CN110023322B - 新的双环核苷和由其制备的寡聚体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的双环核苷和由其制备的寡聚体。具体而言，本发明涉及式(I)的化合物：其中，T1和T2中的一个是OR1或OR2；并且T1和T2中的另一个是OR1或OR2；其中R1是H或羟基保护基，并且R2是磷部分；并且其中Bx是核碱基。此外，本发明涉及所述化合物、双环核苷和所述寡聚体，其用作预防、治疗或诊断疾病的药物。

Description

新的双环核苷和由其制备的寡聚体
技术领域
本发明涉及新的双环核苷和由其制备的寡聚体。具体而言，本发明涉及式(I)的化合物，涉及包含至少一种式(IV)的化合物的寡聚体，涉及用作预防、治疗或诊断疾病的药物的本发明的化合物或寡聚体并且涉及包含本发明的至少一种化合物或至少一种寡聚体的药物组合物。本发明还涉及本发明的寡聚体用于结合靶核酸序列的体外用途和用于固相合成本发明的寡聚体的方法。
背景技术
反义疗法已经成熟作为创新药物开发的重要平台。显示与单链RNA或双链DNA强烈且序列特异性结合并表现出对酶促降解的抗性的寡核苷酸类似物是作为蛋白质表达的抑制剂或调节剂的治疗应用的潜在候选者。将化学修饰的核苷掺入反义化合物中以增强其性质，例如核酸酶抗性、药代动力学或对靶RNA的亲和力。
近年来，合成生物学领域的发展一般旨在开发具有改进的效力和功效的反义系统，其不依赖于天然中使用的已知分子组分。实现这一目标的基本要求是开发人工遗传多聚体(通常称为异种核酸(XNA))，其实现天然DNA或RNA的功能(Herdewijn等,Chem.Biodiversity 2009,6,791)。预计这些系统的可用性及其与活的生物体的整合将使它们具备生物技术和医学领域中令人感兴趣的新特性。
从过去30年出现的大量核酸修饰中，一些候选者已被仔细审查其作为替代遗传材料的适用性。在通过最小化学改变将非天然成分引入天然遗传机制的尝试中，已经表明大肠杆菌菌株基因组中的胸苷在进化过程中能够被5-氯尿苷取代，以达到最低残留胸苷含量(Marlière等,Angewandte Chemie,Int.Edition 2011,50,7109)。在另一种方法中，据报道，非天然核酸，如1,5-脱水己糖醇核酸(HNA；Hendrix等,Chem.Eur.J.1997,3,110)和环己烯核酸(CeNA；Nauwelae室温s等,Nucleic Acids Res.2005,33,2452)、氟阿拉伯寡核苷酸(FANA；Wilds等,J.Nucleic Acids Res.2000,28,3625)、阿拉伯糖核酸(ANA；Damha等,J.Am.Chem.Soc.1998,120,12976)、苏糖核酸(TNA；Schoning等,Science 2000,290,1347)和锁核酸(LNA；Koshkin等,J.Am.Chem.Soc.1998,120,13252；Obika等,TetrahedronLett.1998,39,5401)能够通过DNA聚合酶转录和逆转录成DNA。
在另一种方法中，通过将核苷磷酸酯单元间连接点从糖的3'氧改变至2'氧(2',5'-DNA或2',5'-RNA)，已经改变了RNA和DNA的主链结构。虽然2',5'-RNA是天然存在的生物多聚体，但首先在细菌中发现以2',5'多聚腺苷酸的形式存在，2',5'-DNA是人工的(Trujillo等,Eur.J.Biochem.1987,169,167)。过去已经研究了两种多聚体的配对和复制性质。发现2',5'-RNA与互补RNA结合但不与DNA结合。与纯RNA双链体相比，具有RNA的双链体略微不稳定，并且存在纯2',5'-RNA系列中的双链体，但是甚至更不稳定(Wasner等,J.Biochemistry 1998,37,7478)。此外，在引物模板延伸实验中显示，模板上最多四个2',5'-连接的核苷酸的片段用聚合酶或逆转录酶能够逆转录成DNA，即使2',5'-DNA与天然DNA没有显著亲和力(Sinha等,J.Am.Chem.Soc.2004,126,40)。
为了从熵上稳定具有互补的天然核酸的复合物形成，已经设计了通过与天然DNA不同之处在于位于中心C(3')和C(5')之间的另外的乙烯桥的双环DNA类似物。连接磷酸二酯单元的连接点与天然存在的核酸的连接点相同，即3'和5'末端。碳骨架的这种变化导致锁定的糖构象，其导致双环-脱氧核苷显示出更高程度的单链预组织以形成双链体。双环脱氧腺苷和双环胸苷的十聚体与其天然RNA和DNA互补物结合以及彼此结合，形成双螺旋结构和三螺旋结构。与天然DNA相比，双链体形成与配对焓和熵项减少有关，对双链体形成的自由能具有补偿作用(Bolli等,Nucleic Acids Res.1996,24,4660)。
然而，经过反义领域三十多年的研究，临床应用仍然受到这类化合物的低生物稳定性、较差的药代动力学特性和脱靶毒性的限制。
因此，仍然需要对体内酶促降解具有抗性并显示出与核酸的强烈和序列特异性结合的反义化合物。
发明内容
在第一方面，本发明提供式(I)的化合物：
其中T1和T2中的一个是OR1或OR2；
并且T1和T2中的另一个是OR1或OR2；其中
R1是H或羟基保护基，并且
R2是磷部分；并且其中
Bx是核碱基。
在第二方面，本发明提供包含至少一个式(IV)的化合物的寡聚体
其中独立地对于所述至少一种式(IV)的化合物中的每一个：
T3或T4中的一个是核苷连接基团；
T3和T4中的另一个是OR1、OR2、5'末端基团、7'末端基团或核苷连接基团，其中R1是H或羟基保护基，并且R2是磷部分；并且Bx是核碱基。
在第三方面，本发明提供式(I)、(II)或(III)的本发明的化合物或本发明的寡聚体，其用作预防或治疗疾病的药物。
在进一步的方面，本发明提供本发明的寡聚体、优选式(V)的本发明的寡聚体，其用作预防、治疗或诊断疾病的药物，其中所述疾病是肌营养不良症，并且其中优选所述疾病是杜氏肌营养不良症。
在进一步的方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明至少一种选自式(I)、(II)或(III)的化合物或至少一种寡聚体。
在进一步的方面，本发明的寡聚体用于体外结合靶核酸序列。
在进一步的方面，本发明提供用于固相合成本发明的寡聚体的方法。
本文描述的发明提供新化合物，其中与现有技术的化合物相比，用于与其他实体(例如核苷连接基团)连接的基团的位置发生了移位。因此，本发明化合物通过其双环糖的5'末端和7'末端能够与其他实体如核苷或核苷酸连接或本发明化合物通过其双环糖的5'末端和7'末端与其他实体如核苷或核苷酸连接(图1中的C和图1中的D)。与之相反和在现有技术中，核苷或核苷酸通过3'和5'末端连接，对于已知的包含双环糖的核苷或核苷酸(图1中的B)或如在天然存在的DNA或RNA中(图1中的A)。
由于该移位的连接，改变了寡聚体内本发明化合物的主链几何形状。这种改变的主链几何形状进而诱导本发明化合物的核碱基堆积，其不同于天然存在的核酸螺旋。因此，本发明的寡聚体采用与天然DNA明显不同的螺旋构象。此外，基于这些发现，预期形成双链结构的本发明的寡聚体具有偏离常规规范双链体的几何形状。
尽管主链几何形状和核碱基堆积发生了改变，但我们现在惊奇地发现本发明的寡聚体与天然DNA和RNA交叉配对，并且本发明的寡聚体的自身双链体表现出与天然DNA双链体相同的热稳定性。因此，本发明的寡聚体具有成为可以实现天然DNA功能的新异种核酸所必需的结构和碱基配对性质。此外，与其天然DNA对应物相比，本发明的寡聚体显示出相当的碱基配对选择性并且甚至具有更好的错配识别能力。增加错配辨别力通常会降低潜在的脱靶效应，因此代表了反义候选者的吸引人的特性。
附图说明
图1：A)α-单环DNA；B)双环(bc-)DNA；C)7’,5’-β-bc-DNA,即式(III)的本发明的化合物；D)7’,5’-α-bc-DNA,即式(II)的本发明的化合物。
图2：左侧描绘的7’,5’-β-bc-DNA,即式(III)的本发明的化合物和右侧描绘的7’,5’-α-bc-DNA,即式(II)的本发明的化合物的比较。
图3：a)5’-O-对硝基苯甲酰基-7’,5’-α-bc-T,b)5’-O-乙酰基-7’,5’-α-bc-GAc的X射线结构。为清楚起见，省略了非极性氢原子。
图4：β-DNA内插入极性反转的7’,5’-α-bc-DNA。
图5：与相应的天然DNA双链体相比，具有完全修饰的平行(寡核苷酸ON22；SEQ IDNO：22)和反平行(寡核苷酸ON23；SEQ ID NO：23)的寡核苷酸ON21(SEQ ID NO：21)互补物、平行DNA和平行RNA的UV-解链曲线(260nm)。总链浓度：2μM于10mM NaH2PO4,150mM NaCl,pH7.0。
图6：双链体a)DNA·RNA、b)ON21·RNA和c)ON21·DNA d)ON21·ON22在20℃的CD谱。实验条件：总链浓度2μM于10mM NaH2PO4,150mM NaCl,pH 7.0。
图7：裁剪的凝胶图片。a)DNA对照实验。在b)1小时c)2小时d)4小时e)24小时后的DNA消化反应；f)用寡核苷酸ON21的对照实验；在g)1小时h)2小时i)4小时j)24小时后的ON21消化反应。
图8：C3补体激活的结果；PO表示磷酸酯核苷连接，PS表示硫代磷酸酯核苷连接，bc-DNA表示7',5'-α-bc-DNA支架，tc-DNA表示三环支架。每次测量至少重复3次。5个ON的序列相似。
图9：用PS-α-bc-DNA或PS-tc-DNA孵育后mRNA表达水平的比较。2个ON的序列相似。缩写如图8中所提到的。
图10：7'-O-对硝基苯甲酰基-7',5'-β-bc-T的X射线结构。为清楚起见，省略了氢原子。
图11：与相应的天然DNA双链体相比，同源7',5'-β-bc-DNA双链体的UV解链曲线(260nm)。总链浓度：2μM于10mM NaH2PO4,150mM NaCl,pH 7.0。
图12：三个双链体a)ON13·ON14、b)ON13·DNA和c)DNA·DNA在10至80℃的温度的CD谱。实验条件：总链浓度2μM于10mM NaH2PO4,1M NaCl,pH 7.0，10℃。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
本文中可互换使用的术语“保护氨基的基团”、“保护氨基基团的基团”或“氨基保护基”是本领域公知的，包括在Protecting Groups in Organic Synthesis,T.W.Greeneand P.G.M.Wuts,第3版,John Wiley&Sons,1999,Greene's Protective Groups inOrganic Synthesis,P.G.M.Wuts,第5版,John Wiley&Sons,2014,和在Current Protocolsin Nucleic Acid Chemistry,由S.L.Beaucage等于2012年6月编辑，并且特别是如第2章中描述。用于本发明的“氨基保护基”包括、并且通常而且优选独立地在每次出现时选自氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、9-芴基甲基氨基甲酸酯(Fmoc)、9-(2-磺基)芴基甲基氨基甲酸酯、2,7-二叔丁基-[9-(10,10-二氧代-10,10,10,10-四氢硫代黄原酸)]甲基氨基甲酸酯(DBD-Tmoc)、4-甲氧基苯甲酰氨基甲酸酯(Phenoc)、2,2,2-三氯乙基氨基甲酸酯(Troc)、2-三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯(Teoc)、2-苯基乙基氨基甲酸酯(hZ)、1,1-二甲基-2,2-二溴乙基氨基甲酸酯(DB-t-BOC)、1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙基氨基甲酸酯(TCBOC)、氨基甲酸苄酯(Cbz)、对甲氧基苄基氨基甲酸酯(Moz)和2,4,6-三甲基苄基氨基甲酸酯；以及甲酰胺、乙酰胺、苯甲酰胺。
本文中可互换使用的术语“保护羟基的基团”、“保护羟基基团的基团”或“羟基保护基”是本领域公知的，包括在Protecting Groups in Organic Synthesis,T.W.Greeneand P.G.M.Wuts,第3版,John Wiley&Sons,1999,Greene's Protective Groups inOrganic Synthesis,P.G.M.Wuts,第5版,John Wiley&Sons,2014,和在Current Protocolsin Nucleic Acid Chemistry,由S.L.Beaucage等于2012年6月编辑，并且特别是如第2章中描述。在某个实施方案中，本发明的“羟基保护基”包括、并且通常而且优选各自独立地选自乙酰基、苯甲酰基、苄基、β-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、二甲氧基三苯甲基、[双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基](DMTr)、甲氧基甲基醚(MOM)、甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基](MMT)、对甲氧基苄基醚(PMB)、甲硫基甲基醚、新戊酰基(Piv)、四氢吡喃基(THP)、四氢呋喃(THF)、三苯甲基(三苯甲基，Tr)、甲硅烷基醚，例如叔丁基二苯基甲硅烷基醚(TBDPS)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)和三异丙基甲硅烷基(TIPS)醚；甲基醚、乙氧基乙基醚(EE)。
在优选实施方案中，本发明的“羟基保护基”包括、并且通常而且优选在每次出现时独立地选自乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、对氯苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、苯甲酰基、对苯基苯甲酰基、2,6-二氯苄基、二苯基甲基、对硝基苄基、三苯基甲基(三苯甲基)、4,4'-二甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、三苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、苯甲酰基甲酸酯、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基、9-芴基甲基碳酸酯、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯、4-单甲氧基三苯甲基(MMTr)、4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMTr)和4,4',4"-三甲氧基三苯甲基(TMTr)、2-氰基乙基(CE或Cne)、2-(三甲基甲硅烷基)乙基(TSE)、2-(2-硝基苯基)乙基、2-(4-硝基苯基)乙基2-(4-硝基苯基)乙基(NPE)、2-(4-硝基苯磺酰基)乙基、3,5-二氯苯基、2,4-二甲基苯基、2-硝基苯基、4-硝基苯基、2,4,6-三甲基苯基、2-(2-硝基苯基)乙基、丁基硫代羰基、4,4',4"-三(苯甲酰氧基)三苯甲基、二苯基氨基甲酰基、乙酰丙酰基、2-(二溴甲基)苯甲酰基(Dbmb))、2-(异丙基硫代甲氧基甲基)苯甲酰基(Ptmt)、9-苯基黄嘌呤-9-基(pixyl)或9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。
在一些实施方案中，羟基保护基在每次出现时独立地选自乙酰基、苄基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲基、4-单甲氧基三苯甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMTr)、4,4',4"-三甲氧基三苯甲基(TMTr)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。在优选实施方案中，羟基保护基在每次出现时独立地选自三苯甲基(三苯甲基)、4-单甲氧基三苯甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMTr)、4,4',4"-三甲氧基三苯甲基(TMTr)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。在进一步优选的实施方案中，羟基保护基在每次出现时独立地选自三苯甲基、4-单甲氧基三苯甲基和4,4'-二甲氧基三苯甲基。在非常优选实施方案中，所述羟基保护基在每次出现时独立地选自三苯甲基(三苯甲基)、4-单甲氧基三苯甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMTr)、4,4',4"-三甲氧基三苯甲基(TMTr)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。在更优选的实施方案中，本发明的羟基保护基是乙酰基、二甲氧基三苯甲基(DMTr)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)或叔丁基二苯基甲硅烷基醚(TBDPS)。在另一个非常优选的实施方案中，所述羟基保护基在每次出现时独立地选自4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMTr)或4-单甲氧基三苯甲基。在另一个非常优选的实施方案中，所述羟基保护基是4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMTr)。
如本文所用，术语“磷部分”是指包含PIII或PV价态的磷原子并且由式(VII)表示的部分。
其中
W表示O、S或Se或者W表示电子对；
R3和R4彼此独立地为H、卤素、OH、OR5、NR6R7、SH、SR8、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6氨基烷基；其中R5是C1-C9烷基、C1-C6烷氧基,各自彼此独立地任选地被氰基、硝基、卤素、-NHC(O)C1-C3烷基、NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代；芳基、C1-C6亚烷基芳基、C1-C6亚烷基二芳基，各自彼此独立地任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷基、C1-C4卤代烷氧基、NHC(O)C1-C3烷基、NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代；乙酰基；羟基保护基；其中R6和R7彼此独立地为氢、任选地被氰基、硝基、卤素、C2-C6烯基、C3-C6环烷基、C1-C3烷氧基取代的C1-C9烷基；任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基取代的芳基；氨基保护基；或与它们所连接的氮原子一起形成杂环，其中优选所述杂环选自吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基和高哌嗪,其中所述杂环任选被C1-C3烷基取代；并且其中R8是巯基保护基；并且其中波浪线表示与所述OR2基团的氧的连接。当W表示O、S或Se时，则所述磷部分内的所述P原子处于其PV价态。当W表示电子对时，则所述磷部分内的所述P原子处于其PIII价态。式(VII)的部分包括任何可能的立体异构体。由式(VII)表示的所述部分中进一步包括其盐，其中通常且优选在用无机碱或胺处理时形成所述盐，并且通常而且优选地源自与OH或SH基团反应的盐(彼此独立地)为所述R3和R4。导致所述与OH或SH基团形成盐的优选无机碱或胺是本领域熟知的，并且通常而且优选三甲胺、二乙胺、甲胺或氢氧化铵。如果合适，本发明中包括的这些磷部分也缩写为“O-HB+”，其中所述HB+是指形成的抗衡阳离子。
在优选的实施方案中，在“磷部分”中，R3和R4彼此独立地为H、OH、OR5、NR6R7、C1-C6烷基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6氨基烷基；其中R5是任选地被氰基、硝基、卤素取代的C1-C9烷基；芳基、C1-C6亚烷基芳基，各自彼此独立地任选地被氰基、硝基、卤素取代；乙酰基；羟基保护基；其中R6和R7彼此独立地为氢、任选地被氰基、硝基、卤素取代的C1-C9烷基；任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基取代的芳基；氨基保护基；并且其中R8是巯基保护基；并且其中波浪线表示与所述OR2基团的氧的连接。
如本文所用，术语“磷部分”包括、并且通常而且优选地在每次出现时独立地选自衍生自膦酸酯、亚磷酸三酯、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸三酯、磷酸二酯、硫代磷酸酯、二酯硫代磷酸酯或亚磷酰胺的部分。
因此，在优选的实施方案中，所述OR2在每次出现时独立地选自膦酸酯、亚磷酸三酯、单磷酸盐、二磷酸盐、三磷酸盐、磷酸三酯、磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或亚磷酰胺，并且其中优选所述OR2是亚磷酰胺或磷酸三酯，更优选亚磷酰胺。
在优选的实施方案中，磷部分衍生自式(VII)代表的膦酸酯，其中W是O，R3选自C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6氨基氧基，并且R4是OH或O-HB+；并且其中波浪线表示与所述OR2基团的氧的连接。在另一实施方案中，式(Ⅶ)的磷部分是H-膦酸酯，其中W是O，R3是氢并且R4是OH或O-HB+；并且其中优选所述O-HB+是HNEt3 +。在进一步的实施方案中，式(Ⅶ)的磷部分是烷基-膦酸酯，其中W是O，R3是烷基并且R4是OH或O-HB+；并且其中优选所述O-HB+是HNEt3 +。更优选地，式(Ⅶ)的磷部分是甲基-膦酸酯，其中W是O，R3是氢并且R4是OH或O-HB+；并且其中优选所述O-HB+是HNEt3 +。在另一实施方案中，式(VII)的磷部分是膦酰基羧酸酯，其中R3或R4彼此独立地为羧酸。优选地，所述膦酰基羧酸酯是膦酰基乙酸或膦酰甲酸。在进一步的实施方案中，式(VII)的磷部分是2-氨基乙基-膦酸酯。
在优选的实施方案中，式(VII)的磷部分的R3和R4彼此独立地为H、OH、卤素、OR5、NR6R7、SH、SR8、C1-C4烷基，优选地C1-C2烷基、C1-C4卤代烷基，优选地C1-C2卤代烷基、C1-C4烷氧基，优选地C1-C2烷氧基、C1-C4卤代烷氧基，优选地C1-C2卤代烷氧基、C1-C4氨基烷基，优选地C1-C2氨基烷基；并且其中R5是C1-C6烷基，优选地C1-C3烷基，各自彼此独立地任选地被氰基、硝基、卤素、NHC(O)C1-C3烷基、NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代；芳基、C1-C3亚烷基芳基、C1-C3亚烷基二芳基，各自彼此独立地任选地被氰基、硝基、卤素、NHC(O)C1-C3烷基、NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代；乙酰基；羟基保护基；并且其中R6和R7彼此独立地为氢、C1-C6烷基，优选地C1-C4烷基，各自彼此独立地任选地被氰基、硝基、卤素、C2-C4烯基、C3-C6环烷基、C1-C3烷氧基取代；任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基取代的芳基；氨基保护基；或与它们所连接的氮原子一起形成杂环，其中优选所述杂环选自吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基和高哌嗪,其中所述杂环任选被C1-C3烷基取代；并且其中R8是巯基保护基；并且其中波浪线表示与所述OR2基团的氧的连接。
在另一优选实施方案中，式(VII)的磷部分的R3或R4在每次出现时独立地并且彼此为卤素，优选氯或者OR5，其中R5是羟基保护基。用于本发明的另外的磷部分公开在Tetrahedron Repo室温Number 309(Beaucage and Iyer,Tetrahedron,1992,48,2223-2311)中。
如本文所用，术语“磷部分”优选是指包含PIII或PV价态的磷原子的基团R2并且由式(VIII)、式(IX)或式(X)在每次出现时独立地表示，
其中Y是O、S或Se，并且其中Y优选为O或S，更优选地Y是O；并且其中R5和R5’在每次出现时独立地并且彼此独立地为氢、C1-C9烷基、C1-C6烷氧基，彼此独立地各自任选地被氰基、硝基、卤素、-NHC(O)C1-C3烷基、-NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代；芳基、C1-C6亚烷基芳基、C1-C6亚烷基二芳基，彼此独立地各自任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷基、C1-C4卤代烷氧基、-NHC(O)C1-C3烷基、NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代；羟基保护基；其中R6和R7彼此独立地为氢、任选地被氰基、硝基、卤素、C2-C6烯基、C3-C6环烷基、C1-C3烷氧基取代的C1-C9烷基；任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基取代的芳基，优选苯基；氨基保护基；或与它们所连接的氮原子一起形成杂环，其中优选所述杂环选自吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基和高哌嗪,其中所述杂环任选被C1-C3烷基取代；并且其中R8是巯基保护基；并且其中波浪线表示与所述OR2基团的氧的连接。
在优选的实施方案中，所述磷部分R2由式(VIII)表示
其中Y是O、S或Se，其中Y优选为O或S，最优选地Y是O；并且其中R5和R5’在每次出现时独立地并且彼此独立地为氢、C1-C9烷基、C1-C6烷氧基，彼此独立地各自任选地被氰基、硝基、卤素、-NHC(O)C1-C3烷基、-NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代；芳基、C1-C6亚烷基芳基、C1-C6亚烷基二芳基，彼此独立地各自任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷基、C1-C4卤代烷氧基、-NHC(O)C1-C3烷基、NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代；羟基保护基；P(O)(OR9)(OR9’),P(O)OP(O)(OR9)(OR9’)；其中R9和R9’在每次出现时独立地并且彼此独立地为氢、任选地被氰基、硝基、卤素、-NHC(O)C1-C3烷基、-NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代的C1-C9烷基；芳基、C1-C6亚烷基芳基、C1-C6亚烷基二芳基，彼此独立地各自任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷基、C1-C4卤代烷氧基、-NHC(O)C1-C3烷基、NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代；羟基保护基；并且其中波浪线表示与所述OR2基团的氧的连接。
在优选的实施方案中，式(VIII)的R5和R5’在每次出现时独立地并且彼此独立地为氢、C1-C6烷基、优选C1-C3烷基、C1-C4烷基、优选C1-C2烷氧基，彼此独立地各自任选地被氰基、硝基、卤素、-NHC(O)C1-C3烷基、-NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代；芳基，苯基、C1-C4亚烷基芳基、C1-C4亚烷基二芳基，彼此独立地各自任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷基、C1-C4卤代烷氧基、-NHC(O)C1-C3烷基、NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代；羟基保护基。
在优选的实施方案中，式(VIII)的R5和R5’彼此独立地为C1-C4烷基或芳基，优选苯基。在另一优选的实施方案中，式(VIII)的R5和R5’彼此独立地为甲基或乙基。在进一步的优选实施方案中，式(VIII)的R5和R5’彼此独立地为苯基或苄基。在另一优选的实施方案中，R5和R5’在每次出现时独立地并且彼此独立地为氢或羟基保护基，优选羟基保护基。在优选的实施方案中，在式(VIII)中，R5和R5’在每次出现时独立地并且彼此独立地为氢、彼此各自独立地任选地被氰基、硝基、卤素取代的C1-C9烷基、C1-C6烷氧基；彼此各自独立地任选地被氰基、硝基、卤素取代的芳基、C1-C6亚烷基芳基；羟基保护基。通常且优选地，由式(VIII)表示的所述磷部分R2在本文中称为“磷酸酯部分”。
在优选的实施方案中，所述磷部分R2由式(IX)表示
其中
其中
Y是O、S或Se，并且其中Y优选为O或S，最优选Y是O；并且其中R5在每次出现时独立地为氢、C1-C9烷基、C1-C6烷氧基，彼此独立地各自任选地被氰基、硝基、卤素、-NHC(O)C1-C3烷基、-NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代；芳基、C1-C6亚烷基芳基、C1-C6亚烷基二芳基，彼此独立地各自任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷基、C1-C4卤代烷氧基、-NHC(O)C1-C3烷基、NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代；羟基保护基；其中
R6和R7彼此独立地为氢、任选地被氰基、硝基、卤素、C2-C6烯基、C3-C6环烷基、C1-C3烷氧基取代的C1-C9烷基；任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基取代的芳基，优选苯基；氨基保护基；或与它们所连接的氮原子一起形成杂环，其中优选所述杂环选自吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基和高哌嗪,其中所述杂环任选被C1-C3烷基取代；并且其中波浪线表示与所述OR2基团的氧的连接。通常且优选地，由式(IX)表示的所述磷部分R2在本文中称为“氨基磷酸酯部分”或可互换使用的“氨基酰胺部分”。
在优选的实施方案中，所述磷部分R2由式(X)表示
其中
R5为氢、C1-C9烷基、C1-C6烷氧基，彼此独立地各自任选地被氰基、硝基、卤素、-NHC(O)C1-C3烷基、-NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代；芳基、C1-C6亚烷基芳基、C1-C6亚烷基二芳基，彼此独立地任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷基、C1-C4卤代烷氧基、-NHC(O)C1-C3烷基、NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代；羟基保护基；并且其中
R6和R7彼此独立地为氢、任选地被氰基、硝基、卤素、C2-C6烯基、C3-C6环烷基、C1-C3烷氧基取代的C1-C9烷基；任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基取代的芳基，优选苯基；或与它们所连接的氮原子一起形成杂环，其中优选所述杂环选自吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基和高哌嗪,其中所述杂环任选被C1-C3烷基取代；并且其中波浪线表示与所述OR2基团的氧的连接。通常且优选地，由式(X)表示的所述磷部分R2在本文中称为“亚磷酰胺(phosphoramidite)部分”或可互换使用的“亚磷酰胺(phosphoroamidite)部分”。
在优选的实施方案中，在式(IX)中所述Y是O；所述R5在每次出现时独立地为氢、彼此独立地各自任选地被氰基、硝基、卤素取代的C1-C9烷基、C1-C6烷氧基；彼此独立地各自任选地被氰基、硝基、卤素取代的芳基、C1-C6亚烷基芳基；羟基保护基；其中R6和R7彼此独立地为氢、任选地被氰基、硝基、卤素取代的C1-C9烷基、C2-C6烯基；任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基取代的芳基；氨基保护基；并且其中波浪线表示与所述OR2基团的氧的连接。
在优选的实施方案中，在式(X)中所述R5在每次出现时独立地为氢、彼此独立地各自任选地被氰基、硝基、卤素取代的C1-C9烷基、C1-C6烷氧基；彼此独立地各自任选地被氰基、硝基、卤素取代的芳基、C1-C6亚烷基芳基；羟基保护基；其中R6和R7彼此独立地为氢、任选地被氰基、硝基、卤素取代的C1-C9烷基、C2-C6烯基；任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基取代的芳基；氨基保护基；并且其中波浪线表示与所述OR2基团的氧的连接。
在非常优选的实施方案中，所述磷部分R2在每次出现时独立地选自磷酸酯部分、氨基磷酸酯部分和亚磷酰胺部分。
在进一步优选的实施方案中，所述R5在每次出现时独立地为氢、C1-C6烷基、优选C1-C4烷氧基，彼此独立地各自任选地被氰基、硝基、卤素、-NHC(O)C1-C3烷基、-NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代；芳基、C1-C4亚烷基芳基、C1-C4亚烷基二芳基，彼此独立地各自任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷基、C1-C4卤代烷氧基、-NHC(O)C1-C3烷基、NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代；羟基保护基；其中R6和R7彼此独立地为氢、任选地被氰基、硝基、卤素、C2-C4烯基、C3-C6环烷基、C1-C3烷氧基取代的C1-C6烷基；任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基取代的芳基；氨基保护基；或与它们所连接的氮原子一起形成杂环，其中优选所述杂环选自吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基和高哌嗪,其中所述杂环任选被C1-C3烷基取代；并且其中波浪线表示与所述OR2基团的氧的连接。
在进一步优选的实施方案中，所述R5是任选被氰基、氯、氟或溴取代的C1-C3烷基；芳基、C1-C3亚烷基芳基、C1-C3亚烷基二芳基，彼此独立地任选地被氰基、硝基、氯、氟、溴、C1-C2烷氧基、C1卤代烷基取代。在更优选的实施方案中，所述R5是任选被氰基、氯、氟或溴取代的C1-C3烷基；优选被氰基取代。在又一更优选的实施方案中，所述R5是氰基取代的C2烷基，优选所述R5是–CH2CH2-CN。
在进一步优选的实施方案中，所述R5是C1-C4烷基，优选甲基或乙基；芳基，优选苯基或苄基；氯化物或羟基保护基。在进一步优选的实施方案中，所述R5是甲基或羟基保护基。
在进一步优选的实施方案中，所述R5是任选被氰基、氯、氟或溴取代的C1-C6烷基。
在进一步优选的实施方案中，所述R6和R7彼此独立地为H或C1-C3烷基；或与它们所连接的氮原子一起形成杂环，其中所述杂环选自吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基，其中所述杂环任选被甲基取代。在进一步优选的实施方案中，所述R6和R7彼此独立地为C1-C3烷基、烷氧基或芳基，其中芳基优选为苯基或苄基，任选被氰基、硝基、氯、氟、溴取代。在进一步优选的实施方案中，所述R6是氢，并且R7是(i)C1-C9烷基或(ii)芳基，(i)或(ii)任选被氰基、硝基、卤素、芳基取代，其中优选R7是C1-C3烷基、苯基或苄基。
在进一步优选的实施方案中，所述R6和R7彼此独立地选自甲基、乙基、异丙基或异丁基。在更优选的实施方案中，所述R6和R7彼此独立地为异丙基。
在另一个非常优选的实施方案中，所述磷部分R2由式(X)表示，其中所述R5是(i)C1-C9烷基；(ii)芳基，优选苯基；或(iii)任选被氰基、硝基、卤素、芳基取代的所述(i)或所述(ii)；并且其中所述R6和R7彼此独立地为C1-C9烷基，优选异丙基。
在另一个非常优选的实施方案中，所述磷部分R2由式(X)表示，其中R5是任选被氰基、硝基、卤素、-NHC(O)C1-C3烷基、-NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代的C1-C9烷基；芳基、C1-C6亚烷基芳基、C1-C6亚烷基二芳基，彼此独立地任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷基、C1-C4卤代烷氧基、-NHC(O)C1-C3烷基、-NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代；并且R6和R7彼此独立地为任选地被氰基、硝基、卤素、C2-C6烯基、C3-C6环烷基、C1-C3烷氧基取代的C1-C9烷基；任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基取代的苯基；或与它们所连接的氮原子一起形成杂环，其中优选所述杂环选自吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基和高哌嗪,其中所述杂环任选被C1-C3烷基取代；并且其中波浪线表示与所述OR2基团的氧的连接。
在另一个非常优选的实施方案中，所述磷部分R2由式(X)表示，其中所述R5是任选地被氰基、硝基、氯、氟、溴、-NHC(O)C1-C3烷基、-NHC(O)C1-C3卤代烷基取代的C1-C9烷基；芳基、C1-C6亚烷基芳基、C1-C6亚烷基二芳基，彼此独立地任选地被氰基、硝基、氯、氟、溴、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷基取代。
在另一个非常优选的实施方案中，所述磷部分R2由式(X)表示，其中所述R5是任选被氰基、氯、氟和溴取代的C1-C3烷基；芳基、C1-C3亚烷基芳基、C1-C3亚烷基二芳基，彼此独立地任选地被氰基、硝基、氯、氟、溴、C1-C2烷氧基、C1卤代烷基取代。
在另一个非常优选的实施方案中，所述磷部分R2由式(X)表示，其中所述R5是C1-C3烷基、2-氰基乙基、2,2,2-三氯乙基、2,2,2-三溴乙基、-(CH2)nNHC(O)CF3，其中n＝3-6；苯基、C1-C3亚烷基苯基、二苯甲基，彼此独立地任选地被氰基、硝基、氯、氟、溴、C1-C2烷氧基、-CF3取代。
在另一个非常优选的实施方案中，所述磷部分R2由式(X)表示，其中所述R5是甲基、乙基、2-氰基乙基，再次优选2-氰基乙基(CH2)2CN)。
在另一个非常优选的实施方案中，所述磷部分R2由式(X)表示，其中所述R6和R7彼此独立地为C1-C3烷基或与它们所连接的氮原子一起形成杂环，其中所述杂环选自吡咯烷基、哌啶基、吗啉基，其中所述杂环任选被C1-C3烷基取代，并且其中再次优选所述杂环任选被甲基取代。
在另一个非常优选的实施方案中，所述磷部分R2由式(X)表示，其中R6与R7相同并且R7是异丙基或甲基。
在另一个非常优选的实施方案中，所述磷部分R2由式(X)表示，其中所述R5是甲基、乙基、2-氰基乙基，优选2-氰基乙基，并且其中R6与R7相同并且R7是异丙基或甲基。
每个烷基部分单独或作为较大基团如烷氧基或亚烷基的一部分是直链或支链，并且优选是C1-C6烷基，更优选C1-C3烷基。实例包括甲基、乙基、正丙基、丙-2-基(异丙基；本文可互换地缩写为iPr或Pri，特别是在绘制的化学式中)、正丁基、丁-2-基、2-甲基-丙-1-基或2-甲基-丙-2-基。烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、正己氧基。如本文所述，烷氧基可以包括进一步的取代基，如导致卤代烷氧基部分的卤素原子。
每个亚烷基部分是直链或支链并且是例如-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(CH3)-CH2-或-CH(CH2CH3)-。
每个烯基部分单独或作为较大基团如烯氧基或亚烷基的一部分是直链或支链，并且优选是C2-C6烯基，更优选C2-C4烯基。每个部分能够为(E)-或(Z)-构型。实例包括乙烯基和烯丙基。如果适用，包含烯基部分的本发明化合物可以包括具有所述烯基部分的所述化合物(E)-构型，所述具有所述链基部分的化合物(Z)-构型及其任何比例的混合物。
每个炔基部分单独或作为较大基团如炔氧基的一部分是直链或支链，并且优选是C2-C6炔基，更优选C2-C4炔基。实例是乙炔基和炔丙基。
卤素是氟、氯、溴或碘，优选氯。在优选的实施方案中，卤素取代基是氯。
每个卤代烷基部分单独或作为较大基团如卤代烷氧基的一部分是被一个或多个相同或不同的卤素原子取代的烷基。实例包括二氟甲基、三氟甲基、氯二氟甲基和2,2,2-三氟乙基。
本文所用的术语“芳基”是指通过从母体芳族环系统的单个碳原子上除去一个氢原子衍生的6-14个碳原子的单价芳族烃基(C6-C14)以及所述芳基任选地被一个或多个取代基、通常且优选被如下所述的一个或两个取代基独立地取代。芳基包括双环基团，其包含与饱和的、部分不饱和的环或芳族碳环或杂环稠合的芳环。芳基任选独立地被一个或多个取代基、通常且优选被一个或两个取代基取代，其中所述取代基在每次出现时独立地选自C1-C4烷基、卤素、CF3、OH、C1-C3烷氧基、NR20R21、C6H5、被卤素取代的C6H5、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、NR20R21，其中R20、R21在每次出现时独立地为H、C1-C3烷基。典型的芳基包括但不限于衍生自苯(苯基)、取代的苯基、萘、蒽、联苯、茚基、茚满基、1,2-二氢萘、1,2,3,4-四氢萘基等的基团。如本文所用，术语“芳基”优选是指任选被1至3个R22取代的苯基，其中R22在每次出现时独立地为卤素、-OH、任选被一个或两个OH取代的C1-C3烷基、C1-C2氟烷基、C1-C2烷氧基、C1-C2烷氧基C1-C3烷基、C3-C6环烷基、NHCH3或N(CH3)2。
当所述基团任选被取代时，优选任选1-5个取代基，更优选任选1-3个取代基，再更优选任选1或2个取代基。当所述基团任选被取代时，并且当对于所述基团的所述任选取代存在多于一个取代基时，所述多于一个取代基可以相同或不同。
如本文所用，术语“核碱基”并且缩写为Bx，是指未修饰的或天然存在的核碱基以及修饰的或非天然存在的核碱基及其合成模拟物。核碱基是含有一个或多个原子或原子团的任何杂环碱基，所述原子或原子团能够与核酸的杂环碱基形成氢键。
在一个实施方案中，核碱基是嘌呤碱基或嘧啶碱基，其中优选所述嘌呤碱基是嘌呤或取代的嘌呤，并且所述嘧啶碱基是嘧啶或取代的嘧啶。更优选地，核碱基是(i)腺嘌呤(A)、(ii)胞嘧啶(C)、(iii)5-甲基胞嘧啶(MeC)、(iv)鸟嘌呤(G)、(v)尿嘧啶(U)或(vi)5-甲基尿嘧啶(MeU)或(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的衍生物。术语“(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的衍生物”和“核碱基衍生物”在本文中可互换使用。(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的衍生物和核碱基衍生物是本领域技术人员分别已知的，并且描述于例如Sharma V.K.等,Med.Chem.Commun.,2014,5,1454-1471中，并且包括但不限于5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、烷基腺嘌呤，如6-甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、烷基鸟嘌呤，如6-甲基鸟嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、炔基嘧啶碱基，如5-丙炔基(-C＝C-CH3)尿嘧啶、5-丙炔基(-C＝C-CH3)胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫尿嘧啶；8-取代的嘌呤碱基，如8-卤代-、8-氨基-、8-硫代-、8-硫代烷基-、8-羟基-腺嘌呤或鸟嘌呤、5-取代的嘧啶碱基，如5-卤代-、特别是5-溴-、5-三氟甲基-尿嘧啶或-胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、疏水碱基、混杂碱基、尺寸扩大的碱基或氟化碱基。在某些实施方案中，核碱基包括但不限于三环嘧啶，例如1,3-二氮杂萘嗪-2-酮、1,3-二氮杂吩噻嗪-2-酮或9-(2-氨基乙氧基)-1,3-二氮杂萘嗪-2-酮(G-clamp)。术语“核碱基衍生物”还包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环取代的那些，例如7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶或2-吡啶酮。本发明的其他核碱基包括但不限于本领域技术人员已知的那些(例如美国专利3,687,808；Swayze等,The Medicinal Chemistry ofOligonucleotides,in Antisense a Drug Technology,第6章,第143-182页(Crooke,S.T.,ed.,2008)；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,Kroschwitz,J.I.,Ed.,John Wiley&Sons,1990,第858-859页；Englisch等,AngewandteChemie,International Edition,1991,卷30(6),第613-623页；Sanghvi,Y.S.,AntisenseResearch and Applications,Crooke,S.T.和Lebleu,B.,Eds.,CRC Press,1993,第273-302页)。
优选的核碱基衍生物包括甲基化腺嘌呤，鸟嘌呤，尿嘧啶和胞嘧啶和核碱基衍生物，优选(i)、(ii)、(iii)或(iv)的衍生物，其中各个氨基、优选环外氨基，被酰基保护基或二烷基甲酰胺基，优选二甲基甲酰胺基(DMF)保护，并且还包括核碱基衍生物，例如2-氟尿嘧啶、2-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、氮杂胞嘧啶和嘧啶类似物，例如假异胞嘧啶和假尿嘧啶。
在进一步优选的实施方案中，所述核碱基衍生物选自甲基化腺嘌呤、甲基化鸟嘌呤、甲基化尿嘧啶和甲基化胞嘧啶，以及(i)、(ii)、(iii)或(iv)的核碱基衍生物，其中各氨基，优选环外氨基，受到保护基的保护。
在进一步优选的实施方案中，所述核碱基衍生物选自甲基化腺嘌呤、甲基化鸟嘌呤、甲基化尿嘧啶和甲基化胞嘧啶，以及(i)、(ii)、(iii)或(iv)的核碱基衍生物，其中各氨基，优选环外氨基，受到酰基保护基或二烷基甲酰胺基、优选二甲基甲酰胺基(DMF)的保护。
在进一步优选的实施方案中，所述核碱基衍生物选自(i)、(ii)、(iii)或(iv)的核碱基衍生物，其中各氨基，优选环外氨基，受到保护基的保护。
在进一步优选的实施方案中，所述核碱基衍生物是(i)、(ii)、(iii)或(iv)的核碱基衍生物，其中环外氨基受到酰基保护基或二烷基甲酰胺基、优选二甲基甲酰胺基(DMF)的保护。
在进一步非常优选的实施方案中，所述(i)、(ii)、(iii)或(iv)的核碱基衍生物的所述环外氨基的所述酰基保护基是-C(O)-R11，其中R11彼此独立地选自C1-C10烷基、C6-C10芳基、C6-C10芳基C1-C10亚烷基或C6-C10芳氧基C1-C10亚烷基并且其中所述二烷基甲酰胺基保护基是＝C(H)-NR12R13，其中R12和R13彼此独立地选自C1-C4烷基。
在进一步非常优选的实施方案中，所述(i)、(ii)、(iii)或(iv)的核碱基衍生物的所述环外氨基的所述酰基保护基是-C(O)-R14，其中R14彼此独立地选自C1-C4烷基；苯基；被卤素、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C1-C4烷氧基取代的苯基；苄基；被卤素、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C1-C4烷氧基取代的苄基；或任选被卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基取代的苯氧基C1-C2亚烷基；并且其中所述二烷基甲酰胺基保护基是＝C(H)-NR12R13，其中R12和R13彼此独立地选自C1-C4烷基。
在进一步非常优选的实施方案中，所述(i)、(ii)、(iii)或(iv)的核碱基衍生物的所述环外氨基的所述酰基保护基是-C(O)-R15，其中R15彼此独立地选自C1-C4烷基；苯基；被卤素、C1-C4烷基、C5-C6环烷基、C1-C4烷氧基取代的苯基；苄基；被卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基取代的苄基；或苯氧基亚甲基(CH2-OC6H5)其中苯基任选被卤素、C1-C4烷基、C5-C6环烷基、C1-C4烷氧基取代；并且其中所述二烷基甲酰胺基保护基是＝C(H)-NR12R13，其中R12和R13彼此独立地选自C1-C4烷基。
在进一步非常优选的实施方案中，所述(i)、(ii)、(iii)或(iv)的核碱基衍生物的所述环外氨基的所述酰基保护基是-C(O)-R16，其中R16彼此独立地选自C1-C3烷基；苯基；被C1-C3烷基、甲氧基取代的苯基；或苯氧基亚甲基(CH2-OC6H5)其中C6H5任选被C1-C3烷基、甲氧基取代；并且其中所述二烷基甲酰胺基保护基是＝C(H)-NR12R13，其中R12和R13彼此独立地选自C1-C4烷基。
在进一步非常优选的实施方案中，所述(i)、(ii)、(iii)或(iv)的核碱基衍生物的所述环外氨基的所述酰基保护基是-C(O)-R16，其中R16彼此独立地选自C1-C3烷基；苯基；被C1-C3烷基、甲氧基取代的苯基；或苯氧基亚甲基(CH2-OC6H5)其中C6H5任选被C1-C3烷基、甲氧基取代；并且其中所述二烷基甲酰胺基保护基是二甲基甲酰胺基(DMF)。
在进一步非常优选的实施方案中，所述(i)、(ii)、(iii)或(iv)的核碱基衍生物的所述环外氨基的所述酰基保护基是-C(O)-R18，其中R18彼此独立地选自甲基、异丙基、苯基、苄基或苯氧基亚甲基(CH2-OC6H5)其中C6H5任选被C1-C3烷基、甲氧基取代；并且其中所述二烷基甲酰胺基保护基是二甲基甲酰胺基(DMF)。
在进一步非常优选的实施方案中，所述(i)、(ii)、(iii)或(iv)的核碱基衍生物的所述环外氨基的所述酰基保护基是-C(O)-R19，其中R19彼此独立地选自甲基、异丙基、苯基、苄基或苯氧基亚甲基(CH2-OC6H5)其中C6H5任选被甲基、异丙基取代；并且其中所述二烷基甲酰胺基保护基是二甲基甲酰胺基(DMF)。
本文所用的术语“二甲基甲酰胺基”是指＝C(H)-NR12R13，其中R12和R13彼此独立地选自C1-C4烷基。在优选的实施方案中，所述二烷基甲酰胺基是所述(i)、(ii)、(iii)或(iv)的核碱基衍生物的所述环外氨基的保护基。所得化合物可以是(E)-或(Z)-构型，两种形式以及它们的任何比例的混合物都应包括在本发明的范围内。在优选的实施方案中，本发明的化合物包含(Z)构型的二烷基甲酰胺基、优选二甲基甲酰胺基(DMF)。
根据一个实施方案，Bx选自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤。优选地，Bx选自胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤。根据一个实施方案，Bx是芳基杂环部分，其在掺入DNA或RNA寡聚体中时能够形成碱基对，代替碱基尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤。
如本文所用，术语“核苷连接基团”是指本领域已知的能够将所述本发明的式(IV)、(V)或(VI)的化合物与另一种化合物、优选核苷化合物连接的任何连接基团，所述核苷化合物包括根据本发明的寡聚体内的式(IV)、(V)或(VI)的本发明的其他化合物。教导这类可能的连接基团的代表性专利不限于美国专利5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,677,439；5,646,269和5,792,608。所述其他化合物选自核苷化合物或非核苷化合物。所述核苷化合物包括但不限于、并且通常而且优选选自(i)核苷、(ii)核苷酸、(iii)寡核苷酸或(iv)(i)、(ii)或(iii)的修饰。所述非核苷化合物包括，通常且优选选自肽、蛋白质、硅酸盐化合物或甚至固体支持物。固体载体包括但不限于表面、珠粒、玻璃载体、聚合物或树脂。在一个优选的实施方案中，玻璃是可控孔径玻璃，优选具有的孔。珠粒包括但不限于玻璃珠，优选可控孔玻璃或磁珠。聚合物包括但不限于聚苯乙烯，包括例如二乙烯基苯、苯乙烯和氯甲基苯乙烯。在优选的实施方案中，固体支持物是高度交联的聚苯乙烯珠粒。
术语“核苷连接基团”包括磷连接基团和非磷连接基团。非磷连接基团不含磷原子，非磷连接基团的实例包括、并且通常而且优选选自烷基、芳基，优选苯基、苄基或苯甲酰基、环烷基、亚烷基芳基、亚烷基二芳基、烷氧基、烷氧基亚烷基、烷基磺酰基、炔基、醚，各自彼此独立地任选地被氰基、硝基、卤素取代；羧基、酰胺、胺、氨基、亚胺、硫醇、硫化物、亚砜、砜、氨基磺酸盐、磺酸盐、磺酰胺、硅氧烷或其混合物。在优选的实施方案中，非磷连接基团是氨基丙基、长链烷基胺基、丙基、乙酰胺、氨基甲基、甲缩醛、硫代甲缩醛、硫代甲酰基、核乙酰基、亚甲基亚氨基、亚甲基肼基或中性非离子核苷连接基团，例如酰胺-3(3'-CH2-C(＝O)-N(H)-5')或酰胺-4(3'-CH2-N(H)-C(＝O)-5')。在优选的实施方案中，非磷连接基团包括选自烷基、芳基，优选苯基、苄基或苯甲酰基、环烷基、亚烷基芳基、亚烷基二芳基、烷氧基、烷氧基亚烷基、烷基磺酰基、炔烃或醚的化合物，其中该化合物包括C1-C9、C1-C6或C1-C4。
在优选的实施方案中，所述核苷连接基团是磷连接基团，所述磷连接基团是指包含PIII或PV价态的磷原子的部分，其由式(XI)表示：
其中
W表示O、S、Se或电子对；优选W表示O或S；
R10为H、卤素、OH、OR5、NR6R7、SH、SR8、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6氨基烷基；其中R5是C1-C9烷基、C1-C6烷氧基,各自彼此独立地任选地被氰基、硝基、卤素、-NHC(O)C1-C3烷基、NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代；芳基、C1-C6亚烷基芳基、C1-C6亚烷基二芳基，各自彼此独立地任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷基、C1-C4卤代烷氧基、NHC(O)C1-C3烷基、NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代；乙酰基；羟基保护基；其中R6和R7彼此独立地为氢、任选地被氰基、硝基、卤素、C2-C6烯基、C3-C6环烷基、C1-C3烷氧基取代的C1-C9烷基；任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基取代的芳基；氨基保护基；或与它们所连接的氮原子一起形成杂环，其中优选所述杂环选自吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基和高哌嗪,其中所述杂环任选被C1-C3烷基取代；并且其中R8是巯基保护基；并且其中波浪线中的每一个表示式(XI)的所述磷连接基团与另一化合物、优选与核苷化合物的连接，所述核苷化合物包括根据本发明的寡聚体内的式(IV)、(V)或(VI)的另一本发明的化合物。当W表示O、S或Se时，则所述磷部分内的所述P原子处于其PV价态。当W表示电子对时，则所述磷部分内的所述P原子处于其PIII价态。式(XI)的部分包括任何可能的立体异构体。由式(XI)表示的所述部分中进一步包括其盐，其中通常且优选在用无机碱或胺处理时形成所述盐，并且通常而且优选地源自与OH或SH基团反应的盐(彼此独立地)为所述R10。导致所述与OH或SH基团形成盐的优选无机碱或胺是本领域熟知的，并且通常而且优选三甲胺、二乙胺、甲胺或氢氧化铵。如果合适，本发明中包括的这些磷部分也缩写为“O-HB+”，其中所述HB+是指形成的抗衡阳离子。
在优选的实施方案中，在式(XI)的磷连接基团中，R6和R7彼此独立地为氢、任选被氰基、硝基、卤素、C2-C6烯基取代的C1-C6烷基；任选被氰基、硝基、卤素、C1-C3烷基取代的芳基；或氨基保护基。
在优选的实施方案中，在式(XI)的磷连接基团中，W表示O或S；R10是H、OH、OR5、NR6R7、C1-C6烷基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6氨基烷基；其中R5是C1-C9烷基、C1-C6烷氧基,各自彼此独立地任选地被氰基、硝基、卤素、-NHC(O)C1-C3烷基、NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代；芳基、C1-C6亚烷基芳基、C1-C6亚烷基二芳基，各自彼此独立地任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷基、C1-C4卤代烷氧基、NHC(O)C1-C3烷基、NHC(O)C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基磺酰基取代；乙酰基；羟基保护基；其中R6和R7彼此独立地为氢、任选地被氰基、硝基、卤素取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C3-C6环烷基、C1-C3烷氧基；任选地被氰基、硝基、卤素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基取代的芳基；氨基保护基；并且其中R8是巯基保护基。
在进一步优选的实施方案中，所述核苷键连接基团是磷连接基团，并且所述磷连接基团选自磷酸二酯键连接基团、磷酸三酯连接基团、硫代磷酸酯连接基团、二硫代磷酸酯连接基团、膦酸酯连接基团，优选H-膦酸酯连接基团或甲基膦酸酯连接基团；硫代磷酸酯连接基团，优选H-硫代磷酸酯连接基团、甲基硫代磷酸酯连接基团；次膦酸连接基团、硫代氨基磷酸酯连接、氨基磷酸酯连接基团或亚磷酸酯键连接基团。在另一个非常优选的实施方案中，所述核苷连接基团是磷连接基团，并且其中所述磷连接基团选自磷酸二酯键连接基团、磷酸三酯连接基团、硫代磷酸酯连接基团或膦酸酯连接基团，其中膦酸酯基团优选是H-膦酸酯连接基团或甲基膦酸酯连接基团。
在另一个非常优选的实施方案中，所述核苷连接基团是磷连接基团，并且其中所述磷连接基团是磷酸二酯连接基团。在另一个非常优选的实施方案中，所述核苷连接基团是磷连接基团，并且其中所述磷连接基团是硫代磷酸酯连接基团。
在优选的实施方案中，磷连接基团选自烷基磷酸二酯连接基团、亚烷基磷酸二酯连接基团、硫代烷基磷酸二酯连接基团或氨基烷基磷酸二酯连接基团、烷基磷酸三酯连接基团、亚烷基磷酸三酯连接基团、硫代烷基磷酸三酯连接基团或氨基烷基磷酸酯连接基团、烷基膦酸酯连接基团、亚烷基膦酸酯连接基团、氨基烷基膦酸酯连接基团、硫代烷基膦酸酯连接基团或手性膦酸酯连接基团。更优选地，所述核苷连接基团是磷连接基团，并且其中所述磷连接基团是磷酸二酯连接基团-O-P(＝O)(OH)O-或-O-P(＝O)(O-)O-，[HB+]为抗衡离子、硫代磷酸酯-O-P(＝S)(OH)O-或-O-P(＝S)(O-)O-，[HB+]作为抗衡离子，甲基膦酸酯-O-P(＝O)(CH3)O-。包括磷连接基团的各种盐、混合盐和游离酸形式。
在进一步的实施方案中，所述核苷酸连接基团将核苷、核苷酸或寡核苷酸与另外的核苷、核苷酸或寡核苷酸连接。
式(I)和(IV)中的波浪线表示Bx和本发明化合物的双环核之间的键，表明核碱基Bx的任何空间取向都被式(I)或(IV)所涵盖。这意味着式(I)和(IV)涵盖本发明化合物的α或β构象或α和β异头物的任何混合物。
如本文所用，术语“核苷”是指包含核碱基和与所述核碱基共价连接的糖的化合物。如本文所用，术语“核苷酸”是指进一步包含核苷连接基团或磷部分的核苷，其中所述核苷连接基团或所述磷部分与所述核苷的糖共价连接。
如本文所用，术语“核苷”或“核苷酸”意指分别包括天然存在的或修饰的核苷或核苷模拟物，或天然存在的或修饰的核苷酸或核苷酸模拟物的所有方式，其可以使用天然掺入寡聚体中或化学寡聚体合成。通常且优选地，如本文所用，术语“核苷”是指天然存在的核苷、修饰的核苷或核苷模拟物。通常且优选地，如本文所用，术语“核苷酸”是指天然存在的核苷酸、修饰的核苷酸或核苷酸模拟物。
术语“经修饰的核苷”旨在包括对核苷的糖和/或核碱基进行的修饰，如本领域技术人员已知的和本文所述。术语“经修饰的核苷酸”旨在包括对核苷酸的糖和/或核碱基和/或核苷连接基团或磷部分进行的修饰，如本领域技术人员已知的和本文所述。
术语“核苷模拟物”旨在包括用于取代糖和核碱基的那些结构。核苷模拟物的实例包括核苷，其中核碱基被吩噁嗪部分(例如9-(2-氨基乙氧基)-1,3-二氮杂萘嗪-2-酮基团)替换，糖部分被环己烯基或双环[3.1.0]己基部分替换。本文所用的术语“核苷酸模拟物”意指包括用于替换糖和核苷连接基团的核苷酸。核苷酸模拟物的实例包括肽核酸(PNA)或吗啉代。
术语“核苷”或“核苷酸”还包括修饰的组合，例如多于一个核碱基修饰、多于一个糖修饰或至少一个核碱基和至少一个糖修饰。
核苷或核苷酸的糖包括但不限于单环、双环或三环系统，优选三环或双环系统或单环核糖或脱氧基氧基糖。糖的修饰还包括但不限于修饰的立体化学构型，基团的至少一个取代或基团的至少一个缺失。经修饰的糖通常且优选为核糖基部分的修饰形式，其天然存在于RNA和DNA(即呋喃糖基部分)中，例如双环糖、四氢吡喃、2'-修饰的糖、3'-修饰的糖、4'-修饰的糖、5'-修饰的糖或4'-取代的糖。合适的糖修饰的实例是本领域技术人员已知的，包括但不限于2'、3'和/或4'取代的核苷(例如4'-S-修饰的核苷)；2'-O-修饰的RNA核苷酸残基，例如2'-O-烷基或2'-O-(取代的)烷基，例如2'-O-甲基、2'-O-(2-氰基乙基)、2'-O-(2-甲氧基)乙基(2'-MOE)、2'-O-(2-硫代甲基)乙基；2'-O-(卤代烷氧基)甲基，例如，2'-O-(2-氯乙氧基)甲基(MCEM)、2'-O-(2,2-二氯乙氧基)甲基(DCEM)；2'-O-烷氧基羰基，例如，2'-O-[2-(甲氧基羰基)乙基](MOCE)、2'-O-[2-(N-甲基氨基甲酰基)乙基](MCE)、2'-O-[2-(N,N-二甲基氨基甲酰基)乙基](DMCE)，特别是2'-O-甲基修饰或2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)；或其他经修饰的糖部分，例如吗啉代(PMO)、阳离子吗啉代(PMOPlus)或经修饰的吗啉代基团，例如PMO-X。术语“PMO-X”是指包含至少一个3'或5'末端修饰的修饰的吗啉代基团，例如3'-荧光标记、3'猝灭剂(例如3'-羧基荧光素，3'-Gene Tools Blue，3'-赖氨酸，3'-dabcyl)、3'-亲和标记和用于化学连接的官能团(例如3'-生物素、3'-伯胺、3'-二硫化物酰胺、3'-吡啶基二硫基)、5'-末端修饰(5'-伯胺、5'-dabcyl)、3'-叠氮化物、3'-炔烃、5'-叠氮化物、5'-炔烃，或如WO2011/150408和US2012/0065169中所公开的。
“双糖部分”包括两个相互连接的环系，例如，双环核苷，其中糖部分具有2'-O-CH(烷基)-4'或2'-O-CH2-4'基团、锁核酸(LNA)、木糖-LNA、α-L-LNA、β-D-LNA、cEt(2'-O,4'-C约束乙基)LNA、cMOEt(2'-O,4'-C约束甲氧基乙基)LNA、乙烯桥联核酸(ENA)、己糖醇核酸(HNA)、氟化HNA(F-HNA)、吡喃糖基-RNA(p-RNA)或3'-脱氧吡喃糖基-DNA(p-DNA)。或者，核苷或核苷酸的糖包括例如描述于WO 2013/135900和WO 2014/140348中的三环糖部分。
如本文所用，术语“寡聚体”是指包含通过核苷连接基团连接的两个或更多个单体亚单元的化合物，其中所述两个或更多个单体亚单元中的至少一个是式(IV)的化合物，优选式(V)的化合物或式(VI)的化合物。在优选的实施方案中，寡聚体包含(IV)、(V)或(VI)的化合物中的至少一种式化合物和至少一种核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。更优选地，寡聚体包含(IV)、(V)或(VI)的化合物中的至少一种式化合物和至少一种脱氧核糖核苷酸。
如本文所用，术语“单体亚单元”意指包括适合于寡聚体合成的所有方式的单体单元，包括、并且通常而且优选地指以下单体亚单元，例如α-D-核糖核苷、β-D-核糖核苷、α-D-2'-脱氧核苷、β-D-2'-脱氧核苷、天然存在的核苷、天然存在的核苷酸、修饰的核苷、修饰的核苷酸、核苷的模拟物、核苷酸的模拟物和本文提供的本发明化合物，包括式(I)至(VI)的任何一种化合物。
在优选的实施方案中，寡聚体是寡核苷酸。如本文所用，术语“寡核苷酸”是指包含至少两个核苷的化合物，每个核苷通过核苷连接基团彼此连接。因此，如本文所用，术语“寡核苷酸”包括、并且通常而且优选地是指包含至少两个通过核苷键连接基团连接的核苷的化合物，其中所述至少两个核苷独立地选自天然存在的核苷、修饰的核苷或核苷模拟物。因此，如本文所用，术语“寡核苷酸”包括包含天然存在的核苷酸、修饰的核苷酸或核苷酸模拟物的化合物，因此，如本文所用，术语“寡核苷酸”包括对如本领域技术人员已知的和本文所述的糖和/或核碱基和/或核苷连接基团进行修饰的寡核苷酸。
寡聚体可以是单链或双链的。在一个实施方案中，寡聚体是双链的(即双链体)。在优选的实施方案中，寡聚体是单链的。
在优选的实施方案中，寡聚体与非核苷化合物、优选固体载体偶联。固体载体优选选自珠粒、聚合物或树脂。在某个实施方案中，寡聚体具有至多40个单体亚单元的长度，优选至多30个单体亚单元，更优选至多30个单体亚单元，再更优选至多20个单体亚单元或至多15个单体亚单元。在进一步的实施方案中，所述寡聚体包含5-40个单体亚单元，优选8-30个单体亚单元，更优选8-25个单体亚单元，再更优选8-20个单体亚单元。
在某些实施方案中，通过将一个或多个末端基团共价连接至寡聚体的5'或7'末端来修饰本文提供的寡聚体。末端基团也可以能够在寡聚体的任何末端。
术语“'末端”是指寡聚体、核酸序列或式(IV)、(V)或(VI)的化合物的末端(end)或末端(terminus)，其中整数(3'、5'或7'等)表示包含在寡聚体、核酸序列或式(IV)、(V)或(VI)的化合物的核苷中的糖的碳原子。如本文所用，术语“5'末端基团”或“7'末端基团”是指分别位于式(IV)、(V)或(VI)的化合物中所包含的糖的5'末端或7'末端的基团。“5'末端基团”或“7'末端基团”的实例包括但不限于封端基团、二磷酸盐、三磷酸盐、标记物，例如适于追踪寡聚体、固体载体、非核苷基团、抗体或缀合物基团的荧光标记物(例如荧光素或罗丹明)、染料、报告基团。优选地，“5'末端基团”或“7'末端基团”选自二磷酸盐、三磷酸盐、能够追踪寡聚体、固体载体、非核苷基团、抗体或缀合物基团的荧光标记物、染料、报告基团。
在某些实施方案中，通过共价连接一个或多个缀合物基团来修饰本文提供的寡聚体或式(IV)、(V)或(VI)的化合物。通常，缀合物基团修饰它们所连接的化合物的一种或多种性质。这些性质包括但不限于核酸酶稳定性、结合亲和力、药效学、药代动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、递送、电荷和清除。缀合物基团通常用于化学领域，并且直接或通过任选的连接基团与母体化合物如寡聚体连接。术语“缀合物基团”包括但不限于，并且优选指嵌入剂、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇、硫代胆固醇、胆酸部分、叶酸、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金刚烷、吖啶、亲脂部分或香豆素。
如本文可互换使用的术语“核酸”或“核酸序列”应理解为包含至少两个互连核苷酸或至少两个通过核苷连接基团连接的核苷的寡聚或聚合分子。在本发明的上下文中，核酸包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)，并且优选选自天然存在的RNA、天然存在的DNA、修饰的DNA、修饰的RNA、其混合物，例如RNA-DNA杂交体。修饰可以包含主链，例如核苷连接基团和/或核苷和/或糖，如本文进一步描述的。核酸能够通过化学合成或聚合酶酶促合成。
如本文可互换使用的术语“天然的”或“天然存在的”是指天然来源的化合物。
术语“立体异构体”是指化合物，其具有相同的化学组成，但在空间中原子或基团的排列方面不同。
“非对映异构体”是指具有两个或更多个手性中心的立体异构体，其中化合物不是彼此的镜像。非对映异构体具有不同的物理性质例如熔点、沸点、光谱特性以及化学和生物反应性。非对映异构体的混合物可以在高分辨率分析方法如电泳和色谱法下分离。
“对映异构体”是指化合物的两种立体异构体，它们是彼此不可重叠的镜像。
本文使用的立体化学定义和惯例通常遵循S.P.Parker,Ed.,McRaw-HiffDictionary of Chemical Terms(1984),McGraw-Hill Book Company,纽约以及Eliel,E.与Wilen,S.,"Stereochemistry of Organic Compounds",John Wiley&Sons,Inc.,纽约,1994。
如本文所用，“Tm”(解链温度)是双链核酸的两条链分开的温度。Tm通常用作反义化合物对互补核酸的双链体稳定性的量度。
在第一方面，本发明提供式(I)的化合物：
其中T1和T2中的一个是OR1或OR2；
并且T1和T2中的另一个是OR1或OR2；其中
R1是H或羟基保护基，并且
R2是磷部分；并且其中
Bx是核碱基。
在优选的实施方案中，本发明所述的式(I)的化合物是式(II)的化合物
其中
(i)T1是OR1，并且T2是OR1或OR2；或者
(ii)T1是OR1或OR2，并且T2是OR1；
其中优选T1是OR1或OR2，并且T2是OR1。
式(II)的化合物是α端基异构体或α端基异构体单体，其在1'末端的第一个碳的手性中心处的Bx空间构型中与β端基异构体不同。
在另一优选的实施方案中，所述式(I)的化合物是式(III)的化合物
其中
(i)T1是OR1，并且T2是OR1或OR2；或者
(ii)T1是OR1或OR2，并且T2是OR1；
其中优选T1是OR1，并且T2是OR1或OR2。
式(III)的化合物是β端基异构体或β端基异构体单体，其在1'末端的第一个碳的手性中心处的Bx空间构型中与α端基异构体不同。
在另一优选实施方案中，在式(I)的化合物中，所述磷部分R2选自磷酸酯部分、氨基磷酸酯部分和亚磷酰胺部分。在另一优选实施方案中，在式(II)的化合物中，所述磷部分R2选自磷酸酯部分、氨基磷酸酯部分和亚磷酰胺部分。在另一优选实施方案中，在式(III)的化合物中，所述磷部分R2选自磷酸酯部分、氨基磷酸酯部分和亚磷酰胺部分。
在另一个优选的实施方案中，在式(I)、(II)或(III)的化合物中，所述Bx选自嘌呤碱或嘧啶碱，其中Bx优选选自(i)腺嘌呤(A)、(ii)胞嘧啶(C)、(iii)5-甲基胞嘧啶(MeC)、(iv)鸟嘌呤(G)、(v)尿嘧啶(U)或(vi)5-甲基尿嘧啶(MeU)或(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的衍生物，并且其中进一步优选地，Bx选自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤。再次更优选地，在式(I)、(II)或(III)的化合物中，Bx选自胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤。
在另一优选实施方案中，式(I)、(II)或(III)的化合物与非核苷化合物连接，优选固相连接。
在优选的实施方案中，所述式(I)的化合物选自：
/>
/>
在第二方面，本发明提供包含至少一个式(IV)的化合物的寡聚体
其中独立地对于所述至少一种式(IV)的化合物中的每一个：
T3或T4中的一个是核苷连接基团；
T3和T4中的另一个是OR1、OR2、5'末端基团、7'末端基团或核苷连接基团，其中R1是H或羟基保护基，并且2是磷部分；并且Bx是核碱基。
在优选的实施方案中，本发明的寡聚体包含至少一种式(IV)的化合物，其中所述式(IV)的化合物为式(V)的化合物：
其中
(i)T3是核苷连接基团，并且T4是7'末端基团、OR1、OR2，优选地，T4是7'末端基团或OR1；或者
(ii)T3是5'末端基团、OR1、OR2，优选地，T3是5'末端基团或OR2；并且T4是核苷连接基团；或者
(iii)T3和T4彼此独立地为核苷连接基团。
在另一优选的实施方案中，本发明的寡聚体包含至少一种式(IV)的化合物，其中所述式(IV)的化合物为式(VI)的化合物：
其中
(i)T3是核苷连接基团，并且T4是7'末端基团、OR1、OR2，优选地，T4是7'末端基团或OR2；或者
(ii)T3是5'末端基团、OR1、OR2，优选地，T3是5'末端基团或OR1；并且
T4是核苷连接基团；或
(iii)T3和T4彼此独立地为核苷连接基团。
在优选的实施方案中，所述寡聚体是寡核苷酸。在进一步优选的实施方案中，所述寡聚体是寡核苷酸，其中所述式(IV)的化合物是式(V)的化合物。在另一优选的实施方案中，所述寡聚体是寡核苷酸，其中所述式(IV)的化合物是式(VI)的化合物。在更优选的实施方案中，包含(IV)、(V)或(VI)的化合物中的至少一种式化合物的寡聚体是DNA。
在另一个实施方案中，包含所述至少一种式(IV)、(V)或(VI)的化合物的本发明的寡聚体还包含至少一种不同于式(IV)、(V)或(VI)的化合物或其中任何一种的核苷酸，其中优选地，至少一种不同的核苷酸是(i)包含单环糖的核苷酸，即单环核苷酸，或(ii)包含双环糖的核苷酸，即双环核苷酸，或(iii)包含三环糖的核苷酸，即三环核苷酸。优选地，所述至少一种不同于式(IV)、(V)或(VI)的化合物的核苷酸是包含双环糖的核苷酸。优选地，所述至少一种不同于式(IV)、(V)或(VI)的化合物的核苷酸是包含三环糖的核苷酸。更优选地，所述至少一种不同于式(IV)、(V)或(VI)的化合物的核苷酸是包含单环糖的核苷酸。
在本发明的寡聚体的另一优选的实施方案中，所述式(IV)的化合物是式(V)的化合物，并且所述寡聚体还包含不同于式(V)的化合物或其中任何一种的核苷酸，其中优选地，至少一种不同的核苷酸是(i)包含单环糖的核苷酸，即单环核苷酸，或(ii)包含双环糖的核苷酸，即双环核苷酸，或(iii)包含三环糖的核苷酸，即三环核苷酸。优选地，所述至少一种不同于式(V)的化合物的核苷酸是包含双环糖的核苷酸。优选地，所述至少一种不同于式(V)的化合物的核苷酸是包含三环糖的核苷酸。更优选地，所述至少一种不同于式(V)的化合物的核苷酸是包含单环糖的核苷酸。
在本发明的寡聚体的另一优选的实施方案中，所述式(IV)的化合物是式(VI)的化合物，并且所述寡聚体还包含不同于式(VI)的化合物或其中任何一种的核苷酸，其中优选地，至少一种不同的核苷酸是(i)包含单环糖的核苷酸，即单环核苷酸，或(ii)包含双环糖的核苷酸，即双环核苷酸，或(iii)包含三环糖的核苷酸，即三环核苷酸。优选地，所述至少一种不同于式(VI)的化合物的核苷酸是包含双环糖的核苷酸。优选地，所述至少一种不同于式(VI)的化合物的核苷酸是包含三环糖的核苷酸。更优选地，所述至少一种不同于式(VI)的化合物的核苷酸是包含单环糖的核苷酸。
在另一个实施方案中，包含式(IV)、(V)或(VI)的化合物的寡聚体还包含至少两个不同于式(IV)、(V)或(VI)的化合物的核苷酸，其中至少两个不同的核苷酸通过核苷酸连接基团相互连接，其中每个核苷连接基团彼此独立地选自磷酸二酯连接基团、磷酸三酯连接基团、硫代磷酸酯连接基团、二硫代磷酸酯连接基团、膦酸酯连接基团、硫代膦酸酯连接基团、次膦酸酯连接基团、硫代磷酰胺连接或氨基磷酸酯连接基团，并且其中优选每个核苷连接基团彼此独立地为磷酸二酯连接基团或硫代磷酸酯连接基团，并且其中进一步优选地每个核苷连接基团是硫代磷酸酯连接基团。
在本发明的寡聚体的另一优选的实施方案中，所述式(IV)的化合物是式(V)的化合物，并且所述寡聚体还包含至少两个不同于式(V)的化合物的核苷酸，其中至少两个不同的核苷酸通过核苷酸连接基团相互连接，其中每个核苷连接基团彼此独立地选自磷酸二酯连接基团、磷酸三酯连接基团、硫代磷酸酯连接基团、二硫代磷酸酯连接基团、膦酸酯连接基团、硫代膦酸酯连接基团、次膦酸酯连接基团、硫代磷酰胺连接或氨基磷酸酯连接基团，并且其中优选每个核苷连接基团彼此独立地为磷酸二酯连接基团或硫代磷酸酯连接基团，并且其中进一步优选地每个核苷连接基团是硫代磷酸酯连接基团。
在本发明的寡聚体的另一优选的实施方案中，所述式(IV)的化合物是式(VI)的化合物，并且所述寡聚体还包含至少两个不同于式(VI)的化合物的核苷酸，其中至少两个不同的核苷酸通过核苷酸连接基团相互连接，其中每个核苷连接基团彼此独立地选自磷酸二酯连接基团、磷酸三酯连接基团、硫代磷酸酯连接基团、二硫代磷酸酯连接基团、膦酸酯连接基团、硫代膦酸酯连接基团、次膦酸酯连接基团、硫代磷酰胺连接或氨基磷酸酯连接基团，并且其中优选每个核苷连接基团彼此独立地为磷酸二酯连接基团或硫代磷酸酯连接基团，并且其中进一步优选地每个核苷连接基团是硫代磷酸酯连接基团。
在另一个优选的实施方案中，在本发明的寡聚体中，Bx选自嘌呤碱或嘧啶碱，其中Bx优选选自(i)腺嘌呤(A)、(ii)胞嘧啶(C)、(iii)5-甲基胞嘧啶(MeC)、(iv)鸟嘌呤(G)、(v)尿嘧啶(U)或(vi)5-甲基尿嘧啶(MeU)或(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的衍生物，并且其中进一步优选地，Bx选自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤。更优选地，在本发明的寡聚体中，Bx选自胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤。
在另一优选实施方案中，在本发明的寡聚体中，每个核苷连接基团彼此独立地选自磷酸二酯连接基团、磷酸三酯连接基团、硫代磷酸酯连接基团、二硫代磷酸酯连接基团、膦酸酯连接基团、硫代膦酸酯连接基团、次膦酸酯连接基团、硫代磷酰胺连接或氨基磷酸酯连接基团，并且其中优选每个核苷连接基团彼此独立地为磷酸二酯连接基团或硫代磷酸酯连接基团，并且其中进一步优选地每个核苷连接基团是硫代磷酸酯连接基团。
在另一实施方案中，本发明的寡聚体包含1至5、优选1至4、更优选1至2、再次更优选1至2、再次更优选恰好一种式(IV)、(V)或(VI)的化合物。在本发明的寡聚体的优选的实施方案中，，所述式(IV)的化合物是式(VI)的化合物，并且其中所述寡聚体包含1至5、优选1至5、更优选1至2、再次更优选1至2、再次更优选恰好一种式(VI)的化合物。已经发现，特别地，在寡核苷酸内单独掺入式(VI)的化合物，并且优选单独掺入式(VI)的化合物，其中Bx是甲基胞嘧啶，在DNA双链体内具有显著的稳定性作用。因此，在本发明寡聚体的非常优选的实施方案中，所述寡聚体包含恰好一种式(IV)的化合物，其中所述式(IV)的化合物为式(VI)的化合物，并且其中所述Bx为甲基胞嘧啶，并且其中所述寡聚体是寡核苷酸并且还包含至少一种不同于式(VI)的化合物的核苷酸，其中优选地，所述至少一种不同的核苷酸是包含单环糖的核苷酸。
在本发明的寡聚体的另一优选实施方案中，所述寡聚体包含不同于式(IV)的化合物的至少一种核苷酸，其中所述式(IV)的化合物是式(V)的化合物，并且其中所述式(V)的化合物各自用其5'末端连接至(i)所述不同于式(IV)的化合物的至少一种核苷酸的5'末端或者(ii)另一式(V)的化合物的7'末端；并且其中所述式(V)的化合物用其7'末端连接至(i)所述不同于式(IV)的化合物的至少一种核苷酸的3'末端或者(ii)另一式(V)的化合物的5'末端。
在本发明的寡聚体的另一实施方案中，所述寡聚体包含至少两种式(IV)的化合物并且还包含至少一种不同于式(IV)的化合物的核苷酸，其中所述式(IV)的化合物是式(VI)的化合物，并且其中所述式(VI)的化合物各自用其5'末端连接至(i)所述不同于式(IV)的化合物的至少一种核苷酸的5'末端或者(ii)另一式(VI)的化合物的7'末端；并且其中所述式(VI)的化合物各自用其7'末端连接至(i)所述不同于式(IV)的化合物的至少一种核苷酸的3'末端或者(ii)另一式(VI)的化合物的5'末端。
在本发明的寡聚体的优选实施方案中，所述寡聚体还包含至少两种不同于式(IV)的化合物的核苷酸，并且其中所述式(IV)的化合物是式(V)的化合物，并且其中所述不同于式(IV)的化合物的核苷酸各自用其3'末端连接至(i)所述式(V)的化合物的7'末端或者(ii)另一不同于式(IV)的化合物的核苷酸的5'末端，并且其中所述不同于式(IV)的化合物的核苷酸各自用其5'末端连接至(i)所述式(V)的化合物的5'末端或者(ii)另一不同于式(IV)的化合物的核苷酸的3'末端。
在本发明的寡聚体的优选实施方案中，所述寡聚体还包含至少两种不同于式(IV)的化合物的核苷酸，并且其中所述式(IV)的化合物是式(V)的化合物，并且其中所述不同于式(IV)的化合物的核苷酸各自用其3'末端连接至(i)所述式(V)的化合物的7'末端或者(ii)另一不同于式(IV)的化合物的核苷酸的5'末端，并且其中所述不同于式(IV)的化合物的核苷酸各自用其5'末端连接至(i)所述式(V)的化合物的5'末端或者(ii)另一不同于式(IV)的化合物的核苷酸的3'末端。
在本发明寡聚体的优选实施方案中，所述寡聚体还包含至少两种不同于式(IV)的化合物的核苷酸，并且其中所述式(IV)的化合物是式(V)的化合物，并且其中至少一种式(V)化合物各自用其5'末端连接，并且用其7'末端连接至所述不同于式(IV)的化合物的核苷酸。
在本发明的寡聚体的优选实施方案中，所述寡聚体还包含至少两种不同于式(IV)的化合物的核苷酸，并且其中所述式(IV)的化合物是式(V)的化合物，并且其中所述不同于式(IV)的化合物的核苷酸各自用其3'末端连接至(i)所述式(V)的化合物的7'末端或者(ii)另一不同于式(IV)的化合物的核苷酸的5'末端，并且其中所述不同于式(IV)的化合物的核苷酸各自用其5'末端连接至(i)所述式(V)的化合物的5'末端或者(ii)另一不同于式(IV)的化合物的核苷酸的3'末端。
在本发明寡聚体的优选实施方案中，所述寡聚体还包含至少两种不同于式(IV)的化合物的核苷酸，并且其中所述式(IV)的化合物是式(VI)的化合物，并且其中至少一种式(VI)化合物各自用其5'末端并且用其7'末端连接至所述不同于式(IV)的化合物的核苷酸。
在本发明寡聚体的另一优选实施方案中，所述寡聚体包含至少两种式(IV)的化合物并且还包含至少两种不同于式(IV)的化合物的核苷酸，并且其中所述式(IV)的化合物是式(V)的化合物，并且其中至少一种式(V)化合物各自用其7'末端连接至不同于式(IV)的化合物的核苷酸的3'末端；并且用其5'末端连接至所述不同于式(IV)的化合物的核苷酸的5'末端。
在本发明寡聚体的另一优选实施方案中，所述寡聚体包含至少两种式(IV)的化合物并且还包含至少两种不同于式(IV)的化合物的核苷酸，并且其中所述式(IV)的化合物是式(VI)的化合物，并且其中至少一种式(VI)化合物各自用其5'末端连接至不同于式(IV)的化合物的核苷酸的3'末端；并且用其7'末端连接至所述不同于式(IV)的化合物的核苷酸的5'末端。
在本发明寡聚体的优选实施方案中，所述寡聚体包含至少一种式(IV)的化合物，其中所述化合物是式(VI)的化合物，其中至少一种式(VI)化合物各自用其5'末端并且用其7'末端连接至不同于式(IV)的化合物的核苷酸，并且其中Bx是胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶，优选5-甲基胞嘧啶。
在本发明寡聚体的进一步优选实施方案中，所述寡聚体包含恰好一种式(IV)的化合物，其中所述化合物是式(VI)的化合物，其中所述式(VI)化合物用其5'末端并且用其7'末端连接至不同于式(IV)的化合物的核苷酸，并且其中Bx是胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶，优选5-甲基胞嘧啶。
在另一优选实施方案中，本发明的寡聚体包含1至5、优选1至4、更优选1至2、再次更优选1至2、再次更优选恰好一种式(IV)、(V)或(VI)、优选式(VI)的化合物，其中Bx是嘧啶碱基、更优选胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶、再次更优选5-甲基胞嘧啶。在更优选的实施方案种，本发明的寡聚体包含恰好一种式(VI)的化合物，其中Bx是胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶，优选5-甲基胞嘧啶。并入恰好一种或仅少数几种式(IV)、(V)或(VI)、优选式(VI)的化合物，其中Bx是嘧啶碱基，仅导致与本发明寡聚体形成小的不稳定或甚至稳定双链体。特别是，当核碱基是胞嘧啶或胞嘧啶衍生物时，优选5-甲基胞嘧啶，显著稳定本发明寡聚体包括式(IV)、(V)或(VI)化合物、优选式(VI)化合物与互补DNA的双链体。这种稳定作用对于5-甲基胞嘧啶核苷更明显。在另一实施方案中，本发明的寡聚体包含1至5、优选1至4、更优选1至2、再次更优选1至2、再次更优选恰好一种式(IV)、(V)或(VI)、优选式(VI)的化合物，其中Bx是嘌呤碱基。核碱基嘌呤显著稳定本发明寡聚体包括式(IV)、(V)或(VI)化合物、优选式(VI)化合物与互补RNA的双链体。
在另一优选实施方案中，本发明的寡聚体包含或优选由至少两个连续的式(IV)的化合物组成，其中连续的式(IV)的化合物中的每一个通过核苷连接基团连接至相邻的连续的式(IV)的化合物，其中核苷连接基团连接两个连续的式(IV)的化合物的5'末端和7'末端。在另一优选实施方案中，本发明的寡聚体包含或优选由至少两个连续的式(V)的化合物组成，其中连续的式(V)的化合物中的每一个通过核苷连接基团连接至相邻的连续的式(V)的化合物，其中核苷连接基团连接两个连续的式(V)的化合物的5'末端和7'末端。在另一优选实施方案中，本发明的寡聚体包含或优选由至少两个连续的式(VI)的化合物组成，其中连续的式(VI)的化合物中的每一个通过核苷连接基团连接至相邻的连续的式(VI)的化合物，其中核苷连接基团连接两个连续的式(VI)的化合物的5'末端和7'末端。
在进一步优选的实施方案中，本发明的寡聚体包含或优选由10至40个连续的式(IV)化合物、优选10至30个连续的式(IV)化合物、更优选10至25个连续的式(IV)化合物、再次更优选10至20个连续的式(IV)化合物或10至15个连续的式(IV)化合物组成。在本发明的寡聚体的进一步优选的实施方案中，所述至少一种式(IV)的化合物是式(V)的化合物，并且其中所述寡聚体包含或优选由10至40个连续的式(V)化合物、优选10至30个连续的式(V)化合物、更优选10至25个连续的式(V)化合物、再次更优选10至20个连续的式(V)化合物并且再次更优选10至15个连续的式(V)化合物组成。在本发明的寡聚体的进一步优选的实施方案中，所述至少一种式(IV)的化合物是式(VI)的化合物，并且其中所述寡聚体包含或优选由10至40个连续的式(VI)化合物、优选10至30个连续的式(VI)化合物、更优选10至25个连续的式(VI)化合物、再次更优选10至20个连续的式(VI)化合物并且再次更优选10至15个连续的式(VI)化合物组成。
在本发明的寡聚体的进一步优选的实施方案中，所述至少一种式(IV)的化合物是式(V)的化合物，并且其中所述寡聚体包含或优选由10至40个连续的式(V)化合物、优选10至30个连续的式(V)化合物、更优选10至25个连续的式(V)化合物、再次更优选10至20个连续的式(V)化合物并且再次更优选10至15个连续的式(V)化合物组成并且其中每个式(V)的连续化合物通过核苷连接基团与相邻的式(V)的连续化合物独立连接，其中核苷连接基团连接两个式(V)的连续化合物的5'末端和7'末端，所述核苷连接基团为磷连接基团，所述磷连接基团选自磷酸二酯键连接基团、磷酸三酯连接基团和硫代磷酸酯连接基团，其中优选所述磷连接基团为磷酸二酯连接基团或硫代磷酸酯连接基团。
在进一步优选的实施方案中，本发明的寡聚体包含或优选由至少一个核酸序列组成，其中所述核酸序列包含所述至少一个式(IV)的化合物，并且其中所述核酸序列选自SEQID NO:1至24，优选SEQ ID NO:24。在进一步优选的实施方案中，本发明的寡聚体包含或优选由至少一个核酸序列组成，其中所述核酸序列包含所述至少一个式(V)的化合物，并且其中所述核酸序列选自SEQ ID NO:16至24，优选SEQ ID NO:21至24，更优选SEQ ID NO:24。在进一步优选的实施方案中，本发明的寡聚体包含或优选由至少一个核酸序列组成，其中所述核酸序列包含所述至少一个式(VI)的化合物，并且其中所述核酸序列选自SEQ ID NO:1至15，优选SEQ ID NO:13-15。在更优选的实施方案中，本发明的寡聚体由选自SEQ ID NO：13至15或21至24、优选SEQ ID NO：24的核酸序列组成。在另一优选实施方案中，所述寡聚体是选自SEQ ID NO：13至15或21至24的核酸序列，并且其中优选所述寡聚体是SEQ ID NO:24。
在本发明的寡聚体的进一步优选的实施方案中，所述寡聚体包含核酸序列，其中所述核酸序列由至少两个连续的式(IV)的化合物组成，其中所述核酸序列在其5'末端或其7'末端侧接至少一个核苷酸或核苷，所述核苷酸或核苷不同于式(IV)的化合物。在本发明的寡聚体的进一步优选的实施方案中，所述寡聚体包含核酸序列，其中所述核酸序列由至少两个连续的式(V)的化合物组成，其中所述核酸序列在其5'末端或其7'末端侧接至少一个核苷酸或核苷，所述至少一个核苷酸或核苷不同于式(V)的化合物、优选不同于式(V)或(VI)的化合物，并且进一步优选不同于式(IV)的化合物。在本发明的寡聚体的进一步优选的实施方案中，所述寡聚体包含核酸序列，其中所述核酸序列由至少两个连续的式(VI)的化合物组成，其中所述核酸序列在其5'末端或其7'末端侧接至少一个核苷酸或核苷，所述至少一个核苷酸或核苷不同于式(VI)的化合物、优选不同于式(V)或(VI)的化合物，并且进一步优选不同于式(IV)的化合物。
在本发明的寡聚体的进一步优选的实施方案中，所述寡聚体包含核酸序列，其中所述核酸序列由至少两个连续的式(IV)的化合物组成，其中所述核酸序列在其5'末端和其7'末端侧接至少一个核苷酸或核苷，所述核苷酸或核苷不同于式(IV)的化合物。在本发明的寡聚体的进一步优选的实施方案中，所述寡聚体包含核酸序列，其中所述核酸序列由至少两个连续的式(V)的化合物组成，其中所述核酸序列在其5'末端和其7'末端侧接至少一个核苷酸或核苷，所述至少一个核苷酸或核苷不同于式(V)的化合物、优选不同于式(V)或(VI)的化合物，并且进一步优选不同于式(IV)的化合物。在本发明的寡聚体的进一步优选的实施方案中，所述寡聚体包含核酸序列，其中所述核酸序列由至少两个连续的式(VI)的化合物组成，其中所述核酸序列在其5'末端和其7'末端侧接至少一个核苷酸或核苷，所述至少一个核苷酸或核苷不同于式(VI)的化合物、优选不同于式(V)或(VI)的化合物，并且进一步优选不同于式(IV)的化合物。
在本发明的寡聚体的进一步优选的实施方案中，所述寡聚体包含核酸序列，其中所述核酸序列由至少两个连续的式(V)的化合物组成，其中所述核酸序列在其5'末端或其7'末端侧接至少一个核苷酸或核苷，所述至少一个核苷酸或核苷不同于式(V)的化合物、优选不同于式(V)或(VI)的化合物，并且进一步优选不同于式(IV)的化合物，其中所述核酸序列的5'末端连接至不同于式(V)的化合物、优选不同于式(V)或(VI)的化合物并且进一步优选不同于式(IV)的化合物的核苷酸的5'末端；或其中所述核酸序列的7'末端连接至不同于式(V)的化合物、优选不同于式(V)或(VI)的化合物并且进一步优选不同于式(IV)的化合物的核苷酸或核苷的3'末端。
在本发明的寡聚体的进一步优选的实施方案中，所述寡聚体包含核酸序列，其中所述核酸序列由至少两个连续的式(V)的化合物组成，其中所述核酸序列在其5'末端和在其7'末端侧接至少一个核苷酸或核苷，所述至少一个核苷酸或核苷不同于式(V)的化合物、优选不同于式(V)或(VI)的化合物，并且进一步优选不同于式(IV)的化合物，其中所述核酸序列的5'末端连接至不同于式(V)的化合物、优选不同于式(V)或(VI)的化合物并且进一步优选不同于式(IV)的化合物的核苷酸或核苷的5'末端；并且其中所述核酸序列的7'末端连接至不同于式(V)的化合物、优选不同于式(V)或(VI)的化合物并且进一步优选不同于式(IV)的化合物的核苷酸或核苷的3'末端。
在本发明的寡聚体的进一步优选的实施方案中，所述寡聚体包含核酸序列，其中所述核酸序列由至少两个连续的式(VI)的化合物组成，其中所述核酸序列在其5'末端或在其7'末端侧接至少一个核苷酸或核苷，所述至少一个核苷酸或核苷不同于式(VI)的化合物、优选不同于式(V)或(VI)的化合物，并且进一步优选不同于式(IV)的化合物，其中所述核酸序列的5'末端连接至不同于式(VI)的化合物、优选不同于式(V)或(VI)的化合物并且进一步优选不同于式(IV)的化合物的核苷酸或核苷的3'末端；或其中所述核酸序列的7'末端连接至不同于式(VI)的化合物、优选不同于式(V)或(VI)的化合物并且进一步优选不同于式(IV)的化合物的核苷酸或核苷的5'末端。
在本发明的寡聚体的进一步优选的实施方案中，所述寡聚体包含核酸序列，其中所述核酸序列由至少两个连续的式(VI)的化合物组成，其中所述核酸序列在其5'末端和在其7'末端各自侧接至少一个核苷酸或核苷，所述至少一个核苷酸或核苷不同于式(VI)的化合物、优选不同于式(V)或(VI)的化合物，并且进一步优选不同于式(IV)的化合物，其中所述核酸序列的5'末端连接至不同于式(VI)的化合物、优选不同于式(V)或(VI)的化合物并且进一步优选不同于式(IV)的化合物的核苷酸或核苷的3'末端；和其中所述核酸序列的7'末端连接至不同于式(VI)的化合物、优选不同于式(V)或(VI)的化合物并且进一步优选不同于式(IV)的化合物的核苷酸或核苷的5'末端。
在本发明的寡聚体的进一步优选的实施方案中，所述式(IV)的化合物选自
在进一步优选的实施方案中，本发明的寡聚体是双链的。在某个实施方案中，所述双链寡聚体的恰好一条或两条链包含至少一种式(IV)、(V)或(VI)的化合物。
在第三方面，本发明提供式(I)、(II)或(III)的本发明的化合物，其用作预防、治疗或诊断疾病的药物。
在某个实施方案中，式(I)、(II)或(III)化合物用作预防或治疗疾病的药物。本发明提供了通过向患者施用治疗有效量的式(I)、(II)或(III)来预防患者疾病或治疗患有疾病的患者的方法。在另一实施方案中，式(I)、(II)或(III)化合物用于制备用于预防或治疗疾病的药物。
在进一步的实施方案中，本发明的寡聚体用作预防或治疗疾病的药物。本发明提供了通过向患者施用治疗有效量的本发明的寡聚体来预防患者疾病或治疗患有疾病的患者的方法。在另一优选实施方案中，本发明的寡聚体用于制备用于预防或治疗疾病的药物。
如本文所用的术语“患者”是指人或动物，其中动物优选是哺乳动物。术语“患者”不限于显示疾病或病症症状的受试者，而是包括健康受试者(即没有症状)或有表现症状的风险的受试者。“治疗有效量”是指以单剂量或作为一系列剂量的一部分给予受试者的量，其有效地在受试者中产生所需的生理反应或治疗效果。期望的治疗效果的实例包括但不限于症状或病理学的改善，减轻症状或病理的进展，以及减缓疾病的症状或病理的发作。治疗有效量将根据所用制剂的性质和接受者的类型和状况而变化。通过设计用于评估适当治疗水平的标准系列试验，确定任何给定组合物的适当量在本领域技术范围内。典型和优选的治疗有效量的反义寡核苷酸的范围为约0.05至1000mg/kg体重，特别是约5至500mg/kg体重。
在进一步的实施方案中，本发明的寡聚体是反义寡核苷酸。在优选的实施方案中，本发明的反义寡核苷酸用于预防、治疗或诊断疾病。如本文所用，术语“反义寡核苷酸”是指能够与靶核酸序列杂交的寡核苷酸。在优选的实施方案中，反义寡核苷酸与靶核酸序列互补。当寡核苷酸和靶核酸中的足够数量的互补位置被互补的核碱基占据时，寡核苷酸与靶核酸互补，所述互补的核碱基能够彼此形成氢键，使得寡核苷酸和靶核酸之间发生特异性结合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互补的核碱基，其通过形成氢键而配对。能够在不同的情况下发生杂交。在本领域中应理解，反义寡核苷酸的序列不需要包括与待可杂交的靶核酸的核苷酸100％互补的核苷酸。反义寡核苷酸可以在一个或多个核苷酸上杂交，而介入或相邻的核苷酸不参与杂交。优选本发明的反义寡核苷酸的寡核苷酸部分与靶核酸内的靶区域具有至少70％的序列互补性，更优选它们包含85％或90％的序列互补性，甚至更优选包含95％序列与靶核酸序列内的靶区域互补。
在某个实施方案中，本发明的寡聚体用于预防或治疗疾病，其中寡聚体能够干扰靶核酸的复制、翻译、转录、易位、催化活性、复合物形成、剪接或完整性。在某个实施方案中，本发明的寡聚体用于预防或治疗疾病，其中寡聚体能够结合靶核酸，下调靶核酸的表达，空间阻断靶核酸序列或诱导靶核酸中的核酸干扰、基因沉默、降解或外显子跳跃。在优选的实施方案中，本发明的寡聚体用于预防或治疗疾病，其中寡聚体能够结合靶核酸并下调所述靶核酸的表达。在另一优选的实施方案中，本发明的寡聚体用于预防或治疗疾病，其中寡聚体能够结合靶核酸、立体阻断所述靶核酸并诱导所述靶核酸中的外显子跳跃。在优选的实施方案中，所述靶核酸是DNA或RNA。RNA优选是前mRNA(预处理或前体信使RNA)或成熟RNA。RNA能够为mRNA或非编码RNA的功能形式，例如长的非编码RNA、微RNA、小干扰RNA、小核仁RNA、Piwi相互作用RNA、tRNA衍生的小RNA、小rDNA衍生的RNA、rRNA或tRNA。在某个实施方案中，本发明的寡聚体用于预防或治疗疾病，其中寡聚体能够改变靶核酸中的剪接过程，其中优选靶核酸是前mRNA。优选地，所述寡聚体能够在靶前mRNA中诱导外显子跳跃。“外显子”是指编码蛋白质的核酸的限定区段，或在通过剪接除去前mRNA的任一部分之后以RNA分子的成熟形式表示的核酸序列。
在进一步的实施方案中，本发明的寡聚体用作预防或治疗疾病的药物，其中所述疾病是遗传疾病。在优选的实施方案中，本发明的寡聚体用作预防或治疗疾病的药物，其中所述疾病是肌营养不良症，优选杜氏肌营养不良症。在另一个优选的实施方案中，用作预防、治疗或诊断疾病的药物的寡聚物是SEQ ID NO：21的核酸序列或SEQ ID NO：24的核酸序列，优选SEQ ID NO：24的核酸序列，其中疾病是肌营养不良症，优选杜氏肌营养不良症。本发明的寡聚体特别是SEQ ID NO：24保持对RNA的良好亲和力，并且与其天然存在的相应DNA相比，由式(V)的化合物组成的寡聚体似乎赋予显著改善的生物稳定性。此外，SEQ ID NO：24的核酸不显著激活补体，并且补体激活代表通常与反义寡核苷酸的体内使用相关的重要毒性反应。因此，本发明的寡聚体，优选包含或优选由式(V)的化合物组成的寡聚体是有希望的反义候选物。最后，由式(V)的化合物、优选SEQ ID NO：24的核酸组成的寡聚体能够诱导外显子23的强外显子跳跃和外显子22和23的双外显子跳跃。这些有希望的结果表明，本发明的寡聚体、尤其是由式(V)的化合物组成的寡聚体满足在患有肌营养不良症如杜氏肌营养不良症的患者中诱导强效治疗效果的先决条件。
在另一方面，本发明提供本发明的寡聚体，其用作预防或治疗疾病的药物。
在进一步的方面，本发明的寡聚体用于诊断疾病。在进一步的方面，本发明的寡聚体用作诊断疾病的药物。在另一优选实施方案中，本发明的寡聚体用于制备用于诊断疾病的药物。本发明提供诊断患者疾病的方法。所述诊断(diagnosis或diagnosing)包括
(i)向患者施用有效量的本发明的寡聚体，其中寡聚体被标记，和
(ii)标记的寡聚体或非标记寡聚体的非侵入性或侵入性、优选非侵入性体内成像
(i')从患者那里获得样品，
(ii')向样品中加入本发明的寡聚体，其中寡聚体被标记，和
(iii')分析样品中标记的寡聚体与样品中包含的核酸的结合。在优选的实施方案中，用于诊断疾病的本发明的寡聚物是寡核苷酸，更优选是反义寡核苷酸。从患者获得的样品优选是血液、血清、液体或组织样品。如本文所用的术语“标记的寡聚体”是指包含标记的寡聚体。优选地，标记选自荧光标记、染料、报告基团或放射性标记。
在进一步的方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明至少一种选自式(I)、(II)或(III)。在进一步的方面，本发明提供包含至少一种本发明的寡聚体的药物组合物。在优选的实施方案中，所述药物组合物包含一种或多种本发明的寡聚体，其中所述一种或多种寡聚体中的至少一种是寡核苷酸，更优选是反义寡核苷酸。在优选的实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的至少一种式(I)、(II)或(III)的化合物或至少一种本发明的寡聚体，优选与一种或多种药学可接受的载体一起配制。在一个实施方案中，单位剂量的本发明的药物组合物每单位含有约1微克至20,000微克的寡聚体或式(I)、(II)或(III)的化合物，优选约10至1000微克。对于静脉内递送，单位剂量的药物制剂优选含有0.5-500微克/kg体重、更优选5-300微克/kg体重的本发明的寡聚体。在本发明的药物组合物中，寡聚体或式(I)、(II)或(III)化合物通常以基于组合物总重量的约0.5-95％重量的量存在。
在优选的实施方案中，包含至少一种式(I)、(II)或(III)的化合物或至少一种本发明的寡聚体的药物组合物还包含至少一种药学上可接受的载体。本文所用的术语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石粉镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌，或立体酸)或溶剂封装材料。药学上可接受的载体可以参与将主题化合物从身体的一个器官或部分携带或运输到另一个器官或部分。用于递送核酸的方法描述于例如Akhtar等,1992,Trends CellBio.,2:139；and Delivery Strategies for Antisense OligonucleotideTherapeutics,ed.Akhtar；Sullivan等,PCT WO 94/02595。这些和其他方案可用于递送实际上任何核苷酸或核酸分子，包括式(I)、(II)或(III)化合物和本发明的寡聚体。本发明的特征还在于本发明的药物组合物还包含P-糖蛋白抑制剂(如Pluronic P85)，它可以增强药物进入各种组织；可生物降解的聚合物，例如聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)微球，用于植入后的持续释放递送(Emerich,DF等,1999,Cell Transplant,8,47-58)Alkermes,Inc.Cambridge,Mass)；纳米颗粒，例如由聚氰基丙烯酸丁酯制成的纳米颗粒，其能够通过血脑屏障递送药物并且能够改变细胞摄取机制(Prog Neuropsychopharmacol BiolPsychiatry,23,941-949,1999)；或含有聚乙二醇-脂质的脂质体。
可以使用本领域已知的各种机制进行药物组合物、式(I)、(II)或(III)化合物或本发明的寡聚体的给药。在优选的实施方案中，药物组合物、式(I)、(II)或(III)的化合物或本发明的寡聚体进行局部或全身给药。在优选的实施方案中，药物组合物、式(I)、(II)或(III)的化合物或本发明的寡聚体口服给药(例如，作为水性或非水性溶液或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、糊剂)、肠胃外(例如，通过皮下、肌肉内、静脉内、腹膜内或硬膜外注射，例如无菌溶液或悬浮液，或缓释制剂)、局部(例如，作为乳膏、软膏或控释贴剂或喷雾剂)、作为阴道内或直肠内(例如，子宫托、乳膏或泡沫)、舌下、眼睛、透皮、鼻腔、细胞内或通过直接局部肿瘤注射。在优选的实施方案中，包含本发明的寡聚物的药物组合物用于下调靶核酸的表达，在靶核酸中空间阻断靶核酸序列或诱导核酸干扰、基因沉默、降解或外显子跳跃。
在进一步的方面，本发明的寡聚体用于体外结合靶核酸序列。在优选的实施方案中，本发明的寡聚体在体外用于下调靶核酸的表达，在靶核酸中空间阻断靶核酸序列或诱导核酸干扰、基因沉默、降解或外显子跳跃。在某个实施方案中，本发明的寡聚体在体外用于干扰靶核酸的复制、翻译、转录、易位、催化活性、复合物形成、剪接或完整性。在优选的实施方案中，本发明的寡聚体在体外用于结合靶核酸，其中在所述靶核酸中诱导外显子跳跃。在优选的实施方案中，本发明提供了通过将本发明的寡聚体递送到细胞膜上来下调细胞胞质溶胶中靶基因表达的体外方法。在优选的实施方案中，靶核酸是DNA、前mRNA或成熟mRNA。
另一方面，本发明提供了固相合成本发明的寡聚体的方法，包括使用式(I)至(VI)中的任一种化合物。
实施例
一般程序
在干燥的玻璃器皿中并在氩气的惰性气氛下进行所有反应。通过活性氧化铝过滤或通过分子筛储存获得用于反应的无水溶剂。在硅胶上进行柱色谱(CC)(SiliaFlashP60,40-63um,/>)。用于CC的甲醇是HPLC级的，用于CC的所有其他溶剂都是工业级的并且在使用前蒸馏。在硅胶板上进行薄层色谱(macherey-nagel,预包被的TLC-板sil G-25UV254)。在紫外光下或通过浸入对-茴香醛染色溶液[对-茴香醛(3.7mL)、冰醋酸(3.7mL)、浓硫酸(5mL)、乙醇(135mL)]中然后用热风枪加热观察化合物。在CDCl3、CD3OD或CD3CN中在300或400MHz(1H)、在75或101MHz(13C)和在122MHz(31P)记录NMR谱。相对于残留的未处理溶剂峰[CDCl3:7.26ppm(1H),77.16ppm(13C)；CD3OD:3.31ppm(1H),49.00ppm(13C)]报告化学位移(δ)。信号分配基于APT和DEPT以及1H,1H和1H,13C相关实验(COSY，HSQC，HMBC)。通过正模式(离子阱，ESI+)中的电喷雾电离进行高分辨率质量检测。
在该实施例部分中，为了简单起见，该实施例部分中提到的核苷酸或核苷是指β端基异构体，除非特别提及为α端基异构体。此外，并且与此一致，本实施例部分中提及的寡聚体或寡核苷酸包含β端基异构体，除非特别提及为α端基异构体。
解链温度
在Varian Cary Bio 100UV/vis分光光度计上记录UV解链实验。实验在2μM双链体浓度、10mM NaH2PO4、0.0M至150mM NaCl(α端基异构体)或0.05M至1.00M NaCl(β端基异构体)进行，并将pH调节至7.0。通过二甲基聚硅氧烷的覆盖层保护样品免于蒸发。在260nm处监测吸光度。对于每个实验，进行三次冷却-加热循环，温度梯度为0.5℃/min。用VarianWinUV软件提取曲线一阶导数的最大值，并将Tm值报告为六个ramp的平均值。
圆二色谱
在配备有Jasco PFO-350S温度控制器的Jasco J-715分光偏振计上记录CD光谱。样品条件与UV解链实验相同。以50nm/min的速率记录210至320nm的光谱，并直接从样品测量温度。对于每个实验，记录含有与样品相同的盐浓度的空白。通过平均三次扫描并减去相应的空白光谱获得报告的光谱。
寡核苷酸的表征
a A、G、T、C表示天然2'-脱氧核苷；a、g、t、c分别对应于修饰的腺嘌呤、
鸟嘌呤、胸腺嘧啶和甲基胞嘧啶，*表示硫代磷酸酯连接，c代表修饰的5-
甲基胞嘧啶核苷。
实施例1
本发明化合物的合成
(总体概述)
所考虑的用于随后的核苷合成的双环支架7和10可以由先前描述的中间体1构建(M.；Bolli,M.；Schweizer,B.；Leumann,C.Helv.Chim.Acta1993,76,481)(方案1)。在-78℃通过LiHMDS介导的分子内消除有效地打开1中的环氧环，以良好的收率得到不饱和酯2。随后从双环核心结构的凸侧立体特异性地进行2的镍催化的NaBH4还原，得到作为唯一可识别的非对映异构体的酯3。然后将3中的羟基官能团保护在TBDPS中，得到定量产率的4。因此，中间体4在-78℃用DIBAL还原，得到醛5。然后在温和条件下用In(OTf)3作为催化剂在MeCN和H2O的混合物中水解5中的丙酮化合物保护基(Golden,K.C.；Gregg,B.T.；Quinn,J.F.Tetrahedron Lett.2010,51,4010)，通过简单地将溶剂改变为MeOH，将得到的双环半缩醛转化成甲基糖苷6。然后将化合物6乙酰化，得到受保护的前体7，其通过Vorbrüggen化学用于合成相应的嘌呤核苷。/>
方案1:(a)LiHMDS,THF,-78℃,2h,74％；(b)NaBH4,NiCl2,EtOH,0℃→室温,2h,90％；(c)TBDPSCl,I2,N-甲基咪唑,THF,室温,3h,定量；(d)DiBAL-H,CH2Cl2,-78℃,90分钟,89％；(e)i)In(OTf)3,MeCN/H2O,室温,48h,ii)MeOH,6h,81％；(f)Ac2O,DMAP,DCM,室温,2h,96％；(g)i)TMSOTf,2,6-二甲基吡啶,DCM,室温,60分钟,ii)TBAF,THF,0℃,20分钟,92％；(h)DMTr-Cl,AgOTf,DCM/二甲基砒啶,室温,4h(小时),93％；(i)TBAF,THF,室温,20h,定量。
本发明优选的嘧啶核苷的合成包括β-立体选择性NIH诱导的核碱基添加到相应的双环糖中的应用(Medvecky,M.；Istrate,A.；Leumann,C.J.J.Org.Chem.2015,80,3556；Dugovic,B.；Leumann,C.J.Journal of Organic Chemistry2014,79,1271；Lietard,J.；Leumann,C.J.J.Org.Chem.2012,77,4566)。首先，为了引入胸腺嘧啶核碱基，在烯糖8的直接前体上进行N-碘代琥珀酰亚胺(NIS)诱导的核苷酸化，其中R1＝TMS，其仅通过仅用TMSOTf处理从6获得。该方法导致相应的β-核苷的立体选择性形成，然而，7％的α-端基异构体的显著污染仍然是标准色谱技术不可分离的。有理由认为，如在烯糖10中，通过增加R1的空间体积和降低R2的空间体积可以增强β-选择性。这将有利于C(4)处的亲电子碘的初始-攻击。为此，用TMSOTf将化合物6转化为烯糖8，然后用TBAF短时间处理，以选择性地除去新引入的TMS基团。然后将中间体8精制成二甲氧基三苯甲基化合物9，最后用TBAF除去TBDPS保护基，得到所需的糖组分10。
在原位TMS保护的烯糖10上进行NIS-核苷酸化，然后用Bu3SnH自由基还原碘化物中间体，得到DMTr保护的胸苷衍生物11，收率良好，仅含有痕量α-端基异构体(1H-NMR<2％)(方案2)。用2-氰乙基N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰胺的最终亚磷酸化得到胸苷亚磷酰胺结构单元12。通过碱基胸腺嘧啶的转化实现5-甲基胞嘧啶核苷的合成。为此，核苷11被TMS保护并通过用1,2,4-三唑和POCl3处理转化成相应的三唑内酯。随后在氨和1,4-二氧杂环己烷的混合物中处理该三唑内酯，得到相应的5-甲基胞嘧啶核苷，用Bz2O直接保护，得到13，三步产率为88％。通过如上所述的亚磷酰化获得亚磷酰胺14。
方案2:(a)i)胸腺嘧啶,BSA,NIS,DCM,室温,7h；ii)Bu3SnH,AIBN,甲苯,70℃,30分钟,73％；(b)2-氰乙基N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰胺,ETT,DCM,室温,30分钟,70％对于12,75％对于14；(c)i)BSA,三唑,POCl3,Et3N,CH3CN,室温,5h,ii)1,4-二氧杂环己烷/NH4OH,室温,2h,iii)Bz2O,Et3N,DMF,室温,20h,88％。
应用经典Vorbrüggen核苷化来引入嘌呤核碱基，其通常导致α-核苷的普遍存在。前体7与N6-苯甲酰腺嘌呤或2-氨基-6-氯嘌呤的转化导致不可分离的端基异构混合物15和20，相应的α/β比为4:1和7:3(方案3)。脱乙酰化后可以分离出端基异构体，得到纯的β-端基异构体16和21。从这里，腺嘌呤结构单元19可以通过标准二甲氧基三苯甲基化(→17)获得，随后是TBAF介导的甲硅烷基保护基的裂解(→19)和亚磷酸化。鸟嘌呤结构单元的合成需要转化2-氨基-6-氯嘌呤核碱基。这通过用3-羟基丙腈和TBD处理21并随后用DMF保护2-氨基来实现，得到受保护的鸟苷衍生物22。按照与上述相同的化学途径，通过二甲氧基三苯甲基化(→23)，然后除去甲硅烷基保护基(→24)和亚磷酸化，实现鸟嘌呤结构单元25的合成。
方案3:(a)N6-苯甲酰腺嘌呤,BSA,TMSOTf,MeCN,70℃,20分钟,64％；(b)NaOH,THF/MeOH/H2O,0℃,20分钟,69％；(c)DMTr-Cl,吡啶,室温,24h,87％；(d)TBAF,THF,室温,48h,87％；(e)CEP-Cl,DIPEA,THF,室温,2h,71％；(f)2-氨基-6-氯嘌呤,BSA,TMSOTf,MeCN,55℃,50分钟,77％；(g)NaOH,THF/MeOH/H2O,0℃,20分钟,85％；(i)i)TBD,3-羟基丙腈,DCM,48h,ii)N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛,DMF,55℃,2h,73％；(j)DMTr-Cl,吡啶,室温,18h,70％；(k)TBAF,THF,室温,7h,87％；(l)2-氰乙基N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰胺,ETT,DCM,室温,50分钟,69％。
从保护的糖7开始，开发了本发明的四种优选的亚磷酰胺结构单元的合成。用TMSOTf处理糖7和原位甲硅烷基化胸腺嘧啶的混合物导致核苷35的顺利形成，具有约85:15的有利端基异构体比α/β(通过1H-NMR测定)(方案4)。导致在5'位置带有DMTr基团的胸苷亚磷酰胺的化学途径不允许通过标准色谱法分离端基异构体。因此，为了将具有极性反转的修饰引入DNA链中，将DMTr基团引入7'位置。为此，通过用TBAF(→36)短时间处理除去35的甲硅烷基，然后进行标准二甲氧基三苯甲基化(→37)。标准脱乙酰化后可以分离出两种端基异构体，得到纯的α-端基异构体38。最后通过在5-(乙硫基)-1H-四唑存在下用2-氰乙基N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰胺化物进行亚磷酰化来获得胸苷结构单元39。通过将原位TMS保护的核苷38转化为相应的三唑内酯与POCl3和1,2,4-三唑，然后在氨和1,4-二氧杂环己烷的混合物中处理，中间体38还使我们能够短时间获得5-甲基胞嘧啶核苷。在DMF中用Bz2O直接保护导致核苷40的有效形成，在该过程中不稳定的甲硅烷基保护基被裂解。在如上所述的条件下进行最终的亚磷酰化，得到5-甲基胞苷亚磷酰胺41。
方案4:(a)胸腺嘧啶,BSA,TMSOTf,MeCN,室温,18h,82％；(b)TBAF,THF,2h,75％；(c)DMTr-Cl,吡啶,室温,24h,96％；(d)K2CO3,MeOH,3h,86％；(e)2-氰乙基N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰胺,ETT,DCM,室温,1h,81％对于39,30分钟,80％对于41；f)i)BSA,1,2,4-三唑,POCl3,Et3N,MeCN,室温,7h,ii)1,4-二氧杂环己烷/NH4OH,室温,3h,iii)Bz2O,Et3N,DMF,室温,18h,83％。
对于嘌呤核碱基，通过在略微升高的温度下用N6-苯甲酰腺嘌呤或2-氨基-6-氯嘌呤进行短核苷化来进行嘌呤的引入，得到核苷15和20，相应的α/β比为4：1和7：3(方案5)。为了分离端基异构体，在温和条件下除去乙酰基，得到纯α-端基异构体42和48。腺苷结构单元的形成继续重新引入乙酰基保护基(→43)，用TBAF(→44)除去TPDPS保护基，然后进行标准二甲氧基三苯甲基化(→45)。乙酰基(→46)的选择性脱保护，然后在如上所述的条件下进行亚磷酸化，得到腺嘌呤结构单元47。
对于鸟嘌呤结构单元，在分离两种端基异构体后，通过用TBD和3-羟基丙腈处理将6-氯嘌呤转化为鸟嘌呤核碱基，得到鸟苷核苷49。48小时的乙酰化允许伴随保护5'-羟基和2-氨基，产生受保护的核苷50。与上述类似，通过用TBAF(→51)除去甲硅烷基保护基然后二甲氧基三苯甲基化(→52)引入DMTr基团。通过用K2CO3处理除去两个乙酰基，并用DMF直接保护所得极性产物，得到鸟苷核苷53。最终的亚磷酸化产生了结构单元54。
方案5:a)N6-苯甲酰腺嘌呤,BSA,TMSOTf,MeCN,70℃,20分钟,64％；(b)NaOH,THF/MeOH/H2O,0℃,20分钟,51％α-端基异构体,18％β-端基异构体；(c)Ac2O,DMAP,DCM,室温,18h,90％；(d)TBAF,THF,室温,3.5h,90％；(e)DMTr-Cl,吡啶,室温,24h,89％；(f)NaOH,THF/MeOH/H2O,0℃,30分钟,94％(g)2-氰乙基N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰胺,ETT,DCM,室温,1h,77％对于47,50分钟,67％对于54；(h)2-氨基-6-氯嘌呤,BSA,TMSOTf,MeCN,55℃,50分钟,77％；(i)NaOH,THF/MeOH/H2O,0℃,20分钟,85％；(j)TBD,3-羟基丙腈,DCM,48h,87％(k)Ac2O,DMAP,DCM,室温,48h,76％；(l)TBAF,THF,室温,4h,87％；(m)DMTr-Cl,吡啶,室温,48h,99％；(n)i)K2CO3,MeOH,室温,7h,ii)N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛,DMF,55℃,2h,77％。
实施例2
乙基(E和Z，1‘R,5’S,7’R)-(7'-羟基-3’,3’-二甲基-2',4'-二氧杂双环[3.3.0]辛-6'-亚基)醋酸酯(2a/b)
将环氧化物1(4.46g，18.4mmol)的无水THF(100mL)溶液冷却至-78℃。然后缓慢加入LiHMDS(1M的THF溶液，22.1mL，22.1mmol)。将溶液在-78℃搅拌2小时，然后温热至室温并加入1M HCl水溶液(22.1mL)中和。然后将混合物用EtOAc(100mL)稀释，并在减压下除去THF。然后将混合物用0.5M NaH2PO4(50mL)洗涤，水相用EtOAc(2×50mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(EtOAc/己烷3:1)纯化粗产物，得到两种异构体2a/b(3.30g，74％)，为浅黄色固体。
2a的数据：Rf＝0.37(EtOAc/己烷1:1)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ6.07–5.98(m,1H,H-C(2)),5.59(d,J＝6.0Hz,1H,H-C(5’)),4.94–4.81(m,1H,H-C(1’)),4.65(t,J＝5.6Hz,1H,H-C(7’)),4.18(q,J＝7.1Hz,2H,CH3CH2),2.67(br,1H,OH),2.37(dd,J＝13.5,7.5Hz,1H,H-C(8’)),1.55–1.42(m,1H,H-C(8’)),1.40,1.33(2s,6H,(CH3)2C),1.26(t,J＝7.1Hz,3H,CH2CH3)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ165.75(C(1)),161.61(C(6’)),116.53(C(2)),110.69(C(3’)),76.55(C(5’)),75.52(C(1’)),71.63(C(7’)),60.51(CH2CH3),37.46(C(8’)),26.44,24.11((CH3)2C),14.27(CH2CH3)。
ESI+-HRMS m/z计算的C12H19O5([M+H]+)243.1227,发现243.1231。
2b的数据：Rf＝0.52(EtOAc/己烷1:1)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ6.15–6.05(m,1H,H-C(2)),5.37–5.02(m,2H,H-C(5’),OH),4.87(d,J＝3.4Hz,1H,H-C(1’)),4.67(t,J＝4.9Hz,1H,H-C(7’)),4.20(qd,J＝7.1,0.9Hz,2H,CH3CH2),2.55(dd,J＝14.6,8.1Hz,1H,H-C(8’)),1.94–1.77(m,1H,H-C(8’)),1.39–1.25(m,9H,(CH3)2C,CH2CH3)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ167.91(C(1)),167.43(C(6’)),120.13(C(2)),111.75(C(3’)),81.62(C(5’)),78.08(C(1’)),70.85(C(7’)),61.25(CH2CH3),36.53(C(8’)),27.38,25.45((CH3)2C),14.19(CH2CH3)。
ESI+-HRMS m/z计算的C12H19O5([M+H]+)243.1227,发现243.1227。
实施例3
乙基(1‘R,5’S,6’S,7’R)-(7'-羟基-3’,3’-二甲基-2',4'-二氧杂双环[3.3.0]辛-6'-基)醋酸酯(3)
在0℃向醇2a/b(12.65g，52.2mmol)和氯化镍六水合物(2.48g，10.4mmol)在EtOH中的溶液(300mL)中分批加入硼氢化钠(9.88g，261mmol)。将得到的深色溶液在0℃搅拌30分钟并在室温搅拌90分钟。然后在减压下小心地浓缩EtOH，将得到的固体用EtOAc(200mL)稀释，并通过在0℃加入水(100mL)淬灭过量的NaBH4，然后在室温搅拌30分钟。然后分离两相。用水(100mL)洗涤有机相。然后合并水相，过滤并用EtOAc(2×100mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过CC(EtOAc/己烷2:1)纯化粗产物，得到3(11.4g，90％)，为白色固体。
3的数据：Rf＝0.40(EtOAc/己烷1:1)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ4.65–4.52(m,2H,H-C(1’),H-C(5’)),4.15(qd,J＝7.1,1.4Hz,2H,CH3CH2),4.05(ddd,J＝10.0,9.99,6.2Hz,1H,H-C(7’)),2.86(br,s,1H,OH),2.65(qd,J＝16.9,7.1Hz,2H,H-C(2)),2.24(dd,J＝13.7,6.2Hz,1H,H-C(8’)),1.93(dt,J＝12.7,7.1Hz,1H.H-C(6’)),1.56(ddd,J＝13.9,10.2,5.5Hz,1H,H-C(8’)),1.38(s,3H,(CH3)2C),1.30-1.21(m,6H,(CH3)2C,CH2CH3)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ174.38(C(1)),109.06(C(3’)),79.65(C(5’)),77.19(C(1’),74.32(C(7’),60.80(CH2CH3),46.66(C(6’)),40.38(C(8’)),32.43(C(2)),26.00,23.69((CH3)2C),14.17(CH2CH3)。
ESI+-HRMS m/z计算的C12H21O5([M+H]+)245.1384,发现245.1388。
实施例4
乙基(1‘R,5’S,6’S,7’R)-(7'-(叔丁基二苯基硅烷基)氧基)-3’,3’-二甲基-2',4'-二氧杂双环[3.3.0]辛-6'-基)醋酸酯(4)
在室温向醇3(2.50g，10.2mmol)、N-甲基咪唑(12.6g，153mmol)和碘(7.80g，30.6mmol)的无水THF溶液(60mL)中滴加叔丁基(氯)二苯基硅烷(3.0mL，11.2mmol)。将溶液在室温搅拌3小时，蒸发THF，将混合物用EtOAc(50mL)稀释，并用10％Na2O3S2水溶液(2×40mL)洗涤。然后合并水相并用EtOAc(50mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(EtOAc/己烷1:10)纯化粗产物，得到4(5.01g，定量产量)，为白色固体。
4的数据：Rf＝0.87(DCM/MeOH 10:1)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.77–7.59(m,4H,H-arom),7.51–7.32(m,6H,H-arom),4.61(t,J＝5.7Hz,1H,H-C(5’)),4.49(t,J＝5.7Hz,1H,H-C(1’)),4.15(q,J＝6.9Hz,2H,CH3CH2),3.96(dd,J＝15.5,9.5Hz,1H,H-C(7’)),2.64–2.32(m,2H,H-C(2)),2.15(tt,J＝9.0,4.3Hz,1H,H-C(6’)),1.83(dd,J＝12.7,5.2Hz,1H,H-C(8’)),1.61–1.45(m,1H,H-C(8’)),1.27(td,J＝7.1,1.9Hz,3H,CH2CH3),1.18(s,6H,(CH3)2C),1.09,1.08(2s,9H,(CH3)3-C-Si)
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ173.07(C(1)),135.87,135.85(CH-arom),134.08,133.73(C-arom),129.80,129.75,127.67,127.58(CH-arom),108.82(C(3’)),77.92(C(5’)),76.96(C(1’)),74.93(C(7’)),60.24(CH2CH3),47.27(C(6’)),40.27(C(8’)),31.10(C(2)),27.04(CH3)3-C-Si),25.86((CH3)2C),23.83((CH3)2C),19.23(CH3)3-C-Si),14.24(CH2-CH3)。
ESI+-HRMS m/z计算的C28H39O5Si([M+H]+)483.2561,发现483.2562。
实施例5
(1‘R,5’S,6’S,7’R)-(7'-(叔丁基二苯基硅烷基)氧基)-3’,3’-二甲基-2',4'-二氧杂双环[3.3.0]辛-6'-基)乙醛(5)
将酯4(8.56g，16.3mmol)的无水DCM溶液(120mL)冷却至-78℃，然后缓慢加入DiBAL-H(1M的环己烷溶液，18mL，18mmol)。将溶液在-78℃进一步搅拌90分钟，然后温热至室温。通过加入0.5M NaH2PO4水溶液(100mL)淬灭反应。分离有机相，并用DCM(2×100mL)进一步萃取水相。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(EtOAc/己烷2:10至2:1)纯化粗产物，得到醛5(6.36g，89％)和醇34(0.637g，9％)。
5的数据：Rf＝0.65(EtOAc/己烷2:1)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.72(s,1H,H-C(1)),7.65(td,J＝8.0,1.6Hz,4H,H-arom),7.47–7.33(m,6H,H-arom),4.57(t,J＝5.7Hz,1H,H-C(5’)),4.51(t,J＝5.7Hz,1H,H-C(1’)),3.99(td,J＝10.0,5.9Hz,1H,H-C(7’)),2.58–2.43(m,2H,H-C(2)),2.20–2.08(m,1H,H-C(6’)),1.87(dd,J＝13.5,5.9Hz,1H,H-C(8’)),1.53(ddd,J＝13.5,10.1,5.5Hz,1H,H-C(8’)),1.16(d,J＝3.5Hz,6H,((CH3)2C),1.05(s,9H,(CH3)3-C-Si)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ201.87(C(1)),135.93,135.90(CH-arom),133.96,133.73(C-arom),129.96,129.89,127.79,127.68(CH-arom),108.89(C(3’)),77.76(C(5’)),77.17(C(1’)),74.96(C(7’),45.44(C(6’)),41.31(C(2)),40.16(C(8’)),27.08(CH3)3-C-Si),25.87((CH3)2C),23.79((CH3)2C),19.25(CH3)3-C-Si)。
ESI+-HRMS m/z计算的C26H35O4Si([M+H]+)439.2299,发现439.2297。
实施例6
(3aR,4R,6R,6aS)-4-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-2-甲氧基六氢-2H-环戊二烯并[b]呋喃-6-醇(6)
向醛5(13.73g，31.31mmol)的MeCN(170mL)和H2O的溶液(19mL)中加入三氟甲磺酸铟(III)(703mg，1.25mmol)。将溶液进一步搅拌48小时，然后在减压下除去溶剂并与甲苯共蒸发。将残余物溶于无水MeOH中并搅拌6小时。蒸发溶剂后，通过CC(EtOAc/己烷3:10)纯化粗产物，得到的端基异构比率α/β≈4：1的6(10.50g，81％)混合物，为无色油状物。
6的数据：Rf＝0.53(EtOAc/己烷1:1)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.63(dd,J＝7.1,0.6Hz,4H,H-arom),7.46–7.34(m,6H,H-arom),4.98(d,J＝4.8Hz,0.8H,H-C(2)),4.91(dd,J＝5.9,1.3Hz,0.2H,H-C(2)),4.63–4.54(m,1H,H-C(6a)),4.53–4.37(m,1H,H-C(6)),4.09(m,0.2H,H-C(4)),3.92(br,0.8H,H-C(4)),3.29,3.27(2s,3H,MeO),2.79(dd,J＝17.0,8.2Hz,0.8H,H-C(3a)),2.64–2.51(m,0.2H,H-C(3a)),2.29(d,J＝8.1Hz,1H,OH),2.10–1.80(m,2.4H,H-C(3),H-C(5)),1.65(ddd,J＝13.2,9.1,4.4Hz,0.8H,H-C(5)),1.44–1.34(m,0.2H,H-C(3)),1.22(ddd,J＝13.2,8.1,4.9Hz,0.8H,H-C(3)),1.05(s,9H,(CH3)3-C-Si)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ135.78,135.74(CH-arom),133.96,133.84(C-arom),129.78,127.72(CH-arom),107.21,106.50(C(2)),85.37,81.76(C(6a)),78.11,77.19(C(4)),73.03,72.44(C(6)),55.30,54.46(MeO),50.91,49.67(C(3a)),41.13,40.29(C(3)),38.16,37.98(C(5)),26.96,26.92(CH3)3-C-Si),19.07(CH3)3-C-Si)。
ESI+-HRMS m/z计算的C26H35O4Si([M+H]+)435.1962,发现435.1950。
实施例7
(3aR,4R,6R,6aS)-4-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-2-甲氧基六氢-2H-环戊二烯并[b]呋喃-6-基乙酸酯(7)
在室温向糖6(3.35g，8.12mmol)和4-二甲基氨基吡啶(1.29g，10.6mmol)的无水DCM溶液(100mL)中加入乙酸酐(3.8mL，41mmol)。搅拌2小时后，通过缓慢加入饱和NaHCO3(10mL)淬灭反应。然后将混合物用饱和NaHCO3(50mL)稀释，并用DCM(3×50mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(EtOAc/己烷1:2)纯化粗产物，得到端基异构比率α/β≈4：1的7(3.53g，96％)的混合物，为无色油状物。
7的数据：Rf＝0.42(EtOAc/己烷1:2)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.70–7.59(m,4H,H-arom),7.48–7.34(m,6H,H-arom),5.41(dt,J＝11.0,5.6Hz,0.8H,H-C(6)),5.28(ddd,J＝11.7,6.6,5.2Hz,0.2H,H-C(6)),4.99(d,J＝4.8Hz,0.8H,H-C(2)),4.89–4.81(m,0.4H,H-C(2),H-C(6a)),4.76–4.69(m,0.8H,H-C(6a)),4.11(d,J＝5.1Hz,0.2H,H-C(4)),3.90(d,J＝4.0Hz,0.8H,H-C(4)),3.27,3.24(2s,3H,MeO),2.81(dd,J＝16.6,7.6Hz,0.8H,H-C(3a)),2.60(dd,J＝10.1,7.0Hz,0.2H,H-C(3a)),2.30–2.18(m,0.2H,H-C(5)),2.12,2.10(2s,J＝4.7Hz,3H,MeCO2),2.07–1.82(m,2.8H,H-C(5),H-C(3)),1.24(ddd,J＝12.9,7.6,3.7Hz,1H,H-C(3)),1.07(s,9H,(CH3)3-C-Si)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ170.75,170.66(MeCO2),135.77,135.73,135.72(CH-arom),133.75,133.65(C-arom),129.82,129.74,127.76,127.75,127.71(CH-arom),106.19,106.15(C(2)),83.17,79.80(C(6a)),77.49,76.46(C(4)),75.64,74.41(C(6)),54.34,54.25(MeO),51.48,50.17(C(3a)),38.05,37.98(C(3)),36.96,36.21(C(5)),26.95,26.90(CH3)3-C-Si),21.09,21.04(MeCO2),19.04(CH3)3-C-Si)。
ESI+-HRMS m/z计算的C26H34O5NaSi([M+Na]+)477.2068,发现477.2063。
实施例8
(3aR,4R,6R,6aS)-4-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3a,5,6,6a-四氢-4H-环戊二烯并[b]呋喃-6-醇(8)
在0℃向糖6(2.08g，5.04mmol)的无水DCM溶液(35mL)中加入2,6-二甲基吡啶(2.95mL，25.2mmol)。在0℃搅拌20分钟后，逐滴加入TMSOTf(2.73mL，15.1mmol)，然后将溶液温热至室温并再搅拌60分钟。然后通过加入饱和NaHCO3(40mL)淬灭反应。分离有机相，并用DCM(3×30mL)进一步萃取水相。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。
将所得产物溶于无水THF(35mL)中，冷却至0℃，并加入TBAF(1M的THF溶液，5.6mL，5.6mmol)。将溶液搅拌10分钟，然后用饱和NaHCO3(30mL)稀释，并用DCM(4×40mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(EtOAc/己烷1:4)纯化粗产物，得到烯糖8(1.76g，92％)。
8的数据：Rf＝0.49(EtOAc/己烷1:2)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.66(m,4H,H-arom),7.42(m,6H,H-arom),6.22(t,J＝2.1Hz,1H,H-C(2)),4.91(dd,J＝8.2,5.3Hz,1H,H-C(3)),4.70(dt,J＝11.1,5.6Hz,1H,H-C(6)),4.56(t,J＝2.8Hz,1H,H-C(6a)),3.97(d,J＝4.0Hz,1H,H-C(4)),3.24(d,J＝8.2Hz,1H,H-C(3a)),2.30(br,1H,OH),2.03(dd,J＝12.6,5.4Hz,1H,H-C(5)),1.51(ddd,J＝12.7,11.2,4.2Hz,1H,H-C(5)),1.08(s,9H,(CH3)3-C-Si)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ146.24(C(2)),135.72,135.69(CH-arom),134.03,133.74(C-arom),129.80,129.78,127.73(CH-arom),101.84(C(3)),84.59(C(6a)),76.79(C(4)),74.10(C(6)),55.56(C(3a)),39.38(C(5)),26.93(CH3)3-C-Si),19.08(CH3)3-C-Si)。
ESI+-HRMS m/z计算的C23H29O3Si([M+H]+)381.1880,发现381.1893。
实施例9
(((3aR,4R,6R,6aS)-6-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-3a,5,6,6a-四氢-4H-环戊二烯并[b]呋喃-4-基)氧基)(叔丁基)二苯基硅烷(9)
向烯糖8(1.34g，3.52mmol)和DMTr-Cl(1.43g，4.23mmol)在无水DCM(15mL)和无水2,6-二甲基吡啶(15mL)的混合物中的溶液中逐个部分地加入三氟甲磺酸银(1.13g，4.40mmol)，得到深红色悬浮液。在室温搅拌2小时后，加入另外部分的DMTr-Cl(239mg，0.705mmol)。将悬浮液进一步搅拌2小时，然后过滤。将有机相用饱和NaHCO3(100mL)洗涤，并将水相用DCM(3×30mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(EtOAc/己烷1:7，+0.5％Et3N)纯化粗产物，得到受保护的烯糖9(2.24，93％)，为白色泡沫。
9的数据：Rf＝0.59(EtOAc/己烷1:2)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.76(d,J＝7.4Hz,2H,H-arom),7.69–7.60(m,J＝9.3,5.9,4.6Hz,8H,H-arom),7.56–7.39(m,8H,H-arom),7.33(t,J＝7.3Hz,1H,H-arom),7.00–6.93(m,4H,H-arom),6.47–6.37(m,1H,H-C(2)),4.67–4.58(m,1H,H-C(6)),4.58–4.50(m,2H,H-C(3),H-C(6a)),3.86,3.85(2s,6H,MeO),3.82(d,J＝4.0Hz,1H,H-C(4)),3.08(d,J＝8.1Hz,1H,H-C(3a)),1.67(td,J＝12.4,4.2Hz,1H,H-C(5)),1.28(dd,J＝12.7,5.4Hz,1H,H-C(5)),1.11(s,9H,(CH3)3-C-Si)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ158.67(MeO-C-arom),147.61(C(2)),146.26,137.36,137.21(C-arom),135.81,135.78(CH-arom),134.17,134.04(C-arom),130.48,129.83,129.81,128.37,127.98,127.76,127.73,126.79,113.32,113.28(CH-arom),100.29(C(3)),86.96(C(Ph)3),84.95(C(6a)),76.17(C(6)),76.07(C(4)),55.26(MeO-DMTr),55.11(C(3a)),37.32(C(5)),27.04(CH3)3-C-Si),19.21(CH3)3-C-Si)。
ESI+-HRMS m/z计算的C44H46O5NaSi([M+Na]+)705.3007,发现705.3021。
实施例10
(3aS,4R,6R,6aS)-6-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-3a,5,6,6a-四氢-4H-环戊二烯并[b]呋喃-4-醇(10)
在室温向烯糖9(2.23g，3.27mmol)的无水THF溶液(20mL)中加入TBAF(1M的THF溶液，20mL，20mmol)。将溶液搅拌20小时，然后用饱和NaHCO3(100mL)稀释，并用DCM(3×80mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(0.5％MeOH的DCM溶液，+0.5％Et3N)纯化粗产物，得到10(1.45g，定量)，为白色泡沫。
10的数据：Rf＝0.44(EtOAc/己烷1:1)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.53–7.46(m,2H,H-arom),7.43–7.35(m,4H,H-arom),7.21(dd,J＝10.7,5.3Hz,2H,H-arom),7.16–7.08(m,1H,H-arom),6.80–6.71(m,4H,H-arom),6.30(t,J＝2.1Hz,1H,H-C(2)),4.68(t,J＝2.8Hz,1H,H-C(3)),4.29–4.14(m,2H,H-C(6),H-C(6a)),3.71(s,6H,MeO),3.65(d,J＝3.5Hz,1H,H-C(4)),2.87(d,J＝7.9Hz,1H,H-C(3a)),1.59(ddd,J＝13.2,11.6,4.3Hz,1H,H-C(5)),1.05–0.95(m,2H,H-C(5),OH)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ158.54(MeO-C-arom),147.64(C(2)),145.82,137.12,137.08(C-arom),130.26,128.29,127.81,126.71,113.13(CH-arom),100.17(C(3)),86.75(C(Ph)3),84.42C(6a)),75.54(C(6)),74.59(C(4)),55.22(MeO-DMTr),54.25(C(3a)),37.56(C(5))。
ESI+-HRMS m/z计算的C30H27O5([M+H]+)467.1853,发现467.1844。
实施例11
(3’S,5’R,7’R)-1-{2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-7’-羟基-5’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-β-D-呋喃核糖基}胸腺嘧啶(11)
在0℃向烯糖10(1.45g，3.27mmol)的无水DCM溶液(45mL)中滴加BSA(2.0mL，8.18mmol)，然后将溶液温热至室温。搅拌45分钟后，加入胸腺嘧啶(595mg，4.91mmol)并将反应物在室温下进一步搅拌60分钟。然后将混合物冷却至0℃并加入N-碘代琥珀酰亚胺(875mg，3.92mmol)。在0℃搅拌3小时并在室温搅拌4小时后，将反应混合物用EtOAc(100mL)稀释，随后用10％Na2S2O3水溶液(100mL)和饱和NaHCO3(100mL)洗涤。合并水相，并用DCM(3×50mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。
将粗产物溶于无水甲苯(45mL)中，然后在室温加入Bu3SnH(1.32mL，4.91mmol)和偶氮二异丁腈(AIBN，53mg，0.33mmol)。在70℃加热30分钟后，将混合物冷却至室温并加入TBAF(1M的THF溶液，6.5mL，6.5mmol)。将溶液再搅拌25分钟，然后用饱和NaHCO3(100mL)稀释，并用DCM(4×70mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(3％MeOH的DCM溶液，+0.5％Et3N)纯化粗产物，得到11(1.45g，两步73％)，为白色泡沫。
11的数据：Rf＝0.29(6％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.37(br,1H,H-N(3)),7.83(d,J＝1.1Hz,1H,H-C(6)),7.58–7.52(m,2H,H-arom),7.48–7.41(m,4H,H-arom),7.28(t,J＝7.7Hz,2H,H-arom),7.21(t,J＝7.2Hz,1H,H-arom),6.84(dd,J＝8.9,1.2Hz,4H,H-arom),5.91(dd,J＝8.0,5.5Hz,1H,H-C(1’)),4.25(dt,J＝10.8,6.0Hz,1H,H-C(5’)),4.13–4.08(m,1H,H-C(4’)),3.86(d,J＝3.4Hz,1H,H-C(7’),3.79(s,6H,MeO),2.70(ddd,J＝12.8,10.2,5.5Hz,1H,H-C(2’)),2.61(dd,J＝16.9,8.2Hz,1H,H-C(3’)),1.84(d,J＝0.8Hz,3H,Me-C(5)),1.80(br,1H,OH),1.60(ddd,J＝14.2,10.5,4.2Hz,1H,H-C(6’)),1.33(dt,J＝12.9,8.0Hz,1H,H-C(2’)),1.14(dd,J＝13.7,6.1Hz,1H,H-C(6’))。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.17(C(4)),158.64(MeO-C-arom),150.47(C(2)),145.65,136.85,136.71(C-arom),135.52(C(6)),130.20,128.12,127.91,126.90,113.22,113.21(CH-arom),110.69(C(5)),87.21(C(Ph)3),86.57(C(1’)),82.02(C(4’)),74.19(C(5’)),74.13(C(7’)),55.25(MeO-DMTr),49.40(C(3’)),38.51(C(6’)),37.64(C(2’)),12.58(Me-C(5))。
ESI+-HRMS m/z计算的C33H34O7N2Na([M+Na]+)593.2258,发现593.2250。
实施例12
(3’R,5’R,7’R)-1-{7’-O-[(2-氰乙氧基)-二异丙基氨基膦酰基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-5’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-β-D-呋喃核糖基}胸腺嘧啶(12)
/>
在室温向核苷11(232mg，0.406mmol)和5-(乙硫基)-1H-四唑(90mg，0.69mmol)的无水DCM溶液(10mL)中滴加2-氰乙基N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰胺(0.26mL，0.81mmol)。搅拌30分钟后，将反应混合物用DCM(50mL)稀释，并用饱和NaHCO3(2×30mL)和饱和NaCl(30mL)洗涤。合并水相，并用DCM(50mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(0.5％MeOH的DCM溶液，1.8％ Et3N)纯化粗产物，得到12(219mg，两种异构体的混合物，70％)，为白色泡沫。
11的数据：Rf＝0.68(6％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.93(br,1H,H-N(3)),7.85(d,J＝1.2Hz,1H,H-C(6)),7.65–7.52(m,2H,H-arom),7.52–7.40(m,4H,H-arom),7.40–7.21(m,3H,H-arom),6.96–6.81(m,4H,H-arom),6.00,5.94(2dd,J＝8.3,5.2Hz,1H,H-C(1’)),4.29–4.17(m,1H,H-C(5’)),4.12–3.89(m,2H,H-C(4’),H-C(7’)),3.85,3.84(2s,6H,MeO),3.81–3.63(m,2H,OCH2CH2CN),3.56–3.41(m,2H,(Me2CH)2N),2.88–2.69(m,2H,H-C(3’),H-C(2’)),2.61,2.56(dt,J＝12,9 6.3Hz,2H,OCH2CH2CN),1.92,1.82(2d,J＝0.8Hz,3H,Me-C(5)),1.75–1.56(m,1H,H-C(6’)),1.52–1.36(m,2H,H-C(6’),H-C(2’)),1.22–1.01(m,12H,(Me2CH)2N)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ163.86(C(4)),158.66,158.64(MeO-C-arom),150.29,150.27(C(2)),145.58,145.52,136.76,136.71,136.69,136.60(C-arom),135.49,135.35(C(6)),130.21,130.16,128.17,128.13,127.88,126.91,126.89(CH-arom),117.49(OCH2CH2CN),113.18(CH-arom),110.74(C(5)),87.27,87.25(C(Ph)3),86.58,86.45(C(1’)),81.79,81.68(C(4’)),76.02,75.50(JC,P＝16.5,15.7Hz,C(7’)),74.22(C(5’)),58.26,58.06,57.87(OCH2CH2CN),55.26,55.22(MeO-DMTr),48.85,48.62(JC,P＝2.6,5.0Hz,C(3’)),43.10,43.04(JC,P＝12.3,12.4Hz(Me2CH)2N),37.78(JC,P＝5.3Hz C(6’)),37.62,37.48(C(2’)),37.41(JC,P＝3.6Hz C(6’)),24.57,24.53,24.50,24.46,24.44,24.39,24.37(Me2CH)2N),20.35,20.25(JC,P＝7.1,7.0Hz,OCH2CH2CN),12.58,12.41(7s,Me-C(5))。
31P NMR(122MHz,CDCl3)δ147.32,146.98。
ESI+-HRMS m/z计算的C42H52O8N4P([M+H]+)771.3517,发现771.3512。
实施例13
(3’S,5’R,7’R)-N4-苯甲酰基-1-{2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-7’-羟基-5’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-β-D-呋喃核糖基}-5-甲基胞嘧啶(13)
在0℃向核苷11(302mg，0.530mmol)在无水MeCN溶液(5mL)中滴加BSA(0.31mL，1.27mmol)，然后将溶液在室温下搅拌过夜。在另一个烧瓶中，将1,2,4-三唑(1.28g，18.55mmol)的无水MeCN悬浮液(50mL)冷却至0℃并且加入POCl3(0.40mL，4.2mmol)和Et3N(2.96mL，21.2mmol)。将悬浮液在0℃搅拌30分钟，然后将先前制备的甲硅烷基化化合物11的溶液加入悬浮液中，并将混合物在室温下进一步搅拌5小时。用添加的饱和NaHCO3(10mL)淬灭反应，在减压下移除MeCN，并将得到的混合物用饱和NaHCO3(35mL)稀释，并用DCM(3×40mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。
然后将粗产物溶于1,4-二氧杂环己烷(10mL)和浓NH4OH(10mL)的混合物中。在室温搅拌2小时后，将混合物在真空中减少至一半体积，用饱和NaHCO3(30mL)稀释，并用DCM(4×30mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。
然后将粗产物溶于无水DMF(13mL)、Et3N(90μL，0.64mmol)中，然后在室温下加入Bz2O(300mg，1.33mmol)并将溶液搅拌过夜。通过小心加入饱和NaHCO3(50mL)淬灭所得棕色溶液，并用DCM(4×50mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(己烷/EtOAc 1:2,+0.5％Et3N)纯化粗产物，得到13(315mg，88％)，为白色泡沫。
13的数据：Rf＝0.57(4％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ13.39(br,1H,NH),8.46–8.26(m,2H,H-arom),8.13(d,J＝0.5Hz,1H,C(6)),7.61(d,J＝7.3Hz,2H,H-arom),7.58–7.43(m,7H,H-arom),7.34(t,J＝7.4Hz,2H,H-arom),7.30–7.23(m,1H,H-arom),6.89(d,J＝8.8Hz,4H,H-arom),5.96(dd,J＝7.5,5.8Hz,1H,H-C(1’)),4.38–4.25(m,1H,H-C(5’)),4.22–4.12(m,1H,H-C(4’)),3.90(d,J＝3.6Hz,1H,H-C(7’)),3.83(s,6H,MeO),2.82(ddd,J＝13.3,10.2,5.7Hz,1H,H-C(2’)),2.66(dd,J＝17.0,8.1Hz,1H,H-C(3’)),2.08(s,3H,Me-C(5)),1.77(br,1H,OH),1.71–1.57(m,1H,H-C(6v)),1.49–1.36(m,1H,H-C(2’)),1.21(dd,J＝13.7,6.2Hz,1H,H-C(6’))。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ179.56(CONH),160.01(C(4)),158.70(MeO-C-arom),147.96(C(2)),145.65(C-arom),137.26(C(6)),136.99,136.83,136.71(C-arom),132.41,130.22,129.89,128.16,128.14,127.95,126.94,113.25(CH-arom),111.57(C(5)),87.34(C(Ph)3),87.32(C(1’)),82.57(C(4’)),74.30(C(5’)),74.16(C(7’)),55.27(MeO-DMTr),49.56(C(3’)),38.52(C(6’)),38.00(C(2’)),13.63(Me-C(5))。
ESI+-HRMS m/z计算的C40H40O7N3([M+H]+)674.2861,发现674.2862。
实施例14
(3’R,5’R,7’R)-N4-苯甲酰基-1-{7’-O-[(2-氰乙氧基)-二异丙基氨基膦酰基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-5’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-β-D-呋喃核糖基}5-甲基胞嘧啶(14)
在室温向核苷13(276mg，0.409mmol)和5-(乙硫基)-1H-四唑(69mg，0.53mmol)的无水DCM溶液(10mL)中滴加2-氰乙基N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰胺(0.20mL，0.81mmol)。搅拌60分钟后，将反应混合物用DCM(50mL)稀释，并用饱和NaHCO3(2×30mL)和饱和NaCl(30mL)洗涤。合并水相，并用DCM(50mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(EtOAc/己烷2:3,+0.5％Et3N)纯化粗产物，得到14(268mg，两种异构体的混合物，75％)，为白色泡沫。
14的数据：Rf＝0.77(5％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ13.32(s,1H,NH),8.41–8.28(m,2H,H-arom),8.13–8.04(m,1H,C(6)),7.61–7.51(m,3H,H-arom),7.51–7.40(m,6H,H-arom),7.37–7.29(m,2H,H-arom),7.29–7.20(m,1H,H-arom),6.92–6.82(m,4H,H-arom),6.07–5.87(m,1H,H-C(1’)),4.24(dq,J＝11.7,5.8Hz,1H,H-C(5’)),4.13–4.00(m,1H,H-C(4’)),3.94(ddd,J＝14.5,10.5,2.8Hz,1H,H-C(7’)),3.83,3.82(2s,6H,MeO),3.69(m,2H,OCH2CH2CN),3.53–3.40(m,2H,(Me2CH)2N),2.91–2.70(m,2H,H-C(2’),H-C(3’)),2.57,2.53(2t,J＝6.3Hz,2H,OCH2CH2CN),2.08,1.99(2d,J＝0.6Hz,3H,Me-C(5)),1.72–1.56(m,1H,H-C(6’)),1.54–1.36(m,2H,H-C(2’),H-C(6’)),1.10(m,12H,(Me2CH)2N)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ179.54(CONH),159.98(C(4)),158.69(MeO-C-arom),147.90(C(2)),145.58,145.54(C-arom),137.30,136.93(C(6)),136.81,136.80,136.73,136.70,136.67,136.60(C-arom),132.37,132.35,130.22,130.17,129.89,128.17,128.15,128.11,127.93,126.94(CH-arom),117.49(OCH2CH2CN),113.23(CH-arom),111.60(C(5)),87.36,87.35(C(Ph)3),87.33,87.25(C(1’)),82.33,82.25(C(4’)),76.05,75.52(JC,P＝16.4,15.6Hz,C(7’)),74.32(C(5’)),58.18,57.98(JC,P＝19.5Hz OCH2CH2CN),55.28,55.24(MeO-DMTr),48.93,48.72(JC,P＝2.7,4.9Hz,C(3’)),43.11,43.05(JC,P＝12.4Hz(Me2CH)2N),38.02,37.88(C(2’)),37.74,37.40(JC,P＝5.3,3.4Hz,C(6’)),24.58,24.54,24.50,24.47,24.40,24.38(6s,Me2CH)2N),20.36,20.26(JC,P＝7.1Hz,OCH2CH2CN),),13.66,13.49(Me-C(5))。
31P NMR(122MHz,CDCl3)δ147.37,147.07。
ESI+-HRMS m/z计算的C49H57O8N5P([M+H]+)874.3939,发现874.3937。
实施例15
(3’R,5’R,7’R)-N6-苯甲酰基-9-{5’-O-乙酰基-7’-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-α,β-D-呋喃核糖基}腺嘌呤(15)
在室温向糖7(1.86g，4.10mmol)和N6-苯甲酰腺嘌呤(1.96g，8.20mmol)的无水MeCN悬浮液中(40mL)加入BSA(4.00mL，16.4mmol)。搅拌25分钟后，悬浮液变为澄清溶液，然后加热至70℃。逐滴加入TMSOTf(1.48mL，8.20mmol)并将溶液在70℃进一步搅拌20分钟。然后将溶液冷却至室温，加入饱和NaHCO3(100mL)淬灭并用EtOAc(4×50mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(2％ MeOH的DCM溶液)纯化粗产物，得到端基异构比率α/β≈4：1的15(1.74g，64％)的混合物，为白色泡沫。
15的数据：Rf＝0.33(EtOAc/己烷4:1)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.33(br,1H,NH),8.68(d,J＝5.4Hz,0.8H,H-C(2)),8.64(d,J＝5.6Hz,0.2H,H-C(2)),8.10(d,J＝1.5Hz,0.2H.H-C(8)),7.99(d,J＝7.3Hz,2H,H-arom),7.95(s,0.8H,H-C(8)),7.63(t,J＝8.7Hz,4H,H-arom),7.55(dd,J＝13.0,6.4Hz,1H,H-arom),7.50–7.34(m,8H,H-arom),6.20(dd,J＝6.3,2.5Hz,0.8H,H-C(1’)),6.05(t,J＝6.5Hz,0.2H,H-C(1’)),5.43–5.32(m,1H,H-C(5’)),5.03–4.97(m,0.8H,H-C(4’)),4.83(t,J＝6.0Hz,0.2H,H-C(4’)),4.14(br,0.2H,H-C(7’)),4.08(d,J＝3.7Hz,0.8H,H-C(7’)),3.02(dd,J＝16.1,6.6Hz,0.8H,H-C(3’)),2.83(dd,J＝16.9,7.7Hz,0.2H,H-C(3’)),2.59–2.39(m,1H,H-C(2’)),2.18–2.11(m,1H,H-C(6’)),2.07(d,J＝1.6Hz,2.4H,MeCO2),2.02(d,J＝1.9Hz,0.6H,MeCO2),2.01–1.92(m,1H,H-C(6’)),1.91–1.80(m,1H,H-C(3’)),1.07(s,9H,(CH3)3-C-Si)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ170.57,170.49(MeCO2),164.82(CONH),152.50(C(2)),151.27(C(4)),149.56(C(6)),141.37,141.06(C(8)),135.72,135.68,135.66(CH-arom),133.67,133.57,133.24,133.22(C-arom),132.73,130.03,129.98,128.80,128.78,127.92,127.86,127.85(CH-arom),123.61(C(5)),87.19,86.17(C(1’)),83.22,80.96(C(4’),76.50,76.04(C(7’)),74.38(C(5’)),51.07(C(3’)),37.29,37.15,36.80,36.60(C(2’),C(6’)),26.89(CH3)3-C-Si),20.97,20.90(MeCO2),19.01(CH3)3-C-Si)。
ESI+-HRMS m/z计算的C37H40O5N5Si([M+H]+)662.2793,发现662.2787。
实施例16
(3’R,5’R,7’R)-N6-苯甲酰基-9-{7’-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-β-D-呋喃核糖基}腺嘌呤(16)
在0℃将核苷15(1.74g，2.64mmol)溶于0.15M NaOH的THF/甲醇/H2O(5:4:1,80mL)溶液中。将反应搅拌20分钟并通过加入NH4Cl(1.06g)淬灭。然后在减压下除去溶剂，并通过CC(5％异丙醇的DCM溶液)纯化产物，得到16(287mg，18％)及其相应的α端基异构体(836mg，51％)白色泡沫。
16的数据：Rf＝0.44(6％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.70(s,1H,H-C(2)),8.09–7.98(m,2H,H-arom),7.97(s,1H,H-C(8)),7.63(ddd,J＝7.4,5.7,1.5Hz,4H,H-arom),7.59–7.55(m,1H,H-arom),7.51(m,2H,H-arom),7.44–7.33(m,6H,H-arom),6.02(dd,J＝9.4,5.5Hz,1H,H-C(1’)),4.57(dd,J＝8.1,5.0Hz,1H,H-C(4’)),4.43(dd,J＝11.8,5.3Hz,1H,H-C(5’)),4.26(br,1H,H-C(7’)),2.78(q,J＝8.9Hz,1H,H-C(3’)),2.32–1.80(m,5H,H-C(2’),H-C(6’),OH),1.06(s,9H,(CH3)3-C-Si)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.85(CONH),152.56(C(2)),151.17(C(4)),149.86(C(6)),141.25(C(8)),135.68(CH-arom),133.87,133.39(C-arom),132.78,129.92,128.78,128.01,127.78(CH-arom),123.51(C(5)),87.65(C(1’)),82.91(C(4’)),76.66(C(7’)),72.54(C(5’)),50.44(C(3’)),41.42(C(6’)),36.17(C(2’)),26.89(CH3)3-C-Si),19.03(CH3)3-C-Si)。
ESI+-HRMS m/z计算的C35H38O4N5Si([M+H]+)620.2688,发现620.2671。
实施例17
(3’R,5’R,7’R)-N6-苯甲酰基-9-{7’-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-5’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-β-D-呋喃核糖基}腺嘌呤(17)
在室温向核苷16(307mg，0.495mmol)的无水吡啶溶液(6mL)中加入DMTr-Cl(503mg，1.49mmol)。将溶液搅拌1天，然后用饱和NaHCO3(50mL)稀释，并用DCM(3×70mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(0.5％MeOH的DCM溶液，1.5％ Et3N)纯化粗产物，得到17(395mg，87％)，为黄色泡沫。
17的数据：Rf＝0.65(5％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,MeOD)δ8.64(s,1H,H-C(2)),8.61(s,1H,H-C(8)),8.08(d,J＝7.2Hz,2H,H-arom),7.68–7.17(m,22H,H-arom),6.86–6.75(m,4H,H-arom),6.14(dd,J＝7.4,6.3Hz,1H,H-C(1’)),4.48–4.31(m,1H,H-C(5’)),4.28–4.15(m,1H,H-C(4’)),3.88(d,J＝3.8Hz,1H,H-C(7’)),3.75,3.74(2s,6H,MeO),2.67(dd,J＝16.6,6.7Hz,1H,H-C(3’)),2.47(ddd,J＝13.3,10.2,6.1Hz,1H,H-C(2’)),2.15–1.94(m,1H,H-C(6’)),1.71(ddd,J＝13.0,11.3,4.4Hz,1H,H-C(2’)),1.11(dd,J＝12.2,4.9Hz,1H,H-C(6’)),0.95(s,9H,(CH3)3-C-Si)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ164.69(CONH),158.61,158.60(MeO-C-arom),152.42(C(2)),151.27(C(4)),149.41(C(6)),145.81(C-arom),141.25(C(8)),137.00,136.85(C-arom),135.60,135.57(CH-arom),133.80,133.69,133.43(C-arom),132.70,130.28,130.25,129.85,129.81,128.84,128.18,127.89,127.71,127.65,126.78(CH-arom),123.52(C(5)),113.22,113.19(CH-arom),87.09(C(Ph)3),86.41(C(1’)),83.52(C(4’)),76.05(C(7’)),74.78(C(5’)),55.20(MeO-DMTr),50.43(C(3’)),38.10(C(2’),C(6’)),26.84(CH3)3-C-Si),19.00(CH3)3-C-Si)。
ESI+-HRMS m/z计算的C56H56O6N5Si([M+H]+)922.3994,发现922.3953。
实施例18
(3’S,5’R,7’R)-N6-苯甲酰基-9-{2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-7’-羟基-5’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-β-D-呋喃核糖基}腺嘌呤(18)
在室温向核苷17(376mg，0.408mmol)的无水THF溶液(9mL)中加入TBAF(1M的THF溶液，1.22mL，1.22mmol)。将溶液搅拌2天，然后用饱和NaHCO3(25mL)稀释，并用DCM(4×25mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(0.5％MeOH的DCM溶液，4％ Et3N)纯化粗产物，得到18(242mg，87％)，为白色泡沫。
18的数据：Rf＝0.33(5％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,CD3CN)δ9.35(br,1H,NH),8.67(s,1H,C(2)),8.46(s,1H,C(8)),8.01(d,J＝7.4Hz,2H,H-arom),7.54(m,5H,H-arom),7.35(m,4H,H-arom),7.30–7.17(m,3H,H-arom),6.84(d,J＝8.9Hz,4H,H-arom),6.09(dd,J＝7.8,6.2Hz,1H,H-C(1’)),4.12(dt,J＝11.2,5.8Hz,1H,C(5’)),3.87–3.79(m,2H,C(4’),C(7’)),3.75(s,6H,MeO),2.83–2.64(m,2H,C(2’),OH),2.58–2.46(m,1H,C(3’)),2.21(dd,J＝13.9,7.1Hz,1H,C(2’)),1.92–1.82(m,1H,C(6’)),1.29–1.17(m,1H,C(6’))。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ165.03(CONH),158.57(MeO-C-arom),152.40(C(2)),151.23(C(4)),149.52(C(6)),145.68(C-arom),141.49(C(8)),136.86,136.84,133.77(C-arom),132.77,130.22,128.81,128.16,128.02,127.89,126.84(CH-arom),123.40(C(5)),113.19(CH-arom),87.06(C(Ph)3),86.74(C(1’)),83.58(C(4’)),74.62(C(5’)),74.38(C(8’)),55.25(MeO-DMTr),49.77(C(3’)),38.55,38.32(C(6’),C(2’))。
ESI+-HRMS m/z计算的C40H38O6N5([M+H]+)684.2817,发现684.2830。
实施例19
(3’R,5’R,7’R)-N6-苯甲酰基-9-{7’-O-[(2-氰乙氧基)-二异丙基氨基膦基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-5’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-β-D-呋喃核糖基}腺嘌呤(19)
在室温向核苷18(173mg，0.253mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.18mL，1.0mmol)的无水THF溶液(8mL)中加入N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(0.11mL，0.50mmol)。将溶液搅拌2小时，然后用饱和NaHCO3(40mL)稀释，并用DCM(4×40mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(EtOAc,+0.5％Et3N)纯化粗产物，得到19(177mg，两种异构体的混合物，71％)，为白色泡沫。
19的数据：Rf＝0.38,0.44(EtOAc)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.05(br,1H,NH),8.70,8.70(2s,1H,H-C(2)),8.47,8.46(2s,1H,H-C(8)),7.97(d,J＝7.5Hz,2H,H-arom),7.57–7.50(m,1H,H-arom),7.49–7.41(m,4H,H-arom),7.39–7.31(m,4H,H-arom),7.24–7.17(m,5.4Hz,2H,H-arom),7.13(dt,J＝12.5,6.2Hz,1H,H-arom),6.83–6.70(m,4H,H-arom),6.14–5.97(m,1H,H-C(1’)),4.14(ddd,J＝11.1,7.8,3.4Hz,1H,H-C(5’)),3.91–3.74(m,2H,H-(4’),H-C(7’)),3.71,3.70(2s,6H,MeO),3.65–3.50(m,2H,OCH2CH2CN),3.37(ddq,J＝13.9,10.2,6.8Hz,2H,(Me2CH)2N),2.90–2.76(m,1H,H-C(2’)),2.75–2.60(m,1H,H-C(3’)),2.47,2.42(2t,J＝6.3Hz,2H,OCH2CH2CN),2.11(dt,J＝12.7,6.1Hz,1H,H-C(2’)),1.73(ddt,J＝13.6,10.4,5.1Hz,1H,H-C(6’)),1.39(ddd,J＝50.2,13.4,6.2Hz,1H,H-C(6’)),1.10–0.89(m,12H,(Me2CH)2N)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.66(CONH),158.57(MeO-C-arom),152.46(C(2)),151.32,151.26(C(4)),149.45,149.43(C(6)),145.60,145.59(C-arom),141.52,141.47(C(8)),136.88,136.83,136.81,133.78(C-arom),132.75,132.73,130.22,130.21,130.19,130.17,128.87,128.17,127.87,126.82,126.80(CH-arom),123.59(C(5)),117.53,117.50(OCH2CH2CN),113.17(CH-arom),87.10,87.07(C(Ph)3),86.72,86.68(C(1’)),83.36,83.25(C(4’)),76.55,75.81(JC,P＝16.9,15.7Hz,C(7’)),74.63,74.60(C(5’)),58.24,57.86(JC,P＝19.1,19.2Hz OCH2CH2CN),55.25,55.21(MeO-DMTr),49.29,49.08(JC,P＝2.6,4.7Hz,C(3’)),43.12,43.00(JC,P＝2.4,2.3Hz(Me2CH)2N),38.27,38.23(C(2’)),37.41,37.22(JC,P＝5.3,3.5Hz,C(6’))24.56,24.53,24.49,24.47,24.43,24.41,24.36,24.33(8s,Me2CH)2N),20.36,20.25(JC,P＝7.2,7.0Hz,OCH2CH2CN)。
31P NMR(122MHz,CDCl3)δ147.64,146.87。
ESI+-HRMS m/z计算的C49H55O7N7([M+H]+)884.3895,发现884.3898。
实施例20
(3’R,5’R,7’R)-2-氨基-6-氯-9-{5’-O-乙酰基-7’-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-α,β-D-呋喃核糖基}嘌呤(20)
在室温向糖7(1.75g，3.85mmol)和2-氨基-6-氯嘌呤(1.05g，6.17mmol)的无水MeCN悬浮液中(20mL)加入BSA(3.80mL，15.4mmol)。将悬浮液加热至55℃并搅拌30分钟。然后逐滴加入TMSOTf(1.05mL，5.78mmol)并将溶液在55℃进一步搅拌50分钟。将溶液冷却至室温，加入饱和NaHCO3(10mL)淬灭，用EtOAc(50mL)稀释，并通过短的SiO2垫过滤。用另外的EtOAc洗涤SiO2。然后将混合物用饱和NaHCO3(2×80mL)洗涤，合并水相，并用EtOAc(3×50mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(2.5％ MeOH的DCM溶液)纯化粗产物，得到端基异构比率α/β≈7：3的20(1.77g，77％)的混合物，为白色泡沫。
20的数据：Rf＝0.54(EtOAc/己烷5:1)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.86(s,0.3H,H-C(8)),7.69(s,0.7H,H-C(8)),7.68–7.60(m,4H,H-arom),7.47–7.34(m,6H,H-arom),6.04(dd,J＝6.9,3.0Hz,0.7H,H-C(1’)),5.87(dd,J＝8.0,6.2Hz,0.3H,H-C(1’)),5.37(dt,J＝14.2,4.6Hz,1H,H-C(5’)),5.16(br,2H,NH2),4.91(dd,J＝6.5,5.1Hz,0.7H,H-C(4’)),4.79(dd,J＝6.9,5.2Hz,0.3H,H-C(4’)),4.13(br,0.3H,H-C(7’)),4.06(d,J＝4.0Hz,0.7H,H-C(7’)),2.95(dd,J＝16.3,6.6Hz,0.7H,H-C(3’)),2.81(dd,J＝17.0,7.4Hz,0.3H,H-C(3’)),2.49–2.30(m,1H,H-C(2’)),2.14(dd,J＝13.1,6.7Hz,1H,H-C(6’)),2.08(s,2.1H,MeCO2),2.02(s,0.9H,MeCO2),2.02–1.91(m,1H,H-C(6’)),1.80(td,J＝13.4,6.8Hz,1H,H-C(2’)),1.07,1.06(2s,9H,(CH3)3-C-Si)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ170.55,170.44(MeCO2),158.98,158.91(C(2)),153.18,152.95(C(4)),151.40,151.34(C(6)),140.38,140.14(C(8)),135.73,135.70(CH-arom),133.78,133.62,133.24,133.17(C-arom),130.03,130.00,127.88,127.86(CH-arom),125.65,125.57(C(5)),86.59,85.74(C(1’)),82.93,80.99(C(4’)),76.57,76.14(C(7’)),74.34,74.32(C(5’)),51.15,51.10(C(3’)),37.19,36.99(C(6’)),36.70,36.25(C(2’)),26.87(CH3)3-C-Si),20.95,20.86(MeCO2),19.00(CH3)3-C-Si)。
ESI+-HRMS m/z计算的C30H35O4N5ClSi([M+H]+)592.2141,发现592.2158。
实施例21
(3’R,5’R,7’R)2-氨基-6-氯-9-{7’-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-α,β-D-呋喃核糖基}嘌呤(22b)
在0℃将核苷15(1.78g，3.01mmol)溶于0.5M NaOH的THF/甲醇/H2O(5:4:1,15mL)溶液中。在0℃将反应搅拌20分钟并通过加入NH4Cl(484mg)淬灭。然后将悬浮液用饱和NaHCO3(100mL)稀释，并用DCM(4×75mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(3％ MeOH的DCM溶液)纯化粗产物，得到端基异构比率α/β≈7：3的21(428g，25％)及其相应的α端基异构体(992mg，60％)，为白色泡沫。
21的数据：Rf＝0.43(5％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.71(s,1H,H-C(8)),7.68–7.60(m,4H,H-arom),7.44–7.33(m,6H,H-arom),5.85(dd,J＝9.3,5.8Hz,1H,H-C(1’)),5.33(br,2H,NH2),4.62(dd,J＝8.4,4.9Hz,1H,H-C(4’)),4.44(dd,J＝10.7,5.3Hz,1H,H-C(5’)),4.40–4.15(m,2H,H-C(7’),OH),2.79(q,J＝8.7Hz,1H,H-C(3’)),2.22(dd,J＝15.2,9.3Hz,1H,H-C(6’)),2.11–2.02(m,1H,H-C(6’)),2.02–1.85(m,2H,H-C(2’)),1.06(s,9H,(CH3)3-C-Si)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ158.73(C(2)),152.78(C(4)),151.94(C(6)),140.70(C(8)),135.70(CH-arom),133.91,133.48(C-arom),129.90,127.78(CH-arom),125.97(C(5)),87.96(C(1’)),82.88(C(5’)),76.85(C(7’)),72.36(C(5’)),50.41(C(3’)),41.96(C(6’)),35.73(C(2’)),26.90(CH3)3-C-Si),19.02(CH3)3-C-Si)。
ESI+-HRMS m/z计算的C28H33O3N5ClSi([M+H]+)550.2036,发现550.2015。
实施例22
(3’R,5’R,7’R)-N2-(N,N-二甲基亚胺甲基)-9-{7’-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-β-D-呋喃核糖基}鸟嘌呤(22)
在0℃向21(380mg，0.645mmol)和3-羟基丙腈(0.22mL，3.23mmol)的无水DCM溶液(15mL)中加入1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯(400mg，2.87mmol)。将溶液在0℃搅拌3小时，然后在室温搅拌2天。加入二氧化硅终止反应。蒸发溶剂后，过滤SiO2粉末，用MeOH洗涤，蒸发溶剂，得到棕色泡沫。
将粗产物溶于无水DMF(5mL)中，并加入N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(0.43mL，3.2mmol)。将溶液在55℃搅拌2小时，然后减压除去溶剂。通过CC(6％MeOH的DCM溶液)纯化粗产物，得到23(274mg，73％)，为淡黄色泡沫。
22的数据：Rf＝0.45(12％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.52(s,1H,NH),8.46(s,1H,NCHN(CH3)2),7.63(dd,J＝7.7,1.5Hz,4H,H-arom),7.50(s,1H,H-C(8)),7.44–7.30(m,6H,H-arom),5.83(dd,J＝9.3,6.0Hz,1H,H-C(1’)),4.61(dd,J＝8.7,5.0Hz,1H,H-C(4’)),4.43–4.32(m,1H,H-C(5’)),4.29(dd,J＝7.0,4.8Hz,1H,H-C(7’)),3.95(d,J＝5.1Hz,1H,OH),2.98(s,6H,NCHN(CH3)2),2.79(dd,J＝18.0,7.0Hz,1H,H-C(3’)),2.20(dt,J＝12.8,5.4Hz,1H,H-C(6’)),2.09–1.88(m,3H,H-C(6’),H-C(2’)),1.05(s,9H,(CH3)3-C-Si))。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ158.73(C(2)),157.79(C(6)),156.91(NCHN(CH3)2),149.84(C(4)),137.00(C(8)),135.70,135.67(CH-arom),133.78,133.60(C-arom),129.93,129.86,127.78,127.72(CH-arom),121.61(C(5)),88.04(C(1’)),82.21(C(4’)),77.49(C(7’)),71.94(C(5’)),50.13(C(3’)),42.23(C(6’)),41.20(NCHN(CH3)2),35.50(C(2’)),34.97(NCHN(CH3)2),26.87(CH3)3-C-Si),19.02(CH3)3-C-Si)。
ESI+-HRMS m/z计算的C31H38O4N6Si([M+H]+)586.2718,发现586.2703。
实施例23
(3’R,5’R,7’R)-N2-(N,N-二甲基亚胺甲基)-9-{7’-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-5’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-β-D-呋喃核糖基}鸟嘌呤(23)
在室温3小时内向22(139mg，0.237mmol)的无水吡啶溶液(2mL)中分六部分加入DMTr-Cl(240mg，0.708mmol)。搅拌过夜后，将橙色溶液用饱和NaHCO3(20mL)稀释，并用DCM(3×20mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(0.5％MeOH的DCM溶液，4％ Et3N)纯化粗产物，得到23(148mg，70％)，为淡黄色泡沫。
23的数据：Rf＝0.52(10％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.49(s,1H,NH),8.38(s,1H,NCHN(CH3)2),7.80(s,1H,C(8)),7.50–7.43(m,2H,H-arom),7.42–7.27(m,10H,H-arom),7.26–7.15(m,6H,H-arom),7.14–7.08(m,1H,H-arom),6.77–6.68(m,4H,H-arom),5.78(dd,J＝8.2,5.9Hz,1H,H-C(1’)),4.25(dt,J＝11.0,5.6Hz,1H,H-C(5’)),4.14–4.03(m,1H,H-C(4’)),3.70–3.64(m,7H,MeO,H-C(7’)),3.00(s,3H,NCHN(CH3)2),2.97(s,3H,NCHN(CH3)2),2.43(dd,J＝16.7,7.5Hz,1H,H-C(3’)),2.24(ddd,J＝13.3,10.1,5.8Hz,1H,H-C(2’)),1.62(td,J＝13.1,4.3Hz,1H,H-C(6’)),1.43(dt,J＝13.5,8.0Hz,1H,H-C(2’)),0.99(dd,J＝13.3,6.2Hz,1H),0.86(s,9H,(CH3)3-C-Si))。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ158.51,158.49(MeO-C-arom),158.04(C(2)),157.91(C(6)),156.60(NCHN(CH3)2),149.76(C(4)),145.83,137.12,136.94(C-arom),136.01(C(8)),135.60,135.59(CH-arom),133.81,133.47(C-arom),130.32,130.26,129.77,128.24,127.82,127.65,127.62,126.67(CH-arom),120.65(C(5)),113.13,113.09(CH-arom),86.82(C(Ph)3),85.01(C(1’)),82.26(C(4’)),76.14(C(7’)),74.61(C(5’)),55.19(MeO-DMTr),50.18(C(3’)),41.29(NCHN(CH3)2),38.01(C(6’)),37.76(C(2’)),35.14(NCHN(CH3)2)26.81 87(CH3)3-C-Si),19.01(CH3)3-C-Si)。
ESI+-HRMS m/z计算的C52H57O6N6Si([M+H]+)889.4103,发现889.4128。
实施例24
(3’S,5’R,7’R)-N2-(N,N-二甲基亚胺甲基)-9-{2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-7’-羟基-5’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-β-D-呋喃核糖基}鸟嘌呤(24)
在室温向23(243mg，0.273mmol)的无水THF溶液(2mL)中加入TBAF(1M的THF溶液，1.65mL，1.63mmol)。将溶液搅拌7小时，然后用饱和NaHCO3(30mL)稀释，并用DCM(4×30mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(0.5％MeOH的DCM溶液，7％ Et3N)纯化粗产物，得到24(155mg，87％)，为仍然含有痕量TBAF的白色泡沫。
24的数据：Rf＝0.44(10％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.55(s,1H,NH),8.45(s,1H,NCHN(CH3)2),8.00(s,1H,H-C(8)),7.60–7.50(m,2H,H-arom),7.49–7.39(m,4H,H-arom),7.31–7.23(m,2H,H-arom),7.21–7.12(m,1H,H-arom),6.81(d,J＝8.5Hz,4H,H-arom),5.93(dd,J＝7.5,6.1Hz,1H,H-C(1’)),4.26(dt,J＝11.1,5.8Hz,1H,H-C(5’)),4.07–3.98(m,1H,H-C(4’)),3.91(d,J＝4.3Hz,1H,H-C(7’)),3.77(s,6H,MeO),3.14(s,3H,NCHN(CH3)2),3.04(s,3H,NCHN(CH3)2),2.73(ddd,J＝13.3,10.1,6.0Hz,1H,H-C(2’)),2.63–2.48(m,1H,H-C(3’)),2.12(br,1H,OH),1.95–1.82(m,2H,H-C(6’),H-C(2’)),1.14(dd,J＝13.4,6.1Hz,1H,H-C(6’))。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ158.52(MeO-C-arom),158.12(C(2)),157.88(C(6)),156.65(NCHN(CH3)2),149.78(C(4)),145.69,137.02,136.99(C-arom),136.07(C(8)),130.26,128.26,127.82,126.74(CH-arom),120.53(C(5)),113.12(CH-arom),86.81(C(Ph)3),85.35(C(1’)),82.64(C(4’)),74.61(C(7’)),74.48(C(5’)),55.23(MeO-DMTr),49.63(C(3’)),41.37(NCHN(CH3)2),38.55(C(6’)),38.23(C(2’)),35.14(NCHN(CH3)2)。
ESI+-HRMS m/z计算的C36H39O6N6([M+H]+)651.2926,发现651.2912。
实施例25
(3’R,5’R,7’R)-N2-(N,N-二甲基亚胺甲基)-9-{7’-O-[(2-氰乙氧基)-二异丙基氨基膦酰基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-5’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-β-D-
在室温向核苷24(143mg，0.220mmol)和5-(乙硫基)-1H-四唑(43mg，0.33mmol)的无水DCM溶液(10mL)中滴加2-氰乙基N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰胺(0.12mL，0.38mmol)。搅拌50分钟后，将反应混合物用饱和NaHCO3(20mL)稀释，并用DCM(3×20mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(0.5％MeOH的DCM溶液，3.5％ Et3N)纯化粗产物，得到25(130mg，两种异构体的混合物，69％)，为白色泡沫。
25的数据：Rf＝0.60(10％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.54,9.47(2s,1H,NH),8.54,8.52(2s,1H,NCHN(CH3)2),8.02.8.00(2s,1H,H-C(8)),7.58–7.49(m,2H,H-arom),7.46–7.36(m,4H,H-arom),7.25(dd,J＝11.0,3.5Hz,2H,H-arom),7.21–7.13(m,1H,H-arom),6.80(dd,J＝8.8,2.2Hz,4H,H-arom),6.00–5.82(m,1H,H-C(1’)),4.16(dd,J＝10.7,5.4Hz,1H,H-C(5’)),4.00–3.82(m,2H,H-C(4’),H-C(7’)),3.77,3.77(2s,6H,MeO),3.62(dt,J＝12.2,6.1Hz,2H,OCH2CH2CN),3.51–3.33(m,2H,(Me2CH)2N),3.15,3.14(2s,3H,NCHN(CH3)2),3.07(s,3H,NCHN(CH3)2),2.85–2.61(m,2H,C(2’),C(3’)),2.59–2.44(m,2H,OCH2CH2CN),2.00–1.79(m,2H,H-(C2’),H-C(6’)),1.53–1.26(m,1H,H-C(6’)),1.10,1.01(2t,J＝6.4Hz,12H,(Me2CH)2N)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ158.50(MeO-C-arom),158.04,158.00(C(2)),157.93(C(6)),156.61,156.60(NCHN(CH3)2),149.73,149.72(C(4)),145.62,145.62,136.97,136.94(C-arom),136.14(C(8)),130.27,130.24,130.22,128.26,127.81,126.73(CH-arom),120.81,120.76(C(5)),117.67,117.56(OCH2CH2CN),113.10(CH-arom),86.88,86.85(C(Ph)3),85.58,85.37(C(1’)),82.41,82.07(C(4’)),77.08,76.01(JC,P＝37.0,15.1Hz,C(7’)),74.52,74.46(C(5’)),58.19,57.74(JC,P＝18.9,19.0Hz OCH2CH2CN),55.25,55.21(MeO-DMTr),49.10,48.83(JC,P＝2.2,4.8Hz,C(3’)),43.12,43.00((Me2CH)2N),41.34,41.33(NCHN(CH3)2),38.48,38.41(C(2’)),37.23,36.92(JC,P＝5.7,3.3Hz C(6’)),35.17((Me2CH)2N),24.56,24.53,24.48,24.47,24.43,25.36,24.35(7s,Me2CH)2N),20.39,20.28(JC,P＝7.1,6.9Hz,OCH2CH2CN)。
31P NMR(122MHz,CDCl3)δ147.69,146.37。
ESI+-HRMS m/z计算的C45H56O7N8P([M+H]+)851.4004,发现851.4018。
实施例26
(3’S,5’R,7’R)-1-{7’-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-β-D-呋喃核糖基}尿嘧啶(26)
在0℃向糖6(669mg，1.62mmol)的无水DCM溶液(13mL)中加入2,6-二甲基吡啶(0.94mL，8.10mmol)。在0℃搅拌20分钟后，逐滴加入TMSOTf(0.89mL，4.86mmol)，然后将溶液温热至室温并再搅拌3小时。然后通过加入饱和NaHCO3(20mL)淬灭反应。分离有机相，并用DCM(2×20mL)进一步萃取水相。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。
将粗产物溶于无水DCM(12mL)中，然后在室温下加入尿嘧啶(545mg，4.86mmol)和BSA(1.8mL，7.29mmol)。在室温下搅拌60分钟后，将得到的细悬浮液冷却至0℃并加入N-碘代琥珀酰亚胺(578mg，2.52mmol)。在0℃搅拌30分钟并在室温搅拌4小时后，将反应混合物用EtOAc(50mL)稀释，随后用10％Na2S2O3水溶液(30mL)和饱和NaHCO3(30mL)洗涤。合并水相，并用DCM(2×20mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。
将粗产物溶于无水甲苯(15mL)中，然后在室温加入Bu3SnH(0.65mL，2.43mmol)和偶氮二异丁腈(AIBN，13mg，0.081mmol)。在95℃加热2小时后，将混合物冷却至室温并加入MeOH(7mL)和HCl(1M的水溶液,1.6mL,1.6mmol)。将溶液再搅拌15分钟，然后用饱和NaHCO3(50mL)稀释，并用DCM(3×50mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(EtOAc/己烷4:1)纯化粗产物，得到26(490mg，三步61％)，为白色泡沫。
26的数据：Rf＝0.15(EtOAc/己烷2:1)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.95(br,1H,H-N(3)),7.69(d,J＝6.4Hz,4H,H-arom),7.54–7.39(m,7H,H-C(6),H-arom),5.98(dd,J＝9.3,5.6Hz,1H,H-C(1’)),5.71(d,J＝8.1Hz,1H,H-C(5)),4.51(dd,J＝13.7,6.3Hz,2H,H-C(4’),H-C(5’)),4.14(br,1H,H-C(7’)),3.25(br,1H,OH),2.74(dd,J＝17.1,8.7Hz,1H,H-C(3’)),2.26–1.87(m,3H,H-C(2’),H-C(6’)),1.49–1.19(m,1H,H-C(2’)),1.12(s,9H,(CH3)3-C-Si)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ163.65(C(4)),150.46(C(2)),139.85(C(6)),135.69,135.66(CH-arom),133.71,133.42(C-arom),129.98,129.93,127.85,127.81(CH-arom),102.84(C(5)),86.17(C(1’)),81.83(C(4’)),76.94(C(7’)),72.45(C(5’)),50.09(C(3’)),40.93(C(6’)),35.83(C(2’)),26.91(CH3)3-C-Si),19.03(CH3)3-C-Si)。
ESI+-HRMS m/z计算的C27H32O5N2NaSi([M+Na]+)515.1973,发现515.1963。
实施例27
(3’S,5’R,7’R)-1-{7’-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-5’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-β-D-呋喃核糖基}尿嘧啶(27)
在室温向核苷26(438mg，0.889mmol)的无水吡啶溶液(7mL)中加入DMTr-Cl(1.20g，3.55mmol)。将溶液在室温搅拌1天，然后用饱和NaHCO3(30mL)稀释，并用DCM(3×40mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(0.5％MeOH的DCM溶液，1.5％ Et3N)纯化粗产物，得到27(601mg，80％)，为黄色泡沫。
27的数据：Rf＝0.48(EtOAc/己烷2:1)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.26(br,1H,H-N(3)),7.84(d,J＝8.1Hz,1H,H-C(6)),7.40–7.08(m,19H,H-arom),6.69(dd,J＝8.8,4.9Hz,4H,H-arom),5.70(dd,J＝7.8,5.8Hz,1H,H-C(1’)),5.49(dd,J＝8.1,1.5Hz,1H,H-C(5)),4.24–4.11(m,1H,H-C(5’)),4.05–3.95(m,1H,H-C(4’)),3.65(d,J＝1.7Hz,6H,MeO),3.62(d,J＝3.0Hz,1H,H-C(7’)),2.41(dd,J＝17.2,8.5Hz,1H,H-C(3’)),2.24(ddd,J＝13.5,10.2,5.7Hz,1H,H-C(2’)),1.39–1.24(m,1H,H-C(6’)),1.04(dd,J＝13.1,5.7Hz,1H,H-C(6’)),0.89(dt,J＝13.8,8.3Hz,1H,H-C(2’)),0.81(s,9H,(CH3)3-C-Si)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ163.58(C(4)),158.66(MeO-C-arom),150.38(C(2)),145.61(C-arom),139.92(C(6)),136.71,136.56(C-arom),135.61,135.55(CH-arom),133.55,133.41(C-arom),130.30,129.92,129.84,128.16,127.90,127.74,127.67,126.90,113.19,113.15(CH-arom),102.12(C(5)),87.41(C(Ph)3),86.80(C(1’)),82.32(C4’)),75.54(C(7’)),74.41(C(5’)),55.23(MeO-DMTr),50.05(C(3’)),38.49(C(6’)),37.53(C(2’)),26.81(CH3)3-C-Si),18.99(CH3)3-C-Si)。
ESI+-HRMS m/z计算的C48H50O7N2NaSi([M+Na]+)817.3279,发现817.3286。
实施例28
(3’S,5’R,7’R)-1-{7’-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-5’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-β-D-呋喃核糖基}胞嘧啶(28)
在0℃向1,2,4-三唑(1.83g，26.5mmol)的无水MeCN悬浮液(70mL)中加入POCl3(0.57mL，6.05mmol)，然后加入Et3N(4.2mL，30.2mmol)。将悬浮液在0℃搅拌30分钟，然后在0℃加入核苷27(601mg，0.756mmol)的无水MeCN溶液(4mL)。室温搅拌4小时后，用添加的饱和NaHCO3(20mL)淬灭反应，在减压下移除MeCN，并将得到的混合物用饱和NaHCO3(30mL)稀释，并用DCM(3×60mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。
然后将粗产物溶于1,4-二氧杂环己烷(18mL)和浓NH4OH(18mL)的混合物中。在室温搅拌3小时后，将混合物在真空中减少至一半体积，用饱和NaHCO3(30mL)稀释，并用DCM(3×30mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(0.5％MeOH的DCM溶液，5％ Et3N)纯化粗产物，得到28(520mg，87％)，为白色泡沫。
28的数据：Rf＝0.41(10％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.96(d,J＝7.4Hz,1H,H-C(6)),7.45(d,J＝7.4Hz,2H,H-arom),7.38–7.08(m,17H,H-arom),6.73(dd,J＝8.7,4.7Hz,4H,H-arom),5.73(t,J＝8.6Hz,2H,H-C(5),H-C(1’)),4.32–4.16(m,1H,H-C(5’)),4.03(t,J＝5.6Hz,1H,H-C(4’)),3.66(d,J＝0.9Hz,6H,MeO),3.61(d,J＝2.9Hz,1H,H-C(7’)),2.50–2.33(m,2H,H-C(2’),H-C(3’)),1.47–1.28(m,1H,H-C(6’)),1.03(dd,J＝12.9,5.6Hz,1H,H-C(6’)),0.92–0.75(m,10H,H-C(2’),(CH3)3-C-Si)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ165.78(C(4)),158.59(MeO-C-arom),155.94(C(2)),145.88(C-arom),140.68(C(6)),136.93,136.78(C-arom),135.59,135.53(CH-arom),133.60,133.54(C-arom),130.31,129.86,129.77,128.15,127.88,127.71,127.64,126.79,113.18,113.14(CH-arom),94.53(C(5)),87.55(C(Ph)3),87.22(C(1’)),82.23(C(4’)),75.76(C(7’)),74.68(C(5’)),55.21(MeO-DMTr),50.18(C(3’)),38.25(C(6’)),38.08(C(2’)),26.83(CH3)3-C-Si),19.00(CH3)3-C-Si)。
ESI+-HRMS m/z计算的C48H52O6N3Si([M+H]+)794.3620,发现794.3649。
实施例29
(3’S,5’R,7’R)-N4-苯甲酰基-1-{7’-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-5’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-β-D-呋喃核糖基}胞嘧啶(29)
在室温向核苷28(519mg，0.653mmol)的无水DMF溶液(15mL)中加入Et3N(110μL，0.784mmol)，然后加入Bz2O(370mg，1633mmol)，将溶液搅拌过夜。然后通过小心加入饱和NaHCO3(60mL)淬灭溶液，并用DCM(3×70mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(己烷/EtOAc 2:3,+0.5％Et3N)纯化粗产物，得到29(580mg，99％)，为白色泡沫。
29的数据：Rf＝0.51(EtOAc)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.61(d,J＝7.4Hz,1H,H-C(6)),7.81(d,J＝7.5Hz,2H,H-arom),7.49–7.13(m,24H,H-arom,H-C(5)),6.77(dd,J＝8.5,4.4Hz,4H,H-arom),5.73(t,J＝6.4Hz,1H,H-C(1’)),4.39–4.20(m,1H,H-C(5’)),4.05(t,J＝6.1Hz,1H,H-C(4’)),3.70(s,6H,MeO),3.63(d,J＝2.3Hz,1H,H-C(7’)),2.72–2.55(m,1H,H-C(2’)),2.48(dd,J＝16.0,8.4Hz,1H,H-C(3’)),1.42–1.29(m,1H,H-C(6’)),1.19–1.11(m,1H,H-C(6’)),1.07–0.96(m,1H,H-C(2’)),0.85(s,9H,(CH3)3-C-Si)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ166.64(CONH),162.25(C(4)),158.70(MeO-C-arom),154.84(C(2)),145.71(C-arom),144.84(C(6)),136.74,136.67(C-arom),135.59,135.51(CH-arom),133.52,133.42,133.24(C-arom),133.11,130.30,129.92,129.85,129.02,128.12,127.97,127.76,127.68,127.61,126.94,113.25,113.22(CH-arom),96.22(C(5)),89.07(C(Ph)3),87.53(C(1’)),83.46(C(4’)),75.59(C(7’)),74.71(C(5’)),55.24(MeO-DMTr),50.35(C(3’)),38.61(C(6’)),38.15(C(2’)),26.82(CH3)3-C-Si),19.00(CH3)3-C-Si)。
ESI+-HRMS m/z计算的C55H56O7N3Si([M+H]+)898.3882,发现898.3898。
实施例30
(3’S,5’R,7’R)-N4-苯甲酰基-1-{-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-7’-羟基-5’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-β-D-呋喃核糖基}胞嘧啶(30)
在室温向29(580mg，0.648mmol)的无水THF溶液(14mL)中加入TBAF(1M的THF溶液，3.25mL，3.25mmol)。将溶液搅拌1天，然后用饱和NaHCO3(50mL)稀释，并用DCM(3×40mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(0.5％MeOH的DCM溶液，3％ Et3N)纯化粗产物，得到30(366mg，85％)，为白色泡沫。
30的数据：Rf＝0.31(5％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.90(br,1H,NH),8.73(d,J＝7.5Hz,1H,H-C(6)),7.82(d,J＝7.3Hz,2H,H-arom),7.55–7.31(m,10H,H-arom,H-C(5)),7.28–7.09(m,3H,H-arom),6.76(dd,J＝8.8,1.7Hz,4H,H-arom),5.73(t,J＝6.3Hz,1H,H-C(1’)),4.28–4.13(m,1H,H-C(5’)),3.83(t,J＝6.0Hz,1H,H-C(4’)),3.75(d,J＝3.6Hz,1H,H-C(7’)),3.70(s,6H,MeO),2.86(d,J＝14.7Hz,1H,H-C-(2’)),2.54(dd,J＝17.4,7.4Hz,1H,H-C(3’)),1.68–1.55(m,1H,H-C(6’)),1.45–1.13(m,3H,H-C(2’),H-C(6’),OH)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ166.63(CONH),162.34(C(4)),158.65(MeO-C-arom),155.00(C(2)),145.62(C-arom),145.11(C(6)),136.72,136.64,133.16(C-arom),130.25,129.02,128.12,127.93,127.61,126.95,113.20(CH-arom),96.24(C(5)),89.20(C(Ph)3),87.48(C(1’)),83.40(C(4’)),74.50,(C(5’))73.90(C(7’)),55.25(MeO-DMTr),50.05(C(3’)),38.90(C(6’)),38.40(C(2’))。
ESI+-HRMS m/z计算的C39H38O7N3([M+H]+)660.2704,发现660.2707。
实施例31
(3’S,5’R,7’R)-N4-苯甲酰基-1-{7’-O-[(2-氰乙氧基)-二异丙基氨基膦酰基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-5’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-β-D-呋喃核糖基}胞嘧啶(31)
在室温向核苷30(67mg，0.101mmol)和5-(乙硫基)-1H-四唑(22mg，0.17mmol)的无水DCM溶液(3mL)中滴加2-氰乙基N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰胺(65μL，0.38mmol)。搅拌40分钟后，将反应混合物用DCM(20mL)稀释，并用饱和NaHCO3(2×15mL)和饱和NaCl(15mL)洗涤。合并水相，并用DCM(20mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(EtOAc,+0.5％Et3N)纯化粗产物，得到31(75mg，两种异构体的混合物，86％)，为白色泡沫。
31的数据：Rf＝0.67(4％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.88(s,1H,NH),8.79(d,J＝7.5Hz,1H,H-C(6)),7.93(d,J＝7.5Hz,2H,H-arom),7.67–7.40(m,10H,H-arom,H-C(5)),7.39–7.22(m,3H,H-arom),6.93–6.79(m,4H,H-arom),5.97–5.77(m,1H,H-C(1’)),4.22(dt,J＝14.5,5.6Hz,1H,H-(5’)),3.98–3.84(m,2H,H-C(4’),H-C(7’)),3.82(s,6H,MeO),3.66(ddd,J＝16.8,13.5,6.7Hz,2H,OCH2CH2CN),3.53–3.37(m,2H,(Me2CH)2N),3.14–2.93(m,1H,H-C(2’)),2.84–2.66(m,1H,H-C(3’)),2.53(dt,J＝12.4,6.3Hz,2H,OCH2CH2CN),1.83–1.56(m,2H,H-C(6’)),1.46(td,J＝14.1,7.0Hz,1H,H-C(2’)),1.18–0.97(m,12H,(Me2CH)2N)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ166.70(CONH),162.32,162.28(C(4)),158.68(MeO-C-arom),154.93(C(2)),145.53(C-arom),144.95,144.89(C(6)),136.69,136.63,136.56,136.52,133.24(C-arom),133.10,130.24,130.20,129.01,128.10,127.94,127.60,126.96(CH-arom),117.53(OCH2CH2CN),113.20(CH-arom),96.24(C(5)),89.15,89.10(C(Ph)3),87.55,87.54(C(1’)),83.11,83.04(C(4’)),75.93,75.37(JC,P＝16.7,15.5Hz,C(7’)),74.48(C(5’)),58.25,57.99(JC,P＝17.9,18.1Hz OCH2CH2CN),55.27,55.24(MeO-DMTr),49.27,49.03(JC,P＝3.1,4.8Hz,C(3’)),43.15,42.98((Me2CH)2N),38.89,38.80(C(2’)),37.44,37.24(JC,P＝5.2,3.2Hz,C(6’)),24.58,24.54,24.48,24.45,24.35(5s,Me2CH)2N),20.33,20.24(JC,P＝5.8,5.7Hz,OCH2CH2CN)。
31P NMR(121MHz,CDCl3)δ147.19,146.94。
ESI+-HRMS m/z计算的C48H55O8N5P([M+H]+)860.3783,发现860.3791。
实施例32
(3’S,5’R,7’R)-1-{2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-7’-O-(4-硝基苯甲酸)-5’-5’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-β-D-呋喃核糖基}胸腺嘧啶(32)
在室温向核苷11(100g，0.175mmol)和4-二甲基氨基吡啶(26mg，0.21mmol)的无水DCM溶液(8mL)中加入4-硝基苯甲酰氯(59mg，0.315mmol)。搅拌6小时后，通过加入饱和NaHCO3(5mL)淬灭反应。然后将混合物用饱和NaHCO3(15mL)稀释，并用DCM(3×15mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(0.5％MeOH的DCM溶液，2.5％ Et3N)纯化粗产物，得到32(98mg，78％)，为仍然含有痕量Et3N的白色泡沫。
32的数据：Rf＝0.42(5％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.26(t,J＝7.3Hz,3H,H-arom,HN(3)),8.00(d,J＝8.9Hz,2H,H-arom),7.72(d,J＝1.0Hz,1H,H-C(6)),7.55(d,J＝6.9Hz,2H,H-arom),7.44(dd,J＝8.8,6.6Hz,4H,H-arom),7.35–7.18(m,3H,H-arom),6.83(dd,J＝9.0,2.6Hz,4H,H-arom),6.01(dd,J＝8.2,5.2Hz,1H,H-C(1’)),4.96(d,J＝3.3Hz,1H,H-C(7’)),4.33–4.24(m,1H,H-C(4’)),4.24–4.13(m,1H,H-C(5’)),3.78(d,J＝0.9Hz,6H,MeO),2.92–2.72(m,2H,H-C(3’),H-C(2’)),1.81(d,J＝0.6Hz,3H,Me-C(5)),1.79–1.62(m,2H,H-C(6’)),1.22(d,J＝5.9Hz,1H,H-C(2’))。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ164.05,163.84(C(4),CO2R),158.81(MeO-C-arom),150.64,150.52(O2N-C-arom,C(2)),145.29,136.43,136.34(C-arom),135.18(C(6)),130.62,130.20,130.17,128.16,128.01,127.15,123.58,113.30,113.27(C-arom),111.17(C(5)),87.53(C(Ph)3),86.29(C(1’)),81.59(C(4’)),78.65(C(7’)),74.16(C(5’)),55.26(MeO-DMTr),47.07(C(3’)),37.35(C(2’)),35.71(C(6’)),12.51(Me-C(5))。
ESI+-HRMS m/z计算的C40H37O10N3Na([M+Na]+)742.2371,发现742.2375。
实施例33
((3’S,5’R,7’R)-1-{2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-7’-O-(4-硝基苯甲酸)-β-D-呋喃核糖基}胸腺嘧啶(33)
在室温向32(60mg，0.083mmol)在无水DCM(1mL)和MeOH(0.4mL)的混合物中的溶液中滴加二氯乙酸(0.2mL)。搅拌3小时后，然后将混合物用饱和NaHCO3(15mL)稀释，并用DCM(3×10mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(5％MeOH的DCM溶液)纯化粗产物，得到33(29mg，84％)，为白色泡沫。通过在H2O/MeOH的混合物中重结晶获得适于X射线分析的晶体。
33的数据：Rf＝0.18(5％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.33(s,1H,H-N(3)),8.34(d,J＝8.8Hz,2H,H-arom),8.27–8.13(m,2H,H-arom),7.78(s,1H,H-C(6)),5.96(dd,J＝9.3,5.6Hz,1H,H-C(1’)),5.18(t,J＝3.8Hz,1H,H-C(7’)),5.12(d,J＝6.0Hz,1H,OH),4.33(dd,J＝7.3,4.7Hz,1H,H-C(4’)),4.27(td,J＝10.5,5.5Hz,1H,H-C(5’)),2.90(dd,J＝17.2,8.5Hz,1H,H-C(3’)),2.58–2.46(m,1H,H-C(2’)),2.30(ddd,J＝13.8,8.8,5.3Hz,1H,H-C(6’)),2.03(dd,J＝9.6,4.2Hz,1H,H-C(6’)),1.92–1.76(m,4H,H-C(2’),Me-C(5))。
13C NMR(101MHz,DMSO)δ164.33,164.23(C(4),CO2R),150.91,150.75(O2N-C-arom,C(2)),136.79(C-arom),135.69(C(6)),131.20,124.32(CH-arom),109.89(C(5)),85.31(C(1’)),81.48(C(4’)),80.07(C(7’)),71.72(C(5’)),47.18(C(3’)),37.77(C(6’)),35.48(C(2’)),12.66 12.58(Me-C(5))。
ESI+-HRMS m/z计算的C19H20O8N3([M+H]+)418.1245,发现418.1242。
实施例35
(3’R,5’R,7’R)-1-{5’-O-乙酰基-7’-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-α,β-D-呋喃核糖基}胸腺嘧啶(35)
在室温向糖7(933mg，2.05mmol)和胸腺嘧啶(372mg，3.08mmol)的无水MeCN溶液(12mL)中滴加BSA(1.5mL，6.15mmol)。在室温搅拌50分钟后，将溶液冷却至0℃并逐滴加入TMSOTf(0.45mL，2.5mmol)。进一步在0℃搅拌3小时并在室温搅拌15小时后，将反应混合物用饱和NaHCO3(100mL)稀释，并用DCM(4×40mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(2.5％异丙醇的DCM溶液)纯化粗产物，得到端基异构比率α/β≈85：15的35(924mg，82％)的混合物，为白色泡沫。
35的数据：Rf＝0.56(7％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.14(s,3H,H-C(6)),7.53(td,J＝7.7,1.6Hz,4H,H-arom),7.39–7.23(m,5H,H-arom),7.09(t,J＝1.0Hz,1H,H-C(6’)),6.87(t,J＝1.0Hz,1H,H-C(1’)),5.83(td,J＝10.0,5.9Hz,1H,H-C(1’)),5.80–5.70(m,1H,H-C(5)),5.36–5.04(m,1H,H-C(6’)),4.89(dd,J＝6.3,5.2Hz,1H,H-C(4’)),4.62(ddd,J＝7.1,0,5.5Hz,1H,H-C(7’)),2.76(d,J＝3.5Hz,6H,((CH3)2C),0.96(s,9H,(CH3)3-C-Si)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ170.70(MeCO2),163.87(C(4)),150.29(C(2)),135.69,135.67(CH-arom),134.99(C(6)),133.58,133.18(C-arom),130.03,127.87(CH-arom),111.05(C(5)),87.56(C(1’)),82.85(C(4’)),76.50(C(7’)),74.76(C(5’)),50.72(C(3’)),37.79(C(6’)),36.94(C(2’)),26.88((CH3)3-C-Si),20.95(MeCO2),19.01((CH3)3-C-Si),12.63(Me-C(5))。
ESI+-HRMS m/z计算的C30H37O6N2Si([M+H]+)549.2415,发现549.2401。
实施例36
(3’S,5’R,7’R)-1-{5’-O-乙酰基-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-7’-羟基-α,β-D-呋喃核糖基}胸腺嘧啶(36)
在室温向核苷35(924mg，1.68mmol)的无水THF溶液(10mL)中加入TBAF(1M的THF溶液，3.4mL，3.4mmol)。室温搅拌2小时后，将反应混合物用饱和NaHCO3(80mL)稀释，并用EtOAc(3×80mL)和DCM(2×80mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(5％ MeOH的DCM溶液)纯化粗产物，得到36的端基异构体混合物(391mg，75％)。
36的数据：Rf＝0.24(7％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.66(br,0.15H,H-N(3)),9.63(br,0.85H,H-N(3)),7.27(d,J＝1.0Hz,0.15H,H-C(6)),7.06(d,J＝1.0Hz,0.85H,H-C(6)),6.00(t,J＝6.1Hz,0.85H,H-C(1’)),5.91(dd,J＝8.8,5.5Hz,0.15H,H-C(1’)),5.26–5.10(m,1H,H-C(5’)),4.92(dd,J＝6.5,5.3Hz,0.85H,H-C(4’)),4.65(dd,J＝6.9,5.7Hz,0.15H,H-C(4’)),4.19–4.03(m,1H,H-C(7’)),2.91–2.72(m,2H,H-C(3’),OH),2.64(ddd,J＝13.3,9.8,5.5Hz,0.15H,H-C(2’)),2.25–2.15(m,1.70H,H-C(2’)),2.05(s,0.45H,MeCO2),2.04(s,2.55H,MeCO2),2.03–1.89(m,2H,H-C(6’)),1.88(d,J＝0.7Hz,0.45H,Me-C(5)),1.85(d,J＝0.6Hz,2.55H,Me-C(5)),1.42–1.28(m,0.15H,H-C(2’))。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ170.87(MeCO2),164.26(C(4)),150.66(C(2)),135.54(C(6)),111.22(C(5)),87.97(C(1’)),82.97(C(4’)),75.08(C(7’)),74.52(C(5’)),50.07(C(3’)),37.81(C(2’)),37.23(C(6’)),21.02(MeCO2),12.67(Me-C(5))。
ESI+-HRMS m/z计算的C14H19O6N2([M+H]+)311.1238,发现311.1234。
实施例37
(3’S,5’R,7’R)-1-{5’-O-乙酰基-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-7’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-α,β-D-呋喃核糖基}胸腺嘧啶(37)
在室温向核苷36(364mg，1.17mmol)的无水吡啶溶液(7mL)中加入DMTr-Cl(1.19g，3.51mmol)。将溶液搅拌1天，然后用饱和NaHCO3(50mL)稀释，并用DCM(3×50mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(EtOAc/己烷2:1，+0.5％Et3N)纯化粗产物，得到37的端基异构体混合物(690mg，96％)，为黄色泡沫。
37的数据：Rf＝0.70(8％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.17(br,0.85H,H-N(3)),8.56(br,0.15H,H-N(3)),7.38–7.32(m,2H,H-arom),7.29–7.15(m,7H,H-arom),6.82(d,J＝1.1Hz,1H,H-C(6)),6.76(d,J＝8.9Hz,4H,H-arom),5.86(t,J＝6.0Hz,0.85H,H-C(1’)),5.71(dd,J＝8.9,5.4Hz,0.15H,H-C(1’)),5.25(dd,J＝10.2,5.6Hz,0.15H,H-C(5’)),5.21–5.11(m,0.85H,H-(C5’)),4.78(dd,J＝6.7,4.8Hz,0.85H,H-C(4’)),4.49(dd,J＝7.1,5.3Hz,0.15H,H-C(4’)),3.84(br,1H,H-C(7’)),3,72,3.71(2s,6H,MeO),2.34–2.23(m,1H,H-C(3’)),2.01,1.99(2s,3H,MeCO2),1.82(d,J＝0.5Hz,Me-C(5)),1.80–1.56(m,4H,H-C(2’),H-C(6’))。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ170.69(MeCO2),163.91(C(4)),158.82(MeO-C-arom),150.33(C(2)),145.34,136.64,136.58(C-arom),135.00(C(6)),130.25,128.39,128.07,127.15,113.41(CH-arom),111.04(C(5)),87.70(C(Ph)3),87.31(C(1’)),83.15(C(4’)),77.16(C(7’)),74.96(C(5’)),55.37(MeO-DMTr),49.12(C(3’)),37.55(C(2’)),36.82(C(6’)),21.07(MeCO2),12.66(Me-C(5))。
ESI+-HRMS m/z计算的C35H36O8N2([M+H]+)612.2466,发现612.2453。
实施例38
(3’S,5’R,7’R)-1-{2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-7’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-α-D-呋喃核糖基}胸腺嘧啶(38)
在室温向核苷37(690mg，1.12mmol)的无水MeOH溶液(10mL)中加入K2CO3(467mg，3.36mmol)。将溶液搅拌3小时，然后用饱和NaCl(60mL)稀释，并用DCM(3×60mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(3％异丙醇的Et2O溶液，+0.5％Et3N)纯化粗产物，得到的38α端基异构体(550mg，86％)，为白色固体。
38的数据：Rf＝0.39(5％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.37(br,s,1H,H-N(3)),7.39–7.31(m,2H,H-arom),7.25(d,J＝8.3Hz,4H,H-arom),7.20(t,J＝7.7Hz,2H,H-arom),7.16–7.08(m,1H,H-arom),6.78(d,J＝1.1Hz,1H,H-C(6)),6.74(d,J＝8.8Hz,4H,H-arom),5.91(dd,J＝6.5,4.9Hz,1H,H-C(1’)),4.57(dd,J＝7.2,4.4Hz,1H,H-C(4’)),4.35–4.18(m,1H,H-C(5’)),3.86(d,J＝4.7Hz,1H,H-C(7’)),3.69(s,6H,MeO),2.53(br,1H,OH),2.22(dd,J＝15.3,6.3Hz,1H,H-C(3’)),1.85–1.69(m,5H,Me-C(5),H-C(2’),H-C(6’)),1.66–1.49(m,2H,H-C(2’),H-C(6’))。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ163.98(C(4)),158.67(MeO-C-arom),150.47(C(2)),145.48,136.80,136.75(C-arom),134.94(C(6)),130.19,130.18,128.35,127.97,127.01,113.31(CH-arom),111.04(C(5)),87.82(C(Ph)3),87.05(C(1’)),85.74(C(4’)),78.26(C(7’)),73.33(C(5’)),55.31(MeO-DMTr),48.81(C(3’)),40.21(C(6’)),37.68(C(2’)),12.65(Me-C(5))。
ESI+-HRMS m/z计算的C33H35O7N2([M+H]+)571.2439,发现571.2421。
实施例39
(3’S,5’R,7’R)-1-{5’-O-[(2-氰乙氧基)-二异丙基氨基膦酰基]2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-7’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-α-D-呋喃核糖基}胸腺嘧啶(39)
在室温向核苷38(200mg，0.350mmol)和5-(乙硫基)-1H-四唑(59mg，0.46mmol)的无水DCM溶液(7mL)中滴加2-氰乙基N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰胺(0.17mL，0.53mmol)。搅拌1小时后，将反应混合物用DCM(50mL)稀释，并用饱和NaHCO3(2×25mL)和饱和NaCl(25mL)洗涤。合并水相，并用DCM(30mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(2％MeOH的DCM溶液，+0.5％Et3N)纯化粗产物，得到39(220mg，两种异构体的混合物，81％)，为白色固体。
39的数据：Rf＝0.44(4％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.03(br,1H,H-N(3)),7.36(d,J＝8.1Hz,2H,H-arom),7.30–7.07(m,7H,H-arom),6.84(s,1H,H-C(6)),6.80–6.69(m,4H,H-arom),5.95,5.88(2dd,J＝6.6,4.8Hz,1H,H-C(1’)),4.70,4.61(2dd,J＝7.3,4.3Hz,1H,H-C(4’)),4.41–4.20(m,1H,H-C(5’)),3.94–3.82(m,1H,H-C(7’)),3.81–3.62(m,8H,MeO,OCH2CH2CN),3.59–3.40(m,2H,(Me2CH)2N),2.61–2.46(m,2H,OCH2CH2CN),2.28(ddd,J＝14.1,13.2,7.3Hz,1H,H-C(3’)),1.91–1.73(m,5H,Me-C(5),H-C(6’),H-C(2’)),1.72–1.46(m,2H,H-C(6’),H-C(2’)),1.16–1.00(m,12H,(Me2CH)2N)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ164.01,163.98(C(4)),158.70(MeO-C-arom),150.39,150.17(C(2)),145.52,136.84,136.78(C-arom),135.44,135.39(C(6)),130.21,128.36,128.32,128.00,127.03(CH-arom),118.02,117.76(OCH2CH2CN),113.32(CH-arom),110.91,110.59(C(5)),88.31,88.06(C(Ph)3),87.11,87.06(C(1’)),85.44,85.39(JC,P＝4.6,3.1Hz,C(4’)),78.25,78.13(C(7’)),74.70,74.34(JC,P＝13.5,18.5Hz,C(5’)),58.73,58.47(JC,P＝18.9,20.1Hz,(OCH2CH2CN)),55.35,55.32(MeO-DMTr),48.80,48.64(C(3’)),43.22,43.06(JC,P＝12.4,11.0Hz(Me2CH)2N),39.68,39.63(C(6’)),38.06,37.93(C(2’)),24.81,24.74,24.71,24.68,24.65,24.59(6s,Me2CH)2N),20.37,20.35(JC,P＝7.1,6.8Hz,OCH2CH2CN),12.66(Me-C(5))。
31P NMR(122MHz,CDCl3)δ148.18,147.80。
ESI+-HRMS m/z计算的C42H52O8N4P([M+H]+)771.3517,发现771.3517。
实施例40
(3’S,5’R,7’R)-N4-苯甲酰基-1-{2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-7’--O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-α-D-呋喃核糖基}-5-甲基胞嘧啶(40)
在0℃向核苷38(268mg，0.470mmol)在无水MeCN溶液(5mL)中滴加BSA(0.28mL，1.13mmol)，然后将溶液在室温下搅拌过夜。在另一个烧瓶中，将1,2,4-三唑(1.14g，16.5mmol)的无水MeCN悬浮液(50mL)冷却至0℃并且加入POCl3(0.35mL，3.8mmol)接着Et3N(2.62mL，18.8mmol)。将悬浮液在0℃搅拌30分钟，然后将先前制备的甲硅烷基化化合物38的溶液加入悬浮液中，并将混合物在室温下进一步搅拌7小时。用添加的饱和NaHCO3(10mL)淬灭反应，在减压下移除MeCN，并将得到的混合物用饱和NaHCO3(30mL)稀释，并用DCM(3×30mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。
然后将粗产物溶于1,4-二氧杂环己烷(10mL)和浓NH4OH(10mL)的混合物中。在室温搅拌3小时后，将混合物在真空中减少至一半体积，用饱和NaHCO3(25mL)稀释，并用DCM(4×30mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。
然后将粗产物溶于无水DMF(10mL)中。在室温加入Et3N(80μL,0.56mmol)接着Bz2O(266mg，1.18mmol)并将溶液搅拌过夜。通过小心加入饱和NaHCO3(40mL)淬灭所得棕色溶液，并用DCM(4×40mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(EtOAc/己烷1:1,+0.5％Et3N)纯化粗产物，得到40(263mg，83％)，为白色泡沫。
40的数据：Rf＝0.53(EtOAc/己烷3:1)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ13.11(br,1H,NH),8.30–8.10(m,2H,H-arom),7.47–7.29(m,5H,H-arom),7.28–7.06(m,7H,H-arom),7.00(d,J＝0.8Hz,1H,H-C(6)),6.74(d,J＝8.6Hz,4H,H-arom),5.89(dd,J＝6.3,4.6Hz,1H,H-C(1’)),4.61(dd,J＝7.2,4.5Hz,1H,H-C(4’)),4.33–4.20(m,1H,H-C(5’)),3.87(br,1H,H-C(7’)),3.69(s,6H,MeO),2.32–2.13(m,2H,H-C(3’),OH),1.99(s,3H,Me-C(5)),1.87–1.73(m,2H,H-C(2’),H-C(6’)),1.66–1.47(m,2H,H-C(2’),H-C(6’))。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ179.61(CONH),159.76(C(4)),158.74(MeO-C-arom),147.87(C(2)),145.47(C-arom),137.17(C(6)),136.77,136.68,136.03(C-arom),132.55,130.21,129.98,128.34,128.21,128.03,127.07,113.35(CH-arom),111.81(C(5)),88.74(C(Ph)3),87.13(C(1’)),86.12(C(4’)),78.17(C(7’)),73.31(C(5’)),55.35(MeO-DMTr),48.63(C(3’)),40.35(C(6’)),38.06(C(2’)),13.78(Me-C(5))。
ESI+-HRMS m/z计算的C40H40O7N3([M+H]+)674.2861,发现674.2877。
实施例41
(3’S,5’R,7’R)-N4-苯甲酰基-1-{5’-O-[(2-氰乙氧基)-二异丙基氨基膦酰基]2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-7’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-α-D-呋喃核糖基}5-甲基胞嘧啶(41)
在室温向核苷40(250mg，0.371mmol)和5-(乙硫基)-1H-四唑(73mg，0.56mmol)的无水DCM溶液(8mL)中滴加2-氰乙基N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰胺(0.20mL，0.63mmol)。搅拌20分钟后，将反应混合物用DCM(30mL)稀释，并用饱和NaHCO3(2×20mL)和饱和NaCl(30mL)洗涤。合并水相，并用DCM(20mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(EtOAc/己烷1:1,+0.5％Et3N)纯化粗产物，得到41(260mg，两种异构体的混合物，80％)，为白色泡沫。
41的数据：Rf＝0.57(EtOAc/己烷1:1)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ13.26(br,1H,NH),8.32(d,J＝7.2Hz,2H,H-arom),7.58–7.39(m,5H,H-arom),7.38–7.14(m,8H,H-arom,H-C(6)),6.88–6.77(m,4H,H-arom),6.01,5.96(2dd,J＝6.3,4.6Hz,1H,H-C(1’)),4.82,4.74(2dd,J＝7.3,4.3Hz,1H,H-C(4’)),4.42(td,J＝10.6,6.0Hz,1H,H-C(5’)),3.97(br,1H,H-C(7’)),3.91–3.68(m,8H,MeO,OCH2CH2CN),3.59(dtd,J＝16.7,6.7,3.4Hz,2H,(Me2CH)2N)),2.62(dt,J＝15.5,6.4Hz,2H,OCH2CH2CN),2.49–2.23(m,1H,H-C(3’)),2.11,2.09(2d,J＝0.5Hz,3H,Me-C(5)),2.00–1.82(m,2H,H-C(6’),H-C(2’)),1.82–1.55(m,2H,H-C(6’),H-C(2’)),1.17(dd,J＝16.3,6.8Hz,12H,(Me2CH)2N)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ179.60(CONH),159.97(C(4)),158.76(MeO-C-arom),147.81,147.70(C(2)),145.54(C-arom),137.34,136.83(C(6)),136.77,136.72,136.65,136.55(C-arom),132.45,130.22,130.20,129.96,128.34,128.31,128.18,128.00,127.04(CH-arom),117.89,117.71(OCH2CH2CN),113.35(CH-arom),111.60,111.36(C(5)),89.24,89.01(C(Ph)3),87.16,87.12(C(1’)),85.78,85.62(JC,P＝4.3,3.2Hz,C(4’)),78.20,77.98(C(7’)),74.68,74.37(JC,P＝13.4,18.2Hz,C(5’)),58.70,58.44(JC,P＝18.5,20.0Hz,(OCH2CH2CN)),55.36,55.33(MeO-DMTr),48.65,48.44(C(3’)),43.27,43.14(JC,P＝12.4,12.3Hz(Me2CH)2N),39.87,39.64(JC,P＝3.4,3.7Hz(C(6’)),38.30,38.22(C(2’)),24.80,24.72,24.70,24.67,24.63(Me2CH)2N),20.39,20.37(JC,P＝7.2,6.8Hz,OCH2CH2CN),13.72(Me-C(5))。
31P NMR(121MHz,CDCl3)δ148.18,147.96。
ESI+-HRMS m/z计算的C49H57O8N5P([M+H]+)874.3939,发现874.3946。
实施例42
(3’R,5’R,7’R)-N6-苯甲酰基-9-{7’-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-α-D-呋喃核糖基}腺嘌呤(42)
在0℃将核苷15(1.74g，2.64mmol)溶于0.15M NaOH的THF/甲醇/H2O(5:4:1,80mL)溶液中。将反应搅拌20分钟并通过加入NH4Cl(1.06g)淬灭。然后在减压下除去溶剂，并通过CC(5％异丙醇的DCM溶液)纯化产物，得到42(α-端基异构体，836mg，51％)及16(β-端基异构体，287mg，18％)，为白色泡沫。
42的数据：Rf＝0.35(5％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.34(s,1H,NH),8.71(s,1H,H-C(2)),8.02(d,J＝7.4Hz,2H,H-arom)),7.92(s,1H,H-C(8)),7.68–7.58(m,4H,H-arom),7.58–7.31(m,9H,H-arom),6.23(dd,J＝6.7,2.4Hz,1H,H-C(1’)),4.74(dd,J＝6.6,4.9Hz,1H,H-C(4’)),4.49(dt,J＝12.5,6.3Hz,1H,H-C(5’)),4.10(br,1H,H-C(7’)),3.07(d,J＝6.7Hz,1H,OH),2.92(dd,J＝15.4,7.3Hz,1H,H-C(3’)),2.52–2.35(m,1H,H-C(2’)),2.10–1.97(m,1H,H-C(6’)),1.94–1.77(m,2H,H-C(2’),H-C(6’)),1.06(s,9H,(CH3)3-C-Si)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ164.98(CONH),152.65(C(2)),151.31(C(4)),149.69(C(6)),140.93(C(8)),135.74(CH-arom),133.82,133.68,133.39(C-arom),132.77,130.02,129.98,128.76,128.06,127.87,127.85(CH-arom),123.38(C(5)),87.16(C(1’)),85.35(C(4’)),77.40(C(7’)),72.79(C(5’)),50.63(C(3’)),40.86(C(6’)),37.25(C(2’)),26.94((CH3)3-C-Si),19.05((CH3)3-C-Si)。
ESI+-HRMS m/z计算的C35H38O4N5Si([M+H]+)620.2688,发现620.2671。
实施例43
(3’R,5’R,7’R)-N6-苯甲酰基-9-{5’-O-乙酰基-7’-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-α-D-呋喃核糖基}腺嘌呤(43)
在室温向核苷42(1.09g，1.75mmol)和4-二甲基氨基吡啶(321mg，2.63mmol)的无水DCM溶液(50mL)中加入乙酸酐(0.83mL，8.8mmol)。过夜搅拌后，通过加入饱和NaHCO3(50mL)淬灭反应。相分离，并用DCM(2×80mL)进一步萃取水相。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(2.5％MeOH的DCM溶液)纯化粗产物，得到43(1.04g，90％)，为白色泡沫。
43的数据：Rf＝0.33(EtOAc/己烷4:1)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.99(br,1H,NH),8.73(s,1H,H-C(2)),8.09–7.99(m,2H,H-arom),7.98(s,1H,H-C(8)),7.70–7.58(m,5H,H-arom),7.57–7.48(m,2H,H-arom),7.47–7.34(m,6H,H-arom),6.22(dd,J＝6.8,3.2Hz,1H,H-C(1’)),5.45–5.35(m,1H,H-C(5’)),5.01(dd,J＝6.7,5.0Hz,1H,H-C(4’)),4.09(d,J＝4.1Hz,1H,H-C(7’)),3.02(dt,J＝9.5,6.5Hz,1H,H-C(3’)),2.55(ddd,J＝13.5,10.0,3.2Hz,1H,H-C(2’)),2.15(dd,J＝13.2,6.2Hz,1H,H-C(6’)),2.09(s,3H,MeCO2),2.01(dt,J＝8.0,3.5Hz,1H,H-C(2’)),1.88(dt,J＝13.6,5.3Hz,1H,H-C(6’)),1.08(s,9H,(CH3)3-C-Si)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ170.61(MeCO2),164.75(CONH),152.67(C(2)),151.37(C(4)),149.64(C(6)),141.41(C(8)),135.85(CH-arom),133.71,133.38(C-arom),132.91,130.15,130.10,128.99,128.02,127.99,127.97(CH-arom),123.64(C(5)),87.37(C(1’)),83.37(C(4’)),76.63(C(7’)),74.51(C(5’)),51.19(C(3’)),37.44(C(2’)),37.32(C(6’)),27.01((CH3)3-C-Si),21.08(MeCO2),19.14((CH3)3-C-Si)。
ESI+-HRMS m/z计算的C37H40O5N5Si([M+H]+)662.2793,发现662.2787。
实施例44
(3’S,5’R,7’R)-N6-苯甲酰基-9-{5’-O-乙酰基-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-7’-羟基-α-D-呋喃核糖基}腺嘌呤(44)
在室温向核苷43(990mg，1.50mmol)的无水THF溶液(50mL)中加入TBAF(1M的THF溶液，3.0mL，3.0mmol)。在室温搅拌3.5小时后，将溶液用EtOAc(30mL)稀释，并减压除去THF。然后将混合物用饱和NaHCO3(50mL)稀释，并用DCM(4×50mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(6％MeOH的DCM溶液)纯化粗产物，得到44(570mg，90％)，为含有痕量TBAF的白色泡沫。
44的数据：Rf＝0.33(10％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.60(br,1H,NH),8.67(s,1H,H-C(2)),8.09(s,1H,H-C(8)),7.96(d,J＝7.4Hz,2H,H-arom),7.51(t,J＝7.4Hz,1H,H-arom),7.42(t,J＝7.5Hz,2H,H-arom),6.33(dd,J＝6.7,3.1Hz,1H,H-C(1’)),5.25(ddd,J＝9.7,6.4,5.3Hz,1H,H-C(5’)),4.92(dd,J＝6.4,5.4Hz,1H,H-C(1’)),4.14(br,2H,H-C(7’),OH),3.06(dd,J＝16.0,6.6Hz,1H,H-C(3’)),2.87(ddd,J＝13.2,9.9,3.0Hz,1H,H-C(2’)),2.26–2.17(m,1H,H-C2’)),2.10–1.98(m,5H,H-C(6’),MeCO2)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ170.64(MeCO2),165.27(CONH),152.49(C(2)),151.26(C(4)),149.58(C(6)),141.64(C(8)),133.60(C-arom),132.82,128.76,128.06(CH-arom),123.30(C(5)),87.30(C(1’)),83.17(C(4’)),74.67(C(7’)),74.20(C(5’)),50.41(C(3’)),37.43(C(2’)),36.92(C(6’)),20.96(MeCO2)。
ESI+-HRMS m/z计算的C21H22O5N5([M+H]+)424.1615,发现424.1623。
实施例45
(3’S,5’R,7’R)-N6-苯甲酰基-9-{5’-O-乙酰基-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-7’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-α-D-呋喃核糖基}腺嘌呤(45)
在室温向核苷44(570mg，1.35mmol)的无水吡啶溶液(16mL)中加入DMTr-Cl(1.37g，4.04mmol)。将溶液搅拌1天，然后用饱和NaHCO3(100mL)稀释，并用DCM(3×80mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(0.5％MeOH的DCM溶液，2％ Et3N)纯化粗产物，得到45(876mg，89％)，为黄色泡沫。
45的数据：Rf＝0.81(5％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.42(d,J＝14.6Hz,1H,NH),8.73(s,1H,H-C(2)),8.03(d,J＝7.6Hz,2H,H-arom),7.93(s,1H,H-C(8)),7.66–7.55(m,1H,H-arom),7.55–7.45(m,4H,H-arom),7.45–7.22(m,7H,H-arom),6.87(d,J＝8.7Hz,4H,H-arom),6.25(dd,J＝6.6,2.4Hz,1H,H-C(1’)),5.47–5.33(m,1H,H-C(5’)),4.89(dd,J＝6.7,4.9Hz,1H,H-C(4’)),4.02(d,J＝2.5Hz,1H,H-C(7’)),3.79(s,6H,MeO),2.58(dd,J＝16.0,6.9Hz,1H,H-C(3’)),2.38(ddd,J＝12.7,10.0,2.4Hz,1H,H-C(2’)),2.11(s,3H,MeCO2),2.09–1.87(m,3H,H-C(2’),H-C(6’))。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ170.40(MeCO2),164.84(CONH),158.66(MeO-C-arom),152.45(C(2)),151.22(C(4)),149.51(C(6)),145.23(C-arom),141.23(C(8)),136.51,133.65(C-arom),132.68,130.12,128.75,128.33,127.95,127.90,127.03(CH-arom),123.55(C(5)),113.27(CH-arom),87.19(C(Ph)3),87.12(C(1’)),83.25(C(4’)),77.16(C(7’)),74.41(C(5’)),55.23(MeO-DMTr),49.23(C(3’)),37.61(C(2’)),36.22(C(6’)),20.98(MeCO2)。
ESI+-HRMS m/z计算的C42H40O7N5([M+H]+)726.2922,发现726.2905。
实施例46
(3’S,5’R,7’R)-N6-苯甲酰基-9-{2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-7’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-α-D-呋喃核糖基}腺嘌呤(46)
在0℃将核苷45(870mg，1.20mmol)溶于0.1M NaOH的THF/甲醇/H2O(5:4:1,50mL)溶液中。在0℃将反应搅拌30分钟，然后通过加入NH4Cl(321mg)淬灭。将溶液用饱和NaHCO3(100mL)稀释，并用DCM(4×80mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(0.5％MeOH的DCM溶液，3％ Et3N)纯化粗产物，得到46(777mg，94％)，为白色泡沫。
46的数据：Rf＝0.26(5％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.39(s,1H,NH),8.61(s,1H,H-C(2)),7.93(d,J＝7.4Hz,2H,H-arom),7.75(s,1H,H-C(8)),7.46(t,J＝7.3Hz,1H,H-arom),7.40–7.31(m,4H,H-arom),7.29–7.16(m,6H,H-arom),7.11(t,J＝7.2Hz,1H,H-arom),6.73(d,J＝8.7Hz,4H,H-arom),6.12(dd,J＝6.5,1.9Hz,1H,H-C(1’)),4.53(dd,J＝7.5,4.5Hz,1H,H-C(4’)),4.32(br,1H,H-C(5’)),3.90(t,J＝4.5Hz,1H,H-C(7’)),3.66,3.65(2s,6H,MeO),3.31(br,1H,OH),2.36(dd,J＝16.5,8.1Hz,1H,H-C(3’)),2.04(ddd,J＝12.0,9.9,2.0Hz,1H,H-C(2’)),1.92–1.69(m,3H,H-C(2’),H-C(6’))。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ164.92(CONH),158.64(MeO-C-arom),152.60(C(2)),151.28(C(4)),149.61(C(6)),145.44(C-arom),140.71(C(8)),136.77,133.65(C-arom),132.72,130.15,130.12,128.73,128.39,128.04,127.96,127.02(CH-arom),123.27(C(5)),113.28(CH-arom),87.11(C(1’)),87.01(C(Ph)3),85.60(C(4’)),78.16(C(7’)),72.72(C(5’)),55.28(MeO-DMTr),48.89(C(3’)),39.93(C(6’)),37.55(C(2’))。
ESI+-HRMS m/z计算的C40H38O6N5([M+H]+)684.2817,发现684.2800。
实施例47
(3’S,5’R,7’R)-N6-苯甲酰基-9-{5’-O-[(2-氰乙氧基)-二异丙基氨基膦基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-7’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-α-D-呋喃核糖基}腺嘌呤(47)
在室温向核苷46(199mg，0.290mmol)和5-(乙硫基)-1H-四唑(57mg，0.44mmol)的无水DCM溶液(7mL)中滴加2-氰乙基N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰胺(0.16mL，0.49mmol)。搅拌60分钟后，将反应混合物用饱和NaHCO3(20mL)稀释，并用DCM(3×20mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(EtOAc,+0.5％Et3N)纯化粗产物，得到47(197mg，两种异构体的混合物，77％)，为白色泡沫。
47的数据：Rf＝0.75(5％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.98(br,1H,NH),8.68,8.67(2s,1H,C(2)),7.94(d,J＝7.6Hz,2H,H-arom),7.90,7.84(2s,1H,C(8)),7.56–7.49(m,1H,H-arom),7.48–7.34(m,4H,H-arom),7.30–7.10(m,7H,H-arom),6.80–6.69(m,4H,Harom),6.21,6.15(2dd,J＝6.8,2.2Hz,1H,H-C(1’)),4.69,4.59(2dd,J＝7.3,4.5Hz,1H,H-C(4’)),4.44(tt,J＝12.3,6.3Hz,1H,H-C(5’)),3.90(dd,J＝9.0,3.8Hz,1H,H-C(5’)),3.82–3.63(m,8H,MeO,OCH2CH2CN),3.59–3.43(m,2H,(Me2CH)2N),2.61–2.49(m,2H,OCH2CH2CN),2.47–2.07(m,2H,H-C(3’),H-C(2’)),1.98–1.66(m,3H,H-C(2’),H-C(6’)),1.15–1.03(m,12H,(Me2CH)2N)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.67(CONH),158.77(MeO-C-arom),152.58(C(2)),151.34,151.29(C(4)),149.46(C(6)),145.55,145.54(C-arom),141.58,141.50(C(8)),136.87,136.85,136.84,133.85(C-arom),132.85,130.26,130.23,130.20,128.97,128.47,128.43,128.02,127.96,127.08(CH-arom),123.62,123.58(C(5)),117.91,117.70(OCH2CH2CN),113.37(CH-arom),87.80,87.67(C(1’)),87.20,87.14(C(Ph)3),85.29,85.22((JC,P＝4.2,3.1Hz,C(4’)),78.16,77.96(C(7’)),74.28,73.98(JC,P＝14.8,18.4Hz,C(5’)),58.80,58.61(JC,P＝16.2,17.3Hz OCH2CH2CN),55.37,55.35(MeO-DMTr),49.02,48.91(C(3’)),43.29,43.16(JC,P＝8.9,9.0Hz,((Me2CH)2N),39.09(C(6’)),37.99,37.95(C(2’)),24.82,24.77,24.74,24.70,24.64((Me2CH)2N),20.43,20.42(JC,P＝1.4,1.9Hz,OCH2CH2CN)。
31P NMR(121MHz,CDCl3)δ148.14,148.11。
ESI+-HRMS m/z计算的C45H56O7N8P([M+H]+)884.3895,发现884.3904。
实施例48
(3’R,5’R,7’R)2-氨基-6-氯-9-{7’-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-α-D-呋喃核糖基}嘌呤(48)
在0℃将核苷20(1.78g，3.01mmol)溶于0.5M NaOH的THF/甲醇/H2O(5:4:1,15mL)溶液中。在0℃将反应搅拌20分钟并通过加入NH4Cl(484mg)淬灭。然后将悬浮液用饱和NaHCO3(100mL)稀释，并用DCM(4×75mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(3％MeOH的DCM溶液)纯化粗产物，得到48(α-端基异构体，992mg，60％)和21(β-端基异构体，428mg，25％)，为白色泡沫。
48的数据：Rf＝0.34(5％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.71–7.60(m,5H,H-arom,H-(C(8)),7.49–7.34(m,6H,H-arom),6.08(dd,J＝6.9,2.6Hz,1H,H-C(1’)),5.26(s,2H,NH2),4.70(dd,J＝7.5,4.8Hz,1H,H-C(4’)),4.47(dt,J＝10.0,5.1Hz,1H,H-C(5’)),4.11(t,J＝3.3Hz,1H,H-C(7’)),2.87(dd,J＝16.5,7.7Hz,1H,H-C(3’)),2.57(br,1H,OH),2.27(ddd,J＝14.0,9.9,2.6Hz,1H,H-C(2’)),2.10–2.01(m,1H,H-C(6’)),1.92–1.76(m,2H,H-C(2’),H-C(6’)),1.06(s,9H,(CH3)3-C-Si)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ159.09(C(2)),153.05(C(4)),151.46(C(6)),139.91(C(8)),135.71(CH-arom),133.96,133.27(C-arom),130.00,129.96,127.86,127.83(CH-arom),125.52(C(5)),86.46(C(1’)),84.92(C(4’)),77.40(C(7’)),72.63(C(5’)),50.55(C(3’)),40.92(C(6’)),36.78(C(2’)),26.88((CH3)3-C-Si),19.01((CH3)3-C-Si)。
ESI+-HRMS m/z计算的C28H33O3N5ClSi([M+H]+)550.2036,发现550.2019。
实施例49
(3’R,5’R,7’R)-9-{7’-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-α-D-呋喃核糖基}鸟嘌呤(49)
在室温向核苷48(610mg，1.03mmol)的无水DCM溶液(15mL)中加入3-羟基丙腈(0.28mL，4.12mmol)，然后加入1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯(287mg，2.06mmol)。在室温搅拌4小时后，加入第二份3-羟基丙腈(0.28mL，3.23mmol)，接着加入1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯(287mg，2.06mmol)。将反应物进一步搅拌2天，然后通过CC(10％MeOH的DCM溶液)直接纯化，得到49(500mg，87％)，为白色泡沫。
49的数据：Rf＝0.30(10％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.73–7.61(m,5H,H-arom,H-C(8)),7.53–7.32(m,6H,H-arom),6.06(dd,J＝6.9,3.7Hz,1H,H-C(1’)),4.74(dd,J＝7.0,4.6Hz,1H,H-C(4’)),4.46–4.36(m,1H,H-C(5’)),4.11(br,1H,H-C(7’)),2.91(dd,J＝16.2,6.6Hz,1H,H-C(3’)),2.31(ddd,J＝13.8,10.0,3.7Hz,1H,H-C(2’)),1.98–1.78(m,3H,H-C(2’),H-C(3’)),1.07(s,9H,(CH3)3-C-Si)。
13C NMR(101MHz,MeOD)δ159.30(C(2)),155.14(C(6)),152.38(C(4)),137.28(C(8)),136.93,136.88(CH-arom),135.13,134.78(C-arom),131.07,131.06,128.91,128.89(CH-arom),117.98(C(5)),87.72(C(1’)),86.25(C(4’)),79.21,(C(7’))73.87(C(5’)),52.13(C(3’)),41.44(C(6’)),38.35(C(2’)),27.42((CH3)3-C-Si),19.82((CH3)3-C-Si))。
ESI+-HRMS m/z计算的C28H34O4N5Si([M+H]+)532.2386,发现532.2367。
实施例50
(3’R,5’R,7’R)-N2-乙酰基-9-{5’-O-乙酰基-7’-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-α-D-呋喃核糖基}鸟嘌呤(50)
在室温向核苷49(500mg，0.940mmol)和4-二甲基氨基吡啶(276mg，2.4mmol)的无水DCM溶液(15mL)中加入乙酸酐(1.0mL，10.3mmol)。搅拌2天后，通过加入饱和NaHCO3(30mL)淬灭反应。然后将混合物用DCM(3×30mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(3.5％MeOH的DCM溶液)纯化粗产物，得到50(441mg，76％)，为白色泡沫。
50的数据：Rf＝0.62(10％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ12.11(br,1H,NH-C(4)),9.94(br,1H,H-N(1)),7.62(d,J＝6.7Hz,5H,H-arom,H-C(8)),7.46–7.31(m,6H,H-arom),6.03(dd,J＝6.7,2.7Hz,1H,H-C(1’)),5.31(dt,J＝10.3,5.2Hz,1H,H-(C5’)),4.99–4.81(m,1H,H-C(4’)),4.02(d,J＝3.8Hz,1H,H-C(7’)),2.88(dd,J＝16.0,6.6Hz,1H,H-C(3’)),2.44–2.20(m,4H,MeCONH,H-C(2’)),2.12–1.73(m,6H,MeCO2,H-C(6’),H-C(2’)),1.04(s,9H,(CH3)3-C-Si)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ172.73(MeCONH),170.46(MeCO2),155.87(C(6)),148.09(C(4)),147.47(C(2)),137.13(C(8)),135.74(CH-arom),133.62,133.29(C-arom),130.13,130.09,127.96,127.93(CH-arom),121.54(C(5)),86.47(C(1’)),82.81(C(4’)),76.60(C(7’)),74.37(C(5’)),51.23(C(3’)),37.04,37.01,(C(2’),C(6’))26.92((CH3)3-C-Si),24.46(MeCONH),21.00(MeCO2),19.05((CH3)3-C-Si)。
ESI+-HRMS m/z计算的C32H38O6N5Si([M+H]+)616.2586,发现616.2580。
实施例51
(3’S,5’R,7’R)-N2-乙酰基-9-{5’-O-乙酰基-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-7’-羟基-α-D-呋喃核糖基}鸟嘌呤(51)
在室温向核苷50(440mg，0.714mmol)的无水THF溶液(5mL)中加入TBAF(1M的THF溶液，1.1mL，1.1mmol)。在室温将溶液搅拌4小时，然后通过CC(13％MeOH的DCM溶液)直接纯化，得到51(235mg，87％)，为白色泡沫。通过在H2O/MeOH的混合物中重结晶获得适于X射线分析的晶体。
51的数据：Rf＝0.25(13％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,MeOD)δ8.03(s,1H,H-C(8)),6.28(dd,J＝7.0,3.8Hz,1H,H-C(1’)),5.21(ddd,J＝9.2,6.8,5.1Hz,1H,H-C(5’)),4.98(dd,J＝6.7,5.0Hz,1H,H-(4’)),4.13–4.05(m,1H,H-C(7’)),3.17–3.05(m,1H,H-C(3’)),2.86(ddd,J＝13.8,10.0,3.8Hz,1H,H-C(2’)),2.39–2.27(m,1H,H-C(2’)),2.24(s,3H,MeCONH),2.16–2.00(m,5H,MeCO2,H-C(6’))。
13C NMR(101MHz,MeOD)δ174.95(MeCONH),172.32(MeCO2),157.50(C(6)),149.96(C(4)),149.38(C(2)),139.66(C(8)),121.76(C(5)),88.23(C(1’)),84.23(C(4’)),75.83(C(5’),C(7’)),51.65(C(3’)),38.04,37.93(C(2’),C(6’)),23.83(MeCONH),20.71(MeCO2)。
ESI+-HRMS m/z计算的C16H20O6N5([M+H]+)378.1408,发现378.1419。
实施例52
(3’S,5’R,7’R)-N2-乙酰基-9-{5’-O-乙酰基-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-7’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-α-D-呋喃核糖基}鸟嘌呤(52)
在室温向核苷51(186mg，0.492mmol)的无水吡啶溶液(10mL)中加入DMTr-Cl(501mg，1.48mmol)。将溶液搅拌2天，然后用饱和NaHCO3(40mL)稀释，并用DCM(3×30mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(0.5％MeOH的DCM溶液，3％ Et3N)纯化粗产物，得到52(333mg，99％)，为黄色泡沫。
52的数据：Rf＝0.56(10％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ12.05(br,1H,NH-C(4)),9.90(br,1H,H-N(1)),7.40(s,1H,H-C(8)),7.38–7.31(m,2H,H-arom),7.28–7.08(m,7H,H-arom),6.75(dd,J＝9.0,2.7Hz,4H,H-arom),5.95–5.85(m,1H,H-C(1’)),5.30–5.10(m,1H,H-C(5’)),4.70–4.58(m,1H,H-C(4’)),3.81(br,1H,H-C(7’)),3.68,3.68(2s,6H,MeO),2.25–2.07(m,5H,MeCONH,H-C(3’),H-C(2’)),1.96–1.79(m,5H,MeCO2,H-C(2’),H-C(6’)),1.74–1.59(m,1H,H-C(6’))。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ172.65(MeCONH),170.42(MeCO2),158.73,158.70(MeO-C-arom),155.86(C(6)),147.96(C(4)),147.43(C(2)),145.31(C-arom),137.17(C(8)),136.69,136.44(C-arom),130.32,130.21,128.29,128.05,127.09(CH-arom),121.53(C(5)),113.38,113.35(CH-arom),87.25(C(Ph)3),86.73(C(1’)),82.77(C(4’)),77.19(C(7’)),74.37(C(5’)),55.38(MeO-DMTr),49.28(C(3’)),37.25(C(2’)),36.06(C(6’)),24.40(MeCONH),21.01(MeCO2)。
ESI+-HRMS m/z计算的C37H38O8N5([M+H]+)680.2715,发现680.2718。
实施例53
(3’S,5’R,7’R)-N2-(N,N-二甲基亚胺甲基)-9-{2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-7’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-α-D-呋喃核糖基}鸟嘌呤(53)
在室温向核苷52(333mg，0.490mmol)的无水MeOH溶液(10mL)中加入K2CO3(305mg，2.20mmol)。在室温将该悬浮液搅拌7小时，然后加入NH4Cl(78mg，1.46mmol)，并将所得混合物通过短的SiO2垫过滤。用另外的MeOH洗涤SiO2，然后蒸发溶剂。
将粗产物溶于无水DMF(10mL)中，并加入N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(0.33mL，2.5mmol)。将溶液在55℃搅拌2小时，然后减压除去溶剂。通过CC(0.5％MeOH的DCM溶液，7％Et3N)纯化粗产物，得到53(245mg，77％)，为仍然含有痕量Et3N的白色泡沫。
53的数据：Rf＝0.32(12％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.75(br,1H,H-N(1)),8.25(s,1H,NCHN(CH3)2),7.37(d,J＝7.3Hz,2H,H-arom),7.29–7.08(m,8H,H-arom,H-C(8)),6.74(d,J＝8.1Hz,4H,H-arom),6.03(dd,J＝6.7,2.8Hz,1H,H-C(1’)),4.57(dd,J＝7.5,4.6Hz,1H,H-C(4’)),4.37–4.26(m,1H,H-C(5’)),3.89(t,J＝3.9Hz,1H,H-C(7’)),3.67,3.67(2s,6H,MeO),3.24(br,1H,OH),2.94(s,3H,NCHN(CH3)2),2.87(s,3H,NCHN(CH3)2),2.35(dd,J＝15.9,7.6Hz,1H,H-C(3’)),1.94–1.68(m,4H,H-C(2’),H-C(6’))。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ158.61(MeO-C-arom),158.28(C(2)),157.92(NCHN(CH3)2),156.69(C(6)),149.90(C(4)),145.52,136.86,136.77(C-arom),135.50(C(8)),130.15,128.32,127.92,126.95(CH-arom),120.27(C(5)),113.24(CH-arom),86.92(C(Ph)3),85.57(C(1’)),85.12(C(4’)),78.31(C(7’)),72.69(C(5’)),55.28(MeO-DMTr),49.28(C(3’)),41.38(NCHN(CH3)2),39.77(C(6’)),37.58(C(2’)),35.04(NCHN(CH3)2)。
ESI+-HRMS m/z计算的C36H39O6N6([M+H]+)651.2926,发现651.2921。
实施例54
(3’S,5’R,7’R)-N2-(N,N-二甲基亚胺甲基)-9-{5’-O-[(2-氰乙氧基)-二异丙基氨基膦酰基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-5’-O-[(4,4’-二甲氧基三苯基)甲基]-α-D-呋喃核糖基}鸟嘌呤(54)
在室温向核苷53(245mg，0.377mmol)和5-(乙硫基)-1H-四唑(74mg，0.57mmol)的无水DCM溶液(15mL)中滴加2-氰乙基N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰胺(0.20mL，0.64mmol)。搅拌50分钟后，将反应混合物用饱和NaHCO3(25mL)稀释，并用DCM(3×25mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(0.5％MeOH的DCM溶液，3％ Et3N)纯化粗产物，得到54(212mg，两种异构体的混合物，67％)，为白色泡沫。
54的数据：Rf＝0.42(7％ MeOH的DCM溶液)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.35(br,1H,H-N(1)),8.51,8.49(2s,1H,NCHN(CH3)2),7.41–7.10(m,10H,H-arom,H-C(8)),6.83–6.70(m,4H,H-arom),6.15–6.00(m,1H,H-C(1’)),4.64–4.36(m,2H,H-C(4’),H-C(5’)),3.90–3.82(m,1H,H-C(7’)),3.80–3.62(m,8H,MeO,OCH2CH2CN),3.59–3.43(m,2H,(Me2CH)2N),3.04,3.02(2s,6H,NCHN(CH3)2),2.67–2.48(m,2H,OCH2CH2CN),2.32(ddd,J＝24.1,15.1,6.7Hz,1H,H-C(3’)),2.02–1.63(m,4H,H-C(2’),H-C(6’)),1.14–1.03(m,12H,(Me2CH)2N)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ158.76(MeO-C-arom),158.17,158.12(C(2)),158.03(NCHN(CH3)2),156.66,156.59(C(6)),149.85,149.79(C(4)),145.51,145.49,136.84,136.77,136.73,136.71(C-arom),135.76,135.59(C(8)),130.24,130.20,128.41,128.33,128.02,127.10,127.08(CH-arom),120.74,120.70(C(5)),117.98,117.72(OCH2CH2CN),113.34(CH-arom),87.16,87.10(C(Ph)3),86.00,85.72(C(1’)),84.13,84.10(JC,P＝3.6,2.5Hz,C(4’)),78.02,77.67(C(7’)),74.15,73.74(JC,P＝15.3,18.7Hz,C(5’)),58.90,58.67(JC,P＝18.7,19.7Hz OCH2CH2CN),55.38,55.36(MeO-DMTr),49.20,49.09(C(3’)),43.20,43.15(JC,P＝12.4,12.6Hz,((Me2CH)2N),41.42,41.38(NCHN(CH3)2),38.68,38.65(C(6’)),37.97,37.84(C(2’)),35.25(NCHN(CH3)2),24.83,24.75,24.68,24.60,24.53((Me2CH)2N),20.35,20.28(OCH2CH2CN)。
31P NMR(121MHz,CDCl3)δ148.21,148.01。
ESI+-HRMS m/z计算的C45H56O7N8P([M+H]+)851.4004,发现851.4013。
实施例55
(3aR,4R,6R,6aS)-4-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-2-甲氧基六氢-2H-环戊二烯并[b]呋喃-6-基乙酸酯(4-硝基苯甲酸酯)(55)
在室温向糖6(195mg，0.437mmol)和4-二甲基氨基吡啶(70mg，0.568mmol)的无水DCM溶液(10mL)中加入4-硝基苯甲酰氯(158mg，0.850mmol)。过夜搅拌后，通过缓慢加入饱和NaHCO3(3mL)淬灭反应。然后将混合物用饱和NaHCO3(15mL)稀释，并用DCM(3×15mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(EtOAc/己烷1:5)纯化粗产物，得到端基异构比率α/β≈4：1的55(260mg，98％)的混合物，为白色固体。
55的数据：Rf＝0.62(EtOAc/己烷1:2)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.33–8.17(m,4H,H-arom),7.72–7.61(m,4H,H-arom),7.51–7.32(m,6H,H-arom),5.65–5.47(m,1H,H-C(6)),4.97(dd,J＝9.2,5.6Hz,1H,H-C(2)),4.87(t,J＝5.8Hz,1H,H-C(6a)),4.18(d,J＝5.0Hz,0.2H,H-C(4)),3.98(d,J＝3.5Hz,0.8H,H-C(4)),3.21(d,J＝15.1Hz,3H,MeO),2.88(dd,J＝16.6,7.9Hz,0.8H,H-C(3a)),2.75–2.62(m,0.2H,H-C(3a)),2.49–2.34(m,0.2H,H-C(5)),2.24–1.83(m,2.8H,H-(5),H-C(3)),1.28(ddd,J＝13.0,7.9,4.9Hz,1H,H-C(3)),1.09(s,9H,(CH3)3-C-Si)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ164.46,164.41(CO2R),150.63(O2N-C-arom),135.87,135.82(CH-arom),134.07,133.75,133.69(CH-arom),130.98,130.89,129.98,129.96,129.91,127.89,127.87,127.85,123.59(CH-arom),106.49,106.39(C(2)),83.21,79.87(C(6a)),76.54(C(4)),76.09(C(6)),54.55,54.47(MeO),51.69,50.30(C(3a),38.07(C(3)),37.17,36.65(C(5)),27.04,26.99 90((CH3)3-C-Si),19.14((CH3)3-C-Si)。
ESI+-HRMS m/z计算的C31H35O7NaSi([M+Na]+)584.2075,发现584.2085。
实施例56
(3’R,5’R,7’R)-1-{7’-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧基]-2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-5’-O-(4’-硝基苯甲酸)-α,β-D-呋喃核糖基}胸腺嘧啶(56)
在室温向糖55(260mg，0.463mmol)和胸腺嘧啶(84mg，0.695mmol)的无水MeCN溶液(3mL)中滴加BSA(0.34mL，1.4mmol)。在室温搅拌30分钟后，将溶液冷却至0℃并逐滴加入TMSOTf(0.10mL，1.3mmol)。进一步在0℃搅拌2小时并在室温搅拌18小时后，将反应混合物用饱和NaHCO3(30mL)稀释，并用DCM(4×40mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(2％ MeOH的DCM溶液)纯化粗产物，得到端基异构比率α/β≈88：12的56(240mg，79％)的混合物，为白色泡沫。
56的数据：Rf＝0.56(DCM+3％ MeOH)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.38(br,1H,(s,1H,H-N(3)),8.32–8.23(m,2H,H-arom),8.22–8.11(m,2H,H-arom),7.65(dd,J＝7.7,1.5Hz,4H,H-arom),7.50–7.36(m,6H,H-arom),6.95(d,J＝0.9Hz,1H,H-C(6)),5.96(t,J＝6.3Hz,1H,H-C(1’)),5.55(dt,J＝9.9,6.0Hz,1H,H-C(5’)),5.13(dd,J＝6.4,5.4Hz,1H,H-C(4’)),4.20–4.05(m,1H,H-C(7’)),2.94–2.78(m,1H,H-C(3’)),2.22(dd,J＝13.3,6.4Hz,1H,H-C(6’)),2.09–1.73(m,6H,H-C(6’),H-C(2’),Me-C(5)),1.09(s,9H,(CH3)3-C-Si)。
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ164.32,163.79(C(4),CO2R),150.65,150.39(O2N-C-arom,C(2)),135.70,135.68(CH-arom),135.13(C-arom),134.83(C(6)),133.46,133.10(C-arom),130.91,130.73,130.11,127.93,123.60(CH-arom),111.30(C(5)),87.26(C(1’)),82.44(C(4’)),76.40(C(7’)),76.07(C(5’)),50.76(C(3’)),37.94(C(6’)),36.68(C(2’)),26.89((CH3)3-C-Si),19.03((CH3)3-C-Si),12.62(Me-C(5))。
ESI+-HRMS m/z计算的C35H37O8N3NaSi([M+Na]+)678.2242,发现678.2254。
实施例57
(3’R,5’R,7’R)-1-{2’,3’-双脱氧-3’,5’-乙醇-7’-羟基-5’-O-(4-硝基苯甲酸)-α,β-D-呋喃核糖基}胸腺嘧啶(57)
在室温向核苷56(220mg，0.335mmol)的无水THF溶液(2mL)中加入TBAF(1M的THF溶液，0.84mL，0.84mmol)。室温搅拌4小时后，将反应混合物用饱和NaHCO3(20mL)稀释，并用EtOAc(3×20mL)和DCM(2×80mL)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过CC(5％ MeOH的DCM溶液)纯化粗产物，得到57的端基异构体混合物(101mg，72％)。通过在EtOAc中重结晶获得适于X射线分析的晶体。
57的数据：Rf＝0.50(DCM+7％ MeOH)；
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.96(br,1H,H-N(3)),8.34–8.17(m,4H,H-arom),7.07(d,J＝1.1Hz,1H,H-C(6)),6.11(t,J＝6.3Hz,1H,H-C(1’)),5.57–5.45(m,1H,H-C(5’)),5.15(dd,J＝6.6,5.4Hz,1H,H-C(4’)),4.38–4.23(m,1H,H-C(7’)),2.96(dd,J＝13.5,6.9Hz,1H,H-C(3’)),2.26(ddd,J＝13.1,10.3,5.4Hz,4H,H-C(2’),H-C(6’)),1.91(d,J＝0.9Hz,3H,Me-C(5))。
ESI+-HRMS m/z计算的C19H19O8N3Na([M+Na]+)440.1064,发现440.1072。
实施例58
设计和合成α端基异构单体的寡聚体
为了评估天然β-DNA链内修饰的适应性，制备了具有单个或多个插入胸苷结构单元6的寡脱氧核苷酸(ON16-20)。为了匹配β-DNA的几何结构，插入修饰以极性反转，产生3'-7'和5'-5个核苷键(参见图1和4)。为了测试该新系统与天然核酸的配对特性，还测试其自身的配对特性，制备了含有所有四个核碱基的完全修饰的ON21，以及其反平行(ON22)和平行(ON23)完全修饰的互补物。最后，合成了具有硫代磷酸酯连接的完全修饰的链(ON24)，目的是测试其潜在的反义特性。使用经典的自动亚磷酰胺化学进行合成。完全修饰的链以5'→7'方向合成。因此，DMTr保护基团从7'位置的完全裂解需要5％二氯乙酸的二氯乙烷溶液。在这些条件下，基于三苯甲基测定，偶联产率>98％。完全修饰的链可以通过在浓氨水中在55℃下顺利处理过夜而从通用固体支持物上完全裂解(进一步的合成和分析细节见下文)。
α端基异构寡核苷酸合成、去保护和纯化的方法
寡核苷酸合成在Pharmaci-Gene-Assembler-Plus DNA合成仪上以1.3μmol规模进行。天然DNA亚磷酰胺(dT、dC4bz、dG2DMF、dA6Bz)和固体支持物(dA-Q-CPG 500、dmf-dG-Q-CPG 500、Glen Unysuppo室温500)购自Glen Research。将天然DNA亚磷酰胺制备为0.1M的MeCN溶液，并使用4分钟步骤偶联。制备7’,5’-α-bc-DNA亚磷酰胺作为0.1M的1,2-二氯乙烷溶液，并使用延长的12分钟步骤偶联。使用5-(乙硫基)-1H-四唑(0.25M的MeCN溶液)作为偶联剂。用5％二氯乙酸的二氯乙烷溶液进行修饰核苷的脱三苯甲基化。用0.2M苯基乙酰基二硫化物的MeCN/吡啶(1:1)溶液进行硫化，反应时间为3.5分钟。在标准条件下进行加帽和氧化。通过用浓氨水在55℃处理16小时实现从固体支持物的切割和寡核苷酸的去保护。离心后，收集上清液，用H2O(0.5mL X2)进一步洗涤珠子，将得到的溶液蒸发至干。通过离子交换HPLC(Dionex-DNAPac PA200)纯化粗寡核苷酸。将pH 8.0的25mM Trizma水溶液的缓冲溶液用作流动相“A”，并将pH 8.0的25mM Trizma、1.25M NaCl的水溶液用作流动相“B”。对于硫代磷酸酯链，将pH 12.0的10mM NaOH水溶液的缓冲溶液用作流动相“A”，并将pH 12.0的10mM NaOH、2.50M NaCl的水溶液用作流动相“B”。然后用Sep-pack C-18柱将纯化的寡核苷酸脱盐。通过使用相应的天然DNA寡核苷酸的消光系数，用Nanodrop分光光度计测量260nm处的吸光度来确定浓度。通过ESI-质谱法或通过LC-MS进行寡核苷酸的表征。
实施例59
由α端基异构单体与互补DNA和RNA合成的修饰寡脱氧核苷酸的配对性质
通过260nm处的UV解链曲线评估寡核苷酸的双链体稳定性，并将它们的Tm与其天然DNA类似物进行比较(表1)。具有单一掺入的寡核苷酸ON16-17导致与DNA互补物的强烈去稳定化和与RNA的稍微降低的去稳定化。这种惩罚似乎是累积的并且其之前的两个位置被修饰的ON18的Tm进一步降低。然而，当连续引入两个或五个修饰时(ON19-20)，每个修饰的去稳定化相对于DNA降低至约-3℃，相对于RNA降低至约-1.3℃。这些数据表明DNA和7’,5’-α-bc-DNA之间的连接处诱导强烈去稳定化，取决于序列的情况其Tm有-4至-9℃的减值。已经观察到α-DNA(Aramini等,Nucleic Acids Res 1998,26,5644,Aramini等,Biochemistry1997,36,9715)和α-LNA(Nielsen等,Chemistry-AEuropean Journal 2002,8,712)通过异型主链连接的这种去稳定化。可以通过将修饰作为单元插入来补偿这种去稳定化。
表1.来自具有互补DNA和RNA的双链体的ON16-20的UV解链曲线(260nm)的Tm和ΔTm/mod数据。
a总链浓度2lM于10mM NaH2PO4,150mM NaCl,pH 7.0。
b A,G,T,C表示天然2‘-脱氧核苷；t(粗体类型)对应于修饰的核苷。
c未修饰的双链体的Tm,DNA/DNA:49.1℃,DNA/RNA:49.4℃
d未修饰的双链体的Tm,DNA/DNA:47.5℃,DNA/RNA:44.0℃
实施例60
由α端基异构单体合成的完全修饰的寡核苷酸的配对性质
正如预期的那样，所有三个完全修饰的序列ON21-23表现出与其平行DNA和RNA互补物但不与它们的反平行互补物的协同和可逆的解链行为(图5)。得到的7'，5'-α-bc-DNA/DNA双链体的稳定性略低于它们的天然对应物，每个修饰的去稳定化为-0.1至-0.5℃(表2)。令人惊讶的是，已发现ON21-23与RNA形成非常稳定的双链体，导致每个修饰的1.3至1.5℃的很大稳定性。完全修饰的链与具有单个或多个掺入的天然寡脱氧核苷酸链之间的稳定作用存在相当惊人的差异。这强调了合成完全修饰的链的重要性，以便表征新的配对系统。
表2.来自具有互补平行DNA和RNA的双链体的ON21-24的UV-解链曲线(260nm)的Tm和ΔTm/mod数据。
a总链浓度2μM于10mM NaH2PO4,150mM NaCl,pH 7.0。
b a,g,t,c分别对应于修饰的腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和甲基胞嘧啶，*表示硫代磷酸酯连接。
c未修饰的双链体的Tm,DNA/DNA:49.1℃,DNA/RNA:49.4℃
d未修饰的双链体的Tm,DNA/RNA:43.0℃
e未修饰的双链体的Tm,DNA/DNA:49.0℃,DNA/RNA:43.3℃
f未修饰的双链体的Tm,DNA/DNA:62.0℃,DNA/RNA:67.4℃
为了测试错配区分，用ON21进行UV解链实验，并且其平行DNA互补物在位置4具有所有三个可选的核碱基(表3)。这种错配具有很强的去稳定作用，并使Tm降低了-9.6至-14.3℃。与其天然对应物相比，7’,5’-α-bc-DNA具有更好的错配区分能力，Tm进一步降低了-1.0至-2.4℃。增加错配辨别力应降低潜在的脱靶效应，因此代表了反义候选者的吸引人的特性。在7’,5’-α-bc-DNA的情况下，用硫代磷酸酯连接进行的修饰很好地适应，并且在该修饰中报道的去稳定作用在每个核苷酸-0.5℃的范围内(Kurreck,J.European journalof biochemistry/FEBS 2003,270,1628)。与天然DNA相比，ON24对RNA保持良好的亲和力，稳定效应为0.6℃。
表3：来自双链体中的ON21和DNA1的UV解链曲线(260nm)的Tm值，其中互补DNA包含一个错配。
实验条件：总链浓度2μM于10mM NaH2PO4,150mM NaCl,pH 7.0a A,G,T,C表示天然2‘-脱氧核苷；a,g,t,c分别对应于修饰的腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和甲基胞嘧啶。
在其自身系列中，ON21对其反平行互补物ON22形成非常稳定的双链体，导致Tm意外为83.6℃。由于这种高Tm，只有在没有氯化钠的情况下才能观察到完整的经典S形转变，将Tm降低到68.6℃(表4)。有趣的是，双链体的形成导致低的减色性仅为10％(图5)。这表明碱基堆积不同于经典螺旋，因此可以预期形成具有偏离规范A或B双链体的几何形状的双链体。另一方面，在ON21和其平行互补物ON23之间没有观察到S形解链转变(图5)。发生的减色性变化与分别对两条单链进行的UV解链实验没有差别，这与单链内发生的碱基堆积有关。为了测试7’,5’-α-bc-DNA在A样螺旋内的匹配能力，对三环DNA(tc-DNA)(一种构象受限的RNA模拟物)进行了解链实验(Renneberg等,Journal of the American Chemical Society2002,124,5993.)。当ON21与互补平行的tc-DNA链(Tc1)混合时，观察到令人惊讶的81℃的高Tm，证明了7’,5’-α-bc-DNA适应该螺旋几何结构的能力。
表4.来自与ON21形成双链体的ON22-23和Tc1的UV解链曲线(260nm)的Tm值。
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a总链浓度2μM于10mM NaH2PO4,pH 7.0。
b a,g,t,c分别对应于修饰的腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和甲基胞嘧啶，a,g,t,c分别对应于三环-DNA腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和甲基胞嘧啶。
实施例61
α端基异构寡聚体双链体形成的热力学数据
根据已建立的方法，通过拟合实验解链曲线的曲线提取ON21与DNA和RNA及其天然对应物的双链体形成的热力学数据(Petersheim等,Biochemistry1983,22,256)(表5)。正如预期的那样，25℃时的自由能ΔG遵循与Tm数据相同的趋势，其中ON21·RNA是最受青睐的双链体。就天然系统而言，ON21与具有较低焓的天然核酸结合。然而，这种去稳定化通过熵增益得到补偿。这种行为在bc-DNA系列中是典型的，并且由乙烯桥添加的构象刚性产生。有趣的是，7’,5’-α-bc-DNA对RNA相对于DNA的选择性大部分是由焓驱动的。
表5：双链体形成的热力学数据。
a A,G,T,U,C表示核苷；a,g,t,c分别对应于修饰的腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和甲基胞嘧啶。
实施例62
α端基异构寡聚体的CD光谱
测量了与DNA、RNA或ON22形成双链体的ON21的CD光谱，并与相应的天然DNA/RNA双链体进行了比较(图6)。ON21与DNA或RNA的双链体都具有相对接近天然A/B螺旋的CD特征。然而，ON21/DNA双链体在210nm处不显示负信号，并且在226nm处的椭圆率蓝移5nm并且与振幅增益相关联。ON21/RNA双链体在226nm处具有较高正振幅的峰，并且在266处的正椭圆率蓝移4nm并形成更尖锐的峰。另一方面，修饰的同源双链体具有非常非典型的CD特征，其特征在于具有宽的负椭圆率、在275和300nm之间小振幅和在259nm和218nm处的两个正峰。与双链体形成时的低减色性变化一致，同源双链体的CD光谱表明形成了与常规螺旋不同的结构。
实施例63
α端基异构寡聚体的生物稳定性
在模拟生理条件下研究比较了其相应的天然寡核苷酸的完全修饰的寡核苷酸ON21的生物稳定性。将寡核苷酸在H2O和人血清的1：1混合物中于37℃温育，并通过20％变性PAGE分析反应结果。详细地，将ON21及其相应的天然寡核苷酸在1：1的H2O和人血清(来自人男性AB血浆，美国来源，无菌过滤(Sigma))的混合物中稀释至10μM。反应以20μL规模进行，并在37℃孵育。通过将寡核苷酸在10μM的H2O中在37℃温育24小时来进行对照反应(a，f)。通过加入甲酰胺(20μL)在特定时间停止反应。将所得混合物储存在-20℃，然后在90℃下热变性5分钟，然后通过20％变性PAGE分析。用全染色(stains-all)溶液进行可视化。
该实验显示在4小时后(d)已经完全消化了天然DNA链，其中修饰的寡核苷酸即使在24小时后也保持完全稳定(j)(图7)。7’,5’-α-bc-DNA修饰似乎赋予显著改善的生物稳定性。
实施例64
α端基异构寡聚体的补体C3活化
补体活化代表了通常与反义ON的体内使用相关的重要毒性反应。此外，用tc-DNA进行的体内试验偶尔会诱发这种急性毒性，因此限制了它们的使用。在这种情况下，特别感兴趣的是测试含有硫代磷酸酯核苷连接的7’,5’-α-bc-DNA的补体活化，并将其与充分表征的修饰的ON或天然ON进行比较。通过将小鼠血清样品与4mg/ml测试的ON在37℃温育45分钟进行实验。然后使用PanSpecific C3试剂然后用SC5b-9试剂盒通过ELISA分析小鼠C3补体活化。
与ON24(PS-7’,5’-α-bc-DNA支架)一起孵育导致C3补体蛋白水平低于天然DNA，但高于PS-DNA(图8)。蛋白质水平与无毒PO-tc-DNA相似。这些有希望的结果表明ON24不会显著活化补体。
实施例65
反义活性
杜氏肌营养不良症(DMD)是一种致死性肌肉退行性疾病，由DMD基因突变引起，导致肌肉蛋白外肌营养不良转录，最终缺乏功能性肌营养不良蛋白。在DMD中，异常的疾病相关的前mRNA转录物能够通过反义寡核苷酸(AO)在功能上恢复。这样的AO能够改变剪接模式，并且能够通过排除特定的肌营养不良蛋白外显子来纠正异常的框架肌营养不良蛋白转录物。从而恢复开放阅读框架并产生缩短但有功能的肌营养不良蛋白产物(Yang等,PloSone 2013,8,e61584)。7',5'-α-bc-DNA支架诱导外显子跳跃的能力在体外通过使用lipofectamine LTX用ON24转染来自mdx小鼠(杜氏肌营养不良的小鼠模型)的成肌细胞进行评估。将Mdx成肌细胞与7',5'-α-bc-DNA一起孵育，分离RNA，通过巢式RT-PCR扩增并通过凝胶(PAGE)分析。
结果表明高水平的外显子23跳跃，以及显著水平的外显子22和23的双重跳跃(图9)。对于有效恢复被破坏的阅读框的化合物，经常遇到这种双重外显子跳跃(Mann等,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 2001,98,42；Mann等,The journal of gene medicine2002,4,644；Yin等,J.Molecular therapy.Nucleic acids 2013,2,e124；Yang等,PloS one 2013,8,e61584)并证明了ON24对肌营养不良中治疗性外显子跳跃的效力。此外，7',5'-α-bc-DNA比tc-DNA诱导更高水平的外显子跳跃，已知该修饰在小鼠中具有显著的治疗效果(Goyenvalle等,Nat Med 2015,21,270)。因此，7',5'-α-bc-DNA支架满足在治疗性外显子跳跃中诱导强效应的先决条件。
实施例66
α-端基异构体的X射线晶体结构确定
获得单体的晶体，主要是为了证实7',5'-α-bc-DNA系列的相对构型，但也将该结构与从头开始计算得到的最小值进行比较。为了获得胸苷和鸟苷单体的晶体，在O3'处引入对硝基苯甲酸酯以使T单体(化合物57)能够结晶。该分子与EtOAc共结晶，产生低质量的晶体。得到的结构(图3中的a)采用C1'-endo、O4'-exo糖褶和碳环中的C6'-endo构象。该构象使假定位置的C5'取代基和假轴位置的C7'羟基取向。这种结构在糖褶中偏离了从头开始计算预测的最小值。然而，进一步的分析表明对硝基苯甲酸酯取代基扰乱了糖的构象。受保护的鸟苷51产生了优质的晶体。在这种情况下(图3中的b)，呋喃糖采用几乎完美的C1'-exo构象，而碳环则采用如上所述的几何形状。这次，结构与从头开始计算预测的最小构象之一完全匹配。
化合物57：在空气中将无色透明的[C19H19N3O8]2[0.5(C4H8O2)]晶体安装并用于在环境条件下测定X射线结构。所有测量均在Oxford Diffraction SuperNova区域-探测器衍射仪(Dupradeau等,Nucleic Acids Res 2008,36,D360)上进行，使用镜面光学单色Mo Kα辐射和Al过滤(Lu等,Nature protocols 2008,3,1213)。用于数据收集的晶胞常数和取向矩阵是从1.7°<θ<28.07°范围内的反射设定角的最小二乘法精修获得的。使用ω扫描收集总共440帧，曝光时间为15+15秒，每帧旋转角度为1°，晶体检测器距离为65.1mm，T＝223(2)K。使用CrysAlisPro程序执行数据缩减(Dupradeau等,Nucleic AcidsRes 2008,36,D360)。针对洛伦兹和偏振效应校正强度，并且应用基于使用CrysAlisPro中的SCALE3 ABSPACK的多扫描方法的吸收校正。表6中给出了数据集合和精修参数。使用SHELXT通过直接方法解析结构，其揭示了标题化合物的所有非氢原子的位置。各向异性地精修非氢原子。将所有H原子置于几何计算的位置并使用骑乘模型进行精修，其中每个H原子被赋予固定的各向同性位移参数，其值等于其母原子的1.2Ueq。使用全矩阵最小二乘法对F2进行结构精修，这使得函数Σw(Fo 2–Fc 2)2最小化。加权方案基于统计数据，包括减轻强烈反射的因素。所有计算均使用SHELXL-2014/7程序进行。该化合物在单斜晶系空间群C 2中结晶，单斜角非常接近90度，这意味着容易伪拟半孪晶(easy pseudo-merohedraltwinning)，其不易解卷积。此外，主分子的p-NO2-苯甲酸酯基团在两种构象上是无序的，并且共结晶的乙酸酯溶剂在两个轴上是无序的。由于所有这些原因，结构确定和精修有些复杂，计算了一些短的分子间接触，并且不能确定绝对构型(Flack参数是不现实的)，而是根据反应顺序分配。
表6：化合物57的晶体数据和结构精修
化合物51：在空气中将无色透明的[C16H19N5O6].(CH4O)晶体安装并用于在环境条件下测定X射线结构。所有测量均在Oxford Diffraction SuperNova区域-探测器衍射仪(Dupradeau等,Nucleic Acids Res 2008,36,D360)上进行，使用镜面光学单色Mo Kα辐射和Al过滤。用于数据收集的晶胞常数和取向矩阵是从1.5°<θ<27.2°范围内的反射设定角的最小二乘法精修获得的。使用ω扫描收集总共970帧，曝光时间为45++45秒，每帧旋转角度为1°，晶体检测器距离为65.1mm，T＝123(2)K。使用CrysAlisPro程序进行数据缩减。针对洛伦兹和偏振效应校正强度，并且应用基于使用CrysAlisPro中的SCALE3ABSPACK的多扫描方法的吸收校正。表7中给出了数据集合和精修参数。使用SHELXS-97通过直接方法解析结构，其揭示了标题化合物的所有非氢原子的位置。各向异性地精修非氢原子。将所有H原子置于几何计算的位置并使用骑乘模型进行精修，其中每个H原子被赋予固定的各向同性位移参数，其值等于其母原子的1.2Ueq。使用全矩阵最小二乘法对F2进行结构精修，这使得函数Σw(Fo2–Fc2)2最小化。加权方案基于统计数据，包括减轻强烈反射的因素。使用SHELXL-97程序(Lu等,Nature protocols2008,3,1213)进行所有计算。
表7：化合物51的晶体数据和结构精修
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实施例67
设计和合成β端基异构单体的寡聚体
使用经典的自动亚磷酰胺化学合成一系列具有结构单元12、14、19和25的单个和多个掺入的寡核苷酸以及完全修饰的序列(对于合成和分析细节，参见补充信息)。主要制备具有单个和多个掺入的寡核苷酸，以确定当与互补DNA和RNA复合时修饰对Tm的影响，以及确定Watson-Crick碱基配对选择性。合成完全修饰的寡核苷酸以不仅表征天然DNA和RNA的配对行为，而且还研究7',5'-bc-DNA的自配对。这里的主要兴趣是确定这种新型结构DNA类似物是否能够形成独立的碱基配对系统，该系统可能作为替代遗传系统而受到关注。
β端基异构寡核苷酸合成、去保护和纯化的方法
寡核苷酸合成在Pharmaci-Gene-Assembler-Plus DNA合成仪上以1.3μmol规模进行。天然DNA亚磷酰胺(dT、dC4bz、dG2DMF、dA6Bz)和固体支持物(dA-Q-CPG 500、dmf-dG-Q-CPG500、Glen Unysuppo室温500)购自Glen Research。将天然DNA亚磷酰胺制备为0.1M的MeCN溶液，并使用4分钟步骤偶联。制备Bc-DNA亚磷酰胺作为0.1M的1,2-二氯乙烷溶液，并使用延长的12分钟步骤偶联。使用5-(乙硫基)-1H-四唑(0.25M的MeCN溶液)作为偶联剂。在标准条件下进行加帽、氧化和去三苯甲基化。通过用浓氨水在55℃处理16小时实现从固体支持物的切割和寡核苷酸的去保护。离心后，收集上清液，用H2O(0.5mL X2)进一步洗涤珠子，将得到的溶液蒸发至干。完全修饰的序列在室温用NaOH(0.4M在H2O/MeOH 1:1中)进一步处理1小时以实现从通用支持接头的完全切割，然后使用旋转柱(Amicon Ultra0.5mL离心过滤器，MWCO 3kDa)过滤。通过离子交换HPLC(Dionex-DNAPac PA200)纯化粗寡核苷酸。将pH8.0的25mM Trizma水溶液的缓冲溶液用作流动相“A”，并将pH 8.0的25mM Trizma、1.25MNaCl的水溶液用作流动相“B”。然后用Sep-pack C-18柱将纯化的寡核苷酸脱盐。通过使用相应的天然DNA寡核苷酸的消光系数，用Nanodrop分光光度计测量260nm处的吸光度来确定浓度。通过ESI-质谱法进行寡核苷酸的表征。
实施例68
修饰的β-寡脱氧核苷酸与互补DNA和RNA的配对特性
为了确定单个和多个修饰对双链体稳定性的影响，制备了修饰的寡脱氧核苷酸ON1-ON11，如表8所示，并通过UV解链曲线分析测量了具有互补DNA和RNA的双链体的Tm值。
表8.来自具有互补DNA和RNA的双链体的ON1-ON11的UV解链曲线(260nm)的Tm和ΔTm/mod数据。
a总链浓度2|M于10mM NaH2PO4,150mM NaCl,pH 7.0。
b A,G,T,C表示天然2‘-脱氧核苷；a,t,g,c对应于修饰的核苷,c代表修饰的5-甲基胞嘧啶核苷。
c未修饰的双链体的Tm,DNA/DNA:49.1℃,DNA/RNA:49.4℃
d未修饰的双链体的Tm,DNA/DNA:47.5℃,DNA/RNA:44.0℃
根据ΔTm/mod数据，单或双修饰对热双链体稳定性的影响相对温和。嘌呤修饰(ON6,7)倾向于使具有互补DNA的双链体不稳定，但显示出与互补RNA的Tm略微增加。然而，在嘧啶系列中，存在更多的可变性。修饰的胸苷核苷(ON1-3)通常导致Tm的小幅下降，其中RNA作为互补物，而DNA没有观察到明显趋势。有趣的是，两种胞嘧啶修饰(ON4,5,8-10)都显著稳定了具有互补DNA的双链体，同时对具有互补RNA的Tm具有较小的影响。对于5-甲基胞嘧啶核苷，稳定作用更明显，这表明它有可能增强与相邻碱基对的堆叠相互作用。
为了确定与具有与修饰位点相反的所有三种可能的错配碱基的互补DNA的复合物中ON2的碱基配对选择性Tm(表9)。如预期的那样，错配双链体的Tm降低了5.1至13℃，其中GT摆动对最不稳定。这些数据与完全天然的错配系列相比较，表明修饰的碱基配对选择性没有显著变化。
表9.来自双链体中的ON2和DNA1的UV解链曲线(260nm)的Tm值，其中互补DNA包含一个错配。
实验条件：总链浓度2μM于10mM NaH2PO4,150mM NaCl,pH 7.0
实施例69
完全修饰的β-寡核苷酸与互补DNA和RNA的配对特性
制备仅由嘧啶碱基组成的完全修饰的九聚体(ON12)以及含有所有四种碱基的3个十二聚体(ON13-15)，以测试它们在反平行或平行方向上对互补DNA或RNA的亲和力。形成相应的Tm数据(表10)，显然结合通常很弱。即使在高盐(1M NaCl)条件下，对于ON12，在5-80℃的温度范围内反平行DNA或RNA补体也没有观察到解链转变，表明没有形成双链体。然而，随着较长的十二聚体ON13-15，用互补的反平行DNA和RNA观察到转变。与天然对照双链体相比，这些双链体的Tm低约30℃，相当于-2.5℃的平均ΔTm/mod。这不是单独掺入的Tm实验所预期的(表8)，并且突出了表征新型配对系统时完全修饰的寡核苷酸的重要性。重要的是，没有发现相应的平行DNA和RNA互补物形成双链体的迹象。这清楚地表明，7',5'-bc-DNA仍然能够通过反平行双链体结构与天然核酸连通，尽管基本上具有较低的亲和力水平。
表10.来自与互补反平行或平行DNA或RNA形成双链体的完全修饰的ON21-ON15的UV解链曲线(260nm)的Tm值。
实验条件：总链浓度：2lM于10mM NaH2PO4,1M NaCl,pH 7.0。a n.m.:未测量。bn.d.:由于形成相应RNA链的自身结构，Tm为28℃，因此检测不到。
实施例70
ON14设计为与ON13反平行，ON15是ON13的平行互补物。有了这个，就可以研究两个方向上7',5'-bc-DNA的自配对。结果表明，反平行双链ON13·ON14显示出典型的S形解链行为(图11)，Tm为54.5℃。与相同序列的天然双链体相比，这高出5.4℃。有趣的是，7',5'-bc-DNA双链体在260nm处的增色性仅相当于天然双链体的20％。这表明在两种双链构象中碱基的堆叠排列明显不同。在平行取向(ON13·ON15)中，未发现转变，证明在7',5'-bc-DNA中不能形成平行双链体。
实施例71
通过类似于已知方法的曲线拟合至实验解链曲线，确定双链体ON13·ON14和相应的天然双链体的转变焓和熵(表11)(Petersheim等,Biochemistry 1983,22,256)。这些数据表明天然双链体是焓稳定的，而7',5'-bc-DNA双链体是熵优势的。这与先前在bc-DNA系列中的发现相匹配，并暗示7',5'-bc-DNA主链的构象限制作为熵稳定的起源。双链体形成的自由焓(ΔG)与Tm数据一致，这使得它们有资格作为热力学双相稳定性的量度。
表11：双链体形成的热力学数据。
实施例72
β-端基异构寡聚体的β端基异构体的CD光谱
为了深入了解同7',5'-bc-DNA双链体和杂合7',5'-bc-DNA/DNA双链CD光谱的结构特性，并与相应的天然DNA双链体进行比较(图12)。正如预期的那样，天然双链体显示出B-DNA双链体的经典特征。然而，同7',5'-bc-DNA双链体具有与A-或B-型双螺旋显著不同的CD特征。其特征在于两个最小椭圆率，大约215和265nm，最大值为243nm。杂合双链体具有更接近DNA双链体的特征。与B-DNA相比，260nm处的最小椭圆率红移约15nm，而288nm处的最大椭圆率红移约7nm并且与振幅损失相关。因此，三个CD光谱中的差异表明基础堆叠内的碱基的差异排列，由每条链的主链几何形状的变化诱导。这与相应的UV解链曲线中两个配对系统的差异增色一致(图11)。
实施例73
7',5'-β-bc-DNA单体的X射线晶体结构
制备7',5'-bc-T类似物，在O7'处携带对硝基苯甲酸酯基团。该化合物可以结晶并解析其结构(图10)。除了建立7',5'-bc-DNA系列的相对构型的最终证据外，我们还获得了关于双环糖支架的优选构象的信息。很明显，呋喃糖部分以完美的1'-exo构象存在，而碳环以6'-endo构型存在，因此将氧取代基置于假轴中的C7'和假定赤道位置的5'OH基团中。该结构恰好与通过从头开始计算确定的两种低能构象异构体中的一种匹配。
化合物33：在空气中将无色透明的[C19H19N3O8]晶体安装并用于在环境条件下测定X射线结构。所有测量均在Oxford Diffraction SuperNova区域-探测器衍射仪(OxfordDiffraction(2010))上进行，使用镜面光学单色Mo Kα辐射和Al过滤(Macchi等,J.Appl.Cryst 2011,44,763.)。用于数据收集的晶胞常数和取向矩阵是从2.°<θ<27.°范围内的反射设定角的最小二乘法精修获得的。使用ω扫描收集总共530帧，曝光时间为2.5++2.5秒，每帧旋转角度为1°，晶体检测器距离为65.1mm，T＝173(2)K。使用CrysAlisPro(Version 1.171.34.44).Oxford Diffraction Ltd.,Y.,Oxfordshire,UK)程序进行数据缩减。针对洛伦兹和偏振效应校正强度，并且应用基于使用CrysAlisPro中的SCALE3 ABSPACK的多扫描方法的吸收校正。表12中给出了数据集合和精修参数。使用SHELXS-97(Sheldrick,Acta Cryst.2008,A64,112-122)通过直接方法解析结构，其揭示了标题化合物的所有非氢原子的位置。各向异性地精修非氢原子。将所有H原子置于几何计算的位置并使用骑乘模型进行精修，其中每个H原子被赋予固定的各向同性位移参数，其值等于其母原子的1.2Ueq。使用全矩阵最小二乘法对F2进行结构精修，这使得函数Σw(Fo 2–Fc 2)2最小化。加权方案基于统计数据，包括减轻强烈反射的因素。使用SHELXL-97程序(Macchi等,J.Appl.Cryst 2011,44,763)进行所有计算。
表12.化合物33的晶体数据和结构精修。
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Claims (24)

1.式(I)的化合物：
其中
T1和T2中的一个是OR1或OR2；
并且T1和T2中的另一个是OR1或OR2；其中
R1是H或羟基保护基，其中所述羟基保护基在每次出现时独立地选自乙酰基、苄基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯基甲基、4-单甲氧基三苯甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMTr)、4,4',4"-三甲氧基三苯甲基(TMTr)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)并且
R2是磷部分，其中所述磷部分是由式(X)表示的亚磷酰胺部分：
其中R5是甲基、乙基或2-氰基乙基；并且其中
R6和R7彼此独立地为C1-C3烷基或与它们所连接的氮原子一起形成杂环，其中所述杂环选自吡咯烷基、哌啶基或吗啉基，其中所述杂环任选被C1-C3烷基取代；并且其中
Bx是核碱基，所述Bx选自(i)腺嘌呤(A)、(ii)胞嘧啶(C)、(iii)5-甲基胞嘧啶(MeC)、(iv)鸟嘌呤(G)、(v)尿嘧啶(U)或(vi)5-甲基尿嘧啶(MeU)，或(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的核碱基衍生物；
其中所述核碱基衍生物选自甲基化腺嘌呤、甲基化鸟嘌呤、甲基化尿嘧啶和甲基化胞嘧啶；
或其中所述核碱基衍生物是(i)、(ii)、(iii)或(iv)的核碱基衍生物，其中各自的环外氨基受到酰基保护基或二烷基甲酰胺基保护基的保护。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中Bx选自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中所述式(I)的化合物是式(II)的化合物：
其中
(i)T1是OR1，并且T2是OR1或OR2；或者
(ii)T1是OR1或OR2，并且T2是OR1。
4.根据权利要求3所述的化合物，其中T1是OR1或OR2，并且T2是OR1。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中所述式(I)的化合物是式(III)的化合物：
其中
(i)T1是OR1，并且T2是OR1或OR2；或者
(ii)T1是OR1或OR2，并且T2是OR1。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中T1是OR1，并且T2是OR1或OR2。
7.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自：
8.一种寡聚体，其包含至少一种式(IV)的单体亚单元：
其中独立地对于所述至少一种式(IV)的单体亚单元中的每一个：T3或T4中的一个是核苷连接基团；
T3和T4中的另一个是OR1、OR2、5'末端基团、7'末端基团或核苷连接基团，其中R1是H或羟基保护基，其中所述羟基保护基在每次出现时独立地选自乙酰基、苄基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯基甲基、4-单甲氧基三苯甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMTr)、4,4',4"-三甲氧基三苯甲基(TMTr)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)；
R2是磷部分，其中所述磷部分是由式(X)表示的亚磷酰胺部分：
其中
R5是甲基、乙基或2-氰基乙基；并且其中
R6和R7彼此独立地为C1-C3烷基或与它们所连接的氮原子一起形成杂环，其中所述杂环选自吡咯烷基、哌啶基或吗啉基，其中所述杂环任选被C1-C3烷基取代；
或其中所述磷部分是由式(VIII)表示的磷酸酯部分，
其中Y是O或S；并且
其中R5和R5’各自为氢；并且
Bx是核碱基，所述Bx选自(i)腺嘌呤(A)、(ii)胞嘧啶(C)、(iii)5-甲基胞嘧啶(MeC)、(iv)鸟嘌呤(G)、(v)尿嘧啶(U)或(vi)5-甲基尿嘧啶(MeU)，或(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的核碱基衍生物；
其中所述核碱基衍生物选自甲基化腺嘌呤、甲基化鸟嘌呤、甲基化尿嘧啶和甲基化胞嘧啶；
或其中所述核碱基衍生物是(i)、(ii)、(iii)或(iv)的核碱基衍生物，其中各自的环外氨基受到酰基保护基或二烷基甲酰胺基保护基的保护；
其中每个核苷连接基团彼此独立地选自磷酸二酯连接基团、磷酸三酯连接基团、硫代磷酸酯连接基团、二硫代磷酸酯连接基团、膦酸酯连接基团、硫代膦酸酯连接基团、次膦酸酯连接基团、硫代磷酰胺连接基团或氨基磷酸酯连接基团。
9.根据权利要求8所述的寡聚体，其中Bx选自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤。
10.根据权利要求8所述的寡聚体，其中所述式(IV)的单体亚单元是式(V)的单体亚单元：
其中
(i)T3是核苷连接基团，并且T4是7'末端基团、OR1或OR2；或者
(ii)T3是5'末端基团、OR1或OR2；并且
T4是核苷连接基团；或
(iii)T3和T4彼此独立地为核苷连接基团。
11.根据权利要求10所述的寡聚体，其中
(i)T3是核苷连接基团，并且T4是7'末端基团或OR1；或
(ii)T3是5'末端基团或OR2；并且
T4是核苷连接基团；或
(iii)T3和T4彼此独立地为核苷连接基团。
12.根据权利要求8所述的寡聚体，其中所述式(IV)的单体亚单元是式(VI)的单体亚单元：
其中
(i)T3是核苷连接基团，并且T4是7'末端基团、OR1或OR2；或者
(ii)T3是5'末端基团、OR1或OR2；并且
T4是核苷连接基团；或
(iii)T3和T4彼此独立地为核苷连接基团。
13.根据权利要求12的寡聚体，其中
(i)T3是核苷连接基团，并且T4是7'末端基团或OR2；或者
(ii)T3是5'末端基团或OR1；并且
T4是核苷连接基团；或
(iii)T3和T4彼此独立地为核苷连接基团。
14.根据权利要求8所述的寡聚体，其中每个核苷连接基团彼此独立地为磷酸二酯连接基团或硫代磷酸酯连接基团。
15.根据权利要求8所述的寡聚体，其包含至少两个连续的式(IV)的单体亚单元，其中连续的式(IV)的单体亚单元中的每一个通过核苷连接基团而独立地连接至相邻的连续的式(IV)的单体亚单元，其中所述核苷连接基团连接两个连续的式(IV)的单体亚单元的5'末端和7'末端。
16.根据权利要求8所述的寡聚体，其由至少两个连续的式(IV)的单体亚单元组成，其中连续的式(IV)的单体亚单元中的每一个通过核苷连接基团而独立地连接至相邻的连续的式(IV)的单体亚单元，其中所述核苷连接基团连接两个连续的式(IV)的单体亚单元的5'末端和7'末端。
17.根据权利要求8所述的寡聚体，其中所述寡聚体包含至少一个核酸序列，其中所述核酸序列包含所述至少一个式(IV)的单体亚单元，并且其中所述核酸序列选自SEQ ID NO:1至24中任一个。
18.根据权利要求8所述的寡聚体，其中所述寡聚体由至少一个核酸序列组成，其中所述核酸序列包含所述至少一个式(IV)的单体亚单元，并且其中所述核酸序列选自SEQ IDNO:1至24中任一个。
19.根据权利要求17或18所述的寡聚体，其中所述核酸序列是SEQ ID NO:24。
20.根据权利要求10所述的寡聚体，其中所述寡聚体包含核酸序列，其中所述核酸序列由至少两个连续的式(V)的单体亚单元组成，其中所述核酸序列在其5'末端和其7'末端侧接至少一个核苷酸或核苷，所述核苷酸或核苷不同于式(V)的单体亚单元，
其中所述核酸序列的5'末端连接至不同于式(V)的单体亚单元的核苷酸或核苷的5'末端，并且其中所述核酸序列的7'末端连接至不同于式(V)的单体亚单元的核苷酸或核苷的3'末端。
21.根据权利要求12所述的寡聚体，其中所述寡聚体包含核酸序列，其中所述核酸序列由至少两个连续的式(VI)的单体亚单元组成，其中所述核酸序列在其5'末端和在其7'末端各自侧接至少一个不同于式(VI)的单体亚单元的核苷酸或核苷，
其中所述核酸序列的5'末端连接至不同于式(VI)的单体亚单元的核苷酸或核苷的3'末端，并且其中所述核酸序列的7'末端连接至不同于式(VI)的单体亚单元的核苷酸或核苷的5'末端。
22.根据权利要求8所述的寡聚体，其中所述(IV)的单体亚单元选自
23.根据权利要求8至22中任一项所述的寡聚体在生产用于预防、治疗或诊断疾病的药物中的用途，其中所述疾病是肌营养不良症。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述疾病是杜氏肌营养不良症。
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