TW202015741A - 寡核苷酸組成物及其使用方法 - Google Patents

寡核苷酸組成物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本揭露尤其提供了設計的DMD寡核苷酸、組成物、及其使用方法。在一些實施方式中，本揭露提供了如下技術，所述技術可用於藉由跳讀外顯子51或外顯子53來修復突變體DMD轉錄物，使得可以將轉錄物翻譯成內部截短的、但具有至少部分功能的肌營養不良蛋白質變體。在一些實施方式中，本揭露提供了可用於調節DMD轉錄物剪接的技術。在一些實施方式中，提供的技術可以改變肌營養不良蛋白(DMD)DMD轉錄物的剪接。在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療疾病的方法，該等疾病係如包括但不限於杜興氏肌肉失養症、貝克肌肉營養不良等的肌肉營養不良。

Description

寡核苷酸組成物及其使用方法 相關申請的交叉引用
本申請要求於2018年5月11日提交的美國臨時申請案號62/670,709、於2018年8月7日提交的美國臨時申請案號62/715,684、於2018年8月27日提交的美國專利申請案號62/723,375、於2018年12月6日提交的美國專利申請案號62/776,432、以及於2019年4月11日提交的PCT申請案號PCT/US19/27109的優先權，其每個的全部內容藉由引用結合在此。
寡核苷酸可用於治療、診斷、研究、和奈米材料應用。天然存在的核酸(例如，未修飾的DNA或RNA)用於治療之用途可能受限，例如，因為天然存在的核酸對細胞外和細胞內核酸酶的不穩定性和/或天然存在的核酸的細胞滲透和分佈不良。需要新的且改進的DMD寡核苷酸以及DMD寡核苷酸組成物，例如，能夠調節用於治療肌肉營養不良的肌營養不良蛋白外顯子51或外顯子53的跳讀(skipping)的新的DMD寡核苷酸和DMD寡核苷酸組成物。
本揭露尤其涵蓋識別DMD寡核苷酸的結構元件(如鹼基序列、化學修飾(例如，糖、鹼基、和/或核苷酸間鍵的修飾，及其模式)、和/或立體化學(例如，骨架手性中心的立體化學(手性核苷酸間鍵)、和/或其模式))可以對DMD寡核苷酸特性(例如，外顯子51或53的跳讀、毒性、穩定性、蛋白質結合特性等)具有顯著影響。
在一些實施方式中，本揭露提供了能夠介導DMD外顯子51或外顯子53的跳讀的DMD寡核苷酸或DMD寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，DMD寡核苷酸或DMD寡核苷酸組成物可用於治療肌肉營養不良。在一些實施方式中，DMD寡核苷酸或DMD寡核苷酸組成物係本文揭露的(包括但不限於表A1中的)DMD寡核苷酸或DMD寡核苷酸組成物。
在一些實施方式中，如本文所述的實施方式數據所證明，提供的技術特別可用於降低突變體mRNA(例如，包含有害的突變的DMD轉錄物)和/或由其編碼的蛋白質的水平、和增加修復的mRNA(例如，其中跳讀外顯子51或外顯子53以刪除、改正或補償有害的突變的DMD轉錄物)和/或由其編碼的蛋白質的水平。
在一些實施方式中，提供的技術特別地可用於調節DMD轉錄物的剪接，例如，增加所希望的剪接產物的水平和/或減少不希望的剪接產物的水平。在一些實施方式中，提供的技術特別可用於降低DMD轉錄物(例如，前mRNA、RNA等)的水平，並且在許多情況下，降低由此類DMD轉錄物(如mRNA、蛋白質等)產生或編碼的產物的水平。在一些實施方式中，前mRNA或mRNA或RNA被從一個細胞區室(例如，細胞核、細胞質等)轉移到另一個細胞區室、和/或被一種或多種酶修飾。
例如，在一些實施方式中，肌營養不良蛋白基因可以包含外顯子，該外顯子包含與肌肉營養不良(包括但不限於杜興氏肌肉失養症(Duchenne (Duchenne's)muscular dystrophy，DMD)和貝克氏肌肉失養症(Becker(Becker's)muscular dystrophy，BMD))相關的一種或多種突變。在一些實施方式中，疾病相關的外顯子包含外顯子中的突變(例如，誤義突變、框移突變、無義突變、提前終止密碼子等)。在一些實施方式中，本揭露提供了用於有效地跳讀疾病相關的肌營養不良蛋白外顯子、而保留或恢復讀框使得可以產生較短的(例如，內部截短的)、但是具有部分功能的肌營養不良蛋白(例如，變體)的組成物及方法。
除其他事項之外，本揭露證明了可以使用化學修飾和/或立體化學來調節由DMD寡核苷酸組成物剪接的DMD轉錄物。在一些實施方式中，本揭露提供了化學修飾和立體化學的組合來改善DMD寡核苷酸的特性，例如，它們改變DMD轉錄物的剪接的能力。在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的(chirally controlled)DMD寡核苷酸組成物，當與參考條件(例如，不存在組成物、存在參考組成物(例如，具有相同的組成(如熟悉該項技術者所理解的，除非另有說明，否則構造通常是指分子實體中原子的同一性和連線性(以及對應的鍵多重性)的描述，但是省略了由它們的空間排列引起的任何區別)的DMD寡核苷酸的立體隨機(立體隨機的)組成物、不同的手性受控的DMD寡核苷酸組成物等)、及其組合等)相比時，該手性受控的DMD寡核苷酸組成物提供了增加的DMD外顯子51或DMD外顯子53的跳讀以產生修飾的(例如，修復的)mRNA，該修飾的mRNA可以被翻譯以產生內部截短的、但具有至少部分功能的肌營養不良蛋白質(Dystrophin protein)變體。
在一些實施方式中，與參考條件相比，提供的手性受控的DMD寡核苷酸組成物出人意料地有效。在一些實施方式中，DMD外顯子51或53的剪接可以增強超過5、10、15、20、25、30、40、50、或100倍。
本揭露認識到提供低毒性DMD寡核苷酸組成物及其使用方法的挑戰。在一些實施方式中，本揭露提供了具有減少的毒性的DMD寡核苷酸組成 物和方法。在一些實施方式中，本揭露提供了具有減少的免疫應答誘導的DMD寡核苷酸組成物和方法。
在一些實施方式中，本揭露提供了具有增強的hTLR9活性的對抗作用的DMD寡核苷酸。在一些實施方式中，肌肉營養不良與(例如，肌肉組織中的)炎症相關。在一些實施方式中，提供的技術(例如，DMD寡核苷酸、組成物、方法等)提供了增強的活性(例如，外顯子跳讀活性)和hTLR9拮抗活性兩者，該等活性可以對與炎症相關的一種或多種病症和/或疾病有效。在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸和/或其組成物提供了外顯子跳讀能力以及減少的毒性和/或炎症的水平兩者。
在一些實施方式中，DMD寡核苷酸包含(各自獨立地選自多種類型的)多個核苷酸間鍵。多種類型的核苷酸間鍵在特性上不同。不希望受任何理論束縛，本揭露指出天然磷酸酯鍵(磷酸二酯核苷酸間鍵)係陰離子的，並且當在體內以其自身使用而沒有其他化學修飾時可以是不穩定的；硫代磷酸酯核苷酸間鍵係陽離子的，通常在體內比天然磷酸酯鍵更穩定，並且通常更疏水；中性核苷酸間鍵(如本揭露中例示的包含環狀胍部分的一個)在生理pH下是中性的，在體內可以比天然磷酸酯鍵更穩定並且更疏水。
在一些實施方式中，DMD寡核苷酸包含修飾的核苷酸間鍵，該核苷酸間鍵係在pH[例如，人生理pH(約7.4)、遞送位點(例如，細胞器、細胞、組織、器官、生物等)的pH等]下是非負電荷的(中性或陽離子的)核苷酸間鍵。不希望受任何特定理論的束縛，在至少一些情況下，與不包含中性核苷酸間鍵的相當的核酸相比，DMD寡核苷酸中的中性核苷酸間鍵可以提供改進的特性和/或外顯子51或53的跳讀，例如，改進的遞送、對核酸外切酶和內切核酸酶改進的抗性、改進的細胞攝取、改進的內體逃逸和/或改進的核攝取等。
在一些實施方式中，非負電荷的核苷酸間鍵包含環狀胍部分。在 一些實施方式中，非負電荷的核苷酸間鍵具有以下結構：
Figure 108116317-A0202-12-0005-1
或 其立體異構物(例如，n001R或n001S)。在一些實施方式中，包含環狀胍部分的中性核苷酸間鍵係手性受控的。在一些實施方式中，本揭露涉及包含DMD寡核苷酸的組成物，該DMD寡核苷酸包含至少一個中性核苷酸間鍵和至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
除其他事項之外，本揭露涵蓋認識到立體隨機DMD寡核苷酸配製物包含與彼此不同的多個不同化學實體，例如，在DMD寡核苷酸鏈內的各個骨架手性中心的立體化學結構。在不控制骨架手性中心的立體化學的情況下，立體隨機DMD寡核苷酸配製物提供包含未確定水平的DMD寡核苷酸立體異構物的不受控制的(或立體隨機)組成物。儘管該等立體異構物可以具有相同的鹼基序列和/或化學修飾，但是至少由於它們不同的骨架立體化學它們係不同的化學實體，並且如本文所闡述的，它們可以具有不同的特性，例如，外顯子51或53的跳讀、毒性、分佈等。除其他事項之外，本揭露提供了手性受控的組成物，該手性受控的組成物係或者含有目的DMD寡核苷酸的特定的立體異構物；與手性不受控制的組成物相反，手性受控的組成物包含受控制水平的DMD寡核苷酸的特定的立體異構物。在一些實施方式中，特定的立體異構物可以藉由以下來定義，例如，藉由其鹼基序列、其骨架連接的模式、其骨架手性中心的模式、和骨架磷修飾的模式等。如本領域所理解的，在一些實施方式中，鹼基序列可以僅是指鹼基的序列和/或係指DMD寡核苷中的核苷殘基(例如，相對於標準天然存在的核苷(如腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、和尿嘧啶)的糖和/或鹼基組分)的同一性和/或修飾狀態和/或係指此類殘基的雜交特徵(即，與特定的互補性殘基 雜交的穩定性)。在一些實施方式中，本揭露證明了藉由在DMD寡核苷酸內包含和/或定位特定的手性結構而實現的特性改善(例如，改進的外顯子51或53的跳讀、較低的毒性等)可以與藉由以下實現的那些相當或者甚至更好：使用化學修飾，例如，特定的骨架連接、殘基修飾等(例如，藉由使用某些類型的修飾的磷酸酯[例如，硫代磷酸酯、取代的硫代磷酸酯等]、糖修飾[例如，2'-修飾等]、和/或鹼基修飾[例如，甲基化等])。在一些實施方式中，本揭露證明了包含某些化學修飾(例如，2'-F、2'-OMe、硫代磷酸酯核苷酸間鍵等)的DMD寡核苷酸的手性受控的DMD寡核苷酸組成物證明瞭出乎意料高的外顯子跳讀效率。
在一些實施方式中，本揭露提供了包含多種DMD寡核苷酸的DMD寡核苷酸組成物，該DMD寡核苷酸組成物：1)具有與DMD轉錄物中的靶序列互補的共同的鹼基序列；並且2)包含一個或多個修飾的糖部分和修飾的核苷酸間鍵，其中DMD寡核苷酸係本文所述的(例如，在表A1中)DMD寡核苷酸。
在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸組成物的特徵在於：當與DMD轉錄物剪接系統中的DMD轉錄物接觸時，相對於在選自以下群組的參考條件下觀察到的，DMD轉錄物的剪接改變(例如，外顯子51或53的跳讀增加)，該群組由以下組成：不存在組成物、存在參考組成物、及其組合。
在一些實施方式中，參考條件係不存在組成物。在一些實施方式中，參考條件係存在參考組成物。包含參考多種DMD寡核苷酸的示例參考組成物在此揭露中廣泛地描述。在一些實施方式中，與提供的組成物中的多種DMD寡核苷酸相比，參考多個的DMD寡核苷酸具有不同的結構元件(化學修飾、立體化學等)。在一些實施方式中，參考組成物係具有相同的化學修飾的DMD寡核苷酸的立體隨機製劑。在一些實施方式中，參考組成物係立體異構物的混合物，而提供的組成物係一個立體異構物的手性受控的DMD寡核苷酸組成物。在 一些實施方式中，參考多個的DMD寡核苷酸與提供的組成物中的多種DMD寡核苷酸具有相同的鹼基序列、相同的糖修飾、相同的鹼基修飾、相同的核苷酸間鍵修飾、和/或相同的立體化學，但是不同的化學修飾，例如，鹼基修飾、糖修飾、核苷酸間鍵修飾等。
示例剪接系統係本領域廣泛已知的。在一些實施方式中，剪接系統係體內或體外系統，其包括足以實現相關靶DMD轉錄物的剪接的組分。在一些實施方式中，剪接系統係或包含剪接體(例如，蛋白質和/或其RNA組分)。在一些實施方式中，剪接系統係或包含細胞器膜(例如，核膜)和/或細胞器(例如，細胞核)。在一些實施方式中，剪接系統係或包含細胞或其群體。在一些實施方式中，剪接系統係或包含組織。在一些實施方式中，剪接系統係或包含生物，例如，動物，例如哺乳動物，例如小鼠、大鼠、猴子、狗、人等。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，該DMD寡核苷酸組成物包含藉由以下定義的特定的DMD寡核苷酸類型的多種DMD寡核苷酸：1)鹼基序列；2)骨架連接的模式；3)骨架手性中心的模式；以及4)骨架磷修飾的模式，其中DMD寡核苷酸係本文所述的(例如，在表A1中)DMD寡核苷酸。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，該DMD寡核苷酸組成物包含藉由以下定義的特定的DMD寡核苷酸類型的多種DMD寡核苷酸：1)鹼基序列；2)骨架連接的模式； 3)骨架手性中心的模式；以及4)骨架磷修飾的模式，該組成物係手性受控的，並且相對於具有相同的鹼基序列的DMD寡核苷酸的基本上外消旋的製劑，該組成物富含特定DMD寡核苷酸類型的DMD寡核苷酸，DMD寡核苷酸組成物的特徵在於：當與DMD轉錄物剪接系統中的DMD轉錄物接觸時，相對於在參考條件下所觀察到的，DMD轉錄物的剪接發生改變(例如，外顯子51或53的跳讀增加)，該參考條件選自由以下組成之群組：不存在組成物、存在參考組成物、及其組合，其中DMD寡核苷酸係本文所述的(例如，在表A1中)DMD寡核苷酸。
在一些實施方式中，本揭露提供了表A1中的寡核苷酸的手性受控的寡核苷酸組成物，其中寡核苷酸包含一個或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20或更多個)手性受控的核苷酸間鍵(例如，S、R、nS、或nR的那些)，並且其中寡核苷酸視需要以藥學上可接受的鹽形式。在一些實施方式中，以鈉鹽提供寡核苷酸。
在一些實施方式中，如本文所述的，多個寡核苷酸具有相同的組成。在一些實施方式中，對於組成物中的多個寡核苷酸的手性受控的核苷酸間鍵，在具有多個寡核苷酸的相同組成的組成物中所有寡核苷酸的至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、較佳地至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%在手性受控的核苷酸間鍵中具有相同連接磷構型。
在一些實施方式中，DMD轉錄物係肌營養不良蛋白基因或其變體。
在一些實施方式中，本揭露提供了包含本文揭露的任何DMD寡核苷酸的組成物。在一些實施方式中，本揭露提供了包含本文揭露的任何手性受控的DMD寡核苷酸的組成物。在一些實施方式中，本揭露提供了包含本文揭露的任何手性受控的DMD寡核苷酸的組成物，其中DMD寡核苷酸能夠介導DMD外顯子51或DMD外顯子53的跳讀。
在一些實施方式中，本揭露涉及任何本文所述的(例如，在表A1中)個體DMD寡核苷酸。
在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸和/或組成物能夠介導外顯子51的跳讀。在一些實施方式中，此類DMD寡核苷酸和組成物的非限制性實例包括以下那些：WV-12494、WV-12130、WV-12131、WV-12132、WV-12133、WV-12134、WV-12135、WV-12136、WV-12496、WV-12495、WV-12123、WV-12124、WV-12125、WV-12126、WV-12127、WV-12128、WV-12129、WV-12553、WV-12554、WV-12555、WV-12556、WV-12557、WV-12558、WV-12559、WV-12872、WV-12873、WV-12876、WV-12877、WV-12878、WV-12879、WV-12880、WV-12881、WV-12882、和WV-12883、以及其他DMD寡核苷酸，該等DMD寡核苷酸具有包含該等DMD寡核苷酸的任何的至少15個連續鹼基的鹼基序列。
在一些實施方式中，DMD寡核苷酸(例如，DMD寡核苷酸)能夠介導外顯子53的跳讀。此類DMD寡核苷酸的非限制性實例包括：WV-12880、WV-13826、WV-13827、WV-14791、WV-9517、WV-13835、WV-13864、WV-14344、以及具有鹼基序列(包含任何該等DMD寡核苷酸的至少15個連續鹼基)的DMD寡核苷酸。
在一些實施方式中，本揭露涉及製造本文揭露的(例如，在表A1中)任何DMD寡核苷酸的方法。
在一些實施方式中，本揭露涉及包含本文揭露的(例如，在表A1中)任何DMD寡核苷酸的試劑。
在一些實施方式中，本揭露提供了選自任何表的DMD寡核苷酸的手性受控的DMD寡核苷酸組成物。
在一些實施方式中，DMD寡核苷酸包含核苷酸間鍵，該核苷酸間鍵係天然磷酸酯鍵或硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在一些實施方式中，硫代磷酸酯核苷酸間鍵不是手性受控的。在一些實施方式中，硫代磷酸酯核苷酸間鍵係手性受控的核苷酸間鍵(例如，Sp或Rp)。
在一些實施方式中，DMD寡核苷酸包含非負電荷的核苷酸間鍵。在一些實施方式中，DMD寡核苷酸包含中性核苷酸間鍵。在一些實施方式中，中性核苷酸間鍵係或包含環狀胍部分。
在一些實施方式中，核苷酸間鍵包含胍部分。在一些實施方式中，核苷酸間鍵包含環狀胍部分。在一些實施方式中，核苷酸間鍵包含具有以下結構的環狀胍部分：n001。在一些實施方式中，中性核苷酸間鍵或核苷酸間鍵包含立體化學控制的環狀胍部分。
通常，可以使用任何合適的測定來評估如本文所述DMD寡核苷酸組成物的特性。對於不同的組成物(例如，立體控制的與非立體控制的、和/或不同的立體控制的組成物)的相對的毒性和/或蛋白質結合特性通常理想地在相同的測定中確定，在一些實施方式中基本上同時，並且在一些實施方式中參考歷史結果。
熟悉該項技術者將意識到和/或將能夠容易地開發用於特定的DMD寡核苷酸組成物的合適測定。本揭露提供了某些特定測定的描述，例如可用於評估DMD寡核苷酸組成物行為的一個或多個特徵，例如，補體活化、注射位點炎症、蛋白質結合等。
例如，可用於評估DMD寡核苷酸組成物的毒性和/或蛋白質結合特性的某些測定可以包括本文描述和/或示例的任何測定。
在一些實施方式中，本揭露提供了包含具有相同鹼基序列的多種DMD寡核苷酸的DMD寡核苷酸組成物，其中該多種寡核苷酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個手性受控的核苷酸間鍵。在一些實施方式中，本揭露提供了包含具有相同組成的多種DMD寡核苷酸的DMD寡核苷酸組成物，其中該多種寡核苷酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個手性受控的核苷酸間鍵。在一些實施方式中，當寡核苷酸組成物與DMD轉錄物剪接系統中的DMD轉錄物接觸時，相對於在選自以下群組的參考條件下觀察到的，DMD轉錄物的剪接改變(例如，外顯子51或53的跳讀增加)，該群組由以下組成：不存在組成物、存在參考組成物、及其組合。在一些實施方式中，與參考條件相比，以增加的水平(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500或更多倍)提供具有一個外顯子(例如，在一些實施方式中，外顯子51；在一些實施方式中，外顯子53)跳讀和/或由其編碼的蛋白質的剪接產物。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，該DMD寡核苷酸組成物包含藉由以下定義的特定的DMD寡核苷酸類型的多種DMD寡核苷酸：1)鹼基序列；2)骨架連接的模式；3)骨架手性中心的模式；以及4)骨架磷修飾的模式，其中： 該多種寡核苷酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個手性受控的核苷酸間鍵；並且DMD寡核苷酸組成物的特徵在於：當與DMD轉錄物剪接系統中的DMD轉錄物接觸時，相對於在選自以下群組的參考條件下觀察到的，DMD轉錄物的剪接改變(例如，外顯子51或53的跳讀增加)，該群組由以下組成：不存在組成物、存在參考組成物、及其組合。
在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療或預防肌肉營養不良之方法，該方法包括向受試者給予本文所述的DMD寡核苷酸組成物。
在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療或預防肌肉營養不良之方法，該方法包括向受試者給予包含多種DMD寡核苷酸的DMD寡核苷酸組成物，該多種DMD寡核苷酸：1)具有與DMD轉錄物中的靶序列互補的共同的鹼基序列；並且2)包含一個或多個修飾的糖部分和修飾的核苷酸間鍵，DMD寡核苷酸組成物的特徵在於：當與DMD轉錄物剪接系統中的DMD轉錄物接觸時，相對於在參考條件下所觀察到的，DMD轉錄物的剪接發生改變(例如，外顯子51或53的跳讀增加)，該參考條件選自由以下組成之群組：不存在組成物、存在參考組成物、及其組合，其中DMD寡核苷酸係本文所述的(例如，在表A1中)DMD寡核苷酸。
在一些實施方式中，本揭露提供了用於的方法治療或預防肌肉營養不良之方法，該方法包括向受試者給予手性受控的DMD寡核苷酸組成物，該手性受控的DMD寡核苷酸組成物包含藉由以下定義的特定的DMD寡核苷酸類型的多種DMD寡核苷酸：1)鹼基序列；2)骨架連接的模式； 3)骨架手性中心的模式；以及4)骨架磷修飾的模式，該組成物係手性受控的，並且相對於具有相同的鹼基序列的DMD寡核苷酸的基本上外消旋的製劑，該組成物富含特定DMD寡核苷酸類型的DMD寡核苷酸，其中DMD寡核苷酸組成物的特徵在於：當與DMD轉錄物剪接系統中的DMD轉錄物接觸時，相對於在參考條件下所觀察到的，DMD轉錄物的剪接發生改變(例如，外顯子51或53的跳讀增加)，該參考條件選自由以下組成之群組：不存在組成物、存在參考組成物、及其組合，其中DMD寡核苷酸係本文所述的(例如，在表A1中)DMD寡核苷酸。
在一些實施方式中，提供的寡核苷酸包含至少一個，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個非負電荷的核苷酸間鍵，其實視需要以及獨立地手性受控的。在一些實施方式中，提供的寡核苷酸包含手性受控的非負電荷的核苷酸間鍵。在一些實施方式中，非負電荷的核苷酸間鍵係n001。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，該DMD寡核苷酸組成物包含藉由以下定義的特定的DMD寡核苷酸類型的多種DMD寡核苷酸：1)鹼基序列；2)骨架連接的模式；3)骨架手性中心的模式；以及4)骨架磷修飾的模式，其中： 該多種寡核苷酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個手性受控的核苷酸間鍵；並且該多種寡核苷酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個非負電荷的核苷酸間鍵。
在一些實施方式中，在肌肉營養不良中，跳讀DMD外顯子51或DMD外顯子53之後，肌營養不良蛋白的功能可以藉由內部截短的、但具有至少部分功能的肌營養不良蛋白質變體恢復、或至少部分地恢復。
在一些實施方式中，肌肉營養不良包括但不限於杜興氏肌肉失養症(DMD)和貝克氏肌肉失養症(BMD)。
在一些實施方式中，本揭露提供了藥物組成物，該藥物組成物包含本揭露的DMD寡核苷酸或DMD寡核苷酸組成物、和藥學上可接受的載體。
在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療肌肉營養不良(杜興氏肌肉失養症(DMD)、或貝克氏肌肉失養症(BMD))之方法，該方法包括向易患其或者患有其的受試者給予本揭露中所述的組成物。
在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療肌肉營養不良(杜興氏肌肉失養症(DMD)、或貝克氏肌肉失養症(BMD))之方法，該方法包括向易患其或者患有其的受試者給予包含本文揭露的任何DMD寡核苷酸的組成物。在一些實施方式中，組成物係包含有效量的寡核苷酸的藥物組成物，並且是手性受控的。在一些實施方式中，寡核苷酸以鹽形式(例如，鈉鹽)提供。
在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療肌肉營養不良(杜興氏肌肉失養症(DMD)、或貝克氏肌肉失養症(BMD))之方法，該方法包括(a)向易患其或者患有其的受試者給予包含本文揭露的任何DMD寡核苷酸的組成物，以及(b)向受試者給予另外的治療，該另外的治療能夠預防、治療、減輕 或減緩肌肉營養不良(杜興氏肌肉失養症(DMD)、或貝克氏肌肉失養症(BMD))的至少一個症狀的進展。
定義
如本文使用的，除非另有說明，應施用下列定義。出於本揭露的目的，化學元素係根據元素週期表(Periodic Table of the Elements)，CAS版本，Handbook of Chemistry and Physics[化學與物理手冊]，第75版進行識別的。此外，有機化學的一般原則闡述於「Organic Chemistry[有機化學]」，Thomas Sorrell,University Science Books[大學科學書籍]，Sausalito：1999及「March's Advanced Organic Chemistry[馬奇高級有機化學]」，第5版，編輯：Smith,M.B.和March,J.,約翰威利父子公司(John Wiley & Sons)，紐約：2001。
大約：如本文所用，關於數字的術語「大約」或「約」通常用於包括在任一方向上(大於或小於)落入5%、10%、15%、或20%範圍的數字，除非數字另有指明或另外從上下文明顯可見(除了會小於可能值的0%或者超過可能值的100%的這種數字)。在一些實施方式中，關於劑量使用術語「約」意指±5mg/kg/天。
可比較的：術語「可比較的」在本文中用於描述兩組(或更多組)彼此充分相似的條件或環境，以允許比較所獲得的結果或觀察到的現象。在一些實施方式中，可比較的條件或環境的組的特徵在於多個基本相同的特徵和一個或少量變化的特徵。熟悉該項技術者將理解，當具有足夠數量和類型的基本相同的特徵時，條件的組彼此相當，以保證合理的結論，即在不同組條件下觀察到的結果或觀察到的現象的差異或情況係由那些變化的特徵的變化引起或指示的。
給藥方案：如本文所用，「給藥方案」或「治療方案」係指單獨給予受試者的一組單位劑量(通常多於一種)，通常藉由一段時間分開。在一些實施方式中，給定的治療劑具有推薦的給藥方案，其可以包括一個或多個劑量。 在一些實施方式中，給藥方案包括多個劑量，每個劑量彼此分開相同長度的時間段；在一些實施方式中，劑量方案包含多個劑量和各個劑量的至少兩個不同的時間段。在一些實施方式中，給藥方案內的所有劑量具有相同的單位劑量量。在一些實施方式中，給藥方案內的不同的劑量具有不同的量。在一些實施方式中，給藥方案包含以第一劑量量的第一劑量，然後是以不同於第一劑量量的第二劑量量的一個或多個另外的劑量。在一些實施方式中，給藥方案包含以第一劑量量的第一劑量，然後是以與第一劑量量相同的第二劑量的一個或多個另外的劑量。
雜原子：術語「雜原子」意指不是碳或氫的原子。在一些實施方式中，雜原子係氧、硫、氮、磷、硼或矽(包括氮、硫、磷、或矽的任何氧化的形式；任何鹼性氮或雜環可取代氮的季銨化形式(例如，N，如以3,4-二氫-2H-吡咯基)、NH(如以吡咯啶基)或NR+(如以N-取代的吡咯啶基)；等)。在一些實施方式中，雜原子係硼、氮、氧、矽、硫、或磷。在一些實施方式中，雜原子係氮、氧、矽、硫、或磷。在一些實施方式中，雜原子係氮、氧、硫、或磷。在一些實施方式中，雜原子係氮、氧、或硫。
體外：如本文所用，術語「體外」係指在人造環境中發生的事件，例如在試管或反應容器中，在細胞培養物中等，而不是在生物體(例如，動物、植物和/或微生物)內。
體內：如本文所用，術語「體內」係指在生物體(例如，動物、植物和/或微生物)內發生的事件。
部分不飽和的：如本文使用的，術語「部分不飽和的」係指包含至少一個雙鍵或三鍵的環部分。術語「部分不飽和的」意在涵蓋具有多個不飽和的位點的環，但是如在此定義的不意在包括芳基或雜芳基部分。
藥物組成物：如本文所用，術語「藥物組成物」係指與一種或多種藥學上可接受的載體一起配製的活性劑。在一些實施方式中，活性劑以適合於 在治療方案中給予的單位劑量存在，其顯示當給予相關群體時實現受控制的治療效果的統計學顯著概率。在一些實施方式中，藥物組成物可以針對以固體或液體形式給予而進行特別配製，包括適用於以下的那些：口服給予，例如，浸液(drench)(水性或非水溶液或懸浮液)、片劑(例如針對口腔、舌下和全身吸收的那些)、丸劑、粉劑、顆粒劑、糊劑(應用於舌)；腸胃外給予，例如，作為例如無菌溶液或懸浮液或持續釋放的配製物藉由皮下、肌內、靜脈內或硬膜外注射；局部應用，例如，作為乳膏劑、軟膏劑、或控制釋放貼劑或噴霧劑應用於皮膚、肺或口腔；陰道內或直腸內，例如作為陰道栓劑、乳膏劑或泡沫劑；舌下；眼部；透皮；或經鼻、肺以及應用於其他黏膜表面。
藥學上可接受的：如本文所使用的，短語「藥學上可接受的」係指在正確醫學判斷的範圍內適合於與人和動物的組織接觸而無過多毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，與合理的效益/風險比相稱的那些化合物、材料、組成物、和/或劑型。
藥學上可接受的載體：如本文所用，術語「藥學上可接受的載體」意指藥學上可接受的材料、組成物或運載體，如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑或溶劑包封材料，其涉及將主題化合物從一個器官(或身體的一部分)攜帶或運輸到另一個器官或身體的一部分。在與配製物的其他成分相容並且對患者無害的意義上，每種載體必須是「可接受的」。可充當藥學上可接受的載體的材料的一些實例包括：糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；澱粉，如玉米澱粉和馬鈴薯澱粉；纖維素和它的衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；黃茋膠粉；麥芽；明膠；滑石粉；賦形劑，如可可脂和栓劑蠟；油，如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油、以及大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇、以及聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無熱原水；等滲鹽水；林格氏 溶液；乙醇；pH緩衝的溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及在藥物配製物中採用的其他無毒相容的物質。
藥學上可接受的鹽：如本文所用，術語「藥學上可接受的鹽」係指適合於在製藥環境中使用的此類化合物的鹽，即，在合理醫學判斷的範圍內，適於與人和低等動物的組織接觸使用而無不當毒性、刺激、過敏反應等並且與合理的效益/風險比相稱的鹽。藥學上可接受的鹽係本領域公知的。例如，S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences[藥物科學雜誌]，66：1-19(1977)中詳細地描述了藥學上可接受的鹽。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽包括但不限於，無毒的酸加成鹽，其係使用無機酸諸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸和過氯酸或使用有機酸如乙酸、馬來酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸或丙二酸或藉由使用本領域中所使用的其他方法如離子交換形成的具有胺基基團的鹽。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽包括但不限於己二酸鹽、藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、葡糖酸鹽、半硫酸鹽(hemisulfate)、庚酸鹽、己酸鹽、氫碘化物、2-羥基-乙磺酸鹽、乳糖酸鹽(lactobionate)、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、撲酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對甲苯磺酸鹽、十一酸鹽、戊酸鹽等。代表性鹼金屬或鹼土金屬鹽包括鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽等。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽包括使用平衡離子(如鹵離子、氫氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、具有從1至6個碳原子的烷基、磺酸根以及芳基磺酸根)形成的無毒銨、季銨以及胺陽離子。在一些實施方式中，提供的化合物(例如， 寡核苷酸)包含一個或多個酸性基團(例如，天然磷酸酯鍵基團、硫代磷酸酯連接基團等)，並且藥學上可接受的鹽係鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽、或銨鹽(例如，N(R)3的銨鹽，其中每個R獨立地如本揭露中所定義和所述的)。代表性的鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽包括鈉、鋰、鉀、鈣、鎂等的鹽。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽係鈉鹽。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽係鉀鹽。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽係鈣鹽。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽包括使用平衡離子(如鹵離子、氫氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、具有從1至6個碳原子的烷基、磺酸根以及芳基磺酸根)形成的無毒銨、季銨以及胺陽離子。在一些實施方式中，提供的化合物包含多於一個酸性基團，例如，寡核苷酸可以包含兩個或更多個酸性基團(例如，天然磷酸酯鍵和/或修飾的核苷酸間鍵)。在一些實施方式中，這種化合物的藥學上可接受的鹽(或者通常，鹽)包含兩個或更多個陽離子，該兩個或更多個陽離子可以是相同的或不同的。在一些實施方式中，在藥學上可接受的鹽(或通常，鹽)中，具有足夠酸度的每個酸性基團以其鹽形式獨立地存在(例如，在包含天然磷酸酯鍵和硫代磷酸酯核苷酸間鍵的寡核苷酸中，天然磷酸酯鍵和硫代磷酸酯核苷酸間鍵的每個以其鹽形式獨立地存在)。在一些實施方式中，寡核苷酸(例如，提供的DMD寡核苷酸)的藥學上可接受的鹽係提供的DMD寡核苷酸的鈉鹽。在一些實施方式中，寡核苷酸(例如，DMD寡核苷酸)的藥學上可接受的鹽係此類寡核苷酸的鈉鹽，其中每個酸性鍵(例如，每個天然磷酸酯鍵和硫代磷酸酯核苷酸間鍵)以鈉鹽形式(所有鈉鹽)存在。
保護基團：如本文所用，術語「保護基團，」係本領域熟知的並且包括在Protecting Groups in Organic Synthesis[有機合成中的保護基團]中詳細描述的那些：T.W.Greene和P.G.M.Wuts，第3版，約翰威立父子公司(John Wiley & Sons),1999，其整個內容藉由引用以其整體結合在此。還包括那些特別適用 於核苷和核苷酸化學的保護基團，例如，在Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry[當前的核酸化學方案]中描述的那些，由Serge L.Beaucage等人編輯06/2012，章節2的全部內容藉由引用以其整體結合在此。合適的胺基-保護基團包括胺基甲酸甲酯、胺基甲酸乙酯、9-茀基胺基甲酸甲酯(Fmoc)、9-(2-磺酸基)茀基胺基甲酸甲酯、9-(2,7-二溴)茀基胺基甲酸甲酯、2,7-二-三級丁基-[9-(10,10-二側氧基-10,10,10,10-四氫噻噸基)]胺基甲酸甲酯(DBD-Tmoc)、4-甲氧基苯醯基胺基甲酸酯(Phenoc)、2,2,2-三氯乙基胺基甲酸酯(Troc)、2-三甲基矽基乙基胺基甲酸酯(Teoc)、2-苯基乙基胺基甲酸酯(hZ)、1-(1-金剛烷基)-1-甲基乙基胺基甲酸酯(Adpoc)、1,1-二甲基-2-鹵代乙基胺基甲酸酯、1,1-二甲基-2,2-二溴乙基胺基甲酸酯(DB-t-BOC)、1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙基胺基甲酸酯(TCBOC)、1-甲基-1-(4-聯苯基)乙基胺基甲酸酯(Bpoc)、1-(3,5-二-三級丁基苯基)-1-甲基乙基胺基甲酸酯(t-Bumeoc)、2-(2'-吡啶基和4'-吡啶基)乙基胺基甲酸酯(Pyoc)、2-(N,N-二環己基甲醯胺基)乙基胺基甲酸酯、胺基甲酸三級丁酯(BOC)、1-金剛烷基胺基甲酸酯(Adoc)、胺基甲酸乙烯基酯(Voc)、胺基甲酸烯丙基酯(Alloc)、1-異丙基烯丙基胺基甲酸酯(Ipaoc)、肉桂基胺基甲酸酯(Coc)、4-硝基肉桂基胺基甲酸酯(Noc)、8-喹啉基胺基甲酸酯、N-羥基哌啶基胺基甲酸酯、烷基二硫胺基甲酸酯、苄基胺基甲酸酯(Cbz)、對甲氧基苄基胺基甲酸酯(Moz)、對硝基苯基胺基甲酸酯、對溴苄基胺基甲酸酯、對氯苄基胺基甲酸酯、2,4-二氯苄基胺基甲酸酯、4-甲基亞磺醯基苄基胺基甲酸酯(Msz)、9-蒽基胺基甲酸甲酯、聯苯基胺基甲酸甲酯、2-甲硫基乙基胺基甲酸酯、2-甲基磺醯基乙基胺基甲酸酯、2-(對甲苯磺醯基)乙基胺基甲酸酯、[2-(1,3-二噻
Figure 108116317-A0202-12-0020-49
基)]胺基甲酸甲酯(Dmoc)、4-甲硫基苯基胺基甲酸酯(Mtpc)、2,4-二甲硫基苯基胺基甲酸酯(Bmpc)、2-磷鎓基乙基胺基甲酸酯(Peoc)、2-三苯基磷鎓基異丙基胺基甲酸酯(Ppoc)、1,1-二甲基-2-氰基乙基胺基甲酸酯、間-氯- 對醯氧基苄基胺基甲酸酯、對(二羥基硼烷基)苄基胺基甲酸酯、5-苯并異
Figure 108116317-A0202-12-0021-50
唑基胺基甲酸甲酯、2-(三氟甲基)-6-色酮基胺基甲酸甲酯(Tcroc)、間-硝基苯基胺基甲酸酯、3,5-二甲氧基苄基胺基甲酸酯、鄰-硝基苄基胺基甲酸酯、3,4-二甲氧基-6-硝基苄基胺基甲酸酯、苯基(鄰-硝基苯基)甲基胺基甲酸酯、吩噻
Figure 108116317-A0202-12-0021-51
基-(10)-羰基衍生物、N'-對甲苯磺醯基胺基羰基衍生物、N'-苯基胺基硫代羰基衍生物、胺基甲酸三級戊酯、S-苯基硫胺基甲酸酯、對氰基苄基胺基甲酸酯、環丁基胺基甲酸酯、環己基胺基甲酸酯、環戊基胺基甲酸酯、環丙基胺基甲酸甲酯、對-癸氧基苄基胺基甲酸酯、2,2-二甲氧基羰基乙烯基胺基甲酸酯、鄰-(N,N-二甲基甲醯胺基)苄基胺基甲酸酯、1,1-二甲基-3-(N,N-二甲基甲醯胺基)丙基胺基甲酸酯、1,1-二甲基丙炔基胺基甲酸酯、二(2-吡啶基)胺基甲酸甲酯、2-呋喃基胺基甲酸甲酯、2-碘乙基胺基甲酸酯、異冰片基胺基甲酸酯、異丁基胺基甲酸酯、異煙基胺基甲酸酯、對-(對'-甲氧基苯基偶氮基)苄基胺基甲酸酯、1-甲基環丁基胺基甲酸酯、1-甲基環己基胺基甲酸酯、1-甲基-1-環丙基胺基甲酸甲酯、1-甲基-1-(3,5-二甲氧基苯基)乙基胺基甲酸酯、1-甲基-1-(對苯基偶氮基苯基)乙基胺基甲酸酯、1-甲基-1-苯基乙基胺基甲酸酯、1-甲基-1-(4-吡啶基)乙基胺基甲酸酯、苯基胺基甲酸酯、對-(苯基偶氮基)苄基胺基甲酸酯、2,4,6-三-三級丁基苯基胺基甲酸酯、4-(三甲基銨)苄基胺基甲酸酯、2,4,6-三甲基苄基胺基甲酸酯、甲醯胺、乙醯胺、氯乙醯胺、三氯乙醯胺、三氟乙醯胺、苯基乙醯胺、3-苯基丙醯胺、氮苯醯胺、3-吡啶基甲醯胺、N-苯甲醯基苯基丙胺醯衍生物、苯甲醯胺、對-苯基苯甲醯胺、鄰-硝基苯基乙醯胺、鄰-硝基苯氧基乙醯胺、乙醯基乙醯胺、(N'-二硫苄氧基羰基胺基)乙醯胺、3-(對-羥基苯基)丙醯胺、3-(鄰-硝基苯基)丙醯胺、2-甲基-2-(鄰-硝基苯氧基)丙醯胺、2-甲基-2-(鄰-苯基偶氮基苯氧基)丙醯胺、4-氯丁醯胺、3-甲基-3-硝基丁醯胺、鄰-硝基肉桂醯胺、N-乙醯基甲硫胺酸衍生物、鄰-硝基苯甲醯胺、鄰-(苯甲醯基氧基甲基)苯甲醯胺、4,5-二苯基-3-
Figure 108116317-A0202-12-0021-53
唑啉-2-酮、N-鄰苯二甲醯 亞胺、N-二硫琥珀醯亞胺(Dts)、N-2,3-二苯基馬來醯亞胺、N-2,5-二甲基吡咯、N-1,1,4,4-四甲基二矽基氮雜環戊烷加合物(STABASE)、5-取代的1,3-二甲基-1,3,5-三氮雜環己烷-2-酮、5-取代的1,3-二苄基-1,3,5-三氮雜環己烷-2-酮、1-取代的3,5-二硝基-4-吡啶酮、N-甲基胺、N-烯丙基胺、N-[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基胺(SEM)、N-3-乙醯氧基丙基胺、N-(1-異丙基-4-硝基-2-氧基-3-吡咯啉-3-基)胺、季銨鹽、N-苄基胺、N-二(4-甲氧基苯基)甲基胺、N-5-二苯并環庚胺、N-三苯基甲基胺(Tr)、N-[(4-甲氧基苯基)聯苯基甲基]胺(MMTr)、N-9-苯基第基胺(PhF)、N-2,7-二氯-9-茀基亞甲胺、N-二茂鐵基甲基胺基(Fcm)、N-2-吡啶甲基胺基N'-氧化物、N-1,1-二甲硫基亞甲胺、N-苄基亞甲胺、N-對甲氧基苄基亞甲胺、N-二苯基亞甲胺、N-[(2-吡啶基)三甲苯基]亞甲胺、N-(N',N'-二甲基胺基亞甲基)胺、N,N'-異亞丙二胺、N-對-硝基苄基亞甲胺、N-亞水楊酸基胺、N-5-氯亞水楊酸基胺、N-(5-氯-2-羥基苯基)苯基亞甲胺、N-環己基亞甲胺、N-(5,5-二甲基-3-氧基-1-環己烯基)胺、N-硼烷衍生物、N-二苯基二取代硼酸衍生物、N-[苯基(五羰基鉻-或鎢)羰基]胺、N-銅螯合物、N-鋅螯合物、N-硝胺、N-硝基胺、N-氧化胺、聯苯基膦醯胺(Dpp)、二甲硫基膦醯胺(Mpt)、聯苯基硫代膦醯胺(Ppt)、二烷基胺基磷酸酯、聯苄基胺基磷酸酯、聯苯基胺基磷酸酯、苯次磺醯胺、鄰-硝基苯次磺醯胺(Nps)、2,4-二硝基苯次磺醯胺、五氯苯次磺醯胺、2-硝基-4-甲氧基苯次磺醯胺、三苯基甲基次磺醯胺、3-硝基吡啶次磺醯胺(Npys)、對-甲苯磺醯胺(Ts)、苯磺醯胺、2,3,6,-三甲基-4-甲氧基苯磺醯胺(Mtr)、2,4,6-三甲氧基苯磺醯胺(Mtb)、2,6-二甲基-4-甲氧基苯磺醯胺(Pme)、2,3,5,6-四甲基-4-甲氧基苯磺醯胺(Mte)、4-甲氧基苯磺醯胺(Mbs)、2,4,6-三甲基苯磺醯胺(Mts)、2,6-二甲氧基-4-甲基苯磺醯胺(iMds)、2,2,5,7,8-戊甲基色滿-6-磺醯胺(Pmc)、甲磺醯胺(Ms)、β-三甲基矽基乙磺醯胺(SES)、9-蒽磺醯胺、4-(4',8'-二甲氧 基萘基甲基)苯磺醯胺(DNMBS)、苄基磺醯胺、三氟甲基磺醯胺、和苯醯基磺醯胺。
適當保護的羧酸進一步包括但不限於矽基-、烷基-、烯基-、芳基-、和芳基烷基-保護的羧酸。合適的矽基基團的實例包括三甲基矽基、三乙基矽基、三級丁基二甲基矽基、三級丁基聯苯基矽基、三異丙基矽基等。合適的烷基基團的實例包括甲基、苄基、對甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、三苯甲基、三級丁基、四氫哌喃-2-基。合適的烯基基團的實例包括烯丙基。合適的芳基基團的實例包括視需要取代的苯基、聯苯基、或萘基。合適的芳基烷基基團的實例包括視需要取代的苄基(例如，對甲氧基苄基(MPM)、3,4-二甲氧基苄基、鄰-硝基苄基、對硝基苄基、對鹵代苄基、2,6-二氯苄基、對氰基苄基)、以及2-吡啶甲基和4-吡啶甲基。
合適的羥基保護基團甲基、甲氧基甲基(MOM)、甲基硫代甲基(MTM)、三級丁基硫代甲基、(苯基二甲基矽基)甲氧基甲基(SMOM)、苄氧基甲基(BOM)、對甲氧基苄氧基甲基(PMBM)、(4-甲氧基苯氧基)甲基(對-AOM)、愈創木酚甲基(GUM)、三級丁氧基甲基、4-戊烯基氧基甲基(POM)、矽烷氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、2,2,2-三氯乙氧基甲基、二(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基矽基)乙氧基甲基(SEMOR)、四氫哌喃基(THP)、3-溴四氫哌喃基、四氫噻喃基、1-甲氧基環己基、4-甲氧基四氫哌喃基(MTHP)、4-甲氧基四氫噻喃基、4-甲氧基四氫噻喃基S,S-二氧化物、1-[(2-氯代-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基(CTMP)、1,4-二
Figure 108116317-A0202-12-0023-55
-2-基、四氫呋喃基、四氫噻吩基(tetrahydrothiofuranyl)、2,3,3a,4,5,6,7,7a-八氫-7,8,8-三甲基-4,7-橋亞甲基苯并呋喃-2-基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基-2-氟乙基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基矽基乙基、2-(苯基氫硒基)乙基、三級丁基、烯丙基、對氯苯基、對甲氧基苯基、2,4-二硝基 苯基、苄基、對甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、鄰硝基苄基、對硝基苄基、對鹵代苄基、2,6-二氯苄基、對氰基苄基、對苯基苄基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、3-甲基-2-吡啶甲基N-氧化基、二苯基甲基、p,p'-二硝基二苯甲基、5-二苯并環庚基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基、對甲氧基苯基二苯基甲基、二(對甲氧基苯基)苯基甲基、三(對甲氧基苯基)甲基、4-(4'-溴苯醯基氧基苯基)二苯基甲基、4,4',4"-三(4,5-二氯鄰苯二甲醯亞胺基苯基)甲基、4,4',4"-三(乙醯丙醯基氧基苯基)甲基、4,4',4"-三(苯甲醯基氧基苯基)甲基、3-(咪唑-1-基)二(4',4"-二甲氧基苯基)甲基、1,1-二(4-甲氧基苯基)-1'-芘基甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)噸基、9-(9-苯基-10-側氧基)蒽基、1,3-苯并二硫烷-2-基、苯并異噻唑基S,S-二氧化基、三甲基矽基(TMS)、三乙基矽基(TES)、三異丙基矽基(TIPS)、二甲基異丙基矽基(IPDMS)、二乙基異丙基矽基(DEIPS)、二甲基三級己基(thexyl)矽基、三級丁基二甲基矽基(TBDMS)、三級丁基二苯基矽基(TBDPS)、三苄基矽基、三對二甲苯基矽基、三苯基矽基、二苯基甲基矽基(DPMS)、三級丁基甲氧基苯基矽基(TBMPS)、甲酸酯、苯甲醯甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、對氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-側氧基戊酸酯(乙醯丙酸酯)、4,4-(伸乙基二硫代)戊酸酯(乙醯丙醯基二硫代乙縮醛)、新戊酸酯、金剛酸酯(adamantoate)、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、對苯基苯甲酸酯、2,4,6-三甲基苯甲酸酯(菜酸酯(mesitoate))、烷基甲基碳酸酯、9-茀基甲基碳酸酯(Fmoc)、烷基乙基碳酸酯、烷基2,2,2-三氯乙基碳酸酯(Troc)、2-(三甲基矽基)乙基碳酸酯(TMSEC)、2-(苯基磺醯基)乙基碳酸酯(Psec)、2-(三苯基磷鎓基)乙基碳酸酯(Peoc)、烷基異丁基碳酸酯、烷基乙烯基碳酸酯、烷基烯丙基碳酸酯、烷基對硝基苯基碳酸酯、烷基苄基碳酸酯、烷基對甲氧基苄基碳酸酯、烷基3,4-二甲氧基苄基碳酸酯、烷基鄰硝基苄基碳酸酯、烷基對硝基苄基碳 酸酯、烷基S-苄基硫代碳酸酯、4-乙氧基-1-萘基碳酸酯、二硫代碳酸甲酯、2-碘苯甲酸酯、4-疊氮基丁酸酯、4-硝基-4-甲基戊酸酯、鄰-(二溴甲基)苯甲酸酯、2-甲醯基苯磺酸酯、2-(甲硫基甲氧基)乙基、4-(甲硫基甲氧基)丁酸酯、2-(甲硫基甲氧基甲基)苯甲酸酯、2,6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯、2,6-二氯-4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2,4-二(1,1-二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯二苯基乙酸酯、異丁酸酯、單琥珀酸酯、(E)-2-甲基-2-丁烯酸酯、對-(甲氧基羰基)苯甲酸酯、α-萘甲酸酯、硝酸酯、烷基N,N,N',N'-四甲基二胺基磷酸酯、烷基N-苯基胺基甲酸酯、硼酸酯、二甲基硫膦基、烷基2,4-二硝基苯基次磺酸酯、硫酸酯、甲磺酸酯(methanesulfonate、mesylate)、苄基磺酸酯以及甲苯磺酸酯(Ts)。為了保護1,2-二醇或1,3-二醇，保護基團包括亞甲基縮醛、亞乙基縮醛、1-三級丁基亞乙基縮酮、1-苯基亞乙基縮酮、(4-甲氧基苯基)亞乙基縮醛、2,2,2-三氯亞乙基縮醛、縮丙酮、亞環戊基縮酮、亞環己基縮酮、亞環庚基縮酮、亞苄基縮醛、對-甲氧基亞苄基縮醛、2,4-二甲氧基亞苄基縮酮、3,4-二甲氧基亞苄基縮醛、2-硝基亞苄基縮醛、甲氧基亞甲基縮醛、乙氧基亞甲基縮醛、二甲氧基亞甲基原酸酯、1-甲氧基亞乙基原酸酯、1-乙氧基亞乙基(ethylidine)原酸酯、1,2-二甲氧基亞乙基原酸酯、α-甲氧基亞苄基原酸酯、1-(N,N-二甲基胺基)亞乙基衍生物、α-(N,N'-二甲基胺基)亞苄基衍生物、2-氧雜亞環戊基原酸酯、二-三級丁基亞矽基基團(DTBS)、1,3-(1,1,3,3-四異丙基二矽氧烷亞基)衍生物(TIPDS)、四-三級丁氧基二矽氧烷-1,3-二亞基衍生物(TBDS)、碳酸酯、環硼酸酯、乙基硼酸酯、和苯基硼酸酯。
在一些實施方式中，羥基保護基團係乙醯基、三級丁基、三級丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氫哌喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基矽基乙基、對氯苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、苯甲醯基、對苯基苯甲醯基、2,6-二氯苄基、聯苯基甲基、對硝基苄基、三苯基甲基(三苯甲基)、4,4'-二甲 氧基三苯甲基、三甲基矽基、三乙基矽基、三級丁基二甲基矽基、三級丁基聯苯基矽基、三苯基矽基、三異丙基矽基、苯甲醯基甲酸酯、氯乙醯基、三氯乙醯基、三氟乙醯基、新戊醯、9-茀基甲基碳酸酯、甲磺酸、甲苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基(MMTr)、4,4'-二甲氧基三苯甲基、(DMTr)和4,4',4"-三甲氧基三苯甲基(TMTr)、2-氰基乙基(CE或Cne)、2-(三甲基矽基)乙基(TSE)、2-(2-硝基苯基)乙基、2-(4-氰基苯基)乙基2-(4-硝基苯基)乙基(NPE)、2-(4-硝基苯基磺醯基)乙基、3,5-二氯苯基、2,4-二甲基苯基、2-硝基苯基、4-硝基苯基、2,4,6-三甲基苯基、2-(2-硝基苯基)乙基、丁基硫代羰基、4,4',4"-三(苯甲醯基氧基)三苯甲基、聯苯基胺基甲醯基、乙醯丙醯基(levulinyl)、2-(二溴甲基)苯甲醯基(Dbmb)、2-(異丙基硫代甲氧基甲基)苯甲醯基(Ptmt)、9-苯基氧雜蒽-9-基(苯基呫噸基(pixyl))或9-(對甲氧基苯基)黃嘌呤-9-基(MOX)。在一些實施方式中，每個羥基保護基團獨立地選自乙醯基、苄基、三級丁基二甲基矽基、三級丁基聯苯基矽基、和4,4'-二甲氧基三苯甲基。在一些實施方式中，羥基保護基團選自以下群組，該群組由以下組成：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基和4,4'-二甲氧基三苯甲基基團。
在一些實施方式中，磷保護基團係在整個寡核苷酸合成中與核苷酸間磷鍵附接的基團。在一些實施方式中，磷保護基團與核苷酸間硫代磷酸酯鍵的硫原子附接。在一些實施方式中，磷保護基團與核苷酸間硫代磷酸酯鍵的氧原子附接。在一些實施方式中，磷保護基團與核苷酸間磷酸酯鍵的氧原子附接。在一些實施方式中，磷保護基團係2-氰基乙基(CE或Cne)、2-三甲基矽基乙基、2-硝基乙基、2-磺醯基乙基、甲基、苄基、鄰硝基苄基、2-(對硝基苯基)乙基(NPE或Npe)、2-苯基乙基、3-(N-三級丁基甲醯胺基)-1-丙基、4-側氧基戊基、4-甲硫基-1-丁基、2-氰基-1,1-二甲基乙基、4-N-甲基胺基丁基、3-(2-吡啶基)-1-丙基、2- [N-甲基-N-(2-吡啶基)]胺基乙基、2-(N-甲醯，N-甲基)胺基乙基、4-[N-甲基-N-(2,2,2-三氟乙醯基)胺基]丁基。
蛋白質：如本文所用，術語「蛋白質」係指多肽(即，藉由肽鍵彼此連接的至少兩個胺基酸的串)。在一些實施方式中，蛋白質僅包括天然存在的胺基酸。在一些實施方式中，蛋白質包括一個或多個非天然存在的胺基酸(例如，與相鄰的胺基酸形成一個或多個肽鍵的部分)。在一些實施方式中，蛋白質鏈中的一個或多個殘基含有非胺基酸部分(例如，聚糖等)。在一些實施方式中，蛋白質包括多於一條個多肽鏈，例如一個或多個二硫鍵連接或藉由其他方式締結。在一些實施方式中，蛋白質含有l-胺基酸、d-胺基酸、或兩者；在一些實施方式中，蛋白質含有一個或多個胺基酸修飾或本領域已知的類似物。有用的修飾包括，例如，末端乙醯化、醯胺化、甲基化等。術語「肽」通常用於係指具有小於約100個胺基酸、小於約50個胺基酸、小於20個胺基酸、或小於10個胺基酸的長度的多肽。
受試者：如本文所用，術語「受試者」或「測試受試者」係指任何生物，向該生物中依照本揭露給予提供的化合物或組成物，例如，用於實驗、診斷、預防和/或治療目的。典型的受試者包括動物(例如，哺乳動物，如小鼠、大鼠、兔、非人靈長動物、和人；昆蟲；蠕蟲；等)和植物。在一些實施方式中，受試者可能患有和/或易患疾病、障礙、和/或病症(例如，肌肉營養不良)。
基本上：如在此所使用，術語「基本上」係指展示出一個所感興趣的特徵或特性的總體的或接近總體的範圍或程度的定性的狀態。熟悉該項技術者應當理解的是生物學以及化學現象很少(如果有的話)會達到完成和/或進行到完成或實現或避免一個絕對的結果。因此，術語「基本上」被用在此處用來獲得在許多生物學和/或化學現象中潛在地缺少的內在的完全性。
患有：「患有」疾病、障礙、和/或病症的個體(例如，肌肉萎縮症)已經診斷為和/或顯示出疾病、障礙、和/或病症(例如，肌肉萎縮症)的一種或多種症狀。
易患：「易患」疾病、障礙、和/或病症(例如，肌肉營養不良)的個體係比一般公眾成員具有更高的發展疾病、障礙、和/或病症的風險的個體。在一些實施方式中，易患疾病、障礙、和/或病症(例如，肌肉營養不良)的個體可以未被診斷患有疾病、障礙、和/或病症。在一些實施方式中，易患疾病、障礙、和/或病症(例如，肌肉營養不良)的個體可以展示出疾病、障礙、和/或病症的症狀。在一些實施方式中，易患疾病、障礙、和/或病症(例如，肌肉營養不良)的個體可以不展示出疾病、障礙、和/或病症的症狀。在一些實施方式中，易患疾病、障礙、和/或病症(例如，肌肉營養不良)的個體將會發展疾病、障礙、和/或病症。在一些實施方式中，易患疾病、障礙、和/或病症(例如，肌肉營養不良)的個體將不會發展疾病、障礙、和/或病症。
全身：如本文所用，短語「全身給藥」、「全身地給藥」、「外周給藥」、和「外周地給藥」具有本領域理解的含義，係指給予化合物或組成物使其進入受體的系統。
互變異構形式：本文所用和本領域通常理解的短語「互變異構形式」用於描述能夠容易地相互轉化的有機化合物的不同異構形式。互變異構物的特徵可在於氫原子或質子的形式遷移，伴隨著單鍵和相鄰雙鍵的轉換。在一些實施方式中，互變異構物可以由質子互變異構物(即，質子的重新定位)產生。在一些實施方式中，互變異構物可以由價態互變(即，成鍵電子的快速重組)產生。所有此類互變異構形式旨在包括在本揭露的範圍內。在一些實施方式中，化合物的互變異構形式彼此以移動平衡存在，因此製備單獨物質的嘗試導致形成混合物。在一些實施方式中，化合物的互變異構形式係可分離和可離析的化合物。在 本揭露的一些實施方式中，可以提供化學組成物，其係(或者包括)化合物的單個互變異構形式的純的配製物。在本揭露的一些實施方式中，可以是提供作為化合物的兩個或更多個互變異構形式的混合物的化學組成物。在某些實施方式中，此類混合物含有等量的不同的互變異構形式；在某些實施方式中，此類混合物含有不同量的化合物的至少兩個不同的互變異構形式。在本揭露的一些實施方式中，化學組成物可以含有化合物的所有互變異構形式。在本揭露的一些實施方式中，化學組成物可以含有化合物的少於所有互變異構形式。在本揭露的一些實施方式中，化學組成物可以含有化合物的一個或多個互變異構形式，因為互變現象其量隨著時間的推移而變化。在本揭露的一些實施方式中，互變異構物係酮-烯醇互變異構物。化學領域的技術人員將認識到，可以使用化學領域中已知的任何合適的試劑「捕獲」(即，化學改性以使其保持「烯醇」形式)酮-烯醇互變異構物，以提供烯醇衍生物，其隨後可以使用本領域已知的一種或多種合適的技術分離。除非另有說明，否則本揭露涵蓋相關化合物的所有互變異構形式，無論是純的形式還是彼此的混合物。
治療劑：如本文所用，短語「治療劑」係指當給予受試者時具有治療效果和/或引發所希望的生物學和/或藥理效果的藥劑。在一些實施方式中，治療劑係任何物質，該物質可用於緩解、改善、減輕、抑制、預防、延遲疾病、障礙、和/或病症(例如，肌肉營養不良)的一個或多個症狀或特徵的發作，降低疾病、障礙、和/或病症(例如，肌肉營養不良)的一個或多個症狀或特徵的嚴重性，和/或降低疾病、障礙、和/或病症(例如，肌肉營養不良)的一個或多個症狀或特徵的發生率。
治療有效量：如本文所用，術語「治療有效量」意指當作為治療方案的一部分給予時引發所希望的生物反應的物質(例如，治療劑、組成物和/或配製物)的量。在一些實施方式中，治療有效量物質係當給予患有或易患疾病、 障礙、和/或病症(例如，肌肉營養不良)的受試者時，足以治療、診斷、預防、和/或延遲疾病、障礙、和/或病症的發作的量。如熟悉該項技術者將理解，物質的有效量可取決於以下這類因素變化：如所希望的生物學終點、待遞送的物質、靶細胞或組織等。例如，用於治療疾病、障礙、和/或病症(例如，肌肉營養不良)的配製物中化合物的有效量係緩解、改善、減輕、抑制、預防、延遲疾病、障礙、和/或病症的一種或多種症狀或特徵的發作，降低疾病、障礙、和/或病症的一種或多種症狀或特徵的嚴重程度，和/或降低疾病、障礙、和/或病症的一種或多種症狀或特徵的發病率的量。在一些實施方式中，以單個劑量給予治療有效量；在一些實施方式中，利用多個單位劑量以遞送治療有效量。
治療：如本文所用，術語「治療(treat、treatment、或treating)」係指用於部分地或完全緩解、改善、減輕、抑制、預防、延遲疾病、障礙、和/或病症(例如，肌肉營養不良)的一種或多種症狀或特徵的發作，降低疾病、障礙、和/或病症(例如，肌肉營養不良)的一種或多種症狀或特徵的嚴重程度，和/或降低疾病、障礙、和/或病症(例如，肌肉營養不良)的一種或多種症狀或特徵的發病率的方法。治療可以是給予未展示出疾病、障礙、和/或病症(例如，肌肉營養不良)的跡象的受試者。在一些實施方式中，治療可以給予僅表現出疾病、障礙、和/或病症的早期跡象的受試者，例如出於降低與疾病、障礙、和/或病症相關的病理學風險的目的。
單位劑量：如本文所用，表述「單位劑量」係指作為單個劑量和/或以藥物組成物的物理離散單位給藥的量。在很多實施方式中，單位劑量含有預定量的活性劑。在一些實施方式中，單位劑量含有整個單劑量的藥劑。在一些實施方式中，給予多於一個單位劑量以實現總單個劑量。在一些實施方式中，需要或預期需要給予多個單位劑量，以實現預期的效果。單位劑量可以是，例如，含有預定量的一種或多種治療劑、預定量的以固體形式的一種或多種治療劑的 一定體積的液體(例如，可接受的載體)，含有預定量的一種或多種治療劑等的持續釋放配製物或藥物遞送裝置。應當理解，除了一種或多種治療劑之外，單位劑量可以存在於包括任何各種組分的配製物中。例如，如下文所述，可包括可接受的載體(例如，藥學上可接受的載體)、稀釋劑、穩定劑、緩衝劑、防腐劑等。熟悉該項技術者將理解，在很多實施方式中，特定的治療劑的總適當日劑量可包含一部分或多個單位劑量，並且可由例如在健全的醫學判斷範圍內的主治醫師決定。在一些實施方式中，對於任何特定患者或生物的特定的有效劑量水平將取決於多種因素，該等因素包括正在治療的障礙和障礙的嚴重程度；所採用的特定的活性化合物的活性；所採用的特定的組成物；受試者的年齡、體重、總體健康、性別和飲食；給藥時間，和所採用的特定的活性化合物的排泄率；治療的持續時間；與所採用的特定化合物組合或巧合採用的其他藥物和/或療法，以及醫學領域中熟知的相似因素。
不飽和的：如本文所用，術語「不飽和的」意指具有一個或多個不飽和單元的部分。
野生型：如本文所用，術語「野生型」係指具有其本領域理解的含義，其係指具有在「正常」(與突變體，患病，改變等對比)狀態或背景中在自然界中發現的結構和/或活性的實體。熟悉該項技術者將理解，野生型基因和多肽通常以多種不同形式(例如，等位基因)存在。
核酸：術語「核酸」包括任何核苷酸、其類似物、和其聚合物。如本文所用，術語「多核苷酸」係指任何長度的核苷酸(核糖核苷酸(RNA)或去氧核糖核苷酸(DNA)或其類似物)的聚合形式。該等術語係指分子的一級結構，並且包括雙股DNA和單股DNA、以及雙鏈RNA和單鏈RNA。該等術語包括作為RNA或DNA的等效物、類似物，其由核苷酸類似物和修飾的多核苷酸(例如但不限於甲基化、保護和/或加帽的核苷酸或多核苷酸)製成。該等術語涵蓋 多核糖核苷酸(RNA)或寡核糖核苷酸(RNA)和多核寡去氧核糖核苷酸(DNA)或寡去氧核糖核苷酸(DNA)；衍生自核苷鹼基和/或修飾的核鹼基的N-糖苷或C-糖苷的RNA或DNA；衍生自糖和/或修飾的糖的核酸；和衍生自磷酸橋和/或修飾的磷-原子橋的核酸(在本文中也稱為「核苷酸間鍵」)。該術語涵蓋含有核鹼基、修飾的核鹼基、糖、修飾的糖、天然的天然磷酸核苷酸間鍵或非天然核苷酸間鍵的任何組合的核酸。實例包括但不限於含有核糖部分的核酸、含有去氧核糖部分的核酸、含有核糖和去氧核糖兩者部分的核酸、含有核糖和修飾核糖部分的核酸。除非另有說明，否則前綴「多(poly-)」係指含有2至約10,000個核苷酸單體單元的核酸，並且其中前綴「寡(oligo-)」係指含有2至約200個核苷酸單體單元的核酸。
核苷酸：如本文所用，術語「核苷酸」係指多核苷酸的單體單元，其由雜環鹼基、糖、和一個或多個磷酸基團、或含磷的核苷酸間鍵組成。天然存在的鹼基(鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、和尿嘧啶(U))係嘌呤或嘧啶的衍生物，但應該理解為還包括天然地和非天然存在的鹼基類似物。天然存在的糖包括戊糖(五碳糖)去氧核糖(發現於天然DNA中)或核糖(發現於天然RNA中)，但應理解為還包括天然和非天然存在的糖類似物，如具有2'-修飾的糖、鎖核酸(LNA)中的糖、和磷二醯胺
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啉代寡聚物(phosphorodiamidate morpholino oligomer，PMO)。將核苷酸經由核苷酸間鍵進行連接以形成核酸、或多核苷酸。許多核苷酸間鍵係本領域已知的(如，但不限於天然磷酸酯鍵、硫代磷酸酯鍵、硼烷磷酸酯鍵等)。人工核酸包括PNA(肽核酸)、磷酸三酯、硫代磷酸酯、H-膦酸酯、胺基磷酸酯、硼烷磷酸酯、甲基膦酸酯、膦醯基乙酸酯(phosphonoacetate)、硫代膦醯基乙酸酯、及天然核酸的磷酸酯骨架其他變體等。在一些實施方式中，核苷酸係包含天然存在的核鹼基、天然 存在的糖、和天然磷酸酯鍵的天然核苷酸。在一些實施方式中，核苷酸係修飾的核苷酸或核苷酸類似物，其係可用於代替天然核苷酸的結構類似物。
修飾的核苷酸：術語「修飾的核苷酸」包括在結構上與天然核苷酸不同但能執行天然核苷酸的至少一種功能的任何化學部分。在一些實施方式中，修飾的核苷酸包含在糖、鹼基和/或核苷酸間鍵處的修飾。在一些實施方式中，修飾的核苷酸包含修飾的糖、修飾的核鹼基、和/或修飾的核苷酸間鍵。在一些實施方式中，修飾的核苷酸能夠具有核苷酸的至少一種功能，例如，在能夠與包含至少互補鹼基序列的核酸鹼基配對的聚合物中形成亞基。
類似物：術語「類似物」包括在結構上與參考化學部分或部分類別不同但能執行此類參考化學部分或部分類別的至少一種功能的任何化學部分。作為非限制性實例，核苷酸類似物在結構上與核苷酸不同，但能執行核苷酸的至少一種功能；核鹼基類似物在結構上與核鹼基不同，但能執行核鹼基的至少一種功能；糖類似物在結構上與核鹼基不同，但能執行糖的至少一種功能等。
核苷：術語「核苷」係指其中核鹼基或修飾的核鹼基與糖或修飾的糖共價結合的部分。
修飾的核苷：術語「修飾的核苷」係指與天然核苷在化學上不同的，但能執行核苷的至少一種功能的化學部分。在一些實施方式中，衍生自天然核苷或與天然核苷在化學上相似，但其包含使其與天然核苷有區別的化學修飾。修飾的核苷的非限制性實例包括在鹼基和/或糖上包含修飾的那些。修飾的核苷的非限制性實例包括在糖上具有2'-修飾的那些。修飾的核苷的非限制性實例還包括無鹼基核苷(其缺乏核鹼基)。在一些實施方式中，修飾的核苷能夠具有核苷的至少一種功能，例如，在能夠與包含至少互補鹼基序列的核酸鹼基配對的聚合物中形成部分。
核苷類似物：術語「核苷類似物」係指與天然核苷在化學上不同的，但能執行核苷的至少一種功能的化學部分。在一些實施方式中，核苷類似物包含糖的類似物和/或核鹼基的類似物。在一些實施方式中，修飾的核苷能夠具有核苷的至少一種功能，例如，在能夠與包含互補鹼基序列的核酸鹼基配對的聚合物中形成部分。
糖：術語「糖」係指以封閉和/或開放形式的單糖或多糖。在一些實施方式中，糖係單糖。在一些實施方式中，糖係多糖。糖包括但不限於核糖、去氧核糖、戊呋喃糖、戊哌喃糖、和己哌喃糖部分。如本文所用，術語「糖」還涵蓋用於代替常規糖分子的結構類似物，如例如乙二醇、形成核酸類似物的骨架的聚合物、乙二醇核酸(「GNA」)等。如本文所用，術語「糖」還涵蓋用於代替天然的核苷酸或天然存在的核苷酸的結構類似物，如，修飾的糖和核苷酸糖。在一些實施方式中，糖係D-2-去氧核糖。在一些實施方式中，糖係β-D-去氧呋喃核糖。在一些實施方式中，糖部分係β-D-去氧呋喃核糖部分。在一些實施方式中，糖係D-核糖。在一些實施方式中，糖係β-D-呋喃核糖。在一些實施方式中，糖部分係β-D-呋喃核糖部分。在一些實施方式中，糖係視需要取代的β-D-去氧呋喃核糖或β-D-呋喃核糖。在一些實施方式中，糖部分係視需要取代的β-D-去氧呋喃核糖或β-D-呋喃核糖部分。在一些實施方式中，寡核苷酸(例如，DMD寡核苷酸、核酸等)中的糖部分/單元係包含各自獨立地與核苷酸間鍵連接的一個或多個碳原子的糖，例如，視需要取代的β-D-去氧呋喃核糖或β-D-呋喃核糖，該等糖5'-C和/或3'-C各自獨立地與核苷酸間鍵(例如，天然磷酸酯鍵、修飾的核苷酸間鍵、手性受控的核苷酸間鍵等)連接。
修飾的糖：術語「修飾的糖」係指可以替換糖的部分。修飾的糖模仿糖的空間排列、電子特性、或一些其他物理化學特性。在一些實施方式中，修飾的糖係取代的β-D-去氧呋喃核糖或β-D-呋喃核糖。在一些實施方式中，修飾 的糖包含2'-修飾。在一些實施方式中，修飾的糖包含與兩個糖碳原子(例如，C2和C4)連結的接頭(例如，視需要取代的二價雜脂肪族)，例如，發現於LNA中。在一些實施方式中，接頭係-O-CH(R)-，其中R係如在本揭露中所述的。在一些實施方式中，接頭係-O-CH(R)-，其中O與C2連接，並且-CH(R)-與糖的C4連接，並且R係如在本揭露中所述的。在一些實施方式中，R係甲基。在一些實施方式中，R係-H。在一些實施方式中，-CH(R)-係S構型。在一些實施方式中，-CH(R)-係R構型。
核鹼基：術語「核鹼基」係指參與氫鍵的核酸部分，其以序列特異性方式將一條核酸股與另一條互補股結合。最常見的天然存在的核鹼基係腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)、和胸腺嘧啶(T)。在一些實施方式中，修飾的核鹼基係取代的核鹼基，其核鹼基選自A、T、C、G、U、及其互變異構物。在一些實施方式中，天然存在的核鹼基係修飾的腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、或胸腺嘧啶。在一些實施方式中，天然存在的核鹼基係甲基化的腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、或胸腺嘧啶。在一些實施方式中，核鹼基係「修飾的核鹼基」，例如，除腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)、和胸腺嘧啶(T)之外的核鹼基。在一些實施方式中，修飾的核鹼基係甲基化的腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、或胸腺嘧啶。在一些實施方式中，修飾的核鹼基模擬核鹼基的空間排列、電子特性或一些其他物理化學特性，並保留以序列特異性方式將一條核酸股結合到另一條核酸股的氫鍵的特性。在一些實施方式中，修飾的核鹼基可與所有五種天然存在的鹼基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、或鳥嘌呤)配對，而基本上不影響熔解行為、藉由細胞內酶識別、或寡核苷酸雙鏈體的活性。如本文所用，術語「核鹼基」還涵蓋用於代替天然的核苷酸或天然存在的核苷酸的結構類似物，如修飾的核鹼基和核鹼基 類似物。在一些實施方式中，核鹼基係視需要取代的A、T、C、G、或U、或者取代的核鹼基，該核鹼基選自A、T、C、G、或U、及其互變異構物。
修飾的核鹼基：術語「修飾的核鹼基」、「修飾的鹼基」等係指與核鹼基化學上不同的，但是能執行核鹼基的至少一種功能的化學部分。在一些實施方式中，修飾的核鹼基係包含修飾的核鹼基。在一些實施方式中，修飾的核鹼基能夠具有核鹼基的至少一種功能，例如，在能夠與包含至少互補鹼基序列的核酸鹼基配對的聚合物中形成部分。在一些實施方式中，修飾的核鹼基係取代的核鹼基，其核鹼基選自A、T、C、G、U、及其互變異構物。
手性配位基：術語「手性配位基」或「手性助劑」係指為手性的部分並且可以結合到反應中，使得反應能以某些立體選擇性進行。在一些實施方式中，術語還可以是指包含此類部分的化合物。
阻斷基團：術語「阻斷基團」係指掩蔽官能基反應性的基團。隨後可以藉由去除阻斷基團來掩蔽官能基。在一些實施方式中，阻斷基團係保護基團。
部分：術語「部分」係指分子的特定的區段或官能基。化學部分通常是嵌入或附加於分子的公認的化學實體。在一些實施方式中，化合物的部分係藉由從化合物中去除一個或多個-H和/或其等效物而由化合物形成的一價、二價或多價基團。在一些實施方式中，取決於其上下文，「部分」還可以指化合物或實體，從該化合物或實體衍生出部分。
固體支持物：當核酸、寡核苷酸、或其他化合物的製劑的上下文中使用時，術語「固體支持物」係指能夠合成核酸、寡核苷酸、或其他化合物的任何支持物。在一些實施方式中，該術語係指玻璃或聚合物，其在合成核酸中進行的反應步驟中採用的介質中不溶，並且衍生化以包含反應性基團。在一些實施方式中，固體支持物係高度交聯的聚苯乙烯(HCP)或可控孔徑玻璃(CPG)。 在一些實施方式中，固體支持物係可控孔徑玻璃(CPG)。在一些實施方式中，固體支持物係可控孔徑玻璃(CPG)和高度交聯的聚苯乙烯(HCP)的混合支持物。
讀框：術語「讀框」係指雙股的DNA分子的六個可能的讀框之一，每個方向三個。用於確定哪些密碼子用於編碼胺基酸的讀框在DNA分子編碼序列內。
反義：如本文所用，「反義」核酸分子包含核苷酸序列，其與編碼蛋白質的「有義」核酸互補，例如與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補、與mRNA序列互補或與基因的編碼鏈互補。因此，反義核酸分子可以經由氫與有義核酸分子鍵合。在一些實施方式中，可以從兩條股產生轉錄物(例如，DMD轉錄物)。在一些實施方式中，轉錄物可以編碼或可以不編碼蛋白質產物。在一些實施方式中，當針對或靶向特定的核酸序列時，「反義」序列可以是指與特定的核酸序列互補的序列。
寡核苷：術語「寡核苷酸」係指核苷酸單體的聚合物或低聚物，該核苷酸單體含有核鹼基、修飾的核鹼基、糖、修飾的糖、天然磷酸酯鍵、或非天然核苷酸間鍵的任何組合。
本揭露的寡核苷可具有各種長度。在特定的實施方式中，寡核苷的長度的範圍可以從約20至約200個核苷。在多個相關實施方式中，(單股的、雙股的、和三股的)寡核苷的長度範圍可以從約4至約10個核苷、從約10至約50個核苷、從約20至約50個核苷、從約15至約30個核苷、從約20至約30個核苷。在一些實施方式中，寡核苷的長度係從約9至約39個核苷。在一些實施方式中，寡核苷的長度係至少15個核苷。在一些實施方式中，寡核苷的長度係至少20個核苷。在一些實施方式中，寡核苷的長度係至少25個核苷。在一些實施方式中，寡核苷的長度係至少30個核苷。在一些實施方式中，寡核苷係長度為至少18個核苷 的互補股的雙股體。在一些實施方式中，寡核苷係長度為至少21個核苷的互補股的雙股體。在一些實施方式中，出於寡核苷長度的目的，獨立計數的每個核苷包含選自A、T、C、G、U及其互變異構物的視需要取代的核鹼基。
核苷酸間鍵：如本文所用，短語「核苷酸間鍵」通常是指核酸的或者寡核苷酸的核苷酸單元之間的鍵(通常含磷的鍵)，並且與如上文和在此使用的「糖間鍵」、「核苷間鍵」、和「磷原子橋」可互換地使用。如熟悉該項技術者所理解的，天然DNA和RNA含有天然磷酸酯鍵。在一些實施方式中，核苷酸間鍵係天然磷酸酯鍵(-OP(O)(OH)O-，在pH例如，約7.4以其陰離子形式-OP(O)(O-)O-存在)，如在天然存在的DNA和RNA分子中發現的。在一些實施方式中，核苷酸間鍵係修飾的核苷酸間鍵(或非天然核苷酸間鍵)，其與天然磷酸酯鍵結構上不同，但可以用於替換天然磷酸酯鍵，例如，硫代磷酸酯核苷酸間鍵、PMO鍵等。在一些實施方式中，核苷酸間鍵係修飾的核苷酸間鍵，其中天然磷酸二酯鍵的一個或多個氧原子獨立地被一個或多個有機或無機部分替換。在一些實施方式中，這種有機或無機部分係選自但不限於=S、=Se、=NR'、-SR'、-SeR'、-N(R')2、B(R')3、-S-、-Se-、和-N(R')-，其中每個R'獨立地如下文所定義和描述的。 在一些實施方式中，核苷酸間鍵係磷酸三酯鍵。在一些實施方式中，核苷酸間鍵 係硫代磷酸酯二酯鍵(硫代磷酸酯核苷酸間鍵(
Figure 108116317-A0202-12-0038-2
)，通常以其陰離子 形式-OP(O)(S-)O-於pH例如約7.4存在)。熟悉該項技術者理解，由於鍵中存在酸或鹼部分，核苷酸間鍵可以在給定pH下作為陰離子或陽離子存在。
除非另有說明，否則寡核苷酸序列之前的Rp/Sp標記描述了在手性受控的核苷酸間鍵(寡核苷酸序列的按順序從5'至3')中的連接磷的構型。
寡核苷類型：如本文所用，短語「寡核苷類型」用於定義具有以下的寡核苷酸：特定鹼基序列、骨架連接的模式(即，核苷酸間鍵類型(例如， 天然磷酸酯鍵、硫代磷酸酯核苷酸間鍵、帶負電荷的核苷酸間鍵、中性核苷酸間鍵等)的模式)、骨架手性中心的模式(即，連接磷立體化學(Rp/Sp)的模式)、和骨架磷修飾的模式。在一些實施方式中，共同指定的「類型」的寡核苷酸彼此在結構上相同。
熟悉該項技術者將理解，本揭露的合成的方法在合成寡核苷酸(例如，DMD寡核苷酸)股期間提供一定程度的控制，使得可以預先前設計和/或選擇寡核苷酸股的每個核苷酸單元以在連接磷處具有特定的立體化學和/或在連接磷處具有特定的修飾、和/或特定的鹼基、和/或特定的糖。在一些實施方式中，預先設計和/或選擇寡核苷酸股以在連接磷處具有立體中心的特定組合。在一些實施方式中，設計和/或確定寡核苷酸股以在連接磷處具有修飾的特定組合。在一些實施方式中，設計和/或選擇寡核苷酸股以具有鹼基的特定組合。在一些實施方式中，設計和/或選擇寡核苷酸股以具有一個或多個以上結構特徵的特定組合。本揭露提供了包含多個寡核苷酸分子(例如，手性受控的寡核苷酸組成物)或由其組成的組成物。在一些實施方式中，所有此類分子係相同的類型。在一些實施方式中，所有此類分子彼此在結構上相同。在一些實施方式中，提供的組成物包含不同類型的多個寡核苷酸，通常以預定的(非隨機)相對量。在一些實施方式中，寡核苷酸係如本文所述的DMD寡核苷酸。
手性控制：如本文所用，「手性控制」係指控制寡核苷酸(例如，DMD寡核苷酸)內的手性核苷酸間鍵中的手性連接磷的立體化學名稱。在一些實施方式中，藉由寡核苷酸的糖和鹼基部分中不存在的手性元件實現對照，例如，在一些實施方式中，藉由在寡核苷酸製備期間使用一種或多種手性助劑實現對照，如在本揭露中例示，手性助劑通常是寡核苷酸製備過程中使用的手性亞磷醯胺的一部分。與手性控制相反，熟悉該項技術者認識到，如果使用常規寡核苷酸合成來形成手性核苷酸間鍵，則不使用手性助劑的此類常規寡核苷酸合成不 能控制手性核苷酸間鍵的立體化學。在一些實施方式中，控制了寡核苷酸內手性核苷酸間鍵中每個手性連接磷的立體化學名稱。
手性受控的寡核苷酸組成物：如本文所用，術語「手性受控的(立體控制的或立體定義的)寡核苷酸組成物」、「手性受控的(立體控制的或立體定義的)核酸組成物」等係指包含多個寡核苷酸(或核酸、手性受控的寡核苷酸或手性受控的核酸)的組成物，該等寡核苷酸具有1)共同的鹼基序列、2)共同的骨架連接的模式；3)共同的骨架手性中心的模式、和4)共同的骨架磷修飾模式(特定類型的寡核苷酸)，其中多個寡核苷酸(或核酸)在一個或多個手性核苷酸間鍵(手性受控的核苷酸間鍵，其的手性連接磷係Rp或Sp，而不是作為非手性受控的核苷酸間鍵的隨機的Rp和Sp混合物)處具有相同的立體化學。手性受控的寡核苷酸組成物中多種寡核苷酸(或核酸)的水平係非隨機的(預先確定的、受控制的)。手性受控的寡核苷酸組成物通常藉由手性受控的寡核苷酸製劑進行製備，以立體選擇性地形成一個或多個手性核苷酸間鍵(例如，使用本揭露中例示的手性助劑，與非手性受控的(立體隨機、非立體選擇性、外消旋)寡核苷酸合成(如，使用非手性助劑或手性催化劑的傳統的基於亞磷醯胺的寡核苷酸合成)相比以有目的地控制立體選擇性)。相對於具有共同的鹼基序列、共同的骨架連接的模式、和共同的骨架磷修飾模式的寡核苷酸的基本上外消旋的製劑，對於多個寡核苷酸，手性受控的寡核苷酸組成物的是富含的。在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物包含多種由下式定義的特定寡核苷酸類型的寡核苷酸：1)鹼基序列；2)骨架連接的模式；3)骨架手性中心的模式；以及4)骨架磷修飾的模式，其中相對於具有相同的鹼基序列、骨架連接的模式、和骨架磷修飾的模式的寡核苷酸的基本上外消旋的製劑，該手性受控的寡核苷酸組成物富含特定寡核苷酸類型的寡核苷酸。如熟悉該項技術者容易理解的，這種富集的特徵在於：與基本上外消旋的製劑相比，在每個手性受控的核苷酸間鍵處，較高 水平的連接磷具有所希望的構型。在一些實施方式中，每個手性受控的核苷酸間鍵關於其手性連接磷獨立地具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的非鏡像異構純度(diastereopurity)。在一些實施方式中，各自獨立地具有至少90%的非鏡像異構純度。在一些實施方式中，各自獨立地具有至少95%的非鏡像異構純度。在一些實施方式中，各自獨立地具有至少97%的非鏡像異構純度。在一些實施方式中，各自獨立地具有至少98%的非鏡像異構純度。在一些實施方式中，多個寡核苷酸具有相同的組成。在一些實施方式中，多個寡核苷酸具有相同的組成和立體化學，並且在結構上相同。
在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物中的多個寡核苷酸具有相同的鹼基序列，如果有的話，相同的核鹼基、糖、和核苷酸間鍵修飾，以及獨立地在一個或多個手性受控的核苷酸間鍵的連接磷手性中心處的相同的立體化學(Rp或Sp)，儘管某些連接磷手性中心的立體化學可以不同。在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物中的所有寡核苷酸的約0.1%-100%，(例如，約1%-100%、5%-100%、10%-100%、20%-100%、30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%、80%-100%、90%-100%、95%-100%、50%-90%、或約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)係多個寡核苷酸。在一些實施方式中，在具有共同的鹼基序列的手性受控的寡核苷酸組成物中的所有寡核苷酸的約0.1%-100%，(例如，約1%-100%、5%-100%、10%-100%、20%-100%、30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%、80%-100%、90%-100%、95%-100%、50%-90%、或約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或至少5%、 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)係多個寡核苷酸。在一些實施方式中，在具有共同的鹼基序列、共同的骨架連接模式、和共同的骨架磷修的模式的手性受控的寡核苷酸組成物中的所有寡核苷酸的約0.1%-100%，(例如，約1%-100%、5%-100%、10%-100%、20%-100%、30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%、80%-100%、90%-100%、95%-100%、50%-90%、或約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)係多個寡核苷酸。在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物中的所有寡核苷酸的，或在具有共同的鹼基序列的組成物中的所有寡核苷酸(例如，多個寡核苷酸或寡核苷酸類型)的，或在具有共同的鹼基序列、共同的骨架連接模式、和共同的骨架磷修飾模式的組成物中的所有寡核苷酸(例如，多個寡核苷酸或寡核苷酸類型)的，或在具有共同的鹼基序列、共同的鹼基修飾模式、共同的糖修飾模式、共同的核苷酸間鍵類型模式、和/或共同的核苷酸間鍵修飾模式生物組成物中的所有寡核苷酸(例如，多個寡核苷酸或寡核苷酸類型)的，或在具有相同的組成的組成物中的所有寡核苷酸的約0.1%-100%，(例如，約1%-100%、5%-100%、10%-100%、20%-100%、30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%、80%-100%、90%-100%、95%-100%、50%-90%、或約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)係多個寡核苷酸。在一些實施方式中，百分比係至少(DP)NCI，其中DP係選自85%-100%的百分比，並且NCI係手性受控的核苷酸間鍵的數量。 在一些實施方式中，DP係至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%。在一些實施方式中，DP係至少85%。在一些實施方式中，DP係至少90%。在一些實施方式中，DP係至少95%。在一些實施方式中，DP係至少96%。在一些實施方式中，DP係至少97%。在一些實施方式中，DP係至少98%。在一些實施方式中，DP係至少99%。在一些實施方式中，DP反映了連接磷手性中心手性受控的核苷酸間鍵的非鏡像異構純度。在一些實施方式中，可以通常使用包含這種核苷間鍵和適當的二聚體(被核苷間鍵連接的兩個核苷單元)來評估核苷間鍵的連接磷手性中心的非鏡像異構純度。在一些實施方式中，多個寡核苷酸約1-50個(例如，約1-10、1-20、5-10、5-20、10-15、10-20、10-25、10-30、或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20、或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個)手性核苷酸間鍵具有相同的立體化學。在一些實施方式中，多個寡核苷酸在約0.1%-100%(例如，約1%-100%、5%-100%、10%-100%、20%-100%、30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%、80%-100%、90%-100%、95%-100%、50%-90%、約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%、或至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或99%)的手性核苷酸間鍵具有相同的立體化學。在一些實施方式中，每個手性核苷酸間鍵係手性受控制的核苷酸間鍵，並且組成物係完全手性受控的寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，不是所有手性核苷酸間鍵都是手性受控制的核苷酸間鍵，並且組成物係部分地手性受控的寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物包含預定水平的單個寡核苷酸或核酸類型。例如，在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物包含在預定水平的(例如，如上文描述的)一個寡核苷酸類型。 在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物包含超過一個寡核苷酸類型，各自獨立地在預定水平。在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物包含多個寡核苷酸類型，各自獨立地在預定水平。在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物係寡核苷酸類型的寡核苷酸的組成物，該組成物包含預定水平的寡核苷酸類型的多個寡核苷酸。在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物係包含多種DMD寡核苷酸的手性受控的DMD寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物係DMD寡核苷酸類型的寡核苷酸的組成物。
手性純：如本文所用，短語「手性純」用於描述寡核苷酸或其組成物，其中全部或幾乎所有的寡核苷酸分子(其餘為雜質)相對於連接磷原子以單個非鏡像異構形式存在。在很多實施方式中，如熟悉該項技術者所理解的，手性純寡核苷酸組成物基本上係純的，因為組成物中基本上所有寡核苷酸在結構上相同(係相同的立體異構物)。
連接磷：如本文所定義，短語「連接磷」用於指示所提及的特定磷原子係核苷酸間鍵中存在的磷原子，該磷原子對應於天然磷酸酯鍵的磷原子，如在天然存在DNA和RNA中存在。在一些實施方式中，連接磷原子在修飾的核苷酸間鍵中。在一些實施方式中，連接磷原子係手性的。
出於本揭露的目的，化學元素係根據元素週期表(Periodic Table of the Elements)，CAS版本，Handbook of Chemistry and Physics[化學與物理手冊]，第67版，1986-87，內封面來鑒別。
除非另有說明，否則包括化合物(例如，DMD寡核苷酸、藥劑等)的鹽(如，藥學上可接受的酸或鹼加成鹽)、立體異構形式、和互變異構形式。除非另有說明，否則單數形式「一個(a)」、「一種(an)」以及「該(the)」 包括複數個指示物，除非上下文中另外明確地指示(反之亦然)。因此，例如，提及的「化合物」可以包括多種此類化合物。
合成的寡核苷酸在各種應用中提供有用的分子工具。例如，寡核苷酸可用於治療、診斷、研究、和新的奈米材料應用。天然存在的核酸(例如，未修飾的DNA或RNA)的使用受到限制，例如，它們對內切核酸酶和外切核酸酶的易感性。因此，已經開發了各種合成的對應物以克服該等缺點。該等包括合成的寡核苷酸，該等合成的寡核苷酸含有化學修飾(例如，鹼基修飾、糖修飾、骨架修飾等)，其中，使該等分子不易降解並改善寡核苷酸(例如，DMD寡核苷酸)的其他特性。化學修飾也可能導致某些不希望的效果，例如增加的毒性等。從結構的角度來看，對天然磷酸酯鍵的修飾可以引入手性，並且寡核苷酸的某些特性可能受到形成寡核苷酸的骨架的磷原子構型的影響。
在一些實施方式中，本揭露涉及DMD寡核苷酸或DMD寡核苷酸組成物，其具有與DMD靶核酸至少部分地互補的序列，並且在一些實施方式中，其能夠介導DMD外顯子的跳讀。在一些實施方式中，DMD寡核苷酸或DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子51或53的跳讀。
在一些實施方式中，DMD寡核苷酸或DMD寡核苷酸組成物包含對核苷酸間鍵(例如，骨架)、糖、和/或核鹼基的任何各種修飾。
在一些實施方式中，DMD寡核苷酸或DMD寡核苷酸組成物係本文揭露的(例如，在表A1中)任何DMD寡核苷酸或DMD寡核苷酸組成物。
在一些實施方式中，骨架(例如，磷原子的構型)的手性、或包括在骨架中的天然磷酸酯鍵或非天然核苷酸間鍵、和/或糖和/或核鹼基的修飾、和/或添加化學部分可以影響DMD寡核苷酸的特性和活性，該等特性和活性例如，DMD寡核苷酸(例如，與肌營養不良蛋白(DMD)DMD轉錄物序列反義的DMD寡核苷酸)跳讀DMD外顯子51或DMD外顯子53、和/或DMD寡核苷酸的其他特性(包括但不限於增加的穩定性、改進的藥物動力學、和/或減少的免疫原性等)的能力。用於評估提供的化合物(例如，DMD寡核苷酸)及其組成物的特性和/或活性的適合的測定係本領域廣泛已知的，並且可以依照本揭露使用。
在一些實施方式中，DMD轉錄物係前mRNA。在一些實施方式中，剪接產物係成熟RNA。在一些實施方式中，剪接產物係mRNA。在一些實施方式中，剪接調節或改變包含DMD外顯子51或DMD外顯子53的跳讀。
在一些實施方式中，提供的組成物中的提供的DMD寡核苷酸(例如，多種DMD寡核苷酸)包含鹼基修飾、糖修飾、和/或核苷酸間鍵修飾。在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸包含鹼基修飾和糖修飾。在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸包含鹼基修飾和核苷酸間鍵修飾。在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸包含糖修飾和核苷酸間修飾。在一些實施方式中，提供的組成物包含鹼基修飾、糖修飾、和核苷酸間鍵修飾。示例化學修飾(如鹼基修飾、糖修飾、核苷酸間鍵修飾等)係本領域廣泛已知的，其包括但不限於此揭露中描述的那些。在一些實施方式中，修飾的鹼基係取代的A、T、C、G或U。在一些實施方式中，糖修飾係2'-修飾。在一些實施方式中，2'-修飾係2-F修飾。在一些實施方式中，2'-修飾係2'-OR1，其中R1不是氫。在一些實施方式中，2'-修飾係2'-OR1，其中R1係視需要取代的烷基。在一些實施方式中，2'-修飾係2'-OMe。在一 些實施方式中，2'-修飾係2'-MOE。在一些實施方式中，修飾的糖部分係橋接的二環或多環。在一些實施方式中，修飾的糖部分係具有5-20個環原子的橋接的二環或多環，其中一個或多個環原子視需要並且獨立地是雜原子。示例環結構係本領域廣泛已知的，如在BNA、LNA等中發現的那些。
在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸包含一個或多個修飾的核苷酸間鍵。在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸包含一個或多個手性修飾的核苷酸間鍵。在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸包含一個或多個手性受控的手性修飾的核苷酸間鍵。在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸包含一個或多個天然磷酸酯鍵。在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸包含一個或多個修飾的核苷酸間鍵和一個或多個天然磷酸酯鍵。在一些實施方式中，修飾的核苷酸間鍵係硫代磷酸酯鍵。在一些實施方式中，每個修飾的核苷酸間鍵係硫代磷酸酯鍵。
在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸包含一個或多個修飾的核苷酸間鍵和一個或多個天然磷酸酯鍵兩者。在一些實施方式中，包含修飾的核苷酸間鍵和天然磷酸酯鍵兩者的DMD寡核苷酸及其組成物提供改進的特性，例如，外顯子51或53的跳讀和毒性等。在一些實施方式中，修飾的核苷酸間鍵係手性核苷酸間鍵。在一些實施方式中，修飾的核苷酸間鍵係硫代磷酸酯鍵。在一些實施方式中，修飾的核苷酸間鍵係取代的硫代磷酸酯鍵。
除其他事項之外，本揭露涵蓋認識到立體隨機DMD寡核苷酸配製物含有多個彼此不同的不同化學實體，例如，在DMD寡核苷酸鏈內的各個骨架連接磷手性中心的立體化學結構中。在不控制骨架手性中心的立體化學的情況下，立體隨機DMD寡核苷酸配製物提供了不受控制的組成物，該不受控制的組成物包含關於不受控制的手性中心(例如，手性連接磷)的未確定水平的DMD寡核苷酸立體異構物。儘管該等立體異構物可以具有相同的鹼基序列，但至少由 於它們不同的骨架立體化學它們係不同的化學實體，並且如本文所證明的，它們可以具有不同的特性(例如，外顯子51或53的跳讀、毒性等)。除其他事項之外，本揭露提供了新的DMD寡核苷酸組成物，其中一個或多個連接磷手性中心的立體化學獨立地是受控制的(例如，在手性受控的核苷酸間鍵中)。在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，該手性受控的DMD寡核苷酸組成物係或含有目的DMD寡核苷酸的特定的立體異構物。
在一些實施方式中，在DMD寡核苷酸中，骨架手性中心的模式可以提供改進的一種或多種活性或一種多種特徵，該等活性或特徵包括但不限於：DMD外顯子51或DMD外顯子53的改進的跳讀、增加的穩定性、增加的活性、低毒性、低免疫應答、改進的蛋白質結合特徵、與某些蛋白質增加的結合、和/或增強的遞送。
在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸包含一個或多個非負電荷的核苷酸間鍵。在一些實施方式中，非負電荷的核苷酸間鍵係帶正電荷的核苷酸間鍵。在一些實施方式中，非負電荷的核苷酸間鍵係中性核苷酸間鍵。在一些實施方式中，修飾的核苷酸間鍵(例如，非負電荷的核苷酸間鍵)包含視需要取代的胍部分。在一些實施方式中，修飾的核苷酸間鍵包含視需要取代的環狀胍部分。在一些實施方式中，修飾的核苷酸間鍵包含視需要取代的環狀胍部分，並且 具有以下結構：
Figure 108116317-A0202-12-0048-3
、
Figure 108116317-A0202-12-0048-8
、或
Figure 108116317-A0202-12-0048-7
，其中W係O。在 一些實施方式中，非負電荷的核苷酸間鍵係立體化學控制的。
在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸可以與DMD轉錄物鍵合，並且藉由誘導(例如，介導)外顯子51或53的跳讀改變DMD轉錄物的剪接模式。在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸提供了外顯子的外顯子跳讀， 效率大於在一個或多個合適的條件(例如，如本文所述的)下可比較的DMD寡核苷酸的。在一些實施方式中，提供的跳讀效率係在一個或多個合適的條件(例如，如本文所述的)下的可比較的DMD寡核苷酸的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%或更多，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或更多倍。
在一些實施方式中，與參考條件相比，提供的手性受控的DMD寡核苷酸組成物出人意料地有效。在一些實施方式中，外顯子52或53的跳讀(例如，如藉由增加水平的所希望的mRNA、蛋白質等，減少水平的不希望的mRNA、蛋白質等測量的)可以增強超過5、10、15、20、25、30、40、50、或100倍。在一些實施方式中，藉由與參考條件相比的所希望的mRNA水平的增加測量改變。在一些實施方式中，藉由與參考條件相比的不希望的mRNA水平的減少測量改變。在一些實施方式中，參考條件不存在DMD寡核苷酸處理。在一些實施方式中，參考條件係DMD寡核苷酸的立體隨機組成物，該DMD寡核苷酸具有相同的鹼基序列和化學修飾。
在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸組成物的特徵在於：當其與DMD轉錄物剪接系統中的DMD轉錄物接觸時，相對於在參考條件下所觀察到的，DMD轉錄物的剪接發生改變(例如，外顯子51或53發生跳讀)，該參考條件選自由以下組成之群組：不存在組成物、存在參考組成物、及其組合。在一些實施方式中，所希望的剪接產物(例如，缺乏外顯子51或53的一個產物)增加10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000倍或更多。在一些實施方式中，在參考條件下不存在 所希望的剪接參考(例如，不能藉由定量PCR可靠地檢測)。在一些實施方式中，如本揭露中例示的，在提供的組成物中的多種DMD寡核苷酸(例如，多個DMD寡核苷酸)的水平預確定的。
在一些實施方式中，具有共同的鹼基序列的DMD寡核苷可以具有相同的核苷修飾模式，例如，糖修飾、鹼基修飾等。在一些實施方式中，核苷修飾的模式可以藉由位置和修飾的組合來表示。在一些實施方式中，可以省略所有非手性連接(例如，PO)。在一些實施方式中，具有相同的鹼基序列的DMD寡核苷酸具有相同的組成。
在一些實施方式中，DMD寡核苷酸組成物係手性受控的。
在一些實施方式中，DMD寡核苷酸組成物不是立體隨機的，並且不是非鏡像異構物的外消旋製劑。
如熟悉該項技術者所理解的，藉由核苷酸單體的非立體選擇性和/或低立體選擇性偶合來製備DMD寡核苷酸的立體隨機或外消旋製劑，通常不使用任何手性助劑、手性修飾試劑、和/或手性催化劑。在一些實施方式中，在基本上外消旋(或手性不受控制的)的DMD寡核苷酸製劑中，所有或大多數偶合步驟不是手性受控的，因為偶合步驟沒有特別進行以提供增強的立體選擇性。DMD寡核苷酸的基本上外消旋製劑的實例係硫代磷酸酯DMD寡核苷酸的製劑，藉由從常用的亞磷醯胺DMD寡核苷酸與二硫代四乙基秋蘭姆(thiuram)或(TETD)或3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(BDTD)的硫化亞磷酸三酯，其係本領域熟知的方法。在一些實施方式中，DMD寡核苷酸的基本上外消旋的製劑提供了基本上外消旋的DMD寡核苷酸組成物(或手性不受控制的DMD寡核苷酸組成物)。在一些實施方式中，核苷酸單體的至少一個偶合具有低於約60：40、70：30、80：20、85：15、90：10、91：9、92：8、97：3、98：2、或99：1的非鏡像異構選擇性。在一些實施方式中，每個核苷酸間鍵獨立地具有低於約60： 40、70：30、80：20、85：15、90：10、91：9、92：8、97：3、98：2、或99：1的非鏡像異構選擇性。在一些實施方式中，非鏡像異構選擇性低於約60：40。在一些實施方式中，非鏡像異構選擇性低於約70：30。在一些實施方式中，非鏡像異構選擇性低於約80：20。在一些實施方式中，非鏡像異構選擇性低於約90：10。在一些實施方式中，非鏡像異構選擇性低於約91：9。在一些實施方式中，至少一個核苷酸間鍵具有低於約90：10的非鏡像異構選擇性。在一些實施方式中，每個核苷酸間鍵獨立地具有低於約90：10的非鏡像異構選擇性。在一些實施方式中，非手性受控的核苷酸間鍵具有不超過90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、或55%的非鏡像異構物純度。在一些實施方式中，純度不超過90%。在一些實施方式中，純度不超過85%。在一些實施方式中，純度不超過80%。
相反，在手性受控的DMD寡核苷酸組成物中，關於手性連接磷，至少一種且通常每種手性受控的核苷酸間鍵(如，手性受控的DMD寡核苷酸組成物的DMD寡核苷酸的那些)獨立地具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的非鏡像異構物純度。在一些實施方式中，非鏡像異構物純度係95%或更多。在一些實施方式中，非鏡像異構物純度係96%或更多。在一些實施方式中，非鏡像異構物純度係97%或更多。在一些實施方式中，非鏡像異構物純度係98%或更多。在一些實施方式中，非鏡像異構物純度係99%或更多。除其他事項之外，本揭露的技術通常提供具有高非鏡像異構物純度的手性受控的核苷酸間鍵。
如熟悉該項技術者所理解的，可以藉由二聚體形成的非鏡像異構選擇性/在相同的或可比較的條件下形成的二聚體的核苷間鍵的非鏡像異構物純度來評估偶合的非鏡像異構選擇性或核苷間鍵的非鏡像異構物純度(非鏡像異構純度)，其中二聚體具有相同的5'-和3'-核苷和核苷間鍵。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的(和/或立體化學純的)DMD寡核苷酸組成物，該DMD寡核苷酸組成物包含藉由以下定義的多種DMD寡核苷酸：1)共同的鹼基序列；2)共同的骨架連接模式；以及3)共同的骨架手性中心模式，該組成物係單個DMD寡核苷酸的基本上純的製劑，其中組成物中至少約10%的DMD寡核苷酸具有共同的鹼基序列和長度、共同的骨架連接的模式、和共同的骨架手性中心模式，其中該寡核苷酸在本文中提供(例如，在表A1中)。
在一些實施方式中，本揭露提供了多種DMD寡核苷酸的手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中相對於相同的DMD寡核苷酸的基本上外消旋的製劑，對於單個DMD寡核苷酸類型的DMD寡核苷酸，該組成物係富含的。在一些實施方式中，本揭露提供了多種DMD寡核苷酸的手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中相對於相同的DMD寡核苷酸的基本上外消旋的製劑，對於藉由以下定義的單個DMD寡核苷酸類型的DMD寡核苷酸，該組成物係富含的：1)鹼基序列；2)骨架連接的模式；3)骨架手性中心的模式；以及4)骨架磷修飾的模式，其中在本文中(例如，在表A1中)提供了寡核苷酸。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，該手性受控的DMD寡核苷酸組成物包含藉由以下定義的特定的DMD寡核苷酸類型的多種DMD寡核苷酸：1)鹼基序列；2)骨架連接的模式； 3)骨架手性中心的模式；以及4)骨架磷修飾的模式。
其中相對於具有相同的鹼基序列和長度的DMD寡核苷酸的基本上外消旋的製劑，該組成物富含特定DMD寡核苷酸類型的DMD寡核苷酸，其中在本文中(例如，在表A1中)提供了寡核苷酸。
在一些實施方式中，DMD寡核苷酸類型的DMD寡核苷酸具有共同的骨架磷修飾模式和共同的糖修飾模式。在一些實施方式中，DMD寡核苷酸類型的DMD寡核苷酸具有共同的骨架磷修飾模式和共同的鹼基修飾模式。在一些實施方式中，DMD寡核苷酸類型的DMD寡核苷酸具有共同的骨架磷修飾模式和共同的核苷修飾模式。在一些實施方式中，特定類型的DMD寡核苷酸具有相同的組成。在一些實施方式中，DMD寡核苷酸類型的DMD寡核苷酸係相同的。
在一些實施方式中，手性受控的DMD寡核苷酸組成物係DMD寡核苷酸類型的基本上純的製劑，因為在不是DMD寡核苷酸類型的組成物中的DMD寡核苷酸係來自所述DMD寡核苷酸類型的製備過程(在一些情況下，經過某些淨化程序後)的雜質。
在一些實施方式中，組成物中的DMD寡核苷酸的至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或95%具有共同的鹼基序列、共同的骨架連接模式、和共同的骨架手性中心模式。
在一些實施方式中，具有共同的鹼基序列、共同的骨架連接模式、共同的骨架手性中心模式的DMD寡核苷酸具有共同的骨架磷修飾模式。在一些實施方式中，具有共同的鹼基序列、共同的骨架連接模式、和共同的骨架手性中心模式的DMD寡核苷具有共同的骨架磷修飾模式和共同的核苷修飾模式。在一些實施方式中，具有共同的鹼基序列、共同的骨架連接模式、和共同的骨架手性中心模式的DMD寡核苷酸具有共同的骨架磷修飾模式和共同的糖修飾模式。在 一些實施方式中，具有共同的鹼基序列、共同的骨架連接模式、和共同的骨架手性中心模式的DMD寡核苷酸具有共同的骨架磷修飾模式和共同的鹼基修飾模式。在一些實施方式中，具有共同的鹼基序列、共同的骨架連接模式、和共同的骨架手性中心模式的DMD寡核苷酸係相同的。
在一些實施方式中，DMD寡核苷酸類型的手性受控的DMD寡核苷酸組成物的純度表示為組成物中的DMD寡核苷酸係DMD寡核苷酸類型的百分比。在一些實施方式中，手性受控的DMD寡核苷酸組成物中的至少約10%的DMD寡核苷酸係DMD寡核苷酸類型。在一些實施方式中，手性受控的DMD寡核苷酸組成物中的至少約20%的DMD寡核苷酸係DMD寡核苷酸類型。在一些實施方式中，手性受控的DMD寡核苷酸組成物中的至少約30%的DMD寡核苷酸係DMD寡核苷酸類型。在一些實施方式中，手性受控的DMD寡核苷酸組成物中的至少約40%的DMD寡核苷酸係DMD寡核苷酸類型。在一些實施方式中，手性受控的DMD寡核苷酸組成物中的至少約50%的DMD寡核苷酸係DMD寡核苷酸類型。在一些實施方式中，手性受控的DMD寡核苷酸組成物中的至少約60%的DMD寡核苷酸係DMD寡核苷酸類型。在一些實施方式中，手性受控的DMD寡核苷酸組成物中的至少約70%的DMD寡核苷酸係DMD寡核苷酸類型。在一些實施方式中，手性受控的DMD寡核苷酸組成物中的至少約80%的DMD寡核苷酸係DMD寡核苷酸類型。在一些實施方式中，手性受控的DMD寡核苷酸組成物中的至少約90%的DMD寡核苷酸係DMD寡核苷酸類型。在一些實施方式中，手性受控的DMD寡核苷酸組成物中的至少約92%的DMD寡核苷酸係DMD寡核苷酸類型。在一些實施方式中，手性受控的DMD寡核苷酸組成物中的至少約94%的DMD寡核苷酸係DMD寡核苷酸類型。在一些實施方式中，手性受控的DMD寡核苷酸組成物中的至少約95%的DMD寡核苷酸係DMD寡核苷酸類型。在一些實施方式中，手性受控的DMD寡核苷酸組成物中的至少約96%的DMD寡核苷酸係 DMD寡核苷酸類型。在一些實施方式中，手性受控的DMD寡核苷酸組成物中的至少約97%的DMD寡核苷酸係DMD寡核苷酸類型。在一些實施方式中，手性受控的DMD寡核苷酸組成物中的至少約98%的DMD寡核苷酸係DMD寡核苷酸類型。在一些實施方式中，手性受控的DMD寡核苷酸組成物中的至少約99%的DMD寡核苷酸係DMD寡核苷酸類型。
在一些實施方式中，手性受控的DMD寡核苷酸組成物的純度可以藉由其製備過程中的每個偶合步驟的立體選擇性被控制。在一些實施方式中，偶合步驟具有60%的立體選擇性(例如，非鏡像異構選擇性)(由偶合步驟形成的新的核苷酸間鍵的60%具有預期的立體化學)。在此類偶合步驟後，形成的新的核苷酸間鍵可以被稱為具有60%的純度。在一些實施方式中，每個偶合步驟具有至少60%的立體選擇性。在一些實施方式中，每個偶合步驟具有至少70%的立體選擇性。在一些實施方式中，每個偶合步驟具有至少80%的立體選擇性。在一些實施方式中，每個偶合步驟具有至少85%的立體選擇性。在一些實施方式中，每個偶合步驟具有至少90%的立體選擇性。在一些實施方式中，每個偶合步驟具有至少91%的立體選擇性。在一些實施方式中，每個偶合步驟具有至少92%的立體選擇性。在一些實施方式中，每個偶合步驟具有至少93%的立體選擇性。在一些實施方式中，每個偶合步驟具有至少94%的立體選擇性。在一些實施方式中，每個偶合步驟具有至少95%的立體選擇性。在一些實施方式中，每個偶合步驟具有至少96%的立體選擇性。在一些實施方式中，每個偶合步驟具有至少97%的立體選擇性。在一些實施方式中，每個偶合步驟具有至少98%的立體選擇性。在一些實施方式中，每個偶合步驟具有至少99%的立體選擇性。在一些實施方式中，每個偶合步驟具有至少99.5%的立體選擇性。在一些實施方式中，每個偶合步驟具有幾乎100%的立體選擇性。
在一些實施方式中，在提供的組成物中，具有特定的DMD寡核苷酸類型(由1)鹼基序列；2)骨架連接的模式；3)骨架手性中心的模式；和4)骨架磷修飾的模式定義)的鹼基序列的DMD寡核苷酸的至少0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、97%或99%係特定的DMD寡核苷酸類型的DMD寡核苷酸。在一些實施方式中，具有特定的DMD寡核苷酸類型的鹼基序列、骨架連接的模式、和骨架磷修飾的模式的DMD寡核苷酸的至少0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、97%或99%係特定的DMD寡核苷酸類型的DMD寡核苷酸。
在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸包含一個或多個手性、修飾的磷酸酯鍵。在一些實施方式中，提供的手性受控的(和/或立體化學純)配製物係DMD寡核苷酸，該DMD寡核苷酸包括一個或多個修飾的骨架連接、鹼基、和/或糖。
在一些實施方式中，提供的手性受控的(和/或立體化學純)配製物具有大於約80%的立體化學純度。在一些實施方式中，提供的手性受控的(和/或立體化學純)配製物具有大於約85%的立體化學純度。在一些實施方式中，提供的手性受控的(和/或立體化學純)配製物具有大於約90%的立體化學純度。在一些實施方式中，提供的手性受控的(和/或立體化學純)配製物具有大於約91%的立體化學純度。在一些實施方式中，提供的手性受控的(和/或立體化學純)配製物具有大於約92%的立體化學純度。在一些實施方式中，提供的手性受控的(和/或立體化學純)配製物具有大於約93%的立體化學純度。在一些實施方式 中，提供的手性受控的(和/或立體化學純)配製物具有大於約94%的立體化學純度。在一些實施方式中，提供的手性受控的(和/或立體化學純)配製物具有大於約95%的立體化學純度。在一些實施方式中，提供的手性受控的(和/或立體化學純)配製物具有大於約96%的立體化學純度。在一些實施方式中，提供的手性受控的(和/或立體化學純)配製物具有大於約97%的立體化學純度。在一些實施方式中，提供的手性受控的(和/或立體化學純)配製物具有大於約98%的立體化學純度。在一些實施方式中，提供的手性受控的(和/或立體化學純)配製物具有大於約99%的立體化學純度。
在一些實施方式中，一個或多個係一個。在一些實施方式中，一個或多個係兩個。在一些實施方式中，一個或多個係三個。在一些實施方式中，一個或多個係四個。在一些實施方式中，一個或多個係五個。在一些實施方式中，一個或多個係六個。在一些實施方式中，一個或多個係七個。在一些實施方式中，一個或多個係八個。在一些實施方式中，一個或多個係九個。在一些實施方式中，一個或多個係十個。在一些實施方式中，一個或多個係至少一個。在一些實施方式中，一個或多個係至少兩個。在一些實施方式中，一個或多個係至少三個。在一些實施方式中，一個或多個係至少四個。在一些實施方式中，一個或多個係至少五個。在一些實施方式中，一個或多個係至少六個。在一些實施方式中，一個或多個係至少七個。在一些實施方式中，一個或多個係至少八個。在一些實施方式中，一個或多個係至少九個。在一些實施方式中，一個或多個係至少十個。
在一些實施方式中，鹼基序列(例如，多種DMD寡核苷酸的共同的鹼基序列、特定的DMD寡核苷酸類型的鹼基序列等)包含或係與基因或DMD轉錄物(例如，肌營養不良蛋白或DMD)互補的序列。在一些實施方式中，共同的鹼基序列包含或係與基因100%互補的序列。
在一些實施方式中，手性核苷酸間鍵的連接磷係手性受控的。在一些實施方式中，手性核苷酸間鍵係硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在一些實施方式中，提供的組成物的DMD寡核苷酸中的每個手性核苷酸間鍵係硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
如熟悉該項技術者所理解的，核苷酸間鍵、天然磷酸酯鍵、硫代磷酸酯核苷酸間鍵等能以其鹽形式(取決於它們的環境pH)存在。除非另有說明，否則當提及此類核苷酸間鍵時，此類鹽形式包括在本申請中。
在一些實施方式中，本揭露的DMD寡核苷酸包含一個或多個修飾的糖部分。在一些實施方式中，本揭露的DMD寡核苷酸包含一個或多個修飾的鹼基部分。如熟悉該項技術者所知的並描述在本揭露中的，可以將各種修飾引入糖和鹼基部分。例如，在一些實施方式中，修飾係US 9006198、WO 2014/012081、WO/2015/107425、和WO/2017/062862中描述的修飾，其每個的糖和鹼基修飾藉由引用結合在此。
肌營養不良蛋白
在一些實施方式中，本揭露提供了技術(例如，DMD寡核苷酸、組成物、方法等)，該等技術涉及肌營養不良蛋白(DMD)基因或由其編碼的產物(DMD轉錄物、蛋白質(例如，肌營養不良蛋白質的各種變體)等)。
在一些實施方式中，本揭露提供了技術(包括DMD寡核苷酸和組成物，及使用其的方法)，該等技術用於治療肌肉營養不良(包括但不限於杜興氏肌肉失養症(也縮寫為DMD)和貝克氏肌肉失養症(BMD))。在一些實施方式中，DMD包含一個或多個突變。在一些實施方式中，此類突變與患有或易患肌肉營養不良的受試者中肌營養不良蛋白質的降低的生物學功能相關。
在一些實施方式中，肌營養不良蛋白(DMD)基因或其產物、或其變體或部分可以稱為DMD、BMD、CMD3B、DXS142、DXS164、DXS206、 DXS230、DXS239、DXS268、DXS269、DXS270、DXS272、MRX85、或肌營養不良蛋白；外部ID：OMIM：300377 MGI：94909；同源基因：20856；基因卡：DMD；在人中：Entrez：1756；數據庫：ENSG00000198947；UniProt：P11532；RefSeq(mRNA)：NM_000109；NM_004006；NM_004007；NM_004009；NM_004010；RefSeq(蛋白質)：NP_000100；NP_003997；NP_004000；NP_004001；NP_004002；位置(UCSC)：Chr X：31.1-33.34 Mb；在小鼠中：Entrez：13405；數據庫：ENSMUSG00000045103；UniProt：P11531；RefSeq(mRNA)：NM_007868；NM_001314034；NM_001314035；NM_001314036；NM_001314037；RefSeq(蛋白質)：NP_001300963；NP_001300964；NP_001300965；NP_001300966；NP_001300967；位置(UCSC)：Chr X：82.95-85.21 Mb。
據報導，DMD基因含有79個外顯子，分佈在X染色體上超過230萬bp的遺傳不動位置(genetic real estate)；然而，據報導僅有大約14,000bp(<1%)用於翻譯成蛋白質(編碼序列)。據報導，約99.5%的遺傳序列(即內含子序列)從230萬bp的初始異核RNA DMD轉錄物中剪接，以提供成熟的14,000bp mRNA，其包括肌營養不良蛋白質產生的所有關鍵資訊。在一些實施方式中，患有DMD的患者在DMD基因中具有一個或多個突變，該DMD基因阻止野生型DMDmRNA的適當構建和/或野生型肌營養不良蛋白質的產生，並且患有DMD的患者在他們的肌肉經常顯示出顯著的肌營養不良蛋白缺乏。
在一些實施方式中，肌營養不良蛋白DMD轉錄物(例如，mRNA、或蛋白質)涵蓋與可替代的剪接相關或由其產生的那些。例如，在分析骨骼肌、腦和心臟組織中的DMD基因的剪接模式後，報導了肌營養不良蛋白基因的十六種可替代的DMD轉錄物。Sironi等人2002 FEBS Letters[FEBS通訊]517：163-166。
據報導，肌營養不良蛋白具有若干種同種型。在一些實施方式中，肌營養不良蛋白係指特定的同種型。已經報導了至少三種全長肌營養不良蛋白 同種型，各自由組織-特定的啟動子控制。Klamut等人1990 Mol.Cell.Biol.[細胞生物學雜誌]10：193-205；Nudel等人1989 Nature[自然]337：76-78；Gorecki等人1992 Hum.Mol.Genet.[人類分子遺傳學]1：505-510。據報導，肌肉異構物主要在骨骼肌中表現，但也在平滑肌和心肌中表現[Bies,R.D.,Phelps,S.F.,Cortez,M.D.,Roberts,R.,Caskey,C.T.和Chamberlain,J.S.1992 Nucleic Acids Res.[核酸研究]20：1725-1731]，據報導，腦肌營養不良蛋白對皮質神經元具有特異性，但也可在心臟和小腦神經元中檢測到，而據報導，浦肯野細胞(Purkinje-cell)類型幾乎占了所有小腦肌營養不良蛋白[Gorecki等人1992 Hum.Mol.Genet.[人類分子遺傳學]1：505-510]。據報導，可替代的剪接提供了肌營養不良蛋白多樣化的手段：據報導，基因的3'區域經歷了可替代的剪接，該可替代的剪接導致腦神經元、心臟浦肯野纖維、和平滑肌細胞中的組織-特定的DMD轉錄物[Bies等人1992 Nucleic Acids Res.[核酸研究]20：1725-1731；和Feener等人1989 Nature[自然]338：509-511]，而在骨骼肌基因的5'區域已經報導了12種可替代的剪接模式[Surono等人1997 Biochem.Biophys.Res.Commun.[生物化學與生物物理研究通訊]239：895-899]。
在一些實施方式中，肌營養不良蛋白mRNA、基因或蛋白質係回復突變型版本。其中，報告了回復突變型肌營養不良蛋白，例如在：Hoffman等人1990 J.Neurol.Sci.[神經科學雜誌]99：9-25；Klein等人1992 Am.J.Hum.[美國人遺傳學雜誌]50：950-959；以及Chelly等人1990 Cell[細胞]63：1239-1348；Arahata等人1998 Nature[自然]333：861-863；Bonilla等人1988 Cell[細胞]54：447-452；Fanin等人1992 Neur.Disord.[神經發育障礙雜誌]2：41-45；Nicholson等人1989 J.Neurol.Sci.[神經科學雜誌]94：137-146；Shimizu等人1988 Proc.Jpn.Acad.Sci.[美國國家科學院院刊]64：205-208；Sicinzki等人1989 Science[科學] 244：1578-1580；以及Sherratt等人Am.J.Hum.Genet.[美國人遺傳學雜誌]53：1007-1015中。
DMD基因中的各種突變可以和/或據報導引起肌肉營養不良，包括外顯子51或53中的一些。
肌肉營養不良
包含本文所述的一個或多種DMD寡核苷酸的組成物可以用於治療或延遲肌肉營養不良、或其至少一個症狀的發作。在一些實施方式中，肌肉營養不良(MD)係導致(增加)骨骼肌隨時間減弱和分解的一組肌肉病症、疾病、或障礙中的任一種。主要影響肌肉的病症、疾病或障礙，當症狀開始時的無力程度以及症狀惡化的速度。許多MD患者最終將無法行走。在許多情況下，肌肉營養不良係致命的。一些類型也與其他器官(包括中樞神經系統)的問題有關。在一些實施方式中，肌肉營養不良係杜興氏肌肉失養症(DMD)或貝克氏肌肉失養症(BMD)。
在一些實施方式中，據報導，杜興氏肌肉失養症的症狀係與肌肉萎縮相關的肌肉無力，其中隨意肌肉首先受到影響，尤其是臀部、骨盆區域、大腿、肩膀和小腿的那些。據報導，肌肉無力也會在手臂、頸部和其他部位發生。據報導，小腿經常被擴大。據報導，症狀通常出現在六歲之前，並且可能出現在嬰兒早期。報導的其他身體症狀係：走路、踩踏或跑步的尷尬方式(在某些情況下，由於小腿肌肉張力增加，患者傾向於以前腳行走)，頻繁跌倒，疲勞，運動技能(例如，跑步、單腳跳躍、雙腳跳躍)困難，腰椎脊柱前凸過度、可能導致髖部屈肌縮短，不尋常的整體姿勢和/或行走、踩踏或跑步的方式，跟腱和腿筋的肌肉攣縮損害功能，進行性行走困難，肌纖維畸形，舌頭和小腿肌肉的假性肥大(擴大)，神經行為障礙(例如，ADHD)、學習障礙(例如，閱讀障礙)的高風險，以及特定認知技能(例如，短期言語記憶)的非進行性弱點，被認為係 大腦中缺乏或功能失調的肌營養不良的結果，最終喪失行走能力(通常在12歲時)，骨骼畸形(包括某些情況下的脊柱側凸)，以及從躺著或坐姿起身麻煩。
在一些實施方式中，據報導，貝克氏肌肉失養症(BMD)係由產生縮短但框內DMD轉錄物的突變引起，導致產生截短的、但具有部分功能的一種或多種蛋白質。據報導，此類一種或多種具有部分功能的蛋白質保留了關鍵胺基末端，富含半胱胺酸和C末端結構域，但通常缺乏中心桿結構域的元件，據報導該中心桿結構域的功能意義較小。England等人1990 Nature[自然]，343,180-182。
在一些實施方式中，BMD表型的範圍從輕度DMD到實際上無症狀，這取決於精確突變和產生的肌營養不良蛋白的水平。Yin等人2008 Hum.Mol.Genet.[人類分子遺傳學]17：3909-3918。
在一些實施方式中，具有框架外突變的營養不良患者通常被診斷為具有更嚴重的杜興氏肌肉失養症，並且具有框內突變的營養不良患者通常被診斷為具有不太嚴重的貝克氏肌肉失養症。然而，少數患有框架內缺失的患者被診斷患有杜興氏肌肉失養症(包括在外顯子50或51開始或結束的缺失突變的那些，其編碼部分鉸鏈區，如外顯子47至51、48到51、和49到53的缺失)。不希望受任何特定理論的束縛，本揭露指出儘管存在相同的外顯子缺失，但據報導患者與患者之間疾病嚴重性的可變性可以與以下有關：特定缺失中斷點對mRNA剪接效率和/或模式的影響；基因組重排後的翻譯或DMD轉錄效率；和截短的蛋白質結構的穩定性或功能。Yokota等人2009 Arch.Neurol.[神經病學年鑒]66：32。
外顯子跳讀作為用於肌肉營養不良的治療
在一些實施方式中，治療肌肉營養不良包含使用能夠介導肌營養不良蛋白(DMD)外顯子51或53的跳讀的DMD寡核苷酸。在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療肌肉營養不良之方法，該方法包括向患有其或易患其的 受試者給予DMD寡核苷酸、或包含DMD寡核苷酸的組成物。特別地除其他事項之外，本揭露證明了，與其他方面相同但非手性受控的DMD寡核苷酸/寡核苷酸組成物相比，手性受控的DMD寡核苷酸/手性受控的DMD寡核苷酸組成物出乎意料地有效調節外顯子跳讀。在一些實施方式中，本揭露證明了將一個或多個非帶負電荷的核苷酸間鍵併入到DMD寡核苷酸中可以極大地改善遞送和/或整體外顯子跳讀效率。
在一些實施方式中，肌營養不良的治療使用DMD寡核苷酸，其中DMD寡核苷酸能夠介導(例如，指導)DMD外顯子51或DMD外顯子53的跳讀。在一些實施方式中，DMD寡核苷酸能夠介導外顯子的跳讀，該外顯子包含突變(例如，框移、插入、缺失、誤義、或無義突變、或其他突變)，其中翻譯具有跳讀的外顯子的mRNA產生截短的但功能性(或主要功能性)的DMD蛋白質。
在一些實施方式中，包含DMD寡核苷酸的組成物可用於治療中樞神經系統的肌營養不良蛋白相關的障礙。在一些實施方式中，本揭露涉及治療中樞神經系統的肌營養不良蛋白相關的障礙之方法，其中該方法包括向患有中樞神經系統的肌營養不良蛋白相關的障礙的患者給予治療有效量DMD寡核苷酸的步驟。在一些實施方式中，將DMD寡核苷酸在中樞神經系統外部(作為非限制性實例，靜脈內或肌肉內)給予患有中樞神經系統的肌營養不良蛋白相關的障礙的患者，並且DMD寡核苷酸能夠通過血腦障壁進入中樞神經系統。在一些實施方式中，將DMD寡核苷酸直接給予中樞神經系統(作為非限制性實例，經由鞘內、心室內、顱內等遞送)。
在一些實施方式中，中樞神經系統的肌營養不良蛋白相關的障礙、或其症狀可以是以下的任何一個或多個：智力下降，長期記憶力下降，短期記憶力下降，語言障礙，癲癇，自閉症譜系疾患，注意力不足過動症(ADHD)，強迫症，學習問題，行為障礙，腦容量減少，灰質體積減小，較低的白質分數各 向異性，較高的白質徑向擴散率，顱骨形狀的異常，或海馬體、蒼白球、尾殼核、下丘腦、前連合、導水管周圍灰質、內囊、杏仁核、胼胝體、隔核、伏隔核、傘部(fimbria)、腦室、或中腦丘腦的體積和結構的有害改變。在一些實施方式中，展示肌肉營養不良的肌肉相關的症狀的患者還展示中樞神經系統的肌營養不良蛋白相關的障礙的症狀。
在一些實施方式中，中樞神經系統的肌營養不良蛋白相關的障礙與以下相關、與以下有關係、和/或由以下引起：肌營養不良蛋白基因的基因產物(如全長肌營養不良蛋白或者肌營養不良蛋白的較小同種型，包括但不限於Dp260、Dp140、Dp116、Dp71或Dp40)的水平、活性、表現和/或分佈的異常。在一些實施方式中，將DMD寡核苷酸給予肌肉營養不良患者的中樞神經系統中，以改善中樞神經系統的肌營養不良蛋白相關的障礙的一種或多種系統。在一些實施方式中，中樞神經系統的肌營養不良蛋白相關的障礙與以下相關、與以下有關係、和/或由以下引起：肌營養不良蛋白基因的基因產物(如全長肌營養不良蛋白或者肌營養不良蛋白的較小同種型，包括但不限於Dp260、Dp140、Dp116、Dp71或Dp40)的水平、活性、表現和/或分佈的異常。在一些實施方式中，向患有中樞神經系統的肌營養不良蛋白相關的障礙的患者給予DMD寡核苷酸增加肌營養不良蛋白基因的基因產物的水平、活性、和/或表現，和/或改善肌營養不良蛋白基因的基因產物的分佈。
在一些實施方式中，本揭露提供了用於調節肌營養不良蛋白前mRNA剪接的技術，其中切除外顯子51或外顯子53以去除突變。
在一些實施方式中，在DMD患者中，DMD基因包含外顯子(包含突變)，並且藉由DMD外顯子51或DMD外顯子53的跳讀至少部分地治療障礙。
在一些實施方式中，在DMD患者中，DMD基因或DMD轉錄物在一個或多個外顯子中具有突變，該突變係誤義或無義突變和/或缺失、插入、反向、易位或複製。
在一些實施方式中，在治療肌肉營養不良中，跳讀DMD的外顯子(例如，外顯子51或53)，其中該外顯子編碼一串對DMD蛋白功能不是必需的胺基酸，或者其跳讀可以提供具有完全功能或具有至少部分功能的DMD蛋白質。
在一些實施方式中，在治療肌肉營養不良中，DMD寡核苷酸能夠介導DMD外顯子51或53的跳讀，從而產生mRNA，從該mRNA可以翻譯成人工內部截短的DMD蛋白質變體，該DMD蛋白質變體提供至少部分改善的或完全恢復的生物學活性。
在一些實施方式中，由具有跳讀的外顯子51或跳讀的外顯子53的肌營養不良蛋白DMD轉錄物產生的內部截短的DMD蛋白質變體比末端截短的DMD蛋白質(例如，由具有框外缺失的肌營養不良蛋白DMD轉錄物產生)更具功能性。
在一些實施方式中，由具有跳讀的外顯子51或跳讀的外顯子53的肌營養不良蛋白DMD轉錄物產生的內部截短的DMD蛋白質變體對無義介導的衰變更具抗性，其可降解末端截短的DMD蛋白質，例如由具有框外刪除的肌營養不良蛋白DMD轉錄物。
在一些實施方式中，肌營養不良的治療使用DMD寡核苷酸，其中DMD寡核苷酸能夠介導DMD外顯子51或DMD外顯子53的跳讀。
在一些實施方式中，本揭露涵蓋認識到可以利用DMD突變的性質和位置來設計外顯子跳讀策略。在一些實施方式中，如果DMD患者在外顯子中具有突變，則跳讀突變的外顯子可以產生內部截短的(內部縮短的)、但具有至少部分功能的DMD蛋白質變體。
在一些實施方式中，DMD患者具有改變DMD轉錄物剪接的突變，例如藉由滅活剪接所需的位點、或活化隱蔽位點以使其活化以進行剪接，或藉由創建可替代的(例如，不自然)剪接位點。在一些實施方式中，這種突變導致產生具有低活性或無活性的蛋白質。在一些實施方式中，剪接調節(例如，外顯子跳讀、抑制這種突變等)可以用於去除或減少這種突變的影響，例如藉由恢復適當的剪接以產生具有恢復的活性的蛋白質，或產生具有改善或恢復的活性等的內部截短的肌營養不良蛋白質變體。
在一些實施方式中，恢復讀框可以將框外突變轉換為框內突變；在一些實施方式中，在人中，這種變化可以將嚴重的杜興氏肌肉失養症轉化為更溫和的貝克氏肌肉失養症。
在一些實施方式中，在給予包含DMD寡核苷酸的組成物之前，分析DMD患者或懷疑患有DMD的患者的DMD基因型。
在一些實施方式中，在給予包含DMD寡核苷酸的組成物之前，分析DMD患者或懷疑患有DMD的患者的DMD表型。
在一些實施方式中，分析DMD患者的基因型和表型，以在給予包含DMD寡核苷酸的組成物之前確定DMD基因型和DMD表型的關係。
在一些實施方式中，在給予包含DMD寡核苷酸的組成物之前，遺傳地證實患者具有營養不良。
在一些實施方式中，DMD或患者的DMD基因型或遺傳驗證的分析包含確定患者是否在DMD中具有一個或多個有害突變。
在一些實施方式中，DMD或患者的DMD基因型或遺傳驗證的分析包含確定患者是否在DMD中具有一個或多個有害突變和/或分析DMD剪接和/或檢測DMD的剪接變體，其中藉由DMD的異常拼接產生剪接變體。
在一些實施方式中，DMD基因型的分析或DMD的遺傳驗證通知選擇包含可用於治療的DMD寡核苷酸的組成物。
在一些實施方式中，從患者或患者的一個或多個細胞或一個或多個組織去除或複製異常或突變DMD基因，並且將異常或突變DMD基因、或包含異常或突變的其部分，或其拷貝插入細胞中。在一些實施方式中，此細胞可用於測試包含DMD寡核苷酸的各種組成物，以預測這種組成物是否可用於治療患者。在一些實施方式中，該細胞係成肌細胞或肌微管蛋白。
在一些實施方式中，個體或患者可以在用DMD寡核苷酸治療之前產生DMD的一種或多種剪接變體，通常每種變體以非常低的水平產生。在一些實施方式中，任何合適的方法可用於檢測在給予DMD寡核苷酸之前、期間或之後在患者中產生的低水平的剪接變體。
在一些實施方式中，在給予包含DMD寡核苷酸的組成物之前，分析患者和/或其組織產生DMD基因的各種剪接變體。
在一些實施方式中，本揭露提供了用於設計DMD寡核苷酸(例如，DMD寡核苷酸能夠介導DMD的DMD外顯子51或DMD外顯子53的跳讀)的方法。在一些實施方式中，本揭露利用本文所述的基本原理設計和視需要的序列步驟來設計DMD寡核苷酸，例如，用於在一種或多種測定和/或條件下測試外顯子跳讀。在一些實施方式中，在合理設計後開發有效的DMD寡核苷酸，包括使用給定生物系統的各種資訊。
在一些實施方式中，在用於開發DMD寡核苷酸之方法中，設計DMD寡核苷酸以與一個或多個潛在的剪接相關模體退火，然後測試它們介導外顯子跳讀的能力。
用於評估寡核苷酸和寡核苷酸組成物的示例技術
用於評估DMD寡核苷酸的特性和/或活性的各種技術可以依照本揭露使用，例如，US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/015575、WO 2017/192664、WO 2017/062862、WO 2017/192679、WO 2017/210647等。
例如，依照本揭露，可以評估DMD寡核苷酸在各種測定(包括體外和體內測定)仲介導外顯子跳讀的能力。體外測定可以在本文所述的或本領域已知的各種測試細胞(包括但不限於△48-50患者衍生的成肌細胞)中進行。體內測試可以在本文所述或本領域已知的測試動物(包括但不限於小鼠、大鼠、貓、豬、狗、猴、或非人靈長類動物)中進行。
作為非限制性實例，下文描述了許多測定用於評估DMD寡核苷酸的特性/活性。各種其他合適的測定可用並且可用於評估DMD寡核苷酸特性/活性，包括未設計用於外顯子跳讀的DMD寡核苷酸的那些(例如，對於可以涉及RNA酶H以降低靶DMD轉錄物水平的DMD寡核苷酸的，描述在US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/015575、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647等中的測定)。
可以評估DMD寡核苷酸介導肌營養不良蛋白RNA中外顯子51或53的跳讀的能力，其可以使用巢式PCR、qRT-PCR和/或測序作為非限制性實例進行測試。
可以評估DMD寡核苷酸介導蛋白質恢復的能力(例如，產生缺少與跳讀的外顯子中編碼的密碼子對應的胺基酸的內部截短的肌營養不良蛋白質變體，其與在外顯子跳讀之前產生的蛋白質(如果有的話)相比具有改善的功能)，其可以藉由許多蛋白質檢測和/或定量方法(例如蛋白質印跡，免疫染色等)進行評估。肌營養不良蛋白的抗體可商購的，或者如果需要，可以開發用於所希望的目的。
可以評估DMD寡核苷酸介導穩定恢復蛋白質產生的能力。在非限制性實例中，可以在血清和組織穩定性的測定中測試恢復的蛋白質的穩定性。
可以評估DMD寡核苷酸結合蛋白質(如白蛋白)的能力。示例性相關技術包括例如在WO 2017/015555、WO 2017/015575等中描述的那些。
可以評估DMD寡核苷酸的免疫活性，例如藉由細胞介素活化、補體活化、TLR9活性等的測定。示例性相關技術包括例如在WO 2017/015555、WO 2017/015575、WO 2017/192679、WO 2017/210647等中描述的那些。
在一些實施方式中，可以在以下測試DMD寡核苷酸的功效，例如，電腦分析和預測、無細胞提取物、用人工構建體轉染的細胞、動物(如具有人肌營養不良蛋白轉基因或其部分的小鼠)、正常和營養不良的人肌源性細胞系、和/或臨床試驗。可能需要利用一種以上的測定，因為正常和營養不良的人肌源性細胞系有時在某些條件下可產生不同的功效結果(Mitrpant等人2009 Mol.Ther.[分子理論]17：1418)。
在一些實施方式中，可以在細胞中體外測試DMD寡核苷酸。在一些實施方式中，在細胞中體外測試涉及一種或多種DMD寡核苷酸的體外遞送，或使用遞送劑或轉染子的遞送，其中許多係本領域已知的並且可以依照本揭露使用。
在一些實施方式中，可以在正常人骨骼肌細胞(hSkMC)中體外測試DMD寡核苷酸。參見，例如，Arechavala等人2007 Hum.Gene Ther.[人類基因療法]18：798-810。
在一些實施方式中，可以在來自DMD患者的肌肉外植體中測試DMD寡核苷酸。來自DMD患者的肌肉外植體報導於例如，Fletcher等人2006 J.Gene Med.[基因醫學雜誌]8：207-216；McClorey等人2006 Neur.Dis.[臨床神經 學]16：583-590；以及Arechavala等人2007 Hum.Gene Ther.[人類基因療法]18：798-810。
在一些實施方式中，細胞係或包含來自DMD患者的培養的肌肉細胞。參見，例如：Aartsma-Rus等人2003 Hum.Mol.Genet.[人類基因療法]8：907-914。
在一些實施方式中，單個DMD寡核苷酸可以證明在某些情況下其跳讀外顯子51或53能力的實驗與實驗間變化性。在一些實施方式中，取決於使用哪種細胞、生長條件和其他實驗因子，單獨的DMD寡核苷酸可以證明其跳讀外顯子51或53的能力的可變性。為了控制變異，通常在相同或基本相同的條件下測定待測試的DMD寡核苷酸和對照DMD寡核苷酸。
體外實驗還包括用患者來源的成肌細胞進行的那些。本文描述了來自該等實驗的某些結果。在某些此類實驗中，將細胞在骨骼生長培養基中培養以使它們保持在分裂/未成熟的成肌細胞狀態。然後將培養基更換為「分化」培養基(含有胰島素和2%馬血清)，同時在培養基中添加DMD寡核苷酸用於給藥。細胞分化為肌管，因為它們被給藥一段合適的時間，例如，RNA實驗總共4d以及蛋白質實驗總共6d(這種條件稱為'0d預分化'(RNA為0d+4d，蛋白質為0d+6d))。
不希望受任何特定理論的束縛，本揭露指出，可能需要知道DMD寡核苷酸是否能夠進入成熟肌管並誘導該等細胞以及「未成熟」細胞中的跳讀。在一些實施方式中，本揭露提供了測試DMD寡核苷酸在肌管中的作用的測定。在一些實施方式中，使用不同於'0d預分化'的給藥方案，其中將成肌細胞在分化培養基中預分化成肌管持續數天(4d或7d或10d)，然後給予DMD寡核苷酸。某些相關的方案在示例19中描述。
在一些實施方式中，本揭露證明，在預分化實驗中，DMD寡核苷酸(不包括為PMO的那些)通常產生約相同水平的RNA跳讀和肌營養不良蛋白 質恢復，而不管給藥前的分化培養基中細胞培養的天數。在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸，該DMD寡核苷酸能夠進入成肌細胞和肌管中並且在成肌細胞和肌管中有活性。在一些實施方式中，在△45-52 DMD患者細胞(也稱為D45-52或del45-52)或△52 DMD患者細胞(也稱為D52或del52)中體外測試DMD寡核苷酸，具有0、4或7天的預分化。
在一些實施方式中，DMD寡核苷酸可以在各種動物模型中的任何一種或多種中進行測試，該等動物模型包括非哺乳動物和哺乳動物模型；作為非限制性實例，包括新桿狀線蟲屬(Caenorhabditis)、果蠅屬(Drosophila)、斑馬魚、小鼠、大鼠、貓、狗和豬。參見，例如，McGreevey等人2015 Dis.Mod.Mech.[疾病模型和機制]8：195-213中的綜述。
mdx小鼠的實例用途報導在，例如：Lu等人2003 Nat.Med.[自然醫學]9：1009；Jearawiriyapaisarn等人2008 Mol.Ther.[分子療法]，16,1624-1629；Yin等人2008 Hum.Mol.Genet.[人類分子遺傳學]，17,3909-3918；Wu等人2009 Mol.Ther.[分子療法]，17,864-871；Wu等人2008 Proc.Natl Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]，105,14814-14819；Mann等人2001 Proc.Nat.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]98：42-47；以及Gebski等人2003 Hum.Mol.Gen.[人類基因療法]12：1801-1811中。
可以在狗中測試DMD寡核苷酸的功效，如，金毛獵犬肌肉營養不良(GRMD)動物模型。Lu等人2005 Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]102：198-203；Alter等人2006 Nat.Med.[自然醫學]12：175-7；McClorey等人2006 Gene Ther.[基因療法]13：1373-81；以及Yokota等人2012 Nucl.Acid Ther.[核算療法]22：306。
可以在測試動物體內評估DMD寡核苷酸有效遞送至各種組織(例如，骨骼、心臟和/或膈肌)；在非限制性實例中，這可以藉由雜交ELISA和動物組織中的分佈測試來測試。
可以在測試動物體內評估DMD寡核苷酸的血漿PK；作為非限制性實例，這可以藉由測定AUC(曲線下面積)和半衰期來測試。
在一些實施方式中，可以經由肌肉內給予至測試動物的肌肉在體內測試DMD寡核苷酸。
在一些實施方式中，可以經由肌肉內給予進入測試動物的腓腸肌中體內測試DMD寡核苷酸。
在一些實施方式中，可以經由肌肉內給予進入小鼠的腓腸肌中體內測試DMD寡核苷酸。
在一些實施方式中，可以經由肌肉內給予進入小鼠模型(轉基因整個人肌營養不良蛋白基因座)的腓腸肌中體內測試DMD寡核苷酸。參見，例如：Bremmer-Bout等人2004 Mol.Ther.[分子療法]10,232-240。
可以進行另外的測試來評估DMO DMD寡核苷酸(包括中心成核纖維計數和肌營養不良蛋白陽性纖維計數、以及功能性握力分析)的功效。作為非限制性實例，參見以下報導的實驗方案：Yin等人2009 Hum.Mol.Genet.[人類分子遺傳學]18：4405-4414。
作為非限制性實例，測試DMD寡核苷酸的另外的方法包括以下中報導的方法：Kinali等人2009 Lancet[柳葉刀]8：918；Bertoni等人2003 Hum.Mol.Gen.[人類分子遺傳學]12：1087-1099。
寡核苷酸和組成物的某些示例
在一些實施方式中，本揭露提供了可用於各種目的的DMD寡核苷酸和/或DMD寡核苷酸組成物，該等目的例如，調節跳讀、降低水平的DMD轉錄 物、改善水平的有益蛋白質、治療病症、疾病和障礙等。在一些實施方式中，本揭露提供了具有改進的特性(例如，增加的外顯子51或53的跳讀、減少的毒性等)的DMD寡核苷酸組成物。除其他事項之外，本揭露的DMD寡核苷酸包含化學修飾、立體化學、和/或及組合，該等修飾可以改善DMD寡核苷酸的各種特性和活性。表A1中列出了非限制性實例。在一些實施方式中，DMD寡核苷酸類型係如表A1中的DMD寡核苷酸的鹼基序列、骨架連接的模式、骨架手性中心的模式、和骨架磷修飾的模式定義的類型，其中DMD寡核苷酸包含至少一個手性受控的核苷酸間鍵(「立體化學/鍵」中的至少一個R或S)。
在一些實施方式中，本揭露涉及本文所述(例如，在表A1中)的DMD寡核苷酸。
在下表中，ID指示鑒定或DMD寡核苷酸編號；並且描述指示修飾的序列。
Figure 108116317-A0202-12-0074-9
Figure 108116317-A0202-12-0075-10
Figure 108116317-A0202-12-0076-11
Figure 108116317-A0202-12-0077-12
Figure 108116317-A0202-12-0078-13
Figure 108116317-A0202-12-0079-14
Figure 108116317-A0202-12-0080-15
Figure 108116317-A0202-12-0081-16
Figure 108116317-A0202-12-0082-18
在表A1中：
表A1中的空格用於格式和可讀性，例如，OXXXXX XXXXX XXXXX XXXX說明了與OXXXXXXXXXXXXXXXXXXX相同的立體化學；*S和*S均指示硫代磷酸酯核苷酸間鍵，其中連接磷具有Sp構型；等。
表A1中列出的所有DMD寡核苷酸係單股的。如本申請中所述，它們可以用作單股，或用作與一條或多條其他鏈形成複合物的股。
由於它們的長度，一些序列被分成多行。
ID：寡核苷酸的標識號。
WV-13405、WV-13406和WV-13407係完全PMO(
Figure 108116317-A0202-12-0082-57
啉代寡核苷酸)。
表中的縮寫： n001：非負電荷的鍵
Figure 108116317-A0202-12-0083-21
(除非另有說明，否則其係立體隨機(例 如，作為n001R、或n001S))；n001R：為手性受控的並且具有Rp構型的n001；n001S：為手性受控的並且具有Sp構型的n001；nX：以鍵/立體化學，nO或nX指示立體隨機n001；nR：以鍵/立體化學，nR指示為手性受控的並且具有Rp構型的n001；nS：以鍵/立體化學，nS指示為手性受控的並且具有Sp構型的n001； F，f：在以下核苷(例如，fA(
Figure 108116317-A0202-12-0083-374
，其中BA係核鹼基A))上的 2'-F修飾； m：在以下核苷(例如，mA(
Figure 108116317-A0202-12-0083-375
，其中BA係核鹼基A))上的2'- OMe修飾；*，PS：硫代磷酸酯；*R、R、Rp：以Rp構象的硫代磷酸酯；*S、S、Sp：以Sp構象的硫代磷酸酯；X：立體隨機的硫代磷酸酯；O、PO：磷酸二酯(磷酸酯)。當在兩個核苷單元之間未指定核苷間鍵時，核苷間鍵係磷酸二酯鍵(天然磷酸酯鍵)。
在一些實施方式中，DMD寡核苷酸的每個硫代磷酸酯核苷酸間鍵獨立地是手性受控的核苷酸間鍵。在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸組成物係表A1中列出的DMD寡核苷酸類型的手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其 中DMD寡核苷酸的每個硫代磷酸酯核苷酸間鍵獨立地是手性受控的核苷酸間鍵。
在一些實施方式中，本揭露提供了組成物包含多個提供的DMD寡核苷酸(例如，手性受控的DMD寡核苷酸組成物)或由其組成。在一些實施方式中，多個DMD寡核苷酸的所有係相同的類型，所有均具有相同的鹼基序列、骨架連接的模式、骨架手性中心的模式、和骨架磷修飾的模式。在一些實施方式中，相同的類型的所有DMD寡核苷酸在結構上相同。在一些實施方式中，提供的組成物包含多種DMD寡核苷酸類型的DMD寡核苷酸，通常以受控制的量。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸組成物包含兩個或更多個提供的DMD寡核苷酸類型的組合。
在一些實施方式中，本揭露的DMD寡核苷酸組成物係手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中多個DMD寡核苷酸的其序列包含表A1中列出的鹼基序列或由其組成。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-13405。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-13405。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-13406。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-13407。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-13826。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-13827。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-13835。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-13835。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-13864。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-14344。
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在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20133。
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在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20135。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20136。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20137。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20138。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20139。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20140。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-13835。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-13864。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-14344。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸WV-13835的手性受控的組成物。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸WV-13864的手性受控的組成物。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸WV-14344的手性受控的組成物。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-13405。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-13406。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-13407。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-13826。
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在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-13835。
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在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-14344。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-14522。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-14523。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-14791。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-15860。
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在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-17859。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-17860。
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在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20093。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20094。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20095。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20096。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20097。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20098。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20099。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20100。
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在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20105。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20106。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20107。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20108。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20109。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20110。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20111。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20112。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20113。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20114。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20115。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20116。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20117。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20118。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20119。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20120。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20121。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20122。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20123。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20124。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20125。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20126。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20127。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20128。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20129。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20130。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20131。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20132。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20133。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20134。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20135。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20136。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20137。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20138。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20139。
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸係WV-20140。
在一些實施方式中，這樣提供的寡核苷酸組成物可以是手性受控的，並且包含多個寡核苷酸，其中一個或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個)核苷酸間鍵係手性受控的。在一些實施方式中，每個手性核苷酸間鍵獨立地是手性受控的。在一些實施方式中，手性受控的核苷酸間鍵係一個S、R、nR或nS，如表A1中的「鍵/立體化學」所示。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-13405。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-13406。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-13407。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-13826。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-13827。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-13835。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-13864。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-14344。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-14522。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-14523。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-14791。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-15860。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-15861。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-15862。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-17859。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-17860。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-17861。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-17862。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-17863。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-17864。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-17865。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-17866。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20034。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20037。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20040。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20043。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20046。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20049。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20050。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20051。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20052。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20053。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20054。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20055。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20056。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20057。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20058。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20059。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20060。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20061。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20062。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20063。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20064。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20065。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20066。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20067。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20067。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20068。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20069。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20070。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20071。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20072。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20073。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20074。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20075。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20076。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20076。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20077。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20078。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20079。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20080。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20081。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20082。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20083。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20084。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20085。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20086。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20087。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20088。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20089。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20090。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20091。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20092。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20093。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20094。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20095。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20096。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20097。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20098。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20099。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20100。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20101。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20102。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20103。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20104。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20105。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20106。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20107。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20108。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20109。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20110。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20111。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20112。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20113。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20114。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20115。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20116。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20117。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20118。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20119。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20120。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20121。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20122。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20123。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20124。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20125。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20126。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20127。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20128。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20129。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20130。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20131。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20132。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20133。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20134。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20135。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20136。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20137。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20138。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20139。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸組成物能夠介導DMD外顯子的跳讀，並且DMD寡核苷酸係WV-20140。
在一些實驗中，提供的DMD寡核苷酸可以提供出人意料地高的外顯子51或53的跳讀，例如，當與曲薩珀森(Drisapersen)和/或依普勒森(Eteplirsen)中的那些相比時。例如，與曲薩珀森和/或依普勒森相比，各種手性受控的DMD 寡核苷酸組成物每個顯示出介導肌營養不良蛋白中外顯子51或53的跳讀的優異的能力(在一些實施方式中高出很多倍)。本揭露中作為實例提供了某些數據。
在一些實施方式中，當在小鼠中測定實例DMD寡核苷酸時，藉由以測試量(例如，10mg/kg、30mg/kg等)經由尾靜脈在雄性C57BL/10ScSndmdmdx小鼠(4-5週齡)中靜脈注射DMD寡核苷酸。在一些實施方式中，在測試時間(例如在注射後的例如第2、7和/或14天等)收穫組織，在一些實施方式中，在液氮中新鮮冷凍並儲存在-80℃直至分析。
依照本揭露，可以使用各種測定來評估DMD寡核苷酸水平。在一些實施方式中，使用測試品系列稀釋作為標準曲線，使用雜交-ELISA來定量組織中的DMD寡核苷酸水平：例如，在示例程序中，將馬來酸酐活化的96孔板(皮爾斯公司(Pierce)15110)用50μl的捕獲探針在500nM在2.5% NaHCO3(Gibco公司，25080-094)中在37℃塗覆2小時。然後將板用PBST(PBS+0.1% Tween-20)洗滌3次，並用5%無脂乳-PBST在37℃封閉1小時。測試品DMD寡核苷酸連續稀釋到基質中。將該標準品與原始樣品一起用裂解緩衝液(4M胍；0.33% N-月桂基肌胺酸；25mM檸檬酸鈉；10mM DTT)稀釋，使得所有樣品中的DMD寡核苷酸量小於100ng/mL。將20μl的稀釋的樣品與PBST中稀釋的180μl的333nM檢測探針混合，然後在PCR機器(65℃ 10min，95℃ 15min，4℃ ∞)中變性。50μl變性的樣品在封閉的ELISA板中一式三份進行分配，並在4℃孵育過夜。在3次PBST洗滌後，添加PBST中的1：2000鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)-AP(50μl每孔)，並在室溫孵育1小時。用PBST充分洗滌後，添加100μl的AttoPhos(普洛麥格公司(Promega)S1000)，在室溫在黑暗中孵育10min，並在平板讀數器(分子儀器公司(Molecular Device)，M5)上讀取螢光通道：Ex435nm、Em555nm。藉由4-參數回歸根據標準曲線計算樣品中的寡核苷酸。
在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸在血漿和組織勻漿中都是穩定的。
用於外顯子51的外顯子跳讀的示例肌營養不良蛋白寡核苷酸和組成物
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸、DMD寡核苷酸組成物、及使用其用於介導DMD(例如，小鼠、人的等)中的外顯子51的跳讀的方法。
在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸和/或組成物能夠介導外顯子51的跳讀。
在一些實施方式中，此類DMD寡核苷酸和組成物的非限制性實例包括以下那些：WV-12494、WV-12130、WV-12131、WV-12132、WV-12133、WV-12134、WV-12135、WV-12136、WV-12496、WV-12495、WV-12123、WV-12124、WV-12125、WV-12126、WV-12127、WV-12128、WV-12129、WV-12553、WV-12554、WV-12555、WV-12556、WV-12557、WV-12558、WV-12559、WV-12872、WV-12873、WV-12876、WV-12877、WV-12878、WV-12879、WV-12880、WV-12881、WV-12882、WV-12883、WV-3152、WV-15860、WV-20034、WV-20037、WV-20040、WV-20043、WV-20046、WV-20049、WV-20050、WV-20051、WV-20052、WV-20053、WV-20054、WV-20055、WV-20056、WV-20057、WV-20058、WV-20059、WV-20060、WV-20061、WV-20062、WV-20063、WV-20064、WV-20065、WV-20066、WV-20067、WV-20068、WV-20069、WV-20070、WV-20071、WV-20072、WV-20073、WV-20074、WV-20075、WV-20076、WV-20077、WV-20078、WV-20079、WV-20080、WV-20081、WV-20082、WV-20083、WV-20084、WV-20085、WV-20086、WV-20087、WV-20088、WV-20089、WV-20090、WV-20091、WV-20092、WV-20093、WV-20094、WV-20095、WV-20096、WV-20097、WV-20098、WV-20099、WV-20100、WV-20101、WV-20102、WV-20103、 WV-20104、WV-20105、WV-20106、WV-20107、WV-20108、WV-20109、WV-20110、WV-20111、WV-20112、WV-20113、WV-20114、WV-20115、WV-20116、WV-20117、WV-20118、WV-20119、WV-20120、WV-20121、WV-20122、WV-20123、WV-20124、WV-20125、WV-20126、WV-20127、WV-20128、WV-20129、WV-20130、WV-20131、WV-20132、WV-20133、WV-20134、WV-20135、WV-20136、WV-20137、WV-20138、WV-20139、WV-20140、以及具有鹼基序列(包含任何該等DMD寡核苷酸的至少15個連續鹼基)的其他DMD寡核苷酸。
在一些實施方式中，外顯子51跳讀的目的地區域的序列在小鼠和人之間不同。
依照本揭露，可以使用各種測定來評估用於外顯子跳讀的DMD寡核苷酸。在一些實施方式中，為了測試用於人中的外顯子51跳讀的DMD寡核苷酸的化學和立體化學的特定組合的功效，可以製備具有小鼠序列的相應DMD寡核苷酸，然後在小鼠中進行測試。本揭露認識到在外顯子51的人和小鼠同源物中存在一些差異(下面加底線)：M GTGGTTACTAAGGAAACTGTCATCTCCAAACTAGAAATGCCATCTTCTTTGCTGTTGGAG H GTGGTTACTAAGGAAACTGCCATCTCCAAACTAGAAATGCCATCTTCCTTGATGTTGGAG
其中M係小鼠，nt 7571-7630；並且H係人，nt 7665-7724。
由於該等差異，可以製備用於跳讀外顯子51的稍微不同的DMD寡核苷酸用於在小鼠和人中進行測試。作為非限制性實例，以下DMD寡核苷酸序列可用於人和小鼠中的測試：人DMD寡核苷酸序列：UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU
小鼠DMD寡核苷酸序列：GCAAAGAAGAUGGCAUUUCU
對人與小鼠之間的錯配加底線。
可以用鹼基序列(例如，UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU)、以及特定的化學模式、核苷酸間鍵、立體化學、和另外的化學部分(如果有的話)的特定組合來構建旨在用於治療人受試者的DMD寡核苷酸。可以在人細胞中體外測試或在人受試者體內測試這種DMD寡核苷酸，但是例如在小鼠中測試可能具有有限的適應性，因為兩者的鹼基序列具有錯配。
可以用對應的小鼠鹼基序列(GCAAAGAAGAUGGCAUUUCU)和相同的化學模式、核苷酸間鍵、立體化學、和另外的化學部分(如果有的話)構建對應的DMD寡核苷酸。可以在小鼠體內測試這種DMD寡核苷酸。構建並測試了包含小鼠鹼基序列的若干種DMD寡核苷酸。
在一些實施方式中，可以在小鼠中測試人DMD外顯子跳讀DMD寡核苷酸，已經將該DMD寡核苷酸進行修飾以包含DMD基因(包含人序列)。
本文描述了包含各種模式修飾的各種DMD寡核苷酸。以下表顯示某些DMD寡核苷酸的測試結果。通常，數字指定跳讀的量，其中100指示100%跳讀，並且0表示沒有跳讀，除非另有說明。為了測定DMD的外顯子跳讀，將DMD寡核苷酸在△52人患者衍生的成肌細胞和/或△45-52人患者衍生的成肌細胞(人細胞，其中外顯子52或外顯子45-52已經被刪除)體外測試。除非另有說明，否則在各種實驗中，DMD寡核苷酸在體外(gymnotically)遞送。
Figure 108116317-A0202-12-0124-24
Figure 108116317-A0202-12-0125-23
Figure 108116317-A0202-12-0125-26
Figure 108116317-A0202-12-0126-27
Figure 108116317-A0202-12-0126-376
Figure 108116317-A0202-12-0127-29
Figure 108116317-A0202-12-0127-30
Figure 108116317-A0202-12-0128-31
Figure 108116317-A0202-12-0128-32
Figure 108116317-A0202-12-0129-33
Figure 108116317-A0202-12-0129-34
Figure 108116317-A0202-12-0130-35
[表4D].某些DMD寡核苷酸的活性在自由攝取條件下，將在分化培養基中的寡核苷酸給予患者衍生的△48-50細胞持續4天。藉由基於珠的提取收穫來自24WP的RNA。將DMD'跳讀'的TaqMan訊號和DMD'總'轉錄物標準化為SFSR9內部對照。
Figure 108116317-A0202-12-0131-36
[表4E.]某些DMD寡核苷酸的活性
Figure 108116317-A0202-12-0132-37
Figure 108116317-A0202-12-0133-38
Figure 108116317-A0202-12-0133-39
Figure 108116317-A0202-12-0134-40
[表4G].某些DMD寡核苷酸的活性將△48-50細胞在游離攝取條件下用10uM寡核苷酸在分化培養基中處理4天。用安捷倫基於珠的方案提取RNA，並用隨機六聚體逆轉錄。TaqMan測定針對總DMD轉錄物或對應於跳讀的轉錄物的外顯子連接，每個都與hSFSR9內部對照多重運行。
Figure 108116317-A0202-12-0135-41
Figure 108116317-A0202-12-0136-42
用於外顯子53的外顯子跳讀的示例肌營養不良蛋白寡核苷酸和組成物
在一些實施方式中，本揭露提供了DMD寡核苷酸、DMD寡核苷酸組成物、及使用其用於介導(例如，小鼠、人等的)DMD中的外顯子53的跳讀的方法。
在一些實施方式中，可以在小鼠中測試DMD寡核苷酸(例如，人DMD外顯子53跳讀DMD寡核苷酸)，已經將該DMD寡核苷酸進行修飾以包含DMD基因(包含人外顯子53序列)。
在一些實施方式中，DMD寡核苷酸(例如，DMD寡核苷酸)能夠介導外顯子53的跳讀。此類DMD寡核苷酸的非限制性實例包括：WV-12880、WV-13826、WV-13827、WV-14791、WV-9517、WV-13835、WV-13864、WV-14344、以及具有鹼基序列(包含任何該等DMD寡核苷酸的至少15個連續鹼基)的DMD寡核苷酸。
本揭露中描述了用於跳讀肌營養不良蛋白外顯子53的各種實驗的結果。例如，來自序列識別篩選的數據在以下表5中顯示。
測試另外的DMD寡核苷酸其介導DMD外顯子的跳讀的能力(如以下顯示)。完全PMO(
Figure 108116317-A0202-12-0136-58
啉代)DMD寡核苷酸具有以下序列：
Figure 108116317-A0202-12-0136-43
WV-13407還被指定為PMO NS。
[表5].某些DMD寡核苷酸的示例數據。
Figure 108116317-A0202-12-0137-44
Figure 108116317-A0202-12-0137-45
Figure 108116317-A0202-12-0138-46
Figure 108116317-A0202-12-0138-47
Figure 108116317-A0202-12-0139-48
在高達30uM的多種濃度測試若干種DMD寡核苷酸(包括WV-9517、WV-13864、WV-13835、和WV-14791)用於體外在HEK-藍-TLR9細胞(HEK-blue-TLR9 cell)(16小時體外攝取)的TLR9活化。WV-13864和WV-14791包含以Rp構型的手性受控的非負電荷的核苷酸間鍵。WV-9517、WV-13864、WV-13835、和WV-14791不展示顯著的TLR9活化(小於2-倍TLR9誘導；數據未顯示)。與水相比，WV-13864和WV-14791在PBMC細胞介素釋放測定中也展示出高達30uM的可忽略訊號(數據未顯示)。
用於製備寡核苷酸和組成物的示例方法
除其他事項之外，本揭露提供了用於製備寡核苷酸和寡核苷酸組成物(包括手性受控的寡核苷酸和手性受控的寡核苷酸核苷酸)的技術(方法、試劑、條件、純化方法等)。如本文所述，可以利用各種技術(方法、試劑、病症、純化方法等)來製備依照本揭露提供的寡核苷酸及其組成物，該等技術包括但不限於以下描述的那些：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO 2018/237194、和/或WO 2019/055951，其每個的製備技術藉由引用結合在此。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的寡核苷酸，例如，手性受控的DMD寡核苷酸。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過50%。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過約55%。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過約60%。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過約65%。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過約70%。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過約75%。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過約80%。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過約85%。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過約90%。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過約91%。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過約92%。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過約93%。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過約94%。在一些實施方式中，提供的手性受控的 DMD寡核苷酸的純度超過約95%。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過約96%。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過約97%。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過約98%。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過約99%。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過約99.5%。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過約99.6%。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過約99.7%。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過約99.8%。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過約99.9%。在一些實施方式中，提供的手性受控的DMD寡核苷酸的純度超過至少約99%。
在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物(例如，手性受控的DMD寡核苷酸組成物)係設計為包含單個寡核苷酸類型的組成物。在某些實施方式中，此類組成物係約50%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約50%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約50%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約55%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約60%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約65%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約70%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約75%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約80%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約85%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約90%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約91%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約92%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約93%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此 類組成物係約94%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約95%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約96%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約97%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約98%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約99%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約99.5%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約99.6%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約99.7%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約99.8%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係約99.9%非鏡像異構物純的。在一些實施方式中，此類組成物係至少約99%非鏡像異構物純的。
除其他事項之外，本揭露認識到寡核苷酸(例如，DMD寡核苷酸)的立體選擇性(而非立體隨機或外消旋)製備的挑戰。除其他事項之外，本揭露提供了立體選擇性製備包含多個(例如，超過5、6、7、8、9、或10)核苷酸間鍵的寡核苷酸，並且特別地包含多個(例如，超過5、6、7、8、9、或10)手性核苷酸間鍵的DMD寡核苷酸的方法和試劑。在一些實施方式中，在寡核苷酸(如DMD寡核苷酸)的立體隨機或外消旋製劑中，形成具有小於90：10、95：5、96：4、97：3、或98：2非鏡像異構選擇性的至少一個手性核苷酸間鍵。在一些實施方式中，對於立體選擇性或手性受控的寡核苷酸(如DMD寡核苷酸)的製備，形成具有大於90：10、95：5、96：4、97：3、或98：2非鏡像異構選擇性的每個手性核苷酸間鍵。在一些實施方式中，對於立體選擇性或手性受控的DMD寡核苷酸的製備，形成具有大於95：5非鏡像異構選擇性的每個手性核苷酸間鍵。在一些實施方式中，對於立體選擇性或手性受控的DMD寡核苷酸的製備，形成具有大於96：4非鏡像異構選擇性的每個手性核苷酸間鍵。在一些實施方式中，對於立體選擇性或手性受控的DMD寡核苷酸的製備，形成具有大於97：3非鏡像異構選 擇性的每個手性核苷酸間鍵。在一些實施方式中，對於立體選擇性或手性受控的DMD寡核苷酸的製備，形成具有大於98：2非鏡像異構選擇性的每個手性核苷酸間鍵。在一些實施方式中，對於立體選擇性或手性受控的DMD寡核苷酸的製備，形成具有大於99：1非鏡像異構選擇性的每個手性核苷酸間鍵。在一些實施方式中，寡核苷酸中(例如，DMD寡核苷酸)中的手性核苷間鍵的非鏡像異構選擇性可藉由模型反應測量，例如在基本上相同或相當的條件下形成二聚體，其中二聚體與手性核苷間鍵具有相同的核苷酸間鍵、二聚體的5'-核苷與手性核苷酸間鍵的5'-端的核苷相同、二聚體的3'-核苷與手性核苷酸間鍵的3'-端的核苷相同。
在一些實施方式中，手性受控的DMD寡核苷酸組成物係設計為包含多種DMD寡核苷酸類型的組成物。在一些實施方式中，本揭露的方法允許產生手性受控的DMD寡核苷酸文庫，使得預選量的任何一種或多種手性受控的DMD寡核苷酸類型可以與任何一種或多種其他手性受控的DMD寡核苷酸類型混合，以產生手性受控的DMD寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，預選量的DMD寡核苷酸類型係具有任一種上述非鏡像異構物純度的組成物。
在一些實施方式中，本揭露提供了用於製得手性受控的寡核苷酸(例如，DMD寡核苷酸)之方法，該方法包括以下步驟：(1)偶合；(2)加帽；(3)視需要修飾；(4)去封閉；以及(5)重複步驟(1)-(4)，直至實現所希望的長度。
在一些實施方式中，本揭露提供了例如，用於製備DMD寡核苷酸之方法，該方法包括一個或多個循環，每個訓話獨立地包含：(1)偶合步驟； (2)視需要預修飾加帽步驟；(3)修飾步驟；(4)視需要後修飾加帽步驟；以及(5)視需要去封閉步驟。
在一些實施方式中，循環包含一個或多個預修飾加帽步驟。在一些實施方式中，循環包含一個或多個後修飾加帽步驟。在一些實施方式中，循環包含一個或多個預修飾和後修飾加帽步驟。在一些實施方式中，循環包含一個或多個去封閉步驟。在一些實施方式中，循環包含偶合步驟、預修飾加帽步驟、修飾步驟、後修飾加帽步驟、和去封閉步驟。在一些實施方式中，循環包含偶合步驟、預修飾加帽步驟、修飾步驟、和去封閉步驟。在一些實施方式中，循環包含偶合步驟、修飾步驟、後修飾加帽步驟、和去封閉步驟。在一些實施方式中，包含偶合步驟、預修飾加帽步驟、修飾步驟、後修飾加帽步驟、和去封閉步驟。在一些實施方式中，一個或多個循環包含偶合步驟、預修飾加帽步驟、修飾步驟、和去封閉步驟。在一些實施方式中，一個或多個循環包含偶合步驟、修飾步驟、後修飾加帽步驟和去封閉步驟。
當描述所提供的方法時，「循環」一詞具有熟悉該項技術者所理解的普通含義。在一些實施方式中，步驟(1)-(4)的一個輪回稱為循環。在一些實施方式中，一些循環包含修飾。在一些實施方式中，一些循環不包含修飾。在一些實施方式中，一些循環包含並且一些循環不包含修飾。在一些實施方式中，每個循環獨立地包含修飾步驟。在一些實施方式中，每個循環不包含循環步驟。
在一些實施方式中，為了形成手性受控的核苷酸間鍵，利用包含手性助劑的手性純的亞磷醯胺來立體選擇性地形成手性受控的核苷酸間鍵。可以依照本揭露，利用各種亞磷醯胺和手性助劑，例如，一下中描述的那些：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO 2018/237194、和/或WO 2019/055951，其每個的亞磷醯胺和手性助劑藉由引用結合在此。
在一些實施方式中，這種核苷酸間鍵係中性核苷酸間鍵。在一些實施方式中，這種核苷酸間鍵係手性受控的核苷酸間鍵。在一些實施方式中，這種核苷酸間鍵包含手性助劑部分。在一些實施方式中，這種核苷酸間鍵包含無手性助劑部分。在一些實施方式中，手性助劑部分在修飾期間脫落。
提供的技術提供各種優點。除其他事項之外，如本文所證明的，所提供的技術可以極大地改善寡核苷酸合成粗品純度和產率，特別是對於修飾的和/或手性純的寡核苷酸(如，DMD寡核苷酸)，其提供對治療目的而言至關重要的許多性質和活性。由於能夠為治療上重要的DMD寡核苷酸提供出乎意料的粗品純度和產率，提供的技術可以顯著降低製造成本(藉由例如簡化的純化、大大提高總產率等)。在一些實施方式中，所提供的技術可以容易地按比例放大以產生用於臨床目的的足夠數量和品質的DMD寡核苷酸。在一些實施方式中，包含在G2中包含吸電子基團的手性助劑(例如，PSM手性助劑)的提供的技術特別可用於製備包含P-N鍵的手性受控的核苷酸間鍵(例如，非負電荷的核苷酸間鍵，如n001)，並且可以顯著簡化製造操作、降低成本和/或促進下游形成。
在一些實施方式中，提供的技術提供了改進的試劑相容性。例如，如本揭露所證明的，所提供的技術提供了使用不同試劑系統進行氧化、硫化和/或疊氮化物反應的靈活性，特別是對於手性受控的DMD寡核苷酸合成。
除其他事項之外，本揭露提供了高粗品純度的DMD寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，本揭露提供了高粗品純度的手性受控的DMD寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，本揭露提供了高粗品純度的手性受控的DMD寡核 苷酸。在一些實施方式中，本揭露提供了高粗品純度和/或高立體純度的DMD寡核苷酸。
支持物和接頭
在一些實施方式中，可以再溶液中製備寡核苷酸。在一些實施方式中，可以使用支持物製備寡核苷酸。在一些實施方式中，使用固體支持物製備寡核苷酸。可以依照本揭露利用的合適的支持物包括，例如，以下中描述的固體支持物：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO 2018/237194、和/或WO 2019/055951，其每個的固體支持物藉由引用結合在此。
在一些實施方式中，利用接頭部分在合成期間將寡核苷酸鏈連接至支持物。合適的接頭在本領域中廣泛地利用，並且包括以下中描述的那些：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO 2018/237194、和/或WO 2019/055951，其每個的接頭藉由引用結合在此。
在一些實施方式中，連接部分係琥珀醯胺酸接頭、或琥珀酸酯接頭(-CO-CH2-CH2-CO-)、或草醯基接頭(-CO-CO-)。在一些實施方式中，連接部分和核苷藉由酯鍵而鍵合在一起。在一些實施方式中，連接部分和核苷藉由醯胺鍵而鍵合在一起。在一些實施方式中，連接部分將核苷與另外的核苷酸或核酸連接。合適的接頭描述於，例如，Oligonucleotides And Analogues A Practical Approach[寡核苷酸和類似物實用的方法]，Ekstein,F.Ed.,IRL Press[IRL出版公司]，紐約，1991，章節1，以及Solid-Phase Supports for Oligonucleotide Synthesis[用 於寡核苷酸合成的固相支持物]，Pon,R.T.,Curr.Prot.Nucleic Acid Chem.[核酸化學中的當前方案]，2000,3.1.1-3.1.28。在一些實施方式中，使用通用接頭(UnyLinker)將寡核苷酸與固體支持物附接(Ravikumar等人，Org.Process Res.Dev.[有機加工研究與開發]，2008,12(3),399-410)。在一些實施方式中，使用其他通用接頭(Pon,R.T.,Curr.Prot.Nucleic Acid Chem.[核酸化學中的當前方案]，2000,3.1.1-3.1.28)。在一些實施方式中，使用各種正交接頭(如二硫化的接頭)(Pon,R.T.,Curr.Prot.Nucleic Acid Chem.[核酸化學中的當前方案]，2000,3.1.1-3.1.28)。
除其他事項之外，本揭露認識到可以選擇或設計接頭以與寡核苷酸合成中採用的一組反應條件相容。在一些實施方式中，為了避免寡核苷酸的降解並避免脫硫，在去保護之前選擇性地去除助劑基團。在一些實施方式中，DPSE基團可以藉由F-離子選擇性地去除。在一些實施方式中，本揭露提供了在DPSE去保護條件(例如，在MeCN中的0.1M TBAF、在THF或MeCN中的0.5M HF-Et3N等)下穩定的接頭。在一些實施方式中，提供的接頭係如以下例示的接頭：
Figure 108116317-A0202-12-0147-50
溶劑
寡核苷酸的合成通常在非質子有機溶劑中進行。在一些實施方式中，溶劑係腈類溶劑，例如，乙腈。在一些實施方式中，溶劑係鹼性胺溶劑，例如，吡啶。在一些實施方式中，溶劑係醚溶劑，例如，四氫呋喃。在一些實施方式中，溶劑係鹵代烴，例如，二氯甲烷。在一些實施方式中，使用溶劑的混合物。在某些實施方式中，溶劑係任何一種或多種上述類型溶劑的混合物。
在一些實施方式中，當非質子有機溶劑不是鹼性時，在反應步驟中存在鹼。在存在鹼的一些實施方式中，鹼係胺鹼，例如，吡啶、喹啉、或N,N-二甲基苯胺。其他胺鹼的實例包括吡咯啶、哌啶、N-甲基吡咯啶、吡啶、喹啉、N,N-二甲基胺基吡啶(DMAP)、或N,N-二甲基苯胺。
在一些實施方式中，鹼不是胺鹼。
在一些實施方式中，非質子有機溶劑係無水的。在一些實施方式中，新鮮蒸餾無水非質子有機溶劑。在一些實施方式中，新鮮蒸餾的無水非質子有機溶劑係鹼性胺溶劑，例如，吡啶。在一些實施方式中，新鮮蒸餾的無水非質子有機溶劑係醚溶劑，例如，四氫呋喃。在一些實施方式中，新鮮蒸餾的無水非質子有機溶劑係腈類溶劑，例如，乙腈。
手性試劑/手性助劑
在一些實施方式中，使用手性試劑(也可稱為手性助劑)以在手性受控的寡核苷酸的產物中賦予立體選擇性。許多手性試劑(也由熟悉該項技術者和在本文中稱為手性助劑)可以依照本揭露的方法使用。此類手性試劑的實例在本文和以下中描述：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/098264、WO 2018/223056、WO 2018/237194、和/或WO 2019/055951，其每個的手性助劑藉由引用結合。
在一些實施方式中，手性試劑係具有式3-AA的化合物：
Figure 108116317-A0202-12-0149-51
 其中每個變數獨立地如本文所述。
在式3-AA的一些實施方式中，W1和W2獨立地是-NG5-、-O-、或-S-；G1、G2、G3、G4、和G5獨立地是氫，或者選自以下的視需要取代的基團：脂肪族、烷基、芳烷基、環烷基、環烷基烷基、雜脂肪族、雜環基、雜芳基、或芳基；或者G1、G2、G3、G4、和G5的兩個係G6(一起形成視需要取代的飽和的、部分不飽和的、或不飽和的高達約20個環原子的碳環或含雜原子的環，該碳環或含雜原子的環係單環或多環、稠和的或未稠和的)，並且G1、G2、G3、G4、和G5的不超過四個係G6。與具有式3-I的化合物相似，G1、G2、G3、G4、或G5的任一項視需要被側氧基、硫代、烷基、烯基、炔基、雜芳基、或芳基部分取代。在一些實施方式中，這種取代包括在手性受控的寡核苷酸產生中的立體選擇性。在一些實施方式中，含有雜原子的部分(例如，雜脂肪族、雜環基、雜芳基等)具有1-5個雜原子。在一些實施方式中，雜原子選自氮、氧、硫和矽。在一些實施方式中，至少一個雜原子係氮。在一些實施方式中，脂肪族、烷基、芳烷基、環烷基、環烷基烷基、雜脂肪族、雜環基、雜芳基、或芳基基團就1-20、1-15、1-10、1-9、1-8、1-7或1-6個碳原子。
在一些實施方式中，W1係-NG5-O-。在一些實施方式中，W1係-NG5-O-，其中-O-與-H鍵合。在一些實施方式中，W1係-NG5-。在一些實施方式中，G5以及G3和G4之一一起形成具有0-3個雜原子(除W1的氮原子之外)的視需要取代的3-10員環。在一些實施方式中，G5和G3一起形成具有0-3個雜原子(除W1的氮原子之外)的視需要取代的3-10員環。在一些實施方式中，G5和G4一起 形成具有0-3個雜原子(除W1的氮原子之外)的視需要取代的3-10員環。在一些實施方式中，形成的環係視需要取代的4、5、6、7、或8員環。在一些實施方式中，形成的環係視需要取代的4員環。在一些實施方式中，形成的環係視需要取代的5員環。在一些實施方式中，形成的環係視需要取代的6員環。在一些實施方式中，形成的環係視需要取代的7員環。
在一些實施方式中，提供的手性試劑具有
Figure 108116317-A0202-12-0150-52
的結構。在一 些實施方式中，提供的手性試劑具有
Figure 108116317-A0202-12-0150-53
的結構。在一些實施方式中，提供 的手性試劑具有
Figure 108116317-A0202-12-0150-55
的結構。在一些實施方式中，提供的手性試劑具有
Figure 108116317-A0202-12-0150-56
的結構。在一些實施方式中，提供的手性試劑具有
Figure 108116317-A0202-12-0150-54
的結構。在 一些實施方式中，提供的手性試劑具有
Figure 108116317-A0202-12-0150-59
的結構。在一些實施方式中，提 供的手性試劑具有
Figure 108116317-A0202-12-0150-57
的結構。在一些實施方式中，提供的手性試劑具有
Figure 108116317-A0202-12-0150-60
的結構。
在一些實施方式中，W1係-NG5，W2係O，每個G1和G3獨立地是氫或者選自以下的視需要取代的基團：C1-10脂肪族、雜環基、雜芳基和芳基，G2係-C(R)2Si(R)3，並且G4和G5一起形成視需要取代的飽和的、部分不飽和的、或不飽和的高達約20環原子的含雜原子的環，該含雜原子的環係單環或多環、稠和的或未稠和的。在一些實施方式中，每個R獨立地是氫，或者選自以下的視需要取代的基團：C1-C6脂肪族、碳環基、芳基、雜芳基、和雜環基。在一些實施方式中，G2係-C(R)2Si(R)3，其中-C(R)2-係視需要取代的-CH2-，並且R-Si(R)3的每個係獨立地選自以下的視需要取代的基團：C1-10脂肪族、雜環基、雜芳基和芳基。在 一些實施方式中，-Si(R)3的至少一個R獨立地是視需要取代的C1-10烷基。在一些實施方式中，-Si(R)3的至少一個R獨立地是視需要取代的苯基。在一些實施方式中，-Si(R)3的一個R獨立地是視需要取代的苯基，並且另外兩個R獨立地是視需要取代的C1-10烷基。在一些實施方式中，-Si(R)3的一個R獨立地是視需要取代的C1-10烷基，並且另外兩個R獨立地是視需要取代的苯基。在一些實施方式中，G2係視需要取代的-CH2Si(Ph)(Me)2。在一些實施方式中，G2係視需要取代的-CH2Si(Me)(Ph)2。在一些實施方式中，G2係-CH2Si(Me)(Ph)2。在一些實施方式中，G4和G5一起形成視需要取代的飽和的含有一個氮原子的5-6員環(G5附接在其上)。在一些實施方式中，G4和G5一起形成視需要取代的飽和的含有一個氮原子的5員環。在一些實施方式中，G1係氫。在一些實施方式中，G3係氫。在一些實施方式中，G1和G3均係氫。
在一些實施方式中，W1係-NG5，W2係O，每個G1和G3獨立地是R1，G2係-R1，並且G4和G5一起形成視需要取代的飽和的、部分不飽和的、或不飽和的高達約20環原子的含雜原子的環，該含雜原子的環係單環或多環、稠和的或未稠和的，其中R1係選自以下的視需要取代的基團：C1-20脂肪族、具有1-5雜原子的C1-20脂肪族、C6-20芳基、具有1-5雜原子的C5-20雜芳基、及其組合(例如，脂肪族-芳基/雜芳基、雜脂肪族-芳基/雜芳基)。在一些實施方式中，每個G1和G3獨立地是R。在一些實施方式中，每個G1和G3獨立地是-H。在一些實施方式中，G2藉由碳原子與分子的剩餘部分連接，並且碳原子被一個或多個吸電子基團取代。在一些實施方式中，G2係被一個或多個吸電子基團取代的甲基。在一些實施方式中，G2係被一個且不超過一個吸電子基團取代的甲基。在一些實施方式中，G2係被兩個或更多個吸電子基團取代的甲基。除其他事項之外，具有包含吸電子基團的G2的手性助劑可以容易地被鹼(鹼不穩定的，例如，在基本上不含水的無水條件下；在很多情況下，較佳地在包含含有此類手性助劑的核苷酸間鍵的寡核苷酸 被暴露於條件/試劑系統之前，包含大量的水，特定的在鹼(例如，使用NH4OH切割條件/試劑系統)的存在下)去除，並且提供了如本文所述各種優點，例如，高粗品純度、高產率、高立體選擇性、更簡化的操作、較少的步驟、進一步降低的製造成本、和/或更簡化的下游配製物(例如，裂解後的少量的一種或多種鹽)等。在一些實施方式中，如在實例中所示，此類助劑可以提供與其他官能基和/或保護基團的可替代的或另外的化學相容性。在一些實施方式中，如在實例中證明，鹼基不穩定的手性助劑特別可用於構建手性受控的非負電荷的核苷酸間鍵(例如，中性核苷酸間鍵，如n001)；在一些情況下，如在實例中證明，它們可以提供顯著改進的產率和/或粗品純度與高立體選擇性的，例如，當在無水條件中使用鹼基去除時使用。在一些實施方式中，這種手性助劑經由氧原子與連接磷鍵合(例如，其對應於在對應的手性助劑化合物中的-OH基團)，手性助劑中與氧鍵合的碳原子(α碳)也與-H(除了其他基團；在一些實施方式中，二級碳)鍵合，並且手性助劑中的剩餘的碳原子(β碳)與一個或兩個吸電子基團鍵合。在一些實施方式中，-W2-H係-OH。在一些實施方式中，G1係-H。在一些實施方式中，G2包含一個或兩個吸電子基團或者可以藉由鹼基促進手性助劑的去除。在一些實施方式中，G1係-H，G2包含一個或兩個吸電子基團，-W2-H係-OH。在一些實施方式中，G1係-H，G2包含一個或兩個吸電子基團，-W2-H係-OH，-W1-H係-NG5-H，並且G3和G4之一與G5一起與它們的插入原子形成如本文所述的環(例如，視需要取代的3-20員單環、二環或多環，該環具有除氮原子(G5在其上)之外的0-5雜原子(例如，視需要取代的3、4、5、或6員單環飽和的環，該環具有除氮原子之外(G5在其上)無其他雜原子))。
如熟悉該項技術者所理解的，各種吸電子基團係本領域已知的並且可以根據本揭露使用。在一些實施方式中，吸電子的基團包含和/或藉由例如，-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)(R1)-、-P(S)R1-、或-C(O)-與碳原子連接。在一些實施方式 中，吸電子基團係-CN、-NO2、鹵素、-C(O)R1、-C(O)OR'、-C(O)N(R')2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR')2、或-P(S)(R1)2。在一些實施方式中，吸電子基團係芳基或雜芳基，例如，被-CN、-NO2、鹵素、-C(O)R1、-C(O)OR'、-C(O)N(R')2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR')2、或-P(S)(R1)2的一個或多個取代的苯基。
在一些實施方式中，G2係-L'-L"-R'，其中L'係-C(R)2-或視需要取代的-CH2-，並且L"係-P(O)(R')-、-P(O)(R')O-、-P(O)(OR')-、-P(O)(OR')O-、-P(O)[N(R')]-、-P(O)[N(R')]O-、-P(O)[N(R')][N(R')]-、-P(S)(R')-、-S(O)2-、-S(O)2-、-S(O)2O-、-S(O)-、-C(O)-、-C(O)N(R')-、或-S-，其中每個R'獨立地是如本文所述的R1。在一些實施方式中，L'係-C(R)2-。在一些實施方式中，L'係視需要取代的-CH2-。
在一些實施方式中，L'係-C(R)2-。在一些實施方式中，每個R獨立地是氫，或者選自以下的視需要取代的基團：C1-C6脂肪族、碳環基、芳基、雜芳基、和雜環基。在一些實施方式中，L'係-CH2-。在一些實施方式中，L"係-P(O)(R')-、-P(S)(R')-、-S(O)2-。在一些實施方式中，G2係-L'-C(O)N(R')2。在一些實施方式中，G2係-L'-P(O)(R')2。在一些實施方式中，G2係-L'-P(S)(R')2。在一些實施方式中，每個R'獨立地是視需要取代的脂肪族、雜脂肪族、芳基、或雜芳基，如在本揭露中所述的(例如，針對R描述的那些實施方式)。在一些實施方式中，每個R'獨立地是視需要取代的苯基。在一些實施方式中，每個R'獨立地是視需要取代的苯基，其中一個或多個取代基獨立地選自-CN、-OMe、-Cl、-Br、和-F。在一些實施方式中，每個R'獨立地是取代的苯基，其中一個或多個取代基獨立地選自-CN、-OMe、-Cl、-Br、和-F。在一些實施方式中，每個R'獨立地是取代的苯基，其中取代基獨立地選自-CN、-OMe、-Cl、-Br、和-F。在一些實施方式中，每個R'獨立地是單取代的苯基，其中取代基獨立地選自-CN、-OMe、-Cl、-Br、 和-F。在一些實施方式中，兩個R'係相同的。在一些實施方式中，兩個R'係不同的。在一些實施方式中，G2係-L'-S(O)R'。在一些實施方式中，G2係-L'-C(O)N(R')2。在一些實施方式中，G2係-L'-S(O)2R'。在一些實施方式中，R'係視需要取代的脂肪族、雜脂肪族、芳基、或雜芳基，如在本揭露中所述的(例如，針對R描述的那些實施方式)。在一些實施方式中，R'係視需要取代的苯基。在一些實施方式中，R'係視需要取代的苯基，其中一個或多個取代基獨立地選自-CN、-OMe、-Cl、-Br、和-F。在一些實施方式中，R'係取代的苯基，其中一個或多個取代基獨立地選自-CN、-OMe、-Cl、-Br、和-F。在一些實施方式中，R'係取代的苯基，其中每個取代基獨立地選自-CN、-OMe、-Cl、-Br、和-F。在一些實施方式中，R'係單取代的苯基。在一些實施方式中，R'係單取代的苯基，其中取代基獨立地選自-CN、-OMe、-Cl、-Br、和-F。在一些實施方式中，取代基係吸電子基團。在一些實施方式中，吸電子基團係-CN、-NO2、鹵素、-C(O)R1、-C(O)OR'、-C(O)N(R')2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR')2、或-P(S)(R1)2。
在一些實施方式中，G2係視需要取代的-CH2-L"-R，其中每個L"和R獨立地如本揭露所描述的。在一些實施方式中，G2係視需要取代的-CH(-L"-R)2，其中每個L"和R獨立地如本揭露所描述的。在一些實施方式中，G2係視需要取代的-CH(-S-R)2。在一些實施方式中，G2係視需要取代的-CH2-S-R。在一些實施方式中，兩個R基團與它們的插入原子一起形成環。在一些實施方式中，形成的環係視需要取代的具有0-2個雜原子(除插入雜原子之外)的5、6、7員環。在一些 實施方式中，G2係視需要取代的
Figure 108116317-A0202-12-0154-61
。在一些實施方式中，G2係
Figure 108116317-A0202-12-0154-62
。 在一些實施方式中，-S-可以轉化為-S(O)-或-S(O)2-(例如，藉由氧化)，例如，以便於藉由鹼基去除。
在一些實施方式中，G2係-L'-R'，其中每個變數係如本揭露所述的。在一些實施方式中，G2係-CH2-R'。在一些實施方式中，G2係-CH(R')2。在一些實施方式中，G2係-C(R')3。在一些實施方式中，R'係視需要取代的芳基或雜芳基。在一些實施方式中，R'係取代的芳基或雜芳基，其中一個或多個取代基獨立地是吸電子基團。在一些實施方式中，-L'-係視需要取代的-CH2-，並且R'係R，其中R係視需要取代的芳基或雜芳基。在一些實施方式中，R係取代的芳基或雜芳基，其中一個或多個取代基獨立地是吸電子基團。在一些實施方式中，R係取代的芳基或雜芳基，其中每個取代基獨立地是吸電子基團。在一些實施方式中，R係被兩個或更多個取代基取代的芳基或雜芳基，其中每個取代基獨立地是吸電子基團。在一些實施方式中，吸電子基團係-CN、-NO2、鹵素、-C(O)R1、-C(O)OR'、-C(O)N(R')2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR')2、或-P(S)(R1)2。 在一些實施方式中，R'係
Figure 108116317-A0202-12-0155-64
。在一些實施方式中，R'係p-NO2Ph-。在一 些實施方式中，R'係
Figure 108116317-A0202-12-0155-69
。在一些實施方式中，R'係
Figure 108116317-A0202-12-0155-67
。在 一些實施方式中，R'係
Figure 108116317-A0202-12-0155-66
。在一些實施方式中，R'係
Figure 108116317-A0202-12-0155-70
。在一些實施方式中，R'係
Figure 108116317-A0202-12-0155-81
。在一些實施方式中，G2 係
Figure 108116317-A0202-12-0155-72
。在一些實施方式中，R'係
Figure 108116317-A0202-12-0155-80
。在一些實施方式中， R'係
Figure 108116317-A0202-12-0155-76
。在一些實施方式中，R'係2,4,6-三氯苯基。在一些實施方式 中，R'係2,4,6-三氟苯基。在一些實施方式中，G2係-CH(4-氯苯基)2。在一些實施 方式中，G2係-CH(R')2，其中每個R'係
Figure 108116317-A0202-12-0155-78
。在一些實施方式中，G2係 -CH(R')2，其中每個R'係
Figure 108116317-A0202-12-0155-79
。在一些實施方式中，R'係-C(O)R。在一 些實施方式中，R'係CH3C(O)-。
在一些實施方式中，G2係-L'-S(O)2R'，其中每個變數係如本揭露所述的。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2R'。在一些實施方式中，G2係-L'-S(O)R'，其中每個變數係如本揭露所述的。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)R'。在一些實施方式中，G2係-L'-C(O)2R'，其中每個變數係如本揭露所述的。在一些實施方式中，G2係-CH2-C(O)2R'。在一些實施方式中，G2係-L'-C(O)R'，其中每個變數係如本揭露所述的。在一些實施方式中，G2係-CH2-C(O)R'。在一些實施方式中，-L'-係視需要取代的-CH2-，並且R'係R。在一些實施方式中，R係視需要取代的芳基或雜芳基。在一些實施方式中，R係視需要取代的脂肪族。在一些實施方式中，R係視需要取代的雜脂肪族。在一些實施方式中，R係視需要取代的雜芳基。在一些實施方式中，R係視需要取代的芳基。在一些實施方式中，R係視需要取代的苯基。在一些實施方式中，R不是苯基、或單取代的、二取代的、或三取代的苯基，其中每個取代基選自-NO2、鹵素、-CN、-C1-3烷基、和C1-3烷氧基。在一些實施方式中，R係取代的芳基或雜芳基，其中一個或多個取代基獨立地是吸電子基團。在一些實施方式中，R係取代的芳基或雜芳基，其中每個取代基獨立地是吸電子基團。在一些實施方式中，R係被兩個或更多個取代基取代的芳基或雜芳基，其中每個取代基獨立地是吸電子基團。在一些實施方式中，吸電子基團係-CN、-NO2、鹵素、-C(O)R1、-C(O)OR'、-C(O)N(R')2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR')2、或-P(S)(R1)2。在一些實施方式中，R'係苯基。在一些實 施方式中，R'係取代的苯基。在一些實施方式中，R'係
Figure 108116317-A0202-12-0156-82
。在一些實施 方式中，R'係
Figure 108116317-A0202-12-0156-84
。在一些實施方式中，R'係
Figure 108116317-A0202-12-0156-83
。在一些實施 方式中，R'係視需要取代的C1-6脂肪族。在一些實施方式中，R'係三級丁基。在一些實施方式中，R'係異丙基。在一些實施方式中，R'係甲基。在一些實施方式中， G2係-CH2C(O)OMe。在一些實施方式中，G2係-CH2C(O)Ph。在一些實施方式中，G2係-CH2C(O)-tBu。
在一些實施方式中，G2係-L'-NO2。在一些實施方式中，G2係-CH2-NO2。在一些實施方式中，G2係-L'-S(O)2N(R')2。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2N(R')2。在一些實施方式中，G2係-L'-S(O)2NHR'。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2NHR'。在一些實施方式中，R'係甲基。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2NH(CH3)。在一些實施方式中，R'係-CH2Ph。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2NH(CH2Ph)。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2N(CH2Ph)2。在一些實施方式中，R'係苯基。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2NHPh。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2N(CH3)Ph。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2N(CH3)2。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2NH(CH2Ph)。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2NHPh。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2NH(CH2Ph)。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2N(CH3)2。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2N(CH3)Ph。在一些實施方式中，G2係-L'-S(O)2N(R')(OR')。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2N(R')(OR')。在一些實施方式中，每個R'係甲基。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2N(CH3)(OCH3)。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2N(Ph)(OCH3)。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2N(CH2Ph)(OCH3)。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2N(CH2Ph)(OCH3)。在一些實施方式中，G2係-L'-S(O)2OR'。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2OR'。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2OPh。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2OCH3。在一些實施方式中，G2係-CH2-S(O)2OCH2Ph。
在一些實施方式中，G2係-L'-P(O)(R')2。在一些實施方式中，G2係-CH2-P(O)(R')2。在一些實施方式中，G2係-L'-P(O)[N(R')2]2。在一些實施方式中，G2係-CH2-P(O)[N(R')2]2。在一些實施方式中，G2係-L'-P(O)[O(R')2]2。在一些實施方式中，G2係-CH2-P(O)[O(R')2]2。在一些實施方式中，G2係-L'-P(O)(R')[N(R')2]2。 在一些實施方式中，G2係-CH2-P(O)(R')[N(R')2]。在一些實施方式中，G2係-L'-P(O)(R')[O(R')]。在一些實施方式中，G2係-CH2-P(O)(R')[O(R')]。在一些實施方式中，G2係-L'-P(O)(OR')[N(R')2]。在一些實施方式中，G2係-CH2-P(O)(OR')[N(R')2]。在一些實施方式中，G2係-L'-C(O)N(R')2，其中每個變數係如本揭露所述的。在一些實施方式中，G2係-CH2-C(O)N(R')2。在一些實施方式中，每個R'獨立地是R。在一些實施方式中，一個R'係視需要取代的脂肪族，並且一個R係視需要取代的芳基。在一些實施方式中，一個R'係視需要取代的C1-6脂肪族，並且一個R係視需要取代的苯基。在一些實施方式中，每個R'獨立地是視需要取代的C1-6脂肪族。在一些實施方式中，G2係-CH2-P(O)(CH3)Ph。在一些實施方式中，G2係-CH2-P(O)(CH3)2。在一些實施方式中，G2係-CH2-P(O)(Ph)2。在一些實施方式中，G2係-CH2-P(O)(OCH3)2。在一些實施方式中，G2係-CH2-P(O)(CH2Ph)2。在一些實施方式中，G2係-CH2-P(O)[N(CH3)Ph]2。在一些實施方式中，G2係-CH2-P(O)[N(CH3)2]2。在一些實施方式中，G2係-CH2-P(O)[N(CH2Ph)2]2。在一些實施方式中，G2係-CH2-P(O)(OCH3)2。在一些實施方式中，G2係-CH2-P(O)(OPh)2。
在一些實施方式中，G2係-L'-SR'。在一些實施方式中，G2係-CH2-SR'。在一些實施方式中，R'係視需要取代的苯基。在一些實施方式中，R'係苯基。
在一些實施方式中，提供的手性試劑具有
Figure 108116317-A0202-12-0158-85
的結構， 其中每個R1獨立地如本揭露所描述的。在一些實施方式中，提供的手性試劑具有
Figure 108116317-A0202-12-0158-86
的結構，其中每個R1獨立地如本揭露所描述的。在一些實施方式 中，每個R1獨立地是如在本揭露中所述的R。在一些實施方式中，每個R1獨立地 是R，其中R係如在本揭露中所述的視需要取代的脂肪族、芳基、雜脂肪族、或雜芳基。在一些實施方式中，每個R1係苯基。在一些實施方式中，R1係-L-R'。在一些實施方式中，R1係-L-R'，其中L係-O-、-S-、或-N(R')。在一些實施方式中， 提供的手性試劑具有
Figure 108116317-A0202-12-0159-87
的結構，其中每個X1獨立地是-H、吸電 子基團、-NO2、-CN、-OR、-Cl、-Br、或-F，並且W係O或S。在一些實施方式 中，提供的手性試劑具有
Figure 108116317-A0202-12-0159-88
的結構，其中每個X1獨立地是-H、 吸電子基團、-NO2、-CN、-OR、-Cl、-Br、或-F，並且W係O或S。在一些實施方式中，每個X1獨立地是-CN、-OR、-Cl、-Br、或-F，其中R不是-H。在一些實施方式中，R係視需要取代的C1-6脂肪族。在一些實施方式中，R係視需要取代的C1-6烷基。在一些實施方式中，R係-CH3。在一些實施方式中，一個或多個X1獨立地是吸電子基團(例如，-CN、-NO2、鹵素、-C(O)R1、-C(O)OR'、-C(O)N(R')2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR')2、-P(S)(R1)2等)。
在一些實施方式中，提供的手性試劑具有
Figure 108116317-A0202-12-0159-89
的結構， 其中R1係如在本揭露中所述的。在一些實施方式中，提供的手性試劑具有
Figure 108116317-A0202-12-0159-90
的結構，其中R1係如在本揭露中所述的。在一些實施方式中，R1係 如在本揭露中所述的R。在一些實施方式中，R1係R，其中R係如在本揭露中所述的視需要取代的脂肪族、芳基、雜脂肪族、或雜芳基。在一些實施方式中，R1係 -L-R'。在一些實施方式中，R1係-L-R'，其中L係-O-、-S-、或-N(R')。在一些實施 方式中，提供的手性試劑具有
Figure 108116317-A0202-12-0160-91
的結構，其中X1係-H、吸電子 基團、-NO2、-CN、-OR、-Cl、-Br、或-F，並且W係O或S。在一些實施方式中， 提供的手性試劑具有
Figure 108116317-A0202-12-0160-92
的結構，其中X1係-H、吸電子基團、- NO2、-CN、-OR、-Cl、-Br、或-F，並且W係O或S。在一些實施方式中，X1係-CN、-OR、-Cl、-Br、或-F，其中R不是-H。在一些實施方式中，R係視需要取代的C1-6脂肪族。在一些實施方式中，R係視需要取代的C1-6烷基。在一些實施方式中，R係-CH3。在一些實施方式中，X1係吸電子基團(例如，-CN、-NO2、鹵素、-C(O)R1、-C(O)OR'、-C(O)N(R')2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR')2,-P(S)(R1)2等)。在一些實施方式中，X1為不是-CN、-NO2、或鹵素的吸電子基團。在一些實施方式中，X1不是-H、-CN、-NO2、鹵素、或C1-3烷氧基。
在一些實施方式中，G2係-CH(R21)-CH(R22)=C(R23)(R24)，其中每個R21、R22、R23、和R24獨立地是R。在一些實施方式中，R22和R23均為R，並且兩個R基團與它們的插入原子一起形成如本文所述的視需要取代的芳基或雜芳基環。在一些實施方式中，一個或多個取代基獨立地是吸電子基團。在一些實施方式中，R21和R24均為R，並且兩個R基團與它們的插入原子一起形成如本文所述的視需要取代的環。在一些實施方式中，R21和R24均為R，並且兩個R基團與它們的插入原子一起形成如本文所述的視需要取代的飽和的或者部分飽和的環。在一些實施方式中，R22和R23均為R，並且兩個R基團與它們的插入原子一起形成如本文所述的視需要取代的芳基或雜芳基環，並且R21和R24均為R，並且兩個R基團與它們的插入原子一起形成如本文所述的視需要取代的部分飽和的環。在一些實施 方式中，R21係-H。在一些實施方式中，R24係-H。在一些實施方式中，G2係視需 要取代的
Figure 108116317-A0202-12-0161-95
。在一些實施方式中，G2係視需要取代的
Figure 108116317-A0202-12-0161-94
、
Figure 108116317-A0202-12-0161-93
、 或
Figure 108116317-A0202-12-0161-96
，其中每個環A2獨立地是如本文所述的3-15員單環、二環或多環。在 一些實施方式中，環A2係如本文所述的具有1-5個雜原子的視需要取代的5-10員單環芳基或雜芳基環。在一些實施方式中，環A2係如本文所述的視需要取代的苯 基環。在一些實施方式中，在一些實施方式中，G2係視需要取代的
Figure 108116317-A0202-12-0161-97
。 在一些實施方式中，G2係
Figure 108116317-A0202-12-0161-98
。在一些實施方式中，G2係
Figure 108116317-A0202-12-0161-101
。在一些實施方式中，G2係
Figure 108116317-A0202-12-0161-100
。
在一些實施方式中，手性助劑係DPSE助劑。在一些實施方式中，手性助劑係PSM助劑。
在一些實施方式中，當與鹼接觸時，手性助劑部分(例如，核苷酸間鍵，其對應的化合物係具有式3-I或3-AA的化合物)可以作為烯烴釋放，該烯烴與藉由從對應的化合物中去除水分子(消除G2的-W2-H=-OH和α-H)而形成的產物具有相同的結構。在一些實施方式中，這種烯烴具有(吸電子基團)2=C(R1)-L-N(R5)(R6)、(吸電子基團)H=C(R1)-L-N(R5)(R6)、CH(-L"-R')=C(R1)-L-N(R5)(R6)(其中CH基團係視需要取代的)、或Cx=C(R1)-L-N(R5)(R6)(其中Cx係 視需要取代的
Figure 108116317-A0202-12-0161-102
)的結構，並且可以與一個或多個視需要取代的環視需要 稠和，並且每個其他變數獨立地如本文所述的。在一些實施方式中，Cx係視需要 取代的
Figure 108116317-A0202-12-0161-103
。在一些實施方式中，Cx係
Figure 108116317-A0202-12-0161-104
。在一些實 施方式中，這種烯烴係
Figure 108116317-A0202-12-0162-105
。在一些實施方式中，這種烯烴係
Figure 108116317-A0202-12-0162-106
。在一些實施方式中，這種烯烴係
Figure 108116317-A0202-12-0162-107
。
在一些實施方式中，手性試劑係胺基醇。在一些實施方式中，手性試劑係胺基硫。在一些實施方式中，手性試劑係胺基苯酚。在一些實施方式中，手性試劑係(S)-和(R)-2-甲基胺基-1-苯基乙醇、(1R,2S)-麻黃鹼、或(1R,2S)-2-甲基胺基-1,2-聯苯基乙醇。
在本揭露的一些實施方式中，手性試劑係具有以下式之一的化合物：
Figure 108116317-A0202-12-0162-365
如熟悉該項技術者所理解的，手性試劑通常是立體純的或基本上立體純的，並且通常用作基本上不含其它立體異構物的單一立體異構物。在一些實施方式中，本揭露的化合物係立體純的或基本上立體純的。
如本文所證明的，當用於製備手性核苷酸間鍵時，為了獲得立體選擇性，通常使用立體化學純的手性試劑。除其他事項之外，本揭露提供了立體化學純的手性試劑，包括具有所述結構的那些。
手性試劑的選擇，例如，由式Q表示的異構物或其立體異構物(式R)允許特定控制連接磷的手性。因此，可以在每個合成循環中選擇Rp或Sp構型，允許控制手性受控的DMD寡核苷酸的整體三維結構。在一些實施方式中，手性受控的DMD寡核苷酸具有所有Rp立體中心。在本揭露的一些實施方式中，手性 受控的DMD寡核苷酸具有所有Sp立體中心。在本揭露的一些實施方式中，手性受控的DMD寡核苷酸中的每個連接磷獨立地是Rp或Sp。在本揭露的一些實施方式中，手性受控的DMD寡核苷酸中的每個連接磷獨立地是Rp或Sp，並且至少一個係Rp，以及至少一個使Sp。在一些實施方式中，進行Rp和Sp中心的選擇以賦予手性受控的DMD寡核苷酸特定的三維超結構。此類選擇的實例在本文中進一步詳述。
在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸包含手性助劑部分，例如，以核苷酸間鍵。在一些實施方式中，手性助劑與連接磷連接。在一些實施方式中，手性助劑藉由W2與連接磷連接。在一些實施方式中，手性助劑藉由W2(其中W2係O)與連接磷連接。視需要，W1(例如，當W1係-NG5-時)在DMD寡核苷酸合成期間被加帽。在一些實施方式中，將DMD寡核苷酸中的手性助劑中的W1加帽，例如，藉由DMD寡核苷酸合成期間的加帽試劑。在一些實施方式中，可以有目的地加帽W1以調節DMD寡核苷酸特性。在一些實施方式中，將W1用-R1加帽。在一些實施方式中，R1係-C(O)R'。在一些實施方式中，R'係視需要取代的C1-6脂肪族。在一些實施方式中，R'係甲基。
在一些實施方式中，以手性試劑在上文描繪的循環中的特定的步驟被去除的能力選擇依照本揭露使用的手性試劑。例如，在一些實施方式中，希望在修飾連接磷的步驟期間去除手性試劑。在一些實施方式中，希望在修飾連接磷的步驟之前去除手性試劑。在一些實施方式中，希望在修飾連接磷的步驟之後去除手性試劑。在一些實施方式中，希望在第一偶合步驟已經發生之後但在第二偶合步驟發生之前去除手性試劑，使得在第二偶合期間(並且同樣對於另外的後續的耦合步驟)在生長的DMD寡核苷酸上不存在手性試劑。在一些實施方式中，在「去封閉」反應期間去除手性試劑，該「去封閉」在連接磷的修飾之後但在隨後的循環開始之前發生。本文描述了用於去除的示例方法和試劑。
在一些實施方式中，當進行修飾和/或去封閉步驟時，實現了手性助劑的去除，如方案I中所示。將手性助劑去除與其他轉化(如修飾和去封閉)組合在一起可以是有益的。熟悉該項技術者將理解，保存的步驟/轉化可以提高合成的總效率(例如，關於產率和產物純度)，尤其是對於更長的DMD寡核苷酸。方案I中說明了在修飾和/或去封閉期間去除手性助劑的一個實例。
在一些實施方式中，依照本揭露的方法使用的手性試劑特徵在於：其在某些條件下是可去除的。例如，在一些實施方式中，手性試劑係針對其在酸性條件下被去除的能力來選擇的。在某些實施方式中，手性試劑係針對其在溫和地酸性條件下被去除的能力來選擇的。在某些實施方式中，手性試劑係針對其藉由E1消除反應(例如，由於在酸性條件下在手性試劑上形成陽離子中間體而發生去除，導致手性試劑從DMD寡核苷酸上裂解)被去除的能力來選擇的。在一些實施方式中，手性試劑特徵在於：它具有被認為能夠容納或促進E1消除反應的結構。相關領域的技術人員將理解，可以設想哪些結構傾向於經歷此類消除反應。
在一些實施方式中，手性試劑係針對其與親核試劑一起去除的能力來選擇的。在一些實施方式中，手性試劑係針對其與胺親核試劑一起去除的能力來選擇的。在一些實施方式中，手性試劑係針對其與除胺之外的親核試劑一起去除的能力來選擇的。
在一些實施方式中，手性試劑係針對其與鹼基一起去除的能力來選擇的。在一些實施方式中，手性試劑係針對其與胺一起去除的能力來選擇的。在一些實施方式中，手性試劑係針對其與除胺之外的鹼基一起去除的能力來選擇的。
在一些實施方式中，可以在使用前分離包含手性助劑的手性純的亞磷醯胺。在一些實施方式中，可以不分離而使用包含手性助劑的手性純的亞磷醯胺-在一些實施方式中，可以將其在形成後直接使用。
活化
如熟悉該項技術者所理解的，DMD寡核苷酸製備可以使用各種條件、試劑等以活化反應組分，例如，在亞磷醯胺製備期間、在循環期間的一個或多個步驟期間、在循環後裂解/去保護期間等。可以依照本揭露利用的各種活化技術包括但不限於描述於以下的那些：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO 2018/237194、和/或WO 2019/055951，其每個的活化技術藉由引用結合在此。某些活化技術(例如，試劑、條件、方法等)在實例中進行了說明。
偶合
在一些實施方式中，本揭露的循環包含立體選擇性縮合/偶合步驟以形成手性受控的核苷酸間鍵。對於縮合，通常使用活化試劑，如4,5-二氰基咪唑(DCI)、4,5-二氯咪唑、1-苯基咪唑鎓三氟甲磺酸鹽(PhIMT)、苯并咪唑鎓三氟甲磺酸鹽(BIT)、苯并三唑、3-硝基-1,2,4-三唑(NT)、四唑、5-乙基硫代四唑(ETT)、5-苄基硫代四唑(BTT)、5-(4-硝基苯基)四唑、N-氰基甲基吡咯啶鎓三氟甲磺酸酯(CMPT)、N-氰基甲基哌啶鎓三氟甲磺酸鹽、N-氰基甲基二甲基銨三氟甲磺酸鹽等。包括手性亞磷醯胺的合適的條件和試劑包括描述在以下的那些：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO 2018/237194、和/或WO 2019/055951，其每個的縮合試劑、條件和方法藉由引用結合在此。某些偶合技術(例如，試劑、條件、方法等)在實例中進行了說明。
在一些實施方式中，用於偶合的手性亞磷醯胺具有
Figure 108116317-A0202-12-0166-109
、
Figure 108116317-A0202-12-0166-112
Figure 108116317-A0202-12-0166-113
的結構，其中R2s係-H、-F、或-OR，並且每個其他變數獨立地 如本揭露所描述的。在一些實施方式中，G1或G2包含如在本揭露中所述的吸電子 基團。在一些實施方式中，用於偶合的手性亞磷醯胺具有
Figure 108116317-A0202-12-0166-114
或
Figure 108116317-A0202-12-0166-115
的結構，其中每個變數獨立地如本揭露所描述的。在一些實施 方式中，R1係如在本揭露中所述的R'。在一些實施方式中，R1係如在本揭露中所 述的R。在一些實施方式中，R係如在本揭露中所述的視需要取代的苯基。在一些實施方式中，R係苯基。在一些實施方式中，R係如在本揭露中所述的視需要取代的C1-6脂肪族。在一些實施方式中，R係如在本揭露中所述的視需要取代的C1-6烷基。例如，在一些實施方式中，R係甲基；在一些實施方式中，R係異丙基；在一些實施方式中，R係三級丁基；等。在一些實施方式中，R'係寡核苷酸合成中的5'-阻斷基團，例如，DMTr。在一些實施方式中，BA係如本文所述的視需要保護的核鹼基。在一些實施方式中，BA係視需要取代的A、T、G、C、U、或其互變異構物。在一些實施方式中，BA係保護的核鹼基。在一些實施方式中，BA係視需要取代的保護的A、T、G、C、U、或其互變異構物。在一些實施方式中，R'係保護基團。在一些實施方式中，R'係DMTr。在一些實施方式中，R2s係-H、-F、或-OMe。在一些實施方式中，R2s係-H。在一些實施方式中，R2s係-F。在一些實施方式中，R2s係-OMe。
在一些實施方式中，偶合步驟中形成的核苷酸間鍵包含與連接磷 鍵合的
Figure 108116317-A0202-12-0167-116
、
Figure 108116317-A0202-12-0167-117
、
Figure 108116317-A0202-12-0167-118
、
Figure 108116317-A0202-12-0167-119
、
Figure 108116317-A0202-12-0167-120
、
Figure 108116317-A0202-12-0167-121
、
Figure 108116317-A0202-12-0167-124
、
Figure 108116317-A0202-12-0167-123
、或
Figure 108116317-A0202-12-0167-125
，其中每個變數獨立地依照本揭露。
在一些實施方式中，偶合形成核苷酸間鍵，其具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的立體選擇性。在一些實施方式中，立體選擇性係85%或更多。在一些實施方式中，立體選擇性係85%或更多。在一些實施方式中，立體選擇性係90%或更多。在一些實施方式中，立體選擇性係91%或更多。在一些實施方式中，立體選擇性係92%或更多。在一些實施方式中，立體選擇性係93%或更多。在一些實施方式中，立體選擇性係94%或更多。在一些實施方式中，立體選擇性係95%或更多。在一些實施 方式中，立體選擇性係96%或更多。在一些實施方式中，立體選擇性係97%或更多。在一些實施方式中，立體選擇性係98%或更多。在一些實施方式中，立體選擇性係99%或更多。
加帽(Capping)
如果最終核酸大於二聚體，則未反應的-OH部分通常用封閉/加帽基團進行加帽。寡核苷酸中的手性助劑也可以用阻斷基團被加帽以形成加帽的縮合中間體。合適的加帽技術(例如，試劑、病症等)包括以下中描述的那些：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO 2018/237194、和/或WO 2019/055951，其每個的加帽技術藉由引用結合在此。在一些實施方式中，加帽試劑係羧酸或其衍生物。在一些實施方式中，加帽試劑係R'COOH。在一些實施方式中，加帽步驟將R'COO-引入手性助劑中未反應的5'-OH基團和/或胺基基團。在一些實施方式中，循環可以包含兩個或更多個加帽步驟。在一些實施方式中，循環包含在偶合產物的修飾之前的第一加帽(例如，將P(III)轉化為P(V))，以及在偶合產物的修飾之後的另一加帽。在一些實施方式中，在醯胺化條件下進行第一加帽，該醯化條件例如包含醯化試劑(例如，具有(RC(O))2O(例如，Ac2O)的酸酐)和鹼(例如，2,6-二甲基砒啶)。在一些實施方式中，第一加帽對胺基基團(例如，核苷酸間鍵中的手性助劑的胺基)進行加 帽。在一些實施方式中，加帽步驟中形成的核苷酸間鍵包含
Figure 108116317-A0202-12-0168-126
、
Figure 108116317-A0202-12-0168-128
Figure 108116317-A0202-12-0169-129
、或
Figure 108116317-A0202-12-0169-130
，其中每個變數獨立地依照本揭露。在一些實施方式 中，R1係R-C(O)-。在一些實施方式中，R係CH3-。在一些實施方式中，每個手性受控的偶合(例如，使用手性助劑)之後進行第一加帽。通常，使用傳統亞磷醯胺來構建天然磷酸酯鍵的非手性受控的偶合的循環不包含第一加帽。在一些實施方式中，進行第二加帽，例如在酯化條件下(例如，傳統亞磷醯胺寡核苷酸合成的加帽條件)，其中游離的5'-OH被加帽。
某些加帽技術(例如，試劑、條件、方法等)在實例中進行了說明。
修飾
在一些實施方式中，其中其作為P(III)存在的其連接磷的核苷酸間鍵被修飾以形成另一種修飾的核苷酸間鍵。在很多實施方式中，藉由與親電試劑反應修飾P(III)。依照本揭露可以使用合適的P(III)的各種類型的反應。合適的修飾技術(例如，試劑(例如，硫化試劑、氧化試劑等)、病症等)包括以下描述的那些：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO 2018/237194、和/或WO 2019/055951，其每個的修飾技術藉由引用結合在此。
在一些實施方式中，如實例中說明，本揭露提供了用於引入非負電荷的核苷酸間鍵(包括中性核苷酸間鍵)的修飾劑。
在一些實施方式中，修飾在循環內。在一些實施方式中，修飾可以再循環之外。例如，在一些實施方式中，可以在達到DMD寡核苷酸鏈之後進 行一個或多個修飾步驟以在一個或多個核苷酸間鍵和/或其他位置同時引入修飾。
在一些實施方式中，修飾包括使用點擊化學，例如，其中DMD寡核苷酸(例如，核苷酸間鍵)的炔基與疊氮化物反應。依照本揭露可以利用用於點擊化學的各種試劑和條件。在一些實施方式中，疊氮化物具有R1-N3(其中R1係如在本揭露中所述的)的結構。在一些實施方式中，R1係視需要取代的C1-6烷基。在一些實施方式中，R1係異丙基。
在一些實施方式中，如在實例中證明，在合適的條件下，藉由使 P(III)鍵與疊氮化物或疊氮基咪唑啉鹽反應(例如，包含
Figure 108116317-A0202-12-0170-138
的化合物；在一 些實施方式中，稱為疊氮化物反應)，可以將P(III)鍵轉化為非負電荷的核苷酸間鍵。在一些實施方式中，疊氮基咪唑啉鹽係PF6 -的鹽。在一些實施方式中，疊 氮基咪唑啉鹽係
Figure 108116317-A0202-12-0170-137
的鹽。在一些實施方式中，有用的試劑係
Figure 108116317-A0202-12-0170-136
的 鹽，其中每個Rs獨立地是R1。在一些實施方式中，有用的試劑係
Figure 108116317-A0202-12-0170-135
的 鹽。包含氮陽離子的此類試劑也含有抗衡陰離子(例如，如在本揭露中所述的Q-)，該抗衡陰離子係本領域廣泛已知的並且包含在各種化學試劑中。在一些實 施方式中，有用的試劑係Q+Q-，其中Q+係
Figure 108116317-A0202-12-0170-132
、
Figure 108116317-A0202-12-0170-133
、或
Figure 108116317-A0202-12-0170-134
， 並且Q-係抗衡陰離子。在一些實施方式中，Q+係
Figure 108116317-A0202-12-0170-131
。在一些實施方式中， Q+係
Figure 108116317-A0202-12-0171-140
。在一些實施方式中，Q+係
Figure 108116317-A0202-12-0171-139
。如熟悉該項技術者所理 解的，在具有的結構Q+Q-的化合物中，通常Q+中正電荷的數量等於Q-中負電荷的數量。在一些實施方式中，Q+係單價陽離子，並且Q-係單價陰離子。在一些實施方式中，Q-係F-、Cl-、Br-、BF4 -、PF6 -、TfO-、Tf2N-、AsF6 -、ClO4 -、或SbF6 -。在一些實施方式中，Q-係PF6 -。熟悉該項技術者容易理解，許多其他類型的抗衡陰離子係可獲得的並且可以依照本揭露使用。在一些實施方式中，疊氮基咪唑啉鹽係2-疊氮基-1,3-二甲基咪唑啉六氟磷酸鹽。
在一些實施方式中，P(III)鍵與具有R-GZ的結構的親電試劑(其中R係如在本揭露中所述的，並且GZ係脫離基，例如，-Cl、-Br、-I、-OTf、-Oms、-OTosyl等)反應。在一些實施方式中，R係-CH3。在一些實施方式中，R係-CH2CH3。在一些實施方式中，R係-CH2CH2CH3。在一些實施方式中，R係-CH2OCH3。在一些實施方式中，R係CH3CH2OCH2-。在一些實施方式中，R係PhCH2OCH2-。在一些實施方式中，R係HC≡C-CH2-。在一些實施方式中，R係H3C-C≡C-CH2-。在一些實施方式中，R係CH2=CHCH2-。在一些實施方式中，R係CH3SCH2-。在一些實施方式中，R係-CH2COOCH3。在一些實施方式中，R係-CH2COOCH2CH3。在一些實施方式中，R係-CH2CONHCH3。
在一些實施方式中，在修飾步驟後，將P(III)連接磷轉化為P(V)核苷酸間鍵。在一些實施方式中，將P(III)連接磷轉化為P(V)核苷酸間鍵，並且與連接磷結合的所有基團保持不變。在一些實施方式中，連接磷從P轉化為P(=O)。在一些實施方式中，連接磷從P轉化為P(=S)。在一些實施方式中，連接磷從P轉化 為P(=N-L-R5)。在一些實施方式中，連接磷從P轉化為
Figure 108116317-A0202-12-0172-142
、
Figure 108116317-A0202-12-0172-143
、 或
Figure 108116317-A0202-12-0172-141
，其中每個變數獨立地如本揭露所描述的。在一些實施方式中， P轉化為
Figure 108116317-A0202-12-0172-145
。在一些實施方式中，P轉化為
Figure 108116317-A0202-12-0172-144
。在一些實施方式 中，P轉化為
Figure 108116317-A0202-12-0172-146
。在一些實施方式中，P轉化為
Figure 108116317-A0202-12-0172-147
。如熟悉該項 技術者所理解的，對於每種陽離子，通常存在抗衡陰離子，使得系統(例如，化合物、組成物等)中正電荷的總數等於負電荷的總數。在一些實施方式中，抗衡陰離子係如在本揭露中所述的Q-(例如，F-、Cl-、Br-、BF4 -、PF6 -、TfO-、Tf2N-、AsF6 -、ClO4 -、SbF6 -等)。
在一些實施方式中，這種核苷酸間鍵係手性受控的。在一些實施方式中，所有此類核苷酸間鍵係手性受控的。在一些實施方式中，此類核苷酸間鍵的至少一個的連接磷係Rp。在一些實施方式中，此類核苷酸間鍵的至少一個的連接磷係Sp。在一些實施方式中，此類核苷酸間鍵的至少一個的連接磷係Rp，並且此類核苷酸間鍵的至少一個的連接磷係Sp。在一些實施方式中，本揭露的DMD寡核苷酸包含一個或多個(例如，1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-40、1-50、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個等)此類核苷酸間鍵。在一些實施方式中，此類DMD寡核苷酸進一步包含核苷酸間鍵的一個或多個其他類型，例如，一個 或多個天然磷酸酯鍵、和/或一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵(例如，在一些實施方式中，其中的一個或多個獨立地是手性受控的；在一些實施方式中，其每個獨立地是手性受控的；在一些實施方式中，至少一個係Rp；在一些實施方式中，至少一個係Sp；在一些實施方式中，至少一個係Rp，並且至少一個係Sp；等)。在一些實施方式中，此類DMD寡核苷酸係立體純的(基本上不含其他立體異構物)。在一些實施方式中，本揭露提供了此類DMD寡核苷酸的手性受控的DMD寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，本揭露提供了此類DMD寡核苷酸的手性純的DMD寡核苷酸組成物。
在一些實施方式中，修飾以80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的立體選擇性進行。在一些實施方式中，立體選擇性係85%或更多。在一些實施方式中，立體選擇性係85%或更多。在一些實施方式中，立體選擇性係90%或更多。在一些實施方式中，立體選擇性係91%或更多。在一些實施方式中，立體選擇性係92%或更多。在一些實施方式中，立體選擇性係93%或更多。在一些實施方式中，立體選擇性係94%或更多。在一些實施方式中，立體選擇性係95%或更多。在一些實施方式中，立體選擇性係96%或更多。在一些實施方式中，立體選擇性係97%或更多。在一些實施方式中，立體選擇性係98%或更多。在一些實施方式中，立體選擇性係99%或更多。在一些實施方式中，修飾係立體定向的。
去封閉
在一些實施方式中，循環包含循環步驟。在一些實施方式中，生長的DMD寡核苷的5'羥基基團被封閉(即，保護的)並且必須被去封閉以隨後與核苷偶合配偶體反應。
在一些實施方式中，使用醯化來去除阻斷基團。合適的去封閉技術(例如，試劑、病症等)包括以下中描述的那些：US 9695211、US 9605019、 US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO 2018/237194、和/或WO 2019/055951，其每個的去封閉技術藉由引用結合在此。某些去封閉技術(例如，試劑、條件、方法等)在實例中進行了說明。
切割和去保護
在某些階段，例如，在達到所希望的DMD寡核苷酸長度後，進行切割和/或去保護以使封閉的核鹼基等去保護並從支持物上切割DMD寡核苷酸產物。在一些實施方式中，分開進行切割和去保護。在一些實施方式中，在一個步驟中、或在兩個或更多個步驟中(但不在其間分離產物)進行切割和去保護。在一些實施方式中，切割和/或去保護利用鹼性條件和升高的溫度。在一些實施方式中，對於某些手性助劑，需要氟化物條件(例如，TBAF、HF-ET3N等，視需要具有另外的鹼)。合適的切割和去保護技術(例如，試劑、條件等)包括以下中描述的那些：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO 2018/237194、和/或WO 2019/055951，其每個的切割和去保護技術藉由引用結合在此。某些切割和去保護技術(例如，試劑、條件、方法等)在實例中進行了說明。
在一些實施方式中，在鹼性條件下去除某些手性助劑。在一些實施方式中，使DMD寡核苷酸與鹼(例如，具有N(R)3的結構的胺)接觸以去除某些手性助劑(例如，包含如在本揭露中所述的G2中的吸電子的基團的那些)。在一些實施方式中，鹼係NHR2。在一些實施方式中，每個R獨立地是視需要取代的C1-6脂肪族。在一些實施方式中，每個R獨立地是視需要取代的C1-6烷基。在一些 實施方式中，胺係DEA。在一些實施方式中，胺係TEA。在一些實施方式中，作為溶液提供胺，例如，乙腈溶液。在一些實施方式中，這種接觸在無水條件下進行。在一些實施方式中，在實現所希望的DMD寡核苷酸長度(例如，合成後循環的第一步驟)之後，立即進行這種接觸。在一些實施方式中，在去除手性助劑和/或保護基團，和/或從固體支持物切割DMD寡核苷酸之前進行這種接觸。在一些實施方式中，與鹼接觸可以去除標準DMD寡核苷酸合成中使用的氰基乙基基團，提供能以鹽形式存在的天然磷酸鍵(其中陽離子係例如銨鹽)。
循環
用於製備本揭露的DMD寡核苷酸的合適的循環包括以下中描述的那些：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647(例如，方案I、I-b、I-c、I-d、I-e、I-f等)、WO 2018/223056、WO 2018/237194、和/或WO 2019/055951，其每個的循環藉由引用結合在此。例如，在一些實施方式中，示例循環係方案I-f。在實例中說明了某些循環(例如，用於製備天然磷酸酯鍵，利用其他手性助劑等)。
方案I-e. 使用DPSE手性助劑的示例循環。
Figure 108116317-A0202-12-0176-148
在一些實施方式中，R2s係H或-OR1，其中R1不是氫。在一些實施方式中，R2s係H或-OR1，其中R1係視需要取代的C1-6烷基。在一些實施方式中，R2s係H。在一些實施方式中，R2s係-OMe。在一些實施方式中，R2s係-OCH2CH2OCH3。在一些實施方式中，R2s係-F。在一些實施方式中，R4s係-H。在一些實施方式中，R4s和R2s一起形成如在本揭露中所述的橋-L-O-。在一些實施方式中，-O-在2'位置與碳連接。在一些實施方式中，L係-CH2-。在一些實施方式中，L係-CH(Me)-。在一些實施方式中，L係-(R)-CH(Me)-。在一些實施方式中，L係-(S)-CH(Me)-。
純化和表徵
可以利用各種純化和/或表徵技術(方法、儀器、方案等)來純化和/或表徵依照本揭露的DMD寡核苷酸和DMD寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，使用各種類型的HPLC/UPLC技術進行純化。在一些實施方式中，表徵包含MS、NMR、UV等。在一些實施方式中，純化和表徵可以一起進行，例如HPLC-MS、UPLC-MS等。示例純化和表徵技術包括以下中描述的那些：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、 WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO 2018/237194、和/或WO 2019/055951，其每個的純化和表徵技術藉由引用結合在此。
在一些實施方式中，本揭露提供了用於製備提供的DMD寡核苷酸和DMD寡核苷酸組成物的方法。在一些實施方式中，提供的方法包括提供具有如本文所述具有式3-AA的結構的提供的手性試劑。在一些實施方式中，提供的 方法包括提供具有
Figure 108116317-A0202-12-0177-149
的結構的提供的手性試劑，其中W1係-NG5，W2 係O，G1和G3每個的獨立地是氫或選自以下的視需要取代的基團：C1-10脂肪族、雜環基、雜芳基和芳基，G2係-C(R)2Si(R)3或-C(R)2SO2R1，並且G4和G5一起形成高達約20個環原子視需要取代的含雜原子的飽和的、部分不飽和的、或不飽和的環，該等環係單環或多環、稠和的或未稠和的，其中每個R獨立地是氫，或者選自以下的視需要取代的基團：C1-C6脂肪族、碳環基、芳基、雜芳基、和雜環基。
在一些實施方式中，提供的手性試劑具有
Figure 108116317-A0202-12-0177-150
、
Figure 108116317-A0202-12-0177-151
、
Figure 108116317-A0202-12-0177-160
、或
Figure 108116317-A0202-12-0177-159
的結構，其中每個變數獨立地如本揭露所描述的。在一些 實施方式中，提供的方法包含提供亞磷醯胺，該亞磷醯胺包含來自具有
Figure 108116317-A0202-12-0177-152
、
Figure 108116317-A0202-12-0177-153
、
Figure 108116317-A0202-12-0177-154
、
Figure 108116317-A0202-12-0177-155
、或
Figure 108116317-A0202-12-0177-158
的結構的手性試 劑的部分的，其中-W1H和-W2H、或者羥基和胺基基團與亞磷醯胺的磷原子形成鍵。在一些實施方式中，-W1H和-W2H、或者羥基和胺基基團與亞磷醯胺的磷原 子形成鍵，例如，以
Figure 108116317-A0202-12-0177-161
或
Figure 108116317-A0202-12-0177-162
。在一些實施方式中，亞磷醯 胺具有
Figure 108116317-A0202-12-0178-163
、
Figure 108116317-A0202-12-0178-164
、
Figure 108116317-A0202-12-0178-165
、
Figure 108116317-A0202-12-0178-166
、
Figure 108116317-A0202-12-0178-167
、
Figure 108116317-A0202-12-0178-168
Figure 108116317-A0202-12-0178-169
的結構，其中每個其他變數獨立地如本揭露所描述的。在一些 實施方式中，R2s係-H。在一些實施方式中，R2s係-F。在一些實施方式中，R2s係-OMe。在一些實施方式中，R'係DMTr。在一些實施方式中，BA係視需要取代的A、T、C、G、U或A、T、C、G、U的視需要取代的互變異構物。
在一些實施方式中，G2係-C(R)2Si(R)3，其中-C(R)2-係視需要取代的-CH2-，並且R-Si(R)3的每個係獨立地選自以下的視需要取代的基團：C1-10脂肪 族、雜環基、雜芳基和芳基。在一些實施方式中，-Si(R)3的至少一個R獨立地是視需要取代的C1-10烷基。在一些實施方式中，-Si(R)3的至少一個R獨立地是視需要取代的苯基。在一些實施方式中，-Si(R)3的一個R獨立地是視需要取代的苯基，並且另外兩個R獨立地是視需要取代的C1-10烷基。在一些實施方式中，-Si(R)3的一個R獨立地是視需要取代的C1-10烷基，並且另外兩個R獨立地是視需要取代的苯基。在一些實施方式中，G2係視需要取代的-CH2Si(Ph)(Me)2。在一些實施方式中，G2係視需要取代的-CH2Si(Me)(Ph)2。在一些實施方式中，G2係-CH2Si(Me)(Ph)2。在一些實施方式中，G4和G5一起形成視需要取代的飽和的含有一個氮原子的5-6員環(G5附接在其上)。在一些實施方式中，G4和G5一起形成視需要取代的飽和的含有一個氮原子的5員環。在一些實施方式中，G1係氫。在一些實施方式中，G3係氫。在一些實施方式中，G1和G3均係氫。在一些實施方式中，G1和G3均為氫，G2係-C(R)2Si(R)3，其中-C(R)2-係視需要取代的-CH2-，並且R-Si(R)3的每個獨立地是選自以下的視需要取代的基團：C1-10脂肪族、雜環基、雜芳基和芳基，並且G4和G5一起形成含有一個氮原子的視需要取代的飽和的5員環。在一些實施方式中，提供的方法進一步包括提供含有氟的試劑。在一些實施方式中，提供的含有氟的試劑在合成後從寡核苷酸去除手性試劑、或者從手性試劑形成的產物。依照本揭露可以利用各種已知的含有氟的試劑(包括用於去除-SiR3基團的那些F-源)，例如，TBAF、HF3-Et3N等。在一些實施方式中，與傳統的方法(如濃縮氨)相比，含有氟的試劑提供了更好的結果，例如，更短的治療時間、較低的溫度、較少的去硫化等。在一些實施方式中，對於某個含有氟的試劑，本揭露提供了用於改善結果的接頭，例如，在去除手性試劑(或在DMD寡核苷酸合成期間由其形成的產物)期間從支持物較少的切割DMD寡核苷酸。在一些實施方式中，提供的接頭係SP接頭。在一些實施方式中，本揭露證明可以利用HF-鹼複合物(如HF-NR3)，以在去除手性試劑(或在DMD寡核苷酸合成期 間由其形成的產物)期間控制切割。在一些實施方式中，HF-NR3係HF-NEt3。在一些實施方式中，HF-NR3能夠使用傳統的接頭，例如琥珀醯基接頭。
在一些實施方式中，如本文所述，G2例如，在其α位置包含吸電子基團。在一些實施方式中，G2係被一個或多個吸電子基團取代的甲基。在一些實施方式中，吸電子的基團包含和/或藉由例如，-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)(R1)-、-P(S)R1-、或-C(O)-與碳原子連接。在一些實施方式中，吸電子基團係-CN、-NO2、鹵素、-C(O)R1、-C(O)OR'、-C(O)N(R')2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR')2、或-P(S)(R1)2。在一些實施方式中，吸電子基團係芳基或雜芳基，例如，被-CN、-NO2、鹵素、-C(O)R1、-C(O)OR'、-C(O)N(R')2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR')2、或-P(S)(R1)2的一個或多個取代的苯基。在一些實施方式中，G2係-CH2S(O)R'。在一些實施方式中，G2係-CH2S(O)2R'。在一些實施方式中，G2係-CH2P(O)(R')2。描述了另外的示例實施方式，例如，對於手性試劑/助劑。
可以使用多種合適的技術來確認立體控制的寡核苷酸(例如，藉由本文或本領域所述的方法製備的寡核苷酸)包含預期的立體控制的(手性受控的)核苷酸間鍵。立體控制的(手性受控的)寡核苷酸包含至少一個立體控制的核苷酸間鍵，該核苷酸間鍵可以是例如，包含磷的立體控制的核苷酸間鍵，在Rp構型中的立體控制的硫代磷酸酯核苷酸間鍵(PS)、在Sp構型中的PS等。作為非限制性實例，有用的技術包括：NMR(例如，1D(一維)和/或2D(二維)1H-31P HETCOR(異核相關光譜))HPLC、RP-HPLC、質譜、LC-MS、和/或立體特異性核酸酶。在一些實施方式中，立體特異性核酸酶包括：全能核酸酶(benzonase)、微球菌核酸酶、和svPDE(蛇毒磷酸二酯酶)，其對Rp構型中的核苷酸間鍵(例如，Rp構型中的PS)具有特異性；和核酸酶P1、綠豆核酸酶、和核酸酶S1，其對Sp構型中的核苷酸間鍵(例如，Sp構型中的PS)具有特異性。
在一些實施方式中，本揭露涉及確認或鑒定寡核苷酸(例如，DMD寡核苷酸)的骨架的立體化學模式、和/或特定的核苷酸間鍵的立體化學的方法。在一些實施方式中，DMD寡核苷酸包含含有磷的立體控制的核苷酸間鍵、以Rp構型的立體控制的硫代磷酸酯(PS)、或以Sp構型的PS。在一些實施方式中，DMD寡核苷酸包含至少一個立體控制的核苷酸間鍵和非立體控制的至少一個核苷酸間鍵。在一些實施方式中，方法包括用立體特異性核酸酶消化DMD寡核苷酸。在一些實施方式中，立體特異性核酸酶選自：全能核酸酶(benzonase)、微球菌核酸酶、和svPDE(蛇毒磷酸二酯酶)，其對Rp構型中的核苷酸間鍵(例如，Rp構型中的PS)具有特異性；和核酸酶P1、綠豆(mung bean)核酸酶、和核酸酶S1，其對Sp構型中的核苷酸間鍵(例如，Sp構型中的PS)具有特異性。在一些實施方式中，分析藉由用立體特異性核酸酶消化產生的DMD寡核苷酸或其片段。在一些實施方式中，藉由NMR、1D(一維)和/或2D(二維)1H-31P HETCOR(異核相關譜)、HPLC、RP-HPLC、質譜、LC-MS、UPLC等分析DMD寡核苷酸或其片段(例如，藉由立體特異性核酸酶產生的)。在一些實施方式中，DMD寡核苷酸或其片段與具有已知的立體化學模式的DMD寡核苷酸的化學合成的片段進行比較。
不希望受任何特定理論的束縛，本揭露指出，在至少一些情況下，特定的核酸酶的立體定向性可以藉由修飾(例如，2'-修飾)糖、藉由鹼基序列、或藉由立體化學上下文來改變。例如，在一些實施方式中，全能核酸酶和微球菌核酸酶(其對Rp核苷酸間鍵具有特異性)兩者均能夠切割分離的PS Rp核苷酸間鍵(由PS Sp核苷酸間鍵側翼的)。
可以利用各種技術和材料。在一些實施方式中，本揭露提供了有用的技術的組合。例如，在一些實施方式中，可以藉由用立體特異性核酸酶消化DMD寡核苷酸、並藉由任何種類技術(例如，基於質荷比的分離、NMR、HPLC、 質譜等)分析所得片段(例如，核酸酶消化產物)來確認DMD寡核苷酸的一個或多個特定的核苷酸間鍵的立體化學。在一些實施方式中，藉由例如，經由控制立體化學的技術產生的與化學合成的片段(例如，二聚體、三聚體、四聚體等)進行比較(例如，NMR，HPLC，質譜等)，可以確認用立體特異性核酸酶消化DMD寡核苷酸的產物的立體化學。
在又一個實例中，測試不同的DMD寡核苷酸以確認核苷酸間鍵處於預期的構型。DMD寡核苷酸能夠跳讀DMD的外顯子51；DMD寡核苷酸中的大多數核苷酸係2'-F，並且其餘為2'-OMe；DMD寡核苷酸中的大部分核苷酸間鍵係Sp構型中的PS，並且其餘為PO。藉由用立體特異性核酸酶消化來測試此DMD寡核苷酸，並分析所得的消化片段(例如，藉由LC-MS並藉由與已知立體化學的化學合成片段比較)。結果證實DMD寡核苷酸具有立體控制的核苷酸間鍵的預期模式。
在一些實施方式中，NMR可用於表徵和/或確認立體化學。在一組示例實驗中，測試包含立體控制的CpG模體的一組DMD寡核苷酸以證實CpG模體的預期立體化學。該組的寡核苷酸包含具有pCpGp的結構的模體，其中C係胞嘧啶，G係鳥嘌呤，並且p係立體隨機或立體控制的硫代磷酸酯(例如，以Rp或Sp構型))。例如，一種DMD寡核苷酸包含pCpGp結構，其中硫代磷酸酯(例如，ppp)的立體化學模式係RRR；在另一種DMD寡核苷酸，ppp的立體化學的模式係RSS；在另一種DMD寡核苷酸，ppp的立體化學的模式係RSR；等。在該組中，表示了ppp的所有可能的立體化學模式。在pCpGp結構外的DMD寡核苷酸部分中，所有核苷酸間鍵均為PO；DMD寡核苷酸中的所有核苷均為2'-去氧基。該等各種DMD寡核苷酸在NMR中測試，沒有用立體特異性核酸酶消化，並且觀察到獨特的峰模式，表明每個PS係Rp或Sp產生的獨特的峰，並證實DMD寡核苷酸包含預期的立體化學的立體控制的PS核間核苷酸間鍵。
確認了各種其他立體控制的DMD寡核苷酸的核苷酸間鍵的立體化學模式，其中DMD寡核苷酸包含多種化學修飾和立體化學模式。
生物學應用、示例用途、和給藥方案
如本文所述，提供的組成物和方法可用於各種目的，例如，以下中描述的那些：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、和/或WO 2017/210647。
在一些實施方式中，提供的技術在靶DMD轉錄物中跳讀外顯子51或53。製備了包含各種類型的經修飾的核苷酸間鍵(包括許多包含非負電荷的核苷酸間鍵(例如，n001)，其具有各種鹼基序列和/或靶向各種核酸(例如，各種基因的DMD轉錄物))的許多DMD寡核苷酸，並且說明了各種有用的性質、活性和/或優點。
在一些實施方式中，本揭露提供了用於調節系統中DMD轉錄物或由其編碼的產物的水平之方法，該方法包括給予有效量的提供的DMD寡核苷酸或其組成物。在一些實施方式中，本揭露提供了用於調節系統中DMD轉錄物或由其編碼的產物的水平之方法，該方法包括使DMD轉錄物與提供的DMD寡核苷酸或其組成物接觸。在一些實施方式中，系統係體外系統。在一些實施方式中，系統係細胞。在一些實施方式中，系統係組織。在一些實施方式中，系統係器官。在一些實施方式中，系統係生物。在一些實施方式中，系統係受試者。在一些實施方式中，系統係人。在一些實施方式中，DMD轉錄物的調節水平降低DMD轉錄物的水平。在一些實施方式中，DMD轉錄物的調節水平增加DMD轉錄物的水平。
在一些實施方式中，本揭露提供了用於預防或治療與核酸序列或由其編碼的產物相關的病症、疾病、或障礙之方法，該方法包括向患有或易患其 的受試者給予有效量的提供的DMD寡核苷酸或其組成物，其中DMD寡核苷酸或其組成物調節核酸序列的DMD轉錄物的水平。在一些實施方式中，核酸序列係基因。在一些實施方式中，DMD轉錄物的調節水平降低DMD轉錄物的水平。在一些實施方式中，DMD轉錄物的調節水平增加DMD轉錄物的水平。
在一些實施方式中，例如，藉由敲低、外顯子跳讀等調節的DMD轉錄物的水平改變至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、100、200、500、或1000倍。
在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸和DMD寡核苷酸組成物調節剪接。在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸和DMD寡核苷酸組成物促進外顯子跳讀，從而產生一定水平的DMD轉錄物，其在外顯子跳讀之前具有增加的DMD轉錄物的有益功能。在一些實施方式中，有益功能係編碼具有增加的生物學功能的蛋白質。在一些實施方式中，本揭露提供了用於調節剪接之方法，該方法包括向剪接系統給予提供的DMD寡核苷酸或DMD寡核苷酸組成物，其中改變至少一個DMD轉錄物的剪接(例如，外顯子51或53的跳讀增加)。在一些實施方式中，至少一個剪接產物的水平增加至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、100、200、500、或1000倍。在一些實施方式中，本揭露提供了用於調節DMD剪接之方法，該方法包括向剪接系統給予提供的DMD寡核苷酸或其組成物。
在一些實施方式中，本揭露提供了用於預防或治療DMD之方法，該方法包括向易患其或者患有其的受試者給予藥物組成物，該藥物組成物包含有效量的提供的DMD寡核苷酸或DMD寡核苷酸組成物。
在一些實施方式中，提供的組成物和方法提供了與參考模式相比改進的DMD轉錄物的剪接模式，該參考模式係來自選自以下群組的參考條件的模式，該群組由以下組成：不存在組成物、存在參考組成物、及其組合。改進可 以是任何所需生物學功能的改進。在一些實施方式中，例如，在DMD中，改進係產生mRNA，從中產生具有改善的生物活性的肌營養不良蛋白質。
在一些實施方式中，特別地有用的和有效的是手性受控的DMD寡核苷酸和手性受控的DMD寡核苷酸組成物，其中DMD寡核苷酸(或在手性受控的DMD寡核苷酸組成物中的多個DMD寡核苷酸)視需要包含一個或多個非負電荷的核苷酸間鍵。除其他事項之外，此類DMD寡核苷酸和DMD寡核苷酸組成物可以提供大大改進的效果、更好的遞送、更低的毒性等。
在一些實施方式中，跳讀DMD的外顯子53。
在一些實施方式中，將提供的DMD寡核苷酸組成物以低於其他可比較的參考DMD寡核苷酸組成物的劑量和/或頻率給予，在改變靶DMD轉錄物的剪接方面具有相當的效果。在一些實施方式中，將立體控制的(手性受控的)DMD寡核苷酸組成物以低於其他可比較的立體隨機的參考DMD寡核苷酸組成物的劑量和/或頻率給予，在改變靶DMD轉錄物的剪接方面具有相當的效果。如果需要，由於其較低的毒性，所提供的組成物也可以較高的劑量/頻率給藥。
在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸、組成物和方法具有低毒性，例如，當與參考組成物相比時。如本領域已知的，DMD寡核苷酸在施用於例如細胞、組織、生物等時可以誘導毒性。在一些實施方式中，DMD寡核苷酸可以誘導不希望的免疫應答。在一些實施方式中，DMD寡核苷酸可以誘導補體活化。在一些實施方式中，DMD寡核苷酸可以誘導補體的可替代的途徑的活化。在一些實施方式中，DMD寡核苷酸可以誘導炎症。除其他事項之外，補體系統具有可以破壞細胞的強烈的細胞溶解活性，因此應調整以減少潛在的傷害。在一些實施方式中，DMD寡核苷酸誘導的血管損傷係DMD寡核苷酸開發(例如，藥物用途)中的復發攻擊。在一些實施方式中，當給予高劑量DMD寡核苷酸時，炎症的主要來源涉及活化可替代的補體級聯。在一些實施方式中，係與含有硫代 磷酸酯的DMD寡核苷酸相關的常見挑戰，並且還存在一些硫代磷酸酯序列以誘導先天免疫細胞活化的潛力。在一些實施方式中，細胞介素釋放與DMD寡核苷酸的給予相關。例如，在一些實施方式中，觀察到介白素-6(IL-6)單核細胞趨化蛋白(MCP-1)和/或介白素-12(IL-12)的增加。參見，例如，Frazier,Antisense Oligonucleotide Therapies：The Promise and the Challenges from a Toxicologic Pathologist's Perspective.[反義寡核苷酸療法：毒理學病理學家的承諾和挑戰]Toxicol Pathol.[毒理病理學]，43：78-89,2015；以及Engelhardt等人，Scientific and Regulatory Policy Committee Points-to-consider Paper：Drug-induced Vascular Injury Associated with Nonsmall Molecule Therapeutics in Preclinical Development：Part 2.Antisense Oligonucleotides.[科學和監管政策委員會要點考慮的論文：藥物誘導的血管損傷與臨床前開發中的非小分子治療相關：第2部分反義寡核苷酸]Toxicol Pathol.[毒理病理學]43：935-944,2015。
本文提供的寡核苷酸組成物可用作調節許多細胞過程和機制(包括但不限於DMD轉錄、翻譯、免疫應答、表觀遺傳學等)的藥劑。另外，本文提供的DMD寡核苷酸組成物可用作研究和/或診斷目的的試劑。熟悉該項技術者將容易認識到，本揭露的揭露內容不限於特定用途，而是適用於需要使用合成寡核苷酸的任何情況。除其他事項之外，提供的組成物可用於各種治療、診斷、農業和/或研究應用。
可以利用各種給藥方案來給予提供的手性受控的DMD寡核苷酸組成物，例如，以下中描述的那些：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、和/或WO 2017/210647，其每個的給藥方案藉由引用結合在此。
在一些實施方式中，由於它們的低毒性，所提供的DMD寡核苷酸和組成物能以更高的劑量和/或更高的頻率給予。在一些實施方式中，由於其改進的遞送(和其他特性)，所提供的組成物能以較低劑量和/或較低頻率給予以實現生物學效應，例如臨床功效。
單個劑量可含有不同量的DMD寡核苷酸。在一些實施方式中，單個劑量可含有各種量的一種類型的手性受控的DMD寡核苷酸，如本申請所希望的合適的。在一些實施方式中，單個劑量含有約1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300或更多(例如，約350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000或更多個)mg的手性受控的DMD寡核苷酸的類型。在一些實施方式中，將手性受控的DMD寡核苷酸以比手性不受控制的DMD寡核苷酸以更低量的單個劑量和/或總劑量給予。在一些實施方式中，由於改進的功效，將手性受控的DMD寡核苷酸以比手性不受控制的DMD寡核苷酸以更低量的單個劑量和/或總劑量給予。在一些實施方式中，將手性受控的DMD寡核苷酸以比手性不受控制的DMD寡核苷酸以更高量的單個劑量和/或總劑量給予。在一些實施方式中，由於改進的安全性，將手性受控的DMD寡核苷酸以比手性不受控制的DMD寡核苷酸以更高量的單個劑量和/或總劑量給予。
藥物組成物
當用作治療劑時，本文所述的提供的DMD寡核苷酸或DMD寡核苷酸組成物作為藥物組成物給予。在一些實施方式中，藥物組成物包含治療有效量的提供的DMD寡核苷酸或其藥學上可接受的鹽，以及選自以下的至少一種藥學上可接受的非活性組分：藥學上可接受的稀釋劑、藥學上可接受的賦形劑、和藥學上可接受的載體。在一些實施方式中，在提供的組成物中提供的DMD寡核 苷酸能以鹽(較佳地，藥學上可接受的鹽，例如，鈉鹽、銨鹽等)存在。在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸的鹽包含兩個或更多個陽離子，例如，在一些實施方式中，高達DMD寡核苷酸中帶負電荷的酸性基團(例如，磷酸根、硫代磷酸根等)的數量。如熟悉該項技術者所理解的，能以鹽形式(特別地，藥學上可接受的鹽形式)提供的和/或利用本文所述的DMD寡核苷酸。
在一些實施方式中，本揭露提供了提供的DMD寡核苷酸(例如，手性受控的DMD寡核苷酸)的鹽、及其藥物組成物。在一些實施方式中，鹽係藥學上可接受的鹽。在一些實施方式中，可以捐贈給鹼的每種氫離子(例如，在水溶液、藥物組成物等的條件下)被非H+陽離子替換。例如，在一些實施方式中，DMD寡核苷酸的藥學上可接受的鹽係全金屬離子鹽，其中每個核苷酸間鍵(例如，天然磷酸酯鍵、硫代磷酸酯二酯鍵等)的每個氫離子(例如，-OH、-SH等，在水中足夠酸性)被金屬離子取代。在一些實施方式中，提供的鹽係全鈉鹽。在一些實施方式中，提供的藥學上可接受的鹽係全鈉鹽。在一些實施方式中，提供的鹽係全鈉鹽，其中每個核苷酸間鍵係天然磷酸酯鍵(酸形式-O-P(O)(OH)-O-)，如果有的話，以其鈉鹽形式(-O-P(O)(ONa)-O-)存在，並且每個核苷酸間鍵係硫代磷酸酯二酯鍵(硫代磷酸酯核苷酸間鍵；酸形式-O-P(O)(SH)-O-)，如果有的話，以其鈉鹽形式(-O-P(O)(SNa)-O-)存在。
在一些實施方式中，配製藥物組成物用於靜脈內注射、口服給藥、口腔給藥、吸入、鼻腔給藥、局部給藥、眼科給藥或耳用給藥。在一些實施方式中，藥物組成物係片劑、丸劑、膠囊、液體、吸入劑、鼻噴霧劑溶液、栓劑、懸浮液、凝膠、膠體、分散體、懸浮液、溶液、乳液、軟膏、洗液、滴眼液、或滴耳液。
在一些實施方式中，本揭露提供了包含與藥學上可接受的賦形劑混合的手性受控的DMD寡核苷酸、或其組成物的藥物組成物。熟悉該項技術者 將認識到藥物組成物包括上述的手性受控的DMD寡核苷酸或其組成物的藥學上可接受的鹽。
多種超分子奈米載體可用於遞送核酸。示例奈米載體包括但不限於脂質體、陽離子聚合物複合物、和各種聚合物。核酸與各種聚陽離子的複合係細胞內遞送的另一種方法；這包括使用聚乙二醇化的聚陽離子、聚乙烯胺(PEI)複合物、陽離子嵌段共聚物、和樹狀聚合物。若干種陽離子奈米載體(包括PEI和聚醯胺樹狀聚合物)有助於從內體釋放內容物。其他方法包括使用聚合物奈米顆粒、聚合物膠束、量子點和脂質複合物。在一些實施方式中，DMD寡核苷酸與其他分子綴合。
除本文所述的遞送策略之外，還已知另外的核酸遞送策略。
在治療和/或診斷應用中，本揭露的化合物可以配製用於多種給藥方式，包括全身和局部(topical或localized)給藥。技術和配製物通常可以在Remington,The Science and Practice of Pharmacy[雷明頓：藥學科學與實踐]，(第20版2000)中找到。
提供的DMD寡核苷酸及其組成物在寬劑量範圍內有效。例如，在成年人的治療中，劑量為從約0.01至約1000mg、從約0.5至約100mg、從1至約50mg/天、和從約5至約100mg/天係例如可以使用的劑量。確切的劑量將取決於給藥途徑、給予的化合物的形式、待治療的受試者、待治療的受試者的體重、以及主治醫師的偏好和經驗。
藥學上可接受的鹽通常是熟悉該項技術者所熟知的，並且可以包括，例如但不限於，乙酸鹽、苯磺酸(benzenesulfonate)、苯磺酸鹽(besylate)、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、酒石酸氫鹽、溴化物、乙二胺四乙酸鈣、牛磺酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、乙二磺酸鹽、丙酸酯月桂硫酸鹽(estolate)、酚磺乙胺(esylate)、延胡索酸鹽(fumarate)、葡萄糖酸鹽(gluceptate)、葡 糖酸鹽(gluconate)、麩胺酸鹽、對羥乙醯胺基苯胂酸鹽(glycollylarsanilate)、己基間苯二酚鹽(hexylresorcinate)、氫溴化物、鹽酸鹽、羥萘甲酸鹽、碘化物、羥乙磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖醛酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸、黏酸鹽、萘磺酸鹽、硝酸鹽、雙羥萘酸鹽(pamoate、embonate)、泛酸鹽、磷酸酯/二磷酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽(tearate)、鹼式乙酸鹽(subacetate)、琥珀酸鹽、硫酸鹽、鞣酸鹽、酒石酸鹽、或茶氯酸鹽(teoclate)。其他藥學上可接受的鹽可以例如在，Remington,The Scienceand Practice of Pharmacy[雷明頓：藥學科學與實踐]，(第20版2000)中找到。較佳的藥學上可接受的鹽包括，例如，乙酸鹽、苯甲酸鹽、溴化物、碳酸鹽、檸檬酸鹽、葡糖酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、萘磺酸鹽、雙羥萘酸鹽(pamoate、embonate)、磷酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽或酒石酸鹽。
如本領域具有普通技術的人所理解的，DMD寡核苷酸可以配製成許多鹽，例如用於藥物用途。在一些實施方式中，鹽係金屬陽離子鹽和/或銨鹽。在一些實施方式中，鹽係DMD寡核苷酸的金屬陽離子鹽。在一些實施方式中，鹽係DMD寡核苷酸的銨鹽。代表性鹼金屬或鹼土金屬鹽包括鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽等。在一些實施方式中，鹽係DMD寡核苷酸的鈉鹽。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽在適當時包括與DMD寡核苷酸形成的無毒銨、季銨、和胺陽離子。如本領域具有普通技術的人所理解的，DMD寡核苷酸的鹽可含有多於一個陽離子，例如鈉離子，因為在DMD寡核苷酸內可存在多於一種陰離子。
取決於所治療的具體的條件，可將該等藥劑配製成液體或固體劑型，並全身或局部給藥。如熟悉該項技術者已知的，可以例如以定時或持續低釋放形式遞送藥劑。配製和給予的技術可以在Remington,The Science and Practice of Pharmacy[雷明頓：藥學科學與實踐]，(第20版2000)中找到。合適的途徑可包括口服、口腔、藉由吸入噴霧、舌下、直腸、透皮、陰道、透黏膜、鼻或腸給藥； 腸外遞送，包括肌內、皮下、髓內注射、以及鞘內、直接心室內、靜脈內、關節內、胸骨內、滑膜內、肝內、病灶內、顱內、腹膜內、鼻內或眼內注射、或其他遞送方式。
對於注射，本揭露的試劑可以在水性溶液中進行配製，如在生理相容性緩衝液中，例如漢克斯(Hanks')溶液、格林斯(Ringer's)溶液、或生理鹽水緩衝液。對於這種穿黏膜給予，在配製物中使用適合有待滲透的障礙的滲透劑。該等滲透劑係本領域公知的。
使用藥學上可接受的惰性載體將本文揭露的用於實施本揭露的化合物配製成適於全身給藥的劑量在本揭露的範圍內。藉由適當選擇載體和合適的製造方法，本揭露的組成物，特別是配製成溶液的組成物，可以胃腸外給藥，例如藉由靜脈內注射。
可以使用本領域熟知的藥學上可接受的載體將化合物(例如，DMD寡核苷酸)容易地配製成適於口服給藥的劑量。此類載體使得本揭露的化合物被配製為片劑、丸劑、膠囊、液體、膠體、糖漿劑、藥漿、懸浮液等，用於由被治療的患者口服攝取。
對於鼻或吸入遞送，本揭露的藥劑也可以藉由熟悉該項技術者已知的方法配製，並且可以包括，例如但不限於，增溶、稀釋或分散物質(如，鹽水、防腐劑(如苯甲醇)、吸收促進劑、和碳氟化合物)的實例。
在某些實施方式中，DMD寡核苷酸和組成物遞送至CNS。在某些實施方式中，DMD寡核苷酸和組成物遞送至腦脊髓液。在某些實施方式中，DMD寡核苷酸和組成物給予至腦實質。在某些實施方式中，藉由鞘內給予或腦室內給予將DMD寡核苷酸和組成物遞送至動物/受試者。本文所述的DMD寡核苷酸和組成物在中樞神經系統內的廣泛分佈可藉由實質內給予、鞘內給予、或腦室內給予來實現。
在某些實施方式中，腸胃外給藥係藉由注射，例如注射器，泵等。在某些實施方式中，注射係快速濃注。在某些實施方式中，注射直接給予至組織，如紋狀體、尾狀核、皮質、海馬體、和小腦。
在某些實施方式中，特異性定位藥劑的方法(如，藉由快速濃注)將中值有效濃度(EC50)降低20、25、30、35、40、45、或50倍。在某些實施方式中，靶組織係腦組織。在某些實施方式中，靶組織係紋狀體組織。在某些實施方式中，降低EC50係所希望的，因為它減少了在有此需要的患者中實現藥理學結果所需的劑量。
在某些實施方式中，將DMD寡核苷酸藉由注射或輸注每月、每兩個月、每90天、每3個月、每6個月、每年兩次或每年一次遞送。
本揭露中適合使用的藥物組成物包括如下組成物，其中該組成物包含有效量的活性成分以實現它的預期目標。有效量的確定完全在熟悉該項技術者的能力之內，尤其是根據於此提供的具體揭露。
除活性成分外，該等藥物組成物可以含有合適的藥學上可接受的載體(包含賦形劑和助劑)，其有助於將活性化合物加工成可藥用的製劑。配製的用於口服給藥的製劑可以是片劑、糖衣丸、膠囊或溶液的形式。
口服用的藥物製劑可藉由以下方法而獲得，將該等活性化合物與固體賦形劑相組合(可視需要將所得的混合物磨碎)，並加工顆粒類混合物(如果希望的話，可在添加適宜的助劑之後)，以獲得片劑或糖衣片核心。具體而言，適宜的賦形劑係填充劑如糖類，包括乳糖、蔗糖、甘露糖、或山梨醇；纖維素製劑，例如玉米澱粉、小麥澱粉、大米澱粉、馬鈴薯澱粉、明膠、黃蓍樹膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉(CMC)、和/或聚乙烯吡咯啶酮(PVP：聚維酮)。如果需要，可添加崩解劑，如交聯聚乙烯吡咯啶酮、瓊脂、或海藻酸或其鹽如海藻酸鈉。
糖衣片核心提供有合適的包衣。為此目的，可以使用濃縮的糖溶液，該等糖溶液可以視需要含有阿拉伯樹膠、滑石、聚乙烯吡咯啶酮、卡波姆膠、聚乙二醇(PEG)、和/或二氧化鈦、漆溶液和合適的有機溶劑或溶劑混合物。可以將染料或顏料添加到片劑或糖衣片包衣中，以用於標識或表徵活性化合物劑量的不同組合。
可口服使用的藥物製劑包括由明膠製成的插接式膠囊(push-fit capsule)以及由明膠與增塑劑(如甘油或山梨醇)製成的密封式軟膠囊。插接式膠囊可以包含與填充劑(諸如乳糖)、黏合劑(諸如澱粉)和/或潤滑劑(諸如滑石或硬脂酸鎂)以及視需要穩定劑相混合的活性成分。在軟膠囊中，活性化合物可以溶解或懸浮在合適的液體，如脂肪油、液體石蠟、或液體聚乙二醇(PEG)中。此外，還可以添加穩定劑。
在一些實施方式中，本文所述的任何DMD寡核苷酸或其組合、或包含本文所述的DMD寡核苷酸的任何組成物可以與本文所述的或本領域已知的任何藥物製劑組合。
組合療法
在一些實施方式中，除了提供的DMD寡核苷酸或DMD寡核苷酸組成物(例如，包含DMD寡核苷酸的組成物)之外，向受試者給予另外的治療(包括但不限於，治療劑或方法)。在一些實施方式中，將包含一種或多種DMD寡核苷酸的組成物(兩種或更多種組成物，每個包含DMD寡核苷酸)與另外的治療一起給予患者。
在一些實施方式中，本揭露涉及用於治療肌肉營養不良(杜興氏肌肉失養症(DMD)、或貝克氏肌肉失養症(BMD))之方法，該方法包括(a)向易患其或者患有其的受試者給予包含提供的DMD寡核苷酸的組成物，和(b)向 受試者給予另外的治療，該另外的治療能夠預防、治療、減輕或減緩肌肉營養不良的進展。在一些實施方式中，另外的治療係包含第二DMD寡核苷酸的組成物。
在一些實施方式中，另外的治療能夠自身預防、治療、減輕或減緩肌肉營養不良的進展。在一些實施方式中，當與提供的DMD寡核苷酸一起給予時，另外的治療能夠預防、治療、減輕或減緩肌肉營養不良的進展。
在一些實施方式中，在包含提供的DMD寡核苷酸(例如，提供的DMD寡核苷酸)的組成物之前、之後、或同時，向受試者給予另外的治療。在一些實施方式中，組成物包含一種或多種DMD寡核苷酸和另外的治療兩者。在一些實施方式中，一種或多種DMD寡核苷酸和一種或多種另外的治療在分開的組成物中。在一些實施方式中，本揭露提供了用於組成物療法的技術(例如，組成物、方法等)，例如，與其他治療劑和/或醫療程序。在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸和/或組成物可以與一個或多個其他治療劑一起使用。在一些實施方式中，提供的組成物包含提供的DMD寡核苷酸、和一個或多個其他治療劑。在一些實施方式中，當與組成物中提供的DMD寡核苷酸相比時，一個或多個其他治療劑可以具有一個或多個不同的靶、和/或針對靶的一個或多個不同的機制。在一些實施方式中，治療劑係DMD寡核苷酸。在一些實施方式中，治療劑係小分子藥物。在一些實施方式中，治療劑係蛋白質。在一些實施方式中，治療劑係抗體。可以依照本揭露利用許多治療劑。例如，用於DMD的DMD寡核苷酸可以與調節utrophin產生的一種或多種治療劑(utrophin調節劑)一起使用。在一些實施方式中，utrophin調節劑促進utrophin的產生。在一些實施方式中，utrophin調節劑係依珠卓米(ezutromid)。在一些實施方式中，utrophin調節劑係
Figure 108116317-A0202-12-0194-170
、或其藥學上可接受的鹽。在一些實施方式中，提供的 DMD寡核苷酸或其組成物在一個或多個其他治療劑和/或醫療程序之前、同時或之後給予。在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸或其組成物與一個或多個其他治療劑和/或醫療程序同時給予。在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸或其組成物在一個或多個其他治療劑和/或醫療程序之前給予。在一些實施方式中，提供的DMD寡核苷酸或其組成物在一個或多個其他治療劑和/或醫療程序之後給予。在一些實施方式中，提供的組成物包含一個或多個其他治療劑。
在一些實施方式中，將包含DMD寡核苷酸的組成物與另外的藥劑共同給予，以改善目的DMD外顯子的跳讀。在一些實施方式中，另外的藥劑係抗體、DMD寡核苷酸、蛋白質、或小分子。在一些實施方式中，另外的藥劑干擾參與剪接的蛋白質。在一些實施方式中，另外的藥劑干擾參與剪接的蛋白質，其中該蛋白質係SR蛋白質。
在一些實施方式中，另外的藥劑干擾參與剪接的蛋白質，其中該蛋白質係SR蛋白質，該蛋白質含有具有絲胺酸(S)和精胺酸(R)胺基酸殘基的一個或多個長重複序列的蛋白質結構域。據報導，SR蛋白在細胞中嚴重磷酸化，並參與組成型和可替代的剪接。Long等人2009 Biochem.J.[生物化學雜誌]417：15-27；Shepard等人2009 Genome Biol.[基因組生物學]10：242。在一些實施方式中，另外的藥劑係抑制或減少SR蛋白激酶的化學化合物。在一些實施方式中，抑制或降低SR蛋白激酶的化學化合物係SRPIN340。SRPIN340報導在，例如，Fukuhura等人2006 Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]103：11329-11333中。在一些實施方式中，化學化合物係對Cdc樣激酶(Clk)具有特異性的激酶抑制劑，其也能夠磷酸化SR蛋白質。在一些實施方式中，對能夠磷酸化SR蛋白質的Cdc樣激酶(Clk)特異的激酶抑制劑係TG003。據報導，TG003在體外和體內均影響剪接。Nowak等人2010 J.Biol.Chem.[生物化學雜誌]285：5532-5540；Muraki等人2004 J.Biol.Chem.[生物化學雜誌]279：24246-24254；Yomoda 等人2008 Genes Cells[基因細胞]13：233-244；以及Nishida等人2011 Nat Commun.[自然通訊]2：308。
在一些實施方式中，在患有肌肉營養不良的患者中，肌肉組織被脂肪和結締組織替代，並且受影響的肌肉可能由於脂肪含量增加而看起來更大，這種情況稱為假性肥大。在一些實施方式中，將包含一種或多種DMD寡核苷酸的組成物與以下治療一起給予：減少或預防脂肪或纖維或結締組織的發展、或由脂肪或纖維或結締組織替換肌肉組織。
在一些實施方式中，包含一種或多種DMD寡核苷酸的組成物與以下治療一起給予：減少或預防脂肪或纖維或結締組織的發育、或由脂肪或纖維或結締組織替換肌肉組織，其中該治療係結締組織生長因子(CTGF)的抗體、纖維化的中樞介質(例如，FG-3019)。在一些實施方式中，將包含一種或多種DMD寡核苷酸的組成物與降低人體脂肪含量的藥劑一起給予。
另外的治療包括：藉由免疫調節劑(例如，類固醇和轉化生長因子-β抑制劑)減緩疾病的進展、誘導或引入可補償肌纖維中肌營養不良蛋白缺乏的蛋白質(例如utrophin、雙糖鏈蛋白聚糖、和層黏連蛋白)、或支持肌肉再生反應(例如肌肉生長抑制素和活化素2B)。
在一些實施方式中，另外的治療係能夠恢復肌細胞內鈣的正常平衡的小分子。
在一些實施方式中，另外的治療係能夠藉由校正稱為雷諾丁受體鈣通道複合物(RyR)的一種通道的活性來恢復肌細胞內鈣的正常平衡的小分子。在一些實施方式中，這種小分子係Rycal ARM210(ARMGO製藥公司(ARMGO Pharma)，塔瑞鎮(Tarry Town)，紐約)。
在一些實施方式中，另外的治療係類黃酮。
在一些實施方式中，另外的治療係類黃酮，如表兒茶素。表兒茶素係從可可樹中收穫的黑巧克力中發現的類黃酮，已在動物和人類中報導，其增加心臟和肌肉中新線粒體的產生(例如，線粒體生物發生)，同時刺激肌肉組織的再生。
在一些實施方式中，另外的治療係卵泡抑素基因治療。
在一些實施方式中，另外的治療係卵泡抑素344的腺相關病毒遞送，以增加肌肉力量並預防肌肉萎縮和纖維化。
在一些實施方式中，另外的治療係糖皮質激素。
在一些實施方式中，另外的治療係強的松。
在一些實施方式中，另外的治療係地夫可特。
在一些實施方式中，另外的治療係伐莫龍(vamorolone)(VBP15)。
在一些實施方式中，另外的治療係遞送外源肌營養不良蛋白基因或合成形式或其部分，如微肌營養不良蛋白基因。
在一些實施方式中，另外的治療係遞送外源肌營養不良蛋白基因或其部分(如微肌營養不良蛋白基因(如SGT-001))、用於遞送合成的肌營養不良蛋白基因或微肌營養不良蛋白的腺相關病毒(AAV)載體介導的基因轉移系統(實體生命科學公司(Solid BioSciences)，劍橋，麻塞諸塞州)。
在一些實施方式中，另外的治療係幹細胞治療。
在一些實施方式中，另外的治療係類固醇。
在一些實施方式中，另外的治療係皮質類固醇。
在一些實施方式中，另外的治療係強的松。
在一些實施方式中，另外的治療係β-2激動劑。
在一些實施方式中，另外的治療係離子通道抑制劑。
在一些實施方式中，另外的治療係鈣通道抑制劑。
在一些實施方式中，另外的治療係為黃原膠的鈣通道抑制劑。在一些實施方式中，另外的治療係為甲基黃嘌呤的鈣通道抑制劑。在一些實施方式中，另外的治療係己酮可可鹼的鈣通道抑制劑。在一些實施方式中，另外的治療係為選自以下的甲基黃嘌呤衍生物的鈣通道抑制劑：己酮可可鹼(pentoxifylline)、呋喃茶鹼(furafylline)、利索茶鹼(lisofylline)、丙戊茶鹼(propentofylline)、噴替茶鹼(pentifylline)、茶鹼(theophylline)、托巴茶鹼(torbafylline)、阿比茶鹼(albifylline)、恩丙茶鹼(enprofylline)、及其衍生物。
在一些實施方式中，另外的治療係心臟病或心血管疾病的治療。
在一些實施方式中，另外的治療係血壓藥物。
在一些實施方式中，另外的治療係手術。
在一些實施方式中，另外的治療係手術以固定縮短的肌肉、拉直脊柱或治療心臟或肺部問題。
在一些實施方式中，另外的治療係支架、助行器、站立助行器、或用於行走的其他機械輔助。
在一些實施方式中，另外的治療係運動和/或物理治療。
在一些實施方式中，另外的治療係輔助通氣。
在一些實施方式中，另外的治療係抗驚厥、免疫抑制劑、或便秘治療。
在一些實施方式中，另外的治療係NF-κB的抑制劑。
在一些實施方式中，另外的治療包含水楊酸和/或二十二碳六烯酸(DHA)。
在一些實施方式中，另外的治療係依達奈珍(edasalonexent)(CAT-1004，Catabasis)，水楊酸、和二十二碳六烯酸(DHA)的綴合物。
在一些實施方式中，另外的治療係基於細胞的治療。
在一些實施方式中，另外的治療係包含同種異體心球樣(cardiosphere)衍生的細胞。
在一些實施方式中，另外的治療係CAP-1002(Capricor)。
在一些實施方式中，y、t、n和m(例如，在立體化學模式中)獨立地是1-20，如在本揭露中所述的。在一些實施方式中，y係1。在一些實施方式中，y係至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些實施方式中，y係2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些實施方式中，y係1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。在一些實施方式中，y係1。在一些實施方式中，y係2。在一些實施方式中，y係3。在一些實施方式中，y係4。在一些實施方式中，y係5。在一些實施方式中，y係6。在一些實施方式中，y係7。在一些實施方式中，y係8。在一些實施方式中，y係9。在一些實施方式中，y係10。
在一些實施方式中，n係1。在一些實施方式中，n係至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些實施方式中，n係2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些實施方式中，n係1-10。在一些實施方式中，n係1、2、3、4、5、6、7或8。在一些實施方式中，n係1。在一些實施方式中，n係2、3、4、5、6、7或8。在一些實施方式中，n係3、4、5、6、7或8。在一些實施方式中，n係4、5、6、7或8。在一些實施方式中，n係5、6、7或8。在一些實施方式中，n係6、7或8。在一些實施方式中，n係7或8。在一些實施方式中，n係1。在一些實施方式中，n係2。在一些實施方式中，n係3。在一些實施方式中，n係4。在一些實施方式中，n係5。在一些實施方式中，n係6。在一些實施方式中，n係7。在一些實施方式中，n係8。在一些實施方式中，n係9。在一些實施方式中，n係10。
在一些實施方式中，m係0-50。在一些實施方式中，m係1-50。在一些實施方式中，m係1。在一些實施方式中，m係2-50。在一些實施方式中，m係至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些實施方式中，m係2、3、4、5、6、7或8。在一些實施方式中，m係3、4、5、6、7或8。在一些實施方式中，m係4、5、6、7或8。在一些實施方式中，m係5、6、7或8。在一些實施方式中，m係6、7或8。在一些實施方式中，m係7或8。在一些實施方式中，m係0。在一些實施方式中，m係1。在一些實施方式中，m係2。在一些實施方式中，m係3。在一些實施方式中，m係4。在一些實施方式中，m係5。在一些實施方式中，m係6。在一些實施方式中，m係7。在一些實施方式中，m係8。在一些實施方式中，m係9。在一些實施方式中，m係10。在一些實施方式中，m係11。在一些實施方式中，m係12。在一些實施方式中，m係13。在一些實施方式中，m係14。在一些實施方式中，m係15。在一些實施方式中，m係16。在一些實施方式中，m係17。在一些實施方式中，m係18。在一些實施方式中，m係19。在一些實施方式中，m係20。在一些實施方式中，m係21。在一些實施方式中，m係22。在一些實施方式中，m係23。在一些實施方式中，m係24。在一些實施方式中，m係25。在一些實施方式中，m係至少2。在一些實施方式中，m係至少3。在一些實施方式中，m係至少4。在一些實施方式中，m係至少5。在一些實施方式中，m係至少6。在一些實施方式中，m係至少7。在一些實施方式中，m係至少8。在一些實施方式中，m係至少9。在一些實施方式中，m係至少10。在一些實施方式中，m係至少11。在一些實施方式中，m係至少12。在一些實施方式中，m係至少13。在一些實施方式中，m係至少14。在一些實施方式中，m係至少15。在一些實施方式中，m係至少16。在一些實施方式中，m係至少17。在一些實施方式中，m係至少18。在一些實施方式中，m係至少19。在一些實施方式中，m係至少20。在一些實施方式中，m係至少21。在一些實施方式中，m係至 少22。在一些實施方式中，m係至少23。在一些實施方式中，m係至少24。在一些實施方式中，m係至少25。在一些實施方式中，m至少大於25。
在一些實施方式中，t係1-20。在一些實施方式中，t係1。在一些實施方式中，t係至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些實施方式中，t係2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些實施方式中，t係1-5。在一些實施方式中，t係2。在一些實施方式中，t係3。在一些實施方式中，t係4。在一些實施方式中，t係5。在一些實施方式中，t係6。在一些實施方式中，t係7。在一些實施方式中，t係8。在一些實施方式中，t係9。在一些實施方式中，t係10。在一些實施方式中，t係11。在一些實施方式中，t係12。在一些實施方式中，t係13。在一些實施方式中，t係14。在一些實施方式中，t係15。在一些實施方式中，t係16。在一些實施方式中，t係17。在一些實施方式中，t係18。在一些實施方式中，t係19。在一些實施方式中，t係20。
在一些實施方式中，每個t和m獨立地是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些實施方式中，每個t和m獨立地是至少3。在一些實施方式中，每個t和m獨立地是至少4。在一些實施方式中，每個t和m獨立地是至少5。在一些實施方式中，每個t和m獨立地是至少6。在一些實施方式中，每個t和m獨立地是至少7。在一些實施方式中，每個t和m獨立地是至少8。在一些實施方式中，每個t和m獨立地是至少9。在一些實施方式中，每個t和m獨立地是至少10。
如本揭露中使用的，在一些實施方式中，「一個或多個」係1-200、1-150、1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25。在一些實施方式中，「一個或多個」係一個。在一些實施方式中，「一個或多個」係兩個。在一些實施方式中，「一個或多個」係三個。在一些實施方式 中，「一個或多個」係四個。在一些實施方式中，「一個或多個」係五個。在一些實施方式中，「一個或多個」係六個。在一些實施方式中，「一個或多個」係七個。在一些實施方式中，「一個或多個」係八個。在一些實施方式中，「一個或多個」係九個。在一些實施方式中，「一個或多個」係十個。在一些實施方式中，「一個或多個」係至少一個。在一些實施方式中，「一個或多個」係至少兩個。在一些實施方式中，「一個或多個」係至少三個。在一些實施方式中，「一個或多個」係至少四個。在一些實施方式中，「一個或多個」係至少五個。在一些實施方式中，「一個或多個」係至少六個。在一些實施方式中，「一個或多個」係至少七個。在一些實施方式中，「一個或多個」係至少八個。在一些實施方式中，「一個或多個」係至少九個。在一些實施方式中，「一個或多個」係至少十個。如本揭露中使用的，在一些實施方式中，「至少一個」係1-200、1-150、1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25。在一些實施方式中，「至少一個」係一個。在一些實施方式中，「至少一個」係兩個。在一些實施方式中，「至少一個」係三個。在一些實施方式中，「至少一個」係四個。在一些實施方式中，「至少一個」係五個。在一些實施方式中，「至少一個」係六個。在一些實施方式中，「至少一個」係七個。在一些實施方式中，「至少一個」係八個。在一些實施方式中，「至少一個」係九個。在一些實施方式中，「至少一個」係十個。
除其他事項之外，本揭露提供了以下示例實施方式：
1.一種寡核苷酸，該寡核苷酸具有WV-14791的結構：fU * SfC * SfCn001RfG * SfG * SfUn001RfU * SmCfU * SmG * SfA * SmAmGfG * SfU * SfGn001RfU * SfU * SfC * SfU， 或其藥學上可接受的鹽形式，其中：f代表2'-F修飾的核苷；*S代表Sp硫代磷酸酯；m代表2'-OMe修飾的核苷；並且 n001R係
Figure 108116317-A0202-12-0203-171
，其中磷呈Rp構型。
2.一種寡核苷酸，該寡核苷酸具有WV-13826的結構：fU * SfC * SfC * SfG * SfG * SfU * SfU * SmCfU * SmG * SfA * SmAmGfG * SfU*SfG * SfU * SfU * SfC，或其藥學上可接受的鹽形式，其中：f代表2'-F修飾的核苷；*S代表Sp硫代磷酸酯；m代表2'-OMe修飾的核苷。
3.一種寡核苷酸，該寡核苷酸具有WV-13864的結構：fC * SfU * SfCn001RfC * SfG * SfGn001RfU * SfU * SmCfU * SmG * SfA * SmAfG * SfG * SfU * SfGn001RfU * SfU * SfC，或其藥學上可接受的鹽形式，其中：f代表2'-F修飾的核苷；*S代表Sp硫代磷酸酯；m代表2'-OMe修飾的核苷；並且 n001R係
Figure 108116317-A0202-12-0203-172
，其中磷呈Rp構型。
4.一種寡核苷酸，該寡核苷酸具有WV-13835的結構： fU * SfC * SfC * SfG * SfG * SfU * SfU * SmCfU * SmG * SfA * SmAmGfG * SfU * SfG * SfU * SfU * SfC * SfU，或其藥學上可接受的鹽形式，其中：f代表2'-F修飾的核苷；*S代表Sp硫代磷酸酯；並且m代表2'-OMe修飾的核苷。
5.一種寡核苷酸，該寡核苷酸具有WV-143444的結構：fC * SfU * SfCn001RfC * SfG * SfGn001RfU * SfU * SmCfU * SmG * SfA * SmAfGfG * SfU * SfGn001RfU * SfU * SfC，或其藥學上可接受的鹽形式，其中：f代表2'-F修飾的核苷；*S代表Sp硫代磷酸酯；m代表2'-OMe修飾的核苷；並且 n001R係
Figure 108116317-A0202-12-0204-175
，其中磷呈Rp構型。
6.如實施方式1-5中任一項所述的寡核苷酸，其中該寡核苷酸呈鹽形式。
7.如實施方式6所述的寡核苷酸，其中該鹽形式係鈉鹽。
8.如實施方式7所述的寡核苷酸，其中該鈉鹽中鈉離子的數量等於該寡核苷酸中硫代磷酸酯鍵和磷酸酯鍵的總數量。
9.一種手性受控的寡核苷酸組成物，該手性受控的寡核苷酸組成物包含多個如實施方式1-8中任一項所述的寡核苷酸，其中相對於具有與該寡核苷酸相同鹼基序列的寡核苷酸的基本上外消旋的製劑，該手性受控的寡核苷酸組成物富含該寡核苷酸。
10.一種藥物組成物，該藥物組成物包含治療有效量的如實施方式1-8中任一項所述的寡核苷酸，以及選自以下的藥學上可接受的非活性組分：藥學上可接受的稀釋劑、藥學上可接受的賦形劑、和藥學上可接受的載體。
11.如實施方式10所述的藥物組成物，其中該藥物組成物係溶液。
12.一種寡核苷酸組成物，用於在疾病的治療中使用，所述使用包含改變靶轉錄物的剪接， 其中：該寡核苷酸組成物的特徵在於：當該寡核苷酸組成物與轉錄物剪接系統中的該靶轉錄物接觸時，相對於在參考條件下所觀察到的，該轉錄物的剪接發生改變，該參考條件選自由以下組成之群組：不存在該組成物、存在參考組成物、及其組合。
13.如實施方式12所述使用的寡核苷酸組成物，其中(a)相對於不存在該組成物，該靶轉錄物的剪接發生改變，較佳地其中該靶轉錄物係肌營養不良蛋白的前mRNA，並且其中相對於不存在該組成物，該改變係一個或多個外顯子以增加的水平發生跳讀，更較佳地其中相對於不存在該組成物，肌營養不良蛋白的外顯子53以增加的水平發生跳讀；或者(b)其中該寡核苷酸組成物係如實施方式9-11中任一項所述的組成物。
14.如實施方式1至8中任一項所述的寡核苷酸、或如實施方式9-13中任一項所述的組成物，用於在治療杜興氏肌肉失養症中使用，所述使用包含向易患杜興氏肌肉失養症或者患有杜興氏肌肉失養症的受試者給予如實施方式1至8中任一項所述的寡核苷酸、或如實施方式9-13中任一項所述的組成物。
15.一種用於預防或治療DMD之方法，該方法包括向易患DMD或者患有DMD的受試者給予有效量的DMD寡核苷酸。
16.如實施方式15所述的方法，其中該受試者具有適於外顯子51跳讀的DMD基因突變，並且該DMD寡核苷酸可以提供外顯子51跳讀。
17.如實施方式15所述的方法，其中該受試者具有適於外顯子53跳讀的DMD基因突變，並且該DMD寡核苷酸可以提供外顯子53跳讀。
18.如實施方式15所述的方法，其中該寡核苷酸係如實施方式1-8中任一項所述的寡核苷酸。
19.如實施方式15所述的方法，其中將該寡核苷酸以如實施方式9-13中任一項所述的組成物給予。
20.一種用於製備寡核苷酸之方法，該方法包括使用手性助劑、亞磷醯胺或疊氮化物試劑、或者在說明書中描述的條件。
21.一種寡核苷酸、手性助劑、亞磷醯胺、組成物、或方法，係如在說明書中描述的。
實例
上述內容係對本揭露的某些非限制性實施方式的描述。因此，應理解，本文所述的揭露的實施方式僅說明本揭露的原理的應用。本文對所示實施方式的細節的引用並非旨在限制任何申請專利範圍的範圍。
用於製備、以及用於評估寡核苷酸和寡核苷酸組成物的特性和/或活性的某些方法係本領域廣泛已知的，該等方法包括但不限於以下中描述的那些：US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 2015/0211006、US 2017/0037399、WO 2017/015555、WO 2017/192664、WO 2017/015575、WO2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192679、和WO 2017/210647，其每個的方法和試劑藉由引用結合在此。申請人在本文描述了用於製備提供的DMD寡核苷酸和DMD寡核苷酸組成物的示例方法。
從下面描述的示例可以更全面地理解本揭露的某些實施方式的功能和優點。以下實施方式旨在說明此類實施方式的某些益處。
實例1. DMD寡核苷酸組成物的示例合成
用於製備DMD寡核苷酸及其組成物的某些技術係本領域廣泛已知的。在一些實施方式中，使用在以下的一個或多個中描述的技術(例如，試劑(例如，固體支持物、偶合試劑、切割試劑、亞磷醯胺等)、手性助劑、溶劑(例如，用於反應、洗滌等)、循環、反應條件(例如，時間、溫度等)等)來製備本揭露的DMD寡核苷酸和DMD寡核苷酸組成物：US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 2015/0211006、US 2017/0037399、WO 2017/015555、WO 2017/192664、WO 2017/015575、WO2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、PCT/US18/35687、PCT/US18/38835、和PCT/US18/51398。
實例2. 包含環狀胍部分的胺基磷酸酯核苷酸間鍵的示例合成
如本文說明的，依照本揭露，可以從亞磷酸酯核苷酸間鍵(包括立體純的亞磷酸酯核苷酸間鍵)容易地製備胺基磷酸酯核苷酸間鍵。
Figure 108116317-A0202-12-0207-176
在氬氣氛在室溫下，向亞醯胺(amidite)(474mg，0.624mmol，1.5當量，藉由與乾乙腈共蒸發並且在真空下持續最小12h預乾燥)和TBS保護的醇(150mg，0.41mmol，藉由與乾乙腈共蒸發並且在真空下持續最小12h預乾燥)在乾乙腈(5.2ml)中的攪拌的溶液中添加5-(乙基硫代)-1H-四唑(ETT，2.08 ml，0.6M，3當量)。將反應混合物攪拌5min，然後藉由LCMS監測，然後添加2-疊氮基-1,3-二甲基咪唑啉六氟磷酸鹽(356mg，1.24mmol，3當量)在乙腈(1ml)中的溶液。一旦反應完全(約5min後，藉由LCMS監測)，然後添加三乙胺(0.17ml，1.24mmol，3當量)，並反應藉由LCMS監測。將反應混合物在減壓下濃縮然後再溶於二氯甲烷(50ml)中，用水(25ml)、飽和的碳酸氫鈉水溶液(25ml)、和鹽水(25ml)洗滌，並用硫酸鎂乾燥。在減壓下將溶劑去除。將粗產物藉由矽膠柱(80g)，使用DCM(5%三乙胺)和MeOH作為洗脫液進行純化。收集含有產物的級分，並將溶劑蒸發。所得產物可以含有TEA.HCl鹽。為了去除鹽，將產物再溶於DCM(50ml)中，並用飽和的水溶液碳酸氫鈉(20ml)和鹽水(20ml)洗滌，然後用硫酸鎂乾燥，並將溶劑蒸發。獲得淺黃色固體。產率：440mg(89%)。31P NMR(162MHz,CDCl3)δ -1.34,-1.98。MS計算為C51H65FN7O14PSi[M]+ 1078.17，觀察為：1078.57[M+H]+。
Figure 108116317-A0202-12-0208-177
立體純的(Rp)二聚體的合成。
在氬氣氛在室溫下，向L-DPSE手性亞醯胺(1.87g，2.08mmol，1.5當量，藉由與乾乙腈共蒸發並且在真空下持續最小12h預乾燥)和TBS保護的醇(500mg，1.38mmol，藉由與乾乙腈共蒸發並且在真空下持續最小12h預乾燥)在乾乙腈(18mL)中的攪拌的溶液中添加2-(1H-咪唑-1-基)乙腈三氟甲磺酸酯(CMIMT，5.54mL，0.5M，2當量)。將所得反應混合物攪拌5min，然後藉由LCMS監測，然後添加2-疊氮基-1,3-二甲基咪唑啉六氟磷酸鹽(1.18g，4.16 mmol，3當量)在乙腈(2mL)中的溶液。一旦反應完全(約5min後，藉由LCMS監測)，將反應混合物在減壓下濃縮然後再溶於二氯甲烷(70mL)中，用水(40mL)、飽和的碳酸氫鈉水溶液(40mL)和鹽水(40mL)洗滌，並用硫酸鎂乾燥。在減壓下將溶劑去除。將粗產物藉由矽膠柱(120g)，使用DCM(5%三乙胺)和MeOH作為洗脫液進行純化。收集含有產物的級分，並將溶劑蒸發。所得產物含有TEA.HCl鹽。為了去除鹽，將產物再溶於DCM(50mL)中，並用飽和的碳酸氫鈉水溶液(20mL)和鹽水(20mL)洗滌，然後用硫酸鎂乾燥，並將溶劑蒸發。獲得淡黃色泡沫固體。產率：710mg(47%)。31P NMR(162MHz,CDCl3)δ -1.38。MS計算為C51H65FN7O14PSi[M]+ 1078.17，觀察為：1078.19。
Figure 108116317-A0202-12-0209-180
立體純的(Sp)二聚體的合成
遵循與Rp二聚體相同的程序。代替L-DPSE手性亞醯胺，使用D-DPSE手性亞醯胺。獲得淡黃色泡沫固體。產率：890mg(59%)。31P NMR(162MHz,CDCl3)δ -1.93。MS計算為C51H65FN7O14PSi[M]+ 1078.17，觀察為：1078.00。
在實例31P NMR(在δ 0.0的磷酸內標)中，立體隨機製劑分別在-1.34和-1.98顯示兩個峰；立體純的Rp製劑在-1.93顯示峰，並且立體純的Sp製劑在-1.38顯示峰。
實例3. 製備具有包含中性胍基團的核苷酸間鍵的DMD寡核苷酸
依照本揭露中所述的技術，可以製備具有各種中性和/或陽離子的核苷酸間鍵(例如，在生理pH)的DMD寡核苷酸。下面說明的是包含代表性的此類核苷酸間鍵的DMD寡核苷酸的製備。
WV-11237係包含四個核苷酸間鍵的DMD寡核苷酸，其具有
Figure 108116317-A0202-12-0210-366
結構(n001)向骨架引入中性性質並降低骨架的總負電荷。預期的分 子量：7113.4。
例如，下面描述WV-11237的一種製備，該等製備包括某些合成條件和分析結果。簡而言之，使用L-DPSE亞醯胺和典型的DPSE偶合循環(包含去三苯甲基->偶合->預加帽(Pre-Cap)->硫醇化->後加帽(Post-Cap))構建立體純核苷酸間鍵。修飾對於n001核苷酸間鍵的循環，並包含去三苯甲基->偶合->二甲基咪唑鎓處理->後加帽。與某些氧化循環相比，例如，用I2-吡啶-水來氧化P(III)的氧化步驟被二甲基咪唑鎓處理替換。
示例製備的某些條件和/或結果。
合成規模：127μmol
合成條件(立體純的核苷酸間鍵)
Figure 108116317-A0202-12-0210-181
帽A=20%：80%=NMI：ACN(v/v)
帽B=20%：30%：50%=Ac2O：2,6-二甲基砒啶：ACN(v/v/v)
合成條件(立體隨機n001)
Figure 108116317-A0202-12-0211-184
合成過程參數：
合成器：AKTA Oligopilot 100
固體支持物：CPG 2'氟-U(85umol/g)
合成規模：127umol；1.5gm
柱直徑：20mm
柱體積：6.3mL
立體純的偶合試劑：
單體：0.2M，在MeCN(2'氟-dA-L-DPSE、2'氟-dG-L-DPSE、2'-OMe-A-L-DPSE)中；0.2M，在20%異丁腈/MeCN(2'氟-dC-L-DPSE、2'氟-U-L-DPSE)中
去封閉：3% DCA，在甲苯中
活化劑：0.6M CMIMT，在MeCN中
硫化：0.2M蒼耳烷氫化物，在吡啶中
帽A：20% NMI，在MeCN中
帽B：乙酸酐、二甲基砒啶、MeCN(20：30：50)
預加帽：淨帽B
立體隨機偶合試劑：
單體：0.2M，在MeCN(2'OMeA和2'OMeG)中
去封閉：3% DCA，在甲苯中
活化劑：0.6M ETT，在MeCN中
2-疊氮基-1,3-二甲基咪唑啉-六氟磷酸鹽：0.1M，在MeCN中
帽A：20% NMI，在MeCN中
帽B：乙酸酐、二甲基砒啶、MeCN
去保護條件：
藉由首先用5M TEA.HF(在DMSO中、H 2 O、三乙胺(pH 6.8))處理支持物對一個罐去保護。孵育：3h，室溫，80μL/μmol。隨後添加氨水(200μL/μmol)。孵育：24h，35℃。使用0.45μm過濾器對去保護的材料無菌過濾。
產率：72O.D./μmol
TEA.HF在DMSO/水中配製5X溶液，5/1，v/v：
Figure 108116317-A0202-12-0212-185
在示例粗UPLC層析圖中，有四個不同的峰，所有都具有7113.2的相同的所需分子量：
Figure 108116317-A0202-12-0212-186
示例最終QC UPLC層析圖顯示四個不同的峰，所有都具有7113.2的所需分子量(%純度95.32)。粗LC-MS顯示7113.2的所希望的分子量的單個峰(數據未顯示)。示例最終QC LC-MS顯示具有7113.1的所希望的分子量的主峰。
可以使用相似的循環條件或其變體製備其他DMD寡核苷酸，這取決於每種DMD寡核苷酸的特定化學性質。
實例4. 手性受控的非負電荷的核苷酸間鍵
二聚體合成。
此程序時製得立體純的二聚體磷酸酯骨架，然後將其併入DMD寡核苷酸(例如，反義DMD寡核苷酸或ASO、單股的RNAi試劑或ssRNA等)的可選擇位點。第二種方法係使用自動的DMD寡核苷酸合成器合成分子以在特定位點或完全DMD寡核苷酸處引入非負電荷的核苷酸間鍵(例如，中性核苷酸間鍵)。
Figure 108116317-A0202-12-0213-187
立體純的(Rp)二聚體的一般實驗程序(B)：在氬氣氛在室溫下，向L(或)D-DPSE手性亞醯胺(1.87g，2.08mmol，1.5當量，藉由與乾乙腈共蒸發並且保持在真空下持續最小12h預乾燥)和TBS保護的醇(500mg，1.38mmol，藉由與乾乙腈共蒸發並且保持在真空下持續最小12h預乾燥)在乾乙腈(18mL)中的攪拌的溶液中添加2-(1H-咪唑-1-基)乙腈三氟甲磺酸酯(CMIMT，5.54mL，0.5M，2當量)。將所得反應混合物攪拌5min，然後藉由LCMS監測，然後添加2-疊氮基-1,3-二甲基咪唑啉六氟磷酸鹽(1.18g，4.16mmol，3當量)在乙腈(2mL)中的溶液。一旦反應完全(約5min後，藉由LCMS監測)，然後將反應混合物在減壓下濃縮然後再溶於二氯甲烷(70mL)中，用水(40mL)、飽和的碳酸氫鈉水溶液(40mL)和鹽水(40mL)洗滌，用硫酸鎂乾燥。在減壓下將溶劑去除。將粗產物藉由矽膠柱(120g)，使用DCM(2%三乙胺)和MeOH 作為洗脫液進行純化。蒸發含有產物的級分。獲得淡黃色泡沫固體1002。產率：710mg(47%)。31P NMR(162MHz,CDCl3)δ -1.38。MS(ES)m/z計算為C51H65FN7O14PSi[M]+ 1077.40，觀察為：1078.19[M+H]+。
Figure 108116317-A0202-12-0214-189
立體純的(Sp)二聚體1003：程序B遵循上文所示的。使用D-DPSE手性亞醯胺。獲得淡黃色泡沫固體。產率：890mg(59%)。 31 P NMR(162MHz,CDCl 3 )δ-1.93。MS(ES)m/z計算為C 51 H 65 FN 7 O 14 PSi[M] + 1077.40，觀察為：1078.00[M+H] + 。
去保護TBS基團的一般實驗程序(C)：在室溫，向TBS保護的化合物(9.04mmol)在THF(70mL)中的攪拌的溶液中添加TBAF(1.0M，13.6mmol)。將反應混合物在室溫攪拌2-4h。LCMS顯示沒有剩餘起始材料，然後濃縮，然後使用ISCO-combiflash系統(330g金rediSep高性能矽膠柱預平衡的3 CV，2% TEA，在DCM中)和DCM/甲醇/2% TEA作為梯度洗脫液進行純化。將含有柱級分的產物合併在一起並蒸發，然後在高真空下乾燥得到純的產物。
手性亞醯胺的一般實驗程序(D)：在35℃，將TBS去保護的化合物(2.5mmol)藉由與80mL的無水甲苯(30mL x 2)共蒸發進行乾燥，並在高真空下乾燥過夜。然後將乾燥的其溶於乾THF(30mL)中，隨後添加三乙胺(17.3mmol)，然後將反應混合物冷卻至-65℃[對於鳥嘌呤味：在-65℃添加2.5mmol TMS-Cl；對於無鳥嘌呤味，未添加TMS-Cl]。通過注射器經2min將[(1R,3S,3aS)-1-氯-3-((甲基聯苯矽基)甲基)四氫-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧雜氮雜磷雜茂 (或)(1S,3R,3aR)-1-氯-3-((甲基聯苯矽基)甲基)四氫-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧雜氮雜磷雜茂(1.8當量)的THF溶液添加至以上反應混合物中，然後逐漸溫至室溫。在20-30min，在室溫，TLC以及LCMS指示起始材料轉化為產物(反應時間：1h)。然後在氬氣下使用無空氣過濾管過濾反應混合物，用THF洗滌並在26℃在旋轉蒸發儀下乾燥得到粗固體材料，藉由ISCO-combiflash系統(40g高rediSep高性能矽膠柱(用CH3CN/5% TEA的3 CV，然後用DCM/5% TEA預平衡的3CV)，使用DCM/CH3CN/5% TEA作為溶劑(化合物10-40 DCM/CH3CN/5% TEA中洗脫)進行純化。蒸發後，將合併在一起的柱級分在高真空下乾燥，得到白色固體，以給出分離的產率。
31P NMR(磷酸在δ0.0的內標)：1001：-1.34以及-1.98。1002：-1.93.1003：-1.38.1001、1002、和1003的1H NMR證明了非鏡像異構物的多個氫的不同化學位移。LCMS顯示兩種非鏡像異構物的保留時間也不同。在一種情況下，觀察到以下保留時間：1001為1.90和2.15，並且一種非鏡像異構物為1.92，另一種為非鏡像異構物為2.17。
Figure 108116317-A0202-12-0215-190
化合物1004：隨後是程序B和C，灰白色泡沫固體，產率：(36%)。31P NMR(162MHz,CDCl3)δ -1.23。MS(ES)m/z計算為C47H54FN8O14P[M]+ 1004.34，觀察為：1043.21[M+K]+。
化合物1005：使用程序D，灰白色泡沫固體，產率：(81%)。31P NMR(162MHz,CDCl3)δ 154.43,-2.52。MS(ES)m/z計算為C66H76FN9O15P2Si[M]+ 1343.46，觀察為：1344.85[M+H]+。
Figure 108116317-A0202-12-0216-191
化合物1006：隨後是程序B、和C，灰白色泡沫固體，產率：(47%)。31P NMR(162MHz,CDCl3)δ -2.54。MS(ES)m/z計算為C47H54FN8O14P[M]+ 1004.34，觀察為：1043.12[M+K]+。
化合物1007：使用程序D，灰白色泡沫固體，產率：(81%)。31P NMR(162MHz,CDCl3)δ 153.55,-2.20。MS(ES)m/z計算為C66H76FN9O15P2Si[M]+ 1343.46，觀察為：1344.75[M+H]+。
Figure 108116317-A0202-12-0216-193
化合物1008：隨後是程序B和C，灰白色泡沫固體，產率：(36%)。31P NMR(162MHz,CDCl3)δ -1.38。MS(ES)m/z計算為C58H63FN13O13P[M]+ 1199.43，觀察為：1200.76[M+H]+。
化合物1009：使用程序D，灰白色泡沫固體，產率：(60%)。31P NMR(162MHz,CDCl3)δ 157.26,-2.86。MS(ES)m/z計算為C77H85FN14O14P2Si[M]+ 1538.55，觀察為：1539.93[M+H]+。
Figure 108116317-A0202-12-0217-195
化合物1010：隨後是程序B和C，灰白色泡沫固體，產率：(36%)。31P NMR(162MHz,CDCl3)δ -2.82。MS(ES)m/z計算為C58H63FN13O13P[M]+ 1199.43，觀察為：1200.19[M+H]+。
化合物1011：使用程序D，灰白色泡沫固體，產率：(63%)。31P NMR(162MHz,CDCl3)δ 159.56,-2.99。MS(ES)m/z計算為C77H85FN14O14P2Si[M]+ 1538.55，觀察為：1539.83[M+H]+。
Figure 108116317-A0202-12-0218-196
化合物1012：隨後是程序B和C，灰白色泡沫固體，產率：(36%)。
Figure 108116317-A0202-12-0218-242
。31P NMR(162MHz，氯仿-d)δ -1.83。1H NMR(400
MHz,氯仿-d)δ 12.14(s,1H),11.28(s,1H),9.15(s,1H),8.56(s,1H),8.25-7.94(m,2H),7.90(s,1H),7.72-7.48(m,2H),7.44(dd,J=8.2,6.7Hz,2H),7.35-7.26(m,2H),7.24-7.02(m,8H),6.81-6.56(m,4H),6.04(d,J=5.2Hz,1H),5.67(d,J=5.5Hz,1H),4.83(dt,J=8.6,4.4Hz,1H),4.71-4.54(m,2H),4.49(dt,J=14.2,4.8Hz,2H),4.35(ddt,J=11.0,5.1,3.2Hz,1H),4.28-4.09(m,2H),3.68(s,6H),3.37(d,J=3.3Hz,7H),3.33-3.17(m,5H),2.82(s,5H),2.74-2.60(m,1H),1.92(s,2H),1.72-1.50(m,1H),1.08(d,J=6.9Hz,3H),0.94(d,J=6.9Hz,3H)。MS(ES)m/z計算為C59H66N13O14P 1211.45[M]+，觀察為：1212.42[M+H]+。
化合物1013：使用程序D，灰白色泡沫固體，產率：(78%)。[α]
Figure 108116317-A0202-12-0218-241
。31P NMR(162MHz，氯仿-d)δ 159.42,-2.47。MS(ES) m/z計算為C78H88N14O15P2Si 1550.57[M]+，觀察為：1551.96[M+H]+。
Figure 108116317-A0202-12-0219-197
化合物1014：隨後是程序B和C，灰白色泡沫固體，產率：(30%)。
Figure 108116317-A0202-12-0219-244
。MS(ES)m/z計算為C59H66N13O14P 1211.45[M]+， 觀察為：1212.80[M+H]+。
化合物1015：使用程序D，灰白色泡沫固體，產率：(68%)。[α]
Figure 108116317-A0202-12-0219-243
。MS(ES)m/z計算為C78H88N14O15P2Si 1550.57[M]+， 觀察為：1551.77[M+H]+。
化合物1016：使用程序D，灰白色泡沫固體，產率：(64%)。31P NMR(162MHz,CDCl3)δ 156.64,-2.67。MS(ES)m/z計算為C78H88N14O15P2Si 1550.57[M]+，觀察為：1551.77[M+H]+。
Figure 108116317-A0202-12-0220-198
使用磺醯基亞醯胺的對於立體純的二聚體的一般實驗程序(E)：在氬氣氛在室溫下，向立體純的磺醯基亞醯胺1017(259mg，0.275mmol，1.5當量)和TBS保護的醇(100mg，0.18mmol)在乾乙腈(2mL)中的攪拌的溶液中添加2-(1H-咪唑-1-基)乙腈三氟甲磺酸酯(CMIMT，0.73mL，0.36mmol，0.5M，2當量)。所得反應混合物攪拌5min，並藉由LCMS監測，然後添加乙酸酐(2M，在ACN中，0.18ml，0.36mmol，2當量)和二甲基砒啶(2M，在ACN中，0.18ml，0.36mmol，2當量)的混合物，然後攪拌約5min，然後添加2-疊氮基-1,3-二甲基咪唑啉六氟磷酸鹽(104.7mg，0.367mmol，2當量)在乙腈(1mL)中的溶液。一旦反應完全(約5mim後，藉由LCMS監測)，然後添加三乙胺(0.13mL，0.91mmol，5當量)並藉由LCMS監測。一旦反應完全，將其在減壓下濃縮，然後再溶於二氯甲烷(50mL)中，用水(25mL)、飽和的碳酸氫鈉水溶液(25mL)和鹽水(25mL)洗滌，用硫酸鎂乾燥。在減壓下將溶劑去除。將粗產物藉由矽膠柱(80g)，使用DCM(2%三乙胺)和MeOH作為洗脫液進行純化。收集含有產物的級分並蒸發。獲得灰白色固體1018。產率：204mg(82%)。 31 P NMR(162MHz,CDCl 3 )δ -1.87。MS(ES)m/z計算為C 74 H 75 FN 10 O 14 P[M] + 1359.44，觀察為：1360.39[M+H] + 。
可以用於合成的另外的亞磷醯胺包括：
Figure 108116317-A0202-12-0221-199
另外的有用的手性助劑包括：
Figure 108116317-A0202-12-0221-367
。其他亞磷醯胺和手 性助劑，如以下中描述的那些：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/098264、PCT/US18/35687，和/或PCT/US18/38835，其每個的手性助劑和亞磷醯胺藉由引用結合。
實例5. 手性受控的寡核苷酸製劑-示例有用的手性助劑的示例技術
除其他事項之外，本揭露提供了用於製備手性受控的核苷酸間鍵的技術(例如，手性助劑、亞磷醯胺、循環、條件、試劑等)。在一些實施方式中，提供的技術特別可用於製備包含P-N=(其中P係鍵)的某些核苷酸間鍵，例如，非負電荷的核苷酸間鍵、中性核苷酸間鍵等。在一些實施方式中，該連接磷係三價的。在本文實例中描述了某些示例技術(手性助劑及其配製物、亞磷醯胺及其配製物、循環、條件、試劑等)。除其他事項之外，當與參考手性助劑(例如，式O、P、Q、R或DPSE的手性助劑)相比時，此類手性助劑提供更溫和的反應條件、更高的官能基相容性、可替代的去保護和/或切割條件、更高的粗品 和/或純化的產率、更高的粗品純度、更高的產物純度、和/或更高的(或基本上相同的或可比較的)立體選擇性。
Figure 108116317-A0202-12-0222-201
兩個批次並行：在-70℃，向甲基苯磺醯基(102.93g，658.96mmol，1.5當量)在THF(600mL)的溶液中逐滴添加KHMDS(1M，658.96mL，1.5當量)，並緩慢地經30min溫至-30℃。然後將混合物冷卻至-70℃。在-70℃，逐滴添加化合物1(150g，439.31mmol，1當量)在THF(400mL)中的溶液。將混合物在-70℃攪拌3hr。TLC(石油醚：乙酸乙酯=3：1，Rf=0.1)指示化合物1被完全消耗，並且檢測到一個具有較大極性的主要的新斑點。合併2個批次。將反應混合物藉由添加飽和NH4Cl(水性，1000mL)淬滅，然後用EtOAc(1000mL x 3)萃取。將合併的有機層經Na2SO4乾燥，過濾，並在減壓下濃縮以給出1000mL溶液。然後添加MeOH(600mL)，在減壓下濃縮以給出1000mL溶液，然後過濾殘餘物並用MeOH(150mL)洗滌；將殘餘物用THF(1000mL)和MeOH(600mL)溶解，然後在減壓下濃縮以給出1000mL溶液。然後過濾以給出殘餘物，並用MeOH(150mL)洗滌。並且再重複一遍。獲得呈白色固體的化合物2(248g，粗品)。並將合併的母液在減壓下濃縮以給出呈黃色油的化合物3(200g，粗品)。
化合物2：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ=7.80(d,J=7.5Hz,2H),7.74-7.66(m,1H),7.61-7.53(m,2H),7.47(d,J=7.5Hz,6H),7.24-7.12(m,9H),4.50-4.33(m,1H),3.33(s,1H),3.26(ddd,J=2.9,5.2,8.2Hz,1H),3.23-3.10(m, 2H),3.05-2.91(m,2H),1.59-1.48(m,1H),1.38-1.23(m,1H),1.19-1.01(m,1H),0.31-0.12(m,1H)。
化合物WV-CA-108的製備。
Figure 108116317-A0202-12-0223-368
向化合物2(248g，498.35mmol，1當量)在THF(1L)中的溶液中添加HCl(5M，996.69mL，10當量)。將混合物在15℃攪拌1hr。TLC(石油醚：乙酸乙酯=3：1，Rf=0.03)指示化合物2被完全消耗，並且檢測到一個具有較大極性的主要的新斑點。將所得混合物用MTBE(500mL x 3)洗滌。將合併的有機層用水(100mL)反萃取。將合併水層用5M NaOH水溶液調節至pH 12，並用DCM(500mL x 3)萃取。將合併的有機層經無水Na 2 SO 4 乾燥、過濾並濃縮以得到白色固體。獲得呈白色固體的WV-CA-108(122.6g，粗品)。
1 H NMR(400MHz，氯仿-d)δ=7.95(d,J=7.5Hz,2H),7.66(t,J=7.5Hz,1H),7.57(t,J=7.7Hz,2H),4.03(ddd,J=2.6,5.3,8.3Hz,1H),3.37-3.23(m,2H),3.20-3.14(m,1H),2.91-2.75(m,3H),2.69(br s,1H),1.79-1.54(m,5H)； 13 C NMR(101MHz，氯仿-d)δ=139.58,133.83,129.28,127.98,67.90,61.71,59.99,46.88,25.98,25.84；LCMS[M+H] + ：256.1.LCMS純度：100%。SFC 100%純度。
化合物WV-CA-237的製備。
Figure 108116317-A0202-12-0223-369
向化合物3(400.00g，803.78mmol)在THF(1.5L)中的溶液中添加HCl(5M，1.61L)。將混合物在15℃攪拌2hr。TLC指示化合物3被完全消耗，並且檢測到一個具有較大極性的主要的新斑點。將所得混合物用MTBE(500mL x 3)洗滌。將合併水層用5M NaOH水溶液調節至pH 12，並用DCM(500mL x 1)和EtOAc(1000mL x 2)萃取。將合併的有機層經無水Na2SO4乾燥，過濾，並濃縮以得到棕色固體。獲得呈棕色固體的WV-CA-237(100g，粗品)。
將殘餘物藉由柱層析法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯=3/1至乙酸乙酯：甲醇=1：2)進行純化以給出24g粗品。然後將4g殘餘物藉由製備型HPLC(柱：Phenomenex luna C18 250 x 50mm x 10um；流動相：[水(0.05% HCl)-ACN]；B%：2%→20%，15min)進行純化以給出呈白色固體的所希望的化合物(2.68g，產率65%)。獲得呈白色固體的WV-CA-237(2.68g)。WV-CA-237：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ=7.98-7.88(m,2H),7.68-7.61(m,1H),7.60-7.51(m,2H),4.04(dt,J=2.4,5.6Hz,1H),3.85(ddd,J=3.1,5.6,8.4Hz,1H),3.37-3.09(m,3H),2.95-2.77(m,3H),1.89-1.53(m,4H),1.53-1.39(m,1H)；13C NMR(101MHz,氯仿-d)δ=139.89,133.81,133.70,129.26,129.16,128.05,127.96,68.20,61.77,61.61,61.01,60.05,46.67,28.02,26.24,25.93；LCMS[M+H]+：256.1。LCMS純度：80.0%。SFC dr=77.3：22.7。
Figure 108116317-A0202-12-0224-204
向化合物4(140g，410.02mmol)在THF(1400mL)中的溶液中添加甲基苯磺醯基(96.07g，615.03mmol)，然後在0.5hr添加KHMDS(1M，615.03mL)。將混合物在-70至-40℃攪拌3hr。TLC指示化合物4被消耗並且形成 一個新的斑點。在0℃，將反應混合物藉由添加飽和NH4Cl水溶液3000mL淬滅，然後用EtOAc(3000mL)稀釋並用EtOAc(2000mL x 3)萃取。經Na2SO4乾燥，過濾，並在減壓下濃縮以給出殘餘物。向粗品中添加THF(1000mL)和MeOH(1500mL)，在45℃在減壓下濃縮直至剩餘約1000mL殘餘物，過濾固體。重複3次數。獲得呈黃色固體的化合物5(590g，72.29%產率)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ=7.81(d,J=7.5Hz,2H),7.75-7.65(m,1H),7.62-7.53(m,2H),7.48(br d,J=7.2Hz,6H),7.25-7.11(m,9H),4.50-4.37(m,1H),3.31-3.11(m,3H),3.04-2.87(m,2H),1.60-1.48(m,1H),1.39-1.24(m,1H),1.11(dtd,J=4.5,8.8,12.8Hz,1H),0.32-0.12(m,1H)。
化合物WV-CA-236的製備。
Figure 108116317-A0202-12-0225-205
向化合物5(283g，568.68mmol)在THF(1100mL)中的溶液中添加HCl(5M，1.14L)。將混合物在25℃攪拌2hr。TLC指示化合物5被消耗，並且形成兩個新的斑點。將反應混合物用MTBE(1000mL x 3)洗滌，然後在0℃將水相藉由添加NaOH(5M)進行鹼化直至pH=12，然後用DCM(1000mL x 3)萃取以給出殘餘物，經Na 2 SO 4 乾燥，過濾，並在減壓下濃縮以給出殘餘物。獲得呈黃色固體的化合物WV-CA-236(280g，1.10mol，96.42%產率)。
在0℃，將粗產物添加至HCl/EtOAc(1400mL，4M)，2hr後，過濾白色固體並用MeOH(1000mL x 3)洗滌固體。LCMS顯示固體含有另一個峰(MS=297)。然後向白色固體添加H 2 O(600mL)並用DCM(300mL x 3)洗滌。向水相添加NaOH(5M)直至pH=12。然後用DCM(800mL)稀釋，並 用DCM(800mL x 4)萃取。將合併的有機層經Na 2 SO 4 乾燥，過濾，並在減壓下濃縮以給出產物。獲得呈黃色固體的化合物WV-CA-236(280g)。 1 H NMR(400MHz，氯仿-d)δ=8.01-7.89(m,2H),7.69-7.62(m,1H),7.61-7.51(m,2H),4.05(ddd,J=2.8,5.2,8.4Hz,1H),3.38-3.22(m,2H),3.21-3.08(m,1H),2.95-2.72(m,4H),1.85-1.51(m,4H)； 13 C NMR(101MHz，氯仿-d)δ=139.75,133.76,129.25,127.94,67.57,61.90,60.16,46.86,25.86。LCMS[M+H] + ：256。LCMS純度：95.94。SFC純度：99.86%。
實例6. 手性受控的寡核苷酸製劑-示例有用的亞磷醯胺的示例技術
除其他事項之外，本揭露提供了用於寡核苷酸合成的亞磷醯胺。在一些實施方式中，提供的亞磷醯胺特別可用於製備手性受控的核苷酸間鍵。在一些實施方式中，提供的亞磷醯胺特別可用於製備包含P-N=的手性受控的核苷酸間鍵，例如，非負電荷的核苷酸間鍵或中性核苷酸間鍵等。在一些實施方式中，該連接磷係三價的。在一些實施方式中，該連接磷係五價的。
氯衍生物的一般程序I：在一些實施方式中，在示例程序中，在35℃在旋轉蒸發器中藉由將手性助劑(174.54mmol)與無水甲苯(80mL x 3)共沸蒸發進行乾燥，並在真空下乾燥過夜。在氬下通過套管(起始溫度：-10.0℃，最大溫度0℃，28min添加)，將溶於無水THF(200mL)中的此乾燥的手性助劑(174.54mmol)和4-甲基
Figure 108116317-A0202-12-0226-363
啉(366.54mmol)的溶液添加至放置在三頸圓底燒瓶中的冰冷卻的(異丙醇-乾冰浴)三氯膦(37.07g，16.0mL，183.27mmol)在無水THF(150mL)中的溶液中，並將反應混合物在15℃溫熱1hr。之後，在氬下使用無氣過濾管(Chemglass：過濾管，24/40 Inner Joints，80mm OD Medium Frit,Airfree，舒倫克公司(Schlenk))，將沈澱的白色固體藉由真空過濾。在氬下在低溫(25℃)，用旋轉蒸發器去除溶劑，並將獲得的粗半固體在真空下乾燥過夜(約15h)，並直接用於下個步驟。
氯衍生物的一般程序I：在一些實施方式中，在示例程序中，在35℃在旋轉蒸發器中藉由將手性助劑(174.54mmol)與無水甲苯(80mL x 3)共沸蒸發進行乾燥，並在真空下乾燥過夜。在氬下通過套管(起始溫度：-10.0℃，最大溫度0℃，28min添加)，將溶於無水THF(200mL)中的此乾燥的手性助劑(174.54mmol)和4-甲基
Figure 108116317-A0202-12-0227-364
啉(366.54mmol)的溶液添加至放置在三頸圓底燒瓶中的冰冷卻的(異丙醇-乾冰浴)三氯膦(37.07g，16.0mL，183.27mmol)在無水THF(150mL)中的溶液中，並將反應混合物在15℃溫熱1hr。之後，在氬下使用無氣過濾管(Chemglass：過濾管，24/40 Inner Joints，80mm OD Medium Frit,Airfree，舒倫克公司(Schlenk))，將沈澱的白色固體藉由真空過濾。在氬下在低溫(25℃)，用旋轉蒸發器去除溶劑，並將獲得的粗半固體在真空下乾燥過夜(約15h)，並直接用於下個步驟。
偶合的一般程序III：在一些實施方式中，在示例程序中，在35℃，將核苷(9.11mmol)藉由與60mL無水甲苯(60mL x 2)共蒸發進行乾燥，並在真空下過夜乾燥。將乾燥的核苷溶於乾THF(78mL)中，隨後添加三乙胺(63.80mmol)然後在氬下冷卻至-5℃(對於2'F-dG/2'OMe-dG情況，使用0.95當量的TMS-Cl)。通過套管經3min添加粗品(從一般程序I(或)II製得，14.57mmol)的THF溶液，然後逐漸溫至室溫。在室溫1hr後，TLC指示SM轉化為產物(總反應時間1h)，然後在0℃將反應混合物用H 2 O(4.55mmol)淬滅，並且添加無水MgSO 4 (9.11mmol)並攪拌10min。然後將反應混合物使用無氣過濾管在氬下進行過濾，THF用洗滌，並在26℃在旋轉蒸發儀下乾燥以得到白色粗品固體產物，將其在高真空下過夜乾燥。將粗產物藉由ISCO-Combiflash系統(用乙腈預平衡的rediSep高性能矽膠柱)，使用乙酸乙酯/己烷，用1% TEA作為溶劑(化合物在100% EtOAc/己烷/1% Et 3 N中洗脫)(對於2'F-dG情況，使用乙腈/乙酸乙酯與1% TEA) 進行純化。將合併在一起柱積分蒸發後，將殘餘物在高真空下乾燥以得到呈白色固體的產物。
亞醯胺的製備(1030-1039)。
Figure 108116317-A0202-12-0228-370
1030的製備：一般程序I遵循一般程序III使用。灰白色泡沫固體。產率：(73%)。 31 P NMR(162MHz,CDCl 3 )δ 153.32。(ES)m/z計算為C 47 H 50 FN 6 O 10 PS：940.98[M] + ，觀察到的：941.78[M+H] + 。
1031的製備：一般程序I遵循一般程序III使用。灰白色泡沫固體。產率：(78%)。 31 PNMR(162MHz,CDCl 3 )δ 153.62。(ES)m/z計算為C 42 H 43 FN 3 O 10 PS：831.85[M] + ，觀察到的：870.58[M+K] + 。
1032的製備：一般程序I遵循一般程序III使用。灰白色泡沫固體。產率：(68%)。 31 P NMR(162MHz,CDCl 3 )δ 153.95。(ES)m/z計算為C 44 H 46 FN 4 O 10 PS：872.26[M] + ，觀察到的：873.62[M+H] + 。
1033的製備：一般程序I遵循一般程序III使用。白色泡沫固體。產率：(87%)。 31 P NMR(162MHz,CDCl 3 )δ 151.70。(ES)m/z計算為C 50 H 48 FN 6 O 9 PS：958.29[M] + ，觀察到的：959.79,960.83[M+H] + 。
1034的製備：一般程序I遵循一般程序III使用。灰白色泡沫固體。產率：(65%)。 31 P NMR(162MHz,CDCl 3 )δ 154.80。(ES)m/z計算為C 51 H 51 N 6 O 10 PS：971.31[M] + ，觀察到的：971.81[M+H] + 。
1035的製備：一般程序I遵循一般程序III使用。灰白色泡沫固體。產率：(76%)。 31 P NMR(162MHz,CDCl 3 )δ 156.50。(ES)m/z計算為C 53 H 55 N 6 O 11 PS：1014.33[M] + ，觀察到的：1015.81[M+H] + 。
1036的製備：一般程序I遵循一般程序III使用。灰白色泡沫固體。產率：(78%)。 31 P NMR(162MHz,CDCl 3 )δ 156.40。(ES)m/z計算為C 50 H 57 N 6 O 12 PS：996.34[M] + ，觀察到的：997.90[M+H] + 。
1037的製備：一般程序I遵循一般程序III使用。灰白色泡沫固體。產率：(73%)。 31 P NMR(162MHz,CDCl 3 )δ 154.87。(ES)m/z計算為C 46 H 52 N 3 O 12 PS：901.30[M] + ，觀察到的：940.83[M+K] + 。
1038的製備：一般程序I遵循一般程序III使用。灰白色泡沫固體。產率：(75%)。 31 P NMR(162MHz,CDCl 3 )δ 154.94。(ES)m/z計算為C 53 H 57 N 4 O 12 PS：1004.34[M] + ，觀察到的：1005.86[M+H] + 。
1039的製備：一般程序I遵循一般程序III使用。灰白色泡沫固體。產率：(80%)。 31 P NMR(162MHz,CDCl 3 )δ 153.52。(ES)m/z計算為C 44 H 47 N 4 O 10 PS：854.28[M] + ，觀察到的：855.41[M+H] + 。
亞醯胺的製備(1040-1049)。
Figure 108116317-A0202-12-0230-207
1040的製備：一般程序I遵循一般程序III使用。灰白色泡沫固體。產率：(78%)。 31 P NMR(162MHz,CDCl 3 )δ 157.80。(ES)m/z計算為C 47 H 50 FN 6 O 10 PS：940.98[M] + ，觀察到的：941.68[M+H] + 。
1041的製備：一般程序I遵循一般程序III使用。灰白色泡沫固體。產率：(78%)。 31 PNMR(162MHz,CDCl 3 )δ 157.79。(ES)m/z計算為C 42 H 43 FN 3 O 10 PS：831.85[M] + ，觀察到的：870.68[M+K] + 。
1042的製備：一般程序序I遵循一般程序III使用。灰白色泡沫固體。產率：(78%)。 31 P NMR(162MHz,CDCl 3 )δ 158.07。(ES)m/z計算為C 44 H 46 FN 4 O 10 PS：872.26[M] + ，觀察到的：873.62[M+H] + 。
1043的製備：一般程序I遵循一般程序III使用。白色泡沫固體。產率：(86%)。 31 P NMR(162MHz,CDCl 3 )δ 156.48。(ES)m/z計算為C 50 H 48 FN 6 O 9 PS：958.29[M] + ，觀察到的：959.79,960.83[M+H] + 。
1044的製備：一般程序I遵循一般程序III使用。灰白色泡沫固體。產率：(65%)。 31 PNMR(162MHz,CDCl 3 )δ 154.80。(ES)m/z計算為C 51 H 51 N 6 O 10 PS：971.31[M] + ，觀察到的：971.81[M+H] + 。
1045的製備：一般程序I遵循一般程序III使用。灰白色泡沫固體。產率：(77%)。 31 P NMR(162MHz,CDCl 3 )δ 154.74。(ES)m/z計算為C 53 H 55 N 6 O 11 PS：1014.33[M] + ，觀察到的：1015.81[M+H] + 。
1046的製備：一般程序I遵循一般程序III使用。灰白色泡沫固體。產率：(76%)。 31 P NMR(162MHz,CDCl 3 )δ 155.05。(ES)m/z計算為C 50 H 57 N 6 O 12 PS：996.34[M] + ，觀察到的：997.90[M+H] + 。
1047的製備：一般程序I遵循一般程序III使用。灰白色泡沫固體。產率：(75%)。 31 P NMR(162MHz,CDCl 3 )δ 155.44。(ES)m/z計算為C4 6 H 52 N 3 O 12 PS：901.30[M] + ，觀察到的：940.83[M+K] + 。
1048的製備：一般程序I遵循一般程序III使用。灰白色泡沫固體。產率：(73%)。 31 P NMR(162MHz,CDCl 3 )δ 155.96。(ES)m/z計算為C 53 H 57 N 4 O 12 PS：1004.34[M] + ，觀察到的：1005.86[M+H] + 。
1049的製備：一般程序I遵循一般程序III使用。灰白色泡沫固體。產率：(80%)。 31 P NMR(162MHz,CDCl 3 )δ 156.37。(ES)m/z計算為C 44 H 47 N 4 O 10 PS：854.28[M] + ，觀察到的：855.31[M+H] + 。
實例7. 用於手性受控的寡核苷酸製劑的示例技術-用於寡核苷酸合成的示例循環、條件、和試專
在一些實施方式中，本揭露提供了特別可用於製備手性受控的核苷酸間鍵的技術(例如，試劑、溶劑、條件、循環參數、切割方法、去保護方法、純化方法等)。在一些實施方式中，此類核苷酸間鍵(例如，非負電荷的核苷酸間鍵或中性核苷酸間鍵等)包含P-N=，其中P係連接磷。在一些實施方式中，該連接磷係三價的。在一些實施方式中，該連接磷係五價的。如本文所證明的，本揭露的技術可以提供溫和的反應條件、高官能基相容性、可替代的去保護和/或 切割條件、高粗品和/或純化的產率、高粗品純度、高產物純度、和/或高立體選擇性。
在一些實施方式中，用於製備天然磷酸酯鍵的循環包含以下或由其組成：去保護(例如，去三苯甲基化)、偶合、氧化(例如，使用I2/Pyr/水或本領域可用的其他合適的方法)和加帽(例如，本文所述的加帽2或本領域可用的其他合適的方法)。下面描述了一個示例循環，其中B1和B2獨立地是核鹼基。如熟悉該項技術者所理解的，種修飾(例如，糖修飾、鹼基修飾等)係相容的並且可以包括在內。
Figure 108116317-A0202-12-0232-372
在一些實施方式中，用於製備非天然磷酸酯鍵(例如，硫代磷酸酯核苷酸間鍵)的循環包含以下或由其組成：去保護(例如，去三苯甲基化)、偶合、第一加帽(例如，如本文所述的加帽-1)、修飾(例如，使用XH的硫醇化或本領域可用的其他合適的方法)、和第二加帽(例如，如本文所述的加帽-2、或本領域可用的其他合適的方法)。下面描述了一個示例循環，其中B1和B2獨立地是核鹼基。如熟悉該項技術者所理解的，各種修飾例(例如，糖修飾、鹼基修飾等)係相容的並且可以包括在內。在一些實施方式中，使用DPSE手性助劑的循環稱為DPSE循環或DPSE亞醯胺循環。
Figure 108116317-A0202-12-0233-209
在一些實施方式中，用於製備非天然磷酸酯鍵(例如，某些非負電荷的核苷酸間鍵、中性核苷酸間鍵等)或其鹽形式的循環包含以下或由其組成：去保護(例如，去三苯甲基化)、偶合、第一加帽(例如，如本文所述的加帽-1)、修飾(例如，使用ADIH或本領域可用的其他合適的方法)、和第二加帽(例如，如本文所述的加帽-2、或本領域可用的其他合適的方法)。下面描述了一個示例循環，其中B1和B2獨立地是核鹼基。如熟悉該項技術者所理解的，各種修飾例(例如，糖修飾、鹼基修飾等)係相容的並且可以包括在內。在一些實施方式中，使用PSM手性助劑的循環稱為PSM循環或PSM亞醯胺循環。
Figure 108116317-A0202-12-0234-211
可以依照本揭露利用各種切割和去保護方法。在一些實施方式中，如熟悉該項技術者所理解的，可以鑒於以下調節切割和去保護的參數(例如，鹼、溶劑、溫度、當量、時間等)：例如，待製備的DMD寡核苷酸的結構(例如，核鹼基、糖、核苷酸間鍵、及其修飾/保護)、固體支持物、反應規模等。在一些實施方式中，切割和去保護包含一個、或者兩個或更多個個體步驟。例如，在一些實施方式中，利用兩步驟切割和去保護。在一些實施方式中，切割和去保護步驟包含在合適的溶劑(例如，DMSO/H2O)中，以合適的量(例如，約100或更多(例如，100±5)mL/mmol)含氟的試劑(例如，TEA-HF，視需要用另外的鹼如TEA緩衝)，以及在合適的溫度(例如，約0-100℃、0-80℃、0-50℃、0-40℃、0-30℃、0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃或100℃(例如，在一個實例中，27℃±2℃))進行合適的時間段(例如，約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或更多小時(例如，在一個實例中，6±0.5h))。在一些實施方式中，切割和去保護步驟包含在合適的溶劑(例如，水)(例如，濃NH4OH)，在合適的量(例如，約200或更多(例如，200±5)mL/mmol)的適合的鹼基(例如，NR3)，並且在合適的溫度(例如，約0-100℃、0-80℃、0-50℃、0-40℃、0-30℃、0、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃或100℃(例如，在一個實例中，37℃±2℃))進行合適的時間段(例如，約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或更多小時(例如，在一個實例中，24±1h))。在一些實施方式中，切割和去保護包含兩個步驟或由兩個步驟組成，其中一個步驟(例如，步驟1)係1 x TEA-HF，以DMSO/H2O、100±5mL/mmol、27℃±2℃ 和6±0.5h，並且另一個步驟(例如，步驟2)係濃NH4OH、200±5mL/mmol、37℃±2℃和24±1h。本文描述了切割和去保護過程的某些實例。
如熟悉該項技術者所理解的，DMD寡核苷酸合成通常在固體支持物上進行。許多類型的固體支持物係可商購的和/或能以其他方式製備/獲得，並且可以依照本揭露利用。在一些實施方式中，固體支持物係CPG。在一些實施方式中，固體支持物係NittoPhase HL。可以基於所希望的應用選擇固體載體的類型和尺寸，並且在一些情況下，對於特定用途，一種類型的固體載體可以比另一種更好地進行。在一些實施方式中，觀察到對於某些配製物，與某些聚合物固體支持物(如NittoPhase HL)相比，CPG可以提供更高的粗品產率和/或純度。
亞胺酸鹽通常以合適的濃度溶於溶劑中。在一些實施方式中，亞醯胺溶於ACN中。在一些實施方式中，亞醯胺溶於兩個或更多個溶劑的混合物中。在一些實施方式中，亞醯胺溶於ACN和IBN(例如，20% ACN/80% IBN)的混合物。可以利用各種濃度的亞醯胺，並且可以鑒於具體的條件(例如，固體支持物、待製備的DMD寡核苷酸、反應時間、規模等)進行調節。在一些實施方式中，利用約0.01-0.5、0.05-0.5、0.1-0.5、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45或0.5M的濃度。在一些實施方式中，利用約0.2M的濃度。在很多實施方式中，亞醯胺溶液係乾燥的。在一些實施方式中，利用3Å分子篩以乾燥亞醯胺溶液(或保持亞醯胺溶液乾燥)。在一些實施方式中，利用在約15-20% v/v的分子篩。
各種當量的亞醯胺可用於DMD寡核苷酸合成中。如熟悉該項技術者將理解的，可以鑒於具體的條件(例如，固體支持物、待製備的DMD寡核苷酸、反應時間、規模等)調節亞醯胺的當量，並且在合成期間可以利用相同的或不同的等價物。在一些實施方式中，亞醯胺的當量係約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5或更多。在一些實施方式中，合適的當量係約2。在一些實施方式中， 合適的當量係約2.5。在一些實施方式中，合適的當量係約3。在一些實施方式中，合適的當量係約3.5。在一些實施方式中，合適的當量係約4。
許多活化劑係本領域可用的，並且可以依照本揭露利用。在一些實施方式中，活化劑係ETT。在一些實施方式中，活化劑係CMIMT。在一些實施方式中，將CMIMT用於手性受控的合成。如熟悉該項技術者所理解的，相同的或不同的活化劑可以用於不同的亞醯胺，並且能以不同的量利用。在一些實施方式中，以約40-100%，例如，40%、50%、60%、70%、80%或90%遞送利用活化劑。在一些實施方式中，遞送係約60%(例如，對於ETT)。在一些實施方式中，遞送係約70%(例如，對於CMIMT)。在一些實施方式中，活化劑/亞醯胺的莫耳比率係約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。在一些實施方式中，莫耳比率係約3-6。在一些實施方式中，莫耳比率係約1。在一些實施方式中，莫耳比率係約2。在一些實施方式中，莫耳比率係約3。在一些實施方式中，莫耳比率係約4。在一些實施方式中，莫耳比率係約5。在一些實施方式中，莫耳比率係約6。在一些實施方式中，莫耳比率係約7。在一些實施方式中，莫耳比率係約8。在一些實施方式中，莫耳比率係約9。在一些實施方式中，莫耳比率係約10。在一些實施方式中，莫耳比率係約2-5、2-4或3-4(例如，對於ETT)。在一些實施方式中，莫耳比率係約3.7(例如，對於ETT)。在一些實施方式中，莫耳比率係約3-8、4-8、4-7、4-6、5-7、5-8或5-6(例如，對於CMIMT)。在一些實施方式中，莫耳比率係約5.8(例如，對於CMIMT)。
如熟悉該項技術者所理解的，可以將各種合適的流速和反應時間用於DMD寡核苷酸合成，並且可以根據待製備的DMD寡核苷酸、規模、合成設置等進行調節。在一些實施方式中，用於合成的再循環流速為約200cm/h。在一些實施方式中，再循環時間係約1-10分鐘。在一些實施方式中，再循環時間係約8分鐘。在一些實施方式中，再循環時間係約10分鐘。
許多技術可用於修飾P(III)鍵，例如，在偶合後。例如，可以使用各種方法將P(III)鍵轉化為P(V)P(=O)-型鍵，例如，經由氧化。在一些實施方式中，利用I2/Pyr/H2O。相似地，許多方法可用於將P(III)鍵轉化為P(V)P(=S)-型鍵，例如，經由硫化。在一些實施方式中，如本文所示，XH用作硫醇化試劑。用於將P(III)鍵轉化為P(V)P(=N-)-型鍵的技術也是廣泛可用的，並且可以依照本揭露使用。在一些實施方式中，如本文所示，採用ADIH。本文描述了合適的反應參數。在一些實施方式中，將ADIH以約0.01-0.5、0.05-0.5、0.1-0.5、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45或0.5M的濃度使用。在一些實施方式中，ADIH的濃度係約0.25M。在一些實施方式中，ADIH的濃度係約0.3M。在一些實施方式中，將ADIH以約1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-10、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45或50或更多當量利用。在一些實施方式中，ADIH的當量係約7.5。在一些實施方式中，ADIH的當量係約10。在一些實施方式中，ADIH的當量係約15。在一些實施方式中，ADIH的當量係約20。在一些實施方式中，ADIH的當量係約23。在一些實施方式中，ADIH的當量係約25。在一些實施方式中，ADIH的當量係約30。在一些實施方式中，ADIH的當量係約35。在一些實施方式中，一個實驗，以15.2當量、以及15min接觸時間利用ADIH。在一些實施方式中，取決於亞醯胺，可以調節試劑的濃度、當量、接觸時間，例如，可以調節ADIH。
本揭露的技術適合於各種規模的製備。在一些實施方式中，以數百umol或更多進行合成。在一些實施方式中，規模係約200umol。在一些實施方式中，規模係約300umol。在一些實施方式中，規模係約400umol。在一些實施方式中，規模係約500umol。在一些實施方式中，規模係約550umol。在一些實施方式中，規模係約600umol。在一些實施方式中，規模係約650umol。在一些 實施方式中，規模係約700umol。在一些實施方式中，規模係約750umol。在一些實施方式中，規模係約800umol。在一些實施方式中，規模係約850umol。在一些實施方式中，規模係約900umol。在一些實施方式中，規模係約950umol。在一些實施方式中，規模係約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25、或更多mmol。在一些實施方式中，規模係約1mmol或更多。在一些實施方式中，規模係約2mmol或更多。在一些實施方式中，規模係約5mmol或更多。在一些實施方式中，規模係約10mmol或更多。在一些實施方式中，規模係約15mmol或更多。在一些實施方式中，規模係約20mmol或更多。在一些實施方式中，規模係約25mmol或更多。
在一些實施方式中，觀察到的產率為85-90 OD/umol(例如，對於10.2mmol合成為85,000 OD/mmol，具有58.4%粗品純度(%FLP))。
除其他事項之外，當用於製備包含手性受控的核苷酸間鍵的DMD寡核苷酸(例如，包含P-N=，其中P係連接磷的那些)時，本揭露的技術可以提供各種優勢。例如，如本文所證明的，本揭露的技術可以提供高粗品純度和產率(例如，在很多實施方式中，對於20-mer DMD寡核苷酸，約55%-60%全長產物)，具有最少量的較短DMD寡核苷酸(例如，來自不完全偶合、分解等)。除其他事項之外，此類高粗品產率和/或純度可以顯著減少下游純化並且可以顯著降低生產成本和商品成本，並且在一些實施方式中，極大地促進或使得大規模商業生產、臨床試驗和/或商業化銷售成為可能。
用於製備手性受控的DMD寡核苷酸組成物-WV-13864的示例程序。
以下描述了使用可控孔徑玻璃(CPG)低堆積密度固體支持物(例如，2'-fC(乙醯基)，經由CNA接頭CPG(600Å LBD))的用於製備WV-13864的示例程序。有用的亞磷醯胺包括5'-ODMTr-2'-F-dA(N6-Bz)-(L)-DPSE亞磷醯 胺、5'-ODMTr-2'-F-dC(N4-Ac)-(L)-DPSE亞磷醯胺、5'-ODMTr-2'-F-dG(N2-iBu)-(L)-DPSE亞磷醯胺、5'-ODMTr-2'-F-dU-(L)-DPSE亞磷醯胺、5'-ODMTr-2'-OMe-G(N 2-iBu)-(L)-DPSE亞磷醯胺、5'-ODMTr-2'-F-dC(N4-Ac)-(L)-PSM亞磷醯胺、5'-ODMTr-2'-F-dG(N2-iBu)-(L)-PSM亞磷醯胺、5'-DMT-2'-OMe-A(Bz)-β-氰基乙基亞磷醯胺、和5'-DMT-2'-OMe-C(Ac)-β-氰基乙基亞磷醯胺。
使用0.1M Xanthane氫化物溶液(XH)進行硫醇化。利用0.3M的在乙腈中的2-疊氮基-1,3-二甲基-咪唑啉六氟磷酸鹽(ADIH)形成中性PN鍵。氧化溶液係在吡啶/水中的0.04-0.06M碘，90/10，v/v。帽A係在乙腈中的N-甲基咪唑，20/80，v/v。帽B係乙酸酐/2,6-二甲基砒啶/乙腈，20/30/50，v/v/v。使用甲苯中的3%二氯乙酸進行去封閉。使用的NH4OH係28%-30%濃度的氧化銨。
去三苯甲基。
為了開始合成，使5'-ODMTr-2'-F-dC(N4-Ac)-CPG固體支持物經受酸催化藉由用甲苯中的3%(DCA)處理從5'-羥基去除DMTr保護基團。DMTr去除步驟通常用強烈的紅色或橙色視覺化，並且可以藉由UV手錶命令在436nm的波長下監測。
可以在合成循環開始時重複去除DMTr。在每種情況下，在去三苯甲基化後，用乙腈洗滌支持物結合的材料，為下一步合成做準備。
偶合。
將亞醯胺以0.2M的濃度溶於乙腈(ACN)或溶於20%異丁腈(IBN)/80%ACN中，無需密度校正。在使用前，將溶液經分子篩(3Å)乾燥不小於4h(15%-20%，v/v)。
Figure 108116317-A0202-12-0240-373
Figure 108116317-A0202-12-0241-214
利用雙活化劑(CMIMT和ETT)偶合方法。將兩個活化劑均以0.5M的濃度溶於ACN中。將CMIMT已用於手性受控的偶合，其中CMIMT與亞醯胺莫耳比率為5.833/1。將ETT用於標準亞醯胺(對於，天然磷酸酯鍵)的偶合，其中ETT與亞醯胺莫耳比率為3.752/1。對於所有DPSE和PSM亞醯胺的再循環時間為10min，除了mG-L-DPSE的為8min。將所有標準亞醯胺偶合8min。
加帽-1(Cap-1、Capping-1、第一加帽(first capping))。
使用了帽B(Ac2O/2,6-二甲基吡啶/MeCN(2：3：5，v/v/v))。
在一些實施方式中，加帽-1將二級胺基團加帽到，例如，手性助劑上。在一些實施方式中，二級胺的不完全保護可能導致副反應，導致偶合失敗的偶合或形成一種或多種副產物。在一些實施方式中，加帽-1可能不是酯化的有效條件(例如，對於加帽未反應的5'-OH，係效率不及加帽-2(第二加帽)的條件)。 DPSE循環的硫醇化。
在加帽-1之後，用硫化試劑修飾亞磷酸酯中間體P(III)。在一個示例製備中，1.2CV(6-7當量)的硫化試劑(0.1M XH/吡啶-ACN，1：1，v/v)經由流過模式經6min的接觸時間通過合成柱遞送以形成P(V)。
PSM循環的疊氮化物反應。
在加帽-1後，使用在ACN中的合適的試劑(例如，包含-N3，如ADIH)以形成中性核苷酸間鍵(PN鍵)。在示例準備中，在各自的循環中，利用對於fG-L-PSM，10.3當量的0.25M ADIH經10min接觸時間，並且對於fC-L-PSM，25.8當量的0.3M ADIH經15min接觸時間。
標準核苷酸循環的氧化。
加帽-1步驟對於標準亞醯胺循環不是必須的。在將標準亞醯胺偶合到固體支持物上之後，用0.05M的碘/水/吡啶溶液氧化亞磷酸鹽中間體(P(III))以形成P(V)。在示例製備中，3.5當量的氧化溶液遞通過流通模式經2min接觸時間送至柱用於有效氧化。
加帽-2(Cap-2、capping-2、第二加帽(second capping))。
對於每個循環的固相DMD寡核苷酸合成的偶合效率為大約97%-100%，並且藉由例如，DMTr陽離子的釋放進行監測。將殘餘的未偶合5'-羥基基團(根據detrit監測，通常為1%-3%)在固體支持物上)用帽A(在乙腈中的20%N-甲基咪唑(NMI/ACN=20/80，v/v))和帽B(20%：30%：50%=Ac2O：2,6-二甲基砒啶：ACN(v/v/v))試劑(例如，1：1)封閉。通過流通模式經0.8min接觸時間將兩種試劑(例如，0.4CV)遞送至柱，以預防形成失敗的序列。在此步驟中也可以保護未加帽的胺基團。
如本文說明的，在一些實施方式中，DPSE亞醯胺或DPSE循環係去三苯甲基->偶合->加帽-1(Capping-1、第一加帽)->硫醇化->加帽-2(Capping-1、後加帽、第二加帽)；在一些實施方式中，PSM亞醯胺或PSM循環係去三苯甲基->偶合->加帽-1(Cap-1、Capping-1、第一加帽)->疊氮化物反應->加帽-2(Cap-2、Capping-1、後加帽、第二加帽)；在一些實施方式中，標準亞醯胺或標準的循環(傳統的，非手性受控的)係去三苯甲基->偶合->氧化->加帽-2(Cap-2、Capping-1、後加帽、第二加帽)。
選擇合成循環並重複直至達到所希望的長度。
胺洗滌。
在一些實施方式中，提供的技術對於製備包含核苷酸間鍵(包含P-N=，其中P係連接磷)的DMD寡核苷酸係特別地有效的。在一些實施方式中， 提供的技術包含將DMD寡核苷酸中間體與鹼接觸。在一些實施方式中，在達到所希望的DMD寡核苷酸長度後進行接觸。在一些實施方式中，這種接觸提供了包含核苷酸間鍵的DMD寡核苷酸，該包含核苷酸間鍵包含P-N=，其中P係連接磷。在一些實施方式中，接觸去除了手性助劑(例如，具有藉由碳原子與分子的剩餘部分連接的G2的那些，並且碳原子與至少一個吸電子基團(例如，WV-CA-231、WV-CA-236、WV-CA-240等)連接)。在一些實施方式中，利用鹼或鹼溶液進行接觸，該鹼或鹼溶液基本上不含OH-或水(無水)。在一些實施方式中，鹼係胺(例如，N(R)3)。在一些實施方式中，鹼係N,N-二乙胺(DEA)。在一些實施方式中，鹼溶液係20% DEA/ACN。在一些實施方式中，這種與鹼的接觸降低了副產物水平，該等副產物在包含P-N=的核苷酸間鍵的一個或多個位置處具有天然磷酸酯鍵。
在示例製備中，在完成DMD寡核苷酸核苷酸合成循環後，藉由經15min接觸時間在乙腈中的5個柱體積的20% DEA進行柱上胺洗滌。
在一些實施方式中，與鹼接觸也可以去除2-氰基乙基基團，用於構建標準天然磷酸酯鍵。在一些實施方式中，與鹼接觸提供天然磷酸酯鍵(例如，以鹽形式，其中陽離子係胺鹼的對應的銨鹽)。
切割和去保護。
在與鹼接觸後，將DMD寡核苷酸暴露於進一步的切割和去保護。在示例性製備中，助劑去除(例如，DPSE)、切割和去保護係兩步過程。在步驟1中，在27℃±2℃，用1 x TEA-HF溶液(DMSO：水：TEA.3HF：TEA=43：8.6：2.8：1=v/v/v/v，100±5uL/umol)處理具有DMD寡核苷酸的CPG固體支持物持續6±0.5h。然後在37℃±2℃，將大批的漿料用濃氫氧化銨(28%-30%，200±10mL/mmol)處理24±1h(步驟2)以釋放DMD寡核苷酸形成固體支持物。藉 由過濾收集粗產物。將濾液與固體支持物的洗滌液(例如，水)合併。在一些實施方式中，觀察到產率為約80-90 OD/umole。
除其他事項之外，提供的技術提供的高粗品純度和/或產率。在許多配製物(各種規模、試劑濃度、反應時間等)中，獲得約55%-60%的粗品純度(% FLP)，其具有最少量的較短DMD寡核苷酸(例如，來自不完全偶合、分解、副反應)等。在很多實施方式中，最顯著的較短DMD寡核苷酸的量不超過約2%-10%，通常不超過2%-4%(例如，在一些實施方式中，低至約2%(最顯著的較短DMD寡核苷酸)係N-3))。
各種技術可用於DMD寡核苷酸純化，並且可以依照本揭露使用。在一些實施方式中，使用例如，AEX純化、和/或UF/DF將粗產物進一步純化(例如，超過90%純度)。
使用本文所述的技術，在各種規模(從umol至mmol)製備包含不同的鹼基序列、修飾(例如，核鹼基、糖、和核苷酸間鍵修飾)和/或其模式、連接磷立體化學和/或其模式等的各種DMD寡核苷酸。此類DMD寡核苷酸具有各種靶並且可以藉由各種機制起作用。某些此類DMD寡核苷酸呈現於本揭露的表中。
如熟悉該項技術者所理解的，本文描述的實例僅用於說明。熟悉該項技術者將理解，可以根據例如儀器、規模、試劑、反應物、所希望的結果等來調整各種條件、參數等。使用依照本揭露的各種技術可以進一步改進某些結果。除其他事項之外，提供的DMD寡核苷酸及其組成物可以提供顯著改進的特性和/或外顯子51或53的跳讀，例如，在各種測定和體內模型中，並且可以特別用於預防和/或治療各種病症、障礙、或疾病。在本文實例中提供了某些數據。
實例8. 用於體外給藥的患者成肌細胞的「預分化」時間線
可以依照本揭露利用各種技術，例如描述在以下的那些：US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 2015/0211006、US 2017/0037399、WO 2017/015555、WO 2017/192664、WO 2017/015575、WO2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192679、和WO 2017/210647等以評估本揭露的技術的特性和/或活性。在一些實施方式中，與合適的參考技術(例如，基於DMD寡核苷酸的立體隨機組成物的技術，其具有相同的鹼基序列但在生理pH下沒有中性和/或陽離子核苷酸間鍵)相比，本揭露的技術(例如，DMD寡核苷酸和組成物及其使用方法)證明出乎意料優異結果。以下描述的是可用於評估本揭露中所述的DMD寡核苷酸的特性和/或活性的示例性技術。熟悉該項技術者理解，可以改變/修改下面說明的條件，並且另外和/或可替代地，可以根依照本揭露利用其他合適的試劑、溫度、條件、時間段、量等。
除非另有說明，否則在各種實驗中，實驗中使用的細胞和動物用於對於那些細胞或動物典型的條件。除非另有說明，否則在體外實驗中，各種細胞在標準條件下生長(例如，用於特定細胞類型、細胞系或相似細胞類型或細胞系的最常見條件)，例如，使用普通生長培養基、常溫(37℃)，以及典型的麻塞諸塞州劍橋的重力和大氣壓力。將動物保持在標準實驗室條件下，通常在室溫或幾度較冷，具有正常的飼養條件、籠子大小等。除非另有說明，否則細胞和動物都不會經受極端溫度(例如，冷休克或熱休克)、壓力、重力、環境聲音、食物、或營養物質剝奪等。
維持患者來源的成肌細胞係：
將DMD Δ52和DMD Δ45-52成肌細胞維持在補充有5% FBS、1X青黴素-鏈黴素、和1XL-穀胺醯胺的完全骨骼肌生長培養基(Promocell公司，海德堡，德國)中。將燒瓶或板用Matrigel：DMEM溶液(1：100)塗覆合適的一段時 間(例如，30min)，之後經由抽吸去除Matrigel：DMEM溶液，然後在完全骨骼肌生長培養基中接種細胞。
標準給藥程序(預分化0天)
在第1天：用Matrigel：DMEM溶液塗覆合適的細胞生長容器，例如6孔板或24孔板。在例如37℃/5% CO2的條件下孵育合適的一段時間(例如，30min)。抽吸並將適量的細胞接種到細胞生長容器中，例如150K細胞/孔(總共1500μl的完全生長培養基，6孔板中)和30K細胞/孔(500ul的生長培養基，24孔板中)。在合適的條件下孵育合適的時間，例如37℃、5% CO2過夜。
在第2天：製備合適的分化培養基，例如DMEM+5%馬血清+10μg/ml胰島素。在分化培養基中製備合適的DMD寡核苷酸稀釋液，例如30uM、10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM的系列稀釋液。從貼壁細胞中抽吸生長培養基，並將DMD寡核苷酸：分化培養基溶液添加至細胞。直至收穫細胞，寡核苷酸保留在細胞上(沒有培養基改變)。
在第6天：獲得RNA。在典型的程序中，例如用冷PBS洗滌適量的細胞(例如來自24孔板的孔的細胞)，然後添加適量的用於RNA提取和樣品儲存/RNA提取的試劑，例如，在24孔板中的500ul/孔TRIZOL並在-80℃的冷凍板或繼續RNA提取以獲得RNA。
在第8天：獲得蛋白質。在典型的程序中，將適量的細胞(例如6孔板孔中的細胞)例如用冷PBS洗滌。然後添加適量的合適的裂解緩衝液-例如，在典型的程序中，200ul/孔的RIPA補充有用於6孔板的蛋白酶抑制劑。裂解後，可以儲存樣品，例如在-80℃冷凍，或繼續進行蛋白質提取。
可以採用其他合適的程序，例如，以下描述的那些程序。如熟悉該項技術者所理解的，可以修改許多參數(如試劑、溫度、條件、時間段、量等)。
4天預分化給藥程序
在第1天：用Matrigel：DMEM溶液塗覆6孔板或24孔板。在37℃、5% CO2孵育30min。抽吸，接種150K細胞/孔(總共1500μl的完全生長培養基，6孔板中)和30K細胞/孔(500ul的生長培養基，24孔板中)。在37℃、5% CO2孵育過夜。
在第2天：如下製備分化培養基：DMEM+5%馬血清+10μg/ml胰島素。抽吸生長培養基並用分化培養基取代。
在第6天：細胞分化4天。在分化培養基中製備DMD寡核苷酸稀釋液，例如30uM、10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM的系列稀釋液。從貼壁細胞中抽吸分化培養基，並將DMD寡核苷酸：分化培養基溶液添加至細胞。直至收穫細胞，寡核苷酸保留在細胞上(沒有培養基改變)。
在第10天：用冷PBS洗滌24孔板中的細胞，在24孔板中添加500ul/孔TRIZOL並在-80℃冷凍板或繼續RNA提取。
在第12天：用冷PBS洗滌6孔板中的細胞。添加200ul/孔的RIPA，補充有蛋白酶抑制劑。在-80℃冷凍板或繼續進行蛋白質提取。
7天預分化給藥程序
在第1天：用Matrigel：DMEM溶液塗覆6孔板或24孔板。在37℃、5% CO2孵育30min。抽吸，接種150K細胞/孔(總共1500μl的完全生長培養基，6孔板中)和30K細胞/孔(500ul的生長培養基，24孔板中)。在37℃、5% CO2孵育過夜。
在第2天：如下製備分化培養基：DMEM+5%馬血清+10μg/ml胰島素。抽吸生長培養基並用分化培養基取代。
在第9天：細胞分化7天。在分化培養基中製備DMD寡核苷酸稀釋液，例如30uM、10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM的系列稀釋液。從貼壁細 胞中抽吸分化培養基，並將DMD寡核苷酸：分化培養基溶液添加至細胞。直至收穫細胞，寡核苷酸保留在細胞上(沒有培養基改變)。
在第13天：用冷PBS洗滌24孔板中的細胞，在24孔板中添加500ul/孔TRIZOL並在-80℃冷凍板或繼續RNA提取。
在第15天：用冷PBS洗滌6孔板中的細胞。添加200ul/孔的RIPA，補充有蛋白酶抑制劑。在-80℃冷凍板或繼續進行蛋白質提取。
10天預分化給藥程序
在第1天：用Matrigel：DMEM溶液塗覆6孔板或24孔板。在37℃、5% CO2孵育30min。抽吸，接種150K細胞/孔(總共1500μl的完全生長培養基，6孔板中)和30K細胞/孔(500ul的生長培養基，24孔板中)。在37℃、5% CO2孵育過夜。
在第2天：如下製備分化培養基：DMEM+5%馬血清+10μg/m1胰島素。抽吸生長培養基並用分化培養基取代。
在第12天：細胞分化10天。在分化培養基中製備DMD寡核苷酸稀釋液，例如30uM、10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM的系列稀釋液。從貼壁細胞中抽吸分化培養基，並將DMD寡核苷酸：分化培養基溶液添加至細胞。直至收穫細胞，寡核苷酸保留在細胞上(沒有培養基改變)。
在第16天：用冷PBS洗滌24孔板中的細胞，在24孔板中添加500ul/孔TRIZOL並在-80℃冷凍板或繼續RNA提取。
在第18天：用冷PBS洗滌6孔板中的細胞。添加200ul/孔的RIPA，補充有蛋白酶抑制劑。在-80℃冷凍板或繼續進行蛋白質提取。
等效物
已經描述了本揭露的一些說明性實施方式，對於熟悉該項技術者來說顯而易見的是，前述僅僅是說明性的而非限制性的，僅作為示例呈現。許多 修改和其他說明性實施方式在熟悉該項技術者的範圍內，並且預期落入本揭露的範圍內。特別地，儘管本文呈現的許多示例涉及方法行為或系統元素的特定組合，但應理解，那些行為和那些元素能以其他方式組合以實現相同的目標。僅結合一個實施方式討論的行為、元素和特徵不旨在從其他實施方式中的相似角色中排除。此外，對於在以下申請專利範圍中列舉的一個或多個手段加功能限制(如果有的話)，該等手段不旨在限於本文揭露的用於執行所列舉功能的手段，而是旨在覆蓋用於執行該列舉的功能的任何手段(現在已知或以後開發的)。
在申請專利範圍中使用如「第一」、「第二」、「第三」等的序數術語來修改申請專利範圍本身並不意味著一個申請專利範圍元素比另一個或時間的任何優先權、優先順序、或順序(其中執行方法的行為)，但僅用作標籤以將具有某個名稱的一個申請專利範圍元素與具有相同名稱的另一個元素(但是用於使用序數術語)進行區分，以區分申請專利範圍元素。相似地，使用a)、b)等，或i)、ii)等本身並不意味著申請專利範圍中的任何優先權、優先順序、或步驟順序。類似地，在說明書中使用該等術語本身並不意味著任何所需的優先權、優先順序或順序。
前述書面說明書被認為足以使熟悉該項技術者能夠實施本發明。本揭露限於所提供的示例的範圍。實施方式旨在說明本發明的一個或多個方面，並且其他功能上等同的實施方式也在本發明的範圍內。除了本文示出和描述的那些之外，各種修改將藉由前述描述對於熟悉該項技術者變得清楚並且處於所附申請專利範圍的範圍內。本發明的每個實施方式不一定涵蓋本發明的優點和目的。
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<220>
<223> 合成的
<400> 66
Figure 108116317-A0202-12-0265-298
<210> 67
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 67
Figure 108116317-A0202-12-0265-301
<210> 68
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 68
Figure 108116317-A0202-12-0266-304
<210> 69
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 69
Figure 108116317-A0202-12-0266-305
<210> 70
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 70
Figure 108116317-A0202-12-0266-302
<210> 71
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 71
Figure 108116317-A0202-12-0266-309
<210> 72
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 72
Figure 108116317-A0202-12-0266-307
<210> 73
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 73
Figure 108116317-A0202-12-0267-310
<210> 74
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 74
Figure 108116317-A0202-12-0267-311
<210> 75
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 75
Figure 108116317-A0202-12-0267-312
<210> 76
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 76
Figure 108116317-A0202-12-0267-313
<210> 77
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 77
Figure 108116317-A0202-12-0267-229
<210> 78
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 78
Figure 108116317-A0202-12-0268-316
<210> 79
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 79
Figure 108116317-A0202-12-0268-315
<210> 80
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 80
Figure 108116317-A0202-12-0268-314
<210> 81
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 81
Figure 108116317-A0202-12-0268-317
<210> 82
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 82
Figure 108116317-A0202-12-0269-318
<210> 83
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 83
Figure 108116317-A0202-12-0269-319
<210> 84
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 84
Figure 108116317-A0202-12-0269-320
<210> 85
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 85
Figure 108116317-A0202-12-0269-321
<210> 86
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 86
Figure 108116317-A0202-12-0269-322
<210> 87
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 87
Figure 108116317-A0202-12-0270-325
<210> 88
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 88
Figure 108116317-A0202-12-0270-324
<210> 89
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 89
Figure 108116317-A0202-12-0270-323
<210> 90
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 90
Figure 108116317-A0202-12-0270-326
<210> 91
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 91
Figure 108116317-A0202-12-0270-230
<210> 92
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 92
Figure 108116317-A0202-12-0271-327
<210> 93
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 93
Figure 108116317-A0202-12-0271-328
<210> 94
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 94
Figure 108116317-A0202-12-0271-330
<210> 95
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 95
Figure 108116317-A0202-12-0271-331
<210> 96
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 96
Figure 108116317-A0202-12-0272-334
<210> 97
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 97
Figure 108116317-A0202-12-0272-333
<210> 98
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 98
Figure 108116317-A0202-12-0272-332
<210> 99
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 99
Figure 108116317-A0202-12-0272-336
<210> 100
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 100
Figure 108116317-A0202-12-0272-335
<210> 101
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 101
Figure 108116317-A0202-12-0273-339
<210> 102
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 102
Figure 108116317-A0202-12-0273-338
<210> 103
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 103
Figure 108116317-A0202-12-0273-337
<210> 104
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 104
Figure 108116317-A0202-12-0273-340
<210> 105
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 105
Figure 108116317-A0202-12-0273-231
<210> 106
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 106
Figure 108116317-A0202-12-0274-341
<210> 107
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 107
Figure 108116317-A0202-12-0274-342
<210> 108
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 108
Figure 108116317-A0202-12-0274-344
<210> 109
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 109
Figure 108116317-A0202-12-0274-343
<210> 110
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 110
Figure 108116317-A0202-12-0275-347
<210> 111
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 111
Figure 108116317-A0202-12-0275-346
<210> 112
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 112
Figure 108116317-A0202-12-0275-345
<210> 113
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 113
Figure 108116317-A0202-12-0275-348
<210> 114
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 114
Figure 108116317-A0202-12-0275-349
<210> 115
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 115
Figure 108116317-A0202-12-0276-352
<210> 116
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 116
Figure 108116317-A0202-12-0276-351
<210> 117
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 117
Figure 108116317-A0202-12-0276-350
<210> 118
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 118
Figure 108116317-A0202-12-0276-353
<210> 119
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 119
Figure 108116317-A0202-12-0276-232
<210> 120
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 120
Figure 108116317-A0202-12-0277-356
<210> 121
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 121
Figure 108116317-A0202-12-0277-355
<210> 122
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 122
Figure 108116317-A0202-12-0277-354
<210> 123
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 123
Figure 108116317-A0202-12-0277-357
<210> 124
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 124
Figure 108116317-A0202-12-0278-358
<210> 125
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 125
Figure 108116317-A0202-12-0278-359
<210> 126
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 126
Figure 108116317-A0202-12-0278-360
<210> 127
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 127
Figure 108116317-A0202-12-0278-361
<210> 128
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 128
Figure 108116317-A0202-12-0278-362
<210> 129
<211> 60
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 129
Figure 108116317-A0202-12-0279-233
<210> 130
<211> 60
<212> DNA
<213> 智人
<400> 130
Figure 108116317-A0202-12-0279-234
<210> 131
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 131
Figure 108116317-A0202-12-0279-236
<210> 132
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 132
Figure 108116317-A0202-12-0279-235

Claims (21)

  1. 一種寡核苷酸，該寡核苷酸具有WV-14791的結構：fU * SfC * SfCn001RfG * SfG * SfUn001RfU * SmCfU * SmG * SfA * SmAmGfG * SfU * SfGn001RfU * SfU * SfC * SfU，或其藥學上可接受的鹽形式，其中：f代表2'-F修飾的核苷；*S代表Sp硫代磷酸酯；m代表2'-OMe修飾的核苷；並且 n001R係
    Figure 108116317-A0202-13-0001-237
    ，其中磷呈Rp構型。
  2. 一種寡核苷酸，該寡核苷酸具有WV-13826的結構：fU * SfC * SfC * SfG * SfG * SfU * SfU * SmCfU * SmG * SfA * SmAmGfG * SfU * SfG * SfU * SfU * SfC，或其藥學上可接受的鹽形式，其中：f代表2'-F修飾的核苷；*S代表Sp硫代磷酸酯；m代表2'-OMe修飾的核苷。
  3. 一種寡核苷酸，該寡核苷酸具有WV-13864的結構：fC * SfU * SfCn001RfC * SfG * SfGn001RfU * SfU * SmCfU * SmG * SfA * SmAfG * SfG * SfU * SfGn001RfU * SfU * SfC，或其藥學上可接受的鹽形式，其中：f代表2'-F修飾的核苷；*S代表Sp硫代磷酸酯； m代表2'-OMe修飾的核苷；並且 n001R係
    Figure 108116317-A0202-13-0002-238
    ，其中磷呈Rp構型。
  4. 一種寡核苷酸，該寡核苷酸具有WV-13835的結構：fU * SfC * SfC * SfG * SfG * SfU * SfU * SmCfU * SmG * SfA * SmAmGfG * SfU * SfG * SfU * SfU * SfC * SfU，或其藥學上可接受的鹽形式，其中：f代表2'-F修飾的核苷；*S代表Sp硫代磷酸酯；並且m代表2'-OMe修飾的核苷。
  5. 一種寡核苷酸，該寡核苷酸具有WV-143444的結構：fC * SfU * SfCn001RfC * SfG * SfGn001RfU * SfU * SmCfU * SmG * SfA * SmAfGfG * SfU * SfGn001RfU * SfU * SfC，或其藥學上可接受的鹽形式，其中：f代表2'-F修飾的核苷；*S代表Sp硫代磷酸酯；m代表2'-OMe修飾的核苷；並且 n001R係
    Figure 108116317-A0202-13-0002-240
    ，其中磷呈Rp構型。
  6. 如申請專利範圍第1-5項中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸呈鹽形式。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之寡核苷酸，其中該鹽形式係鈉鹽。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之寡核苷酸，其中該鈉鹽中鈉離子的數量等於該寡核苷酸中硫代磷酸酯鍵和磷酸酯鍵的總數量。
  9. 一種手性受控的寡核苷酸組成物，該手性受控的寡核苷酸組成物包含多個如申請專利範圍第1-8項中任一項所述之寡核苷酸，其中相對於具有與該寡核苷酸相同鹼基序列的寡核苷酸的基本上外消旋的製劑，該手性受控的寡核苷酸組成物富含該寡核苷酸。
  10. 一種藥物組成物，該藥物組成物包含治療有效量的如申請專利範圍第1-8項中任一項所述之寡核苷酸，以及選自以下的藥學上可接受的非活性組分：藥學上可接受的稀釋劑、藥學上可接受的賦形劑、和藥學上可接受的載體。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之藥物組成物，其中該藥物組成物係溶液。
  12. 一種寡核苷酸組成物，用於在疾病的治療中使用，所述使用包含改變靶轉錄物的剪接，其中：該寡核苷酸組成物的特徵在於：當該寡核苷酸組成物與轉錄物剪接系統中的該靶轉錄物接觸時，相對於在參考條件下所觀察到的，該轉錄物的剪接發生改變，該參考條件選自由以下組成之群組：不存在該組成物、存在參考組成物、及其組合。
  13. 如申請專利範圍第12項所述使用的寡核苷酸組成物，其中(a)相對於不存在該組成物，該靶轉錄物的剪接發生改變，較佳地其中該靶轉錄物係肌營養不良蛋白的前mRNA，並且其中相對於不存在該組成物，該改變係一個或多個外顯子以增加的水平發生跳讀，更較佳地其中相對於不存在該組成物，肌營養不良蛋白的外顯子53以增加的水平發生跳讀；或者(b)其中該寡核苷酸組成物係如申請專利範圍第9-11項中任一項所述之組成物。
  14. 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之寡核苷酸、或如申請專利範圍第9-13項中任一項所述之組成物，用於在治療杜興氏肌肉失養症中使用，所述使用包含向易患杜興氏肌肉失養症或者患有杜興氏肌肉失養症的受試者給予如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之寡核苷酸、或如申請專利範圍第9-13項中任一項所述之組成物。
  15. 一種用於預防或治療DMD之方法，該方法包括向易患DMD或者患有DMD的受試者給予有效量的DMD寡核苷酸。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該受試者具有適於外顯子51跳讀的DMD基因突變，並且該DMD寡核苷酸可以提供外顯子51跳讀。
  17. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該受試者具有適於外顯子53跳讀的DMD基因突變，並且該DMD寡核苷酸可以提供外顯子53跳讀。
  18. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該寡核苷酸係如申請專利範圍第1-8項中任一項所述之寡核苷酸。
  19. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中將該寡核苷酸以如申請專利範圍第9-13項中任一項所述之組成物給予。
  20. 一種用於製備寡核苷酸之方法，該方法包括使用手性助劑、亞磷醯胺或疊氮化物試劑、或者在說明書中描述的條件。
  21. 一種寡核苷酸、手性助劑、亞磷醯胺、組成物、或方法，係如在說明書中描述的。
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