CN114502177A - 寡核苷酸组合物及其使用方法 - Google Patents

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钱德拉·瓦尔格赛
钟忠
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Abstract

本披露尤其提供了C9orf72寡核苷酸、其组合物和方法。在一些实施例中，本披露提供了用于治疗与C9orf72相关的病症、障碍或疾病的方法，如肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆。

Description

寡核苷酸组合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年5月9日提交的美国临时申请号62/845,765、于2019年5月22日提交的美国临时申请号62/851,558、于2019年10月6日提交的美国临时申请号62/911,340、以及于2020年3月1日提交的美国临时申请号62/983,736的优先权，其各自的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
寡核苷酸可用于多种应用(例如治疗性应用、诊断性应用和/或研究应用)中，包括但不限于多种病症、障碍或疾病的治疗。
发明内容
本披露提供可降低C9orf72转录物(或其产物)的水平的寡核苷酸及其组合物。在一些实施例中，相比于C9orf72的非疾病相关转录物或弱疾病相关转录物，所提供的寡核苷酸及组合物可优先降低C9orf72的疾病相关转录物(或其产物)的水平(例如参见图1)。实例C9orf72转录物包括自C9orf72基因中的任一条链以及自各种起点产生的转录物。在一些实施例中，至少一些C9orf72转录物翻译成蛋白质；在一些实施例中，至少一些C9orf72转录物不翻译成蛋白质。在一些实施例中，某些C9orf72转录物主要含有内含子序列。
据报导，C9orf72中的六核苷酸重复扩增(染色体9，开放阅读框72)是肌萎缩侧索硬化症(ALS)及额颞叶痴呆(FTD)的最常见遗传原因。包含所述重复扩增的C9orf72基因变体和/或其编码产物也与其他C9orf72相关障碍有关，诸如皮质基底节变性综合征(CBD)、非典型帕金森综合征、橄榄体桥脑小脑变性(OPCD)、原发性侧索硬化症(PLS)、进行性肌萎缩症(PMA)、亨廷顿氏病(HD)拟表型、阿尔兹海默病(AD)、双相障碍、精神分裂症及其他非运动病症。在一些实施例中，本披露提供与寡核苷酸有关的组合物及方法，所述寡核苷酸靶向C9orf72靶标(例如C9orf72寡核苷酸)，且能够敲低或降低C9orf72靶标基因和/或其基因产物(转录物，尤其含有重复扩增的转录物，蛋白质等)的表达、水平和/或活性。
在一些实施例中，一种寡核苷酸靶向包含重复扩增的病理性或疾病相关C9orf72突变或变异。在一些实施例中，C9orf72基因产物是自C9orf72基因转录的RNA(例如mRNA、成熟RNA或mRNA前体)、自C9orf72 RNA转录物翻译的蛋白质(例如自六核苷酸重复序列翻译的二肽重复蛋白)或病灶(focus)(复数形式：病灶(foci))(据报导其包含由RNA结合蛋白结合的包含重复扩增的RNA)。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸能够介导含重复扩增的C9orf72 RNA相对于不含重复扩增的C9orf72 RNA(不含重复扩增的C9orf72 RNA)的优先敲低。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸降低有害C9orf72基因产物(例如包含重复扩增的RNA、二肽重复蛋白或病灶)的表达、活性和/或水平，而不会降低(或降低到更低的程度)野生型或非有害C9orf72基因产物的表达、活性和/或水平。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸降低有害C9orf72基因产物的表达、活性和/或水平，但并未将野生型或非有害C9orf72蛋白质的表达、活性和/或水平降低至足以消除或明显抑制C9orf72蛋白质的一种或多种有益和/或必要生物活性的程度。C9orf72蛋白质的有益和/或必要活性是众所周知的，且包括但不限于限制发炎、预防自身免疫及预防过早死亡。
本披露尤其涵盖，控制C9orf72寡核苷酸的结构元件可对寡核苷酸特性和/或活性具有显著影响，包括C9orf72靶标基因的敲低。在一些实施例中，靶标基因的敲低是由影响翻译的RNA酶H(核糖核酸酶H)或位阻介导。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸的受控结构元件包括但不限于：碱基序列、化学修饰(例如糖、碱基和/或核苷酸间键联的修饰)或其模式、立体化学(例如骨架手性核苷酸间键联的立体化学)或其模式的改变、翼结构、核心结构、翼-核心结构、翼-核心-翼结构或核心-翼结构和/或与另外的化学部分(例如碳水化合物部分、靶向部分等)的缀合。在一些实施例中，本披露提供用于改善C9orf72寡核苷酸稳定性同时维持或提高寡核苷酸活性的技术(例如化合物、方法等)，包括稳定性经改善的寡核苷酸的组合物。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸靶向C9orf72或其产物。在一些实施例中，靶标基因为C9orf72。
在一些实施例中，本披露涵盖，各种任选的另外的化学部分(诸如碳水化合物部分、靶向部分等)在并入至C9orf72寡核苷酸中时可改善一个或多个特性。在一些实施例中，另外的化学部分选自：葡萄糖、GluNAc(N-乙酰葡糖胺)及茴香酰胺部分。本文例如在实例1及2中更详细地描述这些及其他部分。在一些实施例中，寡核苷酸可包含两个或更多个另外的化学部分，其中所述另外的化学部分相同或不相同，或属于同一类别(例如碳水化合物部分、糖部分、靶向部分等)或不属于同一类别。在一些实施例中，某些另外的化学部分有助于将寡核苷酸递送至所需细胞、组织和/或器官，包括但不限于中枢神经系统的特定细胞、部位或部分(例如大脑皮质、海马区、脊髓等)。在一些实施例中，某些另外的化学部分促进寡核苷酸的内化。在一些实施例中，某些另外的化学部分提高寡核苷酸稳定性。在一些实施例中，本披露提供用于将各种另外的化学部分并入至寡核苷酸中的技术。在一些实施例中，本披露提供例如经由核苷酸间键联、糖和/或核碱基引入另外的化学部分的试剂及方法(例如，任选经由接头通过共价连接将另外的化学部分引入至糖、核碱基或核苷酸间键联上的位点)。
在一些实施例中，本披露证实，结构包括如本文中所描述的一个或多个特征的寡核苷酸(例如C9orf72寡核苷酸)可实现出人意料的高靶标特异性[所述一个或多个特征包括但不限于本文中所披露的碱基序列(其中每个U可任选且独立地经T取代且反之亦然)和/或化学修饰和/或立体化学和/或其模式和/或其组合。
在一些实施例中，本披露证实，某些所提供的结构元件、技术和/或特征尤其适用于敲低C9orf72的寡核苷酸。然而，无论如何，本披露的教导不限于参与任何特定生物化学机制或经由任何特定生物化学机制起作用的寡核苷酸。在一些实施例中，本披露提供能够经由某一机制起作用的寡核苷酸，所述机制诸如双链RNA干扰、单链RNA干扰或充当经由RNA酶H介导的机制或翻译位阻而降低C9orf72基因或其基因产物的表达、活性和/或水平的反义寡核苷酸的机制。
此外，本披露涉及经由任何机制起作用且包含本文中所描述的任何序列、结构或形式(或其部分)的任何C9orf72寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含碱基、糖或核苷酸间键联的至少一个非天然存在的修饰。在一些实施例中，本披露涉及包含至少一个立体受控核苷酸间键联(包括但不限于呈Sp或Rp构型的硫代磷酸酯键联)的任何C9orf72寡核苷酸。在一些实施例中，本披露涉及经由任何机制起作用且包含至少一个立体受控核苷酸间键联(包括但不限于呈Sp或Rp构型的硫代磷酸酯键联)的任何C9orf72寡核苷酸。在一些实施例中，本披露提供一种C9orf72寡核苷酸，其包含：本文中所描述的任何序列、结构或形式(或其部分)；任选的另外的化学部分(包括但不限于碳水化合物部分及靶向部分)；立体化学或立体化学模式；核苷酸间键联或核苷酸间键联模式；一种或多种糖修饰或糖修饰模式；一种或多种碱基修饰或碱基修饰模式。在一些实施例中，糖、核碱基或核苷酸间键联的修饰是非天然存在的修饰。
在一些实施例中，C9orf72障碍相关的靶标等位基因含有内含子1中的六核苷酸重复扩增，包括但不限于G4C2或(GGGGCC)ng，其中ng是30或更多。在一些实施例中，ng是50或更多。在一些实施例中，ng是100或更多。在一些实施例中，ng是150或更多。在一些实施例中，ng是200或更多。在一些实施例中，ng是300或更多。在一些实施例中，ng是500或更多。
据报导，在欧洲血统人群中的10例ALS中，内含子1中的C9orf72 G4C2重复扩增占1例。据报导，G4C2重复序列仅约是转录物的10％(例如图1中所说明的病理性等位基因的转录物V3及V1)，其具有至少部分地由二肽重复蛋白及病灶形成所介导的功能获得性毒性，所述病灶由例如含有重复扩增的转录物和/或剪接掉的含有重复扩增的内含子和/或含有重复扩增的区域及各种核酸结合蛋白的反义转录形成。在一些实施例中，据报导，V1以极低的水平转录(约是总C9orf72转录物水平的1％)，且不会明显增加包含六核苷酸重复扩增的转录物的水平。据报导，含有重复扩增的内含子核酸可以mRNA前体、部分经剪接RNA和/或经剪接掉内含子的形式保留，且包含这些核酸的RNA病灶与RNA结合蛋白螯合相关。C9orf72 RNA病灶描述于例如Liu等人,2017,Cell Chemical Biology[细胞化学生物学]24,1-8；Niblock等人Acta Neuropathologica Communications[神经病理学通讯](2016)4:18中。据报导，包含二肽重复蛋白质(DPR蛋白质)的异常蛋白质产物是由重复扩增产生，其具有神经元毒性。在一些实施例中，本披露提供寡核苷酸及其组合物及使用方法，其靶向接近G4C2重复序列的内含子序列，且可降低含有重复扩增的转录物、所述转录物编码的蛋白质和/或相关病灶的水平。在一些实施例中，本披露提供C9orf72寡核苷酸及其组合物，其靶向接近G4C2重复序列的内含子序列，以经由RNAse-H特异性地敲低含有重复扩增的转录物，其对正常C9orf72转录物具有极小影响。在一些实施例中，与现有数据进行比较，本披露证实所提供的靶向内含子序列(例如重复序列与外显子1b之间的内含子序列)的技术可有效和/或优先降低含有重复扩增的产物的水平。
不希望受任何特定理论束缚，本披露指出，文献中已经提出重复扩增的有害及疾病相关作用的若干种可能机制。参见例如：Edbauer等人2016Curr.Opin.Neurobiol.[神经生物学新见]36:99-106；Conlon等人Elife.2016年9月13日；5.pii:e17820；Xi等人2015Acta Neuropathol.[神经病理学报]129:715-727；Cohen-Hada等人2015Stem CellRep.[干细胞通讯]7:927-940；和Burguete等人eLife 2015；4:e08881。本披露尤其提供可减少或消除一种或多种或所有有害及疾病相关C9orf72产物和/或疾病相关作用的技术。
不希望受任何特定理论束缚，本披露指出，含有重复扩增的C9orf72转录物的不利作用的可能机制是产生病灶。据报导，重复扩增使含有内含子1的C9orf72 mRNA保留。大部分保留内含子1的C9orf72mRNA积聚在细胞核中，其在细胞核中靶向无法加工G4C2 RNA重复序列的特定降解途径。所述RNA随后聚集形成病灶，所述病灶也包含RNA结合蛋白，从而隐藏所述RNA的正常功能。Niblock Acta Neuropathol Commun.[神经病理学通讯]2016；4:18。据报导，包含反义C9orf72产物的反义病灶以明显较高的频率存在于小脑浦金埃氏(Purkinje)神经元及运动神经元中，而有义病灶以明显较高的频率存在于小脑颗粒神经元中。Cooper-Knock等人Acta Neuropathol[神经病理学报](2015)130:63-75。在一些实施例中，本披露提供用于降低病灶水平的技术。在一些实施例中，所提供的技术降低一种或多种类型的神经元中的反义病灶和/或有义病灶的水平或消除所述病灶。
不希望受任何特定理论束缚，本披露指出，含有重复扩增的C9orf72转录物的不利作用的另一可能机制是产生二肽重复(DPR)蛋白质。小部分保留内含子1的C9orf72 mRNA输出至所有六个阅读框中用于RAN翻译(重复序列相关的非AUG翻译)的细胞质，形成DPR。Niblock Acta Neuropathol Commun.[神经病理学通讯]2016；4:18。Cooper-Knock等人也报导，含有有义或反义所衍生二肽重复蛋白质的包涵体分别以明显较高的频率存在于小脑颗粒神经元或运动神经元中；且在作为ALS病变的主要靶标的运动神经元中，存在反义病灶但不存在有义病灶与TDP-43的定位错误有关，其是ALS神经退化的标志。在一些实施例中，所提供的技术降低一种或多种或所有C9orf72 DPR蛋白质产物的水平。
在一些实施例中，功能获得性和/或功能缺失性机制导致C9orf72相关障碍中的神经退化。参见，例如：Mizielinska等人2014Science[科学]345:1192-94；Chew等人2015Science[科学]348:1151-1154；Jiang等人2016Neuron[神经元]90:535-550；和Liu等人2016Neuron[神经元]90:521-534；Gendron等人Cold Spring Harb.Perspect.Med.[冷泉港医学观点]2017年1月27日.pii:a024224；Haeusler等人Nat Rev Neurosci.[自然神经科学评论]2016年6月；17(6):383-95；Koppers等人Ann.Neurol.[神经学年报]2015；78:426-438；Todd等人J.Neurochem.[神经化学]2016 138(增刊1)145-162。在一些实施例中，所提供的技术减少非所要的获得性功能，和/或恢复或增强所要功能。
在一些实施例中，所提供寡核苷酸及其组合物及使用方法适用于治疗若干C9orf72相关障碍中的任一者，包括但不限于肌萎缩侧索硬化症(ALS)。在一些实施例中，ALS是MIM：612069。据报导，肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种致命的神经退化性疾病，其临床特征是进行性麻痹，其通常在症状发作的两至三年内由呼吸衰竭导致死亡(Rowland及Shneider,N.Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志],2001,344,1688-1700)。据报导，ALS是西方世界中第三最常见的神经退化性疾病(Hirtz等人,Neurology[神经病学],2007,68,326-337)，且目前不存在有效疗法。大约10％的病例在本质上是家族性的，而大部分经诊断患有所述疾病的患者被分类是偶发性的，因为所述患者看起来系在整个群体中随机出现的(Chio等人,Neurology[神经病学],2008,70,533-537)。据报导，临床、遗传及流行病学资料支持以下假设：ALS及额颞叶痴呆(FTD)表示病理特征是整个中枢神经系统中存在TDP-43阳性包涵体的疾病的重叠连续体(Lillo及Hodges,J.Clin.Neurosci.[临床神经科学杂志],2009,16,1131-1135；Neumann等人,Science[科学],2006,314,130-133)。已发现多个基因潜在地引起典型家族性ALS，例如SOD1、TARDBP、FUS、OPTN及VCP(Johnson等人,Neuron[神经元],2010,68,857-864；Kwiatkowski等人,Science[科学],2009,323,1205-1208；Maruyama等人,Nature[自然],2010,465,223-226；Rosen等人,Nature[自然],1993,362,59-62；Sreedharan等人,Science[科学],2008,319,1668-1672；Vance等人,Brain[脑],2009,129,868-876)。据报导，对涉及多个ALS、FTD及ALS-FTD病例的家族的连锁分析表明，染色体9的短臂上存在对所述疾病而言重要的基因座，经鉴别是C9orf72(Boxer等人,J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry[神经病学和神经外科和精神病学杂志],2011,82,196-203；Morita等人,Neurology[神经病学],2006,66,839-844；Pearson等人J.Neurol.[神经病学],2011,258,647-655；Vance等人,Brain[脑],2006,129,868-876)。此突变被认为是ALS及FTD的最常见遗传原因。在一些实施例中，引起ALS-FTD的突变是染色体9上的C9orf72基因的第一内含子中的较大六核苷酸(例如GGGGCC或G4C2)重复扩增(Renton等人,Neuron[神经元],2011,72,257-268；DeJesus-Hernandez等人,Neuron[神经元],2011,72,245-256)。涵盖C9orf72基因的奠基单倍型(founder haplotype)存在于与此区域有关的大部分病例中(Renton等人,Neuron[神经元],2011,72,257-268)。在一群405个芬兰患者中，染色体9p21上的此基因座占家族性ALS的接近一半，且占所有ALS病例的接近四分之一(Laaksovirta等人,Lancet Neurol.[柳叶刀神经病学],2010,9,978-985)。据报导，ALS的发病率是1:50,000。据报导，家族性ALS代表所有ALS病例的5％-10％；据报导，C9orf72突变可是ALS的最常见原因(40％-50％)。据报导，ALS与脑、脑干及脊髓的运动皮质中的上运动神经元及下运动神经元两者的退化相关。据报导，ALS的症状包括：肌肉无力和/或肌肉萎缩、吞咽或呼吸困难、痉挛、僵硬。据报导，呼吸失效是主要死亡原因。在一些实施例中，所提供的技术降低与ALS或其他C9orf72相关病症、障碍和/或疾病有关的一个或多个症状的严重程度和/或消除所述一个或多个症状。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸及其组合物及使用方法适用于治疗若干C9orf72相关障碍中的任一者，包括但不限于额颞叶痴呆(FTD)。在一些实施例中，FTD被称为额颞叶退化或FTLD，MIM：600274。据报导，额颞叶痴呆是第二最常见形式的初老期痴呆，据报导其与额叶或颞叶的病灶性萎缩相关。Boxer等人2005Alzheimer Dis.Assoc.Disord.[阿尔茨海默病相关障碍]19(增刊1):S3-S6。FTD与肌萎缩侧索硬化症具有大量的临床、病理学及分子重叠部分。如Gijselinck,Cold Spring Perspect.Med.[冷泉港医学观点]2017年1月27日.pii:a026757所报导，据报导存在出现两种疾病(ALS-FTD)的家庭及个别患者(Lomen-Hoerth等人2002Neurology[神经病学]59:1077-1079)，并且尽管ALS及FTLD患者的病理学分布不同，但ALS及FTLD患者中的TDP-43包涵体(Arai等人2006Biochem.Biophys.Res.Comm.[生物化学与生物物理学研究通讯]351:602-611；Neumann等人2006Science[科学]314:130-133)无法区分(Tsuji等人2012Brain[脑]135:3380-3391)。据报导，存在ALS及FTLD可涉及共同疾病路径的证据，此是由于其临床及病理学标志重叠；因此，这些疾病的纯形式被视是一个疾病连续体的两个极端(Lillo及Hodges2009J.Clin.Neurosci.[临床神经科学杂志]16:1131-1135)。据报导，遗传研究鉴别出FTLD及ALS中的相同基因突变，例如TBK1、TARDBP、FUS、VCP(Neumann等人2006；Kovacs等人2009Mov.Disord.[运动障碍]24:1843-1847；Johnson等人2010Neuron[神经元]68:857-864；Van Langenhove等人2010Neurology[神经病学]74:366-371；Cirulli等人2015Science[科学]347:1436-1441；Freischmidt等人2015Nat.Neurosci.[自然神经科学]18:631-636；Pottier等人2015Acta Neuropathol.[神经病理学报]130:77-92)。据报导，对患有ALS、FTLD及ALS-FTD的患者中的C9orf72的重复扩增突变的鉴别提供共同疾病病理机制的遗传证据(Gijselinck等人2010Arch.Neurol.[神经病学学报]67:606-616；De Jesus-Hernandez等人2011Neuron[神经元]72:245-256；Renton等人2011Neuron[神经元]72:257-268)。
在一些实施例中，C9orf72靶标是特定等位基因(例如具有重复扩增的等位基因)，且意欲改变一种或多种产物(例如RNA和/或蛋白质产物，诸如二肽重复蛋白质或DPR)的水平、表达和/或活性。在许多实施例中，C9orf72靶标等位基因为其存在和/或表达与一种或多种疾病和/或病症或其症状的存在、发病率和/或严重程度相关(例如有关)的等位基因，所述一种或多种疾病和/或病症包括但不限于ALS及FTD或其他C9orf72相关障碍。可替代地或另外，在一些实施例中，C9orf72靶标等位基因为其一种或多种基因产物的表达、水平和/或活性的改变与疾病和/或病症的一个或多个方面的改善(例如发作延迟、严重程度降低、对其他治疗的反应性等等)有关的等位基因，所述疾病和/或病症包括但不限于ALS及FTD或其他C9orf72相关障碍。
在一些实施例中，神经疾病的特征在于神经元兴奋过度。在一些实施例中，据报导，由于(GGGGCC)n扩增和/或在所述扩增存在下，C9orf72活性降低50％，其增加经由谷氨酸受体NMDA、AMPA及红藻氨酸(kainite)的神经传递。此外，据报导，谷氨酸受体积聚在神经元上。据报导，神经传递增加及谷氨酸受体积聚导致由神经元兴奋过度引起的谷氨酸诱导型兴奋性毒性。据报导，抑制谷氨酸受体将治疗神经元兴奋过度。据报导，对由扩增产生的二肽重复蛋白质的清除减弱，由此其神经毒性增强。据报导，C9orf72经由RAB5活化而促进及早内体运输，所述活化需要磷脂酰肌醇3-磷酸酶(PI3P)。PIKFYVE将PI3P转化成磷脂酰肌醇(3,5)-二磷酸(PI(3,5)P2)。据报导，抑制PIKFYVE将通过增加PI3P水平而补偿改变的RAB5水平，以允许及早内体成熟，其最终将引起二肽重复蛋白质的清除。据报导，神经元还使用内体运输来调节钠及钾离子通道定位。据报导，抑制PIKFYVE也可治疗神经元兴奋过度。在一些实施例中，所提供的技术降低神经元兴奋过度。在一些实施例中，所提供的技术可作为与PIKFYVE抑制剂的同一治疗方案的部分施用。
在一些实施例中，本披露提供一种寡核苷酸组合物，其包含第一多个寡核苷酸，所述第一多个寡核苷酸共享：
1)共同的碱基序列；
2)共同的骨架键联模式；并且
3)共同的骨架手性中心模式，所述组合物是实质上纯的单一寡核苷酸制剂，因为所述组合物中非随机或受控水平的寡核苷酸具有共同的碱基序列及长度、共同的骨架键联模式及共同的骨架手性中心模式。
在一些实施例中，本披露提供一种C9orf72寡核苷酸组合物，其包含能够导引C9orf72敲低的第一多个寡核苷酸，其中寡核苷酸具有特定寡核苷酸类型，其特征是：
1)共同的碱基序列和长度；
2)共同的骨架键联模式；并且
3)共同的骨架手性中心模式；
所述组合物是手性受控的，因为相对于具有相同碱基序列和长度的寡核苷酸的基本上外消旋制剂而言，所述组合物富集特定寡核苷酸类型的寡核苷酸。
在一些实施例中，本披露提供了包含具有相同构成或结构的多种寡核苷酸的手性受控的寡核苷酸组合物，其中这些寡核苷酸包含一个或多个(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，多个寡核苷酸的每个寡核苷酸的碱基序列包含与C9orf72基因或其转录物的碱基序列或其一部分相同或互补的15、16、17、18、19、20或更多个连续的核碱基。
在一些实施例中，当所提供的寡核苷酸的碱基序列与其靶序列比对以获得最大互补性时，所提供的寡核苷酸的碱基序列包含一个或多个错配(例如，不是AT、AU或CG)。在一些实施例中，错配在3’端。在一些实施例中，存在不超过1、2或3个错配。如本文所证明的，与碱基序列与其靶序列完全互补的寡核苷酸相比，其碱基序列包含一个或多个错配的寡核苷酸(当碱基序列与靶序列比对时)可意外地提供更高的活性(例如，与靶标转录物和RNA酶H接触以降低靶标转录物的水平时)、较低的毒性等。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸(其可靶向C9orf72或靶向C9orf72以外的靶标)包含一个或多个嵌段。在一些实施例中，嵌段包含一个或多个连续核苷、和/或核苷酸、和/或糖、或碱基、和/或核苷酸间键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含三个或更多个嵌段，其中两端上的嵌段不相同，且由此所述寡核苷酸是不对称的。在一些实施例中，嵌段是翼或核心。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸包含至少一个翼及至少一个核心，其中翼在结构上不同于核心，因为翼包含不同于核心的结构[例如立体化学、另外的化学部分，或糖、碱基或核苷酸间键联处的化学修饰(或其模式)]，或反之亦然。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含翼-核心-翼结构。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含翼-核心、核心-翼或翼-核心-翼结构，其中一个翼在结构[例如立体化学、另外的化学部分，或糖、碱基或核苷酸间键联处的化学修饰(或其模式)]上不同于另一翼及核心(例如，不对称寡核苷酸)。在一些实施例中，寡核苷酸具有或包含翼-核心、核心-翼或翼-核心-翼结构，且嵌段是翼或核心。在一些实施例中，核心也称为缺口。
一般而言，如本文所描述的寡核苷酸组合物的特性可使用任何适当分析评估。
本领域内普通技术人员将清楚和/或将能够容易地开发出用于特定寡核苷酸组合物的适当分析。
附图说明
图1.图1描述实例C9orf72转录物。示出了由健康和病理性C9orf72等位基因产生的V3、V2和V1转录物，其中所述病理性等位基因含有六核苷酸重复扩增[(GGGGCC)30+指示的水平条]。指向下的箭头指示一些实例C9orf72寡核苷酸靶向内含子1的位置。
具体实施方式
定义
如本文所用，除非另外指明，应应用下列定义。出于此披露的目的，根据元素周期表(Periodic Table of the Elements),CAS版本,化学与物理手册(HandbookofChemistry and Physics),第75版来鉴别化学元素。另外，有机化学的一般原理描述于“Organic Chemistry[有机化学]”,Thomas Sorrell,University Science Books[大学科学书籍],索萨利托(Sausalito):1999及“March's Advanced Organic Chemistry[马奇高级有机化学]”，第5版，编辑：Smith,M.B.和March,J.,约翰威利父子公司(John Wiley&Sons),纽约:2001。
如本文在本披露中使用的，除非上下文另有明确说明，否则(i)术语“一个(a)”或“一种(an)”可以理解为是指“至少一个”；(ii)术语“或”可以理解为“和/或”；(iii)术语“含有(comprising)”，“包含(comprise)”，“包括(including)”(无论是否与“不限于”一起使用)和“包括(include)”(无论是否与“不限于”一起使用)可以理解为涵盖逐项列出的组分或步骤，无论是单独显示还是与一个或多个其他组分或步骤一起显示；(iv)术语“另一个”可以理解为是指至少一个另外的/第二的一个或多个；(v)术语“大约”和“约”可以理解为允许标准差，如本领域普通技术人员将理解的那样；和(vi)提供范围的情况下，包括端点。
除非另有说明，否则寡核苷酸及其元件的描述(例如碱基序列、糖修饰、核苷酸间键联、键联磷立体化学等)是从5'至3'。如本领域的技术人员将理解，在一些实施例中，寡核苷酸可以作为盐形式，特别是药学上可接受的盐形式(例如钠盐)提供和/或使用。如本领域技术人员也将理解的，在一些实施例中，组合物中的单一寡核苷酸可被认为具有相同的构成和/或结构，即使在这样的组合物(例如液体组合物)中，特别地，这样的寡核苷酸在特定时间可能处于不同的一种或多种盐形式(并且例如在液体组合物中时，其可以溶解并且寡核苷酸链可以阴离子形式存在)。例如，本领域技术人员将意识到，在给定的pH下，沿着寡核苷酸链的单个核苷酸间键联可以呈酸(H)形式，或呈多种可能的盐形式之一(例如钠盐或不同阳离子的盐，取决于制剂或组合物中可能存在哪些离子)，并且将会理解，只要它们的酸形式(例如，用H+替换所有阳离子，如果有的话)具有相同的构成和/或结构，这样的单一寡核苷酸可以适当地认为具有相同的构成和/或结构。
脂肪族：如本文所用，“脂肪族”意指完全饱和或含有一个或多个不饱和单元的直链(即非支链)或支链的经取代或未经取代的烃链，或完全饱和或含有一个或多个不饱和单元(但非芳族)的经取代或未经取代的单环、双环或多环烃环，或其组合。在一些实施例中，脂肪族基团含有1-50个脂肪族碳原子。在一些实施例中，脂肪族基团含有1-20个脂肪族碳原子。在其他实施例中，脂肪族基团含有1-10个脂肪族碳原子。在其他实施例中，脂肪族基团含有1-9个脂肪族碳原子。在其他实施例中，脂肪族基团含有1-8个脂肪族碳原子。在其他实施例中，脂肪族基团含有1-7个脂肪族碳原子。在其他实施例中，脂肪族基团含有1-6个脂肪族碳原子。在还其他实施例中，脂肪族基团含有1-5个脂肪族碳原子，且在又其他实施例中，脂肪族基团含有1、2、3或4个脂肪族碳原子。合适的脂肪族基团包括但不限于直链或支链的经取代或未经取代的烷基、烯基、炔基基团及其杂合物，如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。
烷基：如本文中所用，术语“烷基”以本技术领域中的其一般含义给出，且可包括饱和脂肪族基，包括直链烷基、支链烷基、环烷基(脂环族基)、经烷基取代的环烷基及经环烷基取代的烷基。在一些实施例中，烷基具有1-100个碳原子。在某些实施例中，直链或支链烷基的骨架中具有约1至20个碳原子(例如，直链是C1-C20，支链是C2-C20)，且可替代地具有约1至10个碳原子。在一些实施例中，环烷基环在这类环为单环、双环或多环时在其环结构中具有约3-10个碳原子，且可替代地在环结构中具有约5、6或7个碳原子。在一些实施例中，烷基可是低碳数烷基，其中低碳数烷基包含1至4个碳原子(例如，直链低碳数烷基是C1-C4)。
动物：如本文中所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施例中，“动物”是指处于任何发育阶段的人类。在一些实施例中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施例中，非人类动物是哺乳动物(例如，啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施例中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类和/或蠕虫。在一些实施例中，动物可是转基因动物、经基因工程改造的动物和/或克隆。
大约：如本文所用，关于数字的术语“大约”或“约”通常用于包括在任一方向上(大于或小于)落入5％、10％、15％、或20％范围的数字，除非数字另有指明或另外从上下文明显可见(除了会小于可能值的0％或者超过可能值的100％的这种数字)。在一些实施例中，关于剂量使用术语“约”意指±5mg/kg/天。
芳基：如本文所用，单独使用或作为较大部分如“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”的一部分使用的术语“芳基”是指总共具有五个至三十个环成员的单环、双环或多环系统，其中系统中的至少一个环是芳族。在一些实施例中，芳基为总共具有五个至十四个环成员的单环、双环或多环体系，其中体系中的至少一个环是芳族的，且其中体系中的各环含有3至7个环成员。在一些实施例中，芳基为联芳基。术语“芳基”与术语“芳基环”可互换使用。在本披露的某些实施例中，“芳基”是指包括但不限于苯基、联苯基、萘基、联萘基、蒽基等的芳环体系，其可具有一个或多个取代基。如本文所用，还包括在术语“芳基”的范围内的是其中芳环与一个或多个非芳环稠合的基团，如茚满基、邻苯二甲酰亚胺基、萘啶基、啡啶基或四氢萘基等。
可比较的：术语“可比较的”在本文中用于描述两组(或更多组)彼此充分相似的条件或环境，以允许比较所获得的结果或观察到的现象。在一些实施例中，可比较的条件或环境的组的特征在于多个基本相同的特征和一个或少数变化的特征。本领域普通技术人员将理解，当由足够数量和类型的基本相同的特征表征时，条件的组彼此是可比较的，以保证合理的结论，即在不同组的条件或环境下获得的结果或观察到的现象的差异是由那些变化的特征的变化引起或指示的。
环脂肪族：术语“环脂肪族(cycloaliphatic)”、“碳环(carbocycle)”、“碳环基(carbocyclyl)”“碳环基团(carbocyclic radical)”和“碳环(carbocyclic ring)”可互换使用，且如本文所用，是指具有3至30个环成员的如本文所述的饱和或部分不饱和但非芳族的环脂肪族单环、双环或多环系统，除非另有说明。环脂肪族基团包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环庚烯基、环辛基、环辛烯基、降莰基、金刚烷基和环辛二烯基。在一些实施例中，环脂肪族基团具有3-6个碳原子。在一些实施例中，环脂肪族基团为饱和的且为环烷基。术语“环脂肪族”还可包括与一个或多个芳族或非芳族环稠合的脂肪族环，如十氢萘基或四氢萘基。在一些实施例中，环脂肪族基团为双环。在一些实施例中，环脂肪族基团为三环。在一些实施例中，环脂肪族基团为多环。在一些实施例中，“环脂肪族”是指完全饱和或含有一个或多个不饱和单元但非芳族的C3-C6单环烃或C8-C10双环或多环烃，其具有连至分子的其余部分的单一连接点，或是指完全饱和或含有一个或多个不饱和单元但非芳族的C9-C16多环烃，其具有连至分子的其余部分的单一连接点。
给药方案：如本文所用，“给药方案”或“治疗方案”是指单独施用受试者的一组单位剂量(通常多于一种)，通常通过一段时间分开。在一些实施例中，指定治疗剂具有推荐的给药方案，其可涉及一个或多个剂量。在一些实施例中，给药方案包含多次给药，其中的每一者彼此间隔开相同长度的时段；在一些实施例中，给药方案包含多个剂量及至少两个用于隔开个别剂量的不同时间段。在一些实施例中，给药方案内的所有给药具有相同单位给药量。在一些实施例中，给药方案内的不同给药具有不同的量。在一些实施例中，给药方案包含呈第一给药量的第一次给药，接着是呈不同于第一给药量的第二给药量的一次或多次其他给药。在一些实施例中，给药方案包含呈第一给药量的第一次给药，接着是呈与第一给药量相同的第二给药量的一次或多次其他给药。
杂脂肪族：如本文所用，术语“杂脂肪族”以它在本领域中的普通含义给出，并且是指其中一个或多个碳原子独立地被一个或多个杂原子(例如，氧、氮、硫、硅、磷等)替换的如本文所述的脂肪族基团。在一些实施例中，选自C、CH、CH2及CH3的一个或多个单元独立地经一个或多个杂原子(包括其经氧化和/或经取代形式)替换。在一些实施例中，杂脂肪族基团为杂烷基。在一些实施例中，杂脂肪族基团为杂烯基。
杂烷基：如本文所用，术语“杂烷基”以它在本领域中的普通含义给出，并且是指其中一个或多个碳原子独立地被一个或多个杂原子(例如，氧、氮、硫、硅、磷等)替换的如本文所述的烷基基团。杂烷基的实例包括但不限于烷氧基、聚(乙二醇)-、经烷基取代的氨基、四氢呋喃基、哌啶基、吗啉基等。
杂芳基：如本文所用，单独使用或作为较大部分例如“杂芳烷基”或“杂芳烷氧基”的一部分使用的术语“杂芳基”和“杂芳-”是指总共具有五个至三十个环成员的单环、双环或多环系统，其中系统中的至少一个环是芳族且至少一个芳环原子为杂原子。在一些实施例中，杂芳基是具有5至10个环原子的基团(即，单环、双环或多环)，在一些实施例中具有5、6、9或10个环原子。在一些实施例中，杂芳基具有在环状阵列中共享的6、10或14个π电子；并且除碳原子外，还具有一至五个杂原子。杂芳基包括但不限于噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。在一些实施例中，杂芳基为杂联芳基，如联吡啶基等。如本文所用，术语“杂芳基”和“杂芳基-”还包括其中杂芳环与一个或多个芳基环、环脂肪族环或杂环基环稠合的基团，其中附接基团或附接点在杂芳环上。非限制性实例包括吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H-喹嗪基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、以及吡啶并[2,3-b]-1,4-噁嗪-3(4H)-酮。杂芳基可以是单环的、双环的或多环的。术语“杂芳基(heteroaryl)”可以与术语“杂芳基环(heteroaryl ring)”、“杂芳基基团(heteroarylgroup)”或“杂芳族(heteroaromatic)”互换使用，所述术语中的任一者包括任选地经取代的环。术语“杂芳烷基”是指被杂芳基基团取代的烷基基团，其中烷基部分和杂芳基部分独立地任选地被取代。
杂原子：如本文所用，术语“杂原子”意指不是碳或氢的原子。在一些实施例中，杂原子是硼、氧、硫、氮、磷、或硅(包括氮、硫、磷、或硅的任何氧化的形式；任何碱性氮或杂环的可取代氮的季铵化形式(例如，如在3,4-二氢-2H-吡咯基中的N)、NH(如在吡咯烷基中)或NR+(如在N-取代的吡咯烷基中)；等)。
杂环：如本文所用，术语“杂环(heterocycle)”、“杂环基(heterocyclyl)”、“杂环基基团(heterocyclic radical)”和“杂环(heterocyclic ring)”可互换使用，并且是指饱和或部分不饱和且具有一个或多个杂原子环原子的单环、双环或多环部分(例如，3-30元)。在一些实施例中，杂环基基团是稳定的5元至7元单环或7元至10元双环杂环部分，其是饱和或部分不饱和的且除碳原子外具有一个或多个、优选地一至四个如以上所定义的杂原子。当关于杂环的环原子使用时，术语“氮”包括取代的氮。作为实例，在具有0-3个选自氧、硫和氮的杂原子的饱和或部分不饱和环中，氮可以是N(如在3,4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)或+NR(如在经N-取代的吡咯烷基中)。杂环可以在产生稳定结构的任何杂原子或碳原子处与其侧基附接，并且任何环原子可以任选地被取代。此类饱和或部分不饱和的杂环基团的实例包括但不限于四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、哌啶基、吡咯啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、噁唑烷基、哌嗪基、二噁烷基、二氧戊环基、二氮杂
Figure BDA0003456638050000161
基、氧氮杂
Figure BDA0003456638050000162
基、硫氮杂
Figure BDA0003456638050000163
基、吗啉基和奎宁环基。术语“杂环(heterocycle)”、“杂环基(heterocyclyl)”、“杂环基环(heterocyclyl ring)”、“杂环基团(heterocyclic group)”、“杂环部分(heterocyclic moiety)”和“杂环基团(heterocyclic radical)”在本文中可互换使用，并且还包括其中杂环基环与一个或多个芳基、杂芳基或环脂肪族环稠合的基团，如吲哚啉基、3H-吲哚基、苯并二氢吡喃基、菲啶基或四氢喹啉基。杂环基可以是单环的、双环的或多环的。术语“杂环基烷基”是指被杂环基取代的烷基基团，其中烷基部分和杂环基部分独立地任选地被取代。
体外：如本文所用，术语“体外”是指在人造环境中(例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中等)而不是在生物体(例如，动物、植物和/或微生物)内发生的事件。
体内：如本文所用，术语“体内”是指在生物体(例如，动物、植物和/或微生物)内发生的事件。
任选地经取代的：如本文所述，本披露的化合物(例如寡核苷酸)可以含有任选地经取代的部分和/或经取代的部分。通常，术语“经取代的”，无论前面是否有术语“任选地”，均意指指定部分的一个或多个氢被合适的取代基替换。除非另外指明，否则“任选地经取代的”基团可以在所述基团的每个可取代位置处具有合适的取代基，且当任何给定结构中的超过一个位置可以被选自指定基团的超过一个取代基取代时，在每一位置处的取代基可以相同或不同。在一些实施例中，任选地经取代的基团是未经取代的。本披露所设想的取代基的组合优选是导致形成稳定的或化学上可行的化合物的组合。如本文所用，术语“稳定”是指如下化合物，在出于本文所披露的一个或多个目的而经历其制备、检测以及在某些实施例中经历其回收、纯化和使用的条件时，它们基本上不发生改变。
在可取代原子(例如，合适的碳原子)上的合适的单价取代基独立地是卤素；-(CH2)0-4Ro；-(CH2)0-4ORo；-O(CH2)0-4Ro、-O-(CH2)0-4C(O)ORo；-(CH2)0-4CH(ORo)2；-(CH2)0-4Ph，其可经Ro取代；-(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph，其可经Ro取代；-CH＝CHPh，其可经Ro取代；-(CH2)0-4O(CH2)0-1-吡啶基，其可经Ro取代；-NO2；-CN；-N3；-(CH2)0-4N(Ro)2；-(CH2)0-4N(Ro)C(O)Ro；-N(Ro)C(S)Ro；-(CH2)0-4N(Ro)C(O)NRo 2；-N(Ro)C(S)NRo 2；-(CH2)0-4N(Ro)C(O)ORo；-N(Ro)N(Ro)C(O)Ro；-N(Ro)N(Ro)C(O)NRo 2；-N(Ro)N(Ro)C(O)ORo；-(CH2)0-4C(O)Ro；-C(S)Ro；-(CH2)0-4C(O)ORo；-(CH2)0-4C(O)SRo；-(CH2)0-4C(O)OSiRo 3；-(CH2)0-4OC(O)Ro；-OC(O)(CH2)0-4SR,-SC(S)SRo；-(CH2)0-4SC(O)Ro；-(CH2)0-4C(O)NRo 2；-C(S)NRo 2；-C(S)SRo；-SC(S)SRo,-(CH2)0-4OC(O)NRo 2；-C(O)N(ORo)Ro；-C(O)C(O)Ro；-C(O)CH2C(O)Ro；-C(NORo)Ro；-(CH2)0-4SSRo；-(CH2)0-4S(O)2Ro；-(CH2)0-4S(O)2ORo；-(CH2)0-4OS(O)2Ro；-S(O)2NRo 2；-(CH2)0-4S(O)Ro；-N(Ro)S(O)2NRo 2；-N(Ro)S(O)2Ro；-N(ORo)Ro；-C(NH)NRo 2；-Si(Ro)3；-OSi(Ro)3；-B(Ro)2；-OB(Ro)2；-OB(ORo)2；-P(Ro)2；-P(ORo)2；-OP(Ro)2；-OP(ORo)2；-P(O)(Ro)2；-P(O)(ORo)2；-OP(O)(Ro)2；-OP(O)(ORo)2；-OP(O)(ORo)(SRo)；-SP(O)(Ro)2；-SP(O)(ORo)2；-N(Ro)P(O)(Ro)2；-N(Ro)P(O)(ORo)2；-P(Ro)2[B(Ro)3]；-P(ORo)2[B(Ro)3]；-OP(Ro)2[B(Ro)3]；-OP(ORo)2[B(Ro)3]；-(C1-4直链或支链亚烷基)O-N(Ro)2；或-(C1-4直链或支链亚烷基)C(O)O-N(Ro)2，其中每个Ro可如下文所定义取代且独立地是氢；C1-20脂肪族；具有1至5个独立地选自氮、氧、硫、硅及磷的杂原子的C1-20杂脂肪族；-CH2-(C6-14芳基)；-O(CH2)0-1(C6-14芳基)；-CH2-(5元至14元杂芳基环)；具有0至5个独立地选自氮、氧、硫、硅及磷的杂原子的5元至20元单环、双环或多环的饱和环、部分不饱和环或芳基环；或者不管上述定义，两个独立出现的Ro与居于它们之间的一个或多个原子一起形成具有0至5个独立地选自氮、氧、硫、硅及磷的杂原子的5元至20元单环、双环或多环的饱和环、部分不饱和环或芳基环，其可如下文所定义取代。
Ro(或由两个独立出现的Ro与居于它们之间的原子共同形成的环)上的适合的单价取代基独立地是卤素、-(CH2)0-2R·、-(卤代R·)、-(CH2)0-2OH、-(CH2)0-2OR·、-(CH2)0-2CH(OR·)2、-O(卤代R·)、-CN、-N3、-(CH2)0-2C(O)R·、-(CH2)0-2C(O)OH、-(CH2)0-2C(O)OR·、-(CH2)0-2SR·、-(CH2)0-2SH、-(CH2)0-2NH2、-(CH2)0-2NHR·、-(CH2)0-2NR· 2、-NO2、-SiR· 3、-OSiR· 3、-C(O)SR·、-(C1-4直链或支链亚烷基)C(O)OR·或-SSR·，其中每个R·是未经取代的或在前面有“卤代”的情况下仅被一个或多个卤素取代，且独立地选自C1-4脂肪族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph以及具有0-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳基环。在Ro的饱和碳原子上的合适的二价取代基包括＝O及＝S。
例如在合适的碳原子上的合适的二价取代基独立地是以下：＝O、＝S、＝NNR* 2、＝NNHC(O)R*、＝NNHC(O)OR*、＝NNHS(O)2R*、＝NR*、＝NOR*、-O(C(R* 2))2-3O-或-S(C(R* 2))2-3S-，其中每个独立出现的R*选自氢、可以如下文所定义地被取代的C1-6脂肪族、以及具有0-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的未经取代的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳基环。与“任选地经取代的”基团的邻位可取代碳结合的合适的二价取代基包括：-O(CR* 2)2-3O-，其中各独立出现的R*是选自氢、可如下文所定义经取代的C1-6脂肪族基，以及具有0至4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未经取代的5元至6元饱和环、部分不饱和环或芳基环。
R*的脂肪族基团上的合适的取代基独立地是卤素、-R*、-(卤代R·)、-OH、-OR·、-O(卤代R·)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR·、-NH2、-NHR·、-NR· 2、或-NO2，其中每个R·是未取代的或在前面有“卤代”的情况下仅被一个或多个卤素取代，且独立地是C1-4脂肪族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph或具有0至4个独立地选自氮、氧及硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳基环。
口服：如本文所用的短语“口服施用(oral administration和administeredorally)”具有其领域所理解的含义，是指通过口施用化合物或组合物。
肠胃外：如本文所用的短语“肠胃外施用(parenteral administration和administered parenterally)”具有其领域所理解的含义，是指除了肠内和局部施用之外的施用方式，通常是通过注射，并且包括但不局限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊髓内以及胸骨内注射和输注。
部分不饱和的：如本文使用的，术语“部分不饱和的”是指包括至少一个双键或三键的环部分。术语“部分不饱和的”意在涵盖具有多个不饱和的位点的环，但是如在此定义的不意在包括芳基或杂芳基部分。
药物组合物：如本文所用，术语“药物组合物”是指与一种或多种药学上可接受的载体一起配制的活性剂。在一些实施例中，活性剂以适合于在治疗方案中施用的单位剂量存在，其显示当施用于相关群体时实现预定的治疗效果的统计学显著概率。在一些实施例中，药物组合物能以固体或液体形式被特别配制以进行施用，包括适用于以下的那些：口服施用，例如，浸液(drench)(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂(例如针对口腔、舌下和全身吸收的那些)、大丸剂、粉剂、颗粒剂、糊剂(应用于舌)；肠胃外施用，例如，作为例如无菌溶液或悬浮液或持续释放的配制品通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射；局部应用，例如，作为乳膏剂、软膏剂、或控制释放贴剂或喷雾剂应用于皮肤、肺或口腔；阴道内或直肠内，例如作为阴道栓剂、乳膏剂或泡沫剂；舌下；眼部；透皮；或经鼻、肺以及应用于其他粘膜表面。
药学上可接受的：如本文所用，短语“药学上可接受的”是指在合理医学判断的范围内适合于与人类和动物的组织接触使用而无过多毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物、和/或剂型。
药学上可接受的载体：如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料，其涉及将主题化合物从一个器官(或身体的一部分)携带或运输到另一个器官或身体的一部分。在与配制品的其他成分相容并且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及在药物配制品中采用的其他无毒相容的物质。
药学上可接受的盐：如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指适合于在制药环境中使用的此类化合物的盐，即，在合理医学判断的范围内，适合于与人类和低等动物的组织接触使用而无不当毒性、刺激、过敏反应等并且与合理的效益/风险比相称的盐。药学上可接受的盐是本领域公知的。例如，S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences[药物科学杂志],66:1-19(1977)中详细地描述了药学上可接受的盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐包括但不限于无毒的酸加成盐，其是使用无机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸或使用有机酸如乙酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸或通过使用本领域中所使用的其他方法如离子交换形成的具有氨基基团的盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐包括但不限于己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐(hemisulfate)、庚酸盐、己酸盐、氢碘化物、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐(lactobionate)、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。在一些实施例中，所提供的化合物(例如寡核苷酸)包含一个或多个酸性基团，且药学上可接受的盐是碱金属盐、碱土金属盐或铵盐(例如，N(R)3的铵盐，其中每个R在本披露中被独立地定义和描述)。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等。在一些实施例中，药学上可接受的盐是钠盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐是钾盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐是钙盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐适当地包括使用平衡离子(如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、具有从1至6个碳原子的烷基、磺酸根以及芳基磺酸根)形成的无毒铵、季铵以及胺阳离子。在一些实施例中，所提供的化合物包含多于一个酸性基团，例如，所提供的寡核苷酸可以包含两个或更多个酸性基团(例如，天然磷酸酯键和/或经修饰的核苷酸间键联)。在一些实施例中，这种化合物的药学上可接受的盐(或者通常，盐)包含两个或更多个阳离子，所述两个或更多个阳离子可以是相同的或不同的。在一些实施例中，在药学上可接受的盐(或者通常，盐)中，酸性基团中的所有可电离氢被阳离子替换。在一些实施例中，药学上可接受的盐是所提供的寡核苷酸的钠盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐是所提供的寡核苷酸的钠盐，其中每个酸性键联基团(例如，每个天然磷酸酯键联、每个硫代磷酸酯核苷酸间键联等)独立地以钠盐形式(所有钠盐)存在。
保护基团：如本文所用，术语“保护基团”是本领域熟知的并且包括在ProtectingGroups in Organic Synthesis[有机合成中的保护基团]T.W.Greene和P.G.M.Wuts,第3版,约翰威利父子公司,1999中详细描述的那些，将所述文献的全部内容通过引用并入本文。还包括那些特别适用于核苷和核苷酸化学的保护基团，所述保护基团描述于由SergeL.Beaucage等人在2012年06月编辑的Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry[核酸化学实验室指南]中，将章节2的全部内容通过引用并入本文。合适的氨基-保护基团包括氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、9-芴基氨基甲酸甲酯(Fmoc)、9-(2-磺酸基)芴基氨基甲酸甲酯、9-(2,7-二溴)芴基氨基甲酸甲酯、2,7-二-叔丁基-[9-(10,10-二氧代-10,10,10,10-四氢噻吨基)]氨基甲酸甲酯(DBD-Tmoc)、4-甲氧基苯酰基氨基甲酸酯(Phenoc)、2,2,2-三氯乙基氨基甲酸酯(Troc)、2-三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯(Teoc)、2-苯基乙基氨基甲酸酯(hZ)、1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙基氨基甲酸酯(Adpoc)、1,1-二甲基-2-卤代乙基氨基甲酸酯、1,1-二甲基-2,2-二溴乙基氨基甲酸酯(DB-t-BOC)、1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙基氨基甲酸酯(TCBOC)、1-甲基-1-(4-联苯基)乙基氨基甲酸酯(Bpoc)、1-(3,5-二-叔丁基苯基)-1-甲基乙基氨基甲酸酯(t-Bumeoc)、2-(2’-和4’-吡啶基)乙基氨基甲酸酯(Pyoc)、2-(N,N-二环己基甲酰胺基)乙基氨基甲酸酯、氨基甲酸叔丁酯(BOC)、1-金刚烷基氨基甲酸酯(Adoc)、氨基甲酸乙烯基酯(Voc)、氨基甲酸烯丙基酯(Alloc)、1-异丙基烯丙基氨基甲酸酯(Ipaoc)、肉桂基氨基甲酸酯(Coc)、4-硝基肉桂基氨基甲酸酯(Noc)、8-喹啉基氨基甲酸酯、N-羟基哌啶基氨基甲酸酯、烷基二硫氨基甲酸酯、苄基氨基甲酸酯(Cbz)、对甲氧基苄基氨基甲酸酯(Moz)、对硝基苄基氨基甲酸酯、对溴苄基氨基甲酸酯、对氯苄基氨基甲酸酯、2,4-二氯苄基氨基甲酸酯、4-甲基亚磺酰基苄基氨基甲酸酯(Msz)、9-蒽基氨基甲酸甲酯、联苯基氨基甲酸甲酯、2-甲硫基乙基氨基甲酸酯、2-甲基磺酰基乙基氨基甲酸酯、2-(对甲苯磺酰基)乙基氨基甲酸酯、[2-(1,3-二噻烷基)]氨基甲酸甲酯(Dmoc)、4-甲硫基苯基氨基甲酸酯(Mtpc)、2,4-二甲硫基苯基氨基甲酸酯(Bmpc)、2-磷鎓基乙基氨基甲酸酯(Peoc)、2-三苯基磷鎓基异丙基氨基甲酸酯(Ppoc)、1,1-二甲基-2-氰基乙基氨基甲酸酯、间-氯-对酰氧基苄基氨基甲酸酯、对(二羟基硼烷基)苄基氨基甲酸酯、5-苯并异噁唑基氨基甲酸甲酯、2-(三氟甲基)-6-色酮基氨基甲酸甲酯(Tcroc)、间-硝基苯基氨基甲酸酯、3,5-二甲氧基苄基氨基甲酸酯、邻-硝基苄基氨基甲酸酯、3,4-二甲氧基-6-硝基苄基氨基甲酸酯、苯基(邻-硝基苯基)甲基氨基甲酸酯、吩噻嗪基-(10)-羰基衍生物、N’-对甲苯磺酰基氨基羰基衍生物、N’-苯基氨基硫代羰基衍生物、氨基甲酸叔戊酯、S-苯基硫氨基甲酸酯、对氰基苄基氨基甲酸酯、环丁基氨基甲酸酯、环己基氨基甲酸酯、环戊基氨基甲酸酯、环丙基氨基甲酸甲酯、对-癸氧基苄基氨基甲酸酯、2,2-二甲氧基羰基乙烯基氨基甲酸酯、邻-(N,N-二甲基甲酰胺基)苄基氨基甲酸酯、1,1-二甲基-3-(N,N-二甲基甲酰胺基)丙基氨基甲酸酯、1,1-二甲基丙炔基氨基甲酸酯、二(2-吡啶基)氨基甲酸甲酯、2-呋喃基氨基甲酸甲酯、2-碘乙基氨基甲酸酯、异冰片基氨基甲酸酯、异丁基氨基甲酸酯、异烟基氨基甲酸酯、对-(对’-甲氧基苯基偶氮基)苄基氨基甲酸酯、1-甲基环丁基氨基甲酸酯、1-甲基环己基氨基甲酸酯、1-甲基-1-环丙基氨基甲酸甲酯、1-甲基-1-(3,5-二甲氧基苯基)乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(对苯基偶氮基苯基)乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-苯基乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(4-吡啶基)乙基氨基甲酸酯、苯基氨基甲酸酯、对-(苯基偶氮基)苄基氨基甲酸酯、2,4,6-三-叔丁基苯基氨基甲酸酯、4-(三甲基铵)苄基氨基甲酸酯、2,4,6-三甲基苄基氨基甲酸酯、甲酰胺、乙酰胺、氯乙酰胺、三氯乙酰胺、三氟乙酰胺、苯基乙酰胺、3-苯基丙酰胺、氮苯酰胺、3-吡啶基甲酰胺、N-苯甲酰基苯基丙氨酰衍生物、苯甲酰胺、对-苯基苯甲酰胺、邻-硝基苯基乙酰胺、邻-硝基苯氧基乙酰胺、乙酰基乙酰胺、(N’-二硫苄氧基羰基氨基)乙酰胺、3-(对-羟基苯基)丙酰胺、3-(邻-硝基苯基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻-硝基苯氧基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻-苯基偶氮基苯氧基)丙酰胺、4-氯丁酰胺、3-甲基-3-硝基丁酰胺、邻-硝基肉桂酰胺、N-乙酰基甲硫氨酸衍生物、邻-硝基苯甲酰胺、邻-(苯甲酰基氧基甲基)苯甲酰胺、4,5-二苯基-3-噁唑啉-2-酮、N-邻苯二甲酰亚胺、N-二硫琥珀酰亚胺(Dts)、N-2,3-二苯基马来酰亚胺、N-2,5-二甲基吡咯、N-1,1,4,4-四甲基二甲硅烷基氮杂环戊烷加合物(STABASE)、5-取代的1,3-二甲基-1,3,5-三氮杂环己烷-2-酮、5-取代的1,3-二苄基-1,3,5-三氮杂环己烷-2-酮、1-取代的3,5-二硝基-4-吡啶酮、N-甲基胺、N-烯丙基胺、N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基胺(SEM)、N-3-乙酰氧基丙基胺、N-(1-异丙基-4-硝基-2-氧基-3-吡咯啉-3-基)胺、季铵盐、N-苄基胺、N-二(4-甲氧基苯基)甲基胺、N-5-二苯并环庚胺、N-三苯基甲基胺(Tr)、N-[(4-甲氧基苯基)联苯基甲基]胺(MMTr)、N-9-苯基芴基胺(PhF)、N-2,7-二氯-9-芴基亚甲胺、N-二茂铁基甲基氨基(Fcm)、N-2-吡啶甲基氨基N’-氧化物、N-1,1-二甲硫基亚甲胺、N-苄基亚甲胺、N-对甲氧基苄基亚甲胺、N-二苯基亚甲胺、N-[(2-吡啶基)三甲苯基]亚甲胺、N-(N’,N’-二甲基氨基亚甲基)胺、N,N’-异亚丙二胺、N-对-硝基苄基亚甲胺、N-亚水杨酸基胺、N-5-氯亚水杨酸基胺、N-(5-氯-2-羟基苯基)苯基亚甲胺、N-环己基亚甲胺、N-(5,5-二甲基-3-氧基-1-环己烯基)胺、N-硼烷衍生物、N-二苯基二取代硼酸衍生物、N-[苯基(五羰基铬-或钨)羰基]胺、N-铜螯合物、N-锌螯合物、N-硝胺、N-硝基胺、N-氧化胺、联苯基膦酰胺(Dpp)、二甲硫基膦酰胺(Mpt)、联苯基硫代膦酰胺(Ppt)、二烷基氨基磷酸酯、联苄基氨基磷酸酯、联苯基氨基磷酸酯、苯次磺酰胺、邻-硝基苯次磺酰胺(Nps)、2,4-二硝基苯次磺酰胺、五氯苯次磺酰胺、2-硝基-4-甲氧基苯次磺酰胺、三苯基甲基次磺酰胺、3-硝基吡啶次磺酰胺(Npys)、对-甲苯磺酰胺(Ts)、苯磺酰胺、2,3,6,-三甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mtr)、2,4,6-三甲氧基苯磺酰胺(Mtb)、2,6-二甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Pme)、2,3,5,6-四甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mte)、4-甲氧基苯磺酰胺(Mbs)、2,4,6-三甲基苯磺酰胺(Mts)、2,6-二甲氧基-4-甲基苯磺酰胺(iMds)、2,2,5,7,8-戊甲基色满-6-磺酰胺(Pmc)、甲磺酰胺(Ms)、β-三甲基甲硅烷基乙磺酰胺(SES)、9-蒽磺酰胺、4-(4’,8’-二甲氧基萘基甲基)苯磺酰胺(DNMBS)、苄基磺酰胺、三氟甲基磺酰胺、和苯酰基磺酰胺。
适当保护的羧酸进一步包括但不限于甲硅烷基-、烷基-、烯基-、芳基-、和芳基烷基-保护的羧酸。合适的甲硅烷基基团的实例包括三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基联苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基等。合适的烷基基团的实例包括甲基、苄基、对甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、三苯甲基、叔丁基、四氢吡喃-2-基。合适的烯基基团的实例包括烯丙基。合适的芳基基团的实例包括任选地经取代的苯基、联苯基、或萘基。合适的芳基烷基基团的实例包括任选地经取代的苄基(例如，对甲氧基苄基(MPM)、3,4-二甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、对卤代苄基、2,6-二氯苄基、对氰基苄基)、以及2-吡啶甲基和4-吡啶甲基。
合适的羟基保护基团包括甲基、甲氧基甲基(MOM)、甲基硫代甲基(MTM)、叔丁基硫代甲基、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基(SMOM)、苄氧基甲基(BOM)、对甲氧基苄氧基甲基(PMBM)、(4-甲氧基苯氧基)甲基(对-AOM)、愈创木酚甲基(GUM)、叔丁氧基甲基、4-戊烯基氧基甲基(POM)、甲硅烷氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、2,2,2-三氯乙氧基甲基、二(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基(SEMOR)、四氢吡喃基(THP)、3-溴四氢吡喃基、四氢噻喃基、1-甲氧基环己基、4-甲氧基四氢吡喃基(MTHP)、4-甲氧基四氢噻喃基、4-甲氧基四氢噻喃基S,S-二氧化物、1-[(2-氯代-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基(CTMP)、1,4-二噁烷-2-基、四氢呋喃基、四氢噻吩基(tetrahydrothiofuranyl)、2,3,3a,4,5,6,7,7a-八氢-7,8,8-三甲基-4,7-桥亚甲基苯并呋喃-2-基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基-2-氟乙基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-(苯基氢硒基)乙基、叔丁基、烯丙基、对氯苯基、对甲氧基苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、对甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、对卤代苄基、2,6-二氯苄基、对氰基苄基、对苯基苄基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、3-甲基-2-吡啶甲基N-氧化基、二苯基甲基、p,p’-二硝基二苯甲基、5-二苯并环庚基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基、对甲氧基苯基二苯基甲基、二(对甲氧基苯基)苯基甲基、三(对甲氧基苯基)甲基、4-(4’-溴苯酰基氧基苯基)二苯基甲基、4,4’,4”-三(4,5-二氯邻苯二甲酰亚胺基苯基)甲基、4,4’,4”-三(乙酰丙酰基氧基苯基)甲基、4,4’,4”-三(苯甲酰基氧基苯基)甲基、3-(咪唑-1-基)二(4’,4”-二甲氧基苯基)甲基、1,1-二(4-甲氧基苯基)-1’-芘基甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)吨基、9-(9-苯基-10-氧代)蒽基、1,3-苯并二硫烷-2-基、苯并异噻唑基S,S-二氧化基、三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、二甲基异丙基甲硅烷基(IPDMS)、二乙基异丙基甲硅烷基(DEIPS)、二甲基叔己基(thexyl)甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、三苄基甲硅烷基、三对二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基(DPMS)、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基(TBMPS)、甲酸酯、苯甲酰甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧代戊酸酯(乙酰丙酸酯)、4,4-(亚乙基二硫代)戊酸酯(乙酰丙酰基二硫代乙缩醛)、新戊酸酯、金刚酸酯(adamantoate)、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯基苯甲酸酯、2,4,6-三甲基苯甲酸酯(菜酸酯(mesitoate))、烷基甲基碳酸酯、9-芴基甲基碳酸酯(Fmoc)、烷基乙基碳酸酯、烷基2,2,2-三氯乙基碳酸酯(Troc)、2-(三甲基甲硅烷基)乙基碳酸酯(TMSEC)、2-(苯基磺酰基)乙基碳酸酯(Psec)、2-(三苯基磷鎓基)乙基碳酸酯(Peoc)、烷基异丁基碳酸酯、烷基乙烯基碳酸酯、烷基烯丙基碳酸酯、烷基对硝基苯基碳酸酯、烷基苄基碳酸酯、烷基对甲氧基苄基碳酸酯、烷基3,4-二甲氧基苄基碳酸酯、烷基邻硝基苄基碳酸酯、烷基对硝基苄基碳酸酯、烷基S-苄基硫代碳酸酯、4-乙氧基-1-萘基碳酸酯、二硫代碳酸甲酯、2-碘苯甲酸酯、4-叠氮基丁酸酯、4-硝基-4-甲基戊酸酯、邻-(二溴甲基)苯甲酸酯、2-甲酰基苯磺酸酯、2-(甲硫基甲氧基)乙基、4-(甲硫基甲氧基)丁酸酯、2-(甲硫基甲氧基甲基)苯甲酸酯、2,6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯、2,6-二氯-4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2,4-二(1,1-二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯二苯基乙酸酯、异丁酸酯、单琥珀酸酯、(E)-2-甲基-2-丁烯酸酯、对-(甲氧基羰基)苯甲酸酯、α-萘甲酸酯、硝酸酯、烷基N,N,N’,N’-四甲基二氨基磷酸酯、烷基N-苯基氨基甲酸酯、硼酸酯、二甲基硫膦基、烷基2,4-二硝基苯基次磺酸酯、硫酸酯、甲磺酸酯(methanesulfonate、mesylate)、苄基磺酸酯以及甲苯磺酸酯(Ts)。为了保护1,2-二醇或1,3-二醇，保护基团包括亚甲基缩醛、亚乙基缩醛、1-叔丁基亚乙基缩酮、1-苯基亚乙基缩酮、(4-甲氧基苯基)亚乙基缩醛、2,2,2-三氯亚乙基缩醛、缩丙酮、亚环戊基缩酮、亚环己基缩酮、亚环庚基缩酮、亚苄基缩醛、对-甲氧基亚苄基缩醛、2,4-二甲氧基亚苄基缩酮、3,4-二甲氧基亚苄基缩醛、2-硝基亚苄基缩醛、甲氧基亚甲基缩醛、乙氧基亚甲基缩醛、二甲氧基亚甲基原酸酯、1-甲氧基亚乙基原酸酯、1-乙氧基亚乙基原酸酯、1,2-二甲氧基亚乙基原酸酯、α-甲氧基亚苄基原酸酯、1-(N,N-二甲基氨基)亚乙基衍生物、α-(N,N’-二甲基氨基)亚苄基衍生物、2-氧杂亚环戊基原酸酯、二-叔丁基亚甲硅烷基基团(DTBS)、1,3-(1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷亚基)衍生物(TIPDS)、四-叔丁氧基二硅氧烷-1,3-二亚基衍生物(TBDS)、碳酸酯、环硼酸酯、乙基硼酸酯、和苯基硼酸酯。
在一些实施例中，羟基保护基团是乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、对氯苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、苯甲酰基、对苯基苯甲酰基、2,6-二氯苄基、联苯基甲基、对硝基苄基、三苯基甲基(三苯甲基)、4,4'-二甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基联苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、苯甲酰基甲酸酯、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基、9-芴基甲基碳酸酯、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基(MMTr)、4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMTr)和4,4',4″-三甲氧基三苯甲基(TMTr)、2-氰基乙基(CE或Cne)、2-(三甲基甲硅烷基)乙基(TSE)、2-(2-硝基苯基)乙基、2-(4-氰基苯基)乙基、2-(4-硝基苯基)乙基(NPE)、2-(4-硝基苯基磺酰基)乙基、3,5-二氯苯基、2,4-二甲基苯基、2-硝基苯基、4-硝基苯基、2,4,6-三甲基苯基、2-(2-硝基苯基)乙基、丁基硫代羰基、4,4',4″-三(苯甲酰基氧基)三苯甲基、联苯基氨基甲酰基、乙酰丙酰基、2-(二溴甲基)苯甲酰基(Dbmb)、2-(异丙基硫代甲氧基甲基)苯甲酰基(Ptmt)、9-苯基氧杂蒽-9-基(苯基呫吨基(pixyl))或9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。在一些实施例中，每个羟基保护基团独立地选自乙酰基、苄基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基联苯基甲硅烷基、和4,4'-二甲氧基三苯甲基。在一些实施例中，羟基保护基团选自下组，所述组由以下组成：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基和4,4'-二甲氧基三苯甲基基团。在一些实施例中，磷键联保护基团是在整个寡核苷酸合成中与磷键联(例如核苷酸间键联)附接的基团。在一些实施例中，保护基团与硫代磷酸酯基团的硫原子附接。在一些实施例中，保护基团与核苷酸间硫代磷酸酯键联的氧原子附接。在一些实施例中，保护基团与核苷酸间磷酸酯键联的氧原子附接。在一些实施例中，保护基团是2-氰基乙基(CE或Cne)、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-硝基乙基、2-磺酰基乙基、甲基、苄基、邻硝基苄基、2-(对硝基苯基)乙基(NPE或Npe)、2-苯基乙基、3-(N-叔丁基甲酰胺基)-1-丙基、4-氧代戊基、4-甲硫基-l-丁基、2-氰基-1,1-二甲基乙基、4-N-甲基氨基丁基、3-(2-吡啶基)-1-丙基、2-[N-甲基-N-(2-吡啶基)]氨基乙基、2-(N-甲酰,N-甲基)氨基乙基、或4-[N-甲基-N-(2,2,2-三氟乙酰基)氨基]丁基。
样品：如本文所用的“样品”是特定生物体或自其获得的物质。在一些实施例中，样品是获得自或衍生自如本文所述的目的来源的生物样品。在一些实施例中，目的来源包含生物体，如动物或人类。在一些实施例中，生物样品包含生物组织或体液。在一些实施例中，生物样品是或包含：骨髓；血液；血细胞；腹水；组织或细针活检样品；含细胞的体液；自由浮动的核酸；痰；唾液；尿液；脑脊液，腹膜液；胸膜液；粪便；淋巴；妇科体液(gynecologicalfluid)；皮肤拭子；阴道拭子；口腔拭子；鼻拭子；洗涤液或灌洗液，如导管灌洗液或支气管肺泡灌洗液；抽吸物；刮屑；骨髓样本；组织活检样本；手术样本；粪便、其他体液、分泌物和/或排泄物；和/或来自其的细胞等。在一些实施例中，生物样品是或包含获得自个体的细胞。在一些实施例中，样品是通过任何适当方法直接获得自目的来源的“初级样品”。例如，在一些实施例中，初级生物样品通过选自下组的方法获得，所述组由以下组成：活检(例如，细针抽吸或组织活检)、手术、收集体液(例如，血液、淋巴、粪便等)等。在一些实施例中，如上下文可以清楚地看出，术语“样品”是指通过处理初级样品(例如，通过去除初级样品的一种或多种组分和/或通过向初级样品中添加一种或多种试剂)而获得的制备物。例如，使用半透膜进行过滤。这种“经处理的样品”可以包含例如核酸或蛋白质，所述核酸或蛋白质提取自样品或通过使初级样品经受如扩增或mRNA的反转录、分离和/或某些组分的纯化等技术而获得。在一些实施例中，样品是生物体。在一些实施例中，样品是植物。在一些实施例中，样品是动物。在一些实施例中，样品是人类。在一些实施例中，样品是除人类以外的生物体。
受试者：如本文所用，术语“受试者”或“测试受试者”是指任何生物体，根据本披露向所述生物体施用所提供的化合物或组合物，例如用于实验、诊断、预防和/或治疗目的。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、非人灵长动物和人；昆虫；蠕虫；等)和植物。在一些实施例中，受试者可能患有和/或易患疾病、障碍和/或病症。
基本上：如在此所使用，术语“基本上”是指展示出一个所感兴趣的特征或特性的总体的或接近总体的范围或程度的定性的状态。生物领域的普通技术人员应当理解的是生物学和化学现象(如果有的话)很少会达到完成和/或进行到完成或实现或避免一个绝对的结果。因此，术语“基本上”被用在此处用来获得在许多生物学和/或化学现象中潜在地缺少的内在的完全性。
患有：“患有”疾病、障碍和/或病症的个体已经诊断为和/或显示出疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状。
易患：“易患”疾病、障碍和/或病症的个体是比一般公众成员具有更高的发展疾病、障碍和/或病症的风险的个体。在一些实施例中，易患疾病、障碍和/或病症的个体预先倾向于患有所述疾病、障碍和/或病症。在一些实施例中，易患疾病、障碍和/或病症的个体可以未被诊断出患有所述疾病、障碍和/或病症。在一些实施例中，易患疾病、障碍和/或病症的个体可以表现出所述疾病、障碍和/或病症的症状。在一些实施例中，易患疾病、障碍和/或病症的个体可以不表现出所述疾病、障碍和/或病症的症状。在一些实施例中，易患疾病、障碍、和/或病症的个体将会发展所述疾病、障碍、和/或病症。在一些实施例中，易患疾病、障碍、和/或病症的个体将不会发展所述疾病、障碍、和/或病症。
全身：如本文所用，短语“全身施用”、“全身地施用”、“外周施用”、和“外周地施用”具有本领域理解的含义，是指施用化合物或组合物使其进入受体的系统。
治疗剂：如本文所用，短语“治疗剂”是指当施用受试者时具有治疗效果和/或引发所希望的生物学和/或药理效果的药剂。在一些实施例中，治疗剂是任何物质，所述物质可用于缓解、改善、减轻、抑制、预防、延迟疾病、障碍、和/或病症的一个或多个症状或特征的发作，降低疾病、障碍、和/或病症的一个或多个症状或特征的严重程度，和/或降低疾病、障碍、和/或病症的一个或多个症状或特征的发生率。
治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”意指当作为治疗方案的一部分施用时引发所希望的生物反应的物质(例如，治疗剂、组合物和/或配制品)的量。在一些实施例中，物质的治疗有效量是当施用于患有或易患疾病、障碍、和/或病症的受试者时，足以治疗、诊断、预防、和/或延迟疾病、障碍、和/或病症的发作的量。如本领域的普通技术人员将理解，物质的有效量可取决于以下这类因素变化：如所希望的生物学终点、待递送的物质、靶细胞或组织等。例如，用于治疗疾病、障碍、和/或病症的配制品中化合物的有效量是缓解、改善、减轻、抑制、预防、延迟疾病、障碍、和/或病症的一种或多种症状或特征的发作，降低疾病、障碍、和/或病症的一种或多种症状或特征的严重程度，和/或降低疾病、障碍、和/或病症的一种或多种症状或特征的发病率的量。在一些实施例中，以单个剂量施用治疗有效量；在一些实施例中，需要多个单位剂量来递送治疗有效量。
治疗：如本文所用，术语“治疗(treat、treatment、或treating)”是指用于部分地或完全缓解、改善、减轻、抑制、预防、延迟疾病、障碍、和/或病症的一种或多种症状或特征的发作，降低疾病、障碍、和/或病症的一种或多种症状或特征的严重程度，和/或降低疾病、障碍、和/或病症的一种或多种症状或特征的发生率的任何方法。治疗可以施用于未表现出疾病、障碍、和/或病症的迹象的受试者。在一些实施例中，治疗可以施用给仅表现出疾病、障碍、和/或病症的早期迹象的受试者，例如出于降低与疾病、障碍、和/或病症相关的病理学风险的目的。
不饱和的：如本文所用，术语“不饱和的”意指具有一个或多个不饱和单元的部分。
单位剂量：如本文所用，表述“单位剂量”是指作为单个剂量和/或以药物组合物的物理离散单位给药的量。在很多实施例中，单位剂量含有预定量的活性剂。在一些实施例中，单位剂量含有整个单个剂量的药剂。在一些实施例中，施用多于一个单位剂量以实现总单个剂量。在一些实施例中，需要或预期需要施用多个单位剂量，以实现预期的效果。单位剂量可以是例如含有预定量的一种或多种治疗剂、预定量的固体形式的一种或多种治疗剂的一定体积的液体(例如，可接受的载体)，含有预定量的一种或多种治疗剂等的持续释放配制品或药物递送装置。应当理解，单位剂量可以存在于配制品中，所述配制品除了一种或多种治疗剂之外，还包括任何各种组分。例如，如下文所述，可以包括可接受的载体(例如，药学上可接受的载体)、稀释剂、稳定剂、缓冲剂、防腐剂等。本领域技术人员将理解，在很多实施例中，特定的治疗剂的总适当日剂量可包含一部分或多个单位剂量，并且可由例如在合理的医学判断范围内的主治医师决定。在一些实施例中，对于任何特定受试者或生物体的特定的有效剂量水平将取决于多种因素，所述因素包括正在治疗的障碍和障碍的严重程度；所采用的特定的活性化合物的活性；所采用的特定的组合物；受试者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；施用时间，和所采用的特定的活性化合物的排泄率；治疗的持续时间；与所采用的特定化合物组合或一致使用的药物和/或其他疗法，以及医学领域中熟知的相似因素。
野生型：如本文所用，术语“野生型”具有其本领域理解的含义，其是指具有如在“正常”(与突变体、患病、改变等对比)状态或背景中在自然界中发现的结构和/或活性的实体。本领域普通技术人员将理解，野生型基因和多肽通常以多种不同形式(例如，等位基因)存在。
核酸：如本文所用，术语“核酸”包括任何核苷酸及其聚合物。如本文所用，术语“多核苷酸”是指具有任何长度的核苷酸(核糖核苷酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA))的聚合物形式。这些术语是指分子的一级结构，并且包括双链和单链DNA、以及双链和单链RNA。这些术语包括作为等效物的RNA或DNA的类似物，其由经修饰的核苷酸和/或经修饰的多核苷酸(例如但不限于甲基化、被保护和/或加帽的核苷酸或多核苷酸)制成。所述术语涵盖多核糖核苷酸或寡核糖核苷酸(RNA)和多脱氧核糖核苷酸或寡脱氧核糖核苷酸(DNA)；衍生自核碱基和/或经修饰的核碱基的N-糖苷或C-糖苷的RNA或DNA；衍生自糖和/或经修饰的糖的核酸；以及衍生自磷酸酯桥联和/或经修饰的核苷酸间键联的核酸。所述术语涵盖含有核碱基、经修饰的核碱基、糖、经修饰的糖、磷酸酯桥联或经修饰的核苷酸间键联的任何组合的核酸。实例包括且不限于含有核糖部分的核酸、含有脱氧核糖部分的核酸、含有核糖部分和脱氧核糖部分的核酸、含有核糖部分和经修饰的核糖部分的核酸。除非另有说明，否则前缀“聚(poly-)”是指含有2至约10,000个核苷酸单体单元的核酸，并且其中前缀“寡(oligo-)”是指含有2至约200个核苷酸单体单元的核酸。
核苷酸：如本文所用，术语“核苷酸”是指多核苷酸的单体单元，其由核碱基、糖和一个或多个核苷酸间键联组成。天然存在的碱基(鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、和尿嘧啶(U))是嘌呤或嘧啶的衍生物，但应所述理解为还包括天然存在的和非天然存在的碱基类似物。天然存在的糖是戊糖(五碳糖)，即脱氧核糖(其形成DNA)或核糖(其形成RNA)，但应所述理解，还包括天然存在的和非天然存在的糖类似物。将核苷酸经由核苷酸间键联进行连接以形成核酸、或多核苷酸。许多核苷酸间键联是本领域已知的(如但不限于磷酸酯、硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯等)。人工核酸包括PNA(肽核酸)、磷酸三酯、硫代磷酸酯、H-膦酸酯、氨基磷酸酯、硼烷磷酸酯、甲基膦酸酯、膦酰乙酸酯(phosphonoacetate)、硫代膦酰乙酸酯、以及天然核酸的磷酸酯骨架的其他变体，如本文所述的那些。在一些实施例中，天然核苷酸包含天然存在的碱基、糖和核苷酸间键联。如本文所用，术语“核苷酸”还涵盖用于代替天然核苷酸或天然存在的核苷酸的结构类似物，如修饰的核苷酸和核苷酸类似物。
经修饰的核苷酸：术语“修饰的核苷酸”包括在结构上与天然核苷酸不同但能执行天然核苷酸的至少一种功能的任何化学部分。在一些实施例中，修饰的核苷酸包含在糖、碱基和/或核苷酸间键联处的修饰。在一些实施例中，修饰的核苷酸包含修饰的糖、修饰的核碱基、和/或修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸能够具有核苷酸的至少一种功能，例如，在能够与包含至少互补碱基序列的核酸碱基配对的聚合物中形成亚基。
类似物：术语“类似物”包括在结构上与参考化学部分或部分类别不同但能执行此类参考化学部分或部分类别的至少一种功能的任何化学部分。作为非限制性实例，核苷酸类似物在结构上与核苷酸不同，但能执行核苷酸的至少一种功能；核碱基类似物在结构上与核碱基不同，但能执行核碱基的至少一种功能；等。
核苷：术语“核苷”是指其中核碱基或修饰的核碱基与糖或修饰的糖共价结合的部分。
经修饰的核苷：术语“经修饰的核苷”是指衍生自天然核苷或在化学上类似于天然核苷但包含使其与天然核苷有区别的化学修饰的部分。经修饰的核苷的非限制性实例包括在碱基和/或糖处包含修饰的那些。经修饰的核苷的非限制性实例包括在糖处具有2'修饰的那些。经修饰的核苷的非限制性实例还包括无碱基核苷(其缺乏核碱基)。在一些实施例中，经修饰的核苷能够具有核苷的至少一种功能，例如，在能够与包含至少互补碱基序列的核酸碱基配对的聚合物中形成部分。
核苷类似物：术语“核苷类似物”是指与天然核苷在化学上不同但能执行核苷的至少一种功能的化学部分。在一些实施例中，核苷类似物包含糖的类似物和/或核碱基的类似物。在一些实施例中，经修饰的核苷能够具有核苷的至少一种功能，例如，在能够与包含互补碱基序列的核酸碱基配对的聚合物中形成部分。
糖：术语“糖”是指以封闭和/或开放形式的单糖或多糖。在一些实施例中，糖是单糖。在一些实施例中，糖是多糖。糖包括但不限于核糖、脱氧核糖、戊呋喃糖、戊吡喃糖、和己吡喃糖部分。如本文所用，术语“糖”还涵盖用于代替常规糖分子的结构类似物，如二醇、形成核酸类似物的骨架的聚合物、二醇核酸(“GNA”)等。如本文所用，术语“糖”还涵盖用于代替天然核苷酸或天然存在的核苷酸的结构类似物，如修饰的糖和核苷酸糖。
经修饰的糖：术语“修饰的糖”是指可以替换糖的部分。修饰的糖模仿糖的空间排列、电子特性、或一些其他物理化学特性。
核碱基：术语“核碱基”是指参与氢键的核酸部分，其以序列特异性方式将一条核酸链与另一条互补链结合。最常见的天然存在的核碱基是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)、和胸腺嘧啶(T)。在一些实施例中，天然存在的核碱基是经修饰的腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、或胸腺嘧啶。在一些实施例中，天然存在的核碱基是甲基化的腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、或胸腺嘧啶。在一些实施例中，核碱基是“经修饰的核碱基”，例如，除腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)、和胸腺嘧啶(T)之外的核碱基。在一些实施例中，经修饰的核碱基是甲基化的腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、或胸腺嘧啶。在一些实施例中，经修饰的核碱基模拟核碱基的空间排列、电子特性或一些其他物理化学特性，并保留氢键合的特性，氢键合以序列特异性方式将一条核酸链与另一条核酸链结合。在一些实施例中，经修饰的核碱基可与所有五种天然存在的碱基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、或鸟嘌呤)配对，而基本上不影响熔解行为、被细胞内酶识别、或寡核苷酸双链体的活性。如本文所用，术语“核碱基”还涵盖用于代替天然的核苷酸或天然存在的核苷酸的结构类似物，如修饰的核碱基和核碱基类似物。
经修饰的核碱基：术语“经修饰的核碱基”、“经修饰的碱基”等是指与核碱基化学上不同但能执行核碱基的至少一种功能的化学部分。在一些实施例中，经修饰的核碱基是包含修饰的核碱基。在一些实施例中，经修饰的核碱基能够具有核碱基的至少一种功能，例如，在能够与包含至少互补碱基序列的核酸碱基配对的聚合物中形成部分。
阻断基团：术语“阻断基团”是指掩蔽官能团反应性的基团。随后可以通过去除阻断基团来除去官能团的掩蔽。在一些实施例中，阻断基团是保护基团。
部分：术语“部分”是指分子的特定的区段或官能团。化学部分通常是嵌入或附加于分子的公认的化学实体。
固体支持物：术语“固体支持物”是指能够合成核酸的任何支持物。在一些实施例中，所述术语是指玻璃或聚合物，其不溶于在合成核酸进行的反应步骤中使用的介质，并且衍生化以包含反应性基团。在一些实施例中，固体支持物是高度交联的聚苯乙烯(HCP)或可控孔度玻璃(CPG)。在一些实施例中，固体支持物是可控孔度玻璃(CPG)。在一些实施例中，固体支持物是可控孔度玻璃(CPG)和高度交联的聚苯乙烯(HCP)的杂合支持物。
同源性：“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过对在每个序列中用于比较目的而比对的位置进行比较来各自确定同源性和同一性。当所比较序列中的等同位置由同一碱基占据时，则所述分子在所述位置处是相同的；当等同位点由相同或类似核酸残基(例如，在空间性质和/或电子性质方面是类似的)占据时，则所述分子在所述位置处可称为同源(相似)。作为同源性/相似性或同一性百分比的表述是指在被比较的序列共享的位置处的相同或相似核酸的数目的函数。“不相关”或“非同源”序列与本文所述的序列共享小于40％同一性、小于35％同一性、小于30％同一性、或小于25％同一性。在比较两个序列时，不存在残基(氨基酸或核酸)或存在另外的残基也会降低同一性和同源性/相似性。
在一些实施例中，术语“同源性”描述了基于数学的序列相似性的比较，其用于鉴定具有相似功能或基序的基因。本文所述的核酸序列可用作“查询序列”来对公共数据库进行搜索，例如以鉴定其他家族成员、相关序列或同源物。在一些实施例中，可以使用Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)来进行这类搜索。在一些实施例中，可以用NBLAST程序(评分＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本披露的核酸分子同源的核苷酸序列。在一些实施例中，为了获得用于比较目的的有缺口的比对，可如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.[核酸研究]25(17):3389-3402中所描述地使用有缺口的BLAST。当使用BLAST和有缺口的BLAST程序时，可使用相应的程序(例如，XBLAST和BLAST)的默认参数(参见www.ncbi.nlm.nih.gov)。
同一性：如本文所用，“同一性”意指当将序列进行比对使序列匹配最大化时(即，考虑缺口和插入)，在两个或更多个序列中的相应位置处的相同核苷酸残基的百分比。同一性可容易地通过已知方法计算，包括但不限于本技术领域中已知的那些方法，包括但不限于WO2017/192679中所引用的那些方法。
寡核苷酸：术语“寡核苷酸”是指核苷酸的聚合物或寡聚物，并且可以包含天然和非天然核碱基、糖和核苷酸间键联的任何组合。
寡核苷酸可以是单链或双链的。单链寡核苷酸可以具有双链区域(由单链寡核苷酸的两个部分形成)，并且包含两个寡核苷酸链的双链寡核苷酸可以具有单链区域，例如其中两个寡核苷酸链彼此不互补的区域。示例寡核苷酸包括但不限于结构基因、包含控制区和终止区的基因、自我复制系统(如病毒DNA或质粒DNA)、单链和双链RNAi试剂和其他RNA干扰试剂(RNAi试剂或iRNA试剂)、shRNA、反义寡核苷酸、核酶、微小RNA、微小RNA模拟物、supermir、适体、antimir、antagomir、Ul衔接子、形成三链体的寡核苷酸、G-四链体寡核苷酸、RNA激活子、免疫刺激性寡核苷酸和诱饵寡核苷酸。
核苷酸间键联：如本文所用，短语“核苷酸间键联”通常是指连接寡核苷酸或核酸的核苷单元的键联。在一些实施例中，核苷酸间键联是如在天然存在的DNA和RNA分子中发现的磷酸二酯键联(天然磷酸酯键联)。在一些实施例中，核苷酸间键联包括经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，核苷酸间键联是“经修饰的核苷酸间键联”，其中磷酸二酯键联的每个氧原子任选地且独立地被有机或无机部分替换。在一些实施例中，这种有机或无机部分选自但不限于＝S、＝Se、＝NR'、-SR'、-SeR'、-N(R')2,、B(R')3、-S-、-Se-和-N(R')-，其中每个R'独立地如本披露中所定义和描述的。在一些实施例中，核苷酸间键联是磷酸三酯键联、硫代磷酸二酯键联
Figure BDA0003456638050000341
或经修饰的硫代磷酸三酯键联。在一些实施例中，核苷酸间键联是例如PNA(肽核酸)或PMO(二氨基磷酸酯吗啉基寡聚物)键联之一。本领域普通技术人员理解，由于键联中存在酸或碱部分，核苷酸间键联可以在给定pH下作为阴离子或阳离子存在。
经修饰的核苷酸间键联的非限制性实例是命名为s、s1、s2、s3、s4、s5、s6、s7、s8、s9、s10、s11、s12、s13、s14、s15、s16、s17和s18的经修饰的核苷酸间键联，如WO 2017/210647中所述。
例如，(Rp,Sp)-ATsCs1GA具有1)在T和C之间的硫代磷酸酯核苷酸间键联
Figure BDA0003456638050000351
和2)在C和G之间的具有
Figure BDA0003456638050000352
结构的硫代磷酸三酯核苷酸间键联。除非另有说明，否则在寡核苷酸序列之前的Rp/Sp标识描述了顺序地从寡核苷酸序列的5'至3'的核苷酸间键联中的手性键联磷原子的构型。例如，在(Rp,Sp)-ATsCs1GA中，位于T和C之间的“s”键联中的磷具有Rp构型，并且位于C和G之间的“s1”键联中的磷具有Sp构型。在一些实施例中，“全-(Rp)”或“全-(Sp)”分别用于表示寡核苷酸中的所有手性键联磷原子分别具有相同的Rp或Sp构型。
寡核苷酸类型：如本文所用，短语“寡核苷酸类型”用于定义具有特定碱基序列、骨架键联模式(即，核苷酸间键联类型(例如磷酸酯、硫代磷酸酯等)的模式)、骨架手性中心模式(即，键联磷立体化学模式(Rp/Sp))、以及骨架磷修饰模式的寡核苷酸。在一些实施例中，共同指定的“类型”的寡核苷酸彼此在结构上相同。
本领域技术人员将理解，本披露的合成方法在合成寡核苷酸链期间提供一定程度的控制，使得可以提前设计和/或选择寡核苷酸链的每个核苷酸单元以在键联磷处具有特定的立体化学和/或在键联磷处具有特定的修饰、和/或具有特定的碱基、和/或具有特定的糖。在一些实施例中，提前设计和/或选择寡核苷酸链以在键联磷处具有立体中心的特定组合。在一些实施例中，设计和/或确定寡核苷酸链以在键联磷处具有修饰的特定组合。在一些实施例中，设计和/或选择寡核苷酸链以具有碱基的特定组合。在一些实施例中，设计和/或选择寡核苷酸链以具有一个或多个以上结构特征的特定组合。在一些实施例中，本披露提供了包含多个寡核苷酸分子或由其组成的组合物(例如，手性受控的寡核苷酸组合物)。在一些实施例中，所有此类分子属于同一类型(即，在结构上彼此相同)。然而，在许多实施例中，所提供的组合物包含多个不同类型的寡核苷酸(通常以预定的相对量)。
手性控制：如本文所用，“手性控制”是指控制寡核苷酸内的手性核苷酸间键联中的手性键联磷的立体化学标识。在一些实施例中，通过寡核苷酸的糖和碱基部分中不存在的手性元件实现控制，例如，在一些实施例中，通过在寡核苷酸制备期间使用一种或多种手性助剂实现控制，如在本披露中例示的，手性助剂通常是寡核苷酸制备期间使用的手性亚磷酰胺的一部分。与手性控制相反，本领域普通技术人员认识到，如果使用常规寡核苷酸合成来形成手性核苷酸间键联，则不使用手性助剂的这样的常规寡核苷酸合成不能控制手性核苷酸间键联处的立体化学。在一些实施例中，控制了寡核苷酸内手性核苷酸间键联中每个手性键联磷的立体化学标识。
手性受控的寡核苷酸组合物：如本文所用，术语“手性受控的寡核苷酸组合物”、“手性受控的核酸组合物”等是指包含多个寡核苷酸(或核酸)的组合物，所述多个寡核苷酸(或核酸)共享：1)共同的碱基序列，2)共同的骨架键联模式，以及3)共同的骨架磷修饰模式，其中所述多个寡核苷酸(或核酸)在一个或多个手性核苷酸间键联(手性受控的或立体定义的核苷酸间键联，其手性键联磷在组合物(“立体定义的”)中呈Rp或Sp，而非如同非手性受控的核苷酸间键联一样的随机Rp和Sp混合物)处共享相同的键联磷立体化学。手性受控的寡核苷酸组合物中所述多个寡核苷酸(或核酸)的水平是预定的/受控的(例如，通过手性受控的寡核苷酸制备以立体选择性地形成一个或多个手性核苷酸间键联)。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中的所有寡核苷酸的约1％-100％(例如，约5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％、90％-100％、95％-100％、50％-90％，或约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，或至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)是所述多个寡核苷酸。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中共享共同的碱基序列、共同的骨架键联模式以及共同的骨架磷修饰模式的所有寡核苷酸的约1％-100％(例如，约5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％、90％-100％、95％-100％、50％-90％，或约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，或至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)是所述多个寡核苷酸。在一些实施例中，水平是组合物中的所有寡核苷酸的；或组合物中共享共同的碱基序列(例如，多个寡核苷酸或一种寡核苷酸类型的碱基序列)的所有寡核苷酸的；或组合物中共享共同的碱基序列、共同的骨架键联模式以及共同的骨架磷修饰模式的所有寡核苷酸的；或组合物中共享共同的碱基序列、共同的碱基修饰模式、共同的糖修饰模式、共同的核苷酸间键联类型模式、和/或共同的核苷酸间键联修饰模式的所有寡核苷酸的约1％-100％(例如，约5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％、90％-100％、95％-100％、50％-90％，或约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，或至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)。在一些实施例中，多个寡核苷酸约1-50个(例如，约1-10、1-20、5-10、5-20、10-15、10-20、10-25、10-30、或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20、或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个)手性核苷酸间键联具有相同的立体化学。在一些实施例中，所述多个寡核苷酸在约1％-100％(例如，约5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％、90％-100％、95％-100％、50％-90％，约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，或至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％)的手性核苷酸间键联处共享相同的立体化学。在一些实施例中，多个寡核苷酸(或核酸)具有相同的构成。在一些实施例中，多个寡核苷酸(或核酸)的水平是组合物中的与多个寡核苷酸(或核酸)具有相同构成的所有寡核苷酸(或核酸)的约1％-100％(例如约5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80-100％、90-100％、95-100％、50％-90％，或约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％，或至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)。在一些实施例中，每个手性核苷酸间键联是手性受控的核苷酸间键联，并且组合物是完全手性受控的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，多个寡核苷酸(或核酸)在结构上相同。在一些实施例中，手性受控的核苷酸间键联关于其手性连接磷具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％，典型地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的非对映纯度(diastereopurity)。在一些实施例中，手性受控的核苷酸间键联链具有至少95％的非对映纯度。在一些实施例中，手性受控的核苷酸间键联链具有至少96％的非对映纯度。在一些实施例中，手性受控的核苷酸间键联链具有至少97％的非对映纯度。在一些实施例中，手性受控的核苷酸间键联链具有至少98％的非对映纯度。在一些实施例中，手性受控的核苷酸间键联链具有至少99％的非对映纯度。在一些实施例中，水平的百分比是或至少是(DS)nc，其中DS是如本披露中所述的非对映纯度(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或更高)，并且nc是本披露中描述的手性受控的核苷酸间键联的数目(例如1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个)。在一些实施例中，水平的百分比是或至少是(DS)nc，其中DS是95％-100％。例如，当DS是99％并且nc是10时，所述百分比是或至少是90％((99％)10≈0.90＝90％)。在一些实施例中，组合物中多个寡核苷酸的水平表示为寡核苷酸中每个手性受控的核苷酸间键联链的非对映纯度的乘积。在一些实施例中，连接寡核苷酸(或核酸)中两个核苷的核苷酸间键联的非对映纯度由连接相同两个核苷的二聚体的核苷酸间键联的非对映纯度表示，其中使用可比较的条件(在某些情况下，相同的合成循环条件)制备二聚体(例如，对于寡核苷酸…NxNy…中Nx和Ny之间的键联，二聚体为NxNy)。在一些实施例中，不是所有的手性核苷酸间键联都是手性受控的核苷酸间键联，并且组合物是部分地手性受控的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，如在立体随机寡核苷酸组合物中通常观察到的，非手性受控的核苷酸间键联具有小于约80％、75％、70％、65％、60％、55％或约50％的非对映纯度(例如，如本领域技术人员所知，来自传统的寡核苷酸合成，例如亚磷酰胺方法)。在一些实施例中，多个寡核苷酸(或核酸)具有相同的类型。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物包含非随机水平或受控水平的个别寡核苷酸类型或核酸类型。例如，在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物包含一种且不超过一种寡核苷酸类型。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物包含超过一种寡核苷酸类型。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物包含多种寡核苷酸类型。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物是一种寡核苷酸类型的寡核苷酸的组合物，所述组合物包含非随机水平或受控水平的所述寡核苷酸类型的多个寡核苷酸。
手性纯：如本文所用，短语“手性纯”用于描述寡核苷酸或其组合物，其中全部或几乎所有的寡核苷酸分子(其余为杂质)相对于键联磷原子以单非对映异构形式存在。
预定：预定(predetermined/pre-determined)意指有意选择的或非随机或受控的，例如与随机出现、随机或在无控制的情况下达成相反。阅读本说明书的本领域普通技术人员将理解，本披露提供了以下技术，所述技术允许对将并入寡核苷酸组合物中的特定化学特征和/或立体化学特征进行选择且进一步允许具有这类化学特征和/或立体化学特征的寡核苷酸组合物的控制制备。此类所提供的组合物如本文所述地“预定”。由于通过不受控制以有意产生特定化学特征和/或立体化学特征的过程而偶然产生某些寡核苷酸，可能含有所述寡核苷酸的组合物则不是“预定”组合物。在一些实施例中，预定组合物是可有意地复制(例如，通过重复控制过程)的组合物。在一些实施例中，组合物中多个寡核苷酸的预定水平意指所述组合物中所述多个寡核苷酸的绝对量和/或相对量(比率、百分比等)是控制的。在一些实施例中，组合物中预定水平的多种寡核苷酸是通过手性受控的寡核苷酸制备而获得的。
键联磷：如本文所定义，短语“键联磷”用于指示所提及的特定磷原子是存在于核苷酸间键联中的磷原子，所述磷原子对应于如天然存在的DNA和RNA中所存在的磷酸二酯核苷酸间键联的磷原子。在一些实施例中，键联磷原子位于经修饰的核苷酸间键联中，其中磷酸二酯键联的每个氧原子任选地且独立地被有机或无机部分替换。在一些实施例中，键联磷原子是手性的。在一些实施例中，键联磷原子是非手性的。
P-修饰：如本文所用，术语“P-修饰”是指在键联磷处除立体化学修饰以外的任何修饰。在一些实施例中，P-修饰包含添加、取代或移除与键联磷共价附接的侧基部分。在一些实施例中，“P-修饰”是-X-L-R1，其中X、L和R1中的每一个独立地如本披露所定义和描述。
嵌段体(Blockmer)：如本文所用，术语“嵌段体”是指寡核苷酸链，其表征每个单个核苷酸单元的结构特征模式的特征在于，在核苷酸间磷键联处存在至少两个共享共同的结构特征的连续核苷酸单元。共同的结构特征意指在键联磷处的共同立体化学或在键联磷处的共同修饰。在一些实施例中，所述至少两个在核苷酸间磷键联处共享共同的结构特征的连续核苷酸单元被称为“嵌段”。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸是嵌段体。
在一些实施例中，嵌段体是“立体嵌段体”，例如至少两个连续核苷酸单元在键联磷处具有相同的立体化学。这样的至少两个连续核苷酸单元形成“立体嵌段”。
在一些实施例中，嵌段体是“P-修饰嵌段体”，例如至少两个连续核苷酸单元在键联磷处具有相同的修饰。这样的至少两个连续核苷酸单元形成“P-修饰嵌段”。例如，(Rp,Sp)-ATsCsGA是P-修饰嵌段体，因为至少两个连续核苷酸单元Ts和Cs具有相同的P-修饰(即，均为硫代磷酸二酯)。在(Rp,Sp)-ATsCsGA的同一寡核苷酸中，TsCs形成嵌段，且所述嵌段是P-修饰嵌段。
在一些实施例中，嵌段体是“键联嵌段体”，例如至少两个连续核苷酸单元在键联磷处具有相同的立体化学和相同的修饰。至少两个连续核苷酸单元形成“键联嵌段”。例如，(Rp,Rp)-ATsCsGA是键联嵌段体，因为至少两个连续核苷酸单元Ts和Cs具有相同的立体化学(均为Rp)及P-修饰(均为硫代磷酸酯)。在(Rp,Rp)-ATsCsGA的同一寡核苷酸中，TsCs形成嵌段，且所述嵌段是键联嵌段。
在一些实施例中，嵌段体包含一个或多个独立地选自立体嵌段、P-修饰嵌段和键联嵌段的嵌段。在一些实施例中，嵌段体就一个嵌段而言是立体嵌段体，和/或就另一嵌段而言是P-修饰嵌段体，和/或就又另一嵌段而言是键联嵌段体。
本文关于本披露的化合物和组合物的方法和结构也适用于药学上可接受的酸或碱加成盐形式(除非另有说明)。
某些实施例的描述
寡核苷酸提供适用于各种应用的分子工具。举例而言，寡核苷酸(例如靶向C9orf72的寡核苷酸)适用于治疗性、诊断性及研究性应用，包括各种病症、障碍及疾病的治疗。天然存在的核酸(例如，未经修饰的DNA或RNA)的使用受到限制，例如由于其对核酸内切酶及核酸外切酶的易感性而受到限制。因此，已研发出各种合成对应物来避开这些缺点。这些合成对应物包括含有化学修饰的合成寡核苷酸，所述化学修饰例如碱基修饰、糖修饰、骨架修饰等，其尤其使得这些分子不太容易降解且改善了寡核苷酸的其他特性和/或活性。自结构观点来看，核苷酸间键联修饰可引入手性，且寡核苷酸的某些特性可能受到形成寡核苷酸骨架的磷原子的构型的影响。在很多实施例中，本披露提供了包含手性受控的手性核苷酸间键联的技术(例如寡核苷酸、组合物、方法等)。尤其是，所提供的技术可以提供高活性(例如降低靶标核酸(例如多种转录物)和/或由其编码的产物(例如多种蛋白质)的水平和/或活性)、选择性(例如选择性降低某些靶标核酸(例如多种转录物)和/或由其编码的产物(例如多种蛋白质)相对于一种或多种其他核酸的水平和/或活性)、和/或低毒性(例如低水平的不良副作用，例如低水平的不良免疫活性)。
寡核苷酸
尤其是，本披露提供了各种设计的寡核苷酸，其可包含本披露中描述的各种核碱基及其模式、糖及其模式、核苷酸间键联及其模式和/或其他化学部分及其模式。在一些实施例中，所提供的C9orf72寡核苷酸可指导C9orf72基因和/或其一种或多种产物(例如，转录物，mRNA，蛋白质等)的表达、水平和/或活性降低。在一些实施例中，所提供的C9orf72寡核苷酸可降低与多种病症、障碍或疾病相关的C9orf72核酸(例如，可以是C9orf72基因的任一条链或从C9orf72基因的任一条链转录的基因、转录物、mRNA等)和/或由其编码的产物(例如，多种蛋白质和/或肽等)的表达、水平和/或活性。在一些实施例中，所提供的C9orf72寡核苷酸可指导受试者或患者的细胞中C9orf72基因和/或其一种或多种产物的表达、水平和/或活性降低。在一些实施例中，细胞通常表达C9orf72或产生C9orf72蛋白质。在一些实施例中，所提供的C9orf72寡核苷酸可以指导C9orf72靶标基因或基因产物的表达、水平和/或活性的降低，并且具有以下碱基序列，所述碱基序列由本文披露的C9orf72寡核苷酸的碱基序列组成、包含本文披露的C9orf72寡核苷酸的碱基序列、或包含本文披露的C9orf72寡核苷酸的碱基序列的一部分(例如，序列段为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个连续碱基)，其中每个T可以独立地被U取代并且反之亦然，并且所述寡核苷酸包含碱基、糖和/或核苷酸间键联的至少一种非天然存在的修饰。在一些实施例中，相较与病症、障碍或疾病较低相关或不相关的C9orf72核酸和/或由其编码的产物的表达、水平和/或活性，与多种病症、障碍或疾病相关的C9orf72核酸(例如，可以是C9orf72基因的任一条链或从C9orf72基因的任一条链转录的基因、转录物、mRNA等)和/或由其编码的产物(例如，多种蛋白质和/或肽等)的表达、水平和/或活性被选择性地降低。在一些实施例中，包含扩增的重复序列(例如，如图1所示，反义或有义)的v1和/或v3转录物和/或其产物与多种病症、障碍或疾病相关。在一些实施例中，与包含扩增的重复序列的v1和v3转录物相比，v2转录物与病症、障碍或疾病不相关或较低相关。如本领域技术人员所理解的，如果一个事件或实体的存在、水平和/或形式与另一事件或实体相关联，则两个事件或实体彼此“相关”(如此处使用的术语)。例如，如果一个实体(例如多肽、遗传标记、代谢物、微生物、转录物等)的存在、水平和/或形式与特定疾病、障碍或病症的发生率和/或易感性(例如，在相关人群中)相关联，则认为该实体与该疾病、障碍或病症相关。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可指导靶标基因例如C9orf72靶标基因或其产物的表达、水平和/或活性降低。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可以通过RNA酶H介导的敲低来指导C9orf72靶标基因或其产物的表达、水平和/或活性的降低。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可通过在结合C9orf72靶标基因mRNA后在空间上阻断翻译和/或通过改变或干扰mRNA拼接来指导C9orf72靶标基因或其产物的表达、水平和/或活性降低。然而，无论如何，本披露不限于任何特定机制。在一些实施例中，本披露提供了能够通过双链RNA干扰，单链RNA干扰，RNA酶H介导的敲低，翻译的空间位阻或两个或更多个这样的机制的组合操作的寡核苷酸、组合物、方法等。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸能够介导C9orf72的表达、水平和/或活性降低。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸能够通过涉及C9orf72 mRNA的mRNA降解和/或翻译位阻的机制来介导C9orf72的表达、水平和/或活性的降低。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸能够介导多于一个C9orf72等位基因的表达、水平和/或活性降低。在一些实施例中，相较与病症、障碍或疾病较低相关或不相关的C9orf72等位基因的表达、水平和/或活性，C9orf72寡核苷酸能够选择性地介导与病症、障碍或疾病相关的C9orf72等位基因的表达、水平和/或活性的降低。在一些实施例中，相较与病症、障碍或疾病较低相关或不相关的C9orf72转录物和/或由其编码的产物的表达、水平和/或活性，C9orf72寡核苷酸能够选择性地介导与病症、障碍或疾病相关的C9orf72转录物和/或由其编码的产物的表达、水平和/或活性的降低。
在一些实施例中，本披露涉及治疗与C9orf72相关的疾病、障碍或病症的方法，该方法包括施用治疗有效量的能够介导C9orf72的表达、水平和/或活性降低的C9orf72寡核苷酸的步骤。在一些实施例中，可以存在C9orf72的多种形式(例如等位基因)，并且所提供的技术可以降低两种或更多种或所有形式和其产物的表达、水平和/或活性。在一些实施例中，相较与病症、障碍或疾病较低相关或不相关的那些，所提供的技术选择性地降低与病症、障碍或疾病相关的C9orf72转录物和/或由其编码的产物的表达、水平和/或活性。
在一些实施例中，本披露涉及治疗与C9orf72相关的疾病、障碍或病症的方法，该方法包括向患有该疾病的受试者施用治疗有效量的所提供的寡核苷酸或其组合物。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸包含例如在表中描述的结构元件或其一部分。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸包含本文所述的碱基序列(或其一部分)(其中每个T可以独立地被U取代，反之亦然)，化学修饰或化学修饰模式(或其一部分)和/或本文所述的形式或其一部分。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸具有包含该碱基序列(或其一部分)的碱基序列(其中每个T可以独立地被U取代)，化学修饰模式(或其一部分)和/或本文中所披露的(例如在表中，或本文中所描述的)寡核苷酸的形式。在一些实施例中，这样的寡核苷酸，例如C9orf72寡核苷酸降低了基因例如C9orf72基因或其基因产物的表达、水平和/或活性。
尤其是，C9orf72寡核苷酸可以与它们的靶标核酸(例如，mRNA前体，成熟mRNA等)杂交。例如，在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可以与衍生自DNA链(C9orf72基因的任一链)的C9orf72核酸杂交。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可与C9orf72转录物杂交。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可与处于任何RNA加工阶段的C9orf72核酸杂交，包括但不限于mRNA前体或成熟mRNA。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可与C9orf72核酸或其互补序列的任何元件杂交，包括但不限于：启动子区域、增强子区域、转录终止区域、翻译起始信号、翻译终止信号、编码区域、非编码区域、外显子、内含子、内含子/外显子或外显子/内含子连接，5'UTR或3'UTR。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可以与其具有不超过2个错配的靶标杂交。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可以与其具有不超过一个错配的靶标杂交。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可以与其不具有错配(例如，当所有C-G和/或A-T/U碱基配对时)的靶标杂交。
在一些实施例中，寡核苷酸可与两个或更多个转录物变体杂交。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可与两个或更多个或所有C9orf72转录物变体杂交。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可与衍生自有义链的两个或更多个或所有C9orf72转录物变体杂交。在一些实施例中，寡核苷酸选择性地同与病症、障碍或疾病相关的转录物(例如，包含扩增的重复序列的那些转录物)杂交。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸的C9orf72靶标是并非mRNA的C9orf72 RNA。
在一些实施例中，寡核苷酸(例如C9orf72寡核苷酸)含有增加水平的一种或多种同位素。在一些实施例中，寡核苷酸(例如C9orf72寡核苷酸)例如经一种或多种元素(例如氢、碳、氮等)的一种或多种同位素进行标记。在一些实施例中，所提供的组合物中的寡核苷酸(例如C9orf72寡核苷酸)(例如，多种组合物的寡核苷酸)包含碱基修饰、糖修饰和/或核苷酸间键联修饰，其中这些寡核苷酸含有富集水平的氘。在一些实施例中，寡核苷酸(例如C9orf72寡核苷酸)在一个或多个位置处经氘标记(用-2H替换-1H)。在一些实施例中，寡核苷酸链或与所述寡核苷酸链缀合的任何部分(例如靶向部分等)的一个或多个1H经2H取代。此类寡核苷酸可用于本文所述的组合物和方法中。
在一些实施例中，本披露提供了包含多个寡核苷酸的寡核苷酸组合物，所述寡核苷酸：
1)具有与转录物中的靶标序列(例如，C9orf72靶标序列)互补的共同的碱基序列；并且
2)包含一个或多个修饰的糖部分和/或修饰的核苷酸间键联。
在一些实施例中，具有共同的碱基序列的C9orf72寡核苷酸可以具有相同的核苷修饰(例如糖修饰、碱基修饰等)模式。在一些实施例中，核苷修饰模式可以由位置和修饰的组合表示。在一些实施例中，骨架键联模式包含每个核苷酸间键联的位置和类型(例如磷酸酯、硫代磷酸酯、经取代的硫代磷酸酯等)。
在一些实施例中，所提供的组合物包含多个寡核苷酸。在一些实施例中，多个寡核苷酸是相同的寡核苷酸类型。在一些实施例中，多个寡核苷酸共享共同的碱基序列。在一些实施例中，多个寡核苷酸共享共同的糖修饰模式。在一些实施例中，多个寡核苷酸共享共同的碱基修饰模式。在一些实施例中，多个寡核苷酸共享共同的核苷修饰模式。在一些实施例中，多个寡核苷酸具有相同的构成。在一些实施例中，多个寡核苷酸是相同的。
在一些实施例中，如本文所举例说明的，C9orf72寡核苷酸，是手性受控的，包含一个或多个手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸是立体化学纯的。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸与其他立体异构体基本上分开。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸包含一个或多个修饰的核碱基、一个或多个修饰的糖和/或一个或多个修饰的核苷酸间键联。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸包含一个或多个修饰的糖。在一些实施例中，本披露的寡核苷酸包含一个或多个修饰的核碱基。根据本披露，可以将各种修饰引入糖和/或核碱基。例如，在一些实施例中，修饰是US 9006198中描述的修饰。在一些实施例中，修饰是描述于US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US 10160969、US10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US 2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO2019/200185、WO 2019/217784、和/或WO 2019/032612中的修饰，其各自的糖、碱基和核苷酸间键联修饰通过引用独立地并入本文。
如本披露中使用的，在一些实施例中，“一个或多个”是1-200、1-150、1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25。在一些实施例中，“一个或多个”是一个。在一些实施例中，“一个或多个”是两个。在一些实施例中，“一个或多个”是三个。在一些实施例中，“一个或多个”是四个。在一些实施例中，“一个或多个”是五个。在一些实施例中，“一个或多个”是六个。在一些实施例中，“一个或多个”是七个。在一些实施例中，“一个或多个”是八个。在一些实施例中，“一个或多个”是九个。在一些实施例中，“一个或多个”是十个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少一个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少两个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少三个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少四个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少五个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少六个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少七个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少八个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少九个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少十个。
如本披露中使用的，在一些实施例中，“至少一个”是1-200、1-150、1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25。在一些实施例中，“至少一个”是一个。在一些实施例中，“至少一个”是两个。在一些实施例中，“至少一个”是三个。在一些实施例中，“至少一个”是四个。在一些实施例中，“至少一个”是五个。在一些实施例中，“至少一个”是六个。在一些实施例中，“至少一个”是七个。在一些实施例中，“至少一个”是八个。在一些实施例中，“至少一个”是九个。在一些实施例中，“至少一个”是十个。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸是或包含表中描述的C9orf72寡核苷酸。
如本披露中所证明的，在一些实施例中，所提供的寡核苷酸(例如，C9orf72寡核苷酸)的特征在于，当它与敲低系统中的转录物接触时，其靶标的敲低(例如，C9orf72寡核苷酸的C9orf72转录物。
在一些实施例中，寡核苷酸以盐形式提供。在一些实施例中，寡核苷酸以盐的形式提供，所述盐包含作为盐形式存在的带负电荷的核苷酸间键联(例如，硫代磷酸酯核苷酸间键联，天然磷酸酯键联等)。在一些实施例中，寡核苷酸以药学上可接受的盐的形式提供。在一些实施例中，寡核苷酸以金属盐的形式提供。在一些实施例中，寡核苷酸以钠盐形式提供。在一些实施例中，寡核苷酸以金属盐例如钠盐的形式提供，其中每个带负电荷的核苷酸间键联独立地为盐形式(例如针对钠盐，对于硫代磷酸酯核苷酸间键联是-O-P(O)(SNa)-O-，对于天然磷酸酯键联是-O-P(O)(ONa)-O-，等)。
在一些实施例中，本披露提供包含一个或两个翼及核心且包含或具有翼-核心-翼、核心-翼或翼-核心结构的寡核苷酸，其中每个翼和核心独立地包含一个或多个核碱基。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含或具有翼-核心-翼结构。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含或具有核心-翼结构。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含或具有翼-核心结构。在一些实施例中，核心是如本披露中所描述的连续核苷酸单元区域。在一些实施例中，每个翼独立地包含如本披露中所描述的一个或多个核碱基。
在一些实施例中，翼-核心-翼基序被描述为“X-Y-Z”，其中“X”表示5'-翼的长度(除非另有说明，否则以核碱基数表示)，“Y”表示核心的长度，且“Z”表示3'-翼的长度。在一些实施例中，X是1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，并且Z是1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。在一些实施例中，Y是1-50，例如5-50、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，X和Z具有相同或不同的长度，和/或具有相同或不同的修饰或修饰模式。在一个优选的实施例中，Y介于8与15个核苷酸之间。X、Y或Z可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或更多个核苷酸中的任一者。在一些实施例中，本文所述的寡核苷酸具有或包含例如5-10-5、5-10-4、4-10-4、4-10-3、3-10-3、2-10-2、5-9-5、5-9-4、4-9-5、5-8-5、5-8-4、4-8-5、5-7-5、4-7-5、5-7-4或4-7-4的翼-核心-翼结构。在一些实施例中，本文中所描述的寡核苷酸具有或包含例如5-10、8-4、4-12、12-4、3-14、16-2、18-1、10-3、2-10、1-10、8-2、2-13、5-13、5-8或6-8的翼-核心或核心-翼结构。
在一些实施例中，翼包含一个或多个糖修饰。在一些实施例中，翼-核心-翼结构的两个翼包含相同的糖修饰。在一些实施例中，翼-核心-翼结构的两个翼包含不同糖修饰。在一些实施例中，翼-核心-翼结构的两个翼包含不同糖修饰模式。在一些实施例中，翼-核心-翼结构的两个翼包含相同糖修饰的不同糖修饰模式。在一些实施例中，翼-核心-翼结构的两个翼包含相同的糖修饰模式。在一些实施例中，翼包含两个或更多个不同糖修饰。
在一些实施例中，糖修饰是2'-修饰(例如2’-OR，其中R如本文所述但不是-H)、涉及2’-碳的双环糖修饰(例如在LNA糖中)等。在一些实施例中，翼中的每个糖修饰独立地是2'-修饰。在一些实施例中，翼-核心-翼的两个翼中的每个糖修饰独立地是2'-修饰。在一些实施例中，翼或每个翼独立地包含两个或更多个不同的糖修饰，其中每个糖修饰独立地是2’-修饰。在一些实施例中，每个2′-修饰独立地是2′-OR修饰，其中R如本文所述但不是-H。在一些实施例中，每个2′-修饰独立地是2′-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2'-OMe或2'-MOE。
在一些实施例中，与不存在糖修饰相比，糖修饰提供改善的稳定性和/或杂交。在一些实施例中，某些糖修饰(例如2'-MOE)在其他相同的条件下相比于2'-OMe提供更大稳定性。
在一些实施例中，翼包含一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，翼包含一个或多个连续的天然磷酸酯键联。在一些实施例中，翼包含一个或多个天然磷酸酯键联以及一个或多个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，翼不包含天然磷酸酯键联，并且翼的每个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，翼包含一个或多个不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，翼包含一个或多个中性核苷酸间键联。在一些实施例中，每个翼独立地包含一个或多个不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，每个翼独立地包含一个或多个中性核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联或中性核苷酸间键联独立地是手性受控的。在一些实施例中，每个不带负电荷的核苷酸间键联或中性核苷酸间键联独立地是手性受控的。在一些实施例中，翼包含1-5个，例如1、2、3、4、或5个不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，翼包含1个不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，翼包含2个不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，翼包含3个不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，翼包含4个不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，翼包含5个不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，每个不带负电荷的核苷酸间键联独立地是中性核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联或中性核苷酸间键联是n001。在一些实施例中，每个是001，并且任选地以及独立地是手性受控的。在一些实施例中，每个不带负电荷的核苷酸间键联(例如n001)独立地是手性受控的。在一些实施例中，n001是手性受控的且是Rp。在一些实施例中，n001是手性受控的且是Sp。在一些实施例中，翼包含一个或多个手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联和一个或多个手性受控的中性核苷酸间键联。在一些实施例中，翼包含一个或多个手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联和一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，翼包含一个或多个手性受控的中性核苷酸间键联和一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，翼包含一个或多个手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联和一个或多个手性受控的中性核苷酸间键联和一个或多个天然磷酸酯键联(例如表中某些寡核苷酸中的某些5'-翼)。在一些实施例中，翼中的每个核苷酸间键联独立地选自天然磷酸酯键联和硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，翼中的每个核苷酸间键联独立地选自天然磷酸酯键联、硫代磷酸酯核苷酸间键联和不带负电荷的核苷酸间键联(例如，中性核苷酸间键联(如n001))。在一些实施例中，翼中的每个核苷酸间键联独立地选自硫代磷酸酯核苷酸间键联和不带负电荷的核苷酸间键联(例如，中性核苷酸间键联(如n001))。在一些实施例中，一个或多个或每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性受控的。在一些实施例中，一个或多个或每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性受控的且是Sp。在一些实施例中，一个或多个或每个不带负电荷的核苷酸间键联(例如，中性核苷酸间键联(如n001))独立地是手性受控的。在一些实施例中，一个或多个或每个不带负电荷的核苷酸间键联(例如，中性核苷酸间键联(如n001))独立地是手性受控的且是Rp。在一些实施例中，翼(例如5'-翼)的模式(例如，包括核苷酸间键联的类型和键联磷立体化学)是或包含SOOO，其中S表示手性受控的且是Sp的硫代磷酸酯核苷酸间键联，并且O表示天然磷酸酯键联。在一些实施例中，翼(例如3'-翼)的模式是或包含SSSS。在一些实施例中，翼(例如5'-翼)的模式是或包含SnROnR，其中nR表示不带负电荷的核苷酸间键联(例如，中性核苷酸间键联(如n001))，其是手性受控的且是Rp。在一些实施例中，翼(例如3'-翼)的模式是或包含SnRSS。在一些实施例中，翼(例如3'-翼)的模式是或包含SSnRS。在一些实施例中，翼(例如3'-翼)的模式是或包含SSSnR。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联或中性核苷酸间键联在两个修饰的糖之间。在一些实施例中，核心还可以具有一个或多个不带负电荷的核苷酸间键联或中性核苷酸间键联，它们中的每一个任选地以及独立地是手性受控的；在一些实施例中，每个独立地是手性受控的。在一些实施例中，核心糖(在一些实施例中，不包含2'-O-)不与中性核苷酸间键联键合。
在一些实施例中，对于包含或为翼-核心-翼结构的寡核苷酸，两个翼的不同之处在于它们含有不同水平和/或类型的化学修饰、骨架手性中心立体化学、和/或其模式。在一些实施例中，两个翼的不同之处在于它们含有不同水平和/或类型的糖修饰、和/或核苷酸间键联、和/或核苷酸间键联立体化学、和/或其模式。举例而言，在一些实施例中，一个翼包含2'-OR修饰，其中R是任选经取代的C1-6烷基(例如2-MOE)，而另一翼不包含此类修饰，或包含(例如以数目和/或百分比计)较低水平的此类修饰；另外地且可替代地，一个翼包含天然磷酸酯键联，而另一翼不包含天然磷酸酯键联或包含较低水平(例如以数目和/或百分比计)的天然磷酸酯键联；另外地且可替代地，一个翼可包含特定类型的经修饰的核苷酸间键联(例如硫代磷酸二酯核苷酸间键联)，而另一翼不包含天然磷酸酯键联或包含较低水平(例如以数目和/或百分比计)的所述类型的经修饰的核苷酸间键联；另外地且可替代地，一个翼可包含含有特定构型(例如Rp或Sp)键联磷原子的手性修饰的核苷酸间键联，而另一翼不包含或包含较低水平的含有所述特定构型键联磷原子的手性修饰的核苷酸间键联；另外地或可替代地，每个翼可包含糖修饰、核苷酸间键联和/或骨架手性中心的不同模式。在一些实施例中，一个翼包含一个或多个天然磷酸酯键联和一个或多个2'-OR修饰，其中R不是-H或-Me，且另一翼不包含天然磷酸酯键联且不包含2'-OR修饰，其中R不是-H或-Me。在一些实施例中，一个翼包含一个或多个天然磷酸酯键联和一个或多个2'-MOE修饰，且另一翼中的每个核苷酸间键联是硫代磷酸酯键联，且另一翼的每个糖单元包含2'-OMe修饰。在一些实施例中，一个翼包含一个或多个天然磷酸酯键联和一个或多个2'-MOE修饰，且另一翼中的每个核苷酸间键联是Sp硫代磷酸酯键联，且另一翼的每个糖单元包含2'-OMe修饰。
在一些实施例中，核心不包含含有2'-修饰的糖。在一些实施例中，核心不包含含有2’-OR的糖，其中R如本文所述。在一些实施例中，每个核心糖包含两个2'-H(例如，通常在天然DNA糖中发现的)。
在一些实施例中，核心中不少于70％、80％、90％或100％的核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，核心中不少于70％、80％或90％的核苷酸间键联独立地是具有Sp构型的经修饰的核苷酸间键联，且核心还含有1、2、3、4或5个核苷酸间键联，所述核苷酸间键联选自具有Rp构型的经修饰的核苷酸间键联和天然磷酸酯键联。在一些实施例中，核心中不少于70％、80％或90％的硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是具有Sp构型的经修饰的核苷酸间键联，且核心还含有1、2、3、4或5个具有Rp构型的硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，核心还含有1或2个核苷酸间键联，所述核苷酸间键联选自具有Rp构型的经修饰的核苷酸间键联和天然磷酸酯键联。在一些实施例中，核心还含有1个及不超过1个以下核苷酸间键联，所述核苷酸间键联选自具有Rp构型的经修饰的核苷酸间键联和天然磷酸酯键联，且其余核苷酸间键联独立地是具有Sp构型的经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，核心还含有2个及不超过2个以下核苷酸间键联，所述核苷酸间键联各自独立地选自具有Rp构型的经修饰的核苷酸间键联和天然磷酸酯键联，且其余核苷酸间键联独立地是具有Sp构型的经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，核心还含有1个及不超过1个天然磷酸酯键联，且其余核苷酸间键联独立地是具有Sp构型的经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，核心还含有2个及不超过2个天然磷酸酯键联，且其余核苷酸间键联独立地是具有Sp构型的经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，核心还含有1个及不超过1个具有Rp构型的经修饰的核苷酸间键联，且其余核苷酸间键联独立地是具有Sp构型的经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，核心还含有2个及不超过2个具有Rp构型的经修饰的核苷酸间键联，且其余核苷酸间键联独立地是具有Sp构型的经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，两个天然磷酸酯键联或两个具有Rp构型的经修饰的核苷酸间键联由两个或更多个具有Sp构型的经修饰的核苷酸间键联间隔开。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联具有式I。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。如本领域技术人员所理解的，与翼糖和核心糖键合的核苷酸间键联可以被认为是核心核苷酸间键联。
核心及翼可具有各种长度。在一些实施例中，核心包含不少于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核碱基。在一些实施例中，翼包含不少于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核碱基。在一些实施例中，翼包含不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10个核碱基。在一些实施例中，对于翼-核心-翼结构而言，两个翼具有相同长度，例如具有5个核碱基。在一些实施例中，两个翼具有不同长度。在一些实施例中，核心不少于总寡核苷酸长度的40％、45％、50％、60％、70％、80％或90％，如通过核心内的核苷单元百分比所测量的。在一些实施例中，核心不少于总寡核苷酸长度的50％。
在一些实施例中，寡核苷酸可以多种形式(包括多种盐形式，特别是药学上可接受的盐形式)提供。在一些实施例中，本披露提供寡核苷酸的盐及其药物组合物。在一些实施例中，盐是药学上可接受的盐。在一些实施例中，可以捐赠给碱的每种氢离子(例如，在水溶液、药物组合物等的条件下)被非H+阳离子替换。例如，在一些实施例中，寡核苷酸的药学上可接受的盐是全金属离子盐，其中每个核苷酸间键联(例如天然磷酸酯键联、硫代磷酸二酯键联等)的每个氢离子(例如-OH、-SH等)被金属离子替换。在一些实施例中，所提供的盐是全钠盐。在一些实施例中，所提供的药学上可接受的盐是全钠盐。在一些实施例中，所提供的盐是全钠盐，其中为天然磷酸酯键联(酸形式-O-P(O)(OH)-O-)(如果存在的话)的每个核苷酸间键联以其钠盐形式(-O-P(O)(ONa)-O-)存在，并且为硫代磷酸二酯键联(酸形式-O-P(O)(SH)-O-)(如果存在的话)的每个核苷酸间键联以其钠盐形式(O-P(O)(SNa)-O-)存在。
在一些实施例中，所提供的化合物(例如寡核苷酸)可调节C9orf72靶标的活性和/或功能。在一些实施例中，C9orf72靶标基因为意欲改变与其有关的一种或多种C9orf72基因产物(例如RNA和/或蛋白质产物)的表达和/或活性的基因。在一些实施例中，C9orf72与病症、障碍或疾病相关。在许多实施例中，意欲抑制C9orf72靶标基因。由此，在许多实施例中，在如本文中所描述的C9orf72寡核苷酸作用于特定C9orf72靶标基因时，存在寡核苷酸时与不存在寡核苷酸时相比，该C9orf72基因的一种或多种基因产物的存在和/或活性降低(特别是与病症、障碍或疾病相关的那些)。
在一些实施例中，C9orf72靶标是意欲改变与其有关的一种或多种产物(例如RNA和/或蛋白质产物)的表达和/或活性的特定等位基因(例如与病症、障碍或疾病相关的病理性等位基因)。在许多实施例中，C9orf72靶标等位基因为其存在和/或表达与一种或多种疾病和/或病症(例如C9orf72相关障碍)的存在、发病率和/或严重程度相关(例如有关)的等位基因。替代地或另外，在一些实施例中，C9orf72靶标等位基因为其一种或多种基因产物的水平和/或活性改变与疾病和/或病症的一个或多个方面的改善(例如发作延迟、严重程度降低、对其他治疗的反应等)有关的等位基因。在一些此类实施例中，相对于非病理性等位基因(例如一种或多种较不相关/不相关等位基因)，如本文中所描述的C9orf72寡核苷酸及其使用方法可优先或特异性地靶向病理性等位基因。在一些实施例中，C9orf72的病理性等位基因包含重复扩增，例如六核苷酸重复扩增(HRE)，例如多于约30及直至500或1000或更多的六核苷酸重复扩增。在一些实施例中，等位基因的转录物可能具有两个或更多个变体(例如来自不同剪接模式的变体)。在一些实施例中，相较与病症、障碍或疾病较低相关或不相关的那些，所提供的技术选择性地降低与病症、障碍或疾病相关的转录物(例如RNA)和/或由其编码的产物(例如蛋白质)的表达、活性和/或水平。
在一些实施例中，C9orf72靶标序列是如本文中所描述的寡核苷酸所结合的序列。在许多实施例中，C9orf72靶标序列与所提供寡核苷酸或其中的连续残基的序列一致或是其对应互补序列(例如，所提供的寡核苷酸包括与C9orf72靶标序列一致或是其对应互补序列的靶标结合序列)。在一些实施例中，寡核苷酸(的相关部分)与其靶标序列之间容许少数差异/错配(例如，不超过1、2或3个)。在许多实施例中，C9orf72靶标序列存在于C9orf72靶标基因内。在许多实施例中，C9orf72靶标序列存在于由C9orf72靶标基因产生的转录物(例如mRNA和/或mRNA前体)内。在一些实施例中，C9orf72靶标序列包括一个或多个等位基因位点(亦即，C9orf72靶标基因内发生等位基因变异的位置)。在一些此类实施例中，所提供的寡核苷酸相对于一个或多个其他等位基因优先或特异性地结合至一个等位基因。
在一些实施例中，C9orf72(染色体9开放阅读框72)是一种基因或其基因产物，也称为C9ORF72、C9、ALSFTD、FTDALS、FTDALS1、DENNL72；外部ID：MGI：1920455HomoloGene：10137GeneCards：C9orf72。在一些实施例中，C9orf72可以非正式地称为C9。C9orf72直系同源物：物种：人类Entrez：203228；Ensembl：ENSG00000147894；UniProt：Q96LT7；RefSeq(mRNA)：NM_145005NM_001256054NM_018325；RefSeq(蛋白质)：NP_001242983NP_060795NP_659442；位置(UCSC)：Chr 9:27.55-27.57Mb；物种：小鼠Entrez：73205；Ensembl：ENSMUSG00000028300；UniProt：Q6DFW0；RefSeq(mRNA)：NM_001081343；RefSeq(蛋白质)：NP_00107481；位置(UCSC)：Chr4:35.19-35.23Mb。编码C9orf72的核苷酸包括但不限于GENBANK登录号NM_001256054.1；GENBANK登录号NT_008413.18；GENBANK登录号BQ068108.1；GENBANK登录号NM_018325.3；GENBANK登录号DN993522.1；GENBANK登录号NM_145005.5；GENBANK登录号DB079375.1；GENBANK登录号BU194591.1；序列识别符4141_014_A5；序列识别符4008_73_A；以及GENBANK登录号NT_008413.18。据报道，C9orf72是具有54328Da的分子量的481个氨基酸的蛋白质，其可以经历泛素化和磷酸化的翻译后修饰。据报道，C9orf72的表达水平可能在中枢神经系统中最高，并且所述蛋白质定位在神经元的细胞质以及突触前末梢中。据报道，C9orf72在内体和溶酶体运输调节方面起作用，且已显示出与参与自噬和内吞转运的RAB蛋白质相互作用。据报道，C9orf72激活RAB5，RAB5是介导早期内体运输的GTP酶。据报道，C9orf72中的突变与ALS和FTD相关联。DeJesus-Hernandez等人2011Neuron[神经元]72:245-256；Renton等人2011Neuron[神经元]72:257-268；以及Itzcovich等人2016.Neurobiol.Aging.[神经生物学与衰老]第40卷,第192.e13-192.e15页。据报导，C9orf72中的六核苷酸重复扩增(例如(GGGGCC)n)可存在于患有诸如C9orf72相关障碍的神经疾病的受试者中。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可与来源于任一DNA链的C9orf72核酸杂交。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可与C9orf72反义或有义转录物杂交。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可与处于任何RNA加工阶段的C9orf72核酸杂交，包括但不限于mRNA前体或成熟mRNA。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可与C9orf72核酸或其互补序列的任何元件杂交，包括但不限于：C9orf72核酸的启动子区域、增强子区域、转录终止区域、翻译起始信号、翻译终止信号、编码区域、非编码区域、外显子、内含子、5'UTR、3'UTR、重复区域、六核苷酸重复扩增、剪接接点、内含子/外显子或外显子/内含子接点、外显子:外显子剪接接点、外显子剪接静止子(ESS)、外显子剪接增强子(ESE)、外显子1a、外显子1b、外显子1c、外显子1d、外显子1e、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子6、内含子7、内含子8、内含子9或内含子10。内含子与外显子交替；内含子1在外显子1(或1a或1b或1c等)与外显子2之间；内含子2在外显子2与外显子3之间；等。在一些实施例中，寡核苷酸的碱基序列与内含子1中的靶序列相同或互补。在一些实施例中，寡核苷酸的碱基序列与包含来自外显子1b的一部分和来自内含子1的一部分的靶序列相同或互补。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸跨越外显子1b与内含子1之间的接点。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可与由GENBANK保藏编号NT_008413.18表示的C9orf72 mRNA前体、核苷27535000至27565000或其互补序列的一部分杂交。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可与内含子杂交。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可与包含六核苷酸重复的内含子杂交。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸与衍生自有义链的所有C9orf72变体杂交。在一些实施例中，本文中所描述的反义寡核苷酸选择性地与衍生自有义链的C9orf72变体杂交，该变体包括但不限于包含六核苷酸重复扩增的变体。在一些实施例中，六核苷酸重复扩增包含任何六核苷酸的至少24次重复。在一些实施例中，六核苷酸重复扩增包含任何六核苷酸的至少30次重复。在一些实施例中，六核苷酸重复扩增包含六核苷酸中的任一者的至少50次重复。在一些实施例中，六核苷酸重复扩增包含六核苷酸中的任一者的至少100次重复。在一些实施例中，六核苷酸重复扩增包含任何六核苷酸的至少200次重复。在一些实施例中，六核苷酸重复扩增包含任何六核苷酸的至少500次重复。在一些实施例中，六核苷酸是GGGGCC、GGGGGG、GGGGGC、GGGGCG、CCCCGG、CCCCCC、GCCCCC和/或CGCCCC。在一些实施例中，六核苷酸GGGGCC称为GGGGCCexp或(GGGGCC)n，或是六核苷酸GGGGCC的重复。
在一些实施例中，所提供寡核苷酸或其区域(例如核心)的骨架手性中心模式包含或是(Sp)m(Rp)n、(Rp)n(Sp)m、(Np)t[(Op)n(Sp)m]y、(Sp)t[(Op)n(Sp)m]y、(Np)t[(Rp)n(Sp)m]y、或(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(如本文所述)，其中m、n、t、y各自独立地是1-50。在一些实施例中，至少一个n是1。在一些实施例中，每个n独立地是1。在一些实施例中，y是1。在一些实施例中，y是2。在一些实施例中，骨架手性中心模式包含或是(Rp)n(Sp)m、(Np)t(Rp)n(Sp)m、或(Sp)t(Rp)n(Sp)m，其中m>2。在一些实施例中，骨架手性中心模式包括或为(Rp)n(Sp)m、(Np)t(Rp)n(Sp)m或(Sp)t(Rp)n(Sp)m，其中n为1，t>1，并且m>2。在一些实施例中，至少一个n是1，至少一个t不小于1，且至少一个m不小于2。在一些实施例中，至少一个n是1，至少一个t不小于2，且至少一个m不小于3。在一些实施例中，每个n是1。在一些实施例中，至少一个t>1。在一些实施例中，至少一个t>2。在一些实施例中，至少一个t>3。在一些实施例中，至少一个t>4。在一些实施例中，至少一个m>1。在一些实施例中，至少一个m>2。在一些实施例中，至少一个m>3。在一些实施例中，至少一个m>4。在一些实施例中，骨架手性中心模式包含一个或多个非手性天然磷酸酯键联。在一些实施例中，m、t和n的总和(或在一种模式中无t时，m和n的总和)不小于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，所述总和为5。在一些实施例中，所述总和为6。在一些实施例中，所述总和为7。在一些实施例中，所述总和为8。在一些实施例中，所述总和为9。在一些实施例中，所述总和为10。在一些实施例中，所述总和为11。在一些实施例中，所述总和为12。在一些实施例中，所述总和为13。在一些实施例中，所述总和为14。在一些实施例中，所述总和为15。在一些实施例中，Sp是硫代磷酸酯核苷酸间键联的构型。在一些实施例中，每个Sp是硫代磷酸酯核苷酸间键联的构型。在一些实施例中，Rp是硫代磷酸酯核苷酸间键联的构型。在一些实施例中，每个Rp是硫代磷酸酯核苷酸间键联的构型。在一些实施例中，对于核心的骨架手性中心模式，每个Sp是硫代磷酸酯核苷酸间键联的构型。在一些实施例中，对于核心的骨架手性中心模式，每个Rp是硫代磷酸酯核苷酸间键联的构型。
碱基序列
在一些实施例中，所提供的C9orf72寡核苷酸能够导引C9orf72基因或其基因产物的表达、水平和/或活性的降低。在一些实施例中，C9orf72靶标基因包含重复扩增。在一些实施例中，所提供的C9orf72寡核苷酸可包含本文中所描述的任何碱基序列或其一部分，其中一部分是至少15个连续碱基的序列段或具有1至5个错配的至少15个连续碱基的序列段。在一些实施例中，当与其C9orf72靶标的碱基序列(例如，C9orf72基因或转录物的具有相同长度的序列)进行比对时，所提供的寡核苷酸的碱基序列与靶序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或完全互补或相同。在一些实施例中，存在不超过1、2或3个错配。在一些实施例中，存在不超过2个错配。在一些实施例中，存在不超过1个错配。在一些实施例中，不存在错配。在一些实施例中，错配在翼中。在一些实施例中，错配在5'-翼中。在一些实施例中，错配在3'-翼中。在一些实施例中，错配在核心中。在一些实施例中，所有“错配”是沃森-克里克碱基对。在一些实施例中，存在一个或多个(例如1、2、3个)摆动碱基对。在一些实施例中，存在不超过1、2或3个摆动碱基对。在一些实施例中，存在不超过2个摆动碱基对。在一些实施例中，存在不超过1个摆动碱基对。在一些实施例中，不存在摆动碱基对。在一些实施例中，摆动碱基对在翼中。在一些实施例中，摆动碱基对在5'-翼中。在一些实施例中，摆动碱基对在3'-翼中。在一些实施例中，摆动碱基对在核心中。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸的碱基序列具有充分长度及与C9orf72转录物靶标的同一性，以介导靶标特定性敲低。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸与转录物靶标序列的一部分互补。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸的碱基序列与C9orf72靶标转录物的碱基序列互补。如本文中所用，“靶标转录物序列”、“靶标序列”、“靶标基因”以及其类似者是指在C9orf72基因的转录期间形成的mRNA分子(包括是原始转录产物的RNA加工产物的mRNA)的核苷酸序列的连续部分。
本文中的术语“互补”、“完全互补”及“实质上互补”可在C9orf72寡核苷酸与C9orf72靶标序列之间的碱基匹配方面使用，如将自其使用情境所理解。在一些实施例中，当最大限度地比对，寡核苷酸的各碱基能够与靶标链上的顺序碱基进行碱基配对时，C9orf72寡核苷酸的碱基序列与C9orf72靶标序列的碱基序列互补。作为非限制性实例，如果靶序列具有例如5'-GCAUAGCGAGCGAGGGAAAAC-3'的碱基序列，则具有5'GUUUUCCCUCGCUCGCUAUGC-3'的碱基序列的寡核苷酸与此靶序列互补或完全互补。当然，应注意，用U取代T或反过来都不会改变互补的量。
如本文中所使用，与C9orf72靶标序列“实质上互补”的多核苷酸在很大程度上或基本上互补，但并非100％互补。在一些实施例中，实质上互补的序列(例如C9orf72寡核苷酸)与同靶标序列100％互补的序列之间具有1、2、3、4或5个错配。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸的碱基序列可以包含CpG基序，其可以充当免疫刺激剂(例如，当未甲基化时)。在一些实施例中，修饰CpG基序的C或G以用另一个碱基替换C和/或G。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸的碱基序列是或包含(或包含其至少15个连续碱基的序列段)本文所述的任何C9orf72寡核苷酸的序列，除了CpG基序中的C或G(如果存在)被换为另一种核碱基以外。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸的碱基序列是或包含(或包含其至少15个连续碱基的序列段)本文所述的任何C9orf72寡核苷酸的序列，除了CpG基序中的C(如果存在)被换为另一种核碱基以外。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸的碱基序列是或包含(或包含其至少15个连续碱基的序列段)本文所述的任何C9orf72寡核苷酸的序列，除了CpG基序中的G(如果存在)被另一种核碱基替换以外。如本文所用，与用替换碱基替换寡核苷酸中的碱基有关的短语或其他文本是指以下情况，其中：具有通过沃森-克里克碱基配对(例如，每个U或T与A进行碱基配对，以及每个G与C进行碱基配对)与靶序列(例如mRNA)100％互补的碱基序列的寡核苷酸，除了寡核苷酸中的一个碱基(通常会与靶标核酸中的相应碱基形成沃森-克里克碱基对)被不能与靶标核酸的相应碱基形成沃森-克里克碱基对的替换碱基(例如，核碱基或核碱基衍生物)替换，尽管替换核碱基可任选地(但不一定)与靶标核酸序列中的相应碱基形成非沃森-克里克碱基对[包括但不限于：摆动碱基对，例如鸟嘌呤-尿嘧啶(G-U)，次黄嘌呤-尿嘧啶(I-U)，次黄嘌呤-腺嘌呤(I-A)和次黄嘌呤-胞嘧啶(I-C)]。在一些实施例中，用替换碱基替换寡核苷酸中的碱基将错配引入在该位置的靶序列。在一些实施例中，C被T替换(例如，在核心中，或核苷C不包含2'-OR或在2'-碳上不包含取代基)。在一些实施例中，C被U替换(例如，在翼中，或核苷在2'-碳上包含取代基)。在一些实施例中，一个或多个C独立地被替换。在一些实施例中，寡核苷酸或其一部分(例如5’-翼、核心、3’-翼)中的每个C被独立地被替换。
在一些实施例中，在C9orf72寡核苷酸中，G被肌苷(I)替换。在一些实施例中，本文所用的术语肌苷或I等同于核碱基次黄嘌呤。在一些实施例中，本文所用的术语肌苷等同于包含次黄嘌呤和糖或修饰的糖的核苷。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸包含CpI基序(例如其中核碱基G已被I替换的CpG基序)。此类C9orf72寡核苷酸的非限制性实例包括但不限于：WV-21442和WV-21445。
在一些实施例中，在具有CpG基序的C9orf72寡核苷酸中，C被修饰(例如甲基化成5mC)以例如降低CpG基序的免疫原性。在一些实施例中，经修饰的C核苷(例如5mC核苷)包含2’-MOE修饰。在一些实施例中，在翼中的CpG基序中，C被修饰(例如甲基化成5mC)。
在一些实施例中，在5’-翼中的CpG基序中，C被修饰(例如甲基化成5mC)。在一些实施例中，在3’-翼中的CpG基序中，C被修饰(例如甲基化成5mC)。在一些实施例中，在核心中的CpG基序中，C被修饰(例如甲基化成5mC)。在一些实施例中，CpG基序的每个C被修饰(例如甲基化成5mC)。在一些实施例中，一个或多个不在CpG基序中的C被独立地修饰(例如甲基化成5mC)。此类寡核苷酸的非限制性实例包括：WV-21445、WV-21446、WV-23740、WV-23503和WV-23491。
在一些实施例中，末端碱基(例如，极端的5'或3'端之一)是CpG基序的组分(例如，寡核苷酸的CpG中5'端的C或CpG中3'端的G)。在一些实施例中，与不是末端碱基的碱基(例如，非末端碱基)相比，末端碱基对寡核苷酸与靶标核酸的杂交的贡献较小。在一些实施例中，本披露涉及CpG寡核苷酸，其中末端碱基是CpG基序中的组分，并且该末端碱基被另一碱基替换；并且在一些实施例中，CpG寡核苷酸的末端碱基是G并被I替换。
在考虑用于C9orf72寡核苷酸的设计和构建的碱基序列的一些实施例中，末端碱基是CpG基序中的组分，并且因此末端碱基不包括在寡核苷酸的碱基序列中(例如，寡核苷酸被截短了一个碱基)。此类寡核苷酸的非限制性实例包括：WV-21557、WV-23486、WV-23435和WV-23487。
在一些实施例中，在C9orf72寡核苷酸中，末端碱基是核碱基A，且该碱基被I或G替换。此类寡核苷酸的非限制性实例包括：WV-21445、WV-21446、WV-23740、WV-23503和WV-23491。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下碱基序列、包含以下碱基序列或包含以下碱基序列的至少15个碱基长的部分：CCCACACCTGCTCTTGCTAG、AACAGCCACCCGCCAGGATG、AACCGGGCAG CAGGGACGGC、ACAGGCTGCGGTTGTTTCCC、ACCCACACCTGCTCTTGCTA、ACCCACTCGCCACCGCCTGC、ACCCCAAACAGCCACCCGCC、ACCCCCATCTCATCCCGCAT、ACCCGAGCTGTCTCCTTCCC、ACCCGCCAGGATGCCGCCTC、ACCCGCGCCTCTTCCCGGCA、ACCCTCCGGCCTTCCCCCAG、ACCGGGCAGCAGGGACGGCT、ACCTCTCTTTCCTAGCGGGA、ACGCACCTCTCTTTCCTAGC、ACTCACCCACTCGCCACCGC、AGCAACCGGGCAGCAGGGAC、AGCCGTCCCTGCTGCCCGGT、AGCGCGCGACTCCTGAGTTC、AGCTTGCTACAGGCTGCGGT、AGGATGCCGCCTCCTCACTC、AGGCTGCGGTTGTTTCCCTC、AGGCTGTCAGCTCGGATCTC、AGGGCCACCCCTCCTGGGAA、ATCCCCTCACAGGCTCTTGT、ATGCCGCCTCCTCACTCACC、ATTGCCTGCATCCGGGCCCC、CACCCACTCGCCACCGCCTG、CACCCCCATCTCATCCCGCA、CACCCGCCAGGATGCCGCCT、CACCTCTCTTTCCTAGCGGG、CACTCACCCACTCGCCACCG、CAGGATGCCGCCTCCTCACT、CAGGCTGCGGTTGTTTCCCT、CAGGGTGGCATCTGCTTCAC、CCAAACAGCCACCCGCCAGG、CCACCCGCCAGGATGCCGCC、CCACCCTCCGGCCTTCCCCC、CCACTCGCCACCGCCTGCGC、CCAGGATGCCGCCTCCTCAC、CCCAAACAGCCACCCGCCAG、CCCACTCGCCACCGCCTGCG、CCCCAAACAGCCACCCGCCA、CCCGCCAGGATGCCGCCTCC、CCTCACTCACCCACTCGCCG、CCCGCGCCTCTTCCCGGCAG、CCCGGCAGCCGAACCCCAAA、CCGACTTGCATTGCTGCCCT、CCGCAGCCTGTAGCAAGCTC、CCGCCAGGATGCCGCCTCCT、CCGCCTCCTCACTCACCCAC、CCGCGCCTCTTCCCGGCAGC、CCGCTTCTACCCGCGCCTCT、CCGGGCAGCAGGGACGGCTG、CCTAGCGGGACACCGTAGGT、CCTCACTCACCCACTCGCCA、CCTCCGGCCTTCCCCCAGGC、CCTCCTCACTCACCCACTCG、CCTCTCTTTCCTAGCGGGAC、CCTCTGCCAAGGCCTGCCAC、CCTCTTCCCGGCAGCCGAAC、CCTGAGTTCCAGAGCTTGCT、CCTGCTCTTGCTAGACCCCG、CCTGCTGCCCGGTTGCTTCT、CCTGGTTGCTTCACAGCTCC、CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC、CGCACCTCTCTTTCCTAGCG、CGCATAGAATCCAGTACCAT、CGCCAGGATGCCGCCTCCTC、CGCCTCCTCACTCACCCACT、CGCCTCTTCCCGGCAGCCGA、CGCGCGACTCCTGAGTTCCA、CGCTTCTACCCGCGCCTCTT、CGGGCAGCAGGGACGGCTGA、CGGTTGTTTCCCTCCTTGTT、CTACCCGCGCCTCTTCCCGG、CTCACCCACTCGCCACCGCC、CTCACTCACCCACTCGCCAC、CTCAGTACCCGAGGCTCCCT、CTCCTCACTCACCCACTCGC、CTCTTCCCGGCAGCCGAACC、CTCTTGCTAGACCCCGCCCC、CTCTTTCCTAGCGGGACACC、CTGCGGTTGTTTCCCTCCTT、CTGCTCTTGCTAGACCCCGC、CTTCCCGGCAGCCGAACCCC、CTTCCTTGCTTTCCCGCCCT、CTTCTACCCGCGCCTCTTCC、CTTGCTAGACCCCGCCCCCA、CTTGGTGTGTCAGCCGTCCC、CTTGTTCACCCTCAGCGAGT、CTTTCCTAGCGGGACACCGT、GACATCCCCTCACAGGCTCT、GAGAGCCCCCGCTTCTACCC、GAGCTGCCCAGGACCACTTC、GAGCTTGCTACAGGCTGCGG、GAGGCCAGATCCCCATCCCT、GATCCCCATTCCAGTTTCCA、GATGCCGCCTCCTCACTCAC、GCAACCGGGCAGCAGGGACG、GCACCTCTCTTTCCTAGCGG、GCAGGCGGTGGCGAGTGGGT、GCAGGCGTCTCCACACCCCC、GCAGGGACGGCTGACACACC、GCATCCGGGCCCCGGGCTTC、GCATCCTGGCGGGTGGCTGT、GCCACCCGCCAGGATGCCGC、GCCAGATCCCCATCCCTTGT、GCCAGGATGCCGCCTCCTCA、GCCCTCAGTACCCGAGCTGT、GCCGCCTCCTCACTCACCCA、GCCGGGAAGA GGCGCGGGTAG、GCCGTCCCTGCTGCCCGGTT、GCCTCCTCACTCACCCACTC、GCCTCTCAGTACCCGAGGCT、GCCTCTTCCCGGCAGCCGAA、GCGCAGGCGGTGGCGAGTG GGTGAGTGAGGAGGCGGCATC、GCGCAGGCGGTGGCGAGTGGGTGAGTGAGG、GCGCGACTCCTGAGTTCCAG、GCGCGCGACTCCTGAGTTCC、GCGGCATCCTGGCGGGTGGC、GCGGTTGCGGTGCCTGCGCC、GCGGTTGTTTCCCTCCTTGT、GCTACAGGCTGCGGTTGTTT、GCTAGACCCCGCCCCCAAAA、GCTCTGAGGAGAGCCCCCGC、GCTCTTGCTAGACCCCGCCC、GCTGCGATCCCCATTCCAGT、GCTGCGGTTGTTTCCCTCCT、GCTGGAGATGGCGGTGGGCA、GCTGGGTGTCGGGCTTTCGC、GCTGTTTGACGCACCTCTCT、GCTTCTACCCGCGCCTCTTC、GCTTGCTACAGGCTGCGGTT、GCTTGGTGTGTCAGCCGTCC、GCTTTCCCGCCCTCAGTACC、GGACCCGCTGGGAGCGCTGC、GGATGCCGCCTCCTCACTCA、GGCAGCAGGG ACGGCTGACA、GGCCTCTCAGTACCCGAGGC、GGCGGAGGCGCAGGCGGTGG、GGCGTCTCCACACCCCCATC、GGCTCCCTTTTCTCGAGCCC、GGCTGCGGTTGTTTCCCTCC、GGGAAGGCCGGAGGGTGGGC、GGGCAGCAGGGACGGCTGAC、GGGCTCTCCT CAGAGCTCGA、GGGTGTCGGGCTTTCGCCTC、GGTCCCTGCCGGCGAGGAGA、GTACCCGAGGCTCCCTTTTC、GTCAGCCGTCCCTGCTGCCC、GTCCCTGCTGCCCGGTTGCT、GTCCGTGTGCTCATTGGGTC、GTCGCTGTTTGACGCACCTC、GTCGGTGTGCTCCCCATTCT、GTGCAGGCGTCTCCACACCC、GTGCTGCGATCCCCATTCCA、GTGGCAGGCCTTGGCAGAGG、GTTCACCCTCAGCGAGTACT、GTTGCGGTGCCTGCGCCCGC、GTTGTTTCCCTCCTTGTTTT、TACAGGCTGCGGTTGTTTCC、TACCCGCGCCTCTTCCCGGC、TCACCCACTCGCCACCGCCT、TCACCCTCAGCGAGTACTGT、TCACTCACCCACTCGCCACC、TCCCCTCACAGGCTCTTGTG、TCCCGGCAGCCGAACCCCAA、TCCTCACTCACCCACTCGCC、TCCTTGCTTTCCCGCCCTCA、TCTCAGTACCCGAGGCTCCC、TCTTCCCGGCAGCCGAACCC、TCTTGCTAGACCCCGCCCCC、TGCCGCCTCCTCACTCACCC、TGCCTGCATCCGGGCCCCGG、TGCGGTTGTTTCCCTCCTTG、TGCTACAGGCTGCGGTTGTT、TGCTAGACCCCGCCCCCAAA、TGCTCTTGCTAGACCCCGCC、TGGAATGGGGATCGCAGCAC、TGGAATGGGGATCGCAGCACA、TGGCGAGTGGGTGAGTGAGGAGGCGGCATC、TGTGCTGCGATCCCCATTCC、TTCCAGAGCTTGCTACAGGC、TTCCCGGCAGCCGAACCCCA、TTCTACCCGCGCCTCTTCCC、TTGCTACAGGCTGCGGTTGT、TTGCTAGACCCCGCCCCCAA、TTTCCCCACACCACTGAGCT、ACCCACTCGCCA、ACCCACTCGCCA、ACTCACCCACTCGCCACCGC、ACTCACCCACTCGCCACCGC、ACTCACCCACTCGCCACCGC、ACTCACCCACTCGCCACCGC、ACTCACCCACTCGCCACCGC、ACTCGCCA、AUACUUACCUGG、CACTCGCCA、CCCACTCGCCA、CCCACTCGCCA、CCTCACTCACCCACTCGCC、CCTCACTCACCCACTCGCC、CCTCACTCACCCACTCGCCA、CCTCACTCACCCACTCGCCA、CCTCACTCACCCACTCGCCA、CCTCACTCACCCACTCGCCA、CCTCACTCACCCACTCGCCA、CCTCACTCACCCACTCGCCA、CCTCACTCACCCACTCGCCA、CCTCACTCACCCACTCGCCA、CCTCACTCACCCACTCGCCC、CCTCACTCACCCACTCGCCC、CCTCACTCACCCACTCGCCG、CCTCACTCACCCACTCGCCG、CCTCACTCACCCACTCGCCG、CCTCACTCACCCACTCGCCG、CCTCACTCACCCACTCGCCG、CCTCACTCACCCACTCGCCG、CCTCACTCACCCACTCGCCI、CCTCACTCACCCACTCGCCI、CCTCACTCACCCACTCGCCU、CCTCACTCACCCACTCGCCU、CCTCACTCACCCACUCGCC、CCTCACTCACCCACUCGCC、CCTCACTCACCCACUCGCC、CCTCACTCACCCACUCGCCA、CCTGCTGCCCGGTTGCTTCT、CCTGCTGCCCGGTTGCUUCU、CCUGCTGCCCGGTTGCTTCT、CGCCUCCTCACTCACCCACU、CTCACTCACCCACTCGCCAC、CUCUGGAACUCAGGAGUCGCGCGC、GCGCGACTCCTGAGTTCCAG、GCUACCUAUAUG、GTCCCTGCTGCCCGGTTGCT、GUCCCTGCTG CCCGGTTGCT、TCCTTGCTTTCCCGCCCTCA、TGCCGCCTCCTCACTCACCC、UCCTCACTCA CCCACUCGCC、或UCCUTGCTTTCCCGCCCTCA，其中每个核碱基T可独立且任选地被核碱基U取代，并且其中每个U可独立且任选地被T取代，并且其中一个或多个CpG基序中的核碱基C和/或核碱基G(如果存在)被另一种核碱基替换；并且在一些实施例中，CpG基序中的G核碱基被I替换。
在一些实施例中，寡核苷酸的碱基序列是、包含或包含ACTCACCCACTCGCCACCGC的至少15个碱基的部分，其中每个核碱基T可独立且任选地被核碱基U取代，并且其中每个U可独立且任选地被T取代，并且其中一个或多个CpG基序中的核碱基C和/或核碱基G(如果存在)被另一种核碱基替换；并且在一些实施例中，CpG基序中的G核碱基被I替换。在一些实施例中，寡核苷酸的碱基序列是、包含或包含ACTCACCCACTCGCCACCGC的至少15个碱基的部分，其中每个核碱基T可独立且任选地被核碱基U取代，并且其中每个U可独立且任选地被T取代，并且CpG基序中的一个或多个G独立地被I替换。在一些实施例中，寡核苷酸的碱基序列是、包含或包含ACTCACCCACTCGCCACCGC的至少15个碱基的部分，其中每个核碱基T可独立且任选地被核碱基U取代，并且其中每个U可独立且任选地被T取代。在一些实施例中，寡核苷酸的碱基序列是、包含或包含ACTCACCCACTCGCCACCGC的至少15个碱基的部分。如所述，本披露的寡核苷酸可包含多种碱基、糖和/或核苷酸间键联修饰，例如在一些实施例中，将5mC用作经修饰的C。
本披露在表A1中及其他处提供各种寡核苷酸，其各自具有经定义的碱基序列。在一些实施例中，本披露涵盖具有以下碱基序列的任何寡核苷酸，所述碱基序列是本文所披露的寡核苷酸中的任一者的碱基序列、包含本文所披露的寡核苷酸中的任一者的碱基序列、或包含本文所披露的寡核苷酸中的任一者的碱基序列的一部分。在一些实施例中，本披露涵盖具有以下碱基序列的任何寡核苷酸，所述碱基序列是本文所披露的任何寡核苷酸的碱基序列、包含本文所披露的任何寡核苷酸的碱基序列、或包含本文所披露的任何寡核苷酸的碱基序列的一部分，所述寡核苷酸具有任何化学修饰、立体化学、形式、结构特征(例如，任何结构或修饰模式或其部分)、和/或本文所述的任何其他修饰(例如，与另一部分(如靶向部分、碳水化合物部分等)缀合；和/或多聚体化)。在一些实施例中，“一部分”(例如碱基序列或修饰模式的一部分)是至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个长。在一些实施例中，碱基序列的“一部分”是至少5nt长。在一些实施例中，碱基序列的“一部分”是至少10nt长。在一些实施例中，碱基序列的“一部分”是至少15nt长。在一些实施例中，碱基序列的“一部分”是至少20nt长。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTCACTCACCCACTCGCCA，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTCACTCACCCACTCGCCA，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：ATACTTACCTGG，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：CACTCGCCA，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：ACTCGCCA，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：ACCCACTCGCCA，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：CCCACTCGCCA，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：TGCCGCCTCCTCACTCACCC，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：TGCCGCCTCCTCACTCACCC，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：GCGCGACTCCTGAGTTCCAG，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：TCCTTGCTTTCCCGCCCTCA，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：TCCTTGCTTTCCCGCCCTCA，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：TCCTTGCTTTCCCGCCCTCA，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：GTCCCTGCTGCCCGGTTGCT，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：GTCCCTGCTGCCCGGTTGCT，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：GTCCCTGCTGCCCGGTTGCT，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTGCTGCCCGGTTGCTTCT，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTGCTGCCCGGTTGCTTCT，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTGCTGCCCGGTTGCTTCT，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：GCTACCTATATG，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：CTCTGGAACTCAGGAGTCGCGCGC，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTCACTCACCCACTCGCCI，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTCACTCACCCACTCGCCG，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：TCCTCACTCACCCACTCGCC，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：CTCACTCACCCACTCGCCAC，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：ACTCACCCACTCGCCACCGC，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：CGCCTCCTCACTCACCCACT，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTCACTCACCCACTCGCC，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTCACTCACCCACTCGCCA，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTCACTCACCCACTCGCC，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTCACTCACCCACTCGCCC，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，寡核苷酸靶向C9orf72且其碱基序列是以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTCACTCACCCACTCGCCT，其中每个T可以独立地且任选地被U取代。
在一些实施例中，碱基序列的一部分是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19个或更多个相连(连续)碱基的序列段。在一些实施例中，碱基序列的一部分是15、16、17、18、19个或更多个相连(连续)碱基的序列段。在一些实施例中，寡核苷酸的碱基序列是或包含上述碱基序列。在一些实施例中，寡核苷酸的碱基序列是上述碱基序列。
在一些实施例中，寡核苷酸5'端的核碱基可任选地被替换核碱基(如本领域技术人员所理解的，其与原始的5'端核碱基不同)替换。在一些实施例中，寡核苷酸5'端的核碱基被替换核碱基替换。在一些实施例中，寡核苷酸3'端的核碱基任选地被替换核碱基(如本领域技术人员所理解的，其与原始的3'端核碱基不同)替换。在一些实施例中，寡核苷酸3'端的核碱基被替换核碱基替换。在一些实施例中，替换核碱基选自I、A、T、U、G和C。在一些实施例中，替换核碱基是I。在一些实施例中，替换核碱基是A。在一些实施例中，替换核碱基是T。在一些实施例中，替换核碱基是U。在一些实施例中，替换核碱基是G。在一些实施例中，替换核碱基是C。在一些实施例中，当与靶序列比对时，替换核碱基产生非沃森-克里克(non-Watson-Crick)碱基对。在一些实施例中，替换核碱基产生摆动碱基对。
如本文所证明的，在许多实施例中，替换可以提供改善的特性、活性、选择性等。
在一些实施例中，本披露提供本文中所列举的序列的C9orf72寡核苷酸。在一些实施例中，本披露提供本文中所列举的序列的C9orf72寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能够导引C9orf72基因或其基因产物的表达、水平和/或活性的降低。在一些实施例中，所列举序列的C9orf72寡核苷酸包含本文中所描述的任何结构。在各种序列中，U可经T替换或反过来，或序列可包含U与T的混合物。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸的长度是至多约49、45、40、30、35、25、23个总核苷酸。在一些实施例中，一部分是具有0至3个错配的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个总核苷酸的序列段。在一些实施例中，一部分是具有0至3个错配的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个总核苷酸的序列段，其中具有0个错配的序列段是互补的，且具有1个或更多个错配的序列段是实质上互补的非限制性实例。在上文所述序列以5'端处的U开始的一些实施例中，U可缺失和/或经另一碱基替换。在一些实施例中，本披露涵盖具有是以下或包含以下或包含以下的一部分的碱基序列的任何寡核苷酸：本文中披露的任何寡核苷酸的碱基序列，该碱基序列具有本文中披露的形式或形式的一部分。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可包含本文中所描述的任何碱基序列。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可包含本文中所描述的任何碱基序列或其部分。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可包含本文中所描述的任何碱基序列或其部分，其中一部分是15个连续碱基的序列段或具有1至5个错配的15个连续碱基的序列段。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可包含本文中所描述的任何碱基序列或其部分与本文中所描述的任何其他结构元件或修饰的组合。表A1中描述了碱基序列和有用的结构元件的某些实例(包括其修饰和模式)。
具有各种碱基序列及修饰的C9orf72寡核苷酸的非限制性实例揭示于下表A1中。
Figure BDA0003456638050000701
Figure BDA0003456638050000711
Figure BDA0003456638050000721
Figure BDA0003456638050000731
Figure BDA0003456638050000741
Figure BDA0003456638050000751
Figure BDA0003456638050000761
Figure BDA0003456638050000771
Figure BDA0003456638050000781
Figure BDA0003456638050000791
Figure BDA0003456638050000801
Figure BDA0003456638050000811
Figure BDA0003456638050000821
Figure BDA0003456638050000831
Figure BDA0003456638050000841
Figure BDA0003456638050000851
Figure BDA0003456638050000861
表A1的关键点：
本披露指出，一些序列由于其长度原因而在表A1中分成多行；然而，这些序列以及表A1中的所有寡核苷酸皆是单链的(除非另外指出)。如本领域技术人员所理解的，当在两个核苷单元之间未指定核苷酸间键联时，核苷酸间键联是磷酸二酯键联(天然磷酸酯键联)，除非另有说明，否则糖是在其2'位上不包含取代的天然DNA糖(在2'-碳处两个-H)。各表中所列出的部分和修饰(或用于构建包含这些部分或修饰的寡核苷酸的化合物)：
I：肌苷；
m：2'-OMe；
m5：C的5位处的甲基(核碱基是5-甲基胞嘧啶)；
m5Ceo：5-甲基2'-O-甲氧基乙基C；
m5mC：5-甲基2’-OMe C；
eo：2'-MOE(2’-OCH2CH2OCH3)；
r：2’-OH；
O、PO：磷酸二酯(磷酸酯)；可以是键联，例如接头与寡核苷酸链之间的键联、核苷酸间键联等。立体化学/核苷酸间键联一栏中显示的磷酸二酯可能没有在描述栏中再现；如果在描述栏中未指出核苷酸间键联，则其是磷酸二酯；
*、PS：硫代磷酸酯；可以是键联，例如接头与寡核苷酸链之间的键联、核苷酸间键联等；
R、Rp：呈Rp构型的硫代磷酸酯；应注意，*R表示呈Rp构型的单一硫代磷酸酯
S、Sp：呈Sp构型的硫代磷酸酯；应注意，*S表示呈Sp构型的单一硫代磷酸酯
n001：
Figure BDA0003456638050000871
nX：立体随机n001；
nR或n001R：呈Rp构型的n001；
nS或n001S：呈Sp构型的n001；
X：立体随机硫代磷酸酯；以及
L004：具有结构-NH(CH2)4CH(CH2OH)CH2-的接头，其中-NH-(经由-C(O)-)连接至Mod或-H，且-CH2-连接位点连接至寡核苷酸链的3'端处的键联，例如磷酸二酯键联(-O-P(O)(OH)-O-，可以盐形式存在，可在表中显示为O或PO)、或硫代磷酸酯键联(-O-P(O)(SH)-O-，可以盐形式存在，可在表中显示为*，若硫代磷酸酯非手性受控；显示为*S、S或Sp，若是手性受控且具有Sp构型；以及显示为*R、R或Rp，若是手性受控且具有Rp构型)。例如，L004前面未紧接星号表示键联是磷酸二酯键联。例如，在以mAL004结束的WV-18852中，接头L004(经由-CH2-位点)连接至3'-末端糖(其是2’-OMe且连接至核碱基A)处的3'位置处的磷酸二酯键联，且L004接头经由-NH-连接至-H。
例如，在一些实施例中，本披露提供了具有以下结构的寡核苷酸：
mA*Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA*SC*SC*SC*RA*SC*ST*Sm5C*SG*Rm5C*SC*SmA*SmCn001Rm5Ceo*SmG*SmC，或其药学上可接受的盐，其中：
m代表对核苷的2’-OMe修饰(例如，mA是2’-OMe A)；
*S代表Sp硫代磷酸酯键联；
m5Ceo代表5-甲基2'-O-甲氧基乙基C；
n001R代表Rp n001键联，其中n001键联具有
Figure BDA0003456638050000881
的结构；
eo代表对核苷的2’-OCH2CH2OCH3修饰(例如，Teo是2’-OCH2CH2OCH3 T)；
*R代表Rp硫代磷酸酯键联；并且
m5代表C的5位处的甲基(例如，在5mC中，核碱基是5-甲基胞嘧啶)。
在一些实施例中，本披露提供了具有以下结构的寡核苷酸：
mA*Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA*SC*SC*SC*RA*SC*ST*Sm5C*SG*Rm5C*SC*SmA*SmC*Sm5Ceon001RmG*SmC，或其药学上可接受的盐，
其中m、*S、m5Ceo、n001R、eo、*R、m5等独立地如本文所述。
在一些实施例中，本披露提供了具有以下结构的寡核苷酸：
mA*Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA*SC*SC*SC*RA *SC*ST*Sm5C*SG*Rm5C*SC*SmA*SmC*Sm5Ceo*SmGn001RmC，或其药学上可接受的盐，
其中m、*S、m5Ceo、n001R、eo、*R、m5等独立地如本文所述。
在一些实施例中，本披露提供了具有以下结构的寡核苷酸：
mC*Sm5CeoTeom5CeomA *SC*ST*SC*RA*SC*SC*RC*SA*SC*ST*Sm5mC*SmG*SmC*Sm5mC*SmG，或其药学上可接受的盐，
其中m、*S、m5Ceo、eo、*R、m5等独立地如本文所述。
在一些实施例中，本披露提供了具有以下结构的寡核苷酸：
mA*Sm5CeoTeom5CeomA*SC*SC*SC*RA *SC*ST*Sm5C*SG*Rm5C*SC*SmA*SmC*Sm5mC*SmG*SmC，或其药学上可接受的盐，
其中m、*S、m5Ceo、eo、*R、m5等独立地如本文所述。
在一些实施例中，本披露提供了具有以下结构的寡核苷酸：
mC*Sm5CeoTeom5CeomA *SC*ST*SC*RA*SC*SC*RC*SA*SC*ST*Sm5Ceo*SmG*SmC*Sm5Ceo*SmG，或其药学上可接受的盐，
其中m、*S、m5Ceo、eo、*R、m5等独立地如本文所述。
在一些实施例中，本披露提供了具有以下结构的寡核苷酸：
mA*Sm5CeoTeom5CeomA*SC*SC*SC*RA*SC*ST*Sm5C*SG*Rm5C*SC*SmA*SmC*Sm5Ceo*SmG*SmC，或其药学上可接受的盐，
其中m、*S、m5Ceo、eo、*R、m5等独立地如本文所述。
手性受控的寡核苷酸及手性受控的寡核苷酸组合物
在一些实施例中，所提供的C9orf72寡核苷酸能够导引C9orf72靶标基因或其基因产物的表达、水平和/或活性的降低。在一些实施例中，C9orf72靶标基因包含重复扩增。在一些实施例中，C9orf72靶标基因包含六核苷酸重复扩增。
尤其是，本披露提供具有高纯度及高非对映异构纯度的手性受控的C9orf72寡核苷酸及手性受控的C9orf72寡核苷酸组合物。在一些实施例中，本披露提供具有高纯度的手性受控的C9orf72寡核苷酸及手性受控的C9orf72寡核苷酸组合物。在一些实施例中，本披露提供具有高非对映异构纯度的手性受控的C9orf72寡核苷酸及手性受控的C9orf72寡核苷酸组合物。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸组合物是某一C9orf72寡核苷酸类型的实质上纯制剂，所述组合物中并非所述寡核苷酸类型的寡核苷酸在所述寡核苷酸类型的制备过程中(在一些情况下在某些纯化步骤之后)是杂质形式。
在一些实施例中，本披露提供一种手性受控的C9orf72寡核苷酸，其中所述寡核苷酸内的个别核苷酸间键联中的至少两者相对于彼此具有不同的立体化学和/或不同的P修饰。在某些实施例中，本披露提供一种手性受控的C9orf72寡核苷酸，其中所述寡核苷酸内的至少两个个别核苷酸间键联相对于彼此具有不同的P修饰。在某些实施例中，本披露提供一种手性受控的C9orf72寡核苷酸，其中所述寡核苷酸内的个别核苷酸间键联中的至少两者相对于彼此具有不同的P修饰，且其中手性受控的C9orf72寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联。在某些实施例中，本披露提供一种手性受控的C9orf72寡核苷酸，其中所述寡核苷酸内的个别核苷酸间键联中的至少两者相对于彼此具有不同的P修饰，且其中手性受控的C9orf72寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联及至少一个硫代磷酸二酯核苷酸间键联。在某些实施例中，本披露提供一种手性受控的C9orf72寡核苷酸，其中所述寡核苷酸内的个别核苷酸间键联中的至少两者相对于彼此具有不同的P修饰，且其中手性受控的C9orf72寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸三酯核苷酸间键联。在某些实施例中，本披露提供一种手性受控的C9orf72寡核苷酸，其中所述寡核苷酸内的个别核苷酸间键联中的至少两者相对于彼此具有不同的P修饰，且其中手性受控的C9orf72寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联及至少一个硫代磷酸三酯核苷酸间键联。
在一些实施例中，所提供的化合物(例如所提供的寡核苷酸)具有60％-100％的纯度。在一些实施例中，纯度为至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施例中，纯度为至少60％。在一些实施例中，纯度为至少70％。在一些实施例中，纯度为至少80％。在一些实施例中，纯度为至少85％。在一些实施例中，纯度为至少90％。在一些实施例中，纯度为至少91％。在一些实施例中，纯度为至少92％。在一些实施例中，纯度为至少93％。在一些实施例中，纯度为至少94％。在一些实施例中，纯度为至少95％。在一些实施例中，纯度为至少96％。在一些实施例中，纯度为至少97％。在一些实施例中，纯度为至少98％。在一些实施例中，纯度为至少99％。在一些实施例中，纯度为至少99.5％。
在一些实施例中，所提供的化合物(例如所提供的寡核苷酸)具有60％-100％的立体化学纯度。在一些实施例中，所提供的化合物(例如所提供的寡核苷酸)具有60％-100％的非对映异构纯度。在一些实施例中，非对映异构纯度为至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施例中，所提供的化合物(例如所提供的寡核苷酸)的手性元件(例如手性中心(碳、磷等))具有60％-100％的非对映异构纯度。在一些实施例中，手性元件(例如手性中心(碳、磷等))具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的非对映异构纯度。在一些实施例中，手性受控的核苷酸间键联的每个键联磷独立地具有85％-100％(例如90％-100％)或至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的非对映异构纯度。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中多个寡核苷酸的手性受控的核苷酸间键联独立地具有85％-100％(例如90％-100％)或至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的非对映异构纯度。在一些实施例中，每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性受控的。在一些实施例中，非对映异构纯度为至少60％。在一些实施例中，非对映异构纯度为至少70％。在一些实施例中，非对映异构纯度为至少80％。在一些实施例中，非对映异构纯度为至少85％。在一些实施例中，非对映异构纯度为至少90％。在一些实施例中，非对映异构纯度为至少91％。在一些实施例中，非对映异构纯度为至少92％。在一些实施例中，非对映异构纯度为至少93％。在一些实施例中，非对映异构纯度为至少94％。在一些实施例中，非对映异构纯度为至少95％。在一些实施例中，非对映异构纯度为至少96％。在一些实施例中，非对映异构纯度为至少97％。在一些实施例中，非对映异构纯度为至少98％。在一些实施例中，非对映异构纯度为至少99％。在一些实施例中，非对映异构纯度为至少99.5％。
尤其是，本披露提供了各种寡核苷酸组合物。在一些实施例中，本披露提供了本文所述的寡核苷酸的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，寡核苷酸组合物(例如C9orf72寡核苷酸组合物)包含多个本披露中描述的寡核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸组合物(例如C9orf72寡核苷酸组合物)是手性受控的。在一些实施例中，寡核苷酸组合物(例如C9orf72寡核苷酸组合物)不是手性受控的(是立体随机性的)。
天然磷酸酯键联的键联磷是非手性的。许多修饰的核苷酸间键联，例如硫代磷酸酯核苷酸间键联的键联磷是手性的。在一些实施例中，在寡核苷酸组合物的制备期间(例如，在传统的亚磷酰胺寡核苷酸合成中)，没有有目的地设计或控制手性键联磷的构型，从而产生非手性受控(立体随机)的寡核苷酸组合物(基本上是外消旋制剂)，其是各种立体异构体的复杂的随机的混合物(非对映异构体)-对于具有n个手性核苷酸间键联(键联磷是手性的)的寡核苷酸，通常是2n个立体异构体(例如，当n是10时，210＝1,032；当n为20时，220＝1,048,576)。这些立体异构体具有相同的构成，但是其键联磷的立体化学模式不同。
在一些实施例中，本披露涵盖用于设计和制备手性受控的寡核苷酸组合物的技术。在一些实施例中，本披露提供了手性受控的寡核苷酸组合物，例如表A1中的在其立体化学/键联中含有S和/或R的许多寡核苷酸的手性受控的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物包含受控/预定(不是如非立体随机组合物中那样随机)水平的多个寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在一个或多个手性核苷酸间键联(手性受控的核苷酸间键联)处共享相同的键联磷立体化学。在一些实施例中，寡核苷酸共享相同的骨架手性中心模式(键联磷的立体化学)。在一些实施例中，骨架手性中心模式如本披露中所述。在一些实施例中，寡核苷酸共享相同的构成。在一些实施例中，寡核苷酸是结构相同的。如本领域技术人员所理解的，除非另外指出，否则多种形式的寡核苷酸(例如多种盐形式的寡核苷酸)可以被认为具有相同的构成和/或结构。
在一些实施例中，寡核苷酸组合物是手性受控的寡核苷酸组合物，其包含多个寡核苷酸，其中这些寡核苷酸共享：
1)共同的碱基序列；
2)共同的骨架键联模式；以及
3)在一个或多个(例如，1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)手性核苷酸间键联(手性受控的核苷酸间键联)处相同的键联磷立体化学，
其中相对于共享共同的碱基序列和骨架键联模式的寡核苷酸的基本上外消旋制剂，该组合物富集所述多个寡核苷酸。
在一些实施例中，寡核苷酸组合物是手性受控的寡核苷酸组合物，其包含多个寡核苷酸，其中这些寡核苷酸共享：
1)共同的碱基序列；
2)共同的骨架键联模式；以及
3)共同的骨架手性中心模式，该模式包含至少一个Sp，
其中相对于共享共同的碱基序列和骨架键联模式的寡核苷酸的基本上外消旋制剂，该组合物富集所述多个寡核苷酸。
在一些实施例中，寡核苷酸组合物是手性受控的寡核苷酸组合物，其包含多个寡核苷酸，其中这些寡核苷酸共享：
1)共同的碱基序列；
2)共同的骨架键联模式；以及
3)共同的骨架手性中心模式，该模式包含至少一个Rp，
其中相对于共享共同的碱基序列和骨架键联模式的寡核苷酸的基本上外消旋制剂，该组合物富集所述多个寡核苷酸。
在一些实施例中，多个寡核苷酸具有相同的构成。
在一些实施例中，本披露提供一种手性受控的寡核苷酸组合物，其包含多个寡核苷酸，其中这些寡核苷酸共享：
1)共同的构成，以及
2)在一个或多个(例如，1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个)手性核苷酸间键联(手性受控的核苷酸间键联)处相同的键联磷立体化学，
其中相对于具有共同的构成的寡核苷酸的基本上外消旋制剂，所述组合物富集所述多个寡核苷酸。
在一些实施例中，多个寡核苷酸在结构上相同。在一些实施例中，本披露提供一种手性受控的寡核苷酸组合物，其包含多个寡核苷酸，其中这些寡核苷酸在结构上相同，并且相对于具有与所述多个寡核苷酸相同的构成的寡核苷酸的基本上外消旋制剂，所述组合物富集所述多个寡核苷酸。
在一些实施例中，它们独立地共享相同的立体化学，5-50个或更多个(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或更多个)手性核苷酸间键联。在一些实施例中，多个寡核苷酸在每个硫代磷酸酯核苷酸间键联处共享相同的立体化学。
在一些实施例中，相对于基本外消旋制剂的富集是组合物中所有寡核苷酸的至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％是多个寡核苷酸。在一些实施例中，相对于基本外消旋制剂的富集是组合物中所有共享共同的碱基序列的寡核苷酸的至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％是多个寡核苷酸。在一些实施例中，相对于基本外消旋制剂的富集是组合物中所有共享共同的构成的寡核苷酸的至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％是多个寡核苷酸。在一些实施例中，百分比为至少约10％。在一些实施例中，百分比为至少约20％。在一些实施例中，百分比为至少约30％。在一些实施例中，百分比为至少约40％。在一些实施例中，百分比为至少约50％。在一些实施例中，百分比为至少约60％。在一些实施例中，百分比为至少约70％。在一些实施例中，百分比为至少约75％。在一些实施例中，百分比为至少约80％。在一些实施例中，百分比为至少约85％。在一些实施例中，百分比为至少约90％。在一些实施例中，百分比为至少约91％。在一些实施例中，百分比为至少约92％。在一些实施例中，百分比为至少约93％。在一些实施例中，百分比为至少约94％。在一些实施例中，百分比为至少约95％。在一些实施例中，百分比为至少约96％。在一些实施例中，百分比为至少约97％。在一些实施例中，百分比为至少约98％。在一些实施例中，百分比为至少约99％。如本领域技术人员所理解的，可以适当地认为多种形式的寡核苷酸具有相同的构成和/或结构，并且可以适当地认为共享相同构成的多种形式的寡核苷酸具有相同的构成。
控制手性受控的寡核苷酸组合物中的多个寡核苷酸的水平。相反，在非手性受控的(或立体随机的、外消旋的)寡核苷酸组合物(或制剂)中，寡核苷酸的水平是随机的且不受控的。在一些实施例中，在手性受控的寡核苷酸组合物中，多个寡核苷酸的水平是手性受控的寡核苷酸组合物中所有寡核苷酸的、或手性受控的寡核苷酸组合物中与多个寡核苷酸共享共同的碱基序列的所有寡核苷酸的、或手性受控的寡核苷酸组合物中与多个寡核苷酸共享共同的碱基序列以及骨架键联模式的所有寡核苷酸的、或手性受控的寡核苷酸组合物中与多个寡核苷酸共享共同的碱基序列、骨架键联模式以及骨架磷修饰模式的所有寡核苷酸的、或手性受控的寡核苷酸组合物中与多个寡核苷酸共享相同的构成的所有寡核苷酸的约1％-100％(例如，约5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80-100％、90-100％、95-100％、50％-90％、或约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％、或至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)。在一些实施例中，相对于基本上外消旋制剂的富集是本文描述的水平。
在一些实施例中，百分比水平(例如，受控水平、预定水平、富集)为或至少为(DS)nc，其中DS是90％-100％，并且nc是如本披露中所描述的手性受控的核苷酸间键联的数目(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)。在一些实施例中，每个手性核苷酸间键联是手性受控的，并且nc是手性核苷酸间键联的数目。在一些实施例中，DS是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或更大。在一些实施例中，DS为或至少为90％。在一些实施例中，DS为或至少为91％。在一些实施例中，DS为或至少为92％。在一些实施例中，DS为或至少为93％。在一些实施例中，DS为或至少为94％。在一些实施例中，DS为或至少为95％。在一些实施例中，DS为或至少为96％。在一些实施例中，DS为或至少为97％。在一些实施例中，DS为或至少为98％。在一些实施例中，DS为或至少为99％。在一些实施例中，水平(例如，受控水平、预定水平、富集)是共享相同的构成的组合物中所有寡核苷酸的百分比，其中该百分比为或至少为(DS)nc。例如，当DS是99％并且nc是10时，所述百分比是或至少是90％((99％)10≈0.90＝90％)。如本领域技术人员所理解的，在立体随机制剂中，百分比通常约为1/2nc-当nc为10时，百分比约为1/210≈0.001＝0.1％。
在一些实施例中，寡核苷酸组合物是手性受控的寡核苷酸组合物，其包含多个寡核苷酸，其中这些寡核苷酸共享：
1)共同的碱基序列；
2)共同的骨架键联模式；以及
3)在一个或多个(例如，1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)手性核苷酸间键联(手性受控的核苷酸间键联)处相同的键联磷立体化学，
其中组合物中所有共享共同的碱基序列以及骨架键联模式的寡核苷酸中的多个寡核苷酸的百分比至少为(DS)nc，其中DS为90％-100％，并且nc为手性受控的核苷酸间键联的数目。
在一些实施例中，寡核苷酸组合物是手性受控的寡核苷酸组合物，其包含多个寡核苷酸，其中这些寡核苷酸共享：
1)共同的碱基序列；
2)共同的骨架键联模式；以及
3)共同的骨架手性中心模式，该模式包含至少一个Sp，
其中组合物中所有共享共同的碱基序列以及骨架键联模式的寡核苷酸中的多个寡核苷酸的百分比至少为(DS)nc，其中DS为90％-100％，并且nc为手性受控的核苷酸间键联的数目。
在一些实施例中，寡核苷酸组合物是手性受控的寡核苷酸组合物，其包含多个寡核苷酸，其中这些寡核苷酸共享：
1)共同的碱基序列；
2)共同的骨架键联模式；以及
3)共同的骨架手性中心模式，该模式包含至少一个Rp，
其中组合物中所有共享共同的碱基序列以及骨架键联模式的寡核苷酸中的多个寡核苷酸的百分比至少为(DS)nc，其中DS为90％-100％，并且nc为手性受控的核苷酸间键联的数目。
在一些实施例中，本披露提供一种手性受控的寡核苷酸组合物，其包含多个寡核苷酸，其中这些寡核苷酸具有共同的构成，并且共享在一个或多个(例如，1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)手性核苷酸间键联(手性受控的核苷酸间键联)处相同的键联磷立体化学，其中组合物中所有具有相同的构成的寡核苷酸中的多个寡核苷酸的百分比至少为(DS)nc，其中DS为90％-100％，并且nc为手性受控的核苷酸间键联的数目。
在一些实施例中，多个寡核苷酸具有不同的盐形式。在一些实施例中，多个寡核苷酸包含单一寡核苷酸的一种或多种形式，例如多种药学上可接受的盐形式。在一些实施例中，多个寡核苷酸包含两个或更多个寡核苷酸的一种或多种形式，例如多种药学上可接受的盐形式。在一些实施例中，多个寡核苷酸包含2NCC个寡核苷酸的一种或多种形式，例如多种药学上可接受的盐形式，其中NCC是非手性受控的手性核苷酸间键联的数目。在一些实施例中，2NCC个寡核苷酸在组合物内具有相对相似的水平，例如，没有使用手性受控的寡核苷酸合成来特异性地富集它们。
在一些实施例中，本披露提供一种手性受控的寡核苷酸组合物，其包含多个寡核苷酸，其中这些寡核苷酸在结构上相同，并且组合物中所有与多个寡核苷酸具有相同的构成的寡核苷酸中的多个寡核苷酸的百分比至少为(DS)nc，其中DS为90％-100％，并且nc为手性受控的核苷酸间键联的数目。
在一些实施例中，可以将组合物中的多个寡核苷酸的水平确定为寡核苷酸中每个手性受控的核苷酸间键联的非对映纯度的乘积。在一些实施例中，连接寡核苷酸(或核酸)中两个核苷的核苷酸间键联的非对映纯度由连接相同两个核苷的二聚体的核苷酸间键联的非对映纯度表示，其中使用可比较的条件(在某些情况下，相同的合成循环条件)制备二聚体(例如，对于寡核苷酸…NxNy…中Nx和Ny之间的键联，二聚体为NxNy)。
在一些实施例中，所有手性核苷酸间键联都是手性受控的，并且所述组合物是完全手性受控的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，不是所有的手性核苷酸间键联都是手性受控的核苷酸间键联，并且组合物是部分地手性受控的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，所有手性核苷酸间键联中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％是手性受控的。在一些实施例中，所有手性核苷酸间键联中的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％是手性受控的。在一些实施例中，每个硫代磷酸酯核苷酸间键联是手性受控的。
寡核苷酸可以包含骨架手性中心的各种模式(手性键联磷的立体化学模式)或由其组成。在本披露中描述了骨架手性中心的某些有用的模式。在一些实施例中，多个寡核苷酸共享共同的骨架手性中心模式，其是或包含本披露中描述的模式(例如，如“键联磷立体化学及其模式”中所述，表A1中的手性受控的寡核苷酸的骨架手性中心模式)。
手性受控的寡核苷酸组合物相对于立体随机的寡核苷酸组合物可以显示许多优点。尤其是，就寡核苷酸结构而言，手性受控的寡核苷酸组合物比相应的立体随机的寡核苷酸组合物更均匀。通过控制立体化学，可以制备和评估各个立体异构体的组合物，从而可以开发具有所需特性和/或活性的立体异构体的手性受控的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，与例如相应的立体随机的寡核苷酸组合物相比，手性受控的寡核苷酸组合物提供了更好的递送、稳定性、清除率、活性、选择性和/或毒性谱。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物提供更好的功效、更少的副作用和/或更方便和有效的剂量方案。尤其是，本文所述的骨架手性中心模式可用于提供寡核苷酸靶标(例如，转录物，例如mRNA前体，成熟mRNA等；包括控制切割位点，切割位点处的切割速率和/或程度，和/或总切割速率和程度等)的受控切割，并大大提高了靶标选择性。在一些实施例中，包含某些骨架手性中心模式的寡核苷酸的手性受控的寡核苷酸组合物可以在非常少的位置(在一些实施例中，在单个位置(例如，在SNP位点、点突变位点等))区分具有核碱基差异的序列。
如本领域普通技术人员所理解的，立体随机或(基本上)外消旋制剂/非手性受控的寡核苷酸组合物通常在没有手性受控的情况下(例如，不使用可以在寡核苷酸合成期间在键联磷处提供高立体选择性(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或更高；在一些实施例中，95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或更高；在一些实施例中，97％、98％、99％或99.5％或更高；在一些实施例中，98％、99％或99.5％或更高)的手性助剂、手性修饰试剂、和/或手性催化剂)进行制备。在一些实施例中，在基本上外消旋(或手性不受控制的)的寡核苷酸制剂中，偶联步骤不是手性受控的，因为偶联步骤没有特异性地进行以提供增强的立体选择性。寡核苷酸/非手性受控的寡核苷酸组合物的基本上外消旋制剂的实例是硫代磷酸酯寡核苷酸的制剂，通过传统的亚磷酰胺寡核苷酸合成和用非手性硫化试剂(例如二硫代四乙基秋兰姆或(TETD)，3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(BDTD)等)硫化(本领域熟知的方法)。制备立体随机寡核苷酸组合物/寡核苷酸的基本上外消旋制剂的多种方法是本领域众所周知的和实践的，并且可用于制备此类组合物和本披露的制剂。
在例如实例中显示某些数据，所述数据显示手性受控的寡核苷酸组合物，例如手性受控的C9orf72寡核苷酸组合物在降低C9orf72靶标基因或其基因产物的水平、活性和/或表达方面的特性和/或活性。
在一些实施例中，本披露提供了手性受控的寡核苷酸组合物，例如手性受控的C9orf72寡核苷酸组合物，其中至少一个手性受控的核苷酸间键联的键联磷是Sp。在一些实施例中，本披露提供了手性受控的寡核苷酸组合物，例如手性受控的C9orf72寡核苷酸组合物，其中手性受控的核苷酸间键联的大部分键联磷是Sp。在一些实施例中，寡核苷酸或其一部分(例如5’-翼、3’-翼、核心等)的所有手性受控的核苷酸间键联(或所有手性核苷酸间键联、或所有核苷酸间键联)的约50％-100％、55％-100％、60％-100％、65％-100％、70％-100％、75％-100％、80％-100％、85％-100％、90％-100％、55％-95％、60％-95％、65％-95％、或约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更高是Sp。在一些实施例中，寡核苷酸或其一部分(例如5’-翼、3’-翼、核心等)的所有手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联的约50％-100％、55％-100％、60％-100％、65％-100％、70％-100％、75％-100％、80％-100％、85％-100％、90％-100％、55％-95％、60％-95％、65％-95％、或约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更高是Sp。在一些实施例中，百分比为60％或更高。在一些实施例中，百分比为67％或更高。在一些实施例中，百分比为70％或更高。在一些实施例中，百分比为75％或更高。在一些实施例中，百分比为80％或更高。在一些实施例中，百分比为85％或更高。在一些实施例中，百分比为90％或更高。在一些实施例中，百分比为95％或更高。在一些实施例中，寡核苷酸或其一部分(例如5’-翼、3’-翼、核心等)包含一个或多个Rp手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸或其一部分(例如5’-翼、3’-翼、核心等)包含一个或多个Rp手性受控的不带负电荷的核苷酸间键联(例如，中性核苷酸间键联，如n001)。在一些实施例中，寡核苷酸或其一部分(例如5’-翼、3’-翼、核心等)包含一个或多个Rp手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，核心包含一个或多个Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联，例如以本文所述的包含RpSpSp的骨架手性中心模式。
骨架手性中心的立体化学和模式
与天然磷酸酯键联相反，手性修饰的核苷酸间键联的例如硫代磷酸酯核苷酸间键联的键联磷是手性的。尤其是，本披露提供了包括控制手性核苷酸间键联中的手性键联磷的立体化学的技术(例如，寡核苷酸、组合物、方法等)。在一些实施例中，如本文所示，对立体化学的控制可以提供改善的特性和/或活性，包括所需的稳定性、降低的毒性、改善的靶标核酸还原等。在一些实施例中，本披露提供了对于寡核苷酸和/或其区域有用的骨架手性中心模式，所述模式是手性键联磷的每个手性键联磷(Rp或Sp)的立体化学的组合，每个非手性键联磷(Op，如有)等从5’到3’指示。在一些实施例中，当在切割系统(例如，体外测定、细胞、组织、器官、生物体、受试者等)中与所提供的寡核苷酸或其组合物接触时，骨架手性中心模式可以控制靶标核酸的切割模式。在一些实施例中，当在切割系统中与所提供的寡核苷酸或其组合物接触时，骨架手性中心模式改善了靶标核酸的裂解效率和/或选择性。
在一些实施例中，寡核苷酸(例如C9orf72寡核苷酸)或其区域(例如核心)的骨架手性中心模式包含或是(Sp)m(Rp/Op)n、(Rp/Op)n(Sp)m、(Sp)m(Rp)n、(Rp)n(Sp)m、(Np)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y、[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Np)t、(Np)t[(Rp)n(Sp)m]y、[(Rp)n(Sp)m]y(Np)t、[(Op)n(Sp)m]y(Rp)k、[(Op)n(Sp)m]y、(Sp)t[(Op)n(Sp)m]y、(Sp)t[(Op)n(Sp)m]y(Rp)k、[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)k、[(Rp)n(Sp)m]y、(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y或(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)k，其中每个Np独立地是Sp或Rp，并且m、n、t、y和k各自独立地是1-50。在一些实施例中，寡核苷酸(例如C9orf72寡核苷酸)或其区域(例如核心)的骨架手性中心模式包含或是Rp(Sp)m。在一些实施例中，寡核苷酸(例如C9orf72寡核苷酸)或其区域(例如核心)的骨架手性中心模式包含或是(Sp)tRp(Sp)m。在一些实施例中，寡核苷酸(例如C9orf72寡核苷酸)或其区域(例如核心)的骨架手性中心模式包含或是[Rp(Sp)m]y。在一些实施例中，寡核苷酸(例如C9orf72寡核苷酸)或其区域(例如核心)的骨架手性中心模式包含或是(Np)t[Rp(Sp)m]y。在一些实施例中，寡核苷酸(例如C9orf72寡核苷酸)或其区域(例如核心)的骨架手性中心模式包含或是(Sp)t[Rp(Sp)m]y。在一些实施例中，至少一个n是1。在一些实施例中，每个n是1。在一些实施例中，至少一个m是2或更大。在一些实施例中，每个m独立地是2或更大。在一些实施例中，y是1。在一些实施例中，y是2。在一些实施例中，y是3。在一些实施例中，t是1。在一些实施例中，t是2或更大。在一些实施例中，t是2或更大。在一些实施例中，y是4或更大。在一些实施例中，至少一个Rp/Op是Rp。在一些实施例中，Np、Rp、Sp各自独立地具有硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，Op代表天然磷酸酯键联。
在一些实施例中，m是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。在一些实施例中，在骨架手性中心模式中，每个m独立地是2或更大。在一些实施例中，每个m独立地是2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施例中，每个m独立地是2-3、2-5、2-6或2-10。在一些实施例中，m是2。在一些实施例中，m是3。在一些实施例中，m是4。在一些实施例中，m是5。在一些实施例中，m是6。在一些实施例中，m是7。在一些实施例中，m是8。在一些实施例中，m是9。在一些实施例中，m是10。在一些实施例中，在存在两个或更多个m的情况下，它们可以相同或不同，并且它们各自独立地如本披露中所描述。
在一些实施例中，y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。在一些实施例中，y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。在一些实施例中，y是1。在一些实施例中，y是2。在一些实施例中，y是3。在一些实施例中，y是4。在一些实施例中，y是5。在一些实施例中，y是6。在一些实施例中，y是7。在一些实施例中，y是8。在一些实施例中，y是9。在一些实施例中，y是10。
在一些实施例中，t是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。在一些实施例中，每个t独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施例中，t是2或更大。在一些实施例中，t是3或更大。在一些实施例中，t是4或更大。在一些实施例中，t是1。在一些实施例中，t是2。在一些实施例中，t是3。在一些实施例中，t是4。在一些实施例中，t是5。在一些实施例中，t是6。在一些实施例中，t是7。在一些实施例中，t是8。在一些实施例中，t是9。在一些实施例中，t是10。在一些实施例中，在存在两个或更多个t的情况下，它们可以相同或不同，并且它们各自独立地如本披露中所描述。
在一些实施例中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。在一些实施例中，n是1。在一些实施例中，n是2。在一些实施例中，n是3。在一些实施例中，n是4。在一些实施例中，n是5。在一些实施例中，n是6。在一些实施例中，n是7。在一些实施例中，n是8。在一些实施例中，n是9。在一些实施例中，n是10。在一些实施例中，在存在两个或更多个n的情况下，它们可以相同或不同，并且它们各自独立地如本披露中所描述。在很多实施例中，在骨架手性中心模式中，n的至少一次出现是1；在一些情况下，每个n是1。
在一些实施例中，k是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。在一些实施例中，k是1。在一些实施例中，k是2。在一些实施例中，k是3。在一些实施例中，k是4。在一些实施例中，k是5。在一些实施例中，k是6。在一些实施例中，k是7。在一些实施例中，k是8。在一些实施例中，k是9。在一些实施例中，k是10。
在一些实施例中，至少一个n是1，且至少一个m不小于2。在一些实施例中，至少一个n是1，至少一个t不小于2，且至少一个m不小于3。在一些实施例中，每个n是1。在一些实施例中，t是1。在一些实施例中，至少一个t>1。在一些实施例中，至少一个t>2。在一些实施例中，至少一个t>3。在一些实施例中，至少一个t>4。在一些实施例中，至少一个m>1。在一些实施例中，至少一个m>2。在一些实施例中，至少一个m>3。在一些实施例中，至少一个m>4。在一些实施例中，骨架手性中心模式包含一个或多个非手性天然磷酸酯键联。在一些实施例中，m、t和n的总和(或在一种模式中无t时，m和n的总和)不小于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，所述总和为5。在一些实施例中，所述总和为6。在一些实施例中，所述总和为7。在一些实施例中，所述总和为8。在一些实施例中，所述总和为9。在一些实施例中，所述总和为10。在一些实施例中，所述总和为11。在一些实施例中，所述总和为12。在一些实施例中，所述总和为13。在一些实施例中，所述总和为14。在一些实施例中，所述总和为15。
在一些实施例中，在手性受控的核苷酸间键联中的许多键联磷是Sp。在一些实施例中，至少10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的手性受控的核苷酸间键联具有Sp键联磷。在一些实施例中，至少10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联具有Sp键联磷。在一些实施例中，所有手性核苷酸间键联中的至少10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％是具有Sp键联磷的手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，所有手性核苷酸间键联中的至少10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％是具有Sp键联磷的手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，所有核苷酸间键联中的至少10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％是具有Sp键联磷的手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，百分比为至少20％。在一些实施例中，百分比为至少30％。在一些实施例中，百分比为至少40％。在一些实施例中，百分比为至少50％。在一些实施例中，百分比为至少60％。在一些实施例中，百分比为至少65％。在一些实施例中，百分比为至少70％。在一些实施例中，百分比为至少75％。在一些实施例中，百分比为至少80％。在一些实施例中，百分比为至少90％。在一些实施例中，百分比为至少95％。在一些实施例中，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少5个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少6个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少7个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少8个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少9个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少10个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少11个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少12个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少13个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少14个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少15个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸间键联是具有Rp键联磷的手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸间键联是具有Rp键联磷的手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸中的一个且不超过一个核苷酸间键联是具有Rp键联磷的手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸中的2个且不超过2个核苷酸间键联是具有Rp键联磷的手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸中的3个且不超过3个核苷酸间键联是具有Rp键联磷的手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸中的4个且不超过4个核苷酸间键联是具有Rp键联磷的手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸中的5个且不超过5个核苷酸间键联是具有Rp键联磷的手性受控的核苷酸间键联。
在一些实施例中，寡核苷酸中所有、基本上所有或大部分核苷酸间键联呈Sp构型(例如，寡核苷酸中所有手性受控的核苷酸间键联中、或所有手性核苷酸间键联中、或所有核苷酸间键联中约50％-100％、55％-100％、60％-100％、65％-100％、70％-100％、75％-100％、80％-100％、85％-100％、90％-100％、55％-95％、60％-95％、65％-95％、或约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多)，除了一个或少数核苷酸间键联(例如，寡核苷酸中所有手性受控的核苷酸间键联中、或所有手性核苷酸间键联中、或所有核苷酸间键联中1、2、3、4或5个、和/或少于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％)呈Rp构型。在一些实施例中，核心中所有、基本上所有或大部分核苷酸间键联呈Sp构型(例如，核心中所有手性受控的核苷酸间键联中、或所有手性核苷酸间键联中、或所有核苷酸间键联中约50％-100％、55％-100％、60％-100％、65％-100％、70％-100％、75％-100％、80％-100％、85％-100％、90％-100％、55％-95％、60％-95％、65％-95％、或约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多)，除了一个或少数核苷酸间键联(例如，核心中所有手性受控的核苷酸间键联中、或所有手性核苷酸间键联中、或所有核苷酸间键联中1、2、3、4或5个、和/或少于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％)呈Rp构型。在一些实施例中，核心中所有、基本上所有或大部分核苷酸间键联是呈Sp构型的硫代磷酸酯(例如，核心中所有手性受控的核苷酸间键联中、或所有手性核苷酸间键联中、或所有核苷酸间键联中约50％-100％、55％-100％、60％-100％、65％-100％、70％-100％、75％-100％、80％-100％、85％-100％、90％-100％、55％-95％、60％-95％、65％-95％、或约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多)，除了一个或少数核苷酸间键联(例如，核心中所有手性受控的核苷酸间键联中、或所有手性核苷酸间键联中、或所有核苷酸间键联中1、2、3、4或5个、和/或少于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％)是呈Rp构型的硫代磷酸酯。在一些实施例中，核心中每个核苷酸间键联是呈Sp构型的硫代磷酸酯，除了一个是呈Rp构型的硫代磷酸酯。在一些实施例中，核心中每个核苷酸间键联是呈Sp构型的硫代磷酸酯，除了一个是呈Rp构型的硫代磷酸酯。
在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个Rp核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个且不超过一个Rp核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含两个或更多个Rp核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含三个或更多个Rp核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含四个或更多个Rp核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含五个或更多个Rp核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸中所有手性受控的核苷酸间键联中约5％-50％是Rp。在一些实施例中，寡核苷酸中所有手性受控的核苷酸间键联中约5％-40％是Rp。在一些实施例中，寡核苷酸中所有手性受控的核苷酸间键联中约10％-40％是Rp。在一些实施例中，寡核苷酸中所有手性受控的核苷酸间键联中约15％-40％是Rp。在一些实施例中，寡核苷酸中所有手性受控的核苷酸间键联中约20％-40％是Rp。在一些实施例中，寡核苷酸中所有手性受控的核苷酸间键联中约25％-40％是Rp。在一些实施例中，寡核苷酸中所有手性受控的核苷酸间键联中约30％-40％是Rp。在一些实施例中，寡核苷酸中所有手性受控的核苷酸间键联中约35％-40％是Rp。
在一些实施例中，碱基序列包含或是与靶标核酸中的特征序列元件互补的序列，该特征序列元件可以区分靶标核酸(例如，来自特定等位基因的转录物或来自核酸的转录物的类型(例如，图1中的V3)，其通常与病症、障碍或疾病相关)与其他核酸(例如，来自不同等位基因的转录物或来自核酸的不同类型的转录物(例如，图1中的V2)，其通常与病症、障碍或疾病不相关或较低相关)。在一些实施例中，共同的碱基序列包含与特征序列元件互补的序列。在一些实施例中，共同的碱基序列是与特征序列元件互补的序列。在一些实施例中，共同的碱基序列包含或是与特征序列元件100％互补的序列。在一些实施例中，共同的碱基序列包含与特征序列元件100％互补的序列。在一些实施例中，共同的碱基序列是与特征序列元件100％互补的序列。在一些实施例中，Rp核苷酸间键联(例如，Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联)相对于特征序列元件位于+5、+4、+3、+2、+1、-1、-2、-3、-4或-5位置。在一些实施例中，这样的Rp具有骨架手性中心模式的RpSpSp基序(例如，包含或由(Rp)n(Sp)m、(Np)t[(Rp)n(Sp)m]y、(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y、Rp(Sp)m、(Sp)tRp(Sp)m、[Rp(Sp)m]y、(Np)t[Rp(Sp)m]y或(Sp)t[Rp(Sp)m]y组成的那些，如本文所述)。除非另有说明，否则对于Rp核苷酸间键联定位，“-”是从与特征序列元件互补的序列的5'端的核苷朝向寡核苷酸的5'端计数，其中在-1位置的核苷酸间键联是与同特征序列元件互补的序列的5'端上的核苷的5'碳键合的核苷酸间键联，并且“+”是从与特征序列元件互补的序列的3'端的核苷朝向寡核苷酸的3'端计数，其中在+1位置的核苷酸间键联是与同特征序列元件互补的序列的3'端上的核苷的3'碳键合的核苷酸间键联。在一些实施例中，特征序列元件包含单个区分性位置(例如，点突变)。在一些实施例中，特征序列元件是点突变或SNP。如本领域技术人员所理解的，当特征序列元件仅含有一个核苷时，与特征序列元件互补的序列的5'端的核苷和与特征序列元素互补的序列的3'端的核苷相同。在一些实施例中，Rp在-5处。在一些实施例中，Rp在-4处。在一些实施例中，Rp在-3处。在一些实施例中，Rp在-2处。在一些实施例中，Rp在-1处。在一些实施例中，Rp在+1处。在一些实施例中，Rp在+2处。在一些实施例中，Rp在+3处。在一些实施例中，Rp在+4处。在一些实施例中，Rp在+5处。在一些实施例中，这样的Rp是手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联的构型。在一些实施例中，这样的Rp在核心区域中。
在一些实施例中，Sp构型的核苷酸间键联(具有Sp键联磷)是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，非手性核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，Rp构型的核苷酸间键联(具有Rp键联磷)是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，Sp构型的每个核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个非手性核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，Rp构型的每个核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，Sp构型的每个核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联，每个非手性核苷酸间键联是天然磷酸酯键联，并且Rp构型的每个核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，Rp构型的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联(例如，中性核苷酸间键联(如n001))。在一些实施例中，每个手性受控的不带负电荷的核苷酸间键联(例如，中性核苷酸间键联(如n001))是Rp。在一些实施例中，每个n001是Rp。
在一些实施例中，例如，当描述核心核苷酸间键联的类型、修饰、数量和/或模式时，键合于翼核苷和核心核苷的核苷酸间键联被认为是核心核苷酸间键联之一。在一些实施例中，例如，当描述核心核苷酸间键联的类型、修饰、数量和/或模式时，键合至翼核苷和核心核苷的每个核苷酸间键联被认为是核心核苷酸间键联之一。在一些实施例中，核心核苷酸间键联键合至两个核心核苷。在一些实施例中，核心核苷酸间键联键合至核心核苷和翼核苷。在一些实施例中，每个核心核苷酸间键联独立地键合至两个核心核苷、或者核心核苷和翼核苷。在一些实施例中，每个翼核苷酸间键联独立地键合至两个翼核苷。
在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中所提供的寡核苷酸(例如C9orf72寡核苷酸)各自包含不同类型的核苷酸间键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和至少一个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和至少两个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和至少三个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和至少四个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和至少五个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25或更多个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，修饰的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是n001。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯或中性核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯或n001。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续硫代磷酸酯核苷酸间键联。
在一些实施例中，经修饰的键联包含手性助剂，其例如用于控制反应(例如在寡核苷酸合成循环中的偶联反应)的立体选择性。
核苷酸间键联
在一些实施例中，寡核苷酸包含碱基修饰、糖修饰和/或核苷酸间键联修饰。根据本披露，可以利用各种核苷酸间键联来连接包含核碱基，例如核苷的单元。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷酸间键和一个或多个天然磷酸酯键两者。如本领域技术人员所公知的，天然磷酸酯键联广泛存在于天然DNA和RNA分子中；它们具有-OP(O)(OH)O-的结构，连接DNA和RNA的核苷中的糖，并且可呈各种盐形式，例如在生理pH值(约7.4)下，天然磷酸酯键联主要是以具有-OP(O)(O-)O-阴离子的盐形式存在。修饰的核苷酸间键联或非天然磷酸酯键联是不为天然磷酸酯键联或其盐形式的核苷酸间键联。取决于它们的结构，修饰的核苷酸间键联也可以呈它们的盐形式。例如，如本领域技术人员所理解的，具有-OP(O)(SH)O-结构的硫代磷酸酯核苷酸间键联可以处于各种盐形式，例如在生理pH下(约7.4)，具有-OP(O)(S-)O-阴离子。
在一些实施例中，寡核苷酸包含核苷酸间键联，所述核苷酸间键联是修饰的核苷酸间键联，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸盐、3’-硫代磷酸盐或5’-硫代磷酸盐。
在一些实施例中，修饰的核苷酸间键联是包含手性键联磷的手性核苷酸间键联。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是硫代磷酸酯键联。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。在一些实施例中，手性核苷酸间键联就其手性键联磷而言是手性受控的。在一些实施例中，手性核苷酸间键联就其手性键联磷而言是立体化学纯的。在一些实施例中，手性核苷酸间键联不是手性受控的。在一些实施例中，骨架手性中心模式包含以下或由以下组成：手性受控的核苷酸间键联(Rp或Sp)的位置和键联磷构型以及非手性核苷酸间键联(例如天然磷酸酯键联)的位置。
在一些实施例中，寡核苷酸包含如在以下中描述的经修饰的核苷酸间键联(例如，具有式I、I-a、I-b、或I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2等的结构的经修饰的核苷酸间键联，或其盐形式)：US9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US 10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US 2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO2019/217784、和/或WO 2019/032612，其各自的核苷酸间键联(例如，具有式I、I-a、I-b、或I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2等的那些)通过引用独立地并入本文。在一些实施例中，修饰的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含一个或多个不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是带正电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露提供了包含一个或多个中性核苷酸间键联的寡核苷酸。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联或中性核苷酸间键联(例如，具有式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2等中的一个)如在以下中描述：US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US 10160969、US10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US 2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO2019/200185、WO 2019/217784、和/或WO 2019/032612。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联或中性核苷酸间键联具有式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2等中一个，如在以下中描述：WO 2018/223056、WO 2019/032607、WO 2019/075357、WO 2019/032607、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、和/或WO 2019/032612，其各自的此类核苷酸间键联通过引用独立地并入本文。
在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联可以改善寡核苷酸的递送和/或活性(例如，降低靶标基因或其基因产物的水平、活性和/或表达的能力、选择性等)。
在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联具有-OP(＝W)(-N＝C(R”)2)-O-或-OP(＝W)(-N(R”)2)-O-的结构，其中：
W是O或S；
每个R”独立地是R’或-N(R’)2；
每个R'独立地是-R、-C(O)R、-C(O)OR或-S(O)2R；
每个R独立地是-H，或选自以下的任选地经取代的基团：C1-30脂肪族、具有1-10个杂原子的C1-30杂脂肪族、C6-30芳基、C6-30芳基脂肪族、具有1-10个杂原子的C6-30芳基杂脂肪族、具有1-10个杂原子的5-30元杂芳基、以及具有1-10个杂原子的3-30元杂环基，或：
两个R基团任选地且独立地一起形成共价键，或
同一原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与所述原子一起形成除所述原子外具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环，或：
两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选且独立地与居于它们之间的原子一起形成除所述插入原子外具有0-10个杂原子的任选经取代的3元至30元单环、双环或多环。
在一些实施例中，W是O。在一些实施例中，W是S。
在一些实施例中，R”是R’。在一些实施例中，R”是-N(R’)2。
在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联具有-OP(＝O)(-N＝C(N(R’)2)2-O-的结构。在一些实施例中，一个N(R’)2的R'基团是R，另一个N(R’)2的R'基团是R，并且两个R基团与居于它们之间的原子一起形成任选地经取代的环，例如n001中的5元环。在一些实施例中，每个R’独立地是R，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族。
在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联具有-OP(＝W)(-N(R’)2)-O-的结构。
在一些实施例中，R’是R。在一些实施例中，R’是H。在一些实施例中，R'是-C(O)R。在一些实施例中，R'是-C(O)OR。在一些实施例中，R’是-S(O)2R。
在一些实施例中，R”是-NHR’。在一些实施例中，-N(R’)2是-NHR’。
如本文所述，一些实施例，R是H。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R是甲基。在一些实施例中，R是取代的甲基。在一些实施例中，R是乙基。在一些实施例中，R是取代的乙基。
在一些实施例中，如本文所述，不带负电荷的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。
在一些实施例中，修饰的核苷酸间键联(例如，不带负电荷的核苷酸间键联)包含任选地经取代的三唑基。在一些实施例中，修饰的核苷酸间键联(例如，不带负电荷的核苷酸间键联)包含任选地经取代的炔基。在一些实施例中，修饰的核苷酸间键联包含三唑或炔烃部分。在一些实施例中，三唑部分(例如三唑基基团)是任选地经取代的。在一些实施例中，三唑部分(例如三唑基基团)是经取代的。在一些实施例中，三唑部分是未经取代的。在一些实施例中，修饰的核苷酸间键联包含任选地经取代的环状胍部分。在一些实施例中，修饰的核苷酸间键联包含任选地经取代的环状胍部分，并且具有以下结构：
Figure BDA0003456638050001131
Figure BDA0003456638050001132
其中W是O或S。在一些实施例中，W是O。在一些实施例中，W是S。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是立体化学控制的。
在一些实施例中，核苷酸间键联，例如不带负电荷的核苷酸间键联、中性核苷酸间键联，包含环状胍部分。在一些实施例中，核苷酸间键联包含具有结构
Figure BDA0003456638050001133
的环状胍部分。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联或中性核苷酸间键联是或包含
Figure BDA0003456638050001134
的结构，其中W是O或S。
在一些实施例中，核苷酸间键联包含Tmg基团
Figure BDA0003456638050001135
在一些实施例中，核苷酸间键联包含Tmg基团并具有
Figure BDA0003456638050001136
的结构(“Tmg核苷酸间键联”)。在一些实施例中，中性核苷酸间键联包括PNA和PMO的核苷酸间键联以及Tmg核苷酸间键联。
在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含具有1-10个杂原子的任选地经取代的3-20元杂环基或杂芳基基团。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含具有1-10个杂原子的任选地经取代的3-20元杂环基或杂芳基基团，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，此类杂环基或杂芳基基团具有5元环。在一些实施例中，此类杂环基或杂芳基基团具有6元环。
在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含具有1-10个杂原子的任选地经取代的5-20元杂芳基基团。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含具有1-10个杂原子的任选地经取代的5-20元杂芳基基团，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含具有1-4个杂原子的任选地经取代的5-6元杂芳基基团，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含具有1-4个杂原子的任选地经取代的5元杂芳基基团，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，杂芳基基团直接与键联磷键合。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含具有1-10个杂原子的任选地经取代的5-20元杂环基基团。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含具有1-10个杂原子的任选地经取代的5-20元杂环基基团，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含具有1-4个杂原子的任选地经取代的5-6元杂环基基团，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含具有1-4个杂原子的任选地经取代的5元杂环基基团，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，至少两个杂原子是氮。在一些实施例中，杂环基基团直接与键联磷键合。在一些实施例中，当杂环基基团是经由其＝N-直接与键联磷键合的胍部分的一部分时，所述杂环基基团经由接头(例如＝N-)与键联磷键合。
在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含任选地经取代的
Figure BDA0003456638050001141
基团。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含经取代的
Figure BDA0003456638050001142
基团。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含
Figure BDA0003456638050001143
基团。在一些实施例中，每个R1独立地是任选经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，每个R1独立地是甲基。
在一些实施例中，寡核苷酸包含不同类型的核苷酸间磷键联。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和至少一个经修饰的(非天然)核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和至少一个硫代磷酸酯。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和至少一个不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键联和至少一个不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键联、至少一个天然磷酸酯键联和至少一个不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个(例如1-50、1-40、1-30、1-20、1-15、1-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是不带负电的，因为在给定pH下在水溶液中，少于50％、40％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的核苷酸间键联以带负电的盐形式存在。在一些实施例中，pH为约pH 7.4。在一些实施例中，pH为约4-9。在一些实施例中，百分比小于10％。在一些实施例中，百分比小于5％。在一些实施例中，百分比小于1％。在一些实施例中，核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联，因为核苷酸间键联的中性形式于水中不具有不超过约1、2、3、4、5、6或7的pKa。在一些实施例中，没有pKa为7或更小。在一些实施例中，没有pKa为6或更小。在一些实施例中，没有pKa为5或更小。在一些实施例中，没有pKa为4或更小。在一些实施例中，没有pKa为3或更小。在一些实施例中，没有pKa为2或更小。在一些实施例中，没有pKa为1或更小。在一些实施例中，核苷酸间键联的中性形式的pKa可表示为具有结构CH3-核苷酸间键联-CH3的化合物的中性形式的pKa。例如，
Figure BDA0003456638050001151
的pKa可以由pKa
Figure BDA0003456638050001152
表示。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是带正电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含胍部分。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含杂芳基碱基部分。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含三唑部分。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含炔基部分。
在一些实施例中，寡核苷酸包含不同类型的核苷酸间磷键联。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和至少一个经修饰的(非天然)核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和至少一个硫代磷酸酯。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和至少一个不带负电荷的核苷酸间键联。
不希望受任何特定理论的束缚，本披露指出，中性核苷酸间键联可以比硫代磷酸酯核苷酸间键联(PS)更具疏水性，所述硫代磷酸酯核苷酸间键联可以比天然磷酸酯键联(PO)更具疏水性。通常，不同于PS或PO，中性核苷酸间键联携带更少电荷。不希望受任何特定理论的束缚，本披露指出，将一个或多个中性核苷酸间键联掺入寡核苷酸中可以增加寡核苷酸被细胞摄取和/或寡核苷酸逸出内体的能力。不希望受任何特定理论的束缚，本披露指出，掺入一个或多个中性核苷酸间键联可用于调节在寡核苷酸与其靶标核酸之间形成的双链体的解链温度。
不希望受任何特定理论的束缚，本披露指出，将一个或多个不带负电荷的核苷酸间键联(例如中性核苷酸间键联)掺入寡核苷酸中能够增加寡核苷酸介导例如基因敲低的功能的能力。在一些实施例中，能够介导核酸或由其编码的产物的水平的敲低的寡核苷酸(例如C9orf72寡核苷酸)包含一个或多个不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，能够介导靶标基因的表达敲低的寡核苷酸(例如C9orf72寡核苷酸)包含一个或多个不带负电荷的核苷酸间键联。
在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联(例如，中性核苷酸间键联)不是手性受控的。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是手性受控的。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是手性受控的且其键联磷为Rp。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是手性受控的且其键联磷为Sp。
在许多实施例中，如广泛证明的，本披露的寡核苷酸包含两个或更多个不同的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸间键联和不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸间键联、不带负电荷的核苷酸间键联、和天然磷酸酯键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是n001。在一些实施例中，每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性受控的。在一些实施例中，每个手性经修饰的核苷酸间键联独立地是手性受控的。
在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联(例如，中性核苷酸间键联)不是手性受控的。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是手性受控的。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是手性受控的且其键联磷为Rp。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是手性受控的且其键联磷为Sp。
如天然DNA和RNA中的典型连接是核苷酸间键联与两个糖(其可以是未修饰的或如本文所述的修饰的)形成键。在许多实施例中，如本文所例举的，核苷酸间键联通过其氧原子或杂原子与在其5'碳处的一个任选地修饰的核糖或脱氧核糖和在其3'碳处的另一个任选地修饰的核糖或脱氧核糖形成键。在一些实施例中，通过核苷酸间键联连接的每个核苷单元独立地包含核碱基，所述核碱基独立地是任选地经取代的A、T、C、G或U，或A、T、C、G或U的任选地经取代的互变异构体。
如本领域技术人员所理解的，根据本披露，可以利用许多其他类型的核苷酸间键联，例如，在以下中描述的那些：美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,177,195；5,023,243；5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,188,897；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,423；5,264,564；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,938；5,405,939；5,434,257；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,466,677；5,470,967；5,476,925；5,489,677；5,519,126；5,536,821；5,541,307；5,541,316；5,550,111；5,561,225；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,625,050；5,633,360；5,64,562；5,663,312；5,677,437；5,677,439；6,160,109；6,239,265；6,028,188；6,124,445；6,169,170；6,172,209；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；或RE39464。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联描述于以下中：US 9394333、US9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US 10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US 2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784和/或WO 2019/032612，其各自的核碱基、糖、核苷酸间键联，手性助剂/试剂以及寡核苷酸合成技术(试剂、条件、循环等)通过引用独立地并入本文。
各种类型的核苷酸间键联可以与其他结构元件例如糖组合使用，以实现所需的寡核苷酸特性和/或活性。例如，本发明在设计寡核苷酸时通常利用修饰的核苷酸间键联和修饰的糖，任选地具有天然磷酸酯键和天然糖。在一些实施例中，本披露提供了包含一个或多个修饰的糖的寡核苷酸。在一些实施例中，本披露提供了包含一个或多个修饰的糖和一个或多个修饰的核苷酸间键联的寡核苷酸，其中一个或多个是天然磷酸酯键联。
核碱基
根据本披露，各种核碱基可用于所提供的寡核苷酸中。在一些实施例中，核碱基是天然核碱基，最常见的是A、T、C、G和U。在一些实施例中，核碱基是修饰的核碱基，因为它不是A、T、C、G或U。在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的A、T、C、G或U，或A、T、C、G或U的经取代的互变异构体。在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的A、T、C、G或U，例如5mC、5-羟基甲基C等。在一些实施例中，核碱基是烷基取代的A、T、C、G或U。在一些实施例中，核碱基是A。在一些实施例中，核碱基是T。在一些实施例中，核碱基是C。在一些实施例中，核碱基是G。在一些实施例中，核碱基是U。在一些实施例中，核碱基是5mC。在一些实施例中，核碱基是取代的A、T、C、G或U。在一些实施例中，核碱基是A、T、C、G或U的经取代的互变异构体。在一些实施例中，取代保护核碱基中的某些官能团以最小化寡核苷酸合成过程中不希望的反应。在寡核苷酸合成中用于核碱基保护的合适技术是本领域众所周知的，并且可以根据本披露使用。在一些实施例中，修饰的核碱基改善了寡核苷酸的特性和/或活性。例如，在许多情况下，可以使用5mC代替C来调节某些不希望的生物学效应，例如免疫应答。在一些实施例中，当确定序列同一性时，将具有相同氢键模式的经取代的核碱基与未取代的核碱基相同处理，例如5mC可以与C相同处理[例如，具有5mC代替C(例如AT5mCG)的寡核苷酸被认为与在一个或多个相应位置(例如ATCG)具有C的寡核苷酸具有相同的碱基序列]。
在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个A、T、C、G或U。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个任选地经取代的A、T、C、G或U。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个5-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-甲酰基胞嘧啶或5-羧基胞嘧啶。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个5-甲基胞苷。在一些实施例中，寡核苷酸中的每个核碱基选自由以下组成的组：任选地经取代的A、T、C、G和U，以及A、T、C、G和U的任选地经取代的互变异构体。在一些实施例中，寡核苷酸中的每个核碱基是任选地受保护的A、T、C、G和U。在一些实施例中，寡核苷酸中的每个核碱基是任选地经取代的A、T、C、G或U。在一些实施例中，寡核苷酸中的每个核碱基选自由以下组成的组：A、T、C、G、U和5mC。在一些实施例中，核碱基是次黄嘌呤。
在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的2AP或DAP。在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的2AP。在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的DAP。在一些实施例中，核碱基是2AP。在一些实施例中，核碱基是DAP。
在一些实施例中，核碱基是天然核碱基或衍生自天然核碱基的修饰的核碱基。实例包括任选地其各自的氨基基团被酰基保护基团保护的尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤，2-氟尿嘧啶，2-氟胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，2,6-二氨基嘌呤，氮杂胞嘧啶，嘧啶类似物(如假异胞嘧啶和假尿嘧啶)，以及其他修饰的核碱基(如8-取代的嘌呤、黄嘌呤、或次黄嘌呤，后两个是天然降解产物)。修饰的核碱基的某些实例披露于Chiu和Rana,RNA,2003,9,1034-1048；Limbach等人Nucleic Acids Research[核酸研究],1994,22,2183-2196；以及Revankar和Rao,Comprehensive Natural Products Chemistry[天然产物综合化学],第7卷,313中。在一些实施例中，经修饰的核碱基是取代的尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤。在一些实施例中，修饰的核碱基是尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤的例如就氢键合和/或碱基配对而言的功能替换物。在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶或鸟嘌呤。在一些实施例中，核碱基是尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶或鸟嘌呤。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含一个或多个5-甲基胞嘧啶。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，所述寡核苷酸的碱基序列在本文中例如在表A1中披露，其中每个T可以独立地被U替换，并且反之亦然。在一些实施例中，在提供的寡核苷酸中，一个或多个C独立地被修饰为5mC。如本领域技术人员所理解的，在一些实施例中，就寡核苷酸的碱基序列而言，可以将5mC视为C-这种寡核苷酸在C位置包含核碱基修饰(例如，参见表A1中的各种寡核苷酸)。
在一些实施例中，核碱基是描述于US 9394333、US 9744183、US 9605019、US9598458、US 9982257、US 10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784和/或WO 2019/032612中的核碱基，其各自的核碱基通过引用并入本文。
糖
根据本披露，可以使用各种糖，包括修饰的糖。在一些实施例中，本披露任选地与其他结构元件(例如，核苷酸间键联修饰及其模式，其骨架手性中心模式等)组合地提供糖修饰及其模式，所述其他结构元件在掺入寡核苷酸时可以提供改善的特性和/或活性。
最常见的天然存在的核苷包括连接到核碱基腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)的核糖(例如在RNA中)或脱氧核糖(例如在DNA中)。在一些实施例中，糖，例如表A1中许多寡核苷酸中的各种糖(除非另外说明)，是天然DNA糖(在DNA核酸或寡核苷酸中，具有结构
Figure BDA0003456638050001201
其中核碱基连接至1'位并且3'和5'位连接至核苷酸间键联(如本领域技术人员所理解的，如果在寡核苷酸的5'端，则5'位可以连接至5'端基(例如-OH)，并且如果在寡核苷酸的3'端，则3'位可以连接至3'端基(例如-OH)。在一些实施例中，糖是天然RNA糖(在RNA核酸或寡核苷酸中，具有结构
Figure BDA0003456638050001202
其中核碱基连接至1'位并且3'和5'位连接至核苷酸间键联(如本领域技术人员所理解的，如果在寡核苷酸的5'端，则5'位可以连接至5'端基(例如-OH)，并且如果在寡核苷酸的3'端，则3'位可以连接至3'端基(例如-OH)。在一些实施例中，糖是修饰的糖，因为它不是天然DNA糖或天然RNA糖。尤其是，修饰的糖可提供改善的稳定性。在一些实施例中，修饰的糖可用于改变和/或优化一种或多种杂交特征。在一些实施例中，修饰的糖可用于改变和/或优化靶标识别。在一些实施例中，修饰的糖可以用于优化Tm。在一些实施例中，修饰的糖可用于改善寡核苷酸活性。
糖可以在各个位置结合到核苷酸间键联上。作为非限制性实例，核苷酸间键联可以键合至糖的2'、3'、4'或5'位。在一些实施例中，如天然核酸中最常见的，核苷酸间键联与在5'位的一个糖和在3'位的另一个糖连接，除非另有说明。
在一些实施例中，糖是任选地经取代的天然DNA或RNA糖。在一些实施例中，糖是任选地经取代的
Figure BDA0003456638050001211
在一些实施例中，2’位置是任选地经取代的。在一些实施例中，糖是
Figure BDA0003456638050001212
在一些实施例中，糖具有
Figure BDA0003456638050001213
的结构，其中R1s、R2s、R3s、R4s和R5s各自独立地是-H、合适的取代基或合适的糖修饰(例如，US 9394333、US9744183、US 9605019、US 9982257、US 20170037399、US 20180216108、US 20180216107、US9598458、WO 2017/062862、WO 2018/067973、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/098264、WO 2018/022473、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO2019/032612、WO 2019/055951和/或WO2019/075357中描述的那些，其各自的取代基、糖修饰、R1s、R2s、R3s、R4s和R5s的描述和修饰的糖通过引用独立地并入本文)。在一些实施例中，R1s、R2s、R3s、R4s和R5s各自独立地是Rs，其中每个Rs独立地是-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-N3、-NO、-NO2、-Ls-R’、-Ls-OR’、-Ls-SR’、-Ls-N(R’)2、-O-Ls-OR’、-O-Ls-SR’、或-O-Ls-N(R’)2，其中每个R’独立地如本文所述，并且每个Ls独立地是共价键或任选地经取代的二价C1-6脂肪族或具有1至4个杂原子的杂脂肪族；或两个Rs一起形成桥-Ls-。在一些实施例中，R’是任选地经取代的C1-10脂肪族。在一些实施例中，糖具有
Figure BDA0003456638050001214
的结构。在一些实施例中，R4s是-H。在一些实施例中，糖具有
Figure BDA0003456638050001215
的结构，其中R2s是-H、卤素、或-OR，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R2s是-H。在一些实施例中，R2s是-F。在一些实施例中，R2s是-OMe。在一些实施例中，经修饰的核苷是mA、mT、mC、m5mC、mG、mU等，其中R2s是-OMe。在一些实施例中，R2s是-OCH2CH2OMe。在一些实施例中，经修饰的核苷是Aeo、Teo、Ceo、m5Ceo、Geo、Ueo等，其中R2s是-OCH2CH2OMe。
在一些实施例中，糖具有
Figure BDA0003456638050001221
的结构，其中R2s和R4s一起形成-Ls-，其中Ls是共价键或任选地经取代的二价C1-6脂肪族或具有1至4个杂原子的杂脂肪族。在一些实施例中，每个杂原子独立地选自氮、氧或硫)。在一些实施例中，Ls是任选地经取代的C2-O-CH2-C4。在一些实施例中，Ls是C2-O-CH2-C4。在一些实施例中，Ls是C2-O-(R)-CH(CH2CH3)-C4。在一些实施例中，Ls是C2-O-(S)-CH(CH2CH3)-C4。
在一些实施例中，糖是双环糖，例如如本披露中所述的其中R2s和R4s一起形成连接的糖。在一些实施例中，糖选自LNA糖、BNA糖、cEt糖等。在一些实施例中，桥在2'和4'-碳原子之间(对应于R2s和R4s与居于它们之间的原子一起形成如本文所述的任选地经取代的环)。在一些实施例中，双环糖的实例包括α-L-亚甲基氧基(4'-CH2-O-2’)LNA、β-D-亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')LNA、亚乙基氧基(4'-(CH2)2-O-2’)LNA、氨基氧基(4'-CH2-O-N(R)-2’)LNA和氧基氨基(4'-CH2-N(R)-O-2’)LNA。在一些实施例中，双环糖，例如LNA或BNA糖，是在两个糖碳之间具有至少一个桥的糖。在一些实施例中，核苷中的双环糖可以具有α-L-呋喃核糖或β-D-呋喃核糖的立体化学构型。在一些实施例中，糖是WO1999014226中描述的糖。在一些实施例中，4’-2’双环糖或4’至2’双环糖是包含呋喃糖环的双环糖，所述呋喃糖环包含连接糖环的2’碳原子和4’碳原子的桥。在一些实施例中，双环糖，例如LNA或BNA糖，在两个呋喃戊糖基糖碳之间包含至少一个桥。在一些实施例中，LNA或BNA糖在4'和2'呋喃戊糖基糖碳之间包含至少一个桥。
在一些实施例中，双环糖是以下各项的糖：α-L-亚甲基氧基(4'-CH2-O-2’)BNA、β-D-亚甲基氧基(4'-CH2-O-2’)BNA、亚乙基氧基(4'-(CH2)2-O-2’)BNA、氨基氧基(4'-CH2-O-N(R)-2’)BNA、氧氨基(4'-CH2-N(R)-O-2’)BNA、甲基(亚甲基氧基)(4'-CH(CH3)-O-2’)BNA(也称为受限制的乙基或cEt)、亚甲基-硫基(4'-CH2-S-2’)BNA、亚甲基-氨基(4'-CH2-N(R)-2’)BNA、甲基碳环(4'-CH2-CH(CH3)-2’)BNA、亚丙基碳环(4'-(CH2)3-2’)BNA或乙烯基BNA。
在一些实施例中，糖修饰是2’-OMe、2’-MOE、2’-LNA、2’-F、5’-乙烯基或S-cEt。在一些实施例中，修饰的糖是FRNA糖、FANA糖或吗啉代糖。在一些实施例中，寡核苷酸包含核酸类似物，例如GNA、LNA、PNA、TNA、F-HNA(F-THP或3'-氟四氢吡喃)、MNA(甘露醇核酸，例如Leumann 2002Bioorg.Med.Chem.[生物有机化学与医药化学杂志]10:841-854)、ANA(安尼妥(anitol)核酸)或吗啉代或其一部分。在一些实施例中，糖修饰用另一个环状或无环状部分代替天然糖。此类部分的实例在本领域中是众所周知的，例如用于吗啉代、二醇核酸等中的那些，并且可以根据本披露使用。如本领域技术人员所理解的，当与修饰的糖一起使用时，在一些实施例中，核苷酸间键联可以被修饰，例如在吗啉代、PNA等中。
在一些实施例中，糖是在6-位具有(R)或(S)手性的6’-修饰的双环糖，例如在US7399845中描述的那些。在一些实施例中，糖是在5-位具有(R)或(S)手性的5’-修饰的双环糖，例如在US 20070287831中描述的那些。
在一些实施例中，修饰的糖在2'位含有一个或多个取代基(通常是一个取代基，并且通常在轴向位置)，其独立地选自-F；-CF3、-CN、-N3、-NO、-NO2、-OR'、-SR'、或-N(R')2，其中每个R'独立地是任选地经取代的C1-10脂肪族；-O-(C1-C10烷基)、-S-(C1-C10烷基)、-NH-(C1-C10烷基)、或-N(C1-C10烷基)2；-O-(C2-C10烯基)、-S-(C2-C10烯基)、-NH-(C2-C10烯基)、或-N(C2-C10烯基)2；-O-(C2-C10炔基)、-S-(C2-C10炔基)、-NH-(C2-C10炔基)、或-N(C2-C10炔基)2；或-O--(C1-C10亚烷基)-O--(C1-C10烷基)、-O-(C1-C10亚烷基)-NH-(C1-C10烷基)或-O-(C1-C10亚烷基)-NH(C1-C10烷基)2、-NH-(C1-C10亚烷基)-O-(C1-C10烷基)、或-N(C1-C10烷基)-(C1-C10亚烷基)-O-(C1-C10烷基)，其中烷基、亚烷基、烯基和炔基各自独立且任选地经取代。在一些实施例中，取代基是-O(CH2)nOCH3、-O(CH2)nNH2、MOE、DMAOE或DMAEOE，其中n是1至约10。在一些实施例中，修饰的糖描述于以下中的修饰的糖：WO 2001/088198；和Martin等人,Helv.Chim.Acta[赫尔维蒂卡化学杂志],1995,78,486-504。在一些实施例中，经修饰的糖包含一个或多个选自以下的基团：取代的甲硅烷基、裂解RNA的基团、报告基团、荧光标记、嵌入剂、用于改善核酸的药代动力学特性的基团、用于改善核酸的药效学特性的基团、或其他具有类似特性的取代基。在一些实施例中，在2'、3'、4'或5'位的一个或多个上进行修饰，包括在3'末端核苷上的糖的3'位或在5’末端核苷的5’位。
在一些实施例中，修饰的糖是核糖，其2’-OH被选自以下的基团(例如，R2s)替换：-F；-CF3、-CN、-N3、-NO、-NO2、-OR'、-SR'、或-N(R')2，其中每个R'独立地描述于本披露中；-O-(C1-C10烷基)、-S-(C1-C10烷基)、-NH-(C1-C10烷基)、或-N(C1-C10烷基)2；-O-(C2-C10烯基)、-S-(C2-C10烯基)、-NH-(C2-C10烯基)、或-N(C2-C10烯基)2；-O-(C2-C10炔基)、-S-(C2-C10炔基)、-NH-(C2-C10炔基)、或-N(C2-C10炔基)2；或-O--(C1-C10亚烷基)-O--(C1-C10烷基)、-O-(C1-C10亚烷基)-NH-(C1-C10烷基)或-O-(C1-C10亚烷基)-NH(C1-C10烷基)2、-NH-(C1-C10亚烷基)-O-(C1-C10烷基)、或-N(C1-C10烷基)-(C1-C10亚烷基)-O-(C1-C10烷基)，其中烷基、亚烷基、烯基和炔基各自独立且任选地经取代。在一些实施例中，2'-OH被-H(脱氧核糖)替换。在一些实施例中，2'-OH被-F替换。在一些实施例中，2'-OH被-OR'替换。在一些实施例中，2'-OH被-OMe替换。在一些实施例中，2'-OH被-OCH2CH2OMe替换。
在一些实施例中，糖修饰是2'-修饰。常用的2'-修饰包括但不限于2'-OR，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，修饰是2’-OR，其中R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，修饰是2'-OMe。在一些实施例中，修饰是2'-MOE。在一些实施例中，2'-修饰是S-cEt。在一些实施例中，修饰的糖是LNA糖。在一些实施例中，2'-修饰是-F。在一些实施例中，2'-修饰是FANA。在一些实施例中，2'-修饰是FRNA。在一些实施例中，糖修饰是5’-修饰，例如5’-Me。在一些实施例中，糖修饰改变糖环的大小。在一些实施例中，糖修饰是FHNA中的糖部分。
在一些实施例中，糖修饰用另一个环状或无环状部分替换糖部分。这类部分的实例是本领域广泛已知的，包括但不限于吗啉基(任选地具有其二氨基磷酸酯键联)、二醇核酸等中所使用的那些部分。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸的一个或多个糖被修饰。在一些实施例中，寡核苷酸的每个糖被独立地修饰。在一些实施例中，修饰的糖包含2’-修饰。在一些实施例中，每个修饰的糖独立地包含2’-修饰。在一些实施例中，2'-修饰是2'-OR，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，2’-修饰是2’-OMe。在一些实施例中，2’-修饰是2’-MOE。在一些实施例中，2’-修饰是LNA糖修饰。在一些实施例中，2’-修改是2’-F。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2’-修饰。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2'-OR。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2'-OR，其中R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，每个糖修饰是2’-OMe。在一些实施例中，每个糖修饰是2’-MOE。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2'-OMe或2'-MOE。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2’-OMe、2’-MOE或LNA糖。
在一些实施例中，修饰的糖是任选地经取代的ENA糖。在一些实施例中，糖是在以下中描述的糖：例如Seth等人,J Am Chem Soc.[美国化学学会杂志]2010年10月27日；132(42):14942-14950。在一些实施例中，修饰的糖是在XNA(异种核酸(xenonucleic acid))中的糖，例如阿拉伯糖、无水己糖醇、苏糖、2'氟阿拉伯糖或环己烯。
修饰的糖包括代替呋喃戊糖基糖的环丁基或环戊基部分。这种修饰的糖的代表性实例包括在US 4,981,957、US 5,118,800、US 5,319,080或US 5,359,044中描述的那些。在一些实施例中，核糖环内的氧原子被氮、硫、硒或碳替换。在一些实施例中，-O-被-N(R’)-、-S-、-Se-或-C(R’)2-替换。在一些实施例中，修饰的糖是修饰的核糖，其中核糖环内的氧原子被氮替换，且其中氮任选地被烷基基团(例如甲基、乙基、异丙基等)取代。
在一些实施例中，糖通过核苷酸间键联(在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联)连接。在一些实施例中，核苷酸间键联不包含键联磷。在一些实施例中，核苷酸间键联是-L-。在一些实施例中，核苷酸间键联是-OP(O)(-C≡CH)O-、-OP(O)(R)O-(例如，R是-CH3)、3’-NHP(O)(OH)O-5’、3’-OP(O)(CH3)OCH2-5’、3’-CH2C(O)NHCH2-5’、3’-SCH2OCH2-5’、3’-OCH2OCH2-5’、3’-CH2NR’CH2-5’、3’-CH2N(Me)OCH2-5’、3’-NHC(O)CH2CH2-5’、3’-NR’C(O)CH2CH2-5’、3’-CH2CH2NR’-5’、3’-CH2CH2NH-5’、或3’-OCH2CH2N(R’)-5’。在一些实施例中，5’碳可以任选地被＝O取代。
在一些实施例中，修饰的糖是任选地经取代的戊糖或己糖。在一些实施例中，修饰的糖是任选地经取代的戊糖。在一些实施例中，修饰的糖是任选地经取代的己糖。在一些实施例中，修饰的糖是任选地经取代的核糖或己糖醇。在一些实施例中，修饰的糖是任选地经取代的核糖。在一些实施例中，修饰的糖是任选地经取代的己糖醇。
在一些实施例中，糖修饰是5'-乙烯基(R或S)、5'-甲基(R或S)、2'-SH、2'-F、2'-OCH3、2'-OCH2CH3、2'-OCH2CH2F或2’-O(CH2)20CH3。在一些实施例中，在2’位上的取代基，例如2’-修饰基团是烯丙基、氨基、叠氮基、硫基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、OCF3、OCH2F、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)和O-CH2-C(＝O)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)，其中每个烯丙基、氨基和烷基任选地经取代，并且Rl、Rm和Rn各自独立地是如本披露中所述的R'。在一些实施例中，Rl、Rm和Rn各自独立地是-H或任选地经取代的C1-C10烷基。
在一些实施例中，糖是四氢吡喃或THP糖。在一些实施例中，修饰的核苷是四氢吡喃核苷或THP核苷(其是用六元四氢吡喃糖替代典型的天然核苷中的呋喃戊糖基残基的核苷)。THP糖和/或核苷包括用于己糖醇核酸(HNA)、安尼妥(anitol)核酸(ANA)、甘露醇核酸(MNA)(例如，Leumann,Bioorg.Med.Chem.[生物有机化学与医药化学],2002,10,841-854)或氟代HNA(F-HNA)的那些。
在一些实施例中，糖包含具有多于5个原子和/或多于一个杂原子的环，例如吗啉代糖。
如本领域技术人员将理解的，糖、核碱基、核苷酸间键联等的修饰可以并且经常与寡核苷酸(例如参见表A1中的各种寡核苷酸)组合使用。例如，糖修饰和核碱基修饰的组合是2'-F(糖)5-甲基(核碱基)修饰的核苷。在一些实施例中，组合是用S替换核糖基环氧原子并在2'-位置取代。
在一些实施例中，2'-修饰的糖是在2'位被修饰的呋喃糖基糖。在一些实施例中，2’-修饰是卤素、-R’(其中R’不是-H)、-OR’(其中R’不是-H)、-SR’、-N(R’)2、任选地经取代的-CH2-CH＝CH2、任选地经取代的烯基或任选地经取代的炔基。在一些实施例中，2’-修饰选自-O[(CH2)nO]mCH3、-O(CH2)nNH2、-O(CH2)nCH3、-O(CH2)nF、-O(CH2)nONH2、-OCH2C(＝O)N(H)CH3和-O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中每个n和m独立地是1至约10。在一些实施例中，2'-修饰是任选地经取代的C1-C12烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷芳基、任选地经取代的芳烷基、任选地经取代的-O-烷芳基，任选地经取代的-O-芳烷基，-SH、-SCH3、-OCN、-Cl、-Br、-CN、-F、-CF3、-OCF3、-SOCH3、-SO2CH3、-ONO2、-NO2、-N3、-NH2、任选地经取代的杂环烷基，任选地经取代的杂环烷芳基、任选地经取代的氨基烷基氨基，任选地经取代的聚烷基氨基，经取代的甲硅烷基，报告基团，嵌入剂，用于改善药代动力学特性的基团，用于改善药效学特性的基团和其他取代基。在一些实施例中，2’-修饰是2’-MOE修饰。
在一些实施例中，2’-修饰的或2’-取代的糖或核苷是在糖的2’位包含除-H(通常不视为取代基)或-OH以外的取代基的糖或核苷。在一些实施例中，2’-修饰的糖是双环糖，其包含连接糖环的两个碳原子(其中一个是2’碳)的桥。在一些实施例中，2’-修饰是非桥联的，例如烯丙基，氨基，叠氮基，硫代，任选地经取代的-O-烯丙基，任选地经取代的-O-C1-C10烷基，-OCF3，-O(CH2)2OCH3、2’-O(CH2)2SCH3、-O(CH2)2ON(Rm)(Rn)或-OCH2C(＝O)N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地是-H或任选地经取代的C1-C10烷基。
在一些实施例中，糖是N-甲醇卡巴(N-methanocarba)、LNA、cMOE BNA、cEt BNA、α-L-LNA或相关类似物、HNA、Me-ANA、MOE-ANA、Ara-FHNA、FHNA、R-6'-Me-FHNA、S-6'-Me-FHNA、ENA或c-ANA。在一些实施例中，修饰的核苷酸间键联是C3-酰胺(例如，具有与C3’连接的酰胺修饰的糖，Mutisya等人2014Nucleic Acids Res.[核酸研究]2014年6月1日；42(10):6542-6551)，甲缩醛，硫代甲缩醛，MMI[例如，亚甲基(甲基亚氨基)，Peoc'h等人2006Nucleosides and Nucleotides[核苷与核苷酸]16(7-9)]，PMO(二氨基磷酸酯连接的吗啉代)键联(其连接两个糖)或PNA(肽核酸)键联。
在一些实施例中，糖是描述于US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US 10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US 2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、和/或WO 2019/032612中的糖，其各自的糖通过引用并入本文。
可用于制备寡核苷酸或其类似物的各种另外的糖是本领域已知的，并且可以根据本披露使用。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可包含本文中所描述或本技术领域中已知的任何糖。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可包含本文中所描述或本技术领域中已知的任何糖与本文中所描述的任何其他结构元件或修饰的组合，该任何其他结构元件或修饰包括但不限于碱基序列或其部分、碱基；核苷酸间键联；立体化学或其模式；另外的化学部分，包括但不限于靶向部分等；糖、碱基或核苷酸间键联的修饰模式；其形式或任何结构元件；和/或本文所述的任何其他结构元件或修饰；且在一些实施例中，本披露涉及任何此类寡核苷酸的多聚体。
寡核苷酸和组合物的产生
各种方法可以用于产生寡核苷酸和组合物，并且可以根据本披露使用。例如，传统的亚磷酰胺化学可用于制备立体随机的寡核苷酸和组合物，并且某些试剂和手性受控的技术可用于制备手性受控的寡核苷酸组合物，例如如以下中所描述：US 9394333、US9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US 10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US 2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、和/或WO 2019/032612，其各自的试剂和方法通过引用并入本文。
在一些实施例中，寡核苷酸及其组合物的手性受控/立体选择性制备包括利用手性助剂，例如作为单体亚磷酰胺的一部分。此类手性助剂和亚磷酰胺的实例描述于以下中：US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US 10160969、US10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US 2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO2019/200185、WO 2019/217784、和/或WO 2019/032612，其各自的手性助剂和亚磷酰胺通过引用独立地并入本文。在一些实施例中，手性助剂是
Figure BDA0003456638050001281
(DPSE手性助剂)。在一些实施例中，手性助剂是
Figure BDA0003456638050001282
在一些实施例中，手性助剂是
Figure BDA0003456638050001283
在一些实施例中，手性助剂包含-SO2RAU，其中RAU是选自以下的任选地经取代的基团：C1-20脂肪族、具有1-10个杂原子的C1-20杂脂肪族、C6-20芳基、C6-20芳基脂肪族、具有1-10个杂原子的C6-20芳基杂脂肪族、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基、以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基。在一些实施例中，手性助剂是
Figure BDA0003456638050001291
Figure BDA0003456638050001292
在一些实施例中，RAU是任选地经取代的芳基。在一些实施例中，RAU是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，RAU是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，手性助剂是
Figure BDA0003456638050001293
Figure BDA0003456638050001294
(PSM手性助剂)。在一些实施例中，此类手性助剂，包含此类手性助剂的亚磷酰胺，包含此类助剂的中间寡核苷酸的利用(例如制备)、保护、去除等描述于US 9394333、US 9744183、US 9605019、US9598458、US 9982257、US 10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、和/或WO 2019/032612中，并通过引用并入本文。
在一些实施例中，手性受控的制备技术(包括寡核苷酸合成循环、试剂和条件)描述于以下中：US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US 2019/0127733、US10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO 2018/223056、WO2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、和/或WO 2019/032612，其各自的寡核苷酸合成方法、循环、试剂和条件通过引用独立地并入本文。
一旦合成，通常将进一步纯化寡核苷酸和组合物。合适的纯化技术是本领域技术人员众所周知的和实践的，包括但不限于在以下中描述的那些：US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US 10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US2018/0216107、US 2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US2019/0375774、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、和/或WO 2019/032612，其各自的纯化技术通过引用独立地并入本文。
在一些实施例中，循环包括偶联、加帽、修饰和解嵌段或由其组成。在一些实施例中，循环包括偶联、加帽、修饰、加帽和解嵌段或由其组成。这些步骤通常以其列出的顺序执行，但是在一些实施例中，如本领域技术人员所理解的，可以改变某些步骤的顺序，例如加帽和修饰。如果需要，可以重复一个或多个步骤以提高转化率、产率和/或纯度，如本领域技术人员通常在合成中所进行的。例如，在一些实施例中，可以重复进行偶联；在一些实施例中，可以重复进行修饰(例如，氧化以安装＝O，硫化以安装＝S，等等)；在一些实施例中，在修饰后重复进行偶联，其可以将P(III)键联转化为在某些情况下可以更稳定的P(V)键联，并且偶联后通常进行修饰以转化新形成的P(III)键联为P(V)键联。在一些实施例中，当重复步骤时，可以采用不同的条件(例如，浓度、温度、试剂、时间等)。
在一些实施例中，寡核苷酸连接至固体支持物。在一些实施例中，固体支持物是寡核苷酸合成的支持物。在一些实施例中，固体支持物包括玻璃。在一些实施例中，固体支持物是CPG(可控孔度玻璃)。在一些实施例中，固体支持物是聚合物。在一些实施例中，固体支持物是聚苯乙烯。在一些实施例中，固体支持物是高度交联的聚苯乙烯(HCP)。在一些实施例中，固体支持物是可控孔度玻璃(CPG)和高度交联的聚苯乙烯(HCP)的杂合支持物。在一些实施例中，固体支持物是金属泡沫。在一些实施例中，固体支持物是树脂。在一些实施例中，从固体支持物上切割寡核苷酸。
用于配制所提供的寡核苷酸和/或制备药物组合物的技术，例如用于经由各种途径施用给受试者的技术，在本领域中是容易获得的，并且可以根据本披露使用，例如描述于以下中的那些：US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US 2019/0127733、US10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO 2018/223056、WO2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、和/或WO 2019/032612。
生物应用
如本文中所描述，所提供的组合物及方法能够改善RNA的敲低，包括C9orf72 RNA转录物的敲低。在一些实施例中，所提供的组合物及方法相比于参考条件提供C9orf72转录物(包括但不限于包含重复扩增的那些转录物)的经改善敲低，该参考条件是选自由不存在所述组合物、存在参考组合物及其组合组成的组。
在一些实施例中，相对于野生型或不含重复扩增的C9orf72基因或基因产物(例如，不含六核苷酸重复扩增的C9orf72基因或基因产物)，C9orf72寡核苷酸能够优先降低突变型或含有重复扩增的C9orf72基因或基因产物(例如，包含六核苷酸重复扩增的C9orf72基因或基因产物)的表达、水平和/或活性(敲低)。
在多个实施例中，总转录物包括正常(健康的，不具有重复扩增)和突变型(病理性，包含重复扩增)的V2、V3和V1。各种转录物图解说明于图1中。据报导，V1以极低水平经转录(约是总C9orf72转录物的1％)，且不会明显增加包含六核苷酸重复扩增的转录物的水平，或增加V3转录物分析中所检测的转录物水平。
V1、V2及V3是通过替代性mRNA前体剪接所制造的C9orf72转录物的自然产生的mRNA前体变体。DeJesus-Hernandez等人2011。在变体1及3中，经扩增GGGGCC重复位于两个替代性地剪接外显子之间的内含子中，而在变体2中，重复位于启动子区域中且因此不存在于转录物中。V1是C9orf72变体1转录物，其代表最短的转录物且编码较短的C9orf72蛋白质(同种型b)，参见NM_145005.5。V2是C9orf72变体2转录物，其与变体1相比在5'UTR及3'编码区及UTR中不同。所得C9orf72蛋白质(同种型a)与同种型1相比更长。变体2及3编码相同的C9orf72蛋白质；参见NM_018325.3。V3是C9orf72变体3转录物，其与变体1相比在5'UTR及3'编码区及UTR中不同。所得C9orf72蛋白质(同种型a)与同种型1相比更长；变体2及3编码相同的蛋白质，参见NM_001256054.1。转录物变体1及3经预测编码由C9orf72外显子2-11编码的481个氨基酸长的蛋白质(NP_060795.1；同种型a)；而变体2经预测编码由外显子2-5编码的较短222个氨基酸的蛋白质(NP_659442.2；同种型b)。应注意，根据一些报导，V1、V2及V3转录物不是同等丰富的；据报导，V2是主要转录物，代表90％的总转录物，V3代表9％，且V1代表1％。因此，在不受任何特定理论限制的情况下，本披露提出由一些C9orf72寡核苷酸介导的总转录物减少包括含有重复扩增的转录物的敲低的呈现。数据展示许多C9orf72寡核苷酸由此能够介导含有重复扩增的C9orf72转录物相对于不含重复扩增的C9orf72转录物的优选的敲低。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可优选地敲低或降低突变(例如，含有重复扩增的)V3 C9orf72转录物相对于总C9orf72转录物的表达、水平和/或活性。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸能够介导自重复扩增翻译的DPR蛋白质的表达、活性和/或水平降低。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸能够介导C9orf72基因产物的表达、活性和/或水平降低。在一些实施例中，C9orf72基因产物是蛋白质，诸如二肽重复(DPR)蛋白质。在一些实施例中，DPR可通过含有重复的C9orf72转录物的六个阅读框中的任一者的RAN翻译来制造。在一些实施例中，二肽重复蛋白质经由六核苷酸重复区域的有义或反义链的RNA(重复相关及非ATG依赖性翻译)来产生。DPR蛋白质描述于例如Zu等人2011Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]108:260-265；Zu等人Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.[美国科学院院刊]2013Dec17；110(51):E4968-77；Lopez-Gonzalez等人,2016,Neuron[神经元]92,1-9；May等人Acta Neuropathol[神经病理学报](2014)128:485-503；和Freibaum等人2017Front.Mol.Neurosci.[分子神经科学前沿]10,文章35；和Westergard等人,2016,Cell Reports[细胞报告]17,645-652中。在一些实施例中，C9orf72二肽重复是或包含以下中的任一者：聚-(脯氨酸-丙氨酸)(聚PA或)或聚-(丙氨酸-脯氨酸)或(聚AP)；聚-(脯氨酸-精氨酸)(聚PR)或聚-(精氨酸-脯氨酸)(聚RP)；或聚-(脯氨酸-甘氨酸)(聚PG)或聚-(甘氨酸-脯氨酸)(聚GP)。据报导聚GA在C9orf72脑中充分表达，之后是聚GP及聚GR，而由反义转录物的翻译造成的聚PA及聚PR是罕见的。据报导，聚GA及另一DPR物种在细胞之间传输且DPR摄取如何影响接受细胞。Zhou等人检测所有疏水性DPR物种是细胞至细胞传输且展示聚GA升高重复RNA水平及DPR表达，从而证实DPR传输可触发恶性循环；用抗GA抗体处理细胞降低DPR的细胞内聚集。Zhou等人2017.EMBO Mol.Med.[EMBO分子医学]9(5):687-702。Chang等人报导甘氨酸-丙氨酸二肽重复蛋白质形成具有细胞至细胞传输特性的毒性淀粉样蛋白。Chang等人2016.J.Biol.Chem.[生物化学杂志]291:4903-4911。
在一些实施例中，DPR蛋白质是聚GP。作为非限制性实例，DPR蛋白质的氨基酸序列是或包含以下中的任一者：
GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAWSGRARGRARGGAAVAVPAPA-AAEAQAVASG、
GPGPGPGPGPGPGPGPGPGRGRGGPGGGPGAGLRLRCLRPRRRRRRR-WRVGE、或
GRGRGRGRGRGRGRGRGRGVVGAGPGAGPGRGCGCGACARGGGGAGG-GEWVSEEAASWRVAVWGSAAGKRRG(来自有义框)；或
PRPRPRPRPR-PRPRPRPRPLARDS、GPGPGPGPGPGPGPGPGP、或PAPAPAPAPAPAPAPAPAPSARLLSS-RACYRLRLFPSLFSSG(来自反义框)。
C9orf72基因产物还包括病灶，据报道该病灶包含由多种RNA结合蛋白结合的C9orf72 RNA或其一部分的复合物(例如，经删除内含子)。病灶描述于例如Mori等人，2013Acta Neuropath.[神经病理学报]125:413-423中。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸能够介导包含病灶的细胞数目，和/或每个细胞的病灶数目降低。
作为非限制性实例数据，在小鼠中施用C9orf72寡核苷酸WV-7658及WV-7659显示脊髓前角中的每100个运动神经元细胞核计数的病灶数目降低51.8％及62.2％[与PBS(阴性对照)相比]；大于5个病灶/细胞的细胞数目分别降低58.3％及70.9％；及每100个运动神经元的病灶数目分别降低49.1％及55.0％。
在不希望受任何特定理论束缚的情况下，本披露提出V3C9orf72转录物的显著敲低和/或DPR蛋白质的表达、活性和/或水平降低和/或包含病灶的细胞数目和/或每个细胞的病灶数目减少可导致细胞病理学的显著抑制或与细胞病理学的显著抑制相关，其中根本的生物学基本原理是经扩增六核苷酸重复等位基因致使预剪接C9orf72转录物及经剪接内含子的滞留时间更长，此使其更易受到靶向寡核苷酸的内含子的影响。在不希望受任何特定理论束缚的情况下，本披露提出V3 C9orf72转录物的约50％敲低可导致对细胞病理学的约90％抑制或与细胞病理学的约90％抑制相关。
由C9orf72寡核苷酸介导的改善可是任何所需生物功能的改善，包括但不限于治疗和/或预防C9orf72相关的障碍或其症状。在一些实施例中，C9orf72相关障碍是肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、皮质基底节变性综合征(CBD)、非典型帕金森综合征、橄榄体桥脑小脑变性(OPCD)、原发性侧索硬化症(PLS)、进行性肌萎缩症(PMA)、拟表型亨廷顿氏病(HD)、阿尔兹海默病(AD)、双相障碍、精神分裂症或其他非运动障碍。在一些实施例中，C9orf72相关障碍的症状是选自：躁动、焦虑、钝化情绪、食物偏好改变、能量和/或动机减少、痴呆、抑郁症、呼吸困难、吞咽困难、发音困难、呼吸困难、注意力分散、肌肉的束化和/或痉挛、平衡减弱、损伤的运动功能、不适当的社会行为、同理心缺乏、失去记忆、情绪波动、肌肉抽搐、肌无力、忽略个人卫生、重复或强迫行为、呼吸短促、言语不清、步态不稳、视觉异常、四肢虚弱。
在一些实施例中，C9orf72相关障碍的症状是词义性痴呆、语言理解减弱或使用正确或精确的语言困难。在一些实施例中，C9orf72相关障碍或其症状是皮质基底节变性综合征(CBD)、抖动、缺乏协调、肌肉僵硬和/或痉挛、进行性核上麻痹(PSP)、行走和/或平衡问题、频繁跌倒、肌肉僵硬、颈和/或上部身体中的肌肉僵硬、生理功能丧失，和/或异常眼球运动。
在一些实施例中，FTD是行为变型额颞叶痴呆(bvFTD)。在一些实施例中，在bvFTD中，据报导最显著的初始症状与人格及行为相关。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸能够降低受试者经历抑制解除的程度或速率，其随着个人关系及社会生命的限制丧失而呈现，如根据本技术领域中熟知的方法评定。
在一些实施例中，本披露提供一种治疗疾病的方法，其是通过施用包含第一多个共享共同的碱基序列包含共同的碱基序列的寡核苷酸的组合物，该核苷酸序列与靶标C9orf72转录物中的靶标序列互补，
改善包括使用立体控制的寡核苷酸组合物作为寡核苷酸组合物，所述立体控制的寡核苷酸组合物的特征在于，当其与寡核苷酸或敲低系统中的C9orf72转录物接触时，C9orf72转录物的RNA酶H介导的敲低相对于在参考条件下观测到的敲低得到改善，该参考条件选自由不存在所述组合物、存在参考组合物及其组合组成的组。
在一些实施例中，在一种或多种合适条件(例如，实例中描述的一种或多种测定；在一种或多种浓度下，例如约1、10、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、5000、7000或10000nM)下，相比由参考技术(例如，包含立体随机寡核苷酸组合物的技术，包含不同设计的寡核苷酸的手性受控的寡核苷酸组合物的技术等)提供的减少，本披露的技术提供至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、或190％更多、或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或更多倍更多靶标核酸(例如转录物)和/或由其编码的产物(例如蛋白质)(例如与病症、障碍或疾病相关的那些)的减少。
在一些实施例中，通过施用C9orf72寡核苷酸，C9orf72靶标基因或基因产物的表达或水平降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％或80％。在一些实施例中，通过施用C9orf72寡核苷酸，C9orf72转录物和/或由其编码的产物(例如，与病症、障碍或疾病相关的产物)的表达或水平降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％或80％。在一些实施例中，评估是在体外(例如在细胞中)进行的。在一些实施例中，评估在体内进行。如本领域技术人员所理解的，根据本披露，多种技术可用于评估所提供的技术(例如，寡核苷酸、组合物等)的性质和/或活性；本实例中介绍了某些此类技术)。在一些实施例中，在某些寡核苷酸浓度下(例如约1、10、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、5000、7000或10000nM)实现降低。
在一些实施例中，相较与病症、障碍或疾病不相关或较低相关的那些，本披露的技术可以选择性地降低与病症、障碍或疾病相关的C9orf72核酸和/或由其编码的产物的表达、活性和/或水平。在一些实施例中，选择性至少为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500或1000倍或更多倍。在一些实施例中，通过IC50值的比率来评估选择性，该比率可以通过适合于评估根据本披露的所提供技术的活性的多种技术(例如，实例中所述的那些)获得。
在一些实施例中，在一种或多种寡核苷酸浓度下(例如约1、10、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、5000、7000或10000nM)评估特性、活性、选择性等。
在一些实施例中，所提供技术的IC50是约或不超过约1、10、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、5000、7000或10000nM。在一些实施例中，它不超过100nM。在一些实施例中，它不超过200nM。在一些实施例中，它不超过300nM。在一些实施例中，它不超过400nM。在一些实施例中，它不超过500nM。在一些实施例中，它不超过1uM。在一些实施例中，它不超过5uM。在一些实施例中，它不超过10uM。在一些实施例中，使用实例中描述的技术评估IC50。在一些实施例中，在相关细胞中体外评估IC50。在一些实施例中，IC50被评估为动物模型。
在一些实施例中，活性和/或选择性通过转录物的水平来评估，例如与病症、障碍或疾病相关的那些转录物。在一些实施例中，活性和/或选择性通过蛋白质和/或肽的水平来评估，例如与病症、障碍或疾病相关的那些转录物。在一些实施例中，在细胞群和/或单个细胞中(例如，具有病灶的细胞百分比和/或单个细胞中病灶的水平)，活性和/或选择性通过核酸病灶(例如，RNA病灶)水平来评估，例如与病症、障碍或疾病相关的那些核酸病灶。
在一些实施例中，与病症、障碍或疾病相关的转录物包含扩增的重复序列(例如，G4C2重复序列)。在一些实施例中，扩增的G4C2重复序列在C9orf72的内含子1中。在一些实施例中，扩增的重复序列包含约或至少约30、50、100、150、200、300、或500个重复序列。在一些实施例中，与病症、障碍或疾病相关的转录物是包含扩增的重复序列的V1和/或V3(例如，图1中所说明的那些)。在一些实施例中，相较不包含扩增的重复序列的转录物和/或由其编码的产物，所提供的技术选择性地降低包含扩增的重复序列的转录物和/或由其编码的产物的表达、活性和/或水平(例如，图1中所说明的包含扩增的重复序列的V1和/或V3)。
在一些实施例中，本披露提供用于降低病灶水平的技术。在一些实施例中，病灶包含C9orf72转录物(来自一条或两条链)，其包含扩增的重复序列和/或由其编码的肽)。在一些实施例中，所提供的技术降低具有病灶的细胞的数量/百分比，和/或降低单个细胞中病灶的水平。
表征与评估
包括但不限于本技术领域中已知的许多的各种技术及工具可用于评估及测试根据本披露的C9orf72寡核苷酸。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸的功效的评估及测试可通过量化C9orf72靶标核酸或在传递C9orf72寡核苷酸之后的相对应基因产物的水平、活性、表达、等位基因特异性表达和/或细胞内分布的改变或改善来进行。在一些实施例中，递送可以经由转染剂或不经由转染剂(例如，体外(gymnotic))来进行。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸的功效的评估及测试可通过量化在引入C9orf72寡核苷酸之后的C9orf72基因产物(包括但不限于转录物、DPR或病灶)的水平、活性、表达和/或胞内改变来进行。C9orf72基因产物包括由C9orf72基因或基因座产生的RNA。
在一些实施例中，本披露提供了鉴定和/或表征寡核苷酸组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
提供至少一种包含第一多个寡核苷酸的组合物；并且
相对于参考组合物评估传递。
在一些实施例中，本披露提供了鉴定和/或表征寡核苷酸组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
提供至少一种包含第一多个寡核苷酸的组合物；并且
相对于参考组合物评估细胞摄取。
在一些实施例中，将所提供的寡核苷酸组合物的特性与参考寡核苷酸组合物进行比较。
在一些实施例中，参考寡核苷酸组合物是立体随机寡核苷酸组合物。在一些实施例中，参考寡核苷酸组合物是所有核苷酸间键联均为硫代磷酸酯的寡核苷酸的立体随机组合物。在一些实施例中，参考寡核苷酸组合物是具有所有磷酸酯键联的DNA寡核苷酸组合物。
在一些实施例中，参考组合物是具有相同碱基序列和相同化学修饰的寡核苷酸的组合物。在一些实施例中，参考组合物是具有相同碱基序列和相同化学修饰模式的寡核苷酸的组合物。在一些实施例中，参考组合物是具有相同碱基序列和化学修饰的寡核苷酸的手性不受控(或立体随机)组合物。
在一些实施例中，参考组合物是具有相同碱基序列但不同化学修饰(包括但不限于本文所述的化学修饰)的寡核苷酸的组合物。在一些实施例中，参考组合物是具有相同碱基序列但不同核苷酸间键联模式和/或核苷酸间键联的立体化学和/或化学修饰的寡核苷酸的组合物。
各种方法是本技术领域中已知的用于检测C9orf72基因产物，所述基因产物的表达、水平和/或活性可在引入施用C9orf72寡核苷酸之后经改变。作为非限制性实例：C9orf72转录物及其敲低可用qPCR量化，C9orf72蛋白质水平可经由蛋白质印迹法测定，RNA病灶通过荧光原位杂交(FISH)测定，DPR通过蛋白质印迹法、ELISA或质谱分析测定。可商购的C9orf72抗体包括抗C9orf72抗体GT779(1:2000；GeneTex,尔湾(Irvine),加利福尼亚州)。另外，可通过电生理学及NMJ形成对表达野生型和/或突变C9orf72的运动神经元(MN)执行功能测定。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸的功效的评估及测试可在细胞中体外执行。在一些实施例中，该细胞是表达C9orf72的细胞。在一些实施例中，细胞是经工程改造以表达C9orf72的SH-SY5Y(人类神经母细胞瘤)的细胞。在一些实施例中，细胞是工程改造以表达C9orf72的SH-SY5Y的细胞，如WO 2016/167780中所描述。在一些实施例中，细胞是患者衍生的细胞、患者衍生的纤维母细胞、iPSC或iPSN。在一些实施例中，细胞是iPSC衍生的神经元或运动神经元。适用于测试C9orf72寡核苷酸的各种细胞包括患者衍生的纤维母细胞、iPSC及iPSN且描述于例如Donelly等人2013Neuron[神经元]80,415-428；Sareen等人2013Sci.Trans.Med.[科学转化医学]5:208ra149；Swartz等人STEM CELLS TRANSLATIONALMEDICINE[干细胞转化医学]2016；5:1-12；和Almeida等人2013Acta Neuropathol.[神经病理学报]126:385-399中。在一些实施例中，细胞是BAC转基因小鼠衍生的细胞，包括(但不限于)小鼠胚胎纤维母细胞或皮质原始神经元。在一些实施例中，评估及测试涉及细胞群。在一些实施例中，细胞群是iCell神经元群(还称作iNeurons)、iPS细胞衍生的人类大脑皮质神经元的混合群，其呈现天然电力及生物化学活性，可购自细胞动力国际公司(CellularDynamics International),麦迪逊,威斯康星州。包括脊髓运动神经元、中脑、多巴胺激导性神经元、谷氨酸激导性神经元、GABA能神经元、混合皮质神经元、中型多棘纹状体GABA能神经元、富含小白蛋白的皮质GABA能神经元、V层皮质谷氨酸激导性神经元的另外细胞可购自BrainXell公司,麦迪逊,威斯康星州。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸的评估可在动物中执行。在一些实施例中，动物是小鼠。C9orf72小鼠模型及使用其的实验性程序描述于Hukema等人2014ActaNeuropath.Comm.[神经病理学报通讯]2:166；Ferguson等人2016J.Anat.[解剖学杂志]226:871-891；Lagier-Tourenne等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA.[美国科学院院刊]2013年11月19日；110(47):E4530-9；Koppers等人Ann.Neurol.[神经病学年鉴]2015；78:426-438；Kramer等人2016Science[科学]353:708；Liu等人,2016,Neuron[神经元]90,521-534；Peters等人,2015,Neuron[神经元]88,902-909；Picher-Martel等人ActaNeuropathologica Communications[神经病理学报通讯](2016)4:70中。C9-BAC小鼠模型描述在本文中(参见实例9)。
在一些实施例中，靶标核酸水平可通过本领域已知的任何方法量化，其中的许多方法可使用可商购的试剂盒和材料完成，且所述方法是本领域中熟知的且常规的。此类方法包括例如RNA印迹分析、竞争性聚合酶链式反应(PCR)或实时定量PCR。可对总细胞RNA或聚(A)+mRNA执行RNA分析。探针及引物经设计以与C9orf72核酸杂交。用于设计实时PCR探针和引物的方法是本领域熟知的。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸的功效的评估及测试可使用萤光素酶分析执行。此分析的非限制性实例详述于以下实例3中。在一些实施例中，萤光素酶分析采用包含键联至有义C9orf72转录物的一部分的萤光素酶基因(或其有效部分)的构建体，诸如nt 1-374或nt 158-900(此两者皆包含六核苷酸重复扩增)。在一些实施例中，nt 1-374包含外显子1a及外显子1a与1b之间的内含子。在一些实施例中，萤光素酶分析采用包含键联至反义C9orf72转录物的一部分的萤光素酶基因(或其有效部分)的构建体，诸如nt 900至1(其包含六核苷酸重复扩增)。在一些实施例中，萤光素酶分析在转染COS-7细胞中执行。
在一些实施例中，C9orf72蛋白质水平可以本技术领域中已知的任何方法评估或量化，包括但不限于酶联免疫吸附分析(ELISA)、蛋白质印迹分析(免疫印迹法)、免疫细胞化学、荧光活化细胞分选(FACS)、免疫组织化学、免疫沉淀、蛋白质活性分析(例如半胱天冬酶活性分析)及定量蛋白质分析。适用于检测小鼠、大鼠、猴及人类C9orf72的抗体是可商购的；对C9orf72的另外抗体可经由本技术领域中已知的方法来产生。
用于检测寡核苷酸或其他核酸的水平的分析法描述于本文中(例如，在实例14中)。作为非限制性实例，此分析可用于检测C9orf72寡核苷酸或所关注的任何其他核酸，包括并不靶向C9orf72及核酸的核酸或其他寡核苷酸。
C9orf72寡核苷酸的功效的评估及测试可通过测定在传递C9orf72寡核苷酸之后在细胞中的重复RNA病灶(或RNA病灶)数目的改变来体外或体内执行。重复RNA病灶是当包含六核苷酸重复的RNA隔离RNA结合蛋白时形成的结构，且是RNA介导的毒性的量度和/或原因。在一些实施例中，RNA病灶可是有义或反义RNA病灶。当C9orf72寡核苷酸体内施用至动物时，可在动物的脑或其一部分(诸如但不限于小脑、大脑皮质、海马区、丘脑、髓质或脑的任何其他部分)中测定或检测RNA病灶的存在和/或数目。每个细胞的病灶数目(例如，多达5个或大于5个)或其平均值和/或包含病灶的细胞数目可在递送C9orf72寡核苷酸之后经测定。这些数目中的任一者或所有减少表明C9orf72寡核苷酸的功效。RNA病灶可通过本技术领域中已知的方法来检测，包括但不限于荧光原位杂交(FISH)；FISH的非限制性实例呈现于实例14中。
C9orf72寡核苷酸的功效的评估及测试可通过测定传递C9orf72寡核苷酸之后在细胞中的单倍剂量不足的改变来体外执行。举例而言，当六核苷酸重复RNA对C9orf72转录和/或C9orf72基因的表达充当负面效应子时产生单倍剂量不足，由此减少C9orf72转录物或基因产物的总量。单倍剂量不足降低表明C9orf72寡核苷酸的功效。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸不显著降低C9orf72蛋白质的表达、活性和/或水平。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸降低C9orf72重复扩增或其基因产物的表达、活性和/或水平，但不显著降低C9orf72蛋白质的表达、活性和/或水平。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸(a)降低C9orf72重复扩增或其基因产物的表达、活性和/或水平，及(b)并不将C9orf72的表达、活性和/或水平降低至足以引起疾病病症的程度。与C9orf72的不充分产生相关的各种疾病病症包括不当的核内体移行、由骨髓扩增表征的稳健免疫表型、T细胞活化、浆细胞增加、自体抗体升高、免疫介导性肾小球肾病和/或自身免疫应答，如例如Farg等人2014Human Mol.Gen.[人类分子遗传学]23:3579-3595；及Atanasio等人Sci Rep.2016年3月16日；6:23204.doi:10.1038/srep23204中所描述。
C9orf72寡核苷酸的功效的评估及测试可体内执行。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可在动物中评估和/或测试。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸可在人体和/或其他动物内评估和/或测试以介导水平、活性、表达、等位基因特异性表达和/或胞内分布的改变或改善和/或以预防、治疗、减轻或减缓C9orf72相关障碍或C9orf72相关障碍中的至少一个症状的进展。在一些实施例中，此类体内评估和/或测试可在引入C9orf72寡核苷酸之后测定表型改变，诸如改善的运动功能及呼吸。在一些实施例中，运动功能可通过测定本技术领域中已知的各种测试中的任一者的改变来测量，所述测试包括：平衡杆、握力强度、后肢足迹测试(例如，在动物中)、旷场性能、爬杆，及旋杆。在一些实施例中，呼吸可通过以本技术领域中已知的各种测试中的任一者测定改变来测量，包括：符合性测量、抗侵入性及全身体积描记。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸的功效的测试通过使来自患有神经疾病的受试者的运动神经元细胞与C9orf72寡核苷酸接触且判定运动神经元细胞是否退化来完成。若运动神经元细胞不退化，则C9orf72寡核苷酸可能够降低或抑制运动神经元退化。所述运动神经元细胞可衍生自多能干细胞。多能干细胞可能已经自受试者的细胞再程序化。来自受试者的细胞可以是例如体细胞。例如，体细胞可以是成纤维细胞、淋巴细胞或角质形成细胞。对运动神经元细胞是否退化的评估可以基于与对照的比较。在一些实施例中，对照水平可以是预定值或参考值，其用作评估测量结果和/或可见结果的基准。预定或参考值可是来自未患有神经疾病的受试者样本(例如运动神经元细胞)或来自患有神经疾病但其中运动神经元细胞不与C9orf72寡核苷酸接触的受试者样本中的水平。预定值或参考值可以是来自患有神经疾病的受试者的样品的水平。在这些筛选方法中的任一者中，来自患有神经疾病的受试者的细胞可包含C9orf72中的(GGGGCC)n六核苷酸扩增。
C9orf72的功效还可在合适测试动物中经测试，诸如作为非限制性实例的Peters等人2015Neuron.[神经元]88(5):902-9；O'Rourke等人2015Neuron.[神经元]88(5):892-901；和Liu等人2016Neuron.[神经元]90(3):521-34中所描述的那些。在一些实施例中，测试动物是C9-BAC小鼠。C9orf72的功效还可在具有450个重复扩增的C9-BAC转基因小鼠中经测试，其也描述于Jiang等人2016Neuron[神经元]90,1-16中。
在一些实施例中，在测试动物中，可测定各种C9orf72转录物的水平，可是C9orf72蛋白质水平、RNA病灶及DPR(二肽重复蛋白质)的水平。可在C9orf72寡核苷酸上执行测试且与参考寡核苷酸进行比较。本文所披露的若干C9orf72寡核苷酸能够降低包含RNAi病灶的细胞百分比及每个细胞的病灶平均数目。本文所披露的若干C9orf72寡核苷酸能够降低DPR，诸如聚GP的水平。
在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸能够降低由ALS、FTD或其他C9orf72相关障碍引起的神经退化的程度或速率。在一些实施例中，除了行为症状中任何神经系统组织的退化的程度或速率的改善，或至少降低以外，C9orf72寡核苷酸在受试者或其他动物内的治疗效果还可在脑扫描(例如CAT扫描、功能性MRI或PET扫描或本技术领域中已知的其他方法)下进行监测。
用于分析C9orf72寡核苷酸的各种分析法描述于本文中，例如于实例9、13及14中，且尤其包括报道子分析(萤光素酶分析)，例如在ALS神经元中执行且测量例如对V3/内含子表达、活性和/或水平的分析；稳定性测定；TLR9测定；互补测定；PD(药效学)(C9-BAC、icv或脑室内注射)，例如在C9orf72-BAC(C9-BAC)小鼠模型中的测试的PD和/或功效；体内方法，包括但不限于注射至测试动物(如小鼠)的中枢神经系统的侧脑室或其他区域(包括但不限于皮质和脊髓)；对病灶数目和/或包含病灶的细胞的数目的分析；聚GP(或pGP或DPR测定)。
在一些实施例中，选择标准用来评估由各种分析产生的数据且用来选择特别期望的C9orf72寡核苷酸。在一些实施例中，使用至少一个选择标准。在一些实施例中，使用两个或大于两个选择标准。在一些实施例中，萤光素酶分析的选择标准(例如，V3/内含子敲低)是V3内含子的至少部分敲低和/或内含子转录物的至少部分敲低。在一些实施例中，萤光素酶分析的选择标准(例如，V3/内含子敲低)是V3内含子的50％KD(敲低)及内含子转录物的50％KD。在一些实施例中，选择标准包括对IC50的测定。在一些实施例中，选择标准包括小于约10nM、小于约5nM或小于约1nM的IC50。在一些实施例中，稳定性分析的选择标准是第1天至少50％稳定性[寡核苷酸的至少50％水平仍是剩余的和/或可检测的]。在一些实施例中，稳定性分析的选择标准是第2天至少50％稳定性。在一些实施例中，稳定性分析的选择标准是第3天至少50％稳定性。在一些实施例中，稳定性分析的选择标准是第4天至少50％稳定性。在一些实施例中，稳定性分析的选择标准是第5天至少50％稳定性。在一些实施例中，稳定性分析的选择标准是第5天80％[至少80％的寡核苷酸剩余]。在一些实施例中，选择标准是病灶数目和/或包含病灶的细胞数目中的至少部分敲低。在一些实施例中，选择标准是病灶数目和/或包含病灶的细胞数目中的至少50％KD(敲低)。在一些实施例中，选择标准包括TLR9测定中缺乏活化。在一些实施例中，选择标准包括互补测定中缺乏活化。在一些实施例中，选择标准包括测试动物(诸如小鼠)的中枢神经系统的横向心室或其他区域(包括但不限于皮质及脊髓)中的敲低。在一些实施例中，选择标准包括测试动物(诸如小鼠)的中枢神经系统的横向心室或其他区域(包括但不限于皮质及脊髓)中的至少50％敲低。在一些实施例中，选择标准包括DPR蛋白质的表达、活性和/或水平中的敲低。在一些实施例中，选择标准包括DPR蛋白质的表达、活性和/或水平中的敲低。在一些实施例中，选择标准包括DPR蛋白质的表达、活性和/或水平中的至少50％敲低。在一些实施例中，选择标准包括DPR蛋白质聚GP的表达、活性和/或水平中的至少50％敲低。
已经评估及测试敲低C9orf72的功效的寡核苷酸具有各种用途，包括施用以用于治疗或预防C9orf72相关障碍或其症状。
用于检测所关注的靶标核酸的分析
在一些实施例中，本披露涉及用于检测和/或量化靶标核酸(例如，靶标寡核苷酸)的杂交分析，其中该分析利用捕获探针(其与靶标核酸至少部分互补)及检测探针；其中所述检测探针或包含所述捕获探针、检测探针及靶标核酸的复合物能够被检测。此分析可用于检测C9orf72寡核苷酸(例如，在组织或流体样品中)，或用于检测任何样本中的任何靶标核酸(任何靶标或序列)。在一些实施例中，捕获探针包含伯胺，其能够余氨基反应性固体载体反应，籍此将探针固定于固体载体上。在一些实施例中，氨基反应性固体载体包含马来酸酐。探针的不移动性可使用探针及固体载体上的炔烃及叠氮化物部分用点击化学方法来执行。对于点击化学方法，炔烃或叠氮化物可例如位于探针的5'或3'端，且可任选经由接头附接。对于点击化学方法，固体载体例如包含炔烃或叠氮化物部分。在一些实施例中，点击化学方法包括作为非限制性实例的Kolb等人2011Angew.Chem.Int.Ed.[应用化学国际版]40:2004-2021中所描述的点击化学方法。
在一些实施例中，能够直接地或间接地被检测的探针或复合物参与产生可检测信号。在一些实施例中，探针或复合物是(a)能够在不存在另一化学组分的情况下制备可检测信号(作为非限制性实例，具有能够制备可检测信号的部分，诸如荧光染料或放射性标记)，或(b)包含配体、标记物或其他组分，其在与适当第二部分结合时能够产生可检测信号。在一些实施例中，探针或复合物类型(b)包含标记物，诸如生物素、地高辛、半抗原、配体等，其可与适当第二化学实体(诸如抗体)结合，当其结合至标记物时，能够经由放射性标记、化学发光、染料、碱性磷酸酶信号、过氧化物酶信号等产生信号。
在一些实施例中，将捕获探针固定于固体载体上。在一些实施例中，捕获探针与靶标核酸杂交、结合或连接，且检测探针也与靶标核酸杂交、结合或连接，且复合物能够被检测到。杂交分析的许多变化形式是本技术领域中已知的。在一些实施例中，在杂交分析中，捕获及检测探针是同一探针，且单链核酸酶用于降解不与靶标核酸结合(或不完全结合)的探针。
在一些实施例中，本披露涉及用于检测和/或量化靶标核酸(例如，靶标寡核苷酸)的杂交分析，其中探针(例如，捕获探针)与靶标核酸至少部分互补且包含伯胺，其中伯胺能够与氨基反应性固体载体反应，籍此将探针固定于固体载体上。伯胺可例如位于探针的5'或3'端，且可任选经由接头附接。在一些实施例中，氨基反应性固体载体包含马来酸酐。
靶标寡核苷酸可是例如C9orf72寡核苷酸或到达所关注的任何靶标的寡核苷酸。
在一些实施例中，所述分析是杂交分析、夹心杂交分析、竞争性杂交分析、双连接杂交分析、核酸酶杂交分析或电化学杂交分析。
在一些实施例中，所述分析是夹心杂交分析，其中捕获探针结合至固体载体且能够退火至靶标寡核苷酸的一部分；其中检测探针能够被检测到且能够退火至寡核苷酸的另一部分；且其中捕获探针及检测探针两者与靶标寡核苷酸的杂交产生能够被检测到的复合物。
在一些实施例中，所述分析是核酸酶杂交分析且捕获探针是与靶标寡核苷酸完全互补的切割探针，其中与全长靶标寡核苷酸结合的切割探针能够被检测到；且其中自由的(不结合至靶标寡核苷酸)或结合至靶标寡核苷酸的更短代谢物或降解产物的切割探针通过S1核酸酶处理降解并且因此不产生可检测信号。
在一些实施例中，所述分析是杂交连接分析，其中捕获探针是与靶标寡核苷酸完全互补且意欲用作用于连接酶介导的靶标寡核苷酸及检测探针的连接的底物的模板探针。
在一些实施例中，本披露涉及检测和/或量化例如样本(例如组织或液体)中的靶标核酸(例如，靶标寡核苷酸)的方法，其包含以下步骤：(1)提供捕获探针，其中捕获探针与靶标核酸至少部分互补且包含伯胺，其中所述伯胺能够与氨基反应性固体载体结合，籍此将探针固定于固体载体上；(2)将捕获探针固定于固体载体上；(3)提供检测探针，其中检测探针与靶标核酸(例如，靶标核酸的区域不同于捕获探针结合的区域)至少部分互补且能够直接地或间接地产生信号；其中步骤(2)及(3)可以任一顺序执行；(4)在适用于探针与靶标核酸的杂交的条件下使组织或液体与捕获探针及检测探针接触；(5)去除不与靶标核酸杂交的检测探针；以及(6)检测由检测探针直接地或间接地产生的信号，其中信号的检测指示对靶标核酸的检测和/或量化。
在一些实施例中，靶标寡核苷酸是C9orf72寡核苷酸。在一些实施例中，靶标寡核苷酸不是C9orf72寡核苷酸。在一些实施例中，靶标核酸是寡核苷酸、反义寡核苷酸、siRNA剂、双链siRNA剂、单链siRNA剂或与疾病相关的核酸(例如，在疾病病症中表达或过度表达的基因或基因产物，诸如在癌细胞中大量增加的转录物，或其核酸包含与疾病或障碍相关的突变)。
在一些实施例中，氨基反应性固体载体包含马来酸酐。
靶标寡核苷酸经重新退火至检测探针，且接着与捕获探针组合，所述捕获探针经由伯胺标记物附接至氨基反应性板。在捕获探针、检测探针与靶标寡核苷酸之间产生双杂交(例如，夹心杂交)；缺口可允许在捕获探针与检测探针之间，从而残留不结合至捕获或检测探针的靶标寡核苷酸的单链部分。固体载体(例如，板表面)包含自发地与捕获探针的末端上的伯胺标记物反应(例如，在pH 8至9下)的马来酸酐(例如，马来酸酐活化的板)，从而将探针固定至固体载体。在一些实施例中，固体载体是板、管、过滤器、珠粒、聚合物珠粒、金、颗粒、孔或多孔板。
作为非限制性实例，可使用以下条件：
涂覆：500nM于2.5％Na2CO3中，pH 9.0，50ul/孔，37℃，2小时
样本/检测探针：300nM检测探针作为稀释剂，4℃，O/N
链霉亲和素-AP：1:2000于PBST中，50ul/孔，室温，1-2小时
底物AttoPhos：100ul/孔，室温，5分钟读取
举例而言：靶标核酸经预退火至检测探针，且接着与捕获探针组合，使用探针及固体载体上的炔烃(叠氮化物)部分经由点击化学方法附接至板。在捕获探针、检测探针与靶标核酸之间产生双杂交(例如，夹心杂交)；缺口可允许在捕获探针与检测探针之间，从而残留不结合至捕获或检测探针的靶标寡核苷酸的单链部分。固体载体(例如，板表面)包含炔烃(或叠氮化物)部分，其用点击化学方法与捕获探针的末端上的叠氮化物(或炔烃)部分标记物反应，从而将探针固定至固体载体。在一些实施例中，固体载体是板、管、过滤器、珠粒、聚合物珠粒、金、颗粒、孔或多孔板。
分析的非限制性实例提供于下文中：
测量组织(包括动物活检体)中的靶标寡核苷酸水平的杂交ELISA分析：
靶标寡核苷酸的反向互补序列可划分成2个区段，各自由捕获或检测探针表示。(靶标寡核苷酸的)5'序列可以是5-15nt；3'序列可以是5-15nt。然而，5'-探针序列(与靶标寡核苷酸的3'部分杂交)在其均与靶标寡核苷酸杂交时不应与3'探针序列重叠。5'-探针及3'-探针之间的缺口是可允许的。各探针应具有至少25℃，优选地>45℃，甚至更优选>50℃的熔融温度(Tm)。是实现高Tm，可使用经修饰的核苷酸，诸如锁核酸(LNA)或肽核酸(PNA)。探针中的其他核苷酸可是DNA或RNA核苷酸或任何其他形式的经修饰核苷酸，诸如具有2'-OMe、2'-F或2'-MOE修饰的那些核苷酸。
5'-探针也可用在5'-位置处具有接头的检测部分来标记。此探针是检测探针。
5'-探针(与靶标寡核苷酸的3'-部分杂交)可用5'-位置处具有接头的伯胺来标记。此探针是捕获探针。接头用于连接伯胺至探针核苷酸。接头可是C6-接头、C12-接头、PEG、TEG或与寡核苷酸(诸如寡聚dT)无关的任何核苷酸序列。具有接头的5'伯胺可在合成期间或合成后安置。
3'-探针也可用在3'-位置处具有接头序列的伯胺标记。此探针是捕获探针。
3'-探针(与靶标寡核苷酸的5'部分杂交)可用3'-位置处具有接头的检测部分标记。此探针是检测探针。检测部分可是生物素、地高辛、
Figure BDA0003456638050001471
配体(普洛麦格公司(Promega),麦迪逊,威斯康星州)或任何其他半抗原。检测部分也可是磺酸基标记(中尺度诊断公司(Meso Scale Diagnostics),罗克维尔,马里兰州)。接头用于连接具有探针核苷酸的检测部分。接头可是C6-接头、C12-接头、PEG、TEG或与寡核苷酸(诸如寡聚dT)无关的任何核苷酸序列。具有接头的3'-伯胺可在合成期间或合成后安置。
捕捉探针(在探针的5'端或3'端处具有伯胺)可固定于经活化以与伯胺反应的固体表面上，诸如马来酸酐活化板(皮尔斯公司(Pierce)；购自赛默飞世尔公司(ThermoFisher),沃尔瑟姆,马萨诸塞州)或N-氧基琥珀酰亚胺(NOS)活化的DNA-BIND板(康宁生命科学公司(Corning Life Sciences),图克斯伯里,马萨诸塞州)。板也可是经活化用于胺缀合的其他类别的板，诸如MSD板(中尺度诊断公司,罗克维尔,马里兰州)。表面可是固体载体，诸如珠粒、金颗粒、羧化的聚苯乙烯微米粒子(MagPlex微球，Luminex公司(LuminexCorporation)；购自赛默飞世尔公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)或戴诺珠粒(Dynabead)(赛默飞世尔科学公司(Thermo Fisher Scientific)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)，以使得可使用基于流动的分析平台，诸如流式荧光检测术或珠粒-数组平台(BDTM-细胞学珠粒阵列(Cytometric Bead Array)-CBA，BD生物科学公司(BD Biosciences)，圣何塞，加利福尼亚州)。
含有靶标寡核苷酸的生物样本，诸如组织溶解物或液态生物流体(血浆、血液、血清、CSF、尿液或其他组织或流体)以恰当浓度的寡核苷酸及检测探针与检测探针混合，随后对涂覆有捕捉探针的表面(板或微米粒子)进行加热改性以促进在室温或4℃下在适当杂交缓冲液中的序列特异性杂交持续一段时间(杂交)。过量检测探针通过洗涤表面(板或珠粒)来去除。随后将表面与识别检测部分的试剂，诸如用于生物素的抗生素蛋白/链霉亲和素、针对DIG的抗体或半抗原，或针对其配体的HaloTag一起温育。
检测试剂通常用酶标记，诸如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)或荧光团或磺酸基标记。在广泛洗涤之后，经酶标记的检测试剂通过添加对应的底物，诸如用于HRP的TMB或用于AP的AttoPhos来检测，且通过吸收模式或荧光模式(荧光底物)中的平板读数器来读取各板。在一些实施例中，标记物包含荧光素、B-藻红素、罗丹明、花青染料、别藻蓝蛋白或其变体或衍生物。
经荧光团标记的检测试剂可用于基于流动的检测平台，诸如流式荧光检测或珠粒阵列平台。
磺酸基标记的检测试剂可通过MSD读取器(中尺度发现公司(Meso ScaleDiscovery))直接读取。
寡核苷酸量可使用在相同分析中执行的测试物品的连续稀释的标准曲线来计算。
杂交分析的另一非限制性实例提供于实例14中。
用于寡核苷酸(包括但不限于C9orf72寡核苷酸)的效用的各种分析描述于本文中和/或在本技术领域中是已知的。
寡核苷酸及组合物的施用
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸能够导引靶标基因或其基因产物的表达和/或水平的降低。
在一些实施例中，靶标基因为包含六核苷酸重复扩增的C9orf72。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸组合物以比在改善靶标(作为非限制性实例包括C9orf72转录物)的敲低方面具有类似效应的其他方面类似的参考寡核苷酸组合物的剂量和/或频率低的剂量和/或频率进行施用。在一些实施例中，立体受控的寡核苷酸组合物以比在改善靶标C9orf72转录物的敲低方面具有类似效应的其他方面类似的立体随机参考寡核苷酸组合物的剂量和/或频率低的剂量和/或频率进行施用。
在一些实施例中，本披露涵盖，寡核苷酸及其组合物的特性(例如经改善的敲低活性等)可通过化学修饰和/或立体化学优化。在一些实施例中，本披露提供用于经由化学修饰及立体化学使寡核苷酸特性优化的方法。
在一些实施例中，本披露提供一种施用包含第一多个寡核苷酸且具有共同核苷酸序列的寡核苷酸组合物的方法，改善包含：
施用包含第一多个寡核苷酸的寡核苷酸，其特征在于递送相对于具有相同共同核苷酸序列的参考寡核苷酸组合物而言改善。
在一些实施例中，所提供的C9orf72寡核苷酸、组合物及方法提供改善的递送。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸、组合物及方法提供改善的细胞质递送。在一些实施例中，改善的递送是至细胞群中。在一些实施例中，改善的递送是至组织中。在一些实施例中，改善的递送是至器官中。在一些实施例中，改善的递送是至中枢神经系统或其一部分(例如CNS)中。在一些实施例中，改善的递送是至生物体中。提供改善的递送的实例结构元件(例如，化学修饰、立体化学、其组合等)、寡核苷酸、组合物及方法详述于本披露中。
可采用各种给药方案来施用所提供的手性受控的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，间隔一定时间段施用多个单位剂量。在一些实施例中，指定组合物具有推荐的给药方案，其可涉及一次或多次给药。在一些实施例中，给药方案包含多次给药，其中的每一者彼此间隔开相同长度的时段；在一些实施例中，给药方案包括多次给药以及间隔开个别给药的至少两个不同时段。在一些实施例中，给药方案内的所有给药具有相同单位给药量。在一些实施例中，给药方案内的不同给药具有不同的量。在一些实施例中，给药方案包含呈第一给药量的第一次给药，接着是呈不同于第一给药量的第二给药量的一次或多次其他给药。在一些实施例中，给药方案包含呈第一给药量的第一次给药，接着是呈与第一次给药(或另一先前给药)量相同或不同的第二(或后续)给药量的一次或多次其他给药。在一些实施例中，给药方案包含施用至少一个单位剂量持续至少一天。在一些实施例中，给药方案包含在至少一天且有时超过一天的时间段内施用超过一个剂量。在一些实施例中，给药方案包含在至少一周的时间段内施用多个剂量。在一些实施例中，时间段是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多(例如约45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多)周。在一些实施例中，给药方案包含每周施用一个剂量，持续超过一周。在一些实施例中，给药方案包含每周施用一个剂量，持续2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多(例如约45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多)周。在一些实施例中，给药方案包含每两周施用一个剂量，持续超过两周时间。在一些实施例中，给药方案包含每两周施用一个剂量，持续2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多(例如约45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多)周时间。在一些实施例中，给药方案包含每个月施用一个剂量，持续一个月。在一些实施例中，给药方案包含每个月施用一个剂量，持续超过一个月。在一些实施例中，给药方案包含每个月施用一个剂量，持续2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个月。在一些实施例中，给药方案包含每周施用一个剂量，持续约10周。在一些实施例中，给药方案包含每周施用一个剂量，持续约20周。在一些实施例中，给药方案包含每周施用一个剂量，持续约30周。在一些实施例中，给药方案包含每周施用一个剂量，持续26周。在一些实施例中，寡核苷酸根据一给药方案施用，所述给药方案不同于用于相同序列的非手性受控(例如立体随机)的寡核苷酸组合物的给药方案和/或用于相同序列的不同手性受控的寡核苷酸组合物的给药方案。在一些实施例中，寡核苷酸根据一给药方案施用，所述给药方案相比于相同序列的非手性受控(例如立体随机)的寡核苷酸组合物的给药方案减少，其在给定单位时间内达成较低水平的总暴露、涉及一个或多个较低单位剂量和/或在给定单位时间内包括较少数目次给药。在一些实施例中，寡核苷酸根据一给药方案施用，所述给药方案与相同序列的非手性受控(例如立体随机)的寡核苷酸组合物的给药方案相比延长较长时间段。不希望受理论限制，申请人指出，在一些实施例中，较短给药方案和/或给药之间的较长时间段可根据手性受控的寡核苷酸组合物的改善的稳定性、生物可用性和/或功效来定。在一些实施例中，寡核苷酸相比于对应的非手性受控的寡核苷酸组合物具有较长给药方案。在一些实施例中，寡核苷酸相比于对应的非手性受控的寡核苷酸组合物在至少两次给药之间具有较短时间段。不希望受理论限制，申请人指出，在一些实施例中，较长给药方案和/或各剂量之间的较短时间段可归因于手性受控的寡核苷酸组合物的改善的安全性。
在一些实施例中，凭借改善的递送(及其他特性)，所提供组合物可以较低剂量和/或以较低频率施用以达成生物作用，例如临床功效。
单次给药可含有各种量的寡核苷酸。在一些实施例中，单次给药可含有各种量的视应用需要适合的一种类型的手性受控的寡核苷酸。在一些实施例中，单次给药含有约1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300或更多(例如约350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000或更多)mg一种类型的手性受控的寡核苷酸。在一些实施例中，单次给药含有约1mg一种类型的手性受控的寡核苷酸。在一些实施例中，单次给药含有约5mg一种类型的手性受控的寡核苷酸。在一些实施例中，单次给药含有约10mg一种类型的手性受控的寡核苷酸。在一些实施例中，单次给药含有约15mg一种类型的手性受控的寡核苷酸。在一些实施例中，单次给药含有约20mg一种类型的手性受控的寡核苷酸。在一些实施例中，单次给药含有约50mg一种类型的手性受控的寡核苷酸。在一些实施例中，单次给药含有约100mg一种类型的手性受控的寡核苷酸。在一些实施例中，单次给药含有约150mg一种类型的手性受控的寡核苷酸。在一些实施例中，单次给药含有约200mg一种类型的手性受控的寡核苷酸。在一些实施例中，单次给药含有约250mg一种类型的手性受控的寡核苷酸。在一些实施例中，单次给药含有约300mg一种类型的手性受控的寡核苷酸。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸在单一给药和/或总给药中按比非手性受控的寡核苷酸低的量施用。在一些实施例中，归因于改善的功效，手性受控的寡核苷酸在单一给药和/或总给药中按比非手性受控的寡核苷酸低的量施用。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸在单一给药和/或总给药中按比非手性受控的寡核苷酸高的量施用。在一些实施例中，归因于改善的安全性，手性受控的寡核苷酸在单一给药和/或总给药中按比非手性受控的寡核苷酸高的量施用。
与C9orf72相关的病症、障碍或疾病的治疗
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸能够导引C9orf72靶标基因或其基因产物的表达、水平和/或活性的降低。在一些实施例中，C9orf72相关障碍是与以下情形相关、引起以下情形和/或与以下情形相关联的病症：C9orf72基因或其基因产物的异常或过高的活性、水平和/或表达、有害突变、或异常组织分布、或细胞间或细胞内分布。在一些实施例中，C9orf72相关障碍是肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、皮质基底节变性综合征(CBD)、非典型帕金森综合征、橄榄体桥脑小脑变性(OPCD)、原发性侧索硬化症(PLS)、进行性肌萎缩症(PMA)、拟表型亨廷顿氏病(HD)、阿尔兹海默病(AD)、双相障碍、精神分裂症或其他非运动障碍。C9orf72相关障碍的症状包括本文中所描述及本技术领域中已知的那些症状。
在一些实施例中，本披露提供了用于治疗病症、障碍或疾病的方法，该方法包括向患有该疾病的受试者施用治疗有效量的所提供的寡核苷酸，或包含或递送治疗有效量的所提供的寡核苷酸的组合物。在一些实施例中，本披露提供了用于治疗病症、障碍或疾病的方法，该方法包括向患有该疾病的受试者施用治疗有效量的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，组合物是包含寡核苷酸(在一些实施例中，其药学上可接受的盐形式)和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施例中，病症、障碍或疾病是额颞叶型退化症(FTD)。在一些实施例中，病症、障碍或疾病是肌萎缩侧索硬化症(ALS)。
不希望受任何特定理论或术语束缚，本发明指出，随着对C9orf72相关疾病的理解不断发展，各种C9orf72相关疾病的确切标志也根据报导发展。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸适用于降低C9orf72的含有六核苷酸重复的突变型等位基因的水平(在蛋白质和/或mRNA层级)，和/或降低由含有六核苷酸重复的突变型C9orf72 mRNA产生的二肽重复蛋白质的水平，其中所述寡核苷酸适用于治疗C9orf72相关疾病。
在一些实施例中，C9orf72相关障碍是FTD。在一些实施例中，FTD是额颞叶痴呆或额颞叶型退化症的缩写。在一些实施例中，额颞叶型退化症(FTD)是影响脑的额叶及颞叶的疾病过程。其引起特征是行为、性格、语言和/或动作改变的一组障碍。FTD的临床诊断包括以下中的任何一者或多者：行为变异型FTD(bvFTD)、原发性进行性失语(PPA)及运动障碍进行性核上麻痹(PSP)及皮质基底节变性症(CBD)。在一些实施例中，患有或易患上PPA、PSP或CBD的患者并不呈现痴呆或鉴定是痴呆。在一些实施例中，额颞叶痴呆相当于或其特征是bvFTD的症状。
本披露涉及使用本文中所披露的寡核苷酸的方法，所述寡核苷酸能够靶向C9orf72且适用于治疗C9orf72相关障碍和/或制造用于C9orf72相关障碍的治疗剂。在一些实施例中，寡核苷酸的碱基序列可以包含与指定碱基序列具有指定最大数目个错配的碱基序列或由其组成。
在一些实施例中，本披露涉及包含C9orf72寡核苷酸的组合物的用途，其系用于制造用以治疗神经退化性疾病的药剂。
在一些实施例中，本披露涉及一种治疗或改善患者的C9orf72相关障碍的方法，所述方法包含以下步骤：将治疗有效量的寡核苷酸施用至患者的C9orf72。
在一些实施例中，本披露涉及一种方法，其包含向动物施用包含C9orf72寡核苷酸的组合物。
在一些实施例中，动物是受试者，例如人类。
在一些实施例中，专业医护人员可鉴别或诊断适合于治疗C9orf72相关障碍(诸如施用C9orf72寡核苷酸)的受试者或患者。C9orf72相关疾病是若干神经疾病中的一种。在一些实施例中，可通过评估一个或多个症状，例如运动神经元退化症状，而将受试者诊断是患有神经疾病。在一些实施例中，为了诊断神经疾病，可在体检之后进行彻底的神经检查。在一些实施例中，神经检查可评估运动及感知技能、神经功能、听觉及话语、视力、协调与平衡、精神状态以及情感或行为变化。与神经疾病相关的疾病的非限制性症状可是：手臂、腿部、脚部或脚踝无力；言语不清；脚前部及脚趾抬起困难；手部无力或笨拙；肌肉麻痹；肌肉僵硬；非自主性抖动或书写动作(舞蹈症)；非自主性持续肌肉挛缩(肌张力障碍)；动作迟缓；自发运动丧失；姿势及平衡减弱；缺少灵活性；身体部位麻刺；跟随头部动作出现的电击感觉；手臂、肩部及舌头抽搐；吞咽困难；呼吸困难；咀嚼困难；视力部分或完全丧失；复视；眼球运动缓慢或异常；震颤；步态不稳；疲劳；记忆丧失；眩晕；难以思考或注意集中；阅读或书写困难；空间关系误判；迷失方向；抑郁；焦虑；难以进行决定及判断；冲动控制丧失；难以计划及进行熟悉任务；攻击性；烦躁；社交退缩；情绪波动；痴呆；睡眠习惯改变；神志恍惚；食欲改变。
在一些实施例中，组合物预防、治疗、改善C9orf72相关障碍的至少一个症状或减缓其进程。
在一些实施例中，动物或人类患有C9orf72相关障碍的症状。
在一些实施例中，本披露涉及一种用于将降低C9orf72基因表达的寡核苷酸引入细胞中的方法，所述方法包含：使细胞与寡核苷酸或C9orf72寡核苷酸接触。
在一些实施例中，本披露涉及一种用于降低有需要的哺乳动物中的C9orf72基因表达的方法，所述方法包含：向哺乳动物施用包含针对C9orf72的寡核苷酸的核酸-脂质颗粒。
在一些实施例中，本披露涉及一种用于体内递送靶向C9orf72基因表达的寡核苷酸的方法，所述方法包含：向哺乳动物施用针对C9orf72的寡核苷酸。
在一些实施例中，本披露涉及一种用于治疗和/或改善有需要的哺乳动物的与C9orf72相关障碍相关的一个或多个症状的方法，所述方法包含：向哺乳动物施用治疗有效量的包含针对C9orf72的寡核苷酸的核酸-脂质颗粒。
在一些实施例中，本披露涉及一种抑制细胞中的C9orf72表达的方法，所述方法包含：(a)使细胞与针对C9orf72的寡核苷酸接触；以及(b)将产生的细胞维持在步骤(a)中达足以获得C9orf72基因的mRNA转录物降解的一段时间，从而抑制C9orf72基因于细胞中的表达。
在一些实施例中，将C9orf72表达抑制至少30％。
在一些实施例中，本披露涉及一种治疗由C9orf72表达介导的障碍的方法，其包含向需要此类治疗的人类施用治疗有效量的针对C9orf72的寡核苷酸。
在一些实施例中，施用引起含有重复扩增的C9orf72转录物或其基因产物的表达、活性和/或水平降低。
在一些实施例中，本披露涉及一种治疗C9orf72相关障碍的方法。
在一些实施例中，本披露涉及以下方法，所述方法包括以下步骤：提供包含具有相同mRNA的两种或更多种不同剪接产物的系统，其中至少一种剪接产物是疾病相关的且至少一种剪接产物是非疾病相关的；将寡核苷酸引入系统中，其中所述寡核苷酸与在至少一种疾病相关剪接产物中存在但在至少一种非疾病相关剪接产物中不存在的序列互补，其中相对于所述非疾病相关剪接产物的表达、水平和/或活性，所述寡核苷酸能够降低所述疾病相关剪接产物的表达、水平和/或活性。
在所述方法的一些实施例中，寡核苷酸与疾病相关剪接产物上存在的内含子-外显子接点互补，但不与非疾病相关剪接产物上存在的内含子-外显子接点互补。
在所述方法的一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个手性受控核苷酸间键联。
在所述方法的一些实施例中，寡核苷酸是C9orf72寡核苷酸，且系统是患有和/或易患c9orfy2相关障碍的受试者。
在一些实施例中，向受试者施用第二治疗剂或方法。
在一些实施例中，向受试者施用C9orf72寡核苷酸及一种或多种第二治疗剂或方法。
在一些实施例中，第二治疗剂或方法能够预防、治疗、改善神经疾病或减缓其进程。
在一些实施例中，第二治疗剂或方法能够预防、治疗、改善C9orf72相关障碍或减缓其进程。
在一些实施例中，第二治疗剂或方法能够预防、治疗、改善神经疾病或减缓其进程，所述第二治疗剂或方法选自：内体和/或溶酶体运输调节剂、谷氨酸受体抑制剂、PIKFYVE激酶抑制剂及钾通道活化剂。
在一些实施例中，第二治疗剂或方法包含针对二肽重复蛋白质的抗体或者妨碍RNA病灶大量形成或减少RNA病灶数目的药剂(例如抗体或小分子)。
在一些实施例中，第二治疗剂或方法通过敲低增加C9orf72的表达、活性和/或水平的基因或其基因产物(作为非限制性实例)而间接降低C9orf72的表达、活性和/或水平。在一些实施例中，第二治疗剂或方法敲低SUPT4H1(人类Spt4直系同源物)，其敲低减少了有义及反义C9orf72 RNA病灶以及DPR蛋白质的产生。Kramer等人2016Science[科学]353:708。在一些实施例中，第二治疗剂或方法是核酸、小分子、基因疗法或文献中描述的其他药剂或方法，所述文献包括(作为非限制性实例)Mis等人Mol Neurobiol.[分子神经生物学]2017年8月；54(6):4466-4476。
在一些实施例中，第二治疗剂以物理方式与C9orf72寡核苷酸缀合。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸以物理方式与第二寡核苷酸缀合，所述第二寡核苷酸(直接或间接地)降低C9orf72的表达、活性和/或水平或适用于治疗C9orf72相关障碍的症状。在一些实施例中，第一C9orf72寡核苷酸以物理方式与第二C9orf72寡核苷酸缀合，所述第二C9orf72寡核苷酸可与第一C9orf72寡核苷酸相同或不同，且可与第一C9orf72寡核苷酸靶向不同或相同或重叠的序列。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸与敲低SUPT4H1的寡核苷酸缀合或共同施用或与其并入同一治疗方案中。在一些实施例中，C9orf72寡核苷酸与第二治疗剂缀合或共同施用或与其并入同一治疗方案中，所述第二治疗剂改善与C9orf72相关障碍(诸如ALS或FTD)相关的另一(非C9orf72)基因或基因产物的表达、活性和/或水平，所述另一基因或基因产物诸如：SOD1、TARDBP、FUS/TLS、MAPT、TDP-43、SUPT4H1或FUS/TLS。
在一些实施例中，改善此类基因或基因产物的表达、活性和/或水平尤其包括：降低在疾病病况中过高的此类基因或基因产物的表达、活性和/或水平；增加在疾病病况中过低的此类基因或基因产物的表达、活性和/或水平；和/或降低此类基因或基因产物的突变型和/或疾病相关变体的表达、活性和/或水平。在一些实施例中，第二治疗剂是寡核苷酸。在一些实施例中，第二治疗剂是以物理方式与C9orf72寡核苷酸缀合的寡核苷酸。在一些实施例中，第二治疗剂包含反丁烯二酸单甲酯(MMF)(据报导其活化Nrf2)和/或Ω-3脂肪酸。在一些实施例中，第二治疗剂包含反丁烯二酸单甲酯(MMF)和/或据报导抑制NF-κB的Ω-3脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA)。在一些实施例中，第二治疗剂包含反丁烯二酸单甲酯(MMF)与Ω-3脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA)的缀合物。在一些实施例中，第二治疗剂是CAT-4001(催化活性药物公司(Catabasis Pharmaceuticals),剑桥,马萨诸塞州,美国)。
在一些实施例中，第二治疗剂能够预防、治疗、改善神经疾病或减缓其进程，所述第二治疗剂选自：WO 2016/210372中所描述的内体和/或溶酶体运输调节剂、谷氨酸受体抑制剂、PIKFYVE激酶抑制剂及钾通道活化剂。在一些实施例中，钾通道活化剂是瑞替加滨。在一些实施例中，谷氨酸受体位于运动神经元(MN)或脊髓运动神经元上。在一些实施例中，谷氨酸受体是NMDA、AMPA或红藻氨酸(kainite)。在一些实施例中，谷氨酸受体抑制剂是AP5((2R)-氨基-5-磷酰基戊酸；(2R)-氨基-5-磷酰基戊酸酯)、CNQX(6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮)或NBQX(2,3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并[f]喹喔啉-2,3-二酮)。
在一些实施例中，第二治疗剂能够降低与C9orf72相关障碍相关的基因(或其基因产物)的表达、水平和/或活性，所述基因诸如SOD1、TARDBP、FUS/TLS、MAPT、TDP-43、SUPT4H1或FUS/TLS。在一些实施例中，第二治疗剂是一种药剂，其降低与肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞叶痴呆(FTD)相关的基因(或其基因产物)的表达、水平和/或活性，所述基因诸如SOD1、TARDBP、FUS/TLS、MAPT、TDP-43、SUPT4H1或FUS/TLS。在一些实施例中，第二治疗剂能够控制过度氧化应激。在一些实施例中，第二治疗剂是
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(依达拉奉)。在一些实施例中，第二治疗剂是熊脱氧胆酸(UDCA)。在一些实施例中，第二治疗剂能够影响神经元，其经由封闭进入神经元的Na+入口且封闭引起运动神经元活跃的化学物质的释放来降低神经元活性。在一些实施例中，第二治疗剂是利鲁唑。在一些实施例中，第二治疗剂能够：减轻疲劳、缓解肌肉抽筋、控制痉挛和/或减少过多的唾液及痰。在一些实施例中，第二治疗剂能够减轻疼痛。在一些实施例中，第二治疗剂是非类固醇和/或消炎药物和/或阿片类。在一些实施例中，第二治疗剂能够缓解抑郁、睡眠障碍、吞咽困难、痉挛、唾液吞咽困难和/或便秘。在一些实施例中，第二治疗剂是巴氯芬或安定。在一些实施例中，第二治疗剂是或包含三己芬迪、阿米替林和/或格隆溴铵。在一些实施例中，第二治疗剂是dsRNA或siRNA，其链的序列包含本文中所披露的任何寡核苷酸的序列中的至少15个连续nt。
药物组合物
在一些实施例中，本披露提供了药物组合物，所述药物组合物包含所提供的化合物(例如所提供的寡核苷酸)或其药学上可接受的盐、以及药物载体。在一些实施例中，寡核苷酸是C9orf72寡核苷酸。
当用作治疗剂时，将本文所述的所提供的寡核苷酸或寡核苷酸组合物作为药物组合物施用。在一些实施例中，所述药物组合物适用于将寡核苷酸施用至身体中受障碍影响的区域，包括但不限于中枢神经系统。在一些实施例中，所述药物组合物包含治疗有效量的所提供的寡核苷酸或其药学上可接受的盐、以及至少一种药学上可接受的非活性成分，所述至少一种药学上可接受的非活性成分选自药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂以及药学上可接受的载体。
如本领域技术人员所理解的，可以以其酸、碱或盐形式提供本披露的寡核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸可以是酸形式，例如对于天然磷酸酯键联，-OP(O)(OH)O-的形式；对于硫代磷酸酯核苷酸间键联，-OP(O)(SH)O-的形式；等。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸可以是盐形式，例如对于天然磷酸酯键联，以钠盐的-OP(O)(ONa)O-的形式；对于硫代磷酸酯核苷酸间键联，以钠盐的-OP(O)(SNa)O-的形式；等。在一些实施例中，每个酸性键联(例如，每个天然磷酸酯键联和每个硫代磷酸酯键联(如果有的话))独立地以盐形式(所有盐形式)存在。在一些实施例中，寡核苷酸呈全钠盐形式。除非另有说明，否则本披露的寡核苷酸可以以酸、碱和/或盐形式存在。
在一些实施例中，药物组合物包含治疗有效量的所提供的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的非活性成分。在一些实施例中，药学上可接受的非活性成分选自药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的载体。在一些实施例中，药学上可接受的非活性成分是药学上可接受的载体。
在一些实施例中，本披露提供了药物组合物，其包含与药学上可接受的非活性成分(例如药学上可接受的赋形剂，药学上可接受的载体等)混合的手性受控的寡核苷酸或其组合物。本领域技术人员将认识到，药物组合物包括所提供的寡核苷酸或组合物的药学上可接受的盐。在一些实施例中，药物组合物是手性受控的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，药物组合物是立体纯的寡核苷酸组合物。
在一些实施例中，本披露提供寡核苷酸的盐及其药物组合物。在一些实施例中，盐是药学上可接受的盐。在一些实施例中，药物组合物包含任选以其盐形式的寡核苷酸和钠盐。在一些实施例中，药物组合物包含任选以其盐形式的寡核苷酸和氯化钠。在一些实施例中，寡核苷酸的可以给至碱的每个氢离子(例如，在水溶液、药物组合物等的条件下)被非H+阳离子替换。例如，在一些实施例中，寡核苷酸的药学上可接受的盐是全金属离子盐，其中每个核苷酸间键联(例如天然磷酸酯键联、硫代磷酸酯核苷酸间键联等)的每个氢离子(例如-OH、-SH等)被金属离子替换。用于药物组合物的各种合适的金属盐在本领域中是众所周知的，并且可以根据本披露使用。在一些实施例中，药学上可接受的盐是钠盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐是镁盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐是钙盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐是钾盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐是铵盐(阳离子N(R)4 +)。在一些实施例中，药学上可接受的盐包含一种且不超过一种类型的阳离子。在一些实施例中，药学上可接受的盐包含两种或更多种类型的阳离子。在一些实施例中，阳离子是Li+、Na+、K+、Mg2+或Ca2+。在一些实施例中，药学上可接受的盐是全钠盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐是全钠盐，其中为天然磷酸酯键联(酸形式-O-P(O)(OH)-O-)(如果存在的话)的每个核苷酸间键联以其钠盐形式(-O-P(O)(ONa)-O-)存在，并且为硫代磷酸酯核苷酸间键联(酸形式-O-P(O)(SH)-O-)(如果存在的话)的每个核苷酸间键联以其钠盐形式(O-P(O)(SNa)-O-)存在。
药学上可接受的盐通常是本领域普通技术人员所熟知的，并且可以包括例如但不限于乙酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate)、苯磺酸盐(besylate)、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、乙二胺四乙酸钙、牛磺酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯月桂硫酸盐(estolate)、酚磺乙胺(esylate)、延胡索酸盐、葡萄糖酸盐(gluceptate)、葡糖酸盐(gluconate)、谷氨酸盐、乙醇酰氨基苯胂酸盐(glycollylarsanilate)、己基间苯二酚盐(hexylresorcinate)、海巴明(hydrabamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、羟萘甲酸盐、碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐(pamoate/embonate)、泛酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐(subacetate)、琥珀酸盐、硫酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、或茶氯酸盐(teoclate)。其他药学上可接受的盐可以例如在，Remington,The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践]，(第20版2000)中找到。优选的药学上可接受的盐包括，例如，乙酸盐、苯甲酸盐、溴化物、碳酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、双羟萘酸盐(pamoate、embonate)、磷酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐或酒石酸盐。
根据本披露，可以利用本领域已知的用于递送核酸和/或寡核苷酸的各种技术。例如，多种超分子纳米载体可用于递送核酸。示例纳米载体包括但不限于脂质体、阳离子聚合物复合物、和各种聚合物。核酸与各种聚阳离子的复合是用于细胞内递送的另一种方法；这包括使用聚乙二醇化的聚阳离子、聚乙烯胺(PEI)复合物、阳离子嵌段共聚物、和树状聚合物。若干种阳离子纳米载体(包括PEI和聚酰胺树状聚合物)有助于从内体释放内容物。其他方法包括使用聚合纳米粒子、微球、脂质体、树状聚合物、生物可降解聚合物、缀合物、前药、如硫或铁的无机胶体、抗体、移植物、生物可降解移植物、生物可降解微球、渗透受控移植物、脂质纳米粒子、乳液、油性溶液、水溶液、生物可降解聚合物、聚乳酸羟基乙酸共聚物(poly(lactide-coglycolic acid))、聚(乳酸)、液体储存物、聚合物微胞、量子点以及脂复合物。在一些实施例中，寡核苷酸与另一分子缀合。
在治疗和/或诊断应用中，本披露的化合物例如寡核苷酸可以配制用于多种施用方式，包括全身和局部(topical或localized)施用。技术和配制品通常可以在Remington,The Science and Practice of Pharmacy[药物科学与实践](第20版2000年)中找到。
在一些实施例中，所提供的C9orf72与适合用于递送至中枢神经系统的另一化学部分缀合，所述化学部分选自：葡萄糖、GluNAc(N-乙酰葡糖胺)及茴香酰胺。
在一些实施例中，与寡核苷酸缀合的另外的化学部分能够将寡核苷酸靶向神经系统中的细胞。
在一些实施例中，与所提供的寡核苷酸缀合的另外的化学部分包含茴香酰胺或其衍生物或类似物，且能够使所提供的寡核苷酸靶向表达特定受体(如σ1受体)的细胞。
在一些实施例中，对所提供的寡核苷酸进行配制以施用至表达其靶标的身体细胞和/或组织。
在一些实施例中，与C9orf72寡核苷酸缀合的另一化学部分能够使C9orf72寡核苷酸靶向神经系统中的细胞。
在一些实施例中，与C9orf72寡核苷酸缀合的另一化学部分包含茴香酰胺或其衍生物或类似物，且能够使C9orf72寡核苷酸靶向表达特定受体(诸如σ1受体)的细胞。
在一些实施例中，所提供的C9orf72寡核苷酸经配制以用于施用至表达C9orf72的身体细胞和/或组织。在一些实施例中，这样的身体细胞和/或组织是中枢神经系统的神经元或细胞和/或组织。在一些实施例中，本文中所描述的寡核苷酸及组合物在中枢神经系统内的广泛分布可利用脑实质内施用、鞘内施用或脑室内施用来达成。
在一些实施例中，配制药物组合物用于静脉内注射、口服施用、口腔施用、吸入、鼻腔施用、局部施用、眼部施用或耳部施用。在一些实施例中，药物组合物是片剂、丸剂、胶囊、液体、吸入剂、鼻喷雾剂溶液、栓剂、悬浮液、凝胶、胶体、分散体、悬浮液、溶液、乳液、软膏、洗液、滴眼液、或滴耳液。
在一些实施例中，本披露提供了药物组合物，所述药物组合物包含与药学上可接受的赋形剂混合的手性受控的寡核苷酸或其组合物。本领域技术人员将认识到，药物组合物包括上文所述的手性受控的寡核苷酸的药学上可接受的盐、或其组合物。
多种超分子纳米载体可用于递送核酸。示例纳米载体包括但不限于脂质体、阳离子聚合物复合物、和各种聚合物。核酸与各种聚阳离子的复合是用于细胞内递送的另一种方法；这包括使用聚乙二醇化的聚阳离子、聚乙烯胺(PEI)复合物、阳离子嵌段共聚物、和树状聚合物。若干种阳离子纳米载体(包括PEI和聚酰胺树状聚合物)有助于从内体释放内容物。其他方法包括使用聚合纳米粒子、微球、脂质体、树状聚合物、生物可降解聚合物、缀合物、前药、如硫或铁的无机胶体、抗体、移植物、生物可降解移植物、生物可降解微球、渗透受控移植物、脂质纳米粒子、乳液、油性溶液、水溶液、生物可降解聚合物、聚乳酸羟基乙酸共聚物(poly(lactide-coglycolic acid))、聚(乳酸)、液体储存物、聚合物微胞、量子点以及脂复合物。在一些实施例中，寡核苷酸与另一分子缀合。
除本文所述的示例递送策略以外，还已知另外的核酸递送策略。
在治疗和/或诊断应用中，本披露的化合物可以配制用于多种施用方式，包括全身和局部(topical或localized)施用。技术和配制品通常可以在Remington,The Scienceand Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践]，(第20版2000)中找到。
所提供的寡核苷酸及其组合物在宽剂量范围内有效。例如，在治疗成年人时，每天约0.01至约1000mg、约0.5至约100mg、约1至约50mg以及每天约5至约100mg的剂量是可以使用的剂量实例。准确的剂量将取决于施用途径、施用的化合物的形式、待治疗的受试者、待治疗的受试者的体重、以及主治医师的偏好和经验。
在一些实施例中，所提供的C9orf72寡核苷酸配制于以下文献中所描述d药物组合物中：美国申请号61/774759；2013年12月19日提交的61/918,175、61/918,927；61/918,182；61/918941；62/025224；62/046487；或者国际申请号PCT/US 04/042911、PCT/EP 2010/070412、或PCT/IB2014/059503。
取决于所治疗的具体病症，可将这类试剂配制成液体或固体剂型，并全身或局部施用。如本领域技术人员已知的，可以例如以定时或持续低释放形式递送所述试剂。配制和施用的技术可以在Remington,The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践],(第20版2000)中找到。合适的途径可包括口服、口腔、通过吸入喷雾、舌下、直肠、透皮、阴道、穿粘膜、鼻或肠施用；肠外递送，包括肌内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、关节内、胸骨内、滑膜内、肝内、病灶内、颅内、腹膜内、鼻内或眼内注射，或其他递送方式。
对于注射剂，本披露的试剂可以在水性溶液中进行配制和稀释，如在生理相容性缓冲液中，例如汉克氏(Hank's)溶液、格林氏(Ringer's)溶液、或生理盐水缓冲液。对于这种穿粘膜施用，在配制品中使用适于障碍物渗透的渗透剂。此类渗透剂是本领域公知的。
使用药学上可接受的惰性载体将本文披露的用于实施本披露的化合物配制成适于全身施用的剂量在本披露的范围内。通过适当选择载体和合适的制造方法，本披露的组合物，特别是配制成溶液的组合物，可以胃肠外施用，例如通过静脉内注射。
可以使用本领域熟知的药学上可接受的载体将化合物(例如寡核苷酸)容易地配制成适于口服施用的剂量。此类载体使得本披露的化合物被配制成片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，用于被待治疗的受试者(例如患者)口服摄取。
对于鼻或吸入递送，本披露的试剂也可以通过本领域技术人员已知的方法配制，并且可以包括例如但不限于增溶、稀释或分散物质(如，盐水、防腐剂(如苯甲醇)、吸收促进剂和碳氟化合物)的实例。
在一些实施例中，寡核苷酸或组合物作为包含有效量的寡核苷酸或组合物和药学上可接受的载体的药物组合物施用。在一些实施例中，组合物是手性受控的。在一些实施例中，组合物包含寡核苷酸的一种或多种药学上可接受的盐形式。在一些实施例中，组合物是液体组合物。在一些实施例中，液体组合物具有约中性的pH(例如约pH 7)。在一些实施例中，液体组合物的pH为约7.4。在一些实施例中，液体组合物包含缓冲液。
在某些实施例中，寡核苷酸和组合物递送至CNS。在某些实施例中，寡核苷酸和组合物递送至脑脊液。在某些实施例中，寡核苷酸和组合物施用至脑实质。在某些实施例中，寡核苷酸和组合物通过鞘内施用或脑室内施用而递送至动物/受试者。本文所述的寡核苷酸和组合物在中枢神经系统内的广泛分布可通过实质内施用、鞘内施用、或脑室内施用来实现。
在某些实施例中，肠胃外施用通过注射进行，例如通过针筒、泵等进行。在某些实施例中，注射是快速浓注。在某些实施例中，注射直接施用至组织，如纹状体、尾状核、皮质、海马、和小脑。
在某些实施例中，特异性定位药剂的方法(如，通过快速浓注)将中值有效浓度(EC50)降低20、25、30、35、40、45或50倍。在某些实施例中，药剂是如本文中进一步描述的反义化合物。在某些实施例中，靶组织是脑组织。在某些实施例中，靶组织是纹状体组织。在某些实施例中，降低EC50是所希望的，因为这减少了在有需要的患者中实现药理学结果所需的剂量。
在某些实施例中，反义寡核苷酸通过注射或输注递送，每个月、每两个月、每90天、每3个月、每6个月一次；一年两次或一年一次。
适于在本披露中使用的药物组合物包括以下组合物，其中所述组合物包含有效量的活性成分以实现它的预期目标。有效量的确定完全在本领域技术人员的能力之内，尤其是根据于本文提供的具体披露内容。
除活性成分外，这些药物组合物可以含有合适的药学上可接受的载体(包含赋形剂和助剂)，这些载体有助于将活性化合物加工成可药用的制剂。用于口服施用而配制的制剂可以呈片剂、糖衣丸、胶囊或溶液的形式。
用于口服使用的药物制剂可通过以下方法获得：将活性化合物(例如，寡核苷酸)与固体赋形剂组合，任选地研磨所得混合物，并加工所述颗粒混合物(如果希望的话，在添加合适的助剂之后)，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂尤其是填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠(CMC)、和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP：聚维酮(povidone))。如果需要，可添加崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或海藻酸或其盐(如海藻酸钠)。
在一些实施例中，糖衣丸芯提供有合适的包衣。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，所述糖溶液可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆胶、聚乙二醇(PEG)、和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加到片剂或糖衣丸包衣中，以用于标识或表征活性化合物剂量的不同组合。
可口服使用的药物制剂包括由明胶制成的插接式胶囊(push-fit capsule)以及由明胶与增塑剂(如甘油或山梨醇)制成的密封式软胶囊。插接式胶囊可以包含与填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)和/或润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)以及任选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮在合适的液体，如脂肪油、液体石蜡、或液体聚乙二醇(PEG)中。此外，还可以添加稳定剂。
可通过将活性化合物(例如，寡核苷酸)与脂质组合来获得组合物。在一些实施例中，脂质与活性化合物缀合。在一些实施例中，脂质不与活性化合物缀合。在一些实施例中，脂质包含C10-C40直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含任选经一个或多个C1-4脂肪族基团取代的C10-C40直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质选自由以下组成的组：月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、二十二碳六烯酸(顺-DHA)、喇叭藻酸和二亚油基。在一些实施例中，活性化合物是本文所述的任何寡核苷酸或其他核酸。在一些实施例中，活性化合物是具有包含表A1中所列的任何核酸的任何序列或由所述序列组成的序列的核酸。在一些实施例中，组合物包含脂质和活性化合物，且进一步包含选自以下的另一组分：另一脂质和靶向性化合物或部分。在一些实施例中，脂质包括但不限于：氨基脂质；两亲脂质；阴离子脂质；载脂蛋白；阳离子脂质；低分子量阳离子脂质；如CLinDMA和DLinDMA的阳离子脂质；可电离阳离子脂质；掩蔽组分；辅助脂质；脂肽；中性脂质；中性两性离子脂质；疏水性小分子；疏水性维生素；PEG-脂质；被一个或多个亲水性聚合物修饰的不带电脂质；磷脂；如1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺的磷脂；隐形脂质；固醇；胆固醇；以及靶向性脂质；以及本文所述或本领域所报道的任何其他脂质。在一些实施例中，组合物包含脂质和能够介导另一脂质的至少一种功能的另一脂质的一部分。在一些实施例中，靶向性化合物或部分能够使化合物(例如，包含脂质和活性化合物的组合物)靶向特定细胞或组织或者细胞或组织的亚组。在一些实施例中，靶向部分被设计成用于利用特定靶标、受体、蛋白质或其他亚细胞组分的细胞特异性或组织特异性表达；在一些实施例中，靶向部分是将组合物靶向细胞或组织和/或结合至靶标、受体、蛋白质或其他亚细胞组分的配体(例如，小分子、抗体、肽、蛋白质、碳水化合物、适体等)。
用于制备用于递送活性化合物的组合物的某些示例脂质允许(例如，不阻止或干扰)活性化合物的功能。非限制性例示性脂质包括：月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、二十二碳六烯酸(顺-DHA)、喇叭藻酸和二亚油基。
如本披露中所述，脂质缀合(如与脂肪酸缀合)可改善寡核苷酸的一个或多个特性。
在一些实施例中，用于递送活性化合物的组合物能够将活性化合物根据需要靶向特定细胞或组织。在一些实施例中，用于递送活性化合物的组合物能够将活性化合物靶向肌肉细胞或组织。在一些实施例中，本披露涉及与活性化合物的递送相关的组合物和方法，其中组合物包含活性化合物、脂质。在关于肌肉细胞或组织的各种实施例中，脂质选自：月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、二十二碳六烯酸(顺-DHA)、喇叭藻酸和二亚油基。
在一些实施例中，将包含寡核苷酸的组合物冻干。在一些实施例中，将包含寡核苷酸的组合物冻干，并将冻干的寡核苷酸置于小瓶中。
根据待治疗或预防的具体障碍，通常被施用以治疗或预防所述病症的另外的治疗剂可与本披露的C9orf寡核苷酸一起施用。
在一些实施例中，与第一C9orf72寡核苷酸一起施用的第二治疗剂是不同的第二C9orf72寡核苷酸。
在一些实施例中，本文中所披露的C9orf72寡核苷酸可用于用以预防和/或治疗C9orf72相关障碍或其症状的方法，或用于制造所述方法中使用的药剂。
在一些实施例中，本披露提供了以下示例实施例：
1.一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含糖、碱基或核苷酸间键联的至少一种修饰，其中所述寡核苷酸的碱基序列是或包含与C9orf72基因或其转录物的碱基序列至少80％相同或互补的碱基序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续碱基，并且所述寡核苷酸的3'端上的核碱基任选地被选自I、A、T、U、G和C的替换核碱基替换。
2.一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含糖、碱基或核苷酸间键联的至少一种修饰，其中所述寡核苷酸的碱基序列包含与C9orf72基因或其转录物的碱基序列相同或互补的碱基序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续碱基。
3.如实施例1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含与C9orf72基因或其转录物的碱基序列相同或互补的碱基序列的至少19个连续碱基。
4.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的碱基序列与C9orf72基因或其转录物的碱基序列或其任何部分不完全相同或互补。
5.如实施例4所述的寡核苷酸，其中当所述寡核苷酸的碱基序列进行比对以获得最大互补性时，在其3'端包含错配，所述错配不是选自A和T、A和U、以及C和G的碱基配对。
6.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的3’端核苷是肌苷。
7.如实施例1-3所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的碱基序列与C9orf72基因或其转录物的碱基序列完全相同或互补。
8.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的碱基序列是ACTCACCCACTCGCCACCGC。
9.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中在施用至包含含有重复扩增的C9orf72转录物的系统时，所述寡核苷酸降低所述C9orf72转录物的水平。
10.如实施例9所述的寡核苷酸，其中所述含有重复扩增的C9orf72转录物包含至少30、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个GGGGCC重复序列。
11.如实施例10所述的寡核苷酸，其中如通过百分比所测量，所述含有重复扩增的C9orf72转录物的水平降低是不含重复扩增的C9orf72转录物的水平降低的至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
12.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与C9orf72外显子1a、内含子1、外显子1b或外显子2中的位点杂交。
13.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个核苷酸间键联，其中所述键联磷呈Sp构型。
14.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含核心和至少两个翼，其中每个核心和每个翼独立地包含一个或多个核苷。
15.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含以下或由以下组成：5'-翼-核心-翼-3’结构。
16.如实施例14-15中任一项所述的寡核苷酸，其中5'-翼的糖修饰模式与3'-翼的糖修饰模式不同。
17.如实施例15-16中任一项所述的寡核苷酸，其中每个翼糖独立地包含2'-修饰。
18.如实施例15-16中任一项所述的寡核苷酸，其中每个翼糖独立地包含2’-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族。
19.如实施例15-16中任一项所述的寡核苷酸，其中一个翼包含2’-OMe，且另一个翼不包含。
20.如实施例15-16中任一项所述的寡核苷酸，其中一个翼包含2’-MOE，且另一个翼不包含。
21.如实施例15-16中任一项所述的寡核苷酸，其中一个翼包含2’-OMe且不包含2’-MOE，且另一个翼包含2’-MOE且不包含2’-OMe。
22.如实施例15-16中任一项所述的寡核苷酸，其中所述5'-翼包含一个或多个2'-OMe修饰的糖和一个或多个2’-MOE修饰的糖。
23.如实施例15-16中任一项所述的寡核苷酸，其中每个5’翼糖独立地是2’-OR修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族。
24.如实施例15-16中任一项所述的寡核苷酸，其中所述3'-翼包含一个或多个2'-OMe修饰的糖和一个或多个2’-MOE修饰的糖。
25.如实施例15-16中任一项所述的寡核苷酸，其中所述5'-翼在其5'端和3'端包含2'-OMe修饰的糖，并且在所述5'-翼中的其他每个糖独立地是2'-MOE修饰的糖。
26.如实施例15-25中任一项所述的寡核苷酸，其中所述5'-翼包含一个或多个天然磷酸酯键联。
27.如实施例15-26中任一项所述的寡核苷酸，其中所述5'-翼包含一个或多个一个或多个修饰的核苷酸间键联。
28.如实施例27所述的寡核苷酸，其中与所述5'-翼的5'的两个5'-翼核苷键合的第一核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联。
29.如实施例26-28中任一项所述的寡核苷酸，其中键合到两个5’-翼核苷的彼此的核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。
30.如实施例26-29中任一项所述的寡核苷酸，其中每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联。
31.如实施例26-29中任一项所述的寡核苷酸，其中一个或多个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联。
32.如实施例26-29和31中任一项所述的寡核苷酸，其中一个或多个经修饰的核苷酸间键联独立地是不带负电荷的核苷酸间键联。
33.如实施例30-32中任一项所述的寡核苷酸，其中每个硫代磷酸酯核苷酸间键联是Sp。
34.如实施例15-33中任一项所述的寡核苷酸，其中所述5'-翼包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核碱基。
35.如实施例15-33中任一项所述的寡核苷酸，其中所述5'-翼含有5个且不超过5个核碱基。
36.如实施例15-35中任一项所述的寡核苷酸，其中每个3’-翼糖独立地是2’-OR修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族。
37.如实施例15-35中任一项所述的寡核苷酸，其中所述3'-翼包含一个或多个2'-OMe修饰的糖和一个或多个2’-MOE修饰的糖。
38.如实施例15-35中任一项所述的寡核苷酸，其中每个3’-翼糖独立地是2’-OMe修饰的糖。
39.如实施例15-38中任一项所述的寡核苷酸，其中与两个3’-翼糖键合的一个或多个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。
40.如实施例15-39中任一项所述的寡核苷酸，其中与两个3’-翼糖键合的一个或多个核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。
41.如实施例15-38中任一项所述的寡核苷酸，其中键合到两个3’-翼糖的每个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。
42.如实施例39-41中任一项所述的寡核苷酸，其中每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联。
43.如实施例39-41中任一项所述的寡核苷酸，其中一个或多个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联。
44.如实施例39-41和43中任一项所述的寡核苷酸，其中一个或多个经修饰的核苷酸间键联独立地是不带负电荷的核苷酸间键联。
45.如实施例42-44中任一项所述的寡核苷酸，其中每个硫代磷酸酯核苷酸间键联是Sp。
46.如实施例14-45中任一项所述的寡核苷酸，其中所述3'-翼包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核碱基。
47.如实施例46所述的寡核苷酸，其中所述3'-翼含有5个且不超过5个核碱基。
48.如实施例46所述的寡核苷酸，其中所述3'-翼含有4个且不超过4个核碱基。
49.如实施例46所述的寡核苷酸，其中所述3'-翼含有3个且不超过3个核碱基。
50.如实施例14-49中任一项所述的寡核苷酸，其中所述核心不包含含有2’-OR的糖。
51.如实施例14-50中任一项所述的寡核苷酸，其中每个核心糖独立地包含两个2’-H。
52.如实施例14-51中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸或所述核心包含以下的骨架手性中心(键联磷)模式：
(Np)t[(Op/Rp)n(Sp)m]y，
其中：
t是1-50；
n是1-10；
m是1-50；
y是1-10；
Np是Rp或Sp；
Sp表示手性修饰的核苷酸间键联的手性键联磷的S构型；
Op表示天然磷酸酯键联的非手性键联磷；并且
Rp表示手性修饰的核苷酸间键联的手性键联磷的S构型；并且
y是1-10。
53.如实施例52所述的寡核苷酸，其中所述核心包含(Np)t[(Op/Rp)n(Sp)m]y的骨架手性中心模式。
54.如实施例52所述的寡核苷酸，其中所述核心的骨架手性中心模式是(Np)t[(Op/Rp)n(Sp)m]y。
55.如实施例52-54中任一项所述的寡核苷酸，其中每个Np是Sp。
56.如实施例52-55中任一项所述的寡核苷酸，其中所述模式包含至少一个Rp。
57.如实施例52-55中任一项所述的寡核苷酸，其中所述模式是(Np)t[(Rp)n(Sp)m]y。
58.如实施例52-57中任一项所述的寡核苷酸，其中至少一个n是1。
59.如实施例52-57中任一项所述的寡核苷酸，其中每个n是1。
60.如实施例52-59中任一项所述的寡核苷酸，其中y是1。
61.如实施例52-59中任一项所述的寡核苷酸，其中y是2。
62.如实施例52-61中任一项所述的寡核苷酸，其中t是2或更大。
63.如实施例52-61中任一项所述的寡核苷酸，其中t是3或更大。
64.如实施例52-61中任一项所述的寡核苷酸，其中t是2-20。
65.如实施例52-61中任一项所述的寡核苷酸，其中t是3-20。
66.如实施例52-65中任一项所述的寡核苷酸，其中至少一个m是2-20。
67.如实施例52-66中任一项所述的寡核苷酸，其中至少一个m是2。
68.如实施例52-65中任一项所述的寡核苷酸，其中至少一个m是3、4、5、6、7、8、9或10。
69.如实施例52-68中任一项所述的寡核苷酸，其中每个m独立地是2-20。
70.如实施例52-69中任一项所述的寡核苷酸，其中[(Op/Rp)n(Sp)m]y的第一次出现从5’是RpSpSp。
71.如实施例52-69中任一项所述的寡核苷酸，其中[(Op/Rp)n(Sp)m]y的第一次出现从5’是RpSpSpSp。
72.如实施例52-69中任一项所述的寡核苷酸，其中[(Op/Rp)n(Sp)m]y的第一次出现从5’是RpSpSpSpSp。
73.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的碱基序列包含与所述GGGGCC重复序列不相同或不互补的序列。
74.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的碱基序列包含与任何重复序列不相同或不互补的序列。
75.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的碱基序列与所述GGGGCC重复序列不相同或不互补。
76.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的碱基序列包含靶向C9orf72内含子序列的序列。
77.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的碱基序列包含与C9orf72基因或其转录物的内含子的碱基序列相同或互补的碱基序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续碱基。
78.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的碱基序列包含与C9orf72基因或其转录物的特征碱基序列相同或互补的碱基序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续碱基。
79.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸优先降低疾病相关C9orf72产物的水平。
80.如实施例79所述的寡核苷酸，其中所述产物是包含扩增的GGGGCC重复序列的转录物。
81.如实施例79所述的寡核苷酸，其中所述产物是包含至少30、50、100、200、300、400或500个GGGGCC重复序列的转录物。
82.如实施例79所述的寡核苷酸，其中所述产物是包含扩增的GGGGCC重复序列的反义转录物。
83.如实施例79所述的寡核苷酸，其中所述产物是二肽重复蛋白质。
84.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中每个不带负电荷的核苷酸间键联是n001。
85.一种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是WV-17819、WV-17820、WV-17821、WV-17822、WV-17885、WV-18851、WV-18852、WV-20761、WV-20762、WV-20763、WV-20764、WV-20765、WV-20766、WV-20767、WV-20768、WV-20769、WV-20770、WV-20771、WV-20772、WV-20773、WV-20774、WV-20775、WV-21145、WV-21146、WV-21147、WV-21148、WV-21149、WV-21150、WV-21151、WV-21152、WV-21153、WV-21154、WV-21155、WV-21156、WV-21157、WV-21158、WV-21159、WV-21160、WV-21161、WV-21162、WV-21163、WV-21164、WV-21165、WV-21166、WV-21167、WV-21168、WV-21169、WV-21170、WV-21171、WV-21172、WV-21173、WV-21174、WV-21206、WV-21207、WV-21208、WV-21209、WV-21259、WV-21344、WV-21345、WV-21346、WV-21347、WV-21442、WV-21443、WV-21445、WV-21446、WV-21506、WV-21507、WV-21508、WV-21509、WV-21510、WV-21511、WV-21512、WV-21513、WV-21514、WV-21515、WV-21516、WV-21517、WV-21518、WV-21519、WV-21520、WV-21521、WV-21522、WV-21523、WV-21524、WV-21525、WV-21526、WV-21552、WV-21553、WV-21554、WV-21555、WV-21556、WV-21557、WV-21558、WV-21559、WV-21560、WV-21561、WV-21562、WV-21563、WV-21564、WV-21565、WV-21566、WV-21567、WV-21568、WV-21569、WV-21570、WV-23435、WV-23436、WV-23437、WV-23438、WV-23439、WV-23440、WV-23441、WV-23442、WV-23443、WV-23444、WV-23453、WV-23454、WV-23455、WV-23456、WV-23457、WV-23458、WV-23459、WV-23460、WV-23461、WV-23462、WV-23486、WV-23487、WV-23488、WV-23489、WV-23490、WV-23491、WV-23492、WV-23493、WV-23494、WV-23495、WV-23496、WV-23497、WV-23498、WV-23503、WV-23648、WV-23649、WV-23650、WV-23740、WV-23741、WV-23742、WV-26633、WV-27092、WV-27093、WV-27094、WV-27095、WV-27104、WV-27105、WV-27106、WV-27107、WV-27108、WV-27109、WV-27110、WV-27134、WV-27135、WV-27136、WV-27137、WV-27138、WV-27139、WV-27140、WV-27141、WV-27142、WV-27143、WV-27144、WV-30206、WV-30210、WV-30211、或WV-30212。
86.如实施例67所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是WV-23491、WV-21445、WV-23457、WV-23453、WV-23742、WV-23741、WV-21522、WV-21446、WV-23486、WV-23457、WV-21522、WV-23453、WV-23487、或WV-30206、WV-30210、WV-30211、或WV-30212。
87.如实施例85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是WV-23491。
88.如实施例85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是WV-21445。
89.如实施例85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是WV-23457。
90.如实施例85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是WV-23453。
91.如实施例85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是WV-23742。
92.如实施例85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是WV-23741。
93.如实施例85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是WV-21522。
94.如实施例85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是WV-21446。
95.如实施例85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是WV-23486。
96.如实施例85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是WV-23457。
97.如实施例85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是WV-21522。
98.如实施例85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是WV-23453。
99.如实施例85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是WV-23487。
100.如实施例85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是WV-30206。
101.如实施例85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是WV-30210。
102.如实施例85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是WV-30211。
103.如实施例85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是WV-30212。
104.如实施例85-103中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸呈盐形式。
105.如实施例85-103中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸呈药学上可接受的盐形式。
106.如实施例1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是如实施例85-103中任一项所述的寡核苷酸。
107.一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含糖、碱基或核苷酸间键联的至少一种修饰，其中所述寡核苷酸的碱基序列包含与靶标基因或其转录物的碱基序列相同或互补的碱基序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续碱基，其中所述寡核苷酸的3'端上的核碱基任选地被选自I、A、T、U、G和C的不同核碱基替换。
108.如实施例1-107中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的3'端上的核碱基被选自I、A、T、U、G和C的替换核碱基替换。
109.如实施例1-108中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的3'端上的核碱基被选自I、A、T、U、G和C的替换核碱基替换，其中所述替换在所述寡核苷酸和在该位置的靶标核酸之间引入错配。
110.如实施例1-108中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的3'端上的核碱基被选自I、A、T、U、G和C的替换核碱基替换，其中所述替换在所述寡核苷酸和在该位置的靶标核酸之间引入摆动碱基对。
111.如实施例1-108中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的3'端上的核碱基被选自I、A、T、U、G和C的替换核碱基替换，其中所述替换提高所述寡核苷酸的活性。
112.如实施例1-111中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的3'端上的核碱基被选自I、A、T、U、G和C的替换核碱基替换，其中所述替换将所述寡核苷酸的活性提高至少25％。
113.如实施例1-111中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的3'端上的核碱基被选自I、A、T、U、G和C的替换核碱基替换，其中所述替换将所述寡核苷酸的活性提高至少50％。
114.如实施例1-111中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的3'端上的核碱基被选自I、A、T、U、G和C的替换核碱基替换，其中所述替换将所述寡核苷酸的活性提高至少100％。
115.如实施例1-111中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的3'端上的核碱基被选自I、A、T、U、G和C的替换核碱基替换，其中所述替换将所述寡核苷酸的活性提高至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍。
116.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸中的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的非对映异构纯度。
117.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其非对映异构纯度是至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
118.一种组合物，所述组合物包含如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸或其盐形式。
119.一种药物组合物，所述药物组合物包含或递送如实施例1-117中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐形式。
120.如实施例119所述的组合物，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
121.如实施例118-120中任一项所述的组合物，其中所述盐形式是寡核苷酸的钠盐。
122.如实施例118-121中任一项所述的组合物，其中所述组合物是手性受控的。
123.一种包含特定寡核苷酸类型的寡核苷酸的组合物，所述寡核苷酸的特征在于：
a)共同的碱基序列；
b)共同的骨架键联模式；
c)共同的骨架手性中心模式；
其中相对于具有相同共同的碱基序列的寡核苷酸的基本上外消旋制剂，组合物富集所述特定寡核苷酸类型的寡核苷酸；并且
其中所述寡核苷酸靶向C9orf72。
124.一种寡核苷酸组合物，所述寡核苷酸组合物包含具有以下各项的多个寡核苷酸：
a)共同的碱基序列；
b)共同的骨架键联模式；
c)共同的骨架手性中心模式；
其中所述组合物中所述多个寡核苷酸的水平不是随机的；并且
其中所述多个寡核苷酸各自独立地是如实施例1-117中任一项所述的寡核苷酸或其盐形式。
125.一种包含特定寡核苷酸类型的寡核苷酸的寡核苷酸组合物，所述寡核苷酸的特征在于：
a)共同的碱基序列；
b)共同的骨架键联模式；
c)共同的骨架手性中心模式；
其中相对于具有相同共同的碱基序列的寡核苷酸的基本上外消旋制剂，所述组合物富集所述特定寡核苷酸类型的寡核苷酸；并且
其中所述特定寡核苷酸类型的每个寡核苷酸独立地是如实施例1-117中任一项所述的寡核苷酸或其盐形式。
126.一种寡核苷酸组合物，所述寡核苷酸组合物包含多个寡核苷酸，其中：
所述多个寡核苷酸具有相同的构成；
所述多个寡核苷酸在一个或多个(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多个)手性受控的核苷酸间键联处共享相同的键联磷立体化学；
其中相对于具有相同共同的碱基序列的寡核苷酸的基本上外消旋制剂，所述组合物富集所述特定寡核苷酸类型的寡核苷酸；并且
所述多个寡核苷酸各自独立地是如实施例1-117中任一项所述的寡核苷酸或其盐形式。
127.如实施例123-126中任一项所述的组合物，其中富集所述组合物，使得所述组合物中所有与所述特定类型的寡核苷酸或所述多个寡核苷酸共享相同碱基序列的寡核苷酸的1％-100％(例如，约5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80-100％、90-100％、95-100％、50％-90％、或约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％、或至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)是所述特定类型的寡核苷酸或所述多个寡核苷酸。
128.一种寡核苷酸组合物，所述寡核苷酸组合物包含多个寡核苷酸，其中：
所述多个寡核苷酸具有相同的构成；
所述多个寡核苷酸在一个或多个(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多个)手性受控的核苷酸间键联处共享相同的键联磷立体化学；
在每个手性受控的核苷酸间键联处，所述组合物中所有共享相同构成的寡核苷酸中至少90％、95％、96％、97％、98％或99％共享相同的键联磷立体化学；并且
所述多个寡核苷酸各自独立地是如实施例1-117中任一项所述的寡核苷酸或其盐形式。
129.如实施例126-128中任一项所述的组合物，其中所述多个寡核苷酸在至少5个核苷酸间键联处共享相同的键联磷立体化学。
130.如实施例126-129中任一项所述的组合物，其中所述多个寡核苷酸独立地在每个硫代磷酸酯核苷酸间键联处共享相同的键联磷立体化学。
131.如实施例126-130中任一项所述的组合物，其中所述多个寡核苷酸独立地在一个或多个不带负电荷的核苷酸间键联处共享相同的键联磷立体化学。
132.如实施例126-130中任一项所述的组合物，其中所述多个寡核苷酸独立地在每个不带负电荷的核苷酸间键联处共享相同的键联磷立体化学。
133.如实施例126-130中任一项所述的组合物，其中所述多个寡核苷酸独立地在每个手性核苷酸间键联处共享相同的键联磷立体化学。
134.如实施例123-133中任一项所述的组合物，其中所述多个或类型的寡核苷酸共享相同的结构。
135.如实施例123-134中任一项所述的组合物，其中每个寡核苷酸独立地呈盐形式。
136.如实施例135中任一项所述的组合物，其中所述盐形式是钠形式。
137.一种药物组合物，所述药物组合物包含或递送如实施例123-136中任一项所述的组合物。
138.如实施例137所述的组合物，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
139.一种方法，所述方法包括向患有或易患与C9orf72扩增的重复序列有关的病症、障碍和/或疾病的受试者施用有效量的如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸或组合物。
140.如实施例139所述的方法，其中所述病症、障碍和/或疾病是肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、皮质基底节变性综合征(CBD)、非典型帕金森综合征、橄榄体桥脑小脑变性(OPCD)或阿尔兹海默病。
141.如实施例139所述的方法，其中所述病症、障碍和/或疾病是肌萎缩侧索硬化症(ALS)。
142.如实施例139所述的方法，其中所述病症、障碍和/或疾病是额颞叶痴呆(FTD)。
143.一种降低细胞中C9orf72靶标基因或其基因产物的活性、表达和/或水平的方法，所述方法包括将如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸或组合物引入所述细胞中。
144.一种用于减少细胞群中病灶的方法，所述方法包括使细胞与如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸或组合物接触。
145.如实施例144所述的方法，其中具有病灶的细胞百分比降低。
146.如实施例144-145中任一项所述的方法，其中每个细胞的病灶数目降低。
147.一种用于在细胞中相对于不含重复扩增的C9orf72 RNA转录物优先敲低含有重复扩增的C9orf72 RNA转录物的方法，所述方法包括使包含所述含有重复扩增的C9orf72RNA转录物及所述不含重复扩增的C9orf72 RNA转录物的细胞与如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸或组合物接触，
其中所述寡核苷酸包含存在于所述含重复扩增的C9orf72 RNA转录物中的序列或与所述含重复扩增的C9orf72 RNA转录物中的序列互补的序列，
其中所述寡核苷酸在细胞中相对于不含重复扩增的C9orf72 RNA转录物指导含重复扩增的C9orf72 RNA转录物的优先敲低。
148.说明书中描述的化合物、寡核苷酸、组合物或方法。
实例
用于制备寡核苷酸和寡核苷酸组合物(立体随机和手性受控的)的各种技术是已知的且可根据本披露使用，这些技术包括例如US 9394333、US 9744183、US 9605019、US9598458、US 9982257、US 10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、和/或WO 2019/032612中的那些，将这些文献每一者中的方法和试剂通过引用并入本文。
在一些实施例中，使用合适的手性助剂例如DPSE和PSM手性助剂制备寡核苷酸。根据本披露制备多种寡核苷酸(例如表A1中的那些寡核苷酸)及其组合物。
实例1.C9orf72寡核苷酸组合物在多种测定中具有活性和选择性
尤其是，如本文所证明的，本披露提供了可以有效地和/或选择性地降低与病症、障碍或疾病相关并包含扩增的重复序列的C9orf72转录物和/或由其编码的产物的表达、活性和/或水平的技术。在下表中：示出用C9orf72寡核苷酸处理后，多种C9orf72转录物[例如所有V转录物，仅V3转录物，等等]相对于HPRT1的剩余水平，其中1.000将表示100％相对转录物水平(无敲低)且0.000将表示0％相对转录物水平(例如100％敲低)。显示了重复实验的结果。WV-12890是非靶向性对照。实验是在ALS运动神经元中进行的。另外的测定条件在本文和/或WO 2019/032607中描述。
表1A.C9orf72寡核苷酸的活性
此表显示了敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(仅V3转录物)时多种C9orf72寡核苷酸的数据。与其他“仅V3转录物”评估一样，显示了C9orf72/HPRT1中V3的相对倍数变化。WV-9491是对照，是一种立体随机寡核苷酸组合物(描述：mC*m5CeoTeoTeomC*C*C*T*G*A*A*G*G*T*T*mC*mC*mU*mC*mC，碱基序列：CCTTCCCTGAAGGTTCCUCC，立体化学/核苷酸间键联：XOOOXXXXXXXXXXXXXXX，参见表A1的关键点)。
Figure BDA0003456638050001821
Figure BDA0003456638050001831
表1B.C9orf72寡核苷酸的活性
此表显示了敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(所有V转录物)时多种C9orf72寡核苷酸的数据。示出了C9orf72/HPRT1的相对倍数变化。
Figure BDA0003456638050001832
Figure BDA0003456638050001841
如所证明的，多种寡核苷酸组合物可以有效地和选择性地减少靶标转录物，例如可以含有扩增的重复序列并与多种病症、障碍或疾病相关的转录物(例如，V3转录物)。
表2A.C9orf72寡核苷酸的活性
此表显示了敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(仅V3转录物)时多种C9orf72寡核苷酸的数据。与其他“仅V3转录物”评估一样，显示了C9orf72/HPRT1中V3的相对倍数变化。
Figure BDA0003456638050001842
Figure BDA0003456638050001851
表2B.C9orf72寡核苷酸的活性
此表显示了敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(所有V转录物)时多种C9orf72寡核苷酸的数据。示出了C9orf72/HPRT1的相对倍数变化。
Figure BDA0003456638050001852
Figure BDA0003456638050001861
如所证明的，在多种寡核苷酸浓度下，多种寡核苷酸组合物可以有效地和选择性地减少靶标转录物，例如可以含有扩增的重复序列并与多种病症、障碍或疾病相关的转录物(例如，V3转录物)。
表3A.C9orf72寡核苷酸的活性
此表显示了敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(仅V3转录物)时多种C9orf72寡核苷酸(1uM)的数据。与其他“仅V3转录物”评估一样，显示了C9orf72/HPRT1中V3的相对倍数变化。
Figure BDA0003456638050001862
表3B.C9orf72寡核苷酸的活性
此表显示了敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(仅V3转录物)时多种C9orf72寡核苷酸(1uM)的数据。与其他“仅V3转录物”评估一样，显示了C9orf72/HPRT1中V3的相对倍数变化。
Figure BDA0003456638050001863
表3C.C9orf72寡核苷酸的活性
此表显示了敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(所有V转录物)时多种C9orf72寡核苷酸(1uM)的数据。示出了C9orf72/HPRT1的相对倍数变化。
Figure BDA0003456638050001871
表3D.C9orf72寡核苷酸的活性
此表显示了敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(所有V转录物)时多种C9orf72寡核苷酸(1uM)的数据。示出了C9orf72/HPRT1的相对倍数变化。
WV-8012 WV-23486 WV-28080 WV-28479 WV-28480 WV-9491
0.77 0.84 0.74 0.83 0.84 0.99
0.77 0.79 0.83 0.77 0.75 1.05
0.96 0.84 0.96 0.76 0.81 1.02
如所证明的，多种寡核苷酸组合物可以有效地和选择性地减少靶标转录物，例如可以含有扩增的重复序列并与多种病症、障碍或疾病相关的转录物(例如，V3转录物)。
表4A.C9orf72寡核苷酸的活性
此表显示了敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(仅V3转录物)时多种C9orf72寡核苷酸(1uM)的数据。与其他“仅V3转录物”评估一样，显示了C9orf72/HPRT1中V3的相对倍数变化。
Figure BDA0003456638050001881
表4B.C9orf72寡核苷酸的活性
此表显示了敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(所有V转录物)时多种C9orf72寡核苷酸(1uM)的数据。示出了C9orf72/HPRT1的相对倍数变化。
Figure BDA0003456638050001882
Figure BDA0003456638050001891
如所证明的，多种寡核苷酸组合物可以有效地和选择性地减少靶标转录物，例如可以含有扩增的重复序列并与多种病症、障碍或疾病相关的转录物(例如，V3转录物)。
表5A.C9orf72寡核苷酸的活性
此表显示了敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(V3转录物)时多种C9orf72寡核苷酸(1uM)的数据。示出了C9orf72/HPRT1的相对倍数变化。
Figure BDA0003456638050001892
Figure BDA0003456638050001901
表5B.C9orf72寡核苷酸的活性
此表显示了敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(所有V转录物)时多种C9orf72寡核苷酸(1uM)的数据。示出了C9orf72/HPRT1的相对倍数变化。
Figure BDA0003456638050001902
表5C.某些寡核苷酸的活性。
测试了多种C9orf72寡核苷酸在敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(V3转录物)中的功效。一组结果中的数据如下所示。
ID IC50
WV-8012 184.9nM
WV-28478 130.3nM
WV-26633 171.3nM
WV-30206 232.7nM
WV-30277 459.0nM
如所证明的，在多种寡核苷酸浓度下，多种寡核苷酸组合物可以有效地和选择性地减少靶标转录物，例如可以含有扩增的重复序列并与多种病症、障碍或疾病相关的转录物(例如，V3转录物)。
表6.C9orf72寡核苷酸的活性
此表显示了敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(V3转录物)时多种C9orf72寡核苷酸(1uM)的数据。示出了C9orf72/HPRT1的相对倍数变化。
Figure BDA0003456638050001911
Figure BDA0003456638050001921
表7.C9orf72寡核苷酸的活性
此表显示了敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(所有V转录物)时多种C9orf72寡核苷酸(1uM)的数据。示出了C9orf72/HPRT1的相对倍数变化。
Figure BDA0003456638050001922
Figure BDA0003456638050001931
如所证明的，多种寡核苷酸组合物可以有效地和选择性地减少靶标转录物，例如可以含有扩增的重复序列并与多种病症、障碍或疾病相关的转录物(例如，V3转录物)。
表8A.C9orf72寡核苷酸的活性
此表显示了敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(V3转录物)时多种C9orf72寡核苷酸(1uM)的数据。示出了C9orf72/HPRT1的相对倍数变化。
Figure BDA0003456638050001941
Figure BDA0003456638050001951
表8B.C9orf72寡核苷酸的活性
此表显示了敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(所有V转录物)时多种C9orf72寡核苷酸(1uM)的数据。示出了C9orf72/HPRT1的相对倍数变化。
Figure BDA0003456638050001952
Figure BDA0003456638050001961
如所证明的，多种寡核苷酸组合物可以有效地和选择性地减少靶标转录物，例如可以含有扩增的重复序列并与多种病症、障碍或疾病相关的转录物(例如，V3转录物)，包括含有3'端替换核碱基和/或错配/摆动的寡核苷酸的那些转录物。
表9A.C9orf72寡核苷酸的活性
此表显示了敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(仅V3转录物)时多种C9orf72寡核苷酸的数据。与其他“仅V3转录物”评估一样，显示了C9orf72/HPRT1中V3的相对倍数变化。
Figure BDA0003456638050001962
Figure BDA0003456638050001971
表9B.C9orf72寡核苷酸的活性
此表显示了敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(所有V转录物)时多种C9orf72寡核苷酸的数据。示出了C9orf72/HPRT1的相对倍数变化。
Figure BDA0003456638050001972
Figure BDA0003456638050001981
表9C.某些寡核苷酸的活性。
测试了多种C9orf72寡核苷酸在敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(V3转录物)中的功效。一组结果中的数据如下所示。
Figure BDA0003456638050001982
Figure BDA0003456638050001991
如所证明的，在多种寡核苷酸浓度下，多种寡核苷酸组合物可以有效地和选择性地减少靶标转录物，例如可以含有扩增的重复序列并与多种病症、障碍或疾病相关的转录物(例如，V3转录物)。
表10A.C9orf72寡核苷酸的活性
此表显示了敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(仅V3转录物)时多种C9orf72寡核苷酸的数据。与其他“仅V3转录物”评估一样，显示了C9orf72/HPRT1中V3的相对倍数变化。
Figure BDA0003456638050001992
Figure BDA0003456638050002001
表10B.C9orf72寡核苷酸的活性
此表显示了敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(所有V转录物)时多种C9orf72寡核苷酸的数据。示出了C9orf72/HPRT1的相对倍数变化。
Figure BDA0003456638050002002
表10C.某些寡核苷酸的活性。
测试了多种C9orf72寡核苷酸在敲低ALS运动神经元中的C9orf72转录物(V3转录物)中的功效。一组结果中的数据如下所示。
ID IC50
WV-30210 318.2nM
WV-37246 736.3nM
如所证明的，在多种寡核苷酸浓度下，多种寡核苷酸组合物可以有效地和选择性地减少靶标转录物，例如可以含有扩增的重复序列并与多种病症、障碍或疾病相关的转录物(例如，V3转录物)。
实例2.某些体外筛选方案
依照本披露，可以利用多种技术来评估所提供技术的特性和/或活性。此实例描述C9orf72寡核苷酸的体外筛选方案。
在24孔盘中，将寡核苷酸裸式(gymnotically)递送至ALS神经元后保持48小时。
RNA提取
根据以下方案用RNeasy Plus 96试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，沃尔瑟姆(Waltham)，马萨诸塞州(Mass.))进行RNA提取：使用真空/自旋技术自细胞纯化总RNA(gDNA去除是关键)。对于每个孔，将总RNA在60ul不含RNA酶的水中进行洗脱。
反转录
用大容量RNA-to-cDNATM试剂盒(应用生物系统公司(Applied Biosystems)；可购自赛默飞世尔公司,沃尔瑟姆,马萨诸塞州)进行反转录
2X RT缓冲液混合物 9ul
RNA样品 13.5ul
在72℃下进行5分钟热变性，在冰上使板冷却至少2分钟。
向具有热变性的RNA的每个孔中添加：
2X RT缓冲液混合物 6
20X RT酶混合物 1.5ul
cDNA的最终体积是30ul。
实时PCR
Taqman探针：
C9orf72所有变体：Hs00376619_m1(FAM)，目录号4351368(赛默飞世尔公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)
C9orf72 V3：Hs00948764_m1(FAM)，目录号4351368(赛默飞世尔公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)
C9orf72外显子1a：
正向引物 AGATGACGCTTGGTGTGTC
反向引物 TAAACCCACACCTGCTCTTG
探针 CTGCTGCCCGGTTGCTTCTCTTT
C9orf72反义RNA/内含子：
正向引物 GGTCAGAGAAATGAGAGGGAAAG
反向引物 CGAGTGGGTGAGTGAGGA
探针 AAATGCGTCGAGCTCTGAGGAGAG
内部对照：人类HPRT1(VIC)
Hs02800695_m1，目录号4448486(赛默飞世尔公司,沃尔瑟姆,马萨诸塞州)
PCR反应：
Figure BDA0003456638050002021
*2ul cDNA用于所有变体探针。9ul cDNA用于其他C9探针。
使用Bio-rad CFX96 Touch进行实时PCR
运行信息：
1 95.0C持续3:00
2 95.0C持续0:10
3 60.0C持续0:30
+ 板读取
4 GOTO 2，另外39次
结束
实例3.C9orf72寡核苷酸组合物在多种测定中具有活性和选择性
在多种测定中评估所提供的寡核苷酸和组合物，尤其用以证明活性和/或选择性。
所进行的各种测定的简要说明：
报告子：
萤光素酶测定，如本文所述。对于一些寡核苷酸，给出两个数字(例如，对于WV-6408的1.32/2.63)；这些数字表示重复实验。
ALS神经元：
iPSC的神经元分化：自C9orf72相关的ALS患者(女性，64岁)的成纤维细胞衍生的iPSC获得自RUCDR Infinite Biologics公司。将iPSC以集落形式维持在mTeSR1培养基(干细胞技术公司(STEMCELL Technologies)，温哥华(Vancouver)，不列颠哥伦比亚省(BC))中的Corning Matrigel基质(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，圣路易斯(St.Louis)，密苏里州(MO))上。使用STEMdiff神经系统(干细胞技术公司，温哥华，不列颠哥伦比亚省)产生神经祖细胞。将iPSC悬浮于AggreWell800平板中，并在STEMdiff神经诱导培养基中经5天生长成胚状体，每天更换75％的培养基。使用37μm细胞过滤器收集胚状体，并将其铺板至经Matrigel涂覆的平板上的STEMdiff神经诱导培养基中。每天更换培养基，持续7天，铺板后2天85％-95％的胚状体出现神经玫瑰结(rosette)。手动拾取玫瑰结，且将其转移至用聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白涂覆的平板的STEMdiff神经诱导培养基(干细胞技术公司，温哥华，不列颠哥伦比亚省)中。每天更换培养基，持续7天，直至细胞达到90％汇合，且将其视为神经祖细胞(NPC)。将NPC用TrypLE(Gibco，可获得自赛默飞世尔公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)分离，并使其在补充有生长因子(20ng/ml FGF2、20ng/ml EGF、5μg/ml肝素)的神经维持培养基(NMM、70％DMEM、30％Ham's F12、1X B27补充剂)中在聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白平板上以1:2或1:3的比率进行传代。为了成熟为神经元，维持NPC且使其扩增少于五代，并在>90％汇合下使其在补充有生长因子的NMM中在聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白涂覆的平板上以1:4进行传代。第二天，即分化的第0天，将培养基更换成不含生长因子的新鲜NMM。将进行分化的神经元维持在NMM中，持续4周或更多周，每周两次更换50％的培养基。根据需要用TrypLE以125,000个细胞/cm2的密度重新铺板细胞。
V3/内含子：在ALS神经元中测量V3 RNA转录物及内含子RNA转录物的敲低(KD)。野生型及含有重复序列的V3转录物(WO2019/032607的图1中表示为“健康等位基因”V3及“病理性等位基因”V3)均被敲低。然而，应注意，虽然本披露不受任何特定理论束缚，但含重复序列的转录物在细胞核中可滞留更长时间，且因此可优先被敲低。内含子转录物由WO2019/032607的图1中向后的AS箭头表示。两个数字表示V3及内含子敲低；举例而言，对于WV-6408，V3被敲低59％且内含子被敲低65％。
稳定性：
使用小鼠(Ms)脑匀浆进行体外稳定性测定。
TLR9：
TLR9报告子测定方案：使用人类TLR9或小鼠TLR9报告子测定(HEK-BlueTM TLR9细胞，英杰公司(InvivoGen)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州(California))来分析NF-κB(NF-κB诱导型SEAP)活性的诱导。将浓度为50μM(330μg/mL)且2倍连续稀释的寡核苷酸以在水中的20μL的最终体积铺板至96孔板中。将HEK-BlueTM TLR9细胞以7.2x104个细胞的密度添加至各孔的180μL体积的HEK BlueTM检测培养基中。这些孔中的寡核苷酸的最终工作浓度是5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078和0.0375μM。将HEK-BlueTM TLR9细胞与寡核苷酸一起在37℃及5％CO2下温育16小时。温育结束时，通过Spectramax测量655nM下的吸光度。水为阴性对照。阳性对照是WV-2021和ODN2359(CpG寡核苷酸)。结果表达为相对于经媒介物对照处理的细胞的NF-κB活化倍数变化。参考：人类TLR9激动剂试剂盒(英杰公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)。在此测定中，如果未检测到或基本上未检测到活性，则认为寡核苷酸被“清除”。在一些实验中，WV-8005、WV-8006、WV-8007、WV-8008、WV-8009、WV-8010、WV-8011、WV-8012和WV-8321未显示出可评估的hTLR9活性，但一些显示出较小mTRL9活性。
补体：
在一些实施例中，在食蟹猴血清补体活化离体测定中对补体进行评估。在离体食蟹猴血清中测量寡核苷酸对补体活化的影响。合并来自3只单独雄性食蟹猴的血清样品，并将合并物用于研究。
通过在37℃下在新鲜解冻的食蟹猴血清(1:30比率，v/v)中温育最终浓度为330μg/mL的寡核苷酸或水对照物，来测量C3a产生的时程。具体而言，将9.24μL的在媒介物中的10mg/mL寡核苷酸原液或仅媒介物添加至270.76μL的合并的血清中，并将所得混合物在37℃下温育。在0、5、10和30分钟处，收集20-μL等分试样，并通过添加2.2μL的18mg/mL EDTA而立即终止反应。
使用MicroVue C3a加酶免疫测定，以1:3000的稀释度测量C3a浓度。结果呈现为，与用媒介物对照处理相比，在用寡核苷酸处理经合并的血清后，补体裂解产物的浓度增加。
PD(药效学)(C9-BAC，icv或脑室内注射)：
在C9orf72-BAC(C9-BAC)小鼠模型中测试PD及效力：
用于体内药理学研究的转基因小鼠已描述于O'Rourke等人2015Neuron.[神经元]88(5):892-901中。简言之，使用自患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)的患者的成纤维细胞衍生的细菌人工染色体(BAC)克隆来设计转基因构建体，使得人类9号染色体的开放阅读框72基因(C9orf72)在交替剪接的非编码第一外显子1a与1b之间的内含子中具有六核苷酸重复扩增(GGGGCC)(变体3)。BAC分离出约166kbp的序列(约36kbp的人类C9orf72基因组序列，其中约110kbp为上游序列且约20kbp为下游序列)。在扩增不同BAC亚克隆之后，使用受限收缩成100-1000个GGGGCC重复序列的一个亚克隆。Tg(C9orf72_3)系112小鼠(JAX库存编号023099，杰克逊实验室公司(Jackson Laboratories)，巴尔港(Bar Harbor)，缅因州(Maine))具有C9orf72_3转基因的若干串联拷贝，其中每个拷贝具有100-1000个重复序列([GGGGCC]100-1000)。然而，仅选择表达500个或更多个重复序列的小鼠用于本文所使用的体内研究。
体内程序：
针对将寡核苷酸注射至侧脑室中，麻醉小鼠且将其放置于啮齿动物立体定位设备上；然后在其侧脑室之一中植入不锈钢引导套管(坐标：前囟后方-0.3mm，横向+1.0mm及竖直-2.2mm)，使用牙粘固粉将该套管固定在适当的位置。在注射化合物之前，使小鼠度过一周恢复期。典型药理学研究涉及在第1天注射达2.5μl体积的50μg寡核苷酸，接着在第8天进行相同量和体积的另一次注射。在第15天执行安乐死；将小鼠用阿佛丁深层麻醉且穿心灌注盐水。自头颅快速去除脑，一个半球经处理以用于组织学分析，另一半球经解剖且在干冰上冷冻以用于生物化学分析。类似地，解剖脊髓且在干冰上冷冻(腰脊髓)或处理脊髓以用于组织学分析(颈部/胸部脊髓)。
功效(C9-BAC)：病灶：
组织制备和组织学分析
将半脑和脊髓固定于4％多聚甲醛中保持24小时，然后将其转移至30％蔗糖中保持24-48小时并在液氮中冷冻。在-18℃下于低温恒温器中切下20-μm厚的连续矢状切片，并将其放置于Superfrost载玻片上。
功效(C9-BAC)：聚GP(DPR测定)：
用于蛋白质和聚GP量化的组织制备：
使用2步骤提取程序来处理脑和脊髓样品；每个步骤之后，在4℃下以10,000rpm离心10分钟。第一步骤由以下组成：将样品在RIPA(50mM Tris、150mM NaCl、0.5％DOC、1％NP40、0.1％SDS和CompleteTM，pH 8.0)中均质化。第二步骤由以下组成：将沉淀重新悬浮于5M胍-HCl中。
使用基于中尺度的测定在各合并物中量化聚GP。简言之，将多克隆抗体AB1358(密理博公司(Millipore)，可获得自密理博西格玛公司(Millipore Sigma)，比勒利卡(Billerica)，马萨诸塞州)用作捕获和检测抗体。在4℃下，将多阵列96Sm点滴板包SECTOR板用直接在小点上的、在PBS中的1μl的10ug/ml纯化的抗聚GP抗体(密理博公司，AB1358，可获得自密理博西格玛公司，比勒利卡，马萨诸塞州)涂覆过夜。用PBST(在PBS中的0.05％吐温-20)洗涤3次后，在室温下，将板用MSD阻断剂A试剂盒(R93AA-2)或10％FBS/PBS阻断，持续1小时。将自HEK-293细胞纯化(通过在质粒转染之后进行抗FLAG亲和纯化，金斯瑞公司(Genescript)定制)的聚GP用10％FBS/PBS进行连续稀释，且用作标准品。将25μl的标准品聚GP和样品(经稀释或未经稀释的)添加至各孔，在室温下温育1-2小时。用PBST洗涤3次后，每孔添加25μl经磺基标记的抗GP(AB1358)，且在室温下再温育一小时。然后洗涤板3次，向各孔中添加150μl/孔的MSD读取缓冲液T(1x)(R92TC-2，MSD)，并根据制造商的默认设置通过MSD(MESO QUICKPLEX SQ 120)进行读数。
通过蛋白质印迹法测定C9orf72蛋白质的表达。简言之，通过4％-12％SDS-PAGE(标准凝胶，伯乐公司(Bio-Rad))对来自RIPA提取物的蛋白质进行大小分级，且将其转移至PVDF膜上。为了检测C9orf72，使用小鼠单克隆抗C9orf72抗体GT779(1:2000；吉恩特克斯公司(GeneTex)，尔湾市(Irvine)，加利福尼亚州)然后使用DyLight缀合的二抗对膜进行免疫印迹。使用Odyssey/Li-Cor成像系统进行可视化。
一些其他缩写：
Cx：皮质
HP：海马
KD：敲低
SC：脊髓
Str：纹状体
实例4.某些其他方案
本领域技术人员将理解，根据本披露，多种技术可用于评估所提供的技术。下文呈现了实验的某些其他可用方案。
本文中描述了用于检测靶标核酸的杂交测定的非限制性实例。这种测定可用于检测和/或量化C9orf72寡核苷酸、或针对任何靶标(包括并非C9orf72的靶标)的任何其他核酸或寡核苷酸。
药代动力学研究：
用于寡核苷酸量化和转录物量化的组织制备：解剖组织，并新鲜冷冻于预先称重的微量离心管中。通过对管重新称重来计算组织重量。将4体积的Trizol或裂解缓冲液(4M胍；0.33％N-月桂肌氨酸；25mM柠檬酸钠；10mM DTT)添加到一单位重量(1mg组织添加4μl缓冲液)中。在4C下，通过Precellys Evolution组织匀浆器(贝尔坦科技公司(BertinTechnologies)，蒙蒂尼勒托讷(Montigny-le-Bretonneux)，法国)进行组织裂解，直至所有组织块溶解为止。将30-50μl的组织裂解物保存于96孔板中以进行PK测量，并将其余裂解物在-80C下储存(如果其处于裂解缓冲液中)或继续进行RNA提取(如果其处于Trizol缓冲液中)。
转录物量化：
杂交探针(IDT-DNA)
捕获探针：“C9-内含子-帽”/5AmMC12/TGGCGAGTGG
检测探针：“C9-内含子-Det”：GTGAGTGAGG/3BioTEG/
5AmC12是具有C12接头的5'-胺。
3BioTEG是生物素化的探针。
在37C下，用含500nM的50μl捕获探针的2.5％NaHCO3(吉博公司(Gibco)，25080-094)涂布经马来酸酐活化的96孔培养盘(Pierce 15110)后保持2小时。然后将板用PBST(PBS+0.1％吐温-20)洗涤3次，并用5％脱脂乳-PBST在37C下阻断1小时。将有效负载寡核苷酸连续稀释至基质中。将该标准品与原始样品一起用裂解缓冲液(4M胍；0.33％N-月桂基肌氨酸；25mM柠檬酸钠；10mM DTT)稀释，使得所有样品中的寡核苷酸量小于50ng/ml。将20μl的稀释的样品与PBST中稀释的180μl的333nM检测探针混合，然后在PCR机器(65℃10min，95℃15min，4℃∞)中变性。50μl变性的样品在封闭的ELISA板中一式三份进行分配，并在4℃温育过夜。在用PBST洗涤3次后，添加在PBST中的1:2000链霉亲和素-AP(SouthernBiotech公司，7100-04)，每孔50μl，并在室温下温育1小时。用PBST充分洗涤后，添加100μl的AttoPhos(普洛麦格公司(Promega)S1000)，在室温在黑暗中温育10min，并在平板读数器(分子仪器公司(Molecular Device)，M5)上读取荧光通道：Ex435 nm，Em555 nm。根据标准曲线，通过4参数回归计算样品中的寡核苷酸。
针对GGGGCC和GGCCCC RNA病灶的FISH方案
固定：
使载玻片在室温下干燥30分钟，然后在4％PFA中固定20分钟。固定后，将载玻片在PBS中洗涤3次，然后在4℃下于70％预冷却乙醇中储存至少30分钟。
预杂交：
将载玻片在FISH洗涤缓冲液(40％甲酰胺、在DEPC水中的2XSSC)中再次水合，持续10分钟。在载玻片上添加杂交缓冲液(40％甲酰胺、2X SSC、0.1mg/ml BSA、0.1g/ml硫酸葡聚糖、1％硫酸氧钒复合物、在DEPC水中的0.25mg/ml tRNA)，并在55℃下温育30分钟。
探针的制备：
使Cy3-(GGCCCC)3探针(检测有义重复扩增)和Cy3-(GGGGCC)3探针(检测反义重复扩增)在95℃下变性，持续10分钟。在冰上冷却后，用冷杂交缓冲液将探针稀释至200ng/ml。
杂交：
将载玻片简单地用FISH洗涤缓冲液洗涤，且将经稀释的探针添加至载玻片上。将载玻片在55℃下于杂交仪中温育3小时。杂交后，将载玻片在55℃下用FISH洗涤缓冲液洗涤3次，每次洗涤15分钟。然后将载玻片简单地用1XPBS洗涤一次。
神经元核免疫荧光染色：
将载玻片用阻断溶液(在PBS中的2％正常山羊血清)阻断1小时。将抗NeuN抗体(MAB377，密理博公司)在阻断溶液中以1:500稀释，并在4℃应用于载玻片过夜。然后将载玻片用PBS洗涤3次，并与具有Alexa Fluor 488的1:500稀释的山羊抗小鼠二抗(生命技术公司(Life technology))一起在室温下温育1小时。然后将载玻片用PBS洗涤3次。最后，将载玻片用DAPI封片以供成像。
成像和病灶量化：
用40X放大率的RPI旋转盘共焦显微镜(蔡司公司(Zeiss))拍摄图像。收集488、CY3和DAPI通道。利用ImageJ软件(NIH)量化RNA病灶。
多种技术(试剂、方法、构建等)是合适的，并且被用于多种寡核苷酸的制造、表征、测试等。某些此类技术如下所述。
实验人员从第三方供应商那里获得了某些基于磷酸二酯和立体随机的PS修饰寡核苷酸的合成；此类寡核苷酸也可以使用标准固相寡核苷酸合成方案来制备。实验人员按照所述方法制备了多种化学修饰的、手性受控的寡核苷酸和组合物，有时从制备到制备都有一定的修饰。可以用于手性受控的寡核苷酸合成的某些技术包括在以下中描述的那些技术：Iwamoto,N.等人Control of phosphorothioate stereochemistry substantiallyincreases the efficacy of antisense oligonucleotides[硫代磷酸酯立体化学的控制实质上提高了反义寡核苷酸的功效].Nat Biotechnol[自然生物技术]35,845-851,doi:10.1038/nbt.3948(2017)；Butler,D.C.D.等人Compounds,Compositions and Methodsfor Synthesis[化合物、组合物和合成方法].WO 2018237194(2018)；以及Butler,D.,Iwamoto,N.,Meena,M.,Svrzikapa,N.,Verdine,G.L.,Zlatev,I.Chiral Control[手性控制].WO 2014012081(2014)。
在一些实施例中，在Varian MERCURY 300、400或500NMR光谱仪或Brukar BioSpinGmbH NMR光谱仪上以适当的参考记录NMR光谱(1H NMR、13C NMR和31P NMR)。ESI高分辨质谱记录在Agilent 6230ESI TOF上。
在一些实施例中，用于分析/表征某些寡核苷酸和组合物的有用技术是LC-HRMS和HPLC。下面以某些程序为例进行说明；本领域技术人员将理解，可以调整某些或所有参数。
反相HPLC。在60℃下，使用缓冲液A(200mM六氟异丙醇和8mM三乙胺的水溶液)和缓冲液B(甲醇)作为洗脱液，其中缓冲液B的梯度为5％-30％，将每种低聚物的10μL 5μM溶液注入分析HPLC柱(Poroshell 120EC-C18,2.7μm,2.1x 50mm,Agilent(安捷伦公司))。在254nm和280nm处记录UV吸收。
DNA构建体。对于萤光素酶报道基因测定，在一些实施例中，实验人员将C9orf72序列引入到psiCHECK-2载体(Promega)的NotI位点，其位于hRluc基因的3′-UTR中间。C9orf72序列包含内含子1周围约1Kb的DNA，包括外显子1a和1b以及该基因的下游区域。
动物。根据适当的动物护理和动物护理和使用指南使用动物进行多种动物实验。对于体内研究，实验人员使用了C9BAC转基因小鼠[O'Rourke,J.G.等人C9orf72 BACTransgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD[C9orf72 BAC转基因小鼠显示ALS/FTD的典型病理特征].Neuron[神经元]88,892-901,doi:10.1016/j.neuron.2015.10.027(2015)]Tg(C9orf72_3)编号023099,杰克逊实验室公司(JacksonLaboratories))，它们具有C9orf72转基因的几个串联拷贝，每个拷贝具有100至1,000个重复序列。为了进行本文的研究，实验人员选择了10到12周龄的表达≥500次重复序列的小鼠。实验人员使用了雄性和雌性小鼠。对于立体定位手术下的脑室内(ICV)插管，实验人员将小鼠(阿佛丁)麻醉并置于啮齿动物立体定位器上；然后在其侧脑室之一中植入不锈钢引导套管(坐标：前囟后方-0.3mm，横向+1.0mm及竖直-2.2mm)，实验人员使用牙粘固粉将该套管固定在适当的位置。允许小鼠恢复一周。
在剂量递增研究中，实验人员在第1天和第8天以2.5μL的剂量施用了8μg、20μg或50μg的ASO，并在首次注射后2周对小鼠进行了尸检。在为期2周的多剂量研究中，实验人员在第1天和第8天以2.5μL的剂量施用了50μg寡核苷酸，并按照上述方法对小鼠进行了尸检。在行动研究期间，实验人员在给药后的三个时间点(2、4和8周，每组每个时间点n＝5-8)对小鼠进行了评估。对于单剂量持续时间研究，实验人员在第1天注射了2.5μL的100μg寡核苷酸，并在给药后48小时(每组n＝6)、1周(n＝6)、2周(n＝6)、8周(n＝6)和12周(n＝6)对小鼠进行了评估。尸体剖检时，在阿佛丁麻醉下对小鼠进行穿心灌注盐水。实验人员迅速从头颅快速去除脑；实验人员将一个半球进行组织学分析(滴定在10％福尔马林中固定)，而实验人员将另一半解剖成皮质、海马、纹状体和小脑，并在干冰上冷冻进行生化分析。同样，实验人员解剖脊髓并在干冰上冷冻，或对其进行处理以进行组织学分析。
细胞模型。在一些实施例中，使用细胞模型评估寡核苷酸和/或组合物。实验人员从ATCC获得了Cos-7细胞。源自患者成纤维细胞的iPSC来自一名C9orf72相关的ALS女性患者(64岁，RUCDR Infinite Biologics公司)。实验人员在mTeSR1培养基(干细胞技术公司(STEMCELL Technologies))中将iPSC保留为Corning Matrigel基质(密理博西格玛公司)上的菌落。神经祖细胞是在STEMdiff神经系统(干细胞技术公司)中生产的。将iPSC悬浮于AggreWell800平板中，并在STEMdiff神经诱导培养基中经5天生长成胚状体，每天更换75％的培养基。实验人员用37μm的细胞过滤器收获胚状体，然后将其铺板在STEMdiff神经诱导培养基中的Matrigel包被板上，该培养基每天更换持续7天，铺板后2天有85％-95％的胚状体出现神经玫瑰结(rosette)。手动选取玫瑰结，且将其转移至用聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白涂覆的平板的STEMdiff神经诱导培养基(干细胞技术公司)中。实验人员每天更换培养基，直至细胞达到90％汇合(7天)，且将其视为神经祖细胞(NPC)。实验人员将NPC用TrypLE(赛默飞世尔公司)分离，并使其在补充有生长因子(20ng/mL FGF2、20ng/mL EGF、5μg/mL肝素)的神经维持培养基(NMM、70％DMEM、30％Ham's F12、1X B27补充剂)中在聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白平板上以1:2或1:3的比率进行传代。为了成熟为神经元，实验人员维持NPC且使其扩增<5代，并在>90％汇合下实验人员使其在补充有生长因子的NMM中在聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白涂覆的平板上以1:4进行传代。第二天，即分化的第0天，实验人员将培养基更换成不含生长因子的新鲜NMM。将进行分化的神经元维持在NMM中，持续≥4周，每周两次更换50％的培养基。根据需要用TrypLE以125,000个细胞/cm2的密度重新铺板细胞。通过BrainXell对源自同一患者iPSC系的运动神经元进行了区分，并植入了其标准方案。C9-ALS原代成纤维细胞是从两个不相关的C9携带者的皮肤活检中产生的，每个携带超过1,000个重复序列。简而言之，实验人员将活组织检查的皮肤切成小块，然后与补充有15％FBS的DMEM培养，以允许成纤维细胞扩增。实验人员从E15.5 C9-BAC转基因胚胎生成了原代皮层神经元。O'Rourke,J.G.等人C9orf72 BAC Transgenic Mice Display TypicalPathologic Features of ALS/FTD[C9orf72 BAC转基因小鼠显示ALS/FTD的典型病理特征].Neuron[神经元]88,892-901,doi:10.1016/j.neuron.2015.10.027(2015)。实验人员在冰冷的汉克(Hank)平衡盐溶液(ThermoScientific公司)上解剖了每个胚胎的皮层组织。切碎合并的组织，并在37℃下用0.05％胰蛋白酶-EDTA(生命技术公司)消化12min。通过添加10％FBS/DMEM停止消化。研磨细胞，重悬于补充了Glutamax(ThermoScientific公司)、2％青霉素/链霉素和B27补充剂(ThermoScientific公司)的神经基础培养基中，并以0.5×106个细胞/孔的密度接种在预先涂有聚鸟氨酸(西格玛公司(Sigma))的6孔板中。iCell神经元(iNeurons)可从细胞动力国际公司(Cellular Dynamics International)商购获得。iPSC衍生的运动神经元可从BrainXell商购获得。实验人员在ALS运动神经元的全剂量反应测定(10、2.5、0.625、0.16、0.04和0.001μM)中计算了IC50。简而言之，实验人员在1周后通过裸式递送寡核苷酸并评估了上述转录水平。实验人员使用GraphPad软件对变量斜率(4个参数)使用非线性回归来拟合数据。
DNA印迹。使用Gentra Puregene Tissue试剂盒(凯杰公司)从ALS iPSC、ALS运动神经元和C9 BAC转基因小鼠中分离基因组DNA。将10μg DNA在37℃下用AluI和DdeI消化过夜，然后在0.6％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，转移到带正电的尼龙膜(罗氏应用科学公司(Roche Applied Science))上，通过暴露于紫外(UV)光下进行交联，并在55℃在杂交缓冲液(EasyHyb，罗氏公司(Roche))中用地高辛标记的(G2C4)5DNA探针杂交过夜。使用抗地高辛抗体(目录号11093274910，罗氏公司)和CDP-Star试剂按照制造商的建议检测探针。
热变性(Tm)。将等摩尔量的替代RNA(5'-GGUGGCGAGUGGGUGAGUGAGGAG)、U1模拟物(5'-AUACUUACCUGG)或ASO溶解在1X PBS中，以获得每条链1μM的最终浓度。然后通过在90℃加热，然后缓慢冷却至4℃并在4℃储存的条件下对双链样品进行退火。使用Cary系列UV-Vis分光光度计(安捷伦科技公司(Agilent Technologies))，以每分钟+0.5℃的速率将温度从5℃或15℃升高到95℃，以30秒的间隔记录254nm处的UV吸收。将吸光度相对于温度作图，并通过取每条曲线的一阶导数来计算Tm值。
RNA酶H测定。对于某些RNA酶H测定，实验人员将异源双链体与人类RNA酶HC(如Iwamoto,N.等人Control of phosphorothioate stereochemistry substantiallyincreases the efficacy of antisense oligonucleotides[硫代磷酸酯立体化学的控制大大提高了反义寡核苷酸的功效].Nat Biotechnol[自然生物技术]35,845-851,doi:10.1038/nbt.3948(2017)所述制备)在37℃下温育。实验人员通过混合等摩尔(每个20μM)的ASO和/或U1模拟物和RNA溶液来制备双链体。每个反应在RNA酶H缓冲液(75mM KCl、50mMTris-HCl、3mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇，pH＝8.3)中含有5.6μM ASO-RNA、U1模拟RNA或ASO-U1模拟RNA杂合物，反应体积为90μL。在添加酶+U1模拟物、酶+ASO或单独的终浓度比率为2,000:1、1,000:1或500:1底物:RNA酶HC的酶之前，将预混合物在37℃下温育10分钟。实验人员使用7.0μL的500mM EDTA二钠水溶液在5、10、15、30、45和60min时淬灭了反应。对于0min的时间点，实验人员在酶之前将EDTA加入到反应混合物中。实验人员在70℃下使用缓冲液A(200mM HFIP和8mM三乙胺)和缓冲液B(A+甲醇，50:50，v/v)的梯度，在注入AgilentPoroshell 120EC-C18柱(2.7μm，2.1x 50mm)后记录了每个反应在254nm和280nm处的UV吸收。实验人员从色谱图中整合了与全长RNA低聚物相对应的峰面积，并将其与反义链进行了归一化。实验人员绘制了剩余的RNA百分比，其中将0min时间点定义为100％，以显示RNA裂解的相对速率(n＝3)。实验人员使用双向ANOVA分析数据。误差条表示s.d.。
用于RNA酶H测定的双链体分析。在一些实施例中，实验人员混合了等摩尔的ASO、RNA和/或U1溶液，以制备终浓度为20μM的双链体。实验人员制备了三种复合物：ASO+RNA、RNA+U1和ASO+RNA+U1。将混合物加热至90℃持续2min，然后缓慢冷却至室温超过4h。将D1000阶梯和样品缓冲液(7mM KCl，20mL磷酸盐缓冲液，20mM胍-HCl，80mM NaCl，20mM乙酸盐)在室温下平衡30min。通过将1:1与D1000样品缓冲液混合来制备用于分析的样品。使用IKA涡旋在2,000rpm下彻底混合样品和阶梯1min。将样品离心以确保全部体积沉淀到试管底部。实验人员根据制造商的方案，使用高灵敏度D1000筛选带(尺寸范围35-1,000bp)在4200Agilent TapeStation上分析了双链体。
热变性(Tm)。将等摩尔量的RNA和各ASO溶解在1X PBS中，以获得每条链1μM的最终浓度。然后通过在90℃加热，然后缓慢冷却至4℃并在4℃储存的条件下对双链样品进行退火。使用Cary系列UV-Vis分光光度计(安捷伦科技公司)，以每分钟+0.5℃的速率将温度从15℃升高到95℃，以30秒的间隔记录254nm处的UV吸收。将吸光度相对于温度作图，并通过取每条曲线的一阶导数来计算Tm值。
萤光素酶筛选测定。实验人员生成了萤光素酶构建体，该构建体含有来自psiCHECK2载体中海肾萤光素酶基因3'-UTR中人类C9orf72基因(158-900个碱基对)的序列。靶向该序列的ASO应降低海肾萤光素酶信号而不影响萤火虫萤光素酶信号。实验人员将海肾归一化为萤火虫萤光素酶信号，以比较ASO与非靶向对照ASO(WV-993)的相对活性。实验人员通过用Lipofectamine 2000转染到Cos-7细胞中递送了ASO(15或30nM)和萤光素酶报告基因构建体(20ng)。转染后48小时，用平板读数器(Molecular Devices SpectramaxM5)对萤火虫和海肾萤光素酶信号进行定量。实验人员在每个实验中进行了三个生物学重复。
ASO传递到细胞模型。将人类ALS皮质神经元在NMM中于24孔板中(每孔250,000个细胞)保持至少4周，然后用指定的1μM ASO进行裸式治疗(不使用转染试剂)一周。在培养后5天，以指定的剂量用ASO对来自C9-BAC转基因小鼠的原代神经元进行裸式治疗，并在治疗15天后收集。将人类ALS运动神经元从冷冻原种接种到12孔板中(每孔280,000个细胞)，并在第7天进行裸式处理，并在第14天收获。在第10天添加50μL含有10ng BDNF、10ng GDNF和1ng TGF-β1的生长因子混合物，而无需更换培养基。将C9患者衍生的成纤维细胞铺在10cm皿中，然后用Lipofectamine RNAiMax试剂(ThermoScientific公司)转染ASO。处理72小时后收获细胞。
C9orf72转录物定量测定。在人类C9-ALS皮质神经元和运动神经元中，根据制造商的方案，使用Trizol(英杰公司(Invitrogen))提取了总RNA。对于每个样品，将总RNA洗脱在29.5μL不含RNase的水中，然后添加2μL(4U)的DNA酶I(新英格兰生物实验室(New EnglandBiolabs)，M0303L)和3.5μL的10X反应缓冲液。将样品在37℃温育15min以去除gDNA。加入EDTA至终浓度为5mM，并将DNA酶I在75℃下热灭活10min。根据生产商的说明，使用High-Capacity RNA-to-cDNATM Kit(应用生物系统公司)将RNA反转录。实验人员使用了以下Taqman探针：Hs00376619_m1(FAM)(目录号4351368，赛默飞世尔公司)用于C9orf72所有转录物(在V1、V2和V3上通用)；Hs00948764_m1(FAM)(目录号4351368，赛默飞世尔公司)用于C9orf72V3转录物；Hs02800695_m1用于人类HPRT1转录物(目录号4448486，赛默飞世尔公司)。qPCR反应：在95℃下3min，在95℃下10sec和60℃下30sec的40个循环。在源自C9患者的成纤维细胞和C9-BAC原代细胞系中，使用Trizol(ThermoScientific公司)分离总RNA，然后用DNA酶I(凯杰公司)处理。按照制造商的说明，使用随机六聚体和MultiScribe逆转录酶(ThermoScientific公司)将1μg总RNA反转录为cDNA。如上所述，使用SYBR Green MasterMix(应用生物系统公司)和0.2μM正向和反向引物在StepOnePlus实时PCR(qRT-PCR)系统上进行定量PCR。Tran,H.等人Differential Toxicity of Nuclear RNA Foci versusDipeptide Repeat Proteins in a Drosophila Model of C9ORF72FTD/ALS[在C9ORF72FTD/ALS的果蝇模型中，核RNA病灶相对于二肽重复蛋白的毒性差异].Neuron[神经元]87,1207-1214,doi:10.1016/j.neuron.2015.09.015(2015)。为了检测Hprt，实验人员使用了以下引物：正向5’-CAAACTTTGCTTTCCCTGGTT,反向5’-TGGCCTGTATCCAACACTTC。将每个样品和转录物的Ct值归一化为Hprt。2exp(-ΔΔCt)方法用于确定每个转录物的相对表达。
通过PCR进行转录物分析的组织处理，并且通过杂交ELISA进行ASO定量。实验人员解剖组织，并新鲜冷冻于预先称重的微量离心管(Eppendorf tube)中。实验人员通过对管重新称重来计算组织重量。对于裂解，实验人员将四倍体积的Trizol或裂解缓冲液(4M胍；0.33％N-月桂基肌氨酸；25mM柠檬酸钠；10mM DTT)添加至1单位重量(用于1mg组织的4μL缓冲液)中并使用Precellys在4℃下使组织均质化，直至所有组织碎片溶解。将30-50μL组织溶解产物保存在96孔板中，以进行药代动力学(PK)测量。剩余的裂解产物要么存储在-80℃(在裂解缓冲液中)，要么用于RNA提取(在Trizol中)。
实验人员利用以下探针通过杂交ELISA选择性地量化本研究中使用的ASO：捕获探针：“C9-内含子-帽”/5AmMC12/TGGCGAGTGG；检测探针：“C9-内含子-Det”：GTGAGTGAGG/3BioTEG/。实验人员将马来酸酐活化的96孔板(Pierce 15110)用50μL的捕获探针在500nM在2.5％NaHCO3(吉博公司，25080-094)中在37℃涂覆2小时。然后将板用PBST(PBS+0.1％吐温-20)洗涤3次，并用5％脱脂乳-PBST在37℃下阻断1小时。将有效负载ASO连续稀释至基质中。将该标准品与原始样品一起用裂解缓冲液(4M胍；0.33％N-月桂基肌氨酸；25mM柠檬酸钠；10mM DTT)稀释，使得所有样品中的ASO量小于50ng/mL。将20μL的稀释的样品与PBST中稀释的180μl的333nM检测探针混合，然后(65℃10min，95℃15min，4℃∞)变性。50μL变性的样品在封闭的ELISA板中一式三份进行分配，并在4℃温育过夜。在用PBST洗涤3次后，添加50μL在PBST中的1:2000链霉亲和素-AP(SouthernBiotech公司，7100-04)，每孔50μL，并在室温下温育1小时。用PBST充分洗涤后，添加100μL的AttoPhos(普洛麦格公司(Promega)S1000)，在室温在黑暗中温育10min，并在平板读数器(分子仪器公司(Molecular Device)，M5)上读取荧光通道：Ex435 nm，Em555 nm。根据标准曲线，通过4参数回归计算样品中的ASO。检测的下限是1.25μg ASO/每克组织。
小鼠脑匀浆的稳定性。实验人员通过将5μL每种低聚溶液(200μM)加到45μL小鼠脑匀浆中(内部制备，20mg/mL)，确定了ASO在小鼠脑匀浆中的稳定性。实验人员在37℃下以400rpm摇动温育每个反应。实验人员使用20-mer DNA序列作为阳性对照来评估测定的性能。因为它没有结合化学修饰来防止核酸酶降解，所以DNA会迅速降解。实验人员通过在每个时间点(0-5天)先加入50μL终止缓冲液(2.5％IGEPAL，0.5M NaCl，10mM EDTA，50mMTris，pH＝8.0)然后涡旋来终止反应(实验人员一式三份地进行)。实验人员随后向每个试管中添加20μL内标物(50μM：5'-GCGTTTGCTCTTCTTCUUGCGTTTTUU-3’)、250μL的2％氢氧化铵和100μL苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)。涡旋后，实验人员在室温下以17,000rpm旋转每个反应30分钟，并使用150μL氯仿对水层重复上述萃取操作。将新的水层转移到新的试管中后，实验人员进行干燥，然后用水以100μL的体积重构每个样品。使用Agilent Poroshell柱(120，EC-C18 2.7μm，2.1x 50mm)和流动相A(400mM HFIP，水中15mM TEA)和流动相B(甲醇)将2μL混合物注入Q Exactive质谱仪(赛默飞世尔科学公司)。实验人员使用Xcalibur TM(4.0.27.10版，赛默飞世尔科学公司)进行数据捕获，并计算分析物与内标的峰面积和峰面积比。分析物量的减少用于评估体外稳定性的程度。实验人员从三个技术重复中计算出均值和标准差。
RNA病灶的荧光原位杂交(FISH)检测。实验人员如前所述进行FISH。Tran,H.等人Differential Toxicity of Nuclear RNA Foci versus Dipeptide Repeat Proteins ina Drosophila Model of C9ORF72 FTD/ALS[在C9ORF72 FTD/ALS的果蝇模型中，核RNA病灶相对于二肽重复蛋白的毒性差异].Neuron[神经元]87,1207-1214,doi:10.1016/j.neuron.2015.09.015(2015)。实验人员使用5'端Cy3缀合(G2C4)3-4探针来检测有义重复序列的扩增，并且使用Cy3缀合(G4C2)3探针检测反义重复序列的扩增(Integrated DNATechnologies公司的探针)。探针在55℃下在含有40％甲酰胺，2X SSC，0.1％吐温-20和鲑鱼精子DNA的杂交缓冲液中杂交。然后将样品在预热的缓冲液和严格的洗涤缓冲液(0.2XSSC，0.1％吐温20)中在55℃下洗涤两次。然后将样品安装在带有DAPI(赛默飞世尔公司)的Prolong Gold Antifade试剂中。用Leica TCS SP5 II激光扫描共聚焦显微镜拍摄共聚焦图像，并用Leica LAS AF软件处理。实验人员使用Alexa Fluor 488(生命技术公司(Life Technologies))以1:500稀释的一抗(抗-NeuN抗体，MAB377，密理博公司)和1:500稀释的山羊抗小鼠二抗。实验人员使用RPI旋转盘共聚焦显微镜(蔡司公司)放大40倍，并收集了488nm，Cy3和DAPI通道的图像。使用Z Project功能合并了来自红色(Cy3)、绿色(488)和蓝色(DAPI)的堆叠图像。DAPI通道用于通过具有设定阈值(为每个实验设定，样品之间恒定)的转换为掩蔽(Convert to Mask)功能来制作核掩蔽(Nuclei mask)。
RNA病灶的定量。用掩蔽识别核，并测量每个核的面积。绿色通道被NeuN染色作为神经元标记。基于NeuN将前角区域较大的核染色的观察，核大于78μm2的细胞被鉴定为运动神经元，用于高通量病灶计数。Cy3通道用于识别病灶，“查找最大值(Find Maximum)”功能用于识别具有设置的噪声容限(30至90，为每个实验设置，样本之间恒定)的单个点。记录每个核内的积分密度，并将其除以255，作为该核中的病灶数目。概率模型用于计算病灶/细胞的后验；使用R::Stats包中的函数rpois，利用泊松分布对病灶计数和细胞计数进行建模。使用蒙特卡洛(Monte Carlo)方法获得后验样本。对于每次处理通过从后验减去PBS(即对照)后验(包括其本身)来对后验进行推断。如果复合处理的最高后验密度95％没有覆盖零，那么在95％置信度下，这些处理被认为与PBS确实不同。
使用MSD平台进行聚GP定量。通过在Precellys仪器中用1.4mm氧化锆珠振荡，将脑和脊髓样品在4体积RIPA(50mM Tris，150mM NaCl，0.5％DOC，1％NP40，0.1％SDS和完全蛋白酶抑制剂，pH 8.0)中匀浆。将样品在4℃下以10,000rpm离心10min，然后用600nm蛋白质分析试剂(皮尔斯公司)测定澄清裂解物的总蛋白浓度。MSD Small-Spot板用1μL多克隆捕获抗体(兔抗聚GP；AB1358，密理博公司)的10μg/mL溶液包被，并在4℃温育过夜。第二天，将板用PBST洗涤，在室温下用10％FBS/PBST溶液封闭1小时，然后用PBST洗涤，并与50-120μg的脑裂解液温育(以1:4或1:5稀释进10％FBS/PBST中)2-4小时。用PBST洗涤板，并与磺酸基标记缀合的检测抗体(兔抗聚GP；AB1358，密理博公司)在室温下温育1小时。将板用PBST洗涤，并与150μL MSD读取缓冲液T1X温育，并在MSD QuickPlex SQ 120平板读数器中读取。在野生型小鼠皮质或脊髓匀浆的基质中制备了重组纯化的聚GPx30的标准曲线。从空孔中减去测得的背景信号后，使用标准曲线的线性最佳拟合回归线对每微克组织的聚GP浓度进行插值。
蛋白质印迹法。实验人员通过蛋白质印迹法定量了C9orf72蛋白质的表达。简言之，用预制的4％-12％SDS-PAGE(标准凝胶，伯乐公司(Bio-Rad))对来自RIPA提取物的蛋白质进行大小分级，且将其转移至PVDF膜上。为了检测C9orf72，实验人员使用小鼠单克隆抗C9orf72抗体GT779(1:2,000；吉恩特克斯公司(GeneTex Inc.))和DyLight缀合的二抗。实验人员使用Odyssey成像系统(LI-COR Biosciences公司)可视化并定量了印迹。分析2周数据和8周数据的全尺寸印迹。
组织制备。使用2步骤提取程序来处理脑和脊髓样品；每个步骤之后，在4℃下以10,000rpm离心10min。实验人员首先将样品在RIPA(50mM Tris，150mM NaCl，0.5％DOC，1％NP40，0.1％SDS和Complete(完全)，pH 8.0)缓冲液中匀浆，然后将沉淀重新悬浮在5M胍-HCl中。实验人员使用MSD阻断剂A试剂盒(R93AA-2)(中尺度诊断公司)用磺基标记物缀合的抗聚GP进行Meso Scale Discovery(中尺度发现公司)分析，对每个池中的聚GP进行了定量。实验人员使用多克隆抗GP抗体AB1358(密理博西格玛公司)作为捕获抗体和检测抗体。MSD(MESO QUICKPLEX SQ 120)根据制造商的说明书(中尺度诊断公司)读取测定值。与基于稀释到野生型小鼠大脑RIPA裂解物中的亲和纯化的Flag-聚GP(GenScript公司)的标准曲线相比，实验人员对聚GP进行了定量。
药代动力学(PK)分析。使用具有一阶吸收率和一阶消除率的单室模型对C9orf72-631的平均组织浓度-时间曲线进行建模。组织浓度通过以下方式描述：
Ct＝剂量*Ka/V*(Ka-Ke)*(exp(-Ka*t)-exp(-Ke*t)
其中Ct代表组织浓度，剂量代表施用量，Ka代表吸收率，V代表体积分布，Ke代表消除率，并且t代表给药后时间。组织的终末半衰期推导为ln2/Ke。还对2室模型进行了测试，但似乎参数过高。所有低于定量限值的均设置为零进行分析。使用
Figure BDA0003456638050002201
8.1软件程序(Certara，普林斯顿，新泽西州，美国)估算模型参数。
ViewRNA ISH测定。
实验人员采用了ViewRNA ISH组织1-Plex测定(赛默飞世尔科学公司，目录号QVT0051)来原位检测ASO。简而言之，将脊髓活检在10％中性缓冲福尔马林中于2℃至8℃固定过夜，进行处理并包埋在石蜡中。制备石蜡切片(5μm)，并在室温下保存直至使用。将载玻片在60℃烘烤至少1小时后，实验人员在二甲苯(VWR Chemicals公司)中脱蜡10分钟，然后在100％乙醇(赛默飞世尔科学公司)中漂洗。在室温下将载玻片风干至少30分钟后，实验人员创建疏水屏障，然后继续执行ViewRNAISH标准方案。实验人员用预热的靶标回收试剂在95℃下对再水化的载玻片进行10分钟处理，然后在37℃进行蛋白酶消化(Protease QF1:100在1X PBS中，预热)15分钟。实验人员将载玻片在1X PBS中搅动漂洗，然后用QuantiGeneViewRNAmiRNA探针组处理WVE-3972-01，PPiB(阳性对照)和/或dapB(阴性对照)(赛默飞世尔科学公司)在40℃下于预热的探针组稀释液(Probe Set Diluent)QT(每部分300μL)中稀释至12.5nM，持续2h。实验人员将漂洗过的载玻片在室温下保存长达24h。为了进行信号放大和检测，实验人员将载玻片在预热的放大稀释剂(Amplifier Diluent)QF中以1:100稀释的PreAmp1 QF工作溶液中于40℃温育30分钟；实验人员在洗涤缓冲液中搅动漂洗，然后在预热的放大稀释剂QF中的工作Amp1 QF工作溶液(1:100)中于40℃温育20分钟。漂洗后，实验人员将载玻片在Label Probe-AP工作溶液(1:1,000，于Label Probe Diluent QF中)于40℃温育20分钟，并在洗涤缓冲液中搅动漂洗。实验人员添加AP-Enhancer溶液并在室温下温育5分钟，然后添加Fast Red底物，并将其在40℃再温育30分钟以形成红色沉淀。之后，实验人员将DNA用苏木精和/或Hoechst 33342染料复染。将载玻片用ProLong Gold Antifade固定介质(分子探针公司(Molecular Probes)，目录号P36930)进行固定，并盖上薄玻璃盖玻片。对于每个脊髓横截面，在明场或荧光场下，使用Zeiss Axio Observer显微镜(蔡司公司，索恩伍德(Thornwood)，纽约州(NY)，美国)生成代表性的数字图像。
统计分析。除非另有说明，否则通过单向方差分析(ANOVA)，然后使用SigmaPlot13.0对Student-Newman-Keuls事后分析进行体内数据分析。
使用Capillary Western Immunoassay(毛细管Western免疫测定法)(Wes)定量C9orf72蛋白质表达。
以下以使用Was的评估为例进行说明。材料：
RIPA裂解和提取缓冲液(赛默飞世尔科学公司(Thermo Scientific)，目录号89901)
皮尔斯蛋白酶抑制剂迷你片剂(Pierce Protease Inhibitor Mini Tablet)(生命技术公司，目录号A32953)
Bertin技术公司Precellys Evolution组织匀浆器(Bertin TechnologiesPrecellys Evolution Tissue Homogenizer)
皮尔斯(Pierce)BCA试剂A和B(飞世尔科学公司(Fisher Scientific)，目录号PI23228和目录号PI23224)
皮尔斯牛血清白蛋白标准品(Pierce Bovine Serum Albumin standards)(赛默飞世尔科学公司，目录号23208)
Wes系统(普诺森生物科技公司(ProteinSimple)，目录号004-600)
Jess/Wes分离试剂盒12-230kDa(普诺森生物科技公司，目录号SM-W004)
抗C9orf72抗体，小鼠(吉恩特克斯公司(GeneTex)，目录号GTX632041)
抗HPRT抗体，兔(安诺伦生物科技公司(Novus Biologics)，目录号NBPI-33527)
抗兔检测模块(普诺森生物科技公司，目录号DM-001)
抗小鼠检测模块(普诺森生物科技公司，目录号DM-002)
方法：
来自脊髓和皮质组织的蛋白裂解物是通过在片剂中加入10倍重量体积的RIPA缓冲液和一小勺裂解珠来制备的。然后将样品在Precellys Evolution组织匀浆器上进行匀浆2-4个循环(3x 20秒；6800rpm)，并在4度以14000rpm离心10min。将上清液小心地转移到新管中。为了测量总蛋白浓度，根据制造商的方案，使用带有BSA标准品的Pierce BCA蛋白测定试剂盒对20μl裂解液的15倍稀释液进行定量。将裂解液在0.1X样品缓冲液中归一化为0.5ug/uL。根据制造商的说明书，使用12-230kDa分离模块、抗兔检测模块和抗小鼠检测模块，在Wes系统上进行C9orf72定量。将裂解液与Fluorescent Master Mix混合，并在95℃下变性5分钟。将样品、封闭剂(抗体稀释剂)、一抗(抗体稀释剂中的1:100抗C9orf72、1:250抗HPRT)、HRP缀合的二抗(即用型抗小鼠与即用型抗兔以1:1的比率结合)和化学发光底物移入平板中。使用仪器的默认设置：在475V下堆叠和分离30min；封闭剂持续5min，一抗和二抗均持续30min；鲁米诺/过氧化物化学发光检测持续约15min(暴露1-2-4-8-16-32-64-128-512s)。通过Compass软件自动量化产生的化学发光(曲线下的面积或检测到的峰的“AUC”)，并显示为电泳图或虚拟印迹样图像。通过将C9orf72峰的AUC除以HPRT峰的AUC来分析计算出的浓度。然后将PBS处理的动物组平均，并将所有数据点除以该值。
实例5.C9orf72寡核苷酸组合物在体内具有活性
根据本披露，包括动物模型在内的多种技术可用于评估所提供的技术。在一些实施例中，在小鼠模型中评估了所提供的技术。例如，进行了药效学研究，以评估敲低C9orf72产物时的某些C9orf72寡核苷酸组合物。
测试的C9orf72寡核苷酸是：WV-8012、WV-23741、WV-26633、WV-30206、和WV-28478。阴性对照是PBS(磷酸盐缓冲盐水)。
所使用的动物：雄性和雌性C9-BAC小鼠，2-3月龄，6个组，38只小鼠。表11A示出了剂量设计。
表11A.体内研究设计
Figure BDA0003456638050002231
进行ICV套管插入术。在第1天在清醒的动物中经ICV注射PBS或50μg寡核苷酸。在第7天，第2次剂量的PBS或50μg寡核苷酸。剂量体积2.5uL。第一次注射后2周进行尸体剖检。
尸体剖检：
时间点：2周
组织：
一个半脑在福尔马林中(组织学，石蜡)。
在称重的试管中(PK/PD)，将皮质(CX)、海马、小脑和腰脊髓(SC)的上半部分快速冷冻。
腰脊髓的下半部分，在未称重的试管(DPR)中快速冷冻。
颈和胸脊髓，福尔马林(RNA病灶定量，OCT冷冻块)
结果示于表11B-11I中。
从脊髓(SC)(所有转录物表11B，V3表11C)和大脑皮质(CX)(所有转录物表11D，V3表11E)分析转录物。从大脑皮质(CX)(表11F)和脊髓(SC)(表11G)分析了所有剂量组的聚GP水平。从脊髓(SC)(表11H)和大脑皮质(CX)(表11I)分析了C9orf72蛋白质。实例14中披露了C9orf72蛋白质分析的方案(使用毛细管Western免疫测定法(Wes)定量C9orf72蛋白质表达)。
表11B.转录物分析，脊髓(SC)，所有转录物
Figure BDA0003456638050002241
Figure BDA0003456638050002251
表11C.转录物分析，脊髓(SC)，V3
PBS WV-8012 WV-23741 WV-26633 WV-30206 WV-28478
0.999 0.287 0.297 0.466 0.248
1.172 0.308 0.349 0.334 0.607
0.959 0.233 0.182 0.255 0.212
0.870 0.323 0.138 0.299 0.303 0.230
0.999 0.291 0.262 0.507 0.240 0.525
0.216 0.361 0.374 0.301
0.312 0.236 0.182 0.260
表11D.转录物分析，大脑皮质(CX)，所有转录物
PBS WV-8012 WV-23741 WV-26633 WV-30206 WV-28478
0.8727 0.604 0.776 0.922 0.648 0.776
0.9289 0.776 0.671 0.948 0.942 0.680
1.1436 0.639 0.675 0.809 0.484 0.621
1.0523 0.685 0.803 0.588 0.694 0.714
1.0025 0.661 0.699 0.724 0.680 0.699
0.739 0.714 0.666 0.760
0.584 0.661 0.481 0.704
表11E.转录物分析，大脑皮质(CX)，V3
PBS WV-8012 WV-23741 WV-26633 WV-30206 WV-28478
1.063 0.582 0.806 0.876 0.659 0.547
1.034 0.711 0.641 1.034 0.711 1.063
1.155 0.641 0.570 0.706 0.558 0.637
0.789 0.637 0.778 0.752 0.852 0.594
0.958 0.532 0.811 0.664 0.716 0.562
0.768 0.870 0.602 0.692
0.687 0.882 0.414 0.650
表11F.聚GP水平(所有剂量)，大脑皮质(CX)
PBS WV-8012 WV-23741 WV-26633 WV-30206 WV-28748
2.1830 0.680 1.239 1.119 1.387 0.690
2.3560 0.735 1.179 1.188 0.499 1.250
3.8870 0.894 0.882 1.344 0.703 0.481
0.9520 1.007 0.927 0.180 1.420 0.458
1.1490 0.662 0.789 0.910 0.518 0.622
0.913 0.896 0.543 0.889
1.162 1.641 1.134 1.220
表11G.聚GP水平(所有剂量)，脊髓(SC)
PBS WV-8012 WV-23741 WV-26633 WV-30206 WV-28748
0.968 0.000 0.000 0.284 0.482 0.454
2.868 0.000 0.198 0.502 0.000 0.361
1.445 0.000 0.645 1.117 0.000 0.000
2.165 0.130 0.416 0.088 0.000 0.000
1.345 0.210 0.193 0.382 0.000 0.100
0.173 0.373 0.287 0.469
0.000 0.181 0.121 0.262
表11H.C9orf72蛋白质分析脊髓(SC)
PBS WV-8012 WV-23741 WV-26633 WV-30206 WV-28478
1.1419 1.158 0.973 0.793 0.536 0.966
0.6477 1.178 0.945 0.988 0.617 1.058
0.9952 1.013 0.584 0.764 0.932 1.353
1.0976 0.756 0.846 0.865 0.812 1.287
1.1176 0.975 1.007 0.642 0.555 0.699
0.686 0.712 0.418 0.806
1.051 0.539 0.867 1.208
表11I.C9orf72蛋白质分析大脑皮质(CX)
Figure BDA0003456638050002271
Figure BDA0003456638050002281
如本文所证明，多种C9orf72寡核苷酸组合物可以敲低与病症、障碍或疾病相关的C9orf72产物。
实例6.C9orf72寡核苷酸组合物在体内具有活性
在另一个实例中，进行了药效学研究，以评估敲低C9orf72产物时的某些C9orf72寡核苷酸组合物。
测试的C9orf72寡核苷酸是：WV-30206、WV-30210、WV-30211、和WV-30212。阴性对照是PBS(磷酸盐缓冲盐水)。
所使用的动物：雄性和雌性C9-BAC小鼠，2-4月龄，15个组，102只小鼠。表12A示出了剂量设计。
表12A.体内研究设计
Figure BDA0003456638050002282
Figure BDA0003456638050002291
进行ICV套管插入术。在第1天在清醒的动物中经ICV注射PBS或50μg寡核苷酸。在第7天，第2次剂量的PBS或50μg寡核苷酸。剂量体积2.5uL。首次注射后2周、4周和8周进行尸体剖检。
尸体剖检：
时间点：2周、4周和8周
组织：
一个半脑在福尔马林中(组织学，石蜡)。
在称重的试管中(PK/PD)，将皮质(CX)、海马、小脑、肝、肾和腰脊髓(SC)的上半部分快速冷冻。
腰脊髓的下半部分，在未称重的试管(DPR)中快速冷冻。
颈和胸脊髓，福尔马林(RNA病灶定量，OCT冷冻块)。
结果示于表12B-12I中。
从脊髓(SC)(所有转录物表12B，V3表12C)和大脑皮质(CX)(所有转录物表12D，V3表12E)分析转录物。从大脑皮质(CX)(表12F)和脊髓(SC)(表12G)分析了所有剂量组的聚GP水平。从脊髓(SC)(表12H)和大脑皮质(CX)(表12I)分析了C9orf72蛋白质。实例14中披露了C9orf72蛋白质分析的方案(使用毛细管Western免疫测定法(Wes)定量C9orf72蛋白质表达)。
表12B.转录物分析，脊髓(SC)，所有转录物
Figure BDA0003456638050002301
Figure BDA0003456638050002311
表12C.转录物分析，脊髓(SC)，V3
Figure BDA0003456638050002321
Figure BDA0003456638050002331
表12D.转录物分析，大脑皮质(CX)，所有转录物
Figure BDA0003456638050002332
Figure BDA0003456638050002341
表12E.转录物分析，大脑皮质(CX)，V3
Figure BDA0003456638050002342
Figure BDA0003456638050002351
表12F.聚GP水平(所有剂量)，大脑皮质(CX)
Figure BDA0003456638050002352
Figure BDA0003456638050002361
表12G.聚GP水平(所有剂量)，脊髓(SC)
Figure BDA0003456638050002362
Figure BDA0003456638050002371
表12H.C9orf72蛋白质分析脊髓(SC)
Figure BDA0003456638050002372
Figure BDA0003456638050002381
表12I.C9orf72蛋白质分析大脑皮质(CX)
PBS WV-30206 WV-30210 WV-30211 WV-30212
1.01 0.95 1.11 1.02 0.93
1.13 1.12 0.97 1.14 0.97
0.85 1.04 0.93 0.91 1.10
0.78 1.05 1.00 0.98 0.93
1.08 0.88 0.87 0.96 0.99
1.15 1.08 0.74 1.11 1.06
1.08 0.90 0.96 0.97
如本文所证明，多种C9orf72寡核苷酸组合物可以敲低与病症、障碍或疾病相关的C9orf72产物。
实例7.C9orf72寡核苷酸组合物在体内具有活性
在另一个实例中，进行了药效学研究，以评估敲低C9orf72产物时的某些C9orf72寡核苷酸组合物。
所测试的C9orf72寡核苷酸是WV-8012和WV-21446。阴性对照是PBS(磷酸盐缓冲盐水)。
所使用的动物：雄性和雌性C9-BAC小鼠，2月龄。表13A示出了剂量设计。
表13A.体内研究设计
Figure BDA0003456638050002391
尸体剖检：
时间点：2周
组织：
一个半脑在福尔马林中(组织学，石蜡)。
在称重的试管中(PK/PD)，将皮质、海马、小脑和一半腰脊髓快速冷冻。
另一半腰脊髓，在未称重的试管(DPR)中快速冷冻。
颈和胸脊髓，福尔马林(RNA病灶定量，OCT冷冻块)。结果示于表13B-13G中。
从大脑皮质(CX)(所有转录物表13B，V3表13C)和脊髓(SC)(所有转录物表13D，V3表13E)分析转录物。
表13B.转录物分析，大脑皮质(CX)，所有转录物
Figure BDA0003456638050002401
表13C.转录物分析，大脑皮质(CX)，V3
Figure BDA0003456638050002402
表13D.转录物分析，脊髓(SC)，所有转录物
Figure BDA0003456638050002403
Figure BDA0003456638050002411
表13E.转录物分析，脊髓(SC)，V3转录物
Figure BDA0003456638050002412
评估了WV-8012和WV-21446的CNS组织暴露。在脑和脊髓组织中观察到剂量依赖性增加(2周尸体剖检)。平均组织浓度：
WV-8012：脑(0.4-2.1μg/g)，脊髓：(1.5-2.7μg/g)；以及
WV-21446：脑(0.4-2.9μg/g)，脊髓：(1.8-6.3μg/g)。
表13F.组织暴露，脑
Figure BDA0003456638050002413
Figure BDA0003456638050002421
表13G.组织暴露，脊髓
Figure BDA0003456638050002422
Figure BDA0003456638050002431
如本文所证明，C9orf72寡核苷酸组合物可被递送并可以敲低与病症、障碍或疾病相关的C9orf72产物。
实例8.C9orf72寡核苷酸组合物在体内具有活性
在另一个实例中，进行了药效学研究，以评估敲低C9orf72产物时的某些C9orf72寡核苷酸组合物。
所测试的C9orf72寡核苷酸是WV-30210和WV-30212。阴性对照是PBS(磷酸盐缓冲盐水)。
所使用的动物：雄性和雌性C9-BAC小鼠，2-4月龄。表14A示出了剂量设计。
表14A.体内研究设计
Figure BDA0003456638050002432
Figure BDA0003456638050002441
时间点：6周。
来自每只动物的组织：
皮质：将来自两个半脑的皮质组合，快速冷冻，放入一个称重的试管中。
脊髓：将上腰椎脊髓和下腰椎脊髓分离，快速冷冻，放入两个试管中，上腰椎放入称重的试管(RNAPD和Trizol PK)中，下腰椎放入未称重的试管(DPR)中。颈+胸脊髓，在称重的试管中快速冷冻(蛋白酶K PK)。
海马和小脑：将来自两个半脑的海马和小脑分开，快速冷冻，放入两个未称重的试管中。
结果示于表14B-14G中。
从大脑皮质(CX)(所有转录物表14B，V3表14C，组织暴露表14D)和脊髓(SC)(所有转录物表14E，V3表14F，组织暴露表14G)分析转录物。
表14B转录物分析，大脑皮质(CX)，所有转录物
Figure BDA0003456638050002451
表14C转录物分析，大脑皮质(CX)，V3转录物
Figure BDA0003456638050002452
Figure BDA0003456638050002461
表14D组织暴露，大脑皮质(CX)
Figure BDA0003456638050002462
Figure BDA0003456638050002471
表14E转录物分析，脊髓(SC)，所有转录物
Figure BDA0003456638050002472
表14F转录物分析，脊髓(SC)，V3转录物
Figure BDA0003456638050002481
表14G组织暴露，脊髓(SC)
Figure BDA0003456638050002482
Figure BDA0003456638050002491
如本文所证明，C9orf72寡核苷酸组合物可被递送并可以敲低与病症、障碍或疾病相关的C9orf72产物。
除非另有说明，否则在各种实验中，实验中使用的细胞和动物用于对于那些细胞或动物典型的条件。除非另有说明，否则在体外实验中，各种细胞在标准条件下生长(例如，用于特定细胞类型、细胞系或相似细胞类型或细胞系的最常见条件)，例如，使用普通生长培养基、常温(37℃)，以及典型的马萨诸塞州剑桥的重力和大气压力。将动物保持在标准实验室条件下，通常在室温或几度较冷，具有正常的饲养条件、笼子大小、典型的马萨诸塞州的重力和大气压力等。除非另有说明，否则细胞和动物都不会经受极端温度(例如，冷休克或热休克)、压力、重力、环境声音、食物、或营养物质剥夺等。
虽然本文中已描述且说明各种实施例，但本领域普通技术人员将容易想到，用于执行本披露中所描述的功能和/或获得本披露中所描述的结果和/或一个或多个优势的各种其他方法和/或结构、以及此类变化形式和/或修改中的每一者均被视为包括在内。更一般而言，本领域普通技术人员将容易理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和构型意指实例，并且实际参数、尺寸、材料和/或构型将取决于使用本披露的教导的一个或多个特定应用。本领域技术人员将认识到，或能够使用不超出常规的实验来确定，本披露中所述的本披露的特定实施例的许多等效物。因此，应理解，上述实施例仅通过实例方式呈现，且在所附权利要求书及其等效物的范围内，可以与具体描述和要求的不同的方式实践所要求的技术。另外，如果特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法不是相互不兼容的，则在本披露的范围内包括两个或更多个此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合。

Claims (53)

1.一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含糖、碱基或核苷酸间键联的至少一种修饰，其中所述寡核苷酸的碱基序列是或包含与C9orf72基因或其转录物的碱基序列至少80％相同或互补的碱基序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续碱基，并且所述寡核苷酸的3'端上的核碱基任选地被选自I、A、T、U、G和C的替换核碱基替换。
2.如权利要求1所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含糖、碱基或核苷酸间键联的至少一种修饰，其中所述寡核苷酸的碱基序列包含与C9orf72基因或其转录物的碱基序列相同或互补的碱基序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续碱基。
3.如权利要求2所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的碱基序列是ACTCACCCACTCGCCACCGC。
4.如权利要求3所述的寡核苷酸，其中在施用至包含含有重复扩增的C9orf72转录物的系统时，所述寡核苷酸降低所述C9orf72转录物的水平，其中所述含有重复扩增的C9orf72转录物包含至少30、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个GGGGCC重复序列。
5.如权利要求4所述的寡核苷酸，其中如通过百分比所测量，所述含有重复扩增的C9orf72转录物的水平降低是不含重复扩增的C9orf72转录物的水平降低的至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
6.如权利要求3所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含5'-翼-核心-翼-3’结构或由其组成，其中每个翼糖独立地包含2’-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族。
7.如权利要求6所述的寡核苷酸，其中所述5'-翼包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键联和一个或多个不带负电荷的核苷酸间键联。
8.如权利要求7所述的寡核苷酸，其中所述3'-翼包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键联和一个或多个不带负电荷的核苷酸间键联。
9.如权利要求8所述的寡核苷酸，其中所述5'-翼和所述3'-翼各自独立地包含3、4、5、6、7、8、9或10个核碱基。
10.如权利要求9所述的寡核苷酸，其中每个核心糖独立地包含两个2'-H。
11.如权利要求10所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸或所述核心包含以下的骨架手性中心(键联磷)模式：
(Np)t[(Op/Rp)n(Sp)m]y，
其中：
t是1-50；
n是1-10；
m是1-50；
y是1-10；
Np是Rp或Sp；
Sp表示手性修饰的核苷酸间键联的手性键联磷的S构型；
Op表示天然磷酸酯键联的非手性键联磷；并且
Rp表示手性修饰的核苷酸间键联的手性键联磷的S构型；并且
y是1-10。
12.如权利要求11所述的寡核苷酸，其中每个Np是Sp。
13.如权利要求12所述的寡核苷酸，其中所述模式是(Np)t[(Rp)n(Sp)m]y。
14.如权利要求13所述的寡核苷酸，其中每个n是1。
15.如权利要求14所述的寡核苷酸，其中y是1。
16.如权利要求14所述的寡核苷酸，其中y是2。
17.如权利要求14所述的寡核苷酸，其中t是2或更大。
18.如权利要求14所述的寡核苷酸，其中t是3或更大。
19.如权利要求14所述的寡核苷酸，其中每个m独立地是2-20。
20.一种寡核苷酸，所述寡核苷酸具有以下结构：
mA*Sm5Ceo n001R Teo m5Ceo n001R mA*S C*S C*S C*R A*S C*S T*S m5C*S G*Rm5C*S C*S mA*S mC n001R m5Ceo*S mG*S mC，或其药学上可接受的盐，其中：
m代表对核苷的2’-OMe修饰；
*S代表Sp硫代磷酸酯键联；
m5Ceo代表5-甲基2'-O-甲氧基乙基C；
n001R代表Rp n001键联，其中n001键联具有
Figure FDA0003456638040000041
的结构；
eo代表对核苷的2’-OCH2CH2OCH3修饰；
*R代表Rp硫代磷酸酯键联；并且
m5代表C的5位处的甲基。
21.一种寡核苷酸，所述寡核苷酸具有以下结构：
mA*S m5Ceo n001R Teo m5Ceo n001R mA*S C*S C*S C*R A*S C*S T*S m5C*S G*Rm5C*S C*S mA*S mC*S m5Ceo n001R mG*S mC，或其药学上可接受的盐，其中：
m代表对核苷的2’-OMe修饰；
*S代表Sp硫代磷酸酯键联；
m5Ceo代表5-甲基2'-O-甲氧基乙基C；
n001R代表Rp n001键联，其中n001键联具有
Figure FDA0003456638040000042
的结构；
eo代表对核苷的2’-OCH2CH2OCH3修饰；
*R代表Rp硫代磷酸酯键联；并且
m5代表C的5位处的甲基。
22.一种寡核苷酸，所述寡核苷酸具有以下结构：
mA*S m5Ceo n001R Teo m5Ceo n001R mA*S C*S C*S C*R A*S C*S T*S m5C*S G*Rm5C*S C*S mA*S mC*S m5Ceo*S mG n001R mC，或其药学上可接受的盐，其中：
m代表对核苷的2’-OMe修饰；
*S代表Sp硫代磷酸酯键联；
m5Ceo代表5-甲基2'-O-甲氧基乙基C；
n001R代表Rp n001键联，其中n001键联具有
Figure FDA0003456638040000051
的结构；
eo代表对核苷的2’-OCH2CH2OCH3修饰；
*R代表Rp硫代磷酸酯键联；并且
m5代表C的5位处的甲基。
23.一种寡核苷酸，所述寡核苷酸具有以下结构：
mC*S m5Ceo Teo m5Ceo mA*S C*S T*S C*R A*S C*S C*R C*S A*S C*S T*S m5mC*SmG*S mC*S m5mC*S mG，或其药学上可接受的盐，其中：
m代表对核苷的2’-OMe修饰；
*S代表Sp硫代磷酸酯键联；
m5Ceo代表5-甲基2'-O-甲氧基乙基C；
eo代表对核苷的2’-OCH2CH2OCH3修饰；
*R代表Rp硫代磷酸酯键联；并且
m5代表C的5位处的甲基。
24.一种寡核苷酸，所述寡核苷酸具有以下结构：
mA*S m5Ceo Teo m5Ceo mA*S C*S C*S C*R A*S C*S T*S m5C*S G*R m5C*S C*S mA*S mC*S m5mC*S mG*S mC，或其药学上可接受的盐，其中：
m代表对核苷的2’-OMe修饰；
*S代表Sp硫代磷酸酯键联；
m5Ceo代表5-甲基2'-O-甲氧基乙基C；
eo代表对核苷的2’-OCH2CH2OCH3修饰；
*R代表Rp硫代磷酸酯键联；并且
m5代表C的5位处的甲基。
25.一种寡核苷酸，所述寡核苷酸具有以下结构：
mC*S m5Ceo Teo m5Ceo mA*S C*S T*S C*R A*S C*S C*R C*S A*S C*S T*S m5Ceo*SmG*S mC*Sm5Ceo*S mG，或其药学上可接受的盐，其中：
m代表对核苷的2’-OMe修饰；
*S代表Sp硫代磷酸酯键联；
m5Ceo代表5-甲基2'-O-甲氧基乙基C；
eo代表对核苷的2’-OCH2CH2OCH3修饰；
*R代表Rp硫代磷酸酯键联；并且
m5代表C的5位处的甲基。
26.一种寡核苷酸，所述寡核苷酸具有以下结构：
mA*S m5Ceo Teo m5Ceo mA*S C*S C*S C*R A*S C*S T*S m5C*S G*R m5C*S C*S mA*S mC*S m5Ceo*S mG*S mC，或其药学上可接受的盐，其中：
m代表对核苷的2’-OMe修饰；
*S代表Sp硫代磷酸酯键联；
m5Ceo代表5-甲基2'-O-甲氧基乙基C；
eo代表对核苷的2’-OCH2CH2OCH3修饰；
*R代表Rp硫代磷酸酯键联；并且
m5代表C的5位处的甲基。
27.如权利要求1-26中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸呈药学上可接受的盐形式。
28.如权利要求1-27中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的3'端上的核碱基任选地被选自I、A、T、U、G和C的不同核碱基替换。
29.如权利要求1-28中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸中的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的非对映异构纯度。
30.一种寡核苷酸组合物，所述寡核苷酸组合物包含具有以下各项的多个寡核苷酸：
a)共同的碱基序列；
b)共同的骨架键联模式；
c)共同的骨架手性中心模式；
其中所述组合物中所述多个寡核苷酸的水平不是随机的；并且
其中所述多个寡核苷酸各自独立地是如权利要求1-28中任一项所述的寡核苷酸或其盐形式；或
一种寡核苷酸组合物，所述寡核苷酸组合物包含多个寡核苷酸，其中：
所述多个寡核苷酸具有相同的构成；
所述多个寡核苷酸在一个或多个(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多个)手性受控的核苷酸间键联处共享相同的键联磷立体化学；
其中相对于具有相同共同的碱基序列的寡核苷酸的基本上外消旋制剂，所述组合物富集所述特定寡核苷酸类型的寡核苷酸；并且
所述多个寡核苷酸各自独立地是如权利要求1-28中任一项所述的寡核苷酸或其盐形式；或
一种寡核苷酸组合物，所述寡核苷酸组合物包含多个寡核苷酸，其中：
所述多个寡核苷酸具有相同的构成；
所述多个寡核苷酸在一个或多个(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多个)手性受控的核苷酸间键联处共享相同的键联磷立体化学；
在每个手性受控的核苷酸间键联处，所述组合物中所有共享相同构成的寡核苷酸中至少90％、95％、96％、97％、98％或99％共享相同的键联磷立体化学；并且
所述多个寡核苷酸各自独立地是如权利要求1-28中任一项所述的寡核苷酸或其盐形式。
31.如权利要求30所述的组合物，其中富集所述组合物，使得所述组合物中所有与所述特定类型的寡核苷酸或所述多个寡核苷酸共享相同碱基序列的寡核苷酸的1％-100％(例如，约5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80-100％、90-100％、95-100％、50％-90％、或约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％、或至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)是所述特定类型的寡核苷酸或所述多个寡核苷酸。
32.如权利要求30-31中任一项所述的组合物，其中所述多个寡核苷酸在至少5个核苷酸间键联处共享相同的键联磷立体化学。
33.如权利要求32所述的组合物，其中所述多个寡核苷酸独立地在每个硫代磷酸酯核苷酸间键联处共享相同的键联磷立体化学。
34.如权利要求33所述的组合物，其中所述多个寡核苷酸独立地在每个手性核苷酸间键联处共享相同的键联磷立体化学。
35.如权利要求34所述的组合物，其中所述多个或类型的寡核苷酸共享相同的结构。
36.如权利要求31所述的组合物，其中所述多个寡核苷酸各自独立地是如权利要求20所述的寡核苷酸。
37.如权利要求31所述的组合物，其中所述多个寡核苷酸各自独立地是如权利要求21所述的寡核苷酸。
38.如权利要求31所述的组合物，其中所述多个寡核苷酸各自独立地是如权利要求22所述的寡核苷酸。
39.如权利要求31所述的组合物，其中所述多个寡核苷酸各自独立地是如权利要求23所述的寡核苷酸。
40.如权利要求31所述的组合物，其中所述多个寡核苷酸各自独立地是如权利要求24所述的寡核苷酸。
41.如权利要求31所述的组合物，其中所述多个寡核苷酸各自独立地是如权利要求25所述的寡核苷酸。
42.如权利要求31所述的组合物，其中所述多个寡核苷酸各自独立地是如权利要求26所述的寡核苷酸。
43.如权利要求35-42中任一项所述的组合物，其中每个寡核苷酸独立地呈盐形式。
44.一种药物组合物，所述药物组合物包含或递送如权利要求1-43中任一项的寡核苷酸或组合物，并且包含药学上可接受的载体。
45.一种方法，所述方法包括向患有或易患与C9orf72扩增的重复序列有关的病症、障碍和/或疾病的受试者施用有效量的如权利要求1-44中任一项所述的寡核苷酸或组合物。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述病症、障碍和/或疾病是肌萎缩侧索硬化症(ALS)。
47.如权利要求45所述的方法，其中所述病症、障碍和/或疾病是额颞叶痴呆(FTD)。
48.一种降低细胞中C9orf72靶标基因或其基因产物的活性、表达和/或水平的方法，所述方法包括将如权利要求1-44中任一项所述的寡核苷酸或组合物引入所述细胞中。
49.一种用于减少细胞群中病灶的方法，所述方法包括使细胞与如权利要求1-44中任一项所述的寡核苷酸或组合物接触。
50.如权利要求49所述的方法，其中具有病灶的细胞百分比降低。
51.如权利要求49-50中任一项所述的方法，其中每个细胞的病灶数目降低。
52.一种用于在细胞中相对于不含重复扩增的C9orf72 RNA转录物优先敲低含有重复扩增的C9orf72 RNA转录物的方法，所述方法包括使包含所述含有重复扩增的C9orf72 RNA转录物及所述不含重复扩增的C9orf72 RNA转录物的细胞与如权利要求1-44中任一项所述的寡核苷酸或组合物接触，
其中所述寡核苷酸包含存在于所述含重复扩增的C9orf72 RNA转录物中的序列或与所述含重复扩增的C9orf72 RNA转录物中的序列互补的序列，
其中所述寡核苷酸在细胞中相对于不含重复扩增的C9orf72 RNA转录物指导含重复扩增的C9orf72 RNA转录物的优先敲低。
53.如实施例1-148中任一项所述的化合物、寡核苷酸、组合物或方法。
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