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸显示IC50低于6nM。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸显示IC50低于5nM。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸显示IC50低于4nM。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸显示IC50低于3nM。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸显示IC50低于2nM。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸显示IC50在0.5-8nM的范围内。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸显示IC50在1-4nM的范围内。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸显示IC50在1.5-3nM的范围内。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸显示IC50在1.5-2nM的范围内。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸显示IC50在0.5-2nM的范围内。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸显示IC50在1-2.5nM的范围内。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸显示IC50在1.5-3nM的范围内。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸显示IC50在2.5-5nM的范围内。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸显示IC50在3-6nM的范围内。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸显示IC50在5-8nM的范围内。在一些实施方案中，提供的手性控制的寡核苷酸显示IC50在介于上边界与下边界之间的范围内。在一些所述实施方案中，上边界是8、5、4或3nM。在一些所述实施方案中，下边界是1、1.5、2或2.5nM。如可参照实施例所见，本公开明确例示显示代表性所述IC50值的各种手性控制的寡核苷酸或手性控制的寡核苷酸组合物。
表E-19说明当以手性控制的形式测试时，某些手性控制的寡核苷酸/寡核苷酸组合物比相应立体无规寡核苷酸混合物更强力(寡核苷酸105、109、115和116相较于寡核苷酸118)；它们也比作为立体无规寡核苷酸混合物的米泊美生更具活性(寡核苷酸104、105、106、107、109、115和116相较于120)。
其它手性控制的制备
实施例51.制备手性控制的寡核苷酸制剂
本实施例描述如本文所述的某些寡核苷酸的多种特定手性控制的组合物的制备。具体来说，本实施例描述利用装载的lcaa-CPG-500制备寡核苷酸。
将N4-Bz-5′-O-DMTr-2′-O-MOE-5mC(1)(4.0g，5.5mmol)溶解于无水DCM(20mL)中，并且与2当量丁二酸酐(1.1g，11.1mmol)和3当量4-N，N-二甲基氨基吡啶(2.0g，16.6mmol)混合。在室温下在氩气下搅拌反应。在如通过TLC所确定，起始材料完全消耗(1小时)之后，蒸发溶剂至干燥，将粗残余物溶解于含有1％三乙胺的DCM中，接着通过使用含0-2％MeOH的含有2％三乙胺的DCM梯度进行的快速硅胶色谱法加以纯化。在蒸发之后，纯化合物(2)的产量是4.5g，88％。将所得3′-O-丁二酸酯(2)(0.92g，1.0mmol)、N，N-二异丙基乙胺(0.82ml，5.0mmol)和CPG-500(10g)溶解于DMF(50mL)中，接着添加HBTU(0.42g，1.1mmol)。振荡混合物2小时，接着过滤。载体依次用DMF、MeOH和最后DCM洗涤，接着真空干燥。三苯甲基阳离子分析(在504nm下监测)显示核苷在载体(3)上的装载量是63μmol/g。
根据表E-20中概述的循环，使用装载有2.0g(126μmol)未加帽丁二酰基连接的N4-Bz-5′-O-DMTr-2′-O-MOE-5mC(63μmol/g，来自Glen Research的lcaa CPG-500)的MM-6-200合成管柱(BioAutomation)，在MerMade-12DNA/RNA合成仪(BioAutomation)上合成含有立体确定的嵌合脱氧和2′-O-MOE硫代磷酸三酯核苷酸间键联的寡核苷酸的手性控制的组合物。伴随初步加帽步骤(加帽2)，并且不移除最终末端5′-O-DMTr寡核苷酸基团(DMT存在)来进行寡核苷酸合成循环。在相应手性磷酰胺的偶联和两步加帽过程之后，使用0.3M S-(2-氰基乙基)硫代磺酸甲酯试剂来进行立体特异性硫化步骤(表E-20)。
一旦在保持最终5′-O-DMTr基团下完成自动寡核苷酸合成循环，将合成管柱自DNA/RNA合成仪去除，并且在真空下干燥。将干燥载体转移至空玻璃手动肽合成仪上，并且在不停止在手动肽合成仪中的流动下使40mL 0.5M 1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、0.25MN，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)于ACN中的溶液连续穿过载体5分钟。载体用50％Py/ACN洗涤，并且用氩气流干燥1秒。接着，将载体转移至空螺旋帽塑料小瓶中，并且在60℃下用5％EtOH/浓NH3(20mL)处理6小时，并且在室温下放置12小时。通过过滤来移除载体，并且用浓NH3洗涤。真空干燥滤液，接着将所得物溶解于50mM TEAA(120mL)中。当溶液中存在悬浮物时，进行进一步过滤。将溶液装载在Sep-Pak柱筒(Waters，Sep-Pak Vac 35cc(10g)C18柱筒)上。柱筒用20％ACN/50mM TEAA(70mL)洗涤以移除所有加帽的截短序列，并且用50％ACN/含有0.5％浓NH3的水(50mL)洗涤以洗脱DMT存在的全长寡核苷酸。真空干燥含有DMT存在的寡核苷酸的溶液，接着用50mM TEAA(120mL)稀释，并且装载于另一Sep-Pak柱筒(Waters，Sep-Pak Vac 35cc(10g)C18柱筒)上。柱筒依次用milli Q水(50mL)、2％TFA/水(50mL)和水(50mL)洗涤。DMT去除的寡核苷酸用50％ACN/含有0.5％浓NH3的水(50mL)洗脱。
表E-20.在DNA/RNA合成仪MerMade 12上进行的用于手性控制的合成的寡核苷酸合成的概述。
合成寡核苷酸ONT-75(全(Rp))-Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC
合成寡核苷酸ONT-80(全(Sp))-Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC
合成寡核苷酸ONT-77(Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Rp，Rp，Rp，Rp)-Gs5mCs5mCsTs5mCsAs GsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC(5R-10S-4R)
合成寡核苷酸ONT-81(Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Sp，Sp，Sp，Sp)-Gs5mCs5mCsTs5mCsAs GsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC(5S-10R-4S)
合成寡核苷酸ONT-87(Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Sp，Sp，Rp，Sp，Sp，Rp，Sp，Sp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp)-Gs5mCs5mCsTs5mCsAs GsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC(5R-(SSR)3-5R)
合成寡核苷酸ONT-88(Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Rp，Rp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp)-Gs5mCs5mCsTs5mCsAs GsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC(5S-(RRS)3-5S)
合成寡核苷酸ONT-89(Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp)-Gs5mCs5mCsTs5mCsAs GsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC((SR)9S)
合成寡核苷酸ONT-82(全(Rp))-GsTs5mCs5mCs5mCsTsGsAsAsGsAsTsGsTs5mCsAsAsTsGs5mC
合成寡核苷酸ONT-84(全(Sp))-GsTs5mCs5mCs5mCsTsGsAsAsGsAsTsGsTs5mCsAsAsTsGs5mC
合成寡核苷酸ONT-85(Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Rp，Rp，Rp，Rp)-GsTs5mCs5mCs5mCsTsGsAsAsGsAsTsGsTs5mCsAsAsTsGs5mC(5R-10S-4R)
合成寡核苷酸ONT-86(Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Sp，Sp，Sp，Sp)-GsTs5mCs5mCs5mCsTsGsAsAsGsAsTsGsTs5mCsAsAsTsGs5mC(5S-10R-4S)
实施例52：用于分析DMT存在的粗寡核苷酸和DMT去除的纯 化寡核苷酸的一般性RP-HPLC方法
本实施例描述通过如本文所述的手性控制的合成来制备的粗寡核苷酸组合物和纯化寡核苷酸组合物的RP-HPLC分析。
缓冲液A：50mM TEAA，pH 7.0
缓冲液B：ACN
管柱：XBridge C18，3.5μm，C18，4.6x50mm，零件号186003034
管柱温度＝50℃
在254和280nm下监测信号
使用的梯度：
实施例53：用于分析DMT存在的粗寡核苷酸和DMT去除的纯 化寡核苷酸的一般性IEX-HPLC方法
本实施例描述通过如本文所述的手性控制的合成来制备的粗寡核苷酸组合物和纯化寡核苷酸组合物的IEX-HPLC分析。
缓冲液A：10mM TrisHCl，50％ACN，pH 8.0
缓冲液B：10mM TrisHCl，800mM NaClO4，50％ACN，pH 8.0
管柱：DIONEX，DNAPac，PA-100，分析型，4.0x250mm，零件号063000
管柱温度＝60℃
在254和280nm下监测信号
使用的梯度：
实施例54：用于分析DMT去除的纯化寡核苷酸的一般性 UPLC-LCMS方法
本实施例描述通过如本文所述的手性控制的合成来制备的纯化寡核苷酸组合物的UPLC-LCMS分析。
缓冲液A：15mM TEA，400mM HFIP，水
缓冲液B：50∶50缓冲液A/甲醇
管柱：UPLCOST C181.7μm，2.1×500mm
管柱温度＝50℃
使用的梯度：
实施例55：用于纯化DMT去除的粗寡核苷酸的一般性 IEX-HPLC方法
本实施例描述通过如本文所述的手性控制的合成来制备的粗寡核苷酸组合物的IEX-HPLC纯化。
缓冲液A：20mM NaOH，pH 11.0
缓冲液B：20mM NaOH，2.5M NaCl，pH 11.0
管柱：空管柱Waters AP-2(Waters)，用Source 15Q载体(GEHealthcare)内部定制装填。装填个别纯化管柱，并且用于不同立体纯寡核苷酸。
仪器：AKTA纯化器，配备有P-900泵、UPC-900检测器和50mL注射超容量环(GE Healthcare)
设置的缓冲液加热器温度＝70℃
在254nm下监测信号
洗脱份体积：5mL
使用的梯度：
通过使用上述分析条件和梯度进行分析型IEX-HPLC来个别地分析收集的洗脱份。汇合纯洗脱份以提供纯度是95％以及95％以上的纯化物质，如通过254nm UV吸光度图谱所确定。
表E-21.如实施例XX中所述合成的立体纯硫代磷酸酯寡核苷酸的物理化学性质的汇编。
序列A：人ApoB序列5′-Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC-3′。
序列B：小鼠ApoB序列5′-GsTs5mCs5mCs5mCsTsGsAsAsGsAsTsGsTs5mCsAs AsTsGs5mC-3′。
加下划线的核苷酸表示2′-O-MOE。s＝硫代磷酸酯键联。5mC＝5-甲基-2′-脱氧胞苷。5mC＝5-甲基-2′-O-MOE-胞苷。立体构造描述寡核苷酸的给定硫代磷酸酯键联中的各磷原子的立体异构体性质(Rp/Sp)。使用用于纯化化合物的相应分析方法(上述)获得IEX-HPLC中的保留时间(tR)和实测分子量(MW)值。
实施例56：用于重叠分析DMT去除的纯化寡核苷酸的一般性 RP-HPLC方法
本实施例描述通过如本文所述的手性控制的合成来制备的纯化寡核苷酸组合物的RP-HPLC分析。
缓冲液A：50mM TEAA，pH 7.0
缓冲液B：ACN
管柱：XBridge C18，3.5μm，C18，4.6×50mm
管柱温度＝50℃
在254和280nm下监测信号
使用的梯度：
图37的图幅A是DMT去除的纯化寡核苷酸ONT-75、ONT-77、ONT-80、ONT-81、ONT-87、ONT-88、ONT-89和ONT-41(非对映异构混合物)-Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5 mCsAs 5mCs5mC的RP-HPLC迹线的重叠图。
图37的图幅B显示图幅A的扩展视图，其中各曲线如下加以标记：
曲线编号 寡核苷酸
1 非对映异构混合物(ONT-41)
2 全Rp(ONT-75)
3 5R-(SSR)3-5R(ONT-87)
4 (SR)9-S(ONT-89)
5 5R-10S-4R(ONT-77)
6 5S-10R-4S(ONT-81)
7 5S-(RRS)3-5S(ONT-88)
8 全Sp(ONT-80)
图38的图幅A是DMT去除的纯化寡核苷酸ONT-82、ONT-84、ONT-85、ONT-86和ONT-83(非对映异构混合物)-GsTs5mCs5mCs5m CsTsGsAsAsGsAsTsGsTs5mCsAsAsTsGs5mC的RP-HPLC的重叠图
图38的图幅B显示图幅A的扩展视图，其中各曲线如下加以标记：
曲线编号 寡核苷酸
1 非对映异构混合物(ONT-83)
2 全Rp(ONT-82)
3 5S-10R-4S(ONT-86)
4 5R-10S-4R(ONT-85)
5 全Sp(ONT-84)
实施例57：热变性实验(Tm)
本实施例描述使用热变性表征手性控制的寡核苷酸组合物。
将各DNA链与它的互补RNA链以于1×PBS中1μM的等摩尔浓度进行混合。制备各双链体的总计3mL溶液，并且在90℃下加热混合物2分钟，并且历经数小时的过程使其冷却。接着将混合物在4℃下储存2小时。使用Cary100系列(Agilent Technologies)，以每分钟升高0.5℃使温度梯度自15.0℃起始直至95.0℃，在0.5分钟间隔下记录254nm下的吸光度。相对于温度将254nm吸光度绘图，并且由各曲线的相应一阶导数计算Tm值。
图39呈现手性控制的寡核苷酸和立体无规寡核苷酸的Tm重叠图。
图39说明四种立体纯非对映异构体硫代磷酸酯寡核苷酸(全Rp20聚体、全Sp 20聚体、5R-10S-4R和5S-10R-4S间隔聚体)与立体无规硫代磷酸酯寡核苷酸之间的Tm差异。当相较于具有最低亲和力的完全Sp 20聚体(Tm＝75.1℃)时，完全Rp硫代磷酸酯DNA显示对互补RNA的亲和力最高(Tm＝85.1℃)。5R-10S-4R和5S-10R-4S间隔聚体和立体无规硫代磷酸酯寡核苷酸都显示中间值(Tm范围＝80.1-81.2℃)。
下表E-22给出研究的具有人ApoB序列5′-Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC-3′的研究的立体纯和立体无规硫代磷酸酯寡核苷酸的Tm值，所述序列在硫代磷酸酯骨架上具有各种立体化学构造。
表E-22
实施例58：制备靶向PCSK9的示例性手性控制的siRNA寡核 苷酸
原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/克欣蛋白酶9型(PCSK9)是一种涉及于胆固醇代谢中的酶。PCSK9结合低密度脂蛋白(LDL)的受体，从而触发它的破坏。尽管当受体被破坏时，与受体缔合的LDL也被消除，但PCSK9结合的净作用实际上增加LDL水平，因为受体将另外循环回细胞表面，并且移除更多胆固醇。
若干公司正在开发靶向PCSK9的治疗剂。与本公开特别相关的是Isis Pharmaceuticals、Santaris Pharma和Alnylam Pharmaceuticals各自正在开发抑制PCSK9的核酸药剂。Isis Pharmaceuticals的产品(一种反义寡核苷酸)已显示在小鼠中会增加LDLR的表达，并且降低循环总胆固醇水平(Graham等″Antisense inhibition of proproteinconvertase subtilisin/kexin type 9reduces serum LDL in hyperlipidemicmice″.J.Lipid Res.48(4)：763-7，2007年4月)。AlnylamPharmaceuticals产品ALN-PCS的初始临床试验揭示RNA干扰提供一种用于抑制PCSK9的有效机制(Frank-Kamenetsky等″TherapeuticRNAi targeting PCSK9acutely lowers plasma cholesterol in rodents andLDL cholesterol in nonhuman primates″.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105(33)：11915-20，2008年8月)。
本实施例描述制备多种针对PCSK9的手性控制的或立体无规siRNA药剂。具体来说，这个实施例描述制备如下表E-23中说明的各以下寡核苷酸组合物：
表E-23：
ONT编号 序列 类型
ONT-106 (Rp)-uucuAGAccuGuuuuGcuudTsdT PCSK9有义
ONT-107 (Sp)-uucuAGAccuGuuuuGcuudTsdT PCSK9有义
ONT-108 (Rp)-AAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT PCSK9反义
ONT-109 (Sp)-AAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT PCSK9反义
ONT-110 (Rp，Rp)-asAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT PCSK9反义
ONT-111 (Sp，Rp)-asGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT PCSK9反义
ONT-112 (Sp，Sp)-asGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT PCSK9反义
ONT-113 (Rp，Sp)-asGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT PCSK9反义
注意：小写字母表示2’OMe RNA残基；大写字母表示2’OH RNA残基；并且粗体和斜体“s”指示硫代磷酸酯部分。
根据以下反应制备用于制备这些寡核苷酸的Lcaa-CPG-500：
具体来说，将5′-O-DMTr-2′-脱氧胸苷(1)(4.28g，7.86mmol)溶解于无水DCM(50mL)中，并且与2当量丁二酸酐(1.57g，15.7mmol)和3当量4-N，N-二甲基氨基吡啶(2.88g，23.6mmol)混合。在室温下在氩气下搅拌反应。在如通过TLC所确定，起始材料完全消耗(1小时)之后，蒸发溶剂至干燥，将粗残余物溶解于含有1％三乙胺的DCM中，接着通过使用含0-2％MeOH的含有2％三乙胺的DCM梯度进行的快速硅胶色谱法加以纯化。在蒸发之后，纯化合物(2)的产量是5.5g，94％。将所得5′-O-DMTr-2′-脱氧胸苷-3′-O-丁二酸酯(2)(0.60g，0.81mmol)、N，N-二异丙基乙胺(0.71mL，4.02mmol)和CPG-500(10g)溶解于DMF(50mL)中，接着添加HBTU(0.37g，0.97mmol)。振荡混合物2小时，接着过滤。载体依次用DMF、MeOH和DCM洗涤，接着真空干燥。三苯甲基阳离子分析(在504nm下监测)显示核苷在载体(3)上的装载量是38μmol/g。
分别根据表E-24和表E-25中概述的循环，使用装载有130mg(4.9μmol)丁二酰基连接的5′-O-DMTr-2′-脱氧胸苷(38μmol/g)的10μmol容量合成管柱，在ABI 394 DNA/RNA合成仪上合成如上在表E-23中指示含有2′-OH和2′-OMe磷酸二酯以及立体确定的2′-脱氧和2′-OMe硫代磷酸二酯核苷酸间键联的各寡核苷酸。在合成之前，进行初步加帽步骤(加帽2)，并且以移除末端5′-O-DMTr基团来终止合成。使用可商购获得的叔丁基氢过氧化物(TBHP)于癸烷中的5-6M溶液来进行氧化步骤，接着用四份二氯甲烷稀释。在相应手性磷酰胺的偶联和两步加帽过程之后，使用0.3MS-氰基乙基硫代磺酸甲酯试剂来进行立体特异性硫化步骤(表E-25)。
一旦完成自动寡核苷酸合成循环，并且移除最终5′-O-DMTr基团，将合成管柱自DNA/RNA合成仪去除，并且在真空下干燥。使用连接于合成管柱的一个末端的注射器，在不停止流动下，穿过合成管柱连续添加10mL 0.5M 1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、0.25MN，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)于ACN中的溶液至载体，持续1分钟。载体接着用无水ACN洗涤，并且在真空下干燥。接着，将干燥载体转移至空螺旋帽塑料小瓶中，并且在60℃下用40％MeNH2水溶液(0.5mL)处理10分钟。在那之后，立刻冷却小瓶，并且在用DMSO(0.5mL)稀释之后，通过过滤移除载体，再次用DMSO(1mL)洗涤并过滤。冷却滤液，并且接着立刻在60℃下用3HF·Et3N(0.75mL)处理10分钟，然后立刻冷冻，并且储存在4℃下，随后进行纯化。
表E-24.在DNA/RNA合成仪ABI 394上进行的寡核苷酸合成的概述(2′-O-TBDMS和2′-OMe取代的RNA循环)
表E-25.在DNA/RNA合成仪ABI 394上进行的寡核苷酸合成的概述(立体确定的硫代磷酸酯2′-脱氧和2′-OMe RNA循环)
实施例59.用于分析DMT去除的粗RNA寡核苷酸和DMT去 除的纯化RNA寡核苷酸的一般性IEX-HPLC方法。
缓冲液A：20mM磷酸钠，pH 11.0
缓冲液B：20mM磷酸钠，1M NaBr，pH 11.0
管柱：DIONEX，DNAPac，PA-100，分析型，4.0×250mm
管柱温度＝60℃
在254和280nm下监测信号
使用的梯度：
实施例60.用于分析DMT去除的纯化RNA寡核苷酸的一般性 UPLC-LCMS方法。
缓冲液A：15mM TEA，400mM HFIP，水
缓冲液B：50∶50缓冲液A/甲醇
管柱：UPLCOST C181.7μm，2.1×500mm
管柱温度＝50℃
使用的梯度：
实施例61.用于纯化DMTr去除的粗RNA寡核苷酸的一般性 IEX-HPLC方法。
缓冲液A：20mM磷酸钠，pH 8.5
缓冲液B：20mM磷酸钠，1M NaBr，pH 8.5
管柱：空管柱Waters AP-2(Waters)，用Source 15Q载体(GEHealthcare)内部定制装填。相同纯化管柱用于不同立体纯寡核苷酸。
仪器：配备有2525二元梯度模块、2487双吸光度检测器和20mLFlex注射器(Waters)的Waters HPLC单元。
设置的缓冲液加热器温度＝70℃
在254nm和280nm下监测信号
洗脱份体积：4.5mL
使用的梯度：
通过使用上述分析条件和梯度进行分析型IEX-HPLC来个别地分析收集的洗脱份。汇合纯洗脱份以提供纯度是95％以及95％以上的纯化物质，如通过254nm UV吸光度图谱所确定。
实施例62.用于使纯化RNA寡核苷酸脱盐的一般性 RP-Sep-Pak方法。
将汇合的纯洗脱份的溶液装载在用水预先调节的Sep-Pak柱筒(Waters，Sep-Pak Vac 35cc(10g)C18柱筒)上。在装载样本(100mL)之后，柱筒用milli Q水(50mL)洗涤以移除所有盐，并且接着用50％ACN/水洗涤以洗脱全长脱盐RNA寡核苷酸。真空浓缩收集的溶液至5mL体积，并且自水冻干。
实施例63：使用手性控制的寡核苷酸链制备双链siRNA剂
本实施例描述通过使如上所述的手性控制的寡核苷酸链热退火来制备双链siRNA剂。
将各RNA链与它的互补RNA链以于1×PBS中10μM的等摩尔浓度进行混合。制备各双链体的总计0.5mL溶液，并且在90℃下加热混合物2分钟，并且历经数小时的过程使其冷却。接着将混合物在4℃下储存。利用的RNA链的物理化学性质以下呈现于表E-26中。
表E-26.
使用的寡核苷酸序列，人PCSK9siRNA：有义链(S)5′-uucuAGAccuGuuuuGcuudTsdT-3′；反义链1(AS 1)5′-AAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT-3′；反义链2(AS2)5′-asAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT-3′。大写核苷酸：RNA，小写核苷酸2′-OMe，d＝2′-脱氧，s＝硫代磷酸酯。立体构造描述寡核苷酸的给定硫代磷酸酯键联中的各磷原子的立体异构体性质(Rp/Sp绝对构型)。使用用于纯化化合物的相应分析方法(上述)获得实测分子量(MW)值。
图51显示IEX-HPLC图谱的重叠图，其显示立体纯RNA寡核苷酸之间的保留时间差异。
曲线编号 寡核苷酸
1 ONT-109(Sp)
2 ONT-114(非对映异构混合物)
3 ONT-108(Rp)
图52显示IEX-HPLC图谱的重叠图，其显示立体纯RNA寡核苷酸之间的保留时间差异。
曲线编号 寡核苷酸
1 ONT-109(Rp)
2 ONT-114(非对映异构混合物)
3 ONT-107(Sp)
除以上明确例示的所制备的手性控制的siRNA寡核苷酸之外，本发明也提供制备具有若干手性硫代磷酸酯核苷酸间键联和完全手性硫代磷酸酯核苷酸间键联的siRNA双链体。
例如，根据本发明，通过使用具有如2′-O-PivOM(Debart等，Chem.Eur.J.，2008，14，9135)、2′-O-CEM(Ohgi等，Org.Lett.，2005，7，7913；Wada等，J.Org.Chem.，2012，77，7913)、2′-O-TOM(Pitsch等，Helv.Chim.Acta，2001，84，3773)或2′-O-TC(Dellinger等，J.Am.Chem.Soc.，2011，133，11540)的适合2′-OH保护基的适当手性RNA 3′-亚磷酰胺，在RNA寡核苷酸内部引入多个手性硫代磷酸酯键联。可根据本发明制备具有若干手性硫代磷酸酯核苷酸间键联和完全手性硫代磷酸酯核苷酸间键联的各以下人PCSK9 siRNA有义链：
注意：小写字母表示2’-OMe RNA残基；大写字母表示RNA残基；d＝2’-脱氧残基；并且“s”指示硫代磷酸酯部分。
具有若干手性硫代磷酸酯核苷酸间键联和完全手性硫代磷酸酯核苷酸间键联的人PCSK9 siRNA反义链的合成实施例。
人PCSK9 siRNA反义链
PCSK9(7) (全(Rp))-AsAsGscsAsAsAsAscsAsGsGsUsCsusAsGsAsAsdTsdT
PCSK9(8) (全(Sp))-AsAsGscsAsAsAsAscsAsGsGsUsCsusAsGsAsAsdTsdT
PCSK9(9) (全(Rp))-AsAGcAAAAcsAsGsGsUsCsusAsGsAsAsdTsdT
PCSK9(10) (全(Sp))-AsAGcAAAAcsAsGsGsUsCsusAsGsAsAsdTsdT
注意：小写字母表示2’-OMe RNA残基；大写字母表示RNA残基；d＝2’-脱氧残基；并且“s”指示硫代磷酸酯部分。
或者或另外，本发明提供制备具有若干手性硫代磷酸酯核苷酸间键联和完全手性硫代磷酸酯核苷酸间键联以及完全修饰的核糖部分的siRNA双链体。
例如，在某些实施方案中，通过使用具有如2′-脱氧基-2′-氟(2′-F)或2′-O-甲基(2′-OMe)的相应所需核糖2′-化学修饰的适当手性RNA3′-亚磷酰胺，在完全核糖修饰的RNA寡核苷酸内部引入多个手性硫代磷酸酯键联。仅举几个例子来说，可制备具有若干手性硫代磷酸酯核苷酸间键联和完全手性硫代磷酸酯核苷酸间键联的各以下人PCSK9 siRNA完全修饰的2′-F/2′-OMe有义链。
注意：小写字母表示2’-OMe RNA残基；大写字母表示2’-F RNA残基；d＝2’-脱氧残基；并且“s”指示硫代磷酸酯部分。
具有若干手性硫代磷酸酯核苷酸间键联和完全手性硫代磷酸酯核苷酸间键联的人PCSK9 siRNA完全修饰的2’-F/2’-OMe反义链的合成实施例。
注意：小写字母表示2’-OMe RNA残基；大写字母表示2’-F RNA残基；d＝2’-脱氧残基；并且“s”指示硫代磷酸酯部分。
为装配双链体，进行siRNA双链体的RNA链热退火和制备。具体来说，将各RNA链与它的互补RNA链以于1×PBS中10μM的等摩尔浓度混合。制备各双链体的总计0.5mL溶液，并且在90℃下加热混合物2分钟，并且历经数小时的过程使其冷却。接着将混合物在4℃下储存。
在热RNA链退火步骤之后，可通过使任何有义链与反义链的任何可能的互补链退火来制备所有可能的siRNA双链体组合。
在于HeLa细胞或Hep3B细胞中转染(例如如本文所述)之后，可体外评估所有制备的siRNA双链体的PCSK9基因沉默性质。根据本发明，可观察到例如在手性硫代磷酸酯骨架键联的数目、位置和/或立体构造方面不同，以及任选在一种或多种其它化学修饰的存在性、水平和或类型方面也不同的不同双链体的不同强力性。
任何或所有siRNA性质，如：核酸酶抗性、细胞渗透、内体逃逸、双链体热力学稳定性、双链体的三维结构、对酶相互作用的各种机制步骤的亲和力、对靶标mRNA的亲和力、特异性脱靶作用、免疫刺激、作用的持续时间、药物动力学等都可由如本文所述的手性硫代磷酸酯骨架键联的立体化学加以调节，并且受其影响。
实施例64.制备手性控制的寡核苷酸制剂
本实施例描述制备其中所述的某些寡核苷酸的多种特定手性控制的组合物。
将N4-乙酰基-5′-O-DMTr-2′-O-甲基胞苷(1)(1.15g，1.91mmol)溶解于无水DCM(20mL)中，并且与2当量丁二酸酐(0.383g，3.82mmol)和3当量4-N，N-二甲基氨基吡啶(0.701g，5.73mmol)混合。在室温下在氩气下搅拌反应。在如通过TLC所确定，起始材料完全消耗(1小时)之后，蒸发溶剂至干燥，将粗残余物溶解于含有1％三乙胺的DCM中，接着通过使用含0-2％MeOH的含有2％三乙胺的DCM梯度进行的快速硅胶色谱法加以纯化。在蒸发之后，纯丁二酰基化合物(2)的产量是1.50g，98％。MS(ESI+ve)：(M+H)+计算值：702.27；实测值：702.34。将所得N4-乙酰基-5′-O-DMTr-3′-O-丁二酰基-2′-O-甲基胞苷(2)(0.18g，0.22mmol)、N，N-二异丙基乙胺(0.18mL，0.79mmol)和GE定制SupportTM Amino(1g)溶解于DMF(5mL)中，接着添加HBTU(0.10g，0.26mmol)。振荡混合物2小时，接着过滤。载体依次用DMF、MeOH和最后DCM洗涤，接着真空干燥。三苯甲基阳离子分析(在504nm下监测)显示核苷在载体(3)上的装载量是180μmol/g。
实施例65.制备手性控制的寡核苷酸制剂
使用与实施例64中所述的程序类似的程序，将N2-苯氧基乙酰基-5′-O-DMTr-3′-O-丁二酰基-2′-O-甲基鸟苷(4，MS(ESI+ve)：(M+H)+计算值：834.30；实测值：834.32)装载于GE定制SupportTM Amino上。三苯甲基阳离子分析(在504nm下监测)显示核苷在载体(6)上的装载量是140μmol/g。
在一些实施方案中，根据表E-27中概述的循环，使用装载有60mg(分别10.8和8.4μmol)未加帽的丁二酰基连接的5′-O-DMTr-2′-O-甲基-GPac(6，140μmol/g)或5′-O-DMTr-2′-O-甲基-CAc(3，180μmol/g)的10μmol容量合成管柱，在ABI 394 DNA/RNA合成仪上合成含有立体确定的2′-OMe硫代磷酸三酯核苷酸间键联的寡核苷酸。伴随初步加帽步骤(加帽2)，并且伴随移除末端5′-O-DMTr基团来进行合成循环。在相应手性磷酰胺的偶联和两步加帽过程之后，使用含0.3MS-(2-氰基乙基)硫代磺酸甲酯试剂的含有BSTFA的ACN来进行立体特异性硫化步骤(表E-27)。
一旦完成自动寡核苷酸合成循环，并且移除最终5′-O-DMTr基团，将合成管柱自DNA/RNA合成仪去除，并且在真空下干燥。将干燥载体转移至空玻璃手动肽合成仪上，并且在不停止在手动肽合成仪中的流动下使10mL 0.5M 1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、0.25M N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)于ACN中的溶液连续添加至载体，持续5分钟。载体用ACN洗涤，并且真空干燥。接着，在60℃下用5％EtOH/浓NH3(5mL)处理载体6小时，并且在室温下放置12小时。通过过滤移除载体，并且用浓NH3洗涤。真空浓缩滤液，接着通过IEX纯化。
表E-27.寡核苷酸合成的概述。
合成寡核苷酸ONT-94：(全(Sp))-gsgsusgsgsasasgsgsc。tR(IEX-HPLC)：18.26分钟。计算MW：3563.9；实测MW：3562.6。
合成寡核苷酸ONT-96：(全(Rp))-gsgsusgsgsasasgsgsc。tR(IEX-HPLC)：18.16分钟。计算MW：3563.9；实测MW：3561.7。
合成寡核苷酸ONT-98：(Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp)-gsgsusgsgsasasgsgsc。tR(IEX-HPLC)：18.05分钟。计算MW：3563.9；实测MW：3562.5。
合成寡核苷酸ONT-100：(Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp)-gsgsusgsgsasasgsgsc。tR(IEX-HPLC)：17.86分钟。计算MW：3563.9；实测MW：3561.1。
合成寡核苷酸ONT-102：(Rp，Rp，Sp，Sp，Sp，Sp，Sp，Rp，Rp)-gsgsusgsgsasasgsgsc。tR(IEX-HPLC)：18.30分钟。计算MW：3563.9；实测MW：3561.3。
合成寡核苷酸ONT-104：(Sp，Sp，Rp，Rp，Rp，Rp，Rp，Sp，Sp)-gsgsusgsgsasasgsgsc。tR(IEX-HPLC)：17.95分钟。计算MW3563.9；实测MW：3562.7。
合成寡核苷酸ONT-95：(全(Sp))-gscscsuscscsasg。tR(IEX-HPLC)：14.78分钟。计算MW：2709.2；实测MW：2707.4。
合成寡核苷酸ONT-97：(全(Rp))-gscscsuscscsasg。tR(IEX-HPLC)：15.60分钟。计算MW：2709.2；实测MW：2708.3。
合成寡核苷酸ONT-99：(Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp)-gscscsuscscsasg。tR(IEX-HPLC)：16.10分钟。计算MW：2709.2；实测MW：2708.0。
合成寡核苷酸ONT-101：(Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp)-gscscsuscscsasg。tR(IEX-HPLC)：16.23分钟。计算MW：2709.2；实测MW：2708.2。
合成寡核苷酸ONT-103：(Rp，Rp，Sp，Sp，Sp，Rp，Rp)-gscscsuscscsasg。tR(IEX-HPLC)：16.26分钟。计算MW：2709.2；实测MW：2707.8。
合成寡核苷酸ONT-105：(Sp，Sp，Rp，Rp，Rp，Sp，Sp)-gscscsuscscsasg。tR(IEX-HPLC)：16.22分钟。计算MW：2709.2；实测MW：2710.0。
以与本文实施例中所述的方式类似的方式在ABI 394DNA/RNA上合成含有立体确定的嵌合2′-OMe硫代磷酸三酯和2′-O-MOE硫代磷酸三酯核苷酸间键联的寡核苷酸。
合成寡核苷酸ONT-90：(全(Rp))-GMOEsGMOEsusGMOEsGMOEsasasGMOEsGMOEsc。tR(IEX-HPLC)：15.35分钟。计算MW：3828.2；实测MW：3826.5。
合成寡核苷酸ONT-119：(全(Sp))-GMOEsGMOEsusGMOEsGMOEsasasGMOEsGMOEsc。tR(IEX-HPLC)：16.42分钟。计算MW：3828.2；实测MW：3827.2。
合成寡核苷酸ONT-91：(全(Rp))-GMOEscscsuscscsasg。tR(IEX-HPLC)：15.69分钟。计算MW：2753.3；实测MW：2751.5。
合成寡核苷酸ONT-120：(全(Sp))-GMOEscscsuscscsasg。tR(IEX-HPLC)：14.71分钟。计算MW：2753.3；实测MW：2751.4。
实施例66.用于分析DMT去除的粗RIPtide寡核苷酸和DMT 去除的纯化RIPtide寡核苷酸的一般性IEX-HPLC方法：
缓冲液A：10mM TrisHCl，50％ACN，pH 8.0
缓冲液B：10mM TrisHCl，800mM NaClO4，50％ACN，pH 8.0
管柱：DIONEX，DNAPac，PA-200，分析型，4.0×250mm
管柱温度＝60℃
在254和280nm下监测信号
使用的梯度：
实施例67.用于分析DMT去除的纯化RIPtide寡核苷酸的一般 性UPLC-LCMS方法：
缓冲液A：15mM TEA，400mM HFIP，水
缓冲液B：50∶50缓冲液A/甲醇
管柱：UPLCOST C181.7μm，2.1×500mm
管柱温度＝50℃
使用的梯度：
实施例68.用于纯化DMT去除的粗RIPtide寡核苷酸的一般性 IEX-HPLC方法：
缓冲液A：20mM NaOH，pH 11.0
缓冲液B：20mM NaOH，2.5M NaCl，pH 11.0
管柱：空管柱Waters AP-1(Waters)，用Source 15Q载体(GEHealthcare)内部定制装填。相同纯化管柱用于不同立体纯RIPtide寡核苷酸。
仪器：AKTA纯化器，配备有P-900泵、UPC-900检测器和50mL注射超容量环(GE Healthcare)
设置的缓冲液加热器温度＝70℃
设置的管柱加热器带＝70℃
在254nm下监测信号
洗脱份体积：5mL
使用的梯度：
通过使用上述分析条件和梯度进行分析型IEX-HPLC来个别地分析收集的洗脱份。汇合纯洗脱份以提供纯度是95％以及95％以上的纯化物质，如通过254nm UV吸光度图谱所确定。
用于使纯化RIPtide寡核苷酸脱盐的一般性RP-Sep-Pak方法。将汇合的纯洗脱份的溶液装载在用水预先调节的Sep-Pak柱筒(Waters，Sep-Pak Vac 35cc(10g)C18柱筒)上。在装载样本(100mL)之后，柱筒用milli Q水(50mL)洗涤以移除所有盐，并且接着用50％ACN/水洗涤以洗脱全长脱盐RNA寡核苷酸。真空浓缩收集的溶液至5mL体积，并且自水冻干。
探究一组结合裸露hTR的立体控制的完全硫代磷酸酯修饰的RIPtide(8聚体或10聚体)对端粒酶RNP复合物的活性的体外抑制。作为TRAP(Shay等，Science，1994，266，2011)的变化形式的Cy5-TRAP测定(Shay等，Nat.Protoc.，2006，1，1583)用于根据先前报道的方案(Verdine等，J.Biol.Chem.，2012，287，18843)，使用HeLa细胞提取物来确定立体控制的硫代磷酸酯RIPtide的IC50值。
遵循使用荧光作为定量系统的先前报道的方案，在进行一些修改下来进行TRAP测定。简要来说，在30℃下进行由端粒酶对荧光人工底物的延伸30分钟，随后以30个PCR循环(34℃30秒，59℃30秒，72℃1分钟)进行扩增。最初使用600pM-60μM浓度范围，在重复实验中评估RIPtide在HeLa细胞提取物中的抑制性潜力。在HeLa、DU145(前列腺癌)和HEK293细胞提取物中重复在浓度范围0.06pM-60μM下，用所选RIPtide进行的实验。这些测定中使用若干对照：阳性对照(未处理的细胞溶解产物)、阴性对照(仅缓冲液、加热失活和RNA酶处理的细胞提取物)和PCR扩增对照(在端粒酶延长之后以及在PCR之前添加的60μM RIPtide)。在某些实施方案中，手性控制的RIPtide制剂相较于阳性对照显示对hTR的抑制增强，和/或相较于阴性对照显示对hTR的抑制增强；在一些实施方案中，具有给定序列的一些但任选并非所有RIPtide显示所述性质。在一些实施方案中，在这个背景下，“增强”是指增强介于约五倍与约十倍之间。在一些实施方案中，“增强”是指至少约1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0倍。
细胞培养条件。在37℃下，在5％CO2中，在补充有10％胎牛血清的DMEM中维持转化的胚肾细胞系HEK293和前列腺癌细胞系DU145。通过如制造商说明书中所述，用200μL 1X CHAPS溶解缓冲液(Chemicon)对106个细胞进行去污剂溶解来制备用于TRAP测定的可溶性细胞提取物。
根据本发明，可观察到完全立体控制的硫代磷酸酯RIPtide的各种立体构造的不同强力性和/或不同其它性质。例如，共有相同序列，但关于一个或多个手性硫代磷酸酯骨架键联的不同位置和/或立体化学是彼此不同的手性控制的RIPtide制剂的RIPtide性质，如：核酸酶抗性、组织累积、细胞渗透、内体逃逸、RIPtide的三维结构、对靶标折叠hTR RNA的亲和力、免疫刺激、作用的持续时间、药物动力学等可不同。
实施例69：手性控制的寡核苷酸组合物相较于具有相同序列的未手性控制的组合物显示不同体内活性
本实施例比较手性纯寡核苷酸的体内药理学活性与对于“母体”立体无规混合物(即对于含有与手性纯寡核苷酸具有相同序列，但例如由于已通过立体无规方法来制备而不显示手性纯度的寡核苷酸的组合物)观察到的体内药理学活性。合成、配制各自具有互补于特定靶标转录物或编码目标蛋白质的基因的序列的序列的四种手性纯寡核苷酸，并且各自每周两次持续5周在两种剂量水平下向表达靶标基因的动物施用。定量编码的蛋白质水平。在这个实施例中，具有反义于(并且因此靶向)人脂蛋白元-B(ApoB)的序列的寡核苷酸用于在表达人ApoB的转基因小鼠中进行概念验证。
测试物品
测试物品是单独PBS(即无寡核苷酸对照)，或使用不含核酸酶的水(Qiagen，129115)在分别用于在5和10mg/kg下给药的0.5和1mg/mL下于1X PBS(自10X PBS(Life Technologies，AM9624)稀释)中配制相关寡核苷酸组合物(即米泊美生(ONT-41)、ONT-75、ONT-77、ONT-80或ONT-81寡核苷酸(对于结构，参见实施例52))。制剂是基于绝对质量，其中不调整活性材料。通过用Carry-100UV-Vis(AgilentTechnologies)测量来确认寡核苷酸浓度。使用动力学pyrochrome显色内毒素测定(Associates ofCape Cod，1500-5，E005-5)，检查所有测试物品的样本的内毒素水平。发现所有测试样本都具有低于0.5EU/ml可接受限度的内毒素量。
动物和体内程序
自Taconic获得表达高血浆浓度的人脂蛋白元B100和脂蛋白(a)的雌性转基因小鼠(huApoB小鼠)(J.Clin.Invest.92：3029-3037)(品系B6.SJL-Tg(APOB)l 102Sgy N20+？，型号1004-F)。在递送之前，分析所有动物的基因型。
递送小鼠，并且在研究开始之前，使其驯化至少七天。给与所有小鼠任意取食的定时食物和水，并且在施用化合物之前不禁食。基于在各给药日给药之前测量的个别小鼠体重将小鼠随机分至各研究组中，并且在第1、4、8、11、15、18、22、25、29和32天在10ml/kg下进行腹膜内(IP)给药。在研究过程期间，在第0(第一剂之前的日子)、17、24、31、38、45、52和60天通过下颌下(面颊)放血以及在第66天处死时通过心脏穿刺来收集血液，接着处理以得到血清。
脂蛋白元B蛋白测定
使用ApoB人ELISA试剂盒(Abcam，ab108807)测量血清中的ApoB蛋白水平。1∶20,000稀释血清样本，并且不加修改地根据试剂盒推荐的方案进行测定。使用Aquamax 4000(Molecular Devices)，以30秒浸渍时期进行自动洗涤。在与色原体底物一起孵育12分钟之后，终止反应，并且用Spectramax M5(Molecular Devices)进行测量。
通过在x轴上绘制标准浓度以及在y轴上绘制相应平均450nm吸光度来产生标准曲线。通过使用对数-对数曲线拟合进行回归分析来确定最佳拟合线。各测定板包括阴性(PBS处理)和阳性(米泊美生处理)对照，并且在4个技术平行测定中测定各小鼠血清样本。
对于各样本，相对于PBS处理组的平均值来使ApoB的平均绝对水平标准化以获得ApoB蛋白表达的相对水平。在一种情况下，当测量结果偏离组平均值2个标准偏差时，自分析排除动物。ApoB蛋白表达的相对水平用于依次通过2因素ANOVA和纽曼-科伊尔斯(Newman-Keuls)事后检验来进行统计分析(Graphpad Prism)。
结果
结果显示于表E-28a和图40中。相对于PBS，5mg/kg IP ONT-75导致血清ApoB蛋白水平在研究的第24天显著降低至87％(p＜0.05)。相对于PBS，5mg/kg IP ONT-77导致血清ApoB蛋白水平在研究的第24和31天分别显著降低至对照水平的72％(p＜0.0001)、81％(p＜0.05)。相对于PBS，5mg/kg IP ONT-80导致血清ApoB蛋白水平在研究的第24和31天分别显著降低至对照水平的83％(p＜0.05)、80％(p＜0.05)。相对于PBS，5mg/kg IP ONT-81导致血清ApoB蛋白水平在研究的第17和24天分别显著降低至对照水平的85％(p＜0.05)、70％(p＜0.0001)。
表E-28a：在多次5mg/kg IP剂量的立体异构体或米泊美生之后，相对于PBS，huApoB小鼠(N＝4-5]中的血清人脂蛋白元B水平
a：在统计上不同于米泊美生对照组(ONT-41)，其中p＜0.05(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
b：在统计上不同于米泊美生对照组(ONT-41)，其中p＜0.01(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
c：在统计上不同于米泊美生对照组(ONT-41)，其中p＜0.001(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
d：在统计上不同于米泊美生对照组(ONT-41)，其中p＜0.0001(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
w：在统计上不同于PBS对照组，其中p＜0.5(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
x：在统计上不同于PBS对照组，其中p＜0.01(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
y：在统计上不同于PBS对照组，其中p＜0.001(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
z：在统计上不同于PBS对照组，其中p＜0.0001(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
相较于5mg/kg IP米泊美生，用相同给药范式施用的ONT-75导致血清ApoB蛋白水平在研究的第17、24、31和38(p＜0.0001)和45(p＜0.05)天的降低显著更小。相较于5mg/kg IP米泊美生，用相同给药范式施用的ONT-77导致血清ApoB蛋白水平在研究的第17、31和38(p＜0.0001)、24(p＜0.001)和45(p＜0.05)天的降低显著更小。相较于5mg/kg IP米泊美生，用相同给药范式施用的ONT-80导致血清ApoB蛋白水平在第17、24、31和38天(p＜0.0001)的降低显著更小，但在研究的第45天并无不同(p＞0.05)。相较于5mg/kg IP米泊美生，用相同给药范式施用的ONT-81导致血清ApoB蛋白水平在研究的第17、31和38(p＜0.0001)、24(p＜0.001)和45(p＜0.01)天的降低显著更小。图40显示在5mg/kg立体异构体或米泊美生IP给药之后，相对于PBS，huApoB小鼠中的血清人脂蛋白元B蛋白水平的时程。向下箭头指示给药天数。显示相对于PBS对照组加以标准化的组平均值，其中各组包含4-5个动物。误差条表示标准偏差。
10mg/kg给药范式的结果显示于表E-28b和图53中。相对于PBS，10mg/kg IP ONT-75导致血清ApoB蛋白水平在研究的第17、24和38天分别显著降低至78％(p＜0.0001)、76％(p＜0.0001)和82％(p＜0.001)。相对于PBS，10mg/kg IP ONT-77导致血清ApoB蛋白水平在研究的第17、24、31、38、45和52天分别显著降低至对照水平的62％(p＜0.0001)、61％(p＜0.0001)、54％(p＜0.0001)、59％(p＜0.0001)、72％(p＜0.0001)和73％(p＜0.0001)。相对于PBS，10mg/kgIP ONT-80导致血清ApoB蛋白水平在研究的第17、24、31、38、45、52和66天分别显著降低至对照水平的55％(p＜0.0001)、59％(p＜0.0001)、73％(p＜0.0001)、67％(p＜0.0001)、76％(p＜0.0001)、76％(p＜0.0001)和80％(p＜0.01)。相对于PBS，10mg/kg IP ONT-81导致血清ApoB蛋白水平在研究的第17、24、31、38和45天分别显著降低至对照水平的49％(p＜0.0001)、62％(p＜0.0001)、71％(p＜0.0001)、74％(p＜0.0001)和79％(p＜0.001)。
表E-28b：在多次10mg/kg IP剂量的立体异构体(ONT-75、ONT-77、ONT-80或ONT-81)或米泊美生之后，相对于PBS，huApoB小鼠(N＝4-5)中的血清人脂蛋白元B水平
a：在统计上不同于米泊美生对照组(ONT-41)，其中p＜0.05(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
b：在统计上不同于米泊美生对照组(ONT-41)，其中p＜0.01(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
c：在统计上不同于米泊美生对照组(ONT-41)，其中p＜0.001(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
d：在统计上不同于米泊美生对照组(ONT-41)，其中p＜0.0001(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
w：在统计上不同于PBS对照组，其中p＜0.05(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
x：在统计上不同于PBS对照组，其中p＜0.01(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
y：在统计上不同于PBS对照组，其中p＜0.001(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
z：在统计上不同于PBS对照组，其中p＜0.0001(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
相较于10mg/kg IP米泊美生，用相同给药范式施用的ONT-75导致血清ApoB蛋白水平在研究的第17、24、31、38、45、52、60(p＜0.0001)和66(p＜0.001)天的降低(敲低)显著更低。相较于10mg/kgIP米泊美生，用相同给药范式施用的ONT-77导致血清ApoB蛋白水平在研究的第17、24、31、38和45(p＜0.0001)、60(p＜0.05)和66(p＜0.01)天的降低(敲低)显著更低。相较于10mg/kg IP米泊美生，用相同给药范式施用的ONT-80导致血清ApoB蛋白水平在第24、31、38和45(p＜0.0001)、17(p＜0.001)和66(p＜0.01)天的降低(敲低)显著更低。相较于10mg/kg IP米泊美生，用相同给药范式施用的ONT-81导致血清ApoB蛋白水平在研究的第24、31、38和45(p＜0.0001)、17(p＜0.01)、52和66(p＜0.001)天的降低(敲低)显著更低。
在ONT-75之后，截至第38天(即在末次剂量之后6天)，血清ApoB蛋白水平已返回至基线。考虑到初始血清ApoB蛋白水平降低，在ONT-77和ONT-80之后，返回至血清ApoB蛋白的基线的速率较慢，并且截至第52天，血清ApoB蛋白的水平类似于米泊美生水平。
其它立体纯构造的5mg/kg给药范式的结果显示于表E-28c和图54中。相对于PBS，5mg/kg IP ONT-87导致血清ApoB蛋白水平在研究的第17、24、31和38天分别显著降低至对照水平的27％(p＜0.0001)、40％(p＜0.0001)、55％(p＜0.0001)和71％(p＜0.0001)。相对于PBS，5mg/kg IP ONT-88导致血清ApoB蛋白水平在研究的第17、24、31和38天分别显著降低至对照水平的47％(p＜0.0001)、34％(p＜0.0001)、69％(p＜0.0001)和85％(p＜0.0001)。相对于PBS，5mg/kgIP ONT-89导致血清ApoB蛋白水平在研究的第17、24和31天分别显著降低至对照水平的43％(p＜0.0001)、48％(p＜0.0001)和85％(p＜0.05)。
表E-28c：在多次5mg/kg IP剂量的立体异构体(ONT-87、ONT-88或ONT-89)或米泊美生之后，相对于PBS，huApoB小鼠(N＝3-4)中的血清人脂蛋白元B水平
a：在统计上不同于米泊美生对照组(ONT-41)，其中p＜0.05(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
b：在统计上不同于米泊美生对照组(ONT-41)，其中p＜0.01(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
c：在统计上不同于米泊美生对照组(ONT-41)，其中p＜0.001(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
d：在统计上不同于米泊美生对照组(ONT-41)，其中p＜0.0001(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
w：在统计上不同于PBS对照组，其中p＜0.05(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
x：在统计上不同于PBS对照组，其中p＜0.01(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
y：在统计上不同于PBS对照组，其中p＜0.001(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
z：在统计上不同于PBS对照组，其中p＜0.0001(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
相较于5mg/kg IP米泊美生，用相同给药范式施用的ONT-87导致血清ApoB蛋白水平在研究的第31天的降低(敲低)显著更高(p＜0.01)。相较于5mg/kg IP米泊美生，用相同给药范式施用的ONT-88导致血清ApoB蛋白水平在研究的第17天的降低(敲低)显著更高(p＜0.05)。相较于5mg/kg IP米泊美生，用相同给药范式施用的ONT-89导致血清ApoB蛋白水平在研究的第38天的降低(敲低)显著更高(p＜0.05)。
其它立体纯构造的10mg/kg给药范式的结果显示于表E-28d以及图55和56中。相对于PBS，10mg/kg IP ONT-87导致血清ApoB蛋白水平在研究的第17和24天分别显著降低至对照水平的27％(p＜0.0001)、14％(p＜0.0001)。相对于PBS，10mg/kg IP ONT-88导致血清ApoB蛋白水平在研究的第17和24天分别显著降低至对照水平的23％(p＜0.0001)和17％(p＜0.0001)。相对于PBS，10mg/kg IPONT-89导致血清ApoB蛋白水平在研究的第17和24天分别显著降低至对照水平的29％(p＜0.0001)和23％(p＜0.0001)。
表E-28d：在多次10mg/kg IP剂量的立体异构体(ONT-87、ONT-88或ONT-89)或米泊美生之后，相对于PBS，huApoB小鼠(N＝3-4)中的血清人脂蛋白元B水平
a：在统计上不同于米泊美生对照组(ONT-41)，其中p＜0.05(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
b：在统计上不同于米泊美生对照组(ONT-41)，其中p＜0.01(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
c：在统计上不同于米泊美生对照组(ONT-41)，其中p＜0.001(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
d：在统计上不同于米泊美生对照组(ONT-41)，其中p＜0.0001(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
w：在统计上不同于PBS对照组，其中p＜0.05(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
x：在统计上不同于PBS对照组，其中p＜0.01(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
y：在统计上不同于PBS对照组，其中p＜0.001(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
z：在统计上不同于PBS对照组，其中p＜0.0001(2因素ANOVA以及纽曼-科伊尔斯事后检验)
相较于10mg/kg IP米泊美生，用相同给药范式施用的ONT-87导致血清ApoB蛋白水平在研究的第17天的降低(敲低)显著更高(p＜0.05)。相较于10mg/kg IP米泊美生，用相同给药范式施用的ONT-88导致血清ApoB蛋白水平在研究的第17天的降低(敲低)显著更高(p＜0.05)。相较于10mg/kg IP米泊美生，用相同给药范式施用的ONT-89导致血清ApoB蛋白水平在研究的第17天的降低(敲低)显著更高(p＜0.05)。
因此，在至少一些实施方案中，本发明提供显示生物活性，并且特征在于相较于适当参照(例如具有相同序列，但手性特异性不同的寡核苷酸的制剂，特别包括立体无规制剂)，所述活性随时间的持续性得以延长和/或衰退速率减缓的手性控制的寡核苷酸组合物。在其中观察到所述持续性延长和/或衰退速率减缓的一些实施方案中，可根据关于“母体”立体无规组合物加以利用的总剂量较少和/或两个或更多个剂量之间的时期较长的给药方案施用提供的手性控制的组合物以达成可比的生物和/或治疗作用。例如，如本实施例中所证明，相较于米泊美生，在用手性纯寡核苷酸治疗之后，返回至血清ApoB蛋白的基线减缓表明用手性纯ApoB寡核苷酸给药的频率可小于母体立体无规混合物(例如小于米泊美生)。
这个实施例中呈现的结果例如证明相较于适当参照(例如具有相同序列，但手性特异性不同的寡核苷酸的制剂，特别包括立体无规制剂)，并且具体来说相较于“母体”立体无规制剂，手性纯寡核苷酸组合物可具有显著不同体内药理学活性。本领域技术人员鉴于这一证明将了解由本公开提供的手性控制的寡核苷酸组合物具有出乎意料的活性和特征。本领域技术人员鉴于本公开将进一步了解提供各种方法，包括利用不同于用于非手性控制的组合物(例如具有相同核苷酸序列)的给药方案的给药方案的治疗方法。在一些实施方案中，相较于对照(例如立体无规对照)，可利用相对较大个别剂量的手性控制的(例如手性纯)寡核苷酸。在一些实施方案中，相较于对照(例如立体无规对照)，可利用相对较小个别剂量的手性控制的(例如手性纯)寡核苷酸。在一些实施方案中，相较于对照(例如立体无规对照)，在给定时期内，可利用相对较少剂量的手性控制的(例如手性纯)寡核苷酸。
实施例70：包含手性控制的寡核苷酸的siRNA剂抑制PCSK-9
本实施例证明使用包含如本文所述的手性控制的寡核苷酸的siRNA剂成功抑制靶标基因表达。具体来说，这个实施例描述通过如本文所述的手性控制的合成制备的个别寡核苷酸链的杂交，以便提供双链手性控制的siRNA寡核苷酸组合物。这个实施例进一步证明用所述药剂成功转染细胞，以及此外，成功抑制靶标基因表达。
手性siRNA分子的siRNA转染
在96孔板中，在2.0×104个细胞/孔的密度下反向转染Hep3B或HeLa细胞。使用制造商方案，例外之处是每孔使用0.2ul降低量的转脂胺RNAiMax，用转脂胺RNAiMax(Life Technologies，目录号13778-150)进行siRNA转染。在1uM下起始，产生十二个1∶3siRNA双链体稀释度。接着每孔用制备的9.8ul无血清培养基和0.2ul转脂胺RNAiMax的混合物使10ul 10x siRNA双链体脂质复合。在孵育10-15分钟之后，添加含2.0×104个细胞的80ul EMEM细胞生长培养基(ATCC，30-2003)以使每孔的最终体积达到100ul。对于各剂量，进行两个单独转染事件。
在转染之后24小时，溶解Hep3B或HeLa细胞，并且使用MagMAXTM-96总RNA分离试剂盒(Life Technologies，AM1830)纯化PCSK9mRNA；用具有RNA酶抑制剂的高容量cDNA反转录试剂盒(Life Technologies，4374967)合成15ul cDNA。根据制造商方案，使用针对PCSK9的FAM标记的Taqman探针组(Life Technologies，Hs03037355_m1)和VIC标记的GAPDH引物限制的内源性对照(LifeTechnologies，NM_002046.3)，通过利用Probes Master混合物(Roche，04 707 494 001)在Lightcycler 480(Roche)上进行实时PCR来评估基因表达。
IC50和数据分析
ΔΔCt方法用于计算数值。样本相对于hGAPDH加以标准化，并且相对于模拟转染以及未处理的样本进行校正。立体无规分子用作阳性对照。使用Graphpad Prism将数据表示为2个生物平行测定的平均值。使四参数线性回归曲线与数据拟合，并且将底部和顶部分别约束至0和100常数以计算相对IC50。
表E-29.相对IC50值[Hep3B转染]
表E-30.相对IC50值[HeLa转染]
表E-31.具有3个硫代磷酸酯立体中心的siRNA的相对IC50值[HeLa转染]
图45-50呈现这些研究的结果。图45显示在用siRNA双链体处理Hep3B之后剩余的PCSK-9mRNA％。图46显示在用siRNA双链体处理Hep3B之后剩余的PCSK-9mRNA％曲线拟合。图47显示在用siRNA双链体处理HeLa之后剩余的PCSK-9mRNA％。图48显示在用siRNA双链体处理HeLa之后剩余的PCSK-9mRNA％曲线拟合。图49显示在用含有3个硫代磷酸酯立体中心的siRNA双链体处理HeLa之后剩余的PCSK-9mRNA％。图50显示在用含有3个硫代磷酸酯立体中心的siRNA双链体处理HeLa之后剩余的PCSK-9mRNA％曲线拟合。
如可见，在各链中具有单一立体化学确定的硫代磷酸酯的分子中，观察到在有义链与反义链两者中的硫代磷酸酯处具有Sp立体化学的分子的效能略微增加。尽管明确例示的siRNA剂每个链仅含有一个手性中心，但本领域技术人员在阅读本公开的情况下将认识到证明的差异性作用作为手性的存在可影响活性的原理验证的重要性。
在具有两个以上立体中心的siRNA中，手性的影响更显著。在具有3个手性硫代磷酸酯(一个在有义链中，并且两个在反义链中)的siRNA中，反义链的在5’末端的Sp立体化学(在核苷酸n1与n2之间)与在3’末端的Rp立体化学(在核苷酸n20与n21之间)组合对效能具有有害作用。然而，反义链的在5’末端的Rp立体化学(在核苷酸n1与n2之间)与在3’末端的Sp立体化学(在核苷酸n20与n21之间)组合显示超过立体无规对照siRNA的显著PCSK-9mRNA敲低改进。结果表明两个链均受硫代磷酸酯的立体化学影响。有可能的是观察到的功效差异性对于具有较大数目的手性中心的药剂而言将增加，并且此外，手性中心的位置与类型两者均可影响活性，例如通过对稳定性、效能和/或两者的作用。因此，本领域技术人员在阅读本公开的情况下将了解本公开提供单链手性控制的寡核苷酸组合物与双链手性控制的寡核苷酸组合物两者以及其用途的传授，即在至少一些实施方案中，所述手性控制的寡核苷酸和药剂区别于具有相同序列的立体无规药剂。
实施例71.其它示例性寡核苷酸以及其合成。
根据表E-32概述的合成循环，使用1μmol合成管柱和HCP上的1.7μmol草酰基连接的dGCE，Pac，利用自动合成在ABI-394DNA/RNA合成仪上合成寡核苷酸N101-N104。伴随末端5′-O-DMTr基团的移除(DMT去除)来进行合成循环。在完成自动寡核苷酸合成之后，HCP载体用无水ACN洗涤，并且在真空下干燥。将干燥HCP放置在塑料小瓶中，并且在55℃下用1mL饱和NH3/Py处理1小时，接着在室温下用1mL含无水丙胺的无水吡啶(以1∶4比率)处理18小时。接着蒸发溶剂，并且用pH约1.5的含有10％DMSO的HCl水溶液再悬浮残余物，并且滤除HCP载体。粗产物通过反相制备型HPLC加以纯化(根据下述程序)。汇合纯度高于95％的洗脱份，浓缩，并且通过反相HPLC来脱盐(根据下述程序)。自水冻干最终脱盐产物。
表E-32.在DNA/RNA合成仪ABI-394上进行的用于合成寡核苷酸N101-N102的寡核苷酸合成的概述。
实施例72.用于N101和N102的HPLC方法：
缓冲液A：50mM TEAA，pH 9.6(用TEA调整)
缓冲液B：ACN
管柱：XBridge C8，3.5μm，4.6x50mm，零件号186003034
缓冲液加热器设置温度＝35℃
在254和280nm下监测信号
使用的梯度：
实施例73.用于N101和N102的一般性UPLC-LCMS方法。
缓冲液A：10mM甲酸铵，pH 9.5(用NH3水溶液调整)
缓冲液B：ACN
管柱：UPLCOST C181.7μm，2.1×500mm
管柱温度＝35℃
使用的梯度：
实施例74.用于N101和N102的一般性纯化方法：
缓冲液A：50mM TEAA，pH＝9.6(用TEA调整)
缓冲液B：ACN
管柱：XBridge Prep C18，5μm，C18，250×10mm，零件号186003256
缓冲液加热器设置温度＝RT
在254和280nm下监测信号
使用的梯度：
添加100μL 49-51％磷酸至各洗脱份中(pH 3)，并且通过HPLC来检查，接着储存在-80℃下直至冷冻。将洗脱份保持在冻干器上几小时直至1/2体积，接着储存在-80℃下。
实施例75.用于N101和N102的一般性脱盐方法：
缓冲液A：10mM甲酸
缓冲液B：ACN
管柱：XBridge Prep C18，5μm，C18，250×10mm，零件号186003256
缓冲液加热器设置温度＝RT
在254和280nm下监测信号
使用的梯度：
收集的洗脱份储存在-80℃中直至冷冻，并且保持在冻干器上直至干燥，并且通过HPLC来检查。
实施例76.合成寡核苷酸N101(全 (Rp)-d[5mCs16As16Gs16T] )
如上所述来合成寡核苷酸N101并纯化。RP-HPLC中的RT：(HPLC方法N1)：15.9分钟。UPLC/ESI-MS计算值：1614.64；[+H]实测值：1615.06。
实施例77.合成寡核苷酸N102(全(Sp)-d[5mCs16As16Gs16T])
如上所述来合成寡核苷酸N102并纯化。RP-HPLC(HPLC方法N1)中的RT：16.4分钟。UPLC/ESI-MS计算值：1614.64；[+H]实测值：1614.97。
实施例78.合成寡核苷酸N103(全(Rp)-d[5mCs16As16Gs16Ts1 65mCs16Ts16Gs165mCs16Ts16Ts165mCs16G])
如上所述来合成寡核苷酸N103。RP-HPLC(HPLC方法N1)中的RT：18.4分钟。C197H311N62O62P11S11的UPLC/ESI-MS计算值：5233.38；实测值：5234.7。
实施例79.合成寡核苷酸N104(全(Sp)-d[5mCs16As16Gs16Ts1 65mCs16Ts16Gs165mCs16Ts16Ts165mCs16G])
如上所述来合成寡核苷酸N104。RP-HPLC(HPLC方法N1)中的RT：18.7分钟。UPLC/ESI-MS计算值：5233.38；实测值：5232.9。
根据表E-33上概述的合成循环，使用1μmol合成管柱和HCP上的1.7μmol草酰基连接的dGCE，Pac，利用自动合成在ABI-394DNA/RNA合成仪上合成寡核苷酸N105-N106。伴随末端5′-O-DMTr基团的移除(DMT去除)来进行合成循环。在完成自动寡核苷酸合成之后，HCP载体用无水ACN洗涤，并且在真空下干燥。将干燥HCP放置在塑料小瓶中，并且在55℃下用1mL饱和NH3/i-PrOH处理16小时。接着蒸发溶剂，并且用pH 7.0的含有10％DMSO的水溶液再悬浮残余物，并且滤除HCP载体。粗产物通过反相制备型HPLC加以纯化。汇合纯度高于95％的洗脱份，浓缩，并且通过反相HPLC来脱盐。自水冻干最终脱盐产物。
表E-33.在DNA/RNA合成仪ABI-394上进行的用于合成寡核苷酸N105-N106的寡核苷酸合成的概述。
实施例80.用于N101和N102的HPLC方法：
缓冲液A：50mM TEAA，pH 7.0
缓冲液B：ACN
管柱：XBridge C8，3.5μm，4.6x150mm，零件号186003034
缓冲液加热器设置温度＝35℃
在254和280nm下监测信号
使用的梯度：
实施例81.用于N101和N102的一般性UPLC-LCMS方法。
缓冲液A：10mM甲酸铵，pH 7.0
缓冲液B：ACN
管柱：UPLCOST C181.7μm，2.1×500mm
管柱温度＝35℃
使用的梯度：
实施例82.合成寡核苷酸N105(全(Rp)-d[5mCs9As9Gs9T](s9＝ )
如上所述来合成寡核苷酸N105。RP-HPLC中的RT：(HPLC方法N2)：14.1分钟。UPLC/ESI-MS计算值：1977.78；[-H]实测值：1978.8。
实施例83.合成寡核苷酸N106(全(Sp)-d[5mCs9As9Gs9T])
如上所述来合成并纯化寡核苷酸N106。RP-HPLC(HPLC方法N2)中的RT：14.7分钟。UPLC/ESI-MS计算值：1977.78；[-H]实测值：1977.37。
根据表E-33上概述的合成循环，使用1μmol合成管柱和HCP上的1.7μmol草酰基连接的dGCE，Pac，利用自动合成在ABI-394DNA/RNA合成仪上合成寡核苷酸xxx。伴随末端5′-O-DMTr基团的移除(DMT去除)来进行合成循环。在完成自动寡核苷酸合成之后，HCP载体用无水ACN洗涤，并且在真空下干燥。将干燥HCP放置在塑料小瓶中，并且在55℃下用1mL饱和NH3/i-PrOH处理16小时。接着蒸发溶剂，并且用pH 7.0的含有10％DMSO的水溶液再悬浮残余物，并且滤除HCP载体。粗产物通过反相制备型HPLC加以纯化。汇合纯度高于95％的洗脱份，浓缩，并且通过反相HPLC来脱盐。自水冻干最终脱盐产物。
表E-34.在DNA/RNA合成仪ABI-394上进行的寡核苷酸合成的概述。
实施例84.一般性纯化方法
缓冲液A：50mM TEAA
缓冲液B：ACN
管柱：XBridge Prep C18，5μm，C18，250×10mm，零件号186003256
缓冲液加热器设置温度＝室温
在254和280nm下监测信号
使用的梯度：
HPLC方法5：
ONT-60：寡核苷酸149全(Rp)-d[5mCs8As8Gs8Ts85mCs8Ts8G s85mCs8Ts8Ts85mCs8G] )
如上所述来合成寡核苷酸。RP-HPLC(HPLC方法5)中的RT：15.80分钟。UPLC/ESI-MS计算值：6345.6；实测值：6340.7。
ONT-69：全(Sp)-d[5mCs16As8Gs8Ts85mCs8Ts8Gs85mCs8Ts8 Ts85mCs8G]
如上所述来合成寡核苷酸。RP-HPLC(HPLC方法5)中的RT：18.61分钟。UPLC/ESI-MS计算值：6345.6；实测值：6340.6。
实施例85.
根据表E-4中概述的循环，使用1μmol合成管柱和HCP上的1.7μmol草酰基连接的dGCE，Pac，在ABI-394DNA/RNA合成仪上合成含有立体确定的硫代磷酸二酯与立体确定的吗啉代乙基硫代磷酸三酯核苷酸间键联两者的P修饰的嵌段聚体和交替聚体寡核苷酸。通过进行硫化步骤(1)或(2)来在序列内的预定位置处引入任一立体确定的P修饰的硫代磷酸酯键联。伴随末端5′-O-DMTr基团的移除(DMT去除)来进行合成循环。固体载体用无水ACN洗涤，并且在氩气流下干燥。将干燥HCP放置在塑料小瓶中，并且在室温下用1mL含无水丙胺的无水吡啶(以1∶4比率)处理18小时的时期。接着蒸发溶剂，并且将残余物再悬浮于DMSO中，并且滤除HCP载体。粗产物通过反相制备型HPLC加以纯化。汇合纯度高于95％的洗脱份，浓缩，并且通过反相HPLC(0至80％ACN的梯度)来脱盐。自水冻干最终脱盐产物。
表E-4.在DNA/RNA合成仪ABI-394上进行的用于合成实施例85的寡核苷酸合成的概述。
实施例86.用于实施例85的一般性纯化方法：
缓冲液A：20mM磷酸盐，pH＝6.0(用磷酸调整)
缓冲液B：ACN
管柱：XBridge Prep C18，5μm，C18，250×10mm，零件号186003256
缓冲液加热器设置温度＝50℃
在254和280nm下监测信号
使用的梯度：
HPLC方法6
缓冲液A：20mM乙酸铵，pH 6.0
缓冲液B：ACN
管柱：XBridge C8，3.5μm，4.6x150mm，零件号186003034
缓冲液加热器设置温度＝60℃
在254和280nm下监测信号
使用的梯度：
ONT-71：全(Rp)-d[5mCs1As1GsTs5mCsTsGs5mCsTsTs15mCs1 G]
如上所述来合成寡核苷酸。RP-HPLC(HPLC方法6)中的RT：9.39分钟。UPLC/ESI-MS计算值：4297.9；实测值：4295.3
ONT-72：全(Sp)-d[5mCs1As1GsTs5mCsTsGs5mCsTsTs15mCs1 G]
如上所述来合成寡核苷酸。RP-HPLC(HPLC方法6)中的RT：10.84分钟。UPLC/ESI-MS计算值：4297.9；实测值：4295.7
ONT-73：全(Rp)-d[5mCs1AsGs1Ts5mCs1TsGs15mCsTs1Ts5mC s1G]
如上所述来合成寡核苷酸。RP-HPLC(HPLC方法6)中的RT：13.54分钟。UPLC/ESI-MS计算值：4524.2；实测值：4522.6
ONT-74：全(Sp)-d[5mCs1AsGs1Ts5mCs1TsGs15mCsTs1Ts5mCs 1G]
如上所述来合成寡核苷酸。RP-HPLC(HPLC方法6)中的RT：15.52分钟。UPLC/ESI-MS计算值：4524.2；实测值：4521.0
前药寡核苷酸性质，如：核酸酶抗性、组织累积、细胞渗透、内体逃逸、免疫刺激、作用的持续时间、药物动力学等都由手性硫代磷酸酯骨架键联的立体化学调节，并且受其影响。
根据表E-35、表E-36、表E-37和表E-38中概述的循环，使用装载有130mg(4.9μmol)如先前所述制备的草酰基连接的5′-O-DMTr-2′-脱氧胸苷的10μmol容量合成管柱，在ABI 394DNA/RNA合成仪上合成含有2′-OH、2′-OMe、2′-F、2′-脱氧核苷酸间磷酸二酯或核苷酸间立体确定的硫代磷酸二酯或核苷酸间立体确定的硫代磷酸三酯(前药)(释放核苷酸间磷酸二酯(PO)或核苷酸间立体确定的硫代磷酸二酯(PS))键联的RNA寡核苷酸。在合成之前，进行初步加帽步骤(加帽2)，并且以移除末端5′-O-DMTr基团来终止合成。使用可商购获得的叔丁基氢过氧化物(TBHP)于癸烷中的5-6M溶液来进行氧化步骤，接着用四份二氯甲烷稀释。在相应手性磷酰胺的偶联和两步加帽过程之后，使用0.3MS-氰基乙基硫代磺酸甲酯试剂来进行核苷酸间立体确定的硫代磷酸二酯键联的立体特异性硫化步骤(表E-36)。在相应手性磷酰胺的偶联和两步加帽过程之后，使用0.3MS-(N-吗啉代乙基硫基酯-乙基)-对硝基-甲苯基硫代磺酸酯试剂来进行释放立体确定的核苷酸间磷酸二酯(PS)键联的核苷酸间立体确定的硫代磷酸三酯的立体特异性硫化步骤(表E-37)。在相应手性磷酰胺的偶联和两步加帽过程之后，使用0.3MS-(N-吗啉代乙基)-甲苯基硫代磺酸酯试剂来进行释放核苷酸间磷酸二酯(PO)键联的核苷酸间立体确定的硫代磷酸三酯的立体特异性硫化步骤(表E-38)。对于2′-OHRNA核苷酸，使用2′-O-碱基保护基，如2′-O-PivOM(Debart等，Chem.Eur.J.，2008，14，9135)或2′-O-TC(Dellinger等，J.Am.Chem.Soc.，2011，133，11540)。超温和(C-Ac、G-Pac、A-Pac)保护基用于所有核苷碱基。
一旦完成自动寡核苷酸合成循环，并且移除最终5′-O-DMTr基团，将合成管柱自DNA/RNA合成仪去除，并且在真空下干燥。使用连接于合成管柱的一个末端的注射器，在不停止流动下，穿过合成管柱连续添加10mL 0.5M 1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、0.25MN，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)于ACN中的溶液至载体，持续1分钟。载体接着用无水ACN洗涤，并且在真空下干燥。接着，将干燥载体转移至空螺旋帽塑料小瓶中，并且在室温下用含10％n-PrNH2的无水吡啶(1.5mL)处理12小时。在那之后，蒸发溶剂至干燥，并且将包括固体载体的残余物溶解于2mL在pH 5下的水/DMSO(50/50)中，滤除载体，并且收集滤液，立刻冷冻，并且储存在-80℃下，随后进行纯化。
表E-35.在DNA/RNA合成仪ABI 394上进行的寡核苷酸合成的概述
表E-36.在DNA/RNA合成仪ABI 394上进行的寡核苷酸合成的概述
表E-37.在DNA/RNA合成仪ABI-394上进行的寡核苷酸合成的概述。
表E-38.在DNA/RNA合成仪ABI-394上进行的寡核苷酸合成的概述。
合成寡核苷酸：(Rp)-uucuAGAccuGuuuuGcuudTs10dT
合成寡核苷酸ONT-107：(Sp)-uucuAGAccuGuuuuGcuudTs10dT
合成寡核苷酸ONT-108：(Rp)-AAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTs10dT
合成寡核苷酸ONT-109：(Sp)-AAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTs10dT
合成寡核苷酸：(Rp，Rp)-as1AGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT
合成寡核苷酸：(Sp，Rp)-as1GcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT
合成寡核苷酸：(Sp，Sp)-as1GcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT
合成寡核苷酸：(Rp，Sp)-as1GcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT
合成寡核苷酸：(全(Sp))-us1ucus1AGAccs1uGus1uus1uGcuudTs10dT
合成寡核苷酸：(全(Rp))-As10AGcAAAAcAGGs1UCuAs1GAs1AdTs10dT
siRNA双链体的RNA链热退火和制备。将各RNA链与它的互补RNA链以于1×PBS中10μM的等摩尔浓度混合。制备各双链体的总计0.5mL溶液，并且在90℃下加热混合物2分钟，并且历经数小时的过程使其冷却。接着将混合物在4℃下储存。
在热RNA链退火步骤之后，通过使任何有义链与反义链的任何可能的互补链退火来制备所有可能的siRNA双链体组合。
在于HeLa细胞或Hep3B细胞中转染之后，体外评估所有制备的siRNA双链体的PCSK9基因沉默性质。
在于Hep3B细胞、Huh-7细胞或人原代肝细胞中自由摄取之后，体外评估具有前药基团的所有制备的siRNA双链体的PCSK9基因沉默性质。
观察到不同强力性，其由手性硫代磷酸酯骨架键联的数目、位置和立体构造组合探究的其它化学修饰和前药基团的层数加以调节。
siRNA性质，如：核酸酶抗性、细胞渗透、内体逃逸、双链体热力学稳定性、双链体的三维结构、对酶相互作用的各种机制步骤的亲和力、对靶标mRNA的亲和力、特异性脱靶作用、免疫刺激、作用的持续时间、药物动力学等都可由手性硫代磷酸酯骨架键联的立体化学以及存在或不存在前药基团加以调节，并且受其影响。
PO和PS释放性前药基团连接于siRNA双链体会增强它们在不存在转染试剂或靶向配体下的细胞内递送和自由摄取。
实施例87：非对映异构纯寡核苷酸的稳定性研究
本实施例比较手性纯寡核苷酸的体外稳定性与对于“母体”立体无规混合物(即对于含有与手性纯寡核苷酸具有相同序列，但例如由于已通过立体无规方法来制备而不显示手性纯度的寡核苷酸的组合物)观察到的体外稳定性。合成、配制各自具有互补于特定靶标转录物或编码目标蛋白质的基因的序列的序列的七种手性纯寡核苷酸，并且使用三种不同生物基质：蛇毒磷酸二酯酶(svPDE)、核酸酶P1(nP1)和大鼠完全肝组织均浆评估代谢稳定性。在不同孵育时期之后，通过IEX-HPLC来定量全长寡核苷酸的水平。这个实施例中呈现的结果例如证明相较于适当参照(例如具有相同序列，但手性特异性不同的寡核苷酸的制剂，特别包括立体无规制剂)，并且具体来说相较于“母体”立体无规制剂，手性纯寡核苷酸组合物可具有显著不同的代谢稳定性。在这个实施例中，具有反义于(并且因此靶向)人脂蛋白元-B(ApoB)的序列的寡核苷酸用于在代谢稳定性研究中进行概念验证。
用于寡核苷酸ONT-75、ONT-77、ONT-80、ONT-81、ONT-87、ONT-88、ONT-89和ONT-41的蛇毒磷酸二酯酶(svPDE)消化研究
使用由Oka等(J.Am.Chem.Soc.2008，130，16031-16037)报道的方案，其中进行微小修改。添加含纯化寡核苷酸(10nmol)的水(50μL)至含有svPDE(4×10-3个单位)、100mM Tris-HCl和15mM MgCl2的水溶液(450μL，pH 8.6)中。在37℃下在400rpm下振荡下孵育混合物。在各时间点(0小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天)获取50μL等分试样，并且用25μL 150mM EDTA、2μL蛋白酶K溶液(20mg/mL)和30μL溶解缓冲液(Qiagen，#129115)淬灭，并且在60℃下加热混合物20分钟。添加5μL内标物(5′-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT-3′，一种27聚体寡核苷酸(加下划线的核苷酸被2′-MOE修饰))(200μM)至等分试样中。通过IEX-HPLC来进行定量分析，并且通过UPLC/MS来进行代谢物鉴定。结果说明于图59中。
IEX-HPLC分析显示硫代磷酸酯20聚体在与svPDE一起孵育期间降解，其中在立体异构体之间无显著差异。LCMS分析代谢物揭示大多数降解产物是由于脱硫化而形成。如先前由Prakash等(Biochemistry 2002，41，11642-11648)、Prhave等(Org.Lett.，2003，5，2017-2020)和其他人所报道，也观察到在5′和3′末端的2′-MOE修饰保护这些寡聚物免遭作为3′→5′核酸外切酶的svPDE的消化。
用于寡核苷酸ONT-75、ONT-77、ONT-80、ONT-81、ONT-87、ONT-88、ONT-89和ONT-41的核酸酶P1(nP1)消化研究
采用由Oka等(J.Am.Chem.Soc.2008，130，16031-16037)报道的方案，其中进行微小修改。添加含纯化寡核苷酸(10nmol)的水(50μL)至含有nP1(20个单位)、100mM Tris-HCl和1mM ZnCl2的水溶液(500μL，pH 7.2)中。在37℃下在400rpm下振荡下孵育混合物。在各时间点(0小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、1天、2天)获取50μL等分试样，并且用25μL终止缓冲液(150mM EDTA)、2μL蛋白酶K溶液(20mg/mL)和30μL溶解缓冲液(Qiagen，#129115)淬灭，并且在60℃下加热混合物20分钟。添加5μL内标物(5′-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT-3′)(一种27聚体寡核苷酸)(加下划线的核苷酸被2′-MOE修饰)(200μM)至等分试样中。通过IEX-HPLC来进行定量分析，并且通过UPLC/MS来进行代谢物鉴定。结果说明于图60-67中。
先前已报道核酸酶nP1特异性裂解在磷原子处具有(Sp)绝对构型的DNA硫代磷酸酯键联(Porter等，Biochemistry，1983，22，1369-1377；Oka等，J.Am.Chem.Soc.，2008，130，16031-16037)。观察到研究的5-10-52′-MOE间隔聚体硫代磷酸酯寡核苷酸具有类似裂解样式，其中发现nP1在(Sp)硫代磷酸酯中心处高效消化间隔聚体寡核苷酸的DNA核心，而不影响不依赖于立体化学而稳定的2′-MOE翼区。对于立体无规非对映异构混合物寡核苷酸ONT-41以及对于在DNA核心中含有(Sp)-硫代磷酸酯核苷酸间键联的立体纯寡核苷酸(ONT-77、ONT-80、ONT-87、ONT-88和ONT-89)，观察到DNA核心在1小时内完全消化。所有裂解产物都通过UPLC/MS来明确鉴定。如先前在文献中所报道，我们发现(Rp)硫代磷酸酯DNA明显不是nP1的底物。在37℃下持续1小时的孵育时期，具有(Rp)硫代磷酸酯DNA核心的两种手性纯寡核苷酸(ONT-75和ONT-81)对nP1完全稳定。ONT-75和ONT-81显示在历经数天的孵育过程期间，全长产物损失约10-15％。这个实施例中呈现的结果例如证明相较于适当参照(例如具有相同序列，但手性特异性不同的寡核苷酸的制剂，特别包括立体无规制剂)，并且具体来说相较于“母体”立体无规制剂，手性纯寡核苷酸组合物在nP1测定中可具有显著不同的代谢稳定性。
用于分析酶消化产物的一般性IEX-HPLC方法
缓冲液A：10mM TrisHCl，50％ACN，pH 8.0
缓冲液B：10mM TrisHCl，800mM NaClO4，50％ACN，pH 8.0
管柱：DIONEX，DNAPac，PA-100，4.0×250mm，零件号063000
管柱温度＝60℃
在254和280nm下监测信号
使用的梯度：
用于分析酶消化产物的一般性UPLC-LCMS方法。
缓冲液A：15mM TEA，400mM HFIP，水
缓冲液B：50∶50缓冲液A/甲醇
管柱：UPLCOST C181.7μm，2.1×500mm
管柱温度＝60℃
使用的梯度：
人非对映异构纯寡核苷酸在预孵育的大鼠完全肝组织均浆中的体外代谢稳定性
测量手性纯寡核苷酸在体外大鼠完全肝组织均浆中的代谢稳定性。先前已报道此处采用的方案，并且用于评估寡核苷酸药物的稳定性。
方案：由Geary等报道的方案在进行一些修改下用于当前研究中(Oligonucleotides，2010，20，309)。
测试系统：两只雄性Sprague-Dawley大鼠(褐鼠(Rattusnorvegicus))由Charles River Laboratories，Inc.(Hollister，CA)提供。
组织收集：在组织收集之前使动物适应研究室两天。在组织收集时，用腹膜内(IP)注射戊巴比妥钠溶液来麻醉动物。使用500mL冷冻盐水/动物，通过肝门静脉施用来进行肝灌注。在灌注之后，将肝解剖，并且维持在冰上。将肝切碎成小碎片，接着称重。
肝组织均浆制备：将肝组织的切碎碎片转移至去皮重的50mL离心管中并称重。添加冷冻均质化缓冲液(100mM Tris(pH 8.0)、1mM乙酸镁，具有抗生素-抗霉菌剂)至各管中，以使一个或多个管含有每克组织5mL缓冲液。使用QIAGEN TissueRuptor组织均质器，在将管维持在冰上的情况下使肝/缓冲液混合物均质化。使用PierceBCA蛋白质测定来测定肝组织均浆的蛋白质浓度。将肝组织均浆分成1mL等分试样，转移至冷冻小瓶中，并且储存在-60℃下。
孵育条件：解冻1mL冷冻肝组织均浆等分试样(蛋白质浓度＝31.9mg/mL)，并且在37℃下孵育24小时。取六个埃彭道夫(eppendorf)管(2mL)，并且在各管中添加450μL组织均浆。添加50μL测试寡核苷酸(200μM)至各管中。在混合之后立刻，添加125μL(5×)终止缓冲液(2.5％IGEPAL、0.5M NaCl、5mM EDTA、50mM Tris，pH＝8.0)和12.5μL 20mg/mL蛋白酶K(Ambion，#AM2546)至一个管中，作为0小时时间点。接着在60℃下加热混合物1小时。在37℃下，在VWR孵育微板振荡器上在400rpm下振荡下孵育剩余反应混合物。在孵育指定时期(1、2、3、4和5天)之后，各混合物用125μL(5×)终止缓冲液(2.5％IGEPAL、0.5M NaCl、5mM EDTA、50mM Tris，pH＝8.0)和12.5μL 20mg/mL蛋白酶K(Ambion，#AM2546)处理。
处理和生物分析：(5′-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT-3′)(一种27聚体寡核苷酸)(加下划线的核苷酸被2′-MOE修饰)用作用于定量非对映异构纯寡核苷酸的内标物。添加50μL内标物(200μM)至各管中，随后添加250μL 30％氢氧化铵、800μL苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)。在混合以及在600rpm下离心之后，在快速真空装置上将水层蒸发至100μL，并且装载于Sep Pak管柱(C18，1g，WAT 036905)上。Sep pak管柱的所有水性洗涤物都用快速IEX-HPLC方法测试以确保在那里不会发现产物。浓缩乙腈洗脱物至干燥，并且溶解于100μL水中，并且使用RP-HPLC进行分析。
洗脱剂A＝10mM乙酸三丁铵，pH＝7.0
洗脱剂B＝ACN
管柱：XTerra MS C18，3.5μm，4.6×150mm，零件号：186000432
管柱温度＝60℃
HPLC梯度：
图68显示不同手性纯寡核苷酸在大鼠完全肝组织均浆中具有不同代谢稳定性曲线。实验也证明相较于具有相同序列和化学组成的非对映异构纯立体确定的寡核苷酸(ONT-75和ONT-77在此处用作实例，但如由本领域普通技术人员所了解，这个观察结果可外推至这个分子的其它可能的非对映异构纯立体确定的硫代磷酸酯非对映异构体)，非对映异构混合物ONT-41具有不同代谢稳定性曲线。
在37℃下，在预孵育的大鼠完全肝组织均浆中，具有在所有磷原子处具有完全Rp绝对构型的立体控制的硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸ONT-75在一天内完全降解，从而证明研究中使用的三种寡核苷酸的最低代谢稳定性。
另一非对映异构纯立体确定的硫代磷酸酯寡核苷酸ONT-77(具有绝对构型：5R-10S-4R)比立体无规ONT-41(米泊美生)稳定两倍。在孵育5天之后，相对于立体无规ONT-41(米泊美生)的约15％的全长寡核苷酸，非对映异构纯ONT-77有40％的全长寡核苷酸剩余。ONT-77与ONT-41之间的直接比较明确显示遍及所有分析的时间点，立体控制的异构体5R-10S-4R(ONT-77)的代谢稳定性显著较高。非对映异构纯异构体ONT-77的立体确定的构造明确影响这个寡核苷酸的降解速率和总体代谢稳定性。这些观察结果得出结论：在不意图受理论限制下，相较于立体无规非对映异构混合物，应用于5-10-5间隔聚体寡核苷酸的DNA核心的Sp立体化学提供增强的核酸内切酶抗性以及因此增强的代谢稳定性。将预期用于这个序列的其它非对映异构纯立体控制的硫代磷酸酯异构体的一些其它立体构造在这个实验中显示甚至更高的代谢稳定性。
在不希望受理论限制下，这个实施例中呈现的结果例如证明在硫代磷酸酯键联处的Rp立体化学(ONT-75)在大鼠肝组织均浆中的代谢稳定性小于含有Sp DNA核心的ONT-77。这个实施例中呈现的结果也例如证明相较于适当参照(例如具有相同序列，但手性特异性不同的寡核苷酸的制剂，特别包括立体无规制剂)，并且具体来说相较于“母体”立体无规制剂，手性纯寡核苷酸组合物在大鼠肝组织均浆中可具有显著不同的代谢稳定性。在这个实施例中，具有反义于(并且因此靶向)人脂蛋白元-B(ApoB)的序列的寡核苷酸用于在代谢稳定性研究中进行概念验证。提供的手性控制的寡核苷酸对内源性酶可具有增加或降低的稳定性。通过提供手性控制的寡核苷酸以及其组合物和方法，本发明提供药理学性质比已知未手性控制的寡核苷酸和它们的组合物增强的寡核苷酸和组合物。
具有立体控制的硫代磷酸二酯键联的人PCSK9 siRNA双链体在人血清中的体外代谢稳定性。
使用类似于先前报道的程序(Oka等，J.Am.Chem.Soc.2008，130，16031-16037)的方案。添加含siRNA双链体(2.5μmol)的水(50μL)至人血清(450μL)中。在37℃下在400rpm下振荡下孵育混合物。在各时间点(0小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时和24小时)取出50μL等分试样，并且用25μL 150mM EDTA、2μL蛋白酶K溶液(20mg/mL)和30μL溶解缓冲液(Qiagen，#129115)淬灭，并且在60℃下加热混合物20分钟。添加5μL内标物(5′-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT-3′，一种27聚体寡核苷酸(加下划线的核苷酸被2′-MOE修饰))(200μM)至等分试样中。通过IEX-HPLC来进行定量分析，并且通过UPLC/MS来进行代谢物鉴定。
在一些实施方案中，具有Sp构型的3′末端非对映异构纯硫代磷酸酯的siRNA双链体相较于在相同位置处具有Rp构型的硫代磷酸酯的siRNA或立体无规非对映异构混合物显示在人血清中的代谢稳定性较高。在其它实施方案中，具有Sp构型的5′末端非对映异构纯硫代磷酸酯的siRNA双链体相较于在相同位置处具有Rp构型的硫代磷酸酯的siRNA或立体无规非对映异构混合物显示在人血清中的代谢稳定性较高。在其它实施方案中，具有在3′末端与5′末端两者处均具有Sp构型的非对映异构纯硫代磷酸酯的siRNA双链体相较于在相同位置处具有Rp构型的硫代磷酸酯的siRNA或立体无规非对映异构混合物显示在人血清中的代谢稳定性较高。在其它实施方案中，具有多个Sp构型的非对映异构纯硫代磷酸酯的siRNA双链体相较于具有多个Rp构型的硫代磷酸酯的siRNA或立体无规非对映异构混合物显示在人血清中的代谢稳定性较高。在其它实施方案中，具有完全Sp构型的非对映异构纯硫代磷酸酯骨架的siRNA双链体相较于具有完全Rp构型的硫代磷酸酯骨架的siRNA或立体无规非对映异构混合物显示在人血清中的代谢稳定性较高。
实施例88.手性控制的寡核苷酸组合物相较于具有相同序列的未手性控制的组合物显示不同体外效能
本实施例比较手性纯寡核苷酸的体外药理学活性与对于“母体”立体无规混合物(即对于含有与手性纯寡核苷酸具有相同序列，但例如由于已通过立体无规方法来制备而不显示手性纯度的寡核苷酸的组合物)观察到的体外药理学活性。合成、配制各自具有互补于特定靶标转录物或编码目标蛋白质的基因的序列的序列的四种手性纯寡核苷酸，并且转染至原代小鼠肝细胞中。定量mRNA水平以评估遏制程度。在这个实施例中，具有反义于(并且因此靶向)人脂蛋白元-B(ApoB)的序列的寡核苷酸用于在表达人ApoB的转基因小鼠中进行概念验证。
用寡核苷酸转染小鼠原代肝细胞
7周龄的C57BL6雄性小鼠用于提取小鼠原代肝细胞，并且将其接种在96孔板(不重叠)(Celsis/Bioreclamation IVT)中。使用制造商方案，每个96板孔使用0.5ul脂质转染剂，用脂质转染剂(LifeTechnologies，目录号18292-037)进行原代肝细胞的转染。在6uM下起始，产生十二个1∶3siRNA双链体稀释度。接着使每孔10ul 10x寡聚物与制备的9.5ul体外Gro HI培养基(Celsis目录号Z99009)无血清培养基和0.5ul脂质转染剂的混合物脂质复合。在孵育10-15分钟之后，添加20ul脂质复合的寡聚物至含原代肝细胞的80ul体外GroHI培养基中以使每孔的最终体积达到100ul。在转染之后24小时，溶解细胞。
脂蛋白元B mRNA测定
使用MagMAXTM-96总RNA分离试剂盒(Life Technologies，AM1830)自细胞溶解产物纯化总mRNA；用具有RNA酶抑制剂的高容量cDNA反转录试剂盒(Life Technologies，4374967)合成15ulcDNA。根据制造商方案，使用以下引物，通过利用Probes Master混合物(Roche，04 707 494 001)在Lightcycler 480(Roche)上进行实时PCR来评估基因表达：
小鼠脂蛋白元B引物：
[模板：(GenBank登录号M35186)]
●正向引物：CGTGGGCTCCAGCATTCTA
●反向引物：AGTCATTTCTGCCTTTGCGTC
●PCR探针：FAM-CCAATGGTCGGGCACTGCTCAA--TAMRA
小鼠GAPDH引物：
●正向引物：GGCAAATTCAACGGCACAGT
●反向引物：GGGTCTCGCTCCTGGAAGAT
●PCR探针：5′JOE-AAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATC-TAMRA 3′
数据分析
ΔΔCt方法用于计算数值。对于各样本，相对于平均GAPDH信号来使平均ApoB信号标准化，并且接着相对于模拟转染以及未处理的样本的平均相应比率加以标准化以获得ApoB蛋白的相对表达水平。“母体”立体无规混合物用于参照。使四参数线性回归曲线与数据拟合，并且将底部和顶部分别约束至0％和100％常数以使用GraphpadPrism计算相对IC50。
体外剂量-反应(图71和72)显示手性纯寡核苷酸具有显著不同效能，其中ONT-83最强力，并且ONT-84和ONT-85最不强力，IC50具有8.6倍差异(表E-39)。
表E-39.立体异构体(ONT-83、ONT-84、ONT-85或ONT-86)遏制原代小鼠肝细胞中的小鼠脂蛋白元B/GAPDH mRNA水平的IC50值
底部 顶部 LogIC50 希尔斜率 IC50
ONT-83 0 100 1.6 -0.4 35.8
ONT-82 0 100 1.8 -0.3 64.4
ONT-85 0 100 2.5 -0.3 308.0
ONT-84 0 100 2.5 -0.8 307.8
ONT-86 0 100 1.7 -0.6 51.2
这个实施例中呈现的结果例如证明相较于适当参照(例如具有相同序列，但手性特异性不同的寡核苷酸的制剂，特别包括立体无规制剂)，并且具体来说相较于“母体”立体无规制剂，手性纯寡核苷酸组合物可具有显著不同的体外药理学活性。本领域技术人员鉴于这个证明将了解由本公开提供的手性控制的寡核苷酸组合物具有出乎意料的活性和特征。
等效物
已描述本发明的一些说明性实施方案，应为本领域技术人员显而易知的是前述事项仅是说明性而非限制性的，已仅通过举例方式加以呈现。众多修改和其它说明性实施方案在本领域普通技术人员的能力范围内，并且预期属于本发明的范围。具体来说，尽管本文呈现的许多实例涉及方法动作或系统要素的特定组合，但应了解那些动作和那些要素可以其它方式组合以达成相同目标。仅与一个实施方案关联讨论的动作、要素和特征不旨在自其它实施方案中的类似作用排除。此外，对于以下权利要求中叙述的一个或多个手段加功能限制，手段不旨在限于本文公开的用于执行叙述的功能的手段，而是旨在在范围方面涵盖目前已知或稍后开发的用于执行叙述的功能的任何手段。
在权利要求中使用顺序术语，如“第一”、“第二”、“第三”等来修饰权利要求要素本身并不意味一个权利要求要素超过另一个的任何优先、居先或次序或执行方法的动作所依的时序，而是仅用作区分具有某一名称的一个权利要求要素与(如果不使用顺序术语，那么将)具有相同名称的另一要素以区分所述权利要求要素的标记。类似地，使用a)、b)等或i)、ii)等本身并不意味权利要求中的步骤的任何优先、居先或次序。类似地，在说明书中使用这些术语本身并不意味任何需要的优先、居先或次序。
前述书面说明书被视为足以使得本领域技术人员能够实施本发明。本发明在范围方面不受提供的实施例限制，因为实施例旨在作为对本发明的一个方面的单一说明，并且其它功能等效实施方案在本发明的范围内。除本文所示和所述的那些修改之外，根据先前描述，本发明的各种修改将变得为本领域技术人员显而易知，并且属于随附权利要求的范围。本发明的优势和目标未必由本发明的各实施方案所涵盖。
附录(B)
表1 US 6,207,646 B1
附录(B)
表1-接续
1刺激指数是由至少3个单独实验获得的平均值和标准偏差，
并且与在不添加ODN下培养的各孔进行比较。
ND＝未进行。
对CpG二核苷酸加下划线。
点指示同一性；虚线指示缺失。
指示5甲基胞嘧啶。
表2
点指示同一性；对CpG二核苷酸加下划线；ND＝未进行
a进行实验至少三次，得到类似结果。与脾B细胞两者的未刺激的对照培养物的IL-6的水平均≤10pg/ml。未刺激的培养物的IgM水平是547±82ng/ml。对CpG二核苷酸加下划线，并且点指示同一性。
b[a]尿苷摄取指示为自未刺激的对照(2322.67±213.68cpm)开始的倍数增加(SI：刺激指数)。
细胞用20μM各种CpGO-QDN刺激。数据呈现一式三份的平均值±SD
c通过ELISA所测量。
附录(B)
表3
附录(B)
表5
由CpG寡聚物对人PBMC细胞因子分泌的诱导
附录(B)
表9
表10
对CpG二核苷酸加下划线；合成具有硫代磷酸酯修饰的骨架的寡核苷酸以改进它们的核酸酶抗性。
1如实施例I中所述，通过在与200nM浓度的寡脱氧核苷酸一起培养48小时之后的3H胸苷并入所度量。
2以溶解单位度量。
附录(B)
US 6,214,806 B1
表1
P＞0.05，曼-惠特尼U检验
表2
附录(B)
表3
ODN序列中的CpG二核苷酸是通过加下划线来指示；X指示甲基胞嘧啶。
小写字母指示核酸酶抗性硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键联，视侧接碱基而定，其在滴定实验中的强力性是非修饰的ODN的强力性的20倍以上。
多G末端(g)用于一些ODN中，因为它们显著增加ODN摄取的水平。
虚线指示除指示的变化之外，一些碱基与先前紧邻序列中的那些碱基相同。
附录(B)
表4
1如所述来测量溶解单位(LU)(8)。
简要来说，自正常供体收集PBMC，并且在Ficoll上旋转，接着与或不与指示的ODN(其在6μg/ml下添加至培养物中)一起培养24小时。
接着测定它们溶解51Cr标记的K562细胞的能力。
显示的结果代表用若干不同正常人供体获得的那些结果。
2这个寡聚物混合物在各位置含有随机选择的全部4种碱基。
附录(B)
表5
1PBMC基本上如本文所述。结果代表6个单独实验；各实验代表不同供体。
2这是甲基化形式的ODN1840：Z＝5-甲基胞嘧啶；LU是溶解单位；ND＝未进行；为明确起见，对CpG二核苷酸加下划线。
附录(B)
表6
1细胞＝在手术收集之后储存在-70℃下的人脾细胞或自正常供体收集，并且在Ficoll上旋转的PBMC。细胞在94孔U形底微量滴定板中与或不与指示的ODN(其在6μml下添加至培养物中)一起培养。N＝12个实验。将细胞培养4-7天，用1
3H胸苷脉冲处理18小时，随后收集并闪烁计数。刺激指数＝无ODN的孔中的cpm与已在整个培养时期期间用指示的ODN(在建立培养之后不再添加ODN)剌激的孔中的cpm的比率。ND＝未进行
表7
1自正常供体收集PBMC，并且在Ficoll上旋转，接着与或不与指示的ODN(其在6μg/ml下添加至培养物中)一起在96孔微量滴定板中在106个细胞/孔下培养。在24小时时收集上清液，并且如方法中所述，通过ELISA来测试IL-12水平。在代表不同供体的各实验中操作标准曲线。
附录(B)
表8
对CpG二核苷酸加下划线；合成具有硫代磷酸酯修饰的骨架的寡核苷酸以改进它们的核酸酶抗性。
1如实施例1中所述，通过在与200nM浓度的寡脱氧核苷酸一起培养48小时之后的3H胸苷并入所度量。
2以溶解单位度量。
附录(B)
US 6,218,371
表1
附录(B)
表1-接续
附录(B)
表1-接续
附录(B)
表1-接续
附录(B)
表2
1自正常供体收集PBMC，并且在Ficoll上旋转，接着与或不与指示的寡核苷酸(其在μg/ml下添加至培养物中)一起在96孔微量滴定板中在106个细胞/孔下培养。在24小时时收集上清液，并且如方法中所述，通过ELISA来测试IL-12水平。在代表不同供体的各实验中操作标准曲线。
表3
附录(B)
US 6,239,116 B1
表1
附录(B)
表1接续
刺激指数是由至少3个单独实验获得的平均值和标准偏差，并且与在不添加
ODN下培养的各孔进行比较。
ND＝未进行。
对CpG二核苷酸加下划线。
点指示同一性；虚线指示缺失。
Z指示5甲基胞嘧啶。
附录(B)
表2
点指示同一性；对CpG二核苷酸加下划线；ND＝未进行
a进行实验至少三次，得到类似结果。CH12LX与脾B细胞两者的未刺激的对照培养物的IL-6的水平均≤10pg/ml。未刺激的培养物的IgM水平是547±82ng/ml。对CpG二核苷酸加下划线，并且点指示同一性。
b[3H]尿苷摄取指示为自未刺激的对照(2322.67±213.68cpm)开始的倍数增加（SI：刺激指数)。
细胞用20μM各种CpGO-ODN刺激。数据呈现一式三份的平均值±SD
c通过ELISA所测量。
附录(B)
表3
附录(B)
表3-接续
来自DBA/
2小鼠的去除T细胞的脾细胞用磷酸二酯修饰的寡核苷酸（O-ODN）(20μM)、小牛胸腺DNA(50μg/ml)或大肠杆菌DNA(50μg/ml)在有或无酶处理剂或LPS(10μg/ml)下刺激24小时。数据代表一式三份的平均值(pg/ml）±SD，对CpG二核苷酸加下划线，并且点指示同一性。Z指示5-甲基胞嘧啶。
表4
小鼠(2只小鼠/组)用100μl PBS、200μg大肠杆菌DNA或小牛胸腺DNA，或500μgCpG S-ODN或非CpG对照S-ODN静脉内注射。在注射之后2小时将小鼠放血，并且通过IL-6ELISA来分析各血清的1∶10稀释液。IL-6ELISA的灵敏限是5pg/ml。CpG S-ODN的序列是5′GCATGACGT-TGAGCT3′（SEQ.ID.No：6)，并且非刺激性S-ODN的序列是5′GCTAGATGTTAGCGT3′(SEQ.ID.No：49)。应注意尽管在序列48中存在CpG，但它太接近于3′末端以致不能实现刺激，如本文所说明。数据代表一式两份的平均值±SD。进行实验至少两次，得到类似结果。
附录(B)
表5
表5-接续
点指示同一性；对CpG二核苷酸加下划线
1通过使用来自R&DSystems的Quantikine试剂盒进行ELISA所测量(pg/ml)。在具有指示的寡脱氧核苷酸(12μg/ml)的10％自体血清中培养细胞4小时(在TNF-α的情况下)或24小时(对于其它细胞因子)，随后收集并测定上清液。数据呈现为高于未添加寡脱氧核苷酸的孔中的细胞因子水平的细胞因子水平。
附录(B)
表6
1所有细胞因子的水平都如先前表中所述，通过使用来自R&DSystems的Quantikine试剂盒进行ELISA来测定。结果代表使用来自不同供体的PBMC。
2细胞用L-亮氨酰基-L-亮氨酸甲酯(M-LME)预处理15分钟以确定在这些条件下的细胞因子产生是否来自单核细胞(或其它L-LME敏感细胞)。
3根据制造商说明书，使用每μgDNA2UμgCPG甲基酶(New England Biolabs)使EC DNA甲基化，并且通过用Hpa-II和Msp-I消化来确认甲基化。作为阴性对照，包括含有两倍最大量的LPS的样本，所述LPS含于在这些实验条件下未能诱导可检测细胞因子产生的最高浓度的EC DNA中。ND＝未进行
表7
附录(B)
表8
附录(B)
表9
ODN序列中的CpG二核苷酸是通过加下划线来指示；Z指示甲基胞嘧啶。小写字母指示核酸酶抗性硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键联，视侧接碱基而定，其在滴定实验中的强力性是非修饰的ODN的强力性的20倍以上。多G末端(g)用于一些ODN中，因为它们显著增加ODN摄取的水平。
附录(B)
表10
1如所述来测量溶解单位(LU)(8).简要来说，自正常供体收集PBMC，并且在Ficoll上旋转，接着与或不与指示的ODN(其在6μg/ml下添加至培养物中)一起培养24小时。接着测定它们常解51Cr标记的K562细胞的能力。显示的结果代表用若干不同正常人供体获得的那些结果。2这个寡聚物混合物在各位置含有随机选择的全部4种碱基。
附录(B)
表11
1PBMC基本上如本文所述。结果代表6个单独实验；各实验代表不同供体。
2这是甲基化形式的ODN 1840(SEQ ID NO：83)；Z＝在残基8和17处的5-甲基胞嘧啶；LU是溶解单位；ND＝未进行；为明确起见，对CpG二核苷酸加下划线
附录(B)
表12
表12-接续
1细胞＝在手术收集之后储存在-70℃下的人脾细胞或自正常供体收集，并且在Ficoll上旋转的PBMC。细胞在96孔U形底微量滴定板中与或不与指示的ODN（其在6μml下添加至培养物中)一起培养。N＝12个实验。将细胞培养4-7天，用1μCi3H胸苷脉冲处理18小时。随后收集并闪烁计数。刺激指数＝无ODN的孔中的cpm与已在整个培养时期期间用指示的ODN(在建立培养之后不再添加ODN）刺激的孔中的cpm的比率。ND＝未进行
附录(B)
表13
附录(B)
表13-接续
1自正常供体收集PBMC，并且在Ficoll上旋转，接着与或不与指示的ODN(其在6μg/ml下添加至培养物中)一起在96孔微量滴定板中在106个细胞/孔下培养。在24小时时收集上清液，并且如方法中所述，通过ELISA来测试IL-12水平。在代表不同供体的各实验中操作标准曲线。
表14
对CpG二核苷酸加下划线；合成具有硫代磷酸酯修饰的骨架的寡核苷酸以改进它们的核酸酶抗性。1如实施例1中所述，通过在与200nM浓度的寡脱氧核苷酸一起培养48小时之后的3H胸苷并入所度量。2以溶解单位度量。
附录(B)
表15
表15代号IL-12和TNF-α测定；将氯类单核细胞细胞系3774(1x个细胞/mL(对于IL12)或1x106个细胞ml(TNF-α))与或不与所示浓度的指示的抑制剂一起培养2小时，接着用2μMCpG寡脱氧核苷酸(ODN)1826(TCCATGACGTTCCTCACGTT SEQ ID NO：10)或LPS(10μg/ml))刺激4小时(TNF-α)或24小时(IL-12)，此时收集上清液。基本上如所述对上清液进行针对IL-12或TNF-α（pg/ml)的ELISA(A.K.Krig，A.K.Yi，S.Maison.T，J，waldschmidt，G，A，Bishop，R.Teasdale，G.Koretzky和D.Klinman Nature 374，546(1995)，YiA.-K.，D.M.Klinman，T.L.Martin，S.Matson和A.M.Krieg，J Immunol.，157，5394-5402(1996)；Krieg.A.MJ Lab Clin，Med，128，128-133(1996)。
细胞与缺乏CpG基序的ODN一起培养不诱导细胞因子分沁。用IL-6测定，并且在使用原代脾细胞或B细胞系CH12LX和WEHI-231的实验中，观察到CpG反应的类似特异性抑制。2.5μg/ml的氯喹等效于＜5μM。NF-κB活化的其它抑制剂(包括PDTC和钙蛋白酶抑制剂I和II）给出与所示抑制剂类似的结果。所示结果代表在十个不同实验中获得的那些结果。
附录(B)
US 6,339,068 B1
附录(B)
表6
注解：(分别SEQ ID NO：51-67)
附录(B)
表10
表11
注解：
寡聚物1619的序列是TCCATGTCGTTCCTGATGCT(SEQ ID NO：71）
1949在3′末端仅具有1个GCG，其基本上不具有抑制活性
附录(B)
表13
1ODM 1952和1953的序列中的点指示与ODN 1619的同一性；为明确起见，对CpG二核苷酸加下划线。无CpG-N或CpG-S基序的ODN对细胞因子产生具有少许或不具有影响。所示数据代表4个实验。
2所有细胞因子都以pg/ml给出；通过对来自在96孔板中在2x107个细胞/ml下与30μg/ml的指示的ODN一起培养24小时的DBA/2脾细胞的上清液进行ELISA所测量。三重孔的标准偏差是＜7％。无ODN诱导大量IL-5。
表14
1将BALB/c脾细胞在96孔板中在2x107个细胞/ml下与指示的ODN一起培养24小时，接着通过ELISA来测定上清液的IL-12(pg/ml)。
2将细胞设置成与1中相同，例外之处是通过在30μg/ml下添加CpG ODM1619(TCCATGTCGTTCCTGATGCT)来诱导IL-12分泌。所示数据代表5个实验。
附录(C)
示例性人miRNA序列

Claims (100)

1.一种手性控制的寡核苷酸组合物，其包含多种至少一种类型的寡核苷酸，其中每种类型是由以下加以定义：
1)碱基序列；
2)骨架键联样式；
3)骨架手性中心样式；以及
4)骨架X部分样式。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种类型的寡核苷酸是单聚体。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述至少一种类型的寡核苷酸是立体单聚体、P修饰单聚体或键联单聚体。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种类型的寡核苷酸是交替聚体。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述至少一种类型的寡核苷酸是立体交替聚体、P修饰交替聚体或键联交替聚体。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种类型的寡核苷酸是嵌段聚体。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述至少一种类型的寡核苷酸是立体嵌段聚体、P修饰嵌段聚体或键联嵌段聚体。
8.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种类型的寡核苷酸是间隔聚体。
9.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种类型的寡核苷酸是跳跃聚体。
10.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种类型的寡核苷酸是反义寡核苷酸、微小RNA拮抗剂、微小RNA、前微小RNA、反义微小RNA、超级微小RNA、核糖酶、Ul衔接头、RNA活化剂、RNAi剂、诱饵寡核苷酸、成三链体寡核苷酸或适体。
11.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种类型的寡核苷酸适用于调控蛋白质或RNA的水平。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述至少一种类型的寡核苷酸适用于调控mRNA的水平。
13.如权利要求11所述的组合物，其中所述至少一种类型的寡核苷酸适用于调控微小RNA的水平。
14.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种寡核苷酸类型包含一个或多个硫代磷酸三酯核苷酸间键联。
15.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种寡核苷酸类型包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少10个硫代磷酸三酯核苷酸间键联。
16.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种寡核苷酸类型包含至少10个、至少12个或至少15个硫代磷酸三酯核苷酸间键联。
17.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种寡核苷酸类型包含一个或多个独立地具有式I结构的修饰的核苷酸间键联：
其中：
P*是不对称磷原子，并且是Rp或Sp；
W是O、S或Se；
X、Y和Z各自独立地是-O-、-S-、-N(-L-R1)-或L；
L是共价键或任选地取代的直链或分支C1-C50亚烷基，其中L的一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-；
R1是卤素、R或任选地取代的C1-C10脂族，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-；
各R′独立地是-R、-C(O)R、-CO2R或-SO2R，或：
同一氮上的两个R′连同它们的间插原子一起形成任选地取代的杂环或杂芳基环，或
同一碳上的两个R′连同它们的间插原子一起形成任选地取代的芳基、碳环、杂环或杂芳基环；
-Cy-是选自亚苯基、亚碳环基、亚芳基、亚杂芳基或亚杂环基的任选地取代的二价环；
各R独立地是氢或选自C1-C6脂族、苯基、碳环基、芳基、杂芳基或杂环基的任选地取代的基团；并且
各独立地表示与核苷的连接。
18.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种寡核苷酸类型包含一个或多个独立地具有式I-a、I-b或I-c结构的修饰的核苷酸间键联。
19.如权利要求18所述的组合物，其中所述至少一种寡核苷酸类型包含一个或多个独立地具有式I-c结构的修饰的核苷酸间键联。
20.如权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中所述至少一种寡核苷酸类型还包含一个或多个磷酸二酯键联。
21.一种寡核苷酸组合物，其因所述组合物含有预定水平的一种或多种个别寡核苷酸类型而是手性控制的，其中寡核苷酸类型是由以下加以定义：
1)碱基序列；
2)骨架键联样式；
3)骨架手性中心样式；以及
4)骨架X部分样式。
22.如权利要求21所述的寡核苷酸组合物，其中所述组合物是手性纯的。
23.如权利要求22所述的寡核苷酸组合物，其中所述组合物是手性均一的。
24.如权利要求22所述的寡核苷酸组合物，其中所述组合物含有预定水平的至少两种寡核苷酸类型。
25.如权利要求22所述的寡核苷酸组合物，其中所述组合物含有预定水平的至少三种或至少四种寡核苷酸类型。
26.如权利要求1或权利要求21所述的寡核苷酸组合物，其中一种或多种寡核苷酸类型选自表2。
27.一种手性控制的寡核苷酸，其包含一个或多个硫代磷酸三酯核苷酸间键联。
28.如权利要求27所述的组合物，其包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少10个硫代磷酸三酯核苷酸间键联。
29.一种手性控制的寡核苷酸，其包含至少10个、至少12个或至少15个硫代磷酸三酯核苷酸间键联。
30.一种手性控制的寡核苷酸，其包含一个或多个独立地具有式I结构的修饰的核苷酸间键联：
其中：
P*是不对称磷原子，并且是Rp或Sp；
W是O、S或Se；
X、Y和Z各自独立地是-O-、-S-、-N(-L-R1)-或L；
L是共价键或任选地取代的直链或分支C1-C50亚烷基，其中L的一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-；
R1是卤素、R或任选地取代的C1-C10脂族，其中一个或多个亚甲基单元任选地并独立地被以下置换：任选地取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-c≡c-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-N(R′)C(O)O-、-OC(O)N(R′)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-N(R′)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-或-C(O)O-；
各R′独立地是-R、-C(O)R、-CO2R或-SO2R，或：
同一氮上的两个R′连同它们的间插原子一起形成任选地取代的杂环或杂芳基环，或
同一碳上的两个R′连同它们的间插原子一起形成任选地取代的芳基、碳环、杂环或杂芳基环；
-Cy-是选自亚苯基、亚碳环基、亚芳基、亚杂芳基或亚杂环基的任选地取代的二价环；
各R独立地是氢或选自C1-C6脂族、苯基、碳环基、芳基、杂芳基或杂环基的任选地取代的基团；并且
各独立地表示与核苷的连接。
31.一种手性控制的寡核苷酸，其包含一个或多个独立地具有式I-a、I-b或I-c结构的修饰的核苷酸间键联。
32.一种手性控制的寡核苷酸，其包含一个或多个独立地具有式I-c结构的修饰的核苷酸间键联。
33.如权利要求27-32中任一项所述的手性控制的寡核苷酸，其中所述至少一种寡核苷酸类型还包含一个或多个磷酸二酯键联。
34.如权利要求27-33中任一项所述的手性控制的寡核苷酸，其包含至少5个、至少6个或至少7个连续修饰的核苷酸间键联，并且至少一个所述连续修饰的核苷酸间键联不是硫代磷酸二酯键联。
35.如权利要求27-34中任一项所述的手性控制的寡核苷酸，其包含至少一个具有以下结构的核苷酸间键联：
36.一种手性控制的寡核苷酸，其选自表2。
37.一种用于制备手性控制的寡核苷酸的方法，其包括以下步骤：
(1)偶联；
(2)加帽；
(3)修饰；
(4)去封闭；以及
(5)重复步骤(1)-(4)直至达成所需长度。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述偶联步骤包括使用CMPT和其中BPRO是受保护的核苷碱基。
39.如权利要求37或38所述的方法，其中所述加帽步骤包括对手性助剂中的氨基加帽以及对未反应的5’-OH加帽的步骤。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述加帽步骤包括使用(Pac)2O。
41.如权利要求37所述的方法，其中所述修饰步骤包括硫化。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述硫化步骤包括使用式S-I或S-II的硫化试剂。
43.如权利要求41所述的方法，其中包括所述硫化步骤的循环形成具有式I的结构的核苷酸间键联。
44.如权利要求37所述的方法，其中所述去封闭步骤包括使用酸的步骤。
45.如权利要求37所述的方法，其中比所述所需长度短一个核苷酸的所有寡核苷酸在组合时小于粗产物的10％。
46.如权利要求45所述的方法，其中比所述所需长度短一个核苷酸的所有寡核苷酸在组合时小于粗产物的5％。
47.如权利要求45所述的方法，其中比所述所需长度短一个核苷酸的所有寡核苷酸在组合时小于粗产物的4％。
48.如权利要求45所述的方法，其中比所述所需长度短一个核苷酸的所有寡核苷酸在组合时小于粗产物的3％。
49.如权利要求45所述的方法，其中比所述所需长度短一个核苷酸的所有寡核苷酸在组合时小于粗产物的2％。
50.如权利要求45所述的方法，其中比所述所需长度短一个核苷酸的所有寡核苷酸在组合时小于粗产物的1％。
51.如权利要求45所述的方法，其中比所述所需长度短一个核苷酸的所有寡核苷酸在组合时小于粗产物的0.5％。
52.一种用于制备手性控制的寡核苷酸组合物的方法，其包括以预定量提供一种或多种寡核苷酸类型。
53.如权利要求37所述的方法，其中硫代磷酸二酯前体用于各硫代磷酸二酯键联。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述硫代磷酸二酯前体是
55.如权利要求53或54所述的方法，其中在达成所需寡核苷酸长度之后，使各硫代磷酸二酯前体转化成硫代磷酸二酯键联。
56.如权利要求37-55中任一项所述的方法，其中至少一个修饰步骤被氧化步骤替换。
57.一种用于修饰寡核苷酸的方法，其包括以下步骤：
(1)提供手性控制的寡核苷酸；
(2)提供修饰试剂；以及
(3)使所述手性控制的寡核苷酸与所述修饰试剂在适于实现对所述手性控制的寡核苷酸的键联磷修饰的条件下反应。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述修饰试剂具有式S-I或S-II。
59.如权利要求57所述的方法，其中使至少一种硫代磷酸二酯前体转化成硫代磷酸二酯键联。
60.如权利要求59所述的方法，其中使各硫代磷酸二酯前体转化成硫代磷酸二酯键联。
61.一种硫化试剂，其具有式S-I。
62.一种硫化试剂，其具有式S-II。
63.一种硫化试剂，其选自表5。
64.一种用于治疗疾病的药物组合物，其包含治疗有效量的如权利要求27-36中任一项所述的手性控制的寡核苷酸以及药学上可接受的赋形剂。
65.一种方法，其包括以下步骤：向罹患或易感癌症的受试者施用一定量的如权利要求1-26和64中任一项所述的寡核苷酸组合物，所述量足以部分或完全减轻、改善、缓和、抑制、预防癌症、延迟其发作、减轻其严重性、和/或降低其一种或多种症状或特征的发生。
66.如权利要求27-35中任一项所述的手性控制的寡核苷酸，其中所述手性控制的寡核苷酸包含见于GCCTCAGTCTGCTTCGCACC中的序列。
67.如权利要求66所述的手性控制的寡核苷酸，其选自表4。
68.如权利要求27-36、66和67中任一项所述的手性控制的寡核苷酸，其中所述手性控制的寡核苷酸具有＞50％的纯度。
69.如权利要求68所述的手性控制的寡核苷酸，其中所述手性控制的寡核苷酸具有＞60％的纯度。
70.如权利要求68所述的手性控制的寡核苷酸，其中所述手性控制的寡核苷酸具有＞70％的纯度。
71.如权利要求68所述的手性控制的寡核苷酸，其中所述手性控制的寡核苷酸具有＞80％的纯度。
72.如权利要求68所述的手性控制的寡核苷酸，其中所述手性控制的寡核苷酸具有＞85％的纯度。
73.如权利要求68所述的手性控制的寡核苷酸，其中所述手性控制的寡核苷酸具有＞90％的纯度。
74.如权利要求68所述的手性控制的寡核苷酸，其中所述手性控制的寡核苷酸具有＞95％的纯度。
75.如权利要求68所述的手性控制的寡核苷酸，其中所述手性控制的寡核苷酸具有＞98％的纯度。
76.如权利要求68所述的手性控制的寡核苷酸，其中所述手性控制的寡核苷酸具有＞99％的纯度。
77.一种手性控制的寡核苷酸，其具有图26中描绘的结构中的一种。
78.一种手性控制的寡核苷酸，其具有图27中描绘的结构中的一种。
79.一种手性控制的寡核苷酸，其具有图28中描绘的结构中的一种。
80.一种手性控制的寡核苷酸，其具有图29中描绘的结构中的一种。
81.一种手性控制的寡核苷酸，其具有图30中描绘的结构中的一种。
82.一种手性控制的寡核苷酸组合物，其包含一种或多种图26中描绘的寡核苷酸。
83.一种手性控制的寡核苷酸组合物，其包含一种或多种图27中描绘的寡核苷酸。
84.一种手性控制的寡核苷酸组合物，其包含一种或多种图28中描绘的寡核苷酸。
85.一种手性控制的寡核苷酸组合物，其包含一种或多种图29中描绘的寡核苷酸。
86.一种手性控制的寡核苷酸组合物，其包含一种或多种图30中描绘的寡核苷酸。
87.一种手性控制的寡核苷酸，其具有WO 2012/030683中描绘的任一结构。
88.一种手性控制的寡核苷酸组合物，其包含具有WO2012/030683中描绘的任一结构的寡核苷酸。
89.一种手性控制的寡核苷酸，其具有WO 2012/030683中描述或描绘的任一碱基序列。
90.一种手性控制的寡核苷酸，其是通过如权利要求37-60中任一项所述的方法来制备。
91.一种手性控制的寡核苷酸，其是通过包括方案I中描绘的一个或多个循环的方法来制备。
92.一种手性控制的寡核苷酸，其是通过包括方案I-b中描绘的一个或多个循环的方法来制备。
93.一种手性控制的寡核苷酸，其是通过包括方案I-c中描绘的一个或多个循环的方法来制备。
94.一种手性控制的寡核苷酸，其是通过包括方案I-d中描绘的一个或多个循环的方法来制备。
95.如权利要求27-36以及66-94中任一项所述的手性控制的寡核苷酸，其中所述手性控制的寡核苷酸不连接于固体载体。
96.一种手性控制的寡核苷酸组合物，其包含具有WO2012/030683中描述或描绘的任一碱基序列的寡核苷酸。
97.一种手性控制的寡核苷酸组合物，其包含如权利要求27-36以及66-95中任一项所述的手性控制的寡核苷酸。
98.一种方法，其包括以下步骤：
a)对第一组合物进行第一分析，所述第一组合物包含多种不同类型的寡核苷酸；以及
b)比较所述进行的第一分析与在与所述第一分析可比的条件下对第二组合物的第二分析，所述第二组合物是所述寡核苷酸的手性控制的组合物，其中所述第一分析与所述第二分析之间的差异反映相较于所述第二组合物，所述第一组合物中的至少一种类型的所述寡核苷酸的存在性或水平的差异。
99.如权利要求98所述的方法，其中所述第二组合物仅含有单一类型的所述寡核苷酸。
100.如权利要求98所述的方法，其中所述第二组合物是如权利要求1-26以及95-96中任一项所述的组合物。
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