CN102361981A - Tlr7的合成rna基激动剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型稳定的寡核糖核苷酸作为用于免疫疗法应用的免疫调节剂的治疗性用途。具体而言，本发明提供了具有改善的核酸酶和RNA酶稳定性并且通过TLR7选择性地引起免疫调节活力的新型RNA基寡核糖核苷酸。

Description

TLR7的合成RNA基激动剂
本专利申请主张2009年2月10日提交的美国临时专利申请No.61/151,211的优先权，该专利申请的公开内容通过引用而明确并入本文。
背景技术
技术领域
本发明一般而言涉及使用寡核糖核苷酸作为免疫调节剂的免疫学和免疫疗法应用领域。更具体而言，本发明涉及免疫调节RNA组合物及其用于通过Toll样受体7(TLR7)调节免疫应答的使用方法。
相关领域概述
根据参与免疫应答的细胞亚群，免疫应答包括先天性和继承性应答。例如，参与经典的细胞介导功能(如迟发性过敏反应和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活化)的辅助性T(Th)细胞为Th1细胞，而作为辅助性细胞参与用于B细胞活化的Th细胞为Th2细胞。免疫应答的类型受到在对抗原暴露的响应中所产生的细胞因子和趋化激素的影响。通过影响辅助性T细胞1(Th1)和辅助性T细胞2(Th2)之间的平衡，细胞因子提供了用于控制免疫应答的方式，Th1和Th2之间的平衡直接影响所产生的免疫应答类型。如果该平衡趋向于更多的Th1细胞，则发生细胞介导的免疫应答，其包括细胞毒性T细胞(CTL)的活化。当该平衡趋向于更多的Th2细胞时，则发生体液或抗体免疫应答。这些免疫应答中的每一种均导致从Th1和Th2细胞中分泌出不同类的细胞因子。Th1和Th2细胞所分泌的细胞因子的差异可能由这两种T细胞亚群的不同生物学功能导致。
Th1细胞参与了身体对抗原(例如，病毒感染、细胞内病原体和肿瘤细胞)的先天性应答。对抗原的初始应答可以是抗原呈递细胞(例如，活化的巨噬细胞和树突状细胞)的IL-12分泌和Th1细胞的相伴活化。活化Th1细胞的结果是某些细胞因子(例如，IL-2、IFN-γ以及其它细胞因子)的分泌和抗原特异性CTL的相伴活化。已知Th2细胞在对细菌、寄生虫、抗原和变态反应原的应答中被激活，并且它们可以通过某些细胞因子(例如，IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13以及其它细胞因子)和趋化激素的分泌来介导身体的继承性免疫应答(例如，免疫球蛋白的产生和嗜曙红细胞的活化)。这些细胞因子中的某些细胞因子的分泌可导致B细胞增殖且提高抗体产生。另外，这些细胞因子中的某些细胞因子可刺激或抑制其它细胞因子的释放(例如，IL-10抑制从Th1细胞中分泌IFN-γ和从树突状细胞中分泌IL-12)。最终，Th1和Th2细胞之间的平衡以及在对所选刺激物的应答中释放的细胞因子和趋化激素在身体免疫系统如何对疾病产生应答中可具有重要作用。例如，IFN-α可以抑制丙型肝炎，而MIP-1α和MIP-1β(也分别被称为CCL3和CCL4)可以抑制HIV-1感染。Th1/Th2免疫应答的最佳平衡提供了使用免疫系统治疗和预防多种疾病的机会。
例如通过含有未甲基化CpG二核苷酸的细菌或合成DNA的引入，可以在哺乳动物中引起Th1免疫应答，这种免疫应答由对被称为模式识别受体(PRR)的某些免疫细胞上的受体的特异寡核苷酸序列(例如，未甲基化的CpG)的存在所引起。这些PRR中的一些为Toll样受体(TLR)。
TLR密切参与在对微生物感染应答中引起先天性免疫应答。在脊椎动物中，TLR由已知可识别病原体相关分子模式(PAMP)的至少十一种蛋白质(TLR1至TLR11)家族组成。一些TLR位于细胞表面上以检测和发起对细胞外病原体的应答，而其它TLR位于细胞内部以检测和发起对细胞内病原体的应答。表1提供了TLR、因此已知的激动剂和已知含有TLR的细胞类型的代表(Diebold，S.S.等人(2004)Science 303：1529-31；Liew，F.等人(2005)Nature5：446-58；Hemmi，H.等人(2002)Nat.Immunol.3：196-200；Jurk，M.等人(2002)Nat.Immunol.3：499；Lee，J.等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：6646-51；Alexopoulou，L.(2001)Nature 413：732-38)。
表1
Figure BPA00001421721000021
Figure BPA00001421721000031
由配体和TLR之间的相互作用介导的信号转导途径由TLR家族中大部分成员所共享且与toll/IL-1受体(TIR域)、髓样分化标志物88(MyD88)、IL-1R-相关激酶(IRAK)、干扰素调节因子(IRF)、TNF受体相关因子(TRAF)、TGFβ-激活激酶1、IκB激酶、IκB和NF-κB有关(参见，例如Akira，S.(2003)J.Biol.Chem.278：38105和Geller等人(2008)Curr.Drug Dev.Tech.5：29-38)。更具体而言，对于TLR 1、2、4、5、6、7、8、9和11，这种信号级联开始于与膜结合TLR相互作用并将其激活的PAMP配体，其作为内体膜或细胞表面中的同型二聚体存在。激活后，受体经历构象变化以允许募集含有蛋白MyD88的TIR域，其是对除TLR3之外的所有TLR信号途径通用的衔接蛋白。MyD88募集IRAK4，其使得IRAK1磷酸化并激活。激活的IRAK1与TRAF6结合，其催化多聚泛素加入到TRAF6上。泛素的加入激活TAK/TAB复合物，其又使IRF磷酸化，从而导致NF-κB向核释放和输送。核中的NF-κB诱导促炎基因的表达(参见，例如Trinchieri和Sher(2007)Nat.Rev.Immunol.7：179-90)。
TLR的选择性定位以及由此所产生的信号为它们在免疫应答中的作用提供了一些见解。免疫应答根据参与该应答的细胞亚群而包括先天性和继承性应答。例如，参与经典细胞介导功能(如迟发性过敏反应和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活化)的辅助性T细胞为Th1细胞。该应答是身体对抗原(例如，病毒感染、细胞内病原体和肿瘤细胞)的先天性应答，并导致IFN-γ的分泌和CTL的相伴活化。
由于TLR参与调节炎症应答，已表明TLR在多种疾病的发病中起作用，所述疾病包括自身免疫疾病、传染病和炎症(Papadimitraki等人(2007)J.Autoimmun.29：310-18；Sun等人(2007)Inflam.Allergy Drug Targets 6：223-35；Diebold(2008)Adv.Drug Deliv.Rev.60：813-23；Cook，D.N.等人(2004)NatureImmunol.5：975-79；Tse和Horner(2008)Semin.Immunopathol.30：53-62；Tobias&Curtiss(2008)Semin.Immunopathol.30：23-27；Ropert等人(2008)Semin.Immunopathol.30：41-51；Lee等人(2008)Semin.Immunopathol.30：3-9；Gao等人(2008)Semin.Immunopathol.30：29-40；Vijay-Kumar等人(2008)Semin.Immunopathol.30：11-21)。
研究已表明了使用含有CpG二核苷酸的反义寡核苷酸的免疫应答刺激(Zhao，Q.等人(1996)Biochem.Pharmacol.26：173-82)。随后的研究显示TLR9识别细菌和合成DNA中存在的未甲基化的CpG基序(Hemmi，H.等人(2000)Nature 408：740-45)。含有CpG的硫代磷酸寡核苷酸的其它变型也可以影响它们通过TLR9起作用和调节免疫应答的能力(参见，例如Zhao等人(1996)Biochem.Pharmacol.51：173-82；Zhao等人(1996)Biochem.Pharmacol.52：1537-44；Zhao等人(1997)Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7：495-502；Zhao等人(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9：3453-58；Zhao等人(2000)Bioorg.Med.Chem.Lett.10：1051-54；Yu等人(2000)Bioorg.Med.Chem.Lett.10：2585-88；Yu等人(2001)Bioorg.Med.Chem.Lett.11：2263-67；和Kandimalla等人(2001)Bioorg.Med.Chem.9：807-13)。另外，结构活性关系研究以使得能够鉴别引起特定免疫应答谱的合成基序和新型DNA基结构，所述免疫应答谱不同于由未甲基化的CpG二核苷酸产生的那些谱(Kandimalla，E.R.等人(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA102：6925-30；Kandimalla，E.R.等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100：14303-08；Cong，Y.P.等人(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.310：1133-39；Kandimalla，E.R.等人(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.306：948-53；Kandimalla，E.R.等人(2003)Nucleic Acids Res.31：2393-400；Yu，D.等人(2003)Bioorg.Med.Chem.11：459-64；Bhagat，L.等人(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.300：853-61；Yu，D.等人(2002)Nucleic Acids Res.30：4460-69；Yu，D.等人(2002)J.Med.Chem.45：4540-48；Yu，D.等人(2002)Biochem.Biophys.Res.Commun.297：83-90；Kandimalla，E.R.等人(2002)Bioconjug.Chem.13：966-74；Yu，D.K.等人(2002)Nucleic Acids Res.30：1613-19；Yu，D.等人(2001)Bioorg.Med.Chem.9：2803-08；Yu，D.等人(2001)Bioorg.Med.Chem.Lett.11：2263-67；Kandimalla，E.R.等人(2001)Bioorg.Med.Chem.9：807-13；Yu，D.等人(2000)Bioorg.Med.Chem.Lett.10：2585-88；Putta，M.R.等人(2006)Nucleic Acids Res.34：3231-38)。然而，直到最近仍未知TLR7和TLR8的天然配体。
已表明TLR7和TLR8可识别病毒和合成单链RNA以及小分子，其包括多种核苷(Diebold，S.S.等人(2004)Science 303：1529-31)。Diebold等人表明IFN-α对流感病毒的应答需要流感基因组RNA的内体识别以及通过TLR7和MyD88实现的信号且将ssRNA鉴别为TLR7的配体。某些合成化合物，例如咪唑喹诺酮、咪喹莫特(R-837)和雷西莫特(R-848)，是TLR7和TLR8的配体(Hemmi，H.等人(2002)Nat.Immunol3：196-200；Jurk，M.等人(2002)Nat.Immunol 3：499)。另外，已表明诸如7-去氮-G、7-噻-8-氧代-G(TOG)和7-烯丙基-8-氧代-G(洛索立宾(loxoribine))等的某些鸟嘌呤核苷在高浓度时激活TLR7(Lee，J.等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：6646-51)。然而，还已知这些小分子(例如，咪喹莫特)通过其它受体起作用(Schon，M.P.等人(2006)J.Invest.Dermatol.126：1338-47)。
用于TLR7或TLR8识别的任何已知特异性ssRNA的缺乏以及潜在广泛的刺激性ssRNA分子表明TLR7和TLR8能够识别自身和病毒RNA。最近，研究表明当与N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N三甲基甲磺酸铵(DOTAP)或其它脂肪试剂复合时，某些富含GU的寡核糖核苷酸是免疫刺激性的并且通过TLR7和TLR8起作用(Heil等人(2004)Science 303：1526-29；Lipford等人，国际公开No.WO 03/086280；Wagner等人，国际公开No.WO 98/32462)。然而，RNA分子已经(例如)作为核糖酶使用了多年，并且最近还使用了siRNA和小RNA，用作核糖酶的RNA、siRNA和小RNA含有GU二核苷酸。另外，已显示多种这些RNA分子在存在脂肪的情况下通过TLR刺激引起免疫应答(Kariko等人(2005)Immunity 23：165-75；Ma，Z.等人(2005)Biochem.Biophys.Res.Commun.330：755-59)。然而，这些RNA分子的不稳定性阻碍了这些分子在许多领域(例如，人疾病的预防和治疗)中的使用和应用进展。
含有核糖或脱氧核糖的寡核苷酸和寡脱氧核苷酸已用于多个领域中，包括(但不限于)诊断探针、PCR引物、基因表达的反义抑制、siRNA、小RNA、适体、核糖酶和基于Toll样受体(TLR)的免疫治疗剂。最近，很多出版物已指出寡脱氧核苷酸在很多疾病的免疫治疗应用中用作免疫调节剂以及它们单独使用或用作佐剂，所述疾病诸如过敏症、哮喘、自身免疫疾病、癌和传染病。
通过TLR9识别DNA寡核苷酸而通过TLR7和/或TLR8识别RNA寡核苷酸，这很可能是由于DNA和RNA之间结构构象的差异所造成的。然而，DNA和RNA之间的化学差异还使得DNA在化学和酶学方面远比RNA稳定。
RNA被普遍存在的细胞外核糖核酸酶(RNase)快速降解，这确保少量(如果有的话)自身ssRNA到达抗原呈递细胞。核酸的核酸外切酶降解作用主要是3′-核酸酶消化，而较少的部分是通过5′-核酸外切酶作用的。除核酸外切酶消化之外，RNA还可以通过RNA酶的核酸内切酶活力而被降解。到目前为止，RNA基分子必须与脂肪复合以提供对核酸酶的稳定性。
尽管这些核糖核酸酶提供了防止自体免疫反应性这一必需功能，但是对于设计用于免疫疗法的任何合成ssRNA分子来说，这些核糖核酸酶还存在相当大的问题，这是因为核糖核酸酶将快速降解合成ssRNA和天然ssRNA两者。为了克服该障碍，已经尝试通过将ssRNA包封在脂质体中、将其与聚氮丙啶缩合或将其复合到如N-[1-(2，3二油酰氧基)-丙基]-N，N，N-三甲基甲磺酸铵(DOTAP)的分子上来保护ssRNA分子不被降解。然而，这些保护措施是应用于仍不稳定的ssRNA的次级手段，并且这些保护措施对ssRNA(天然的或合成的ssRNA)的体内效力和免疫调节活力的影响仍不清楚。
Agrawal等人(美国专利申请公布No.2008/0171712)描述了与TLR7和TLR8结合的一类新型SIMRA组合物。然而，仍然存在开发与TLR7选择性结合的化合物的需求。理想地，可以通过设计可以用作新型免疫治疗剂的固有稳定性RNA基分子来满足这种需求，所述RNA基分子将用于多种临床相关应用中，如当共施用时改善疫苗接种效果，或者当引起或增强免疫应答有益时治疗和/或预防疾病，例如癌、自体免疫病症、气道炎症、炎性病症、传染病、皮肤病、过敏症、哮喘或由病原体引起的疾病。
发明内容
在第一个方面，本发明提供了新型稳定的免疫调节RNA(SIMRA)化合物(以下将进一步限定)，其特异地激活TLR7，并且提供了所述化合物在引起和/或增强通过TLR7的免疫应答中的用途。根据本发明的新型化学实体提供了在引诱免疫应答方面明显更有效并且明显更不易被降解的免疫应答引诱和/或增强化合物。根据本发明的方法使得能够使用TLR7特异性SIMRA来改变用于免疫疗法应用的细胞因子和/或趋化因子谱。
在第一个方面的另一实施方式中，本发明提供了作为佐剂的TLR7特异性SIMRA化合物。
在第二个方面，本发明提供了药物组合物。这些组合物包含至少一种根据本发明所述的TLR7特异性SIMRA组合物和生理学可用或药物可用载体。
在第三个方面，本发明提供了在个体中产生免疫应答的方法，该方法包括向脊椎动物施用至少一种根据本发明的TLR7特异性SIMRA化合物。
在第四个方面，本发明提供了用于治疗性治疗患有疾病或病症的个体的方法，其中在该疾病或病症下，引起和/或增强免疫应答对是有益的，所述疾病或病症例如为癌、自体免疫病症、气道炎症、炎性病症、传染病、皮肤病、过敏症、哮喘或由病原体引起的疾病，这种方法包括以药物有效量向患有该病症或疾病的患者施用至少一种根据本发明的TLR7特异性SIMRA化合物。
在第五个方面，本发明提供了用于在脊椎动物中预防其中引起和/或增强免疫应答将对其有益的疾病或病症的方法，所述疾病或病症例如，癌、自体免疫病症、气道炎症、炎性病症、传染病、皮肤病、过敏症、哮喘或由病原体引起的疾病，这种方法包括向易患该病症或疾病的脊椎动物以药物有效量施用至少一种根据本发明的TLR7特异性SIMRA化合物。
在第六个方面，本发明提供了分离能够产生细胞因子或趋化激素的细胞(例如，免疫细胞，PBMC)、在标准细胞培养条件下培养这些细胞、用根据本发明的至少一种TLR7特异性SIMRA化合物离体处理这些细胞从而所分离的细胞产生或分泌更高水平的细胞因子或趋化激素、以及向需要细胞因子或趋化激素疗法的患者施用或再施用经处理的细胞以用于疾病的预防或治疗的方法。
在本发明的该方面的其它实施方式中，结合一种或多种根据本发明的TLR7特异性SIMRA化合物和/或一种或多种TLR7和/或TLR8激动剂，向需要细胞因子或趋化激素疗法来预防或治疗疾病的患者施用根据第六方面的、分离的、经TLR7特异性SIMRA处理的细胞。
附图说明
图1是用于根据本发明的TLR7特异性SIMRA化合物的平行合成的合成方案。DMTr＝4，4′-二甲氧基三苯甲基；CE＝氰乙基。根据实施例1合成了本发明的TLR7特异性SIMRA化合物。
具体实施方式
本发明涉及寡核糖核苷酸作为免疫调节剂用于免疫疗法应用的治疗性使用。具体地，本发明提供了具有改善的体内稳定性的RNA基寡核苷酸，其选择性地调节通过TLR7的免疫应答(TLR7特异性SIMRA化合物)。通过起始不同的先天性和获得性免疫应答机制，例如通过用稳定的TLR7特异性SIMRA化合物激活树突状细胞及其它抗原呈递细胞，所得的细胞因子谱可以导致病原体、受感染细胞或肿瘤细胞的破坏和抗原特异性抗体的发展以及CTL应答。因此，本发明提供了一组TLR7特异性SIMRA化合物，它们中的每一种均具有其自身独特的免疫调节特性。以这种方式，可以通过提供对适应症具有所需类的免疫调节特性的TLR7特异性SIMRA化合物来为不同的医学适应症定制免疫应答的范围和性质。本文所引用的授权专利、专利申请和参考文献以似乎将它们中的每一个具体并单独指明作为参考并入的相同程度作为参考并入本文。在本文所引用的任何参考文献的任何教导内容与本说明书不一致的情况下，对于本发明来说，应以本说明书为准。
本发明提供了使用TLR7特异性SIMRA化合物来增强免疫应答的方法。这些方法将在免疫疗法应用中获得使用，如(但不限于)癌、自体免疫病症、哮喘、呼吸过敏症、食物过敏症、皮肤过敏症以及细菌、寄生虫和病毒感染的治疗，以及作为疫苗佐剂在成人和儿童应用中以及兽医应用中的使用。因此，本发明还提供了对免疫疗法具有最佳免疫调节作用水平的新型TLR7特异性SIMRA化合物以及制备和使用这些化合物的方法。另外，本发明的TLR7特异性SIMRA化合物作为佐剂，或者与不消除TLR7特异性SIMRA化合物对疾病预防和治疗的免疫调节作用的对治疗疾病或病况有用的试剂结合是有用的。
定义
术语“2′-取代的核糖核苷”或“2′-取代的阿拉伯糖苷”一般包括其中戊糖部分的2’位置上的羟基被取代以产生2′取代的或2′-O-取代的核糖核苷的核糖核苷或阿拉伯核糖核苷。在某些实施方式中，这种取代是用含有1-6个饱和或不饱和碳原子的低级烃基基团、卤素原子或具有6-10个碳原子的芳基基团取代的，其中该烃基或芳基基团可以是未取代的或可以是取代的，例如，用卤素、羟基、三氟甲基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、烷氧基、羧基、烷氧羰基或氨基取代。本发明的阿拉伯糖核苷包括(但不限于)阿拉伯糖-G、阿拉伯糖-C、阿拉伯糖-U、阿拉伯糖-A。2′-O-取代的核糖核苷或2′-O-取代的阿拉伯糖苷的实例无限制地包括2′-氨基、2′-氟代、2′-烯丙基、2′-O-烷基和2’-炔丙基核糖核苷或阿拉伯糖苷、2′-O-甲基核糖核苷或2’-O-甲基阿拉伯糖苷和2′-O-甲氧基乙氧基核糖核苷或2’-O-甲氧基乙氧基阿拉伯糖苷。
当用于表示方向时，术语“3′”一般是指相对于相同多核苷酸或寡核苷酸的另一区域或位置的3′(朝向糖的3′位置)方向的多核苷酸或寡核苷酸中的区域或位置。
当用于表示方向时，术语“5′”一般是指相对于相同多核苷酸或寡核苷酸的另一区域或位置的5′(朝向糖的5′位置)方向的多核苷酸或寡核苷酸中的区域或位置。
术语“约”通常表示确切的数值并不关键。因此，寡核糖核苷酸中的核糖核苷残基数目并不关键，并且考虑具有一个或两个较少核糖核苷或阿拉伯糖核苷残基，或者一个至几个其它核糖核苷或阿拉伯糖核苷残基的寡核糖核苷酸作为上述每个实施方式的等价物。
术语“佐剂”一般是指当加入到如疫苗或抗原的免疫原性试剂中时，一旦暴露于该混合物后将增强或加强受体宿主对所述试剂的免疫应答的物质。
术语“气道炎症”一般无限制地包括呼吸道中由传染性变态反应原所引起的炎症，其包括哮喘。
术语“变态反应原”一般是指抗原或分子(通常为蛋白质)的抗原部分，其一旦暴露于受试者后将引起变态反应。通常，如通过(例如)红斑风团测试或本领域中已知的任何方法所指明的，受试者对变态反应原过敏。即使仅有一小部分受试者在暴露于分子时表现出过敏性(例如，IgE)免疫应答，则仍将该分子称为是变态反应原。
术语“过敏症”一般无限制地包括食物过敏症、呼吸过敏症和皮肤过敏症。
术语“抗原”一般是指被抗体或T细胞抗原受体识别并选择性结合的物质。抗原可以包括(但不限于)肽、蛋白质、核苷、核苷酸和它们的组合。抗原可以是天然的或合成的，并且一般引起对该抗原特异的免疫应答。
术语“自体免疫病症”一般是指其中“自身”抗原经受免疫系统攻击的病症。
阻断3′或5′降解或者“帽”或“加帽”表示将寡核糖核苷酸的3′或5′端连接到另一个分子(例如，接头或其它非RNA核苷酸)上以充分抑制核酸酶降解(例如，3′核酸外切酶降解)。
术语“载体”通常涵盖了任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油剂、脂肪、含脂囊泡、微球、脂质体包覆或在用于药物制剂的领域中熟知的其它材料。应理解载体、赋形剂或稀释剂的特性将取决于特定应用的施用途径。在(例如)由A.Gennaro编辑，由Mack Publishing Co.，Easton，PA于1990年出版的Remington′s Pharmaceutical Sciences(第18版)中说明了含有这些材料的药物可用制剂的制备。
术语“共施用”一般是指在足够近的时间内施用至少两种不同的物质以调节免疫应答。共施用包括至少两种不同物质的同时施用。
术语“互补”一般表示具有与核酸杂交的能力。这种杂交通常是互补链之间氢键键合的结果，从而优选地形成了沃森-克里克(Watson-Crick)或霍氏(Hoogsteen)碱基对，尽管其它模式的氢键键合和碱基堆积也可以导致杂交。
术语“免疫调节寡核糖核苷酸”一般是指当施用于如鱼、鸟或哺乳动物的脊椎动物时，引起或抑制免疫应答的寡核糖核苷酸。
术语“结合”通常表示在治疗相同患者中的相同疾病的过程中，并且它包括施用TLR7特异性SIMRA化合物以及用于治疗疾病或病况但不会消除TLR7特异性SIMRA化合物的免疫调节作用的试剂。这种施用可以采用任何顺序，包括同时施用或共施用，以及从相隔几秒钟至长达几天或从相隔几分钟至几天或从相隔几分钟至几小时的时间间隔。这种组合治疗还可以包括TLR7特异性SIMRA化合物的不止一次施用和/或独立地施用所述试剂。可以通过相同或不同途径施用TLR7特异性SIMRA化合物和所述试剂。
术语“个体”或“受试者”一般是指哺乳动物，如人。哺乳动物通常包括(但不限于)人、非人的灵长类、大鼠、小鼠、猫、狗、马、牛、母牛、猪、羊和兔。
术语“线性合成”一般是指从免疫调节寡核糖核苷酸的一端开始并线性地进行到另一端的合成。线性合成允许将相同或不相同(就掺入的长度、碱基组成和/或化学变型而言)的单体单元掺入到免疫调节寡核糖核苷酸中。
术语“接头”一般是指可以通过糖、碱基或主链以共价或非共价键连接到寡核糖核苷酸上的任何部分。接头可以用于连接两个或更多个核苷或者可以连接到寡核糖核苷酸中的5′和/或3′末端核苷酸。该接头可以是非核苷酸接头或核苷酸接头。
术语“变型的核苷”一般是包含变型的杂环碱基、变型的糖部分或它们的任意组合的核苷。在一些实施方式中，变型的核苷是非天然嘧啶或嘌呤核苷，如本文所述的。对本发明来说，变型的核苷、嘧啶或嘌呤类似物或非天然存在的嘧啶或嘌呤可以替换使用并且表示包含非天然存在的碱基和/或非天然存在的糖部分的核苷。对本发明来说，如果碱基不是鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶，则认为它是非天然的。在一些实施方式中，变型的核苷是可以取代至寡核糖核苷酸的所选位置的2′-取代的核糖核苷、阿拉伯糖核苷或2′-脱氧-2′-取代-阿拉伯糖苷，从而在不干扰TLR7活力的情况下改善了稳定性。
术语“调节”或“刺激”一般是指可以由应答的引起和/或增强所产生的变化，如应答的提高或应答的定性差异。
术语“非核苷酸接头”一般是指可以通过共价或非共价键连接到寡核糖核苷酸上的核苷酸键以外的化学部分。优选地，这种非核苷酸接头的长度为约2埃至约200埃并且可以处于顺势或反式取向。
术语“核苷酸键”一般是指通过它们的糖将两个核苷相连的化学键(例如，3′-3′、2′-3′、2′-5′、3′-5′)，其由相邻核苷之间的磷酸酯、非磷酸酯、带电或中性基团(例如，磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯)组成。
术语“肽”一般是指无论肽是否为半抗原，具有足够长度和组成以影响生物反应(例如，抗体产生或细胞因子活力)的多肽。术语“肽”可以包括变型的氨基酸(无论是天然存在的或是非天然存在的)，其中这些变型包括(但不限于)磷酸化、糖基化、聚乙二醇化、酯化和甲基化。
术语“药物可用的”或“生理学可用的”一般是指不干扰根据本发明的化合物的有效性并且与如细胞、细胞培养物、组织或有机体的生物系统相容的材料。优选地，所述生物系统为活体，如脊椎动物。
术语“药物有效量”一般是指足以产生所需生物效应(如有益结果)的量。因此，“药物有效量”将取决于其所施用的背景。可以在一个或多个预防性或治疗性施用中施用药物有效量。
术语“SIMRA”一般是指稳定的免疫调节RNA化合物，其中所述化合物可以含有单链RNA(ssRNA)和/或双链RNA(dsRNA)，以及保护或稳定其3′端的变型(例如，通过阻断3′降解作用或通过对3′端加帽或通过连接两个或更多个寡核糖核苷酸的3′端)，但前提条件是SIMRA比未变型的寡核糖核苷酸的体内稳定性更高或将更高，并因此影响其免疫调节能力。SIMRA可以包含变型的寡核糖核苷酸。SIMRA化合物还可以包含保护其5′端的变型(例如，通过阻断5′降解作用或对5′端加帽)以进一步改善寡核糖核苷酸的稳定性。SIMRA可以是直链或支链的，其中核酸是通过(例如)磷酸二酯键、硫代磷酸酯键或交替的键连接的核糖核苷的聚合物。SIMRA可以由共价连接到核糖残基或其衍生物上的嘌呤(腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)或其衍生物(例如，7-去氮-G、阿拉伯糖-G和阿拉伯糖-A))或嘧啶(胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)或其衍生物(例如，阿拉伯糖-C和阿拉伯糖-U))碱基组成。
术语“治疗”一般是指旨在获得有益或所需结果的方法，所述有益或所需结果可以包括症状的减轻或疾病进展的延缓或改善。
术语“病毒性疾病”一般是指以病毒作为其病原的疾病，其包括(但不限于)乙型肝炎、丙型肝炎、流感、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)和带状疱疹。
在第一个方面，本发明提供了新型TLR7特异性SIMRA化合物。本专利申请显示保护其3′端的免疫调节寡核糖核苷酸的变型(例如，通过阻断3′降解作用或对3′端加帽或通过连接两个或更多个寡核糖核苷酸的3′端)显著影响了其免疫调节能力。另外，已确定这种保护显著改善了寡核糖核苷酸的稳定性，从而消除了对脂肪结合或其它保护方式的需要。此外，除了保护3′端外或与保护3′端结合，阻断5′降解作用或对5′端加帽也可以改善寡核糖核苷酸的稳定性。
在本发明中，证明了TLR7的激活以及新型SIMRA化合物对独特免疫应答(例如，细胞因子和/或趋化激素谱的变化)的引起。因此，本专利申请意外地显示通过TLR7细胞因子和/或趋化激素的激活，可以通过使用变型的化学结构来调节与之有关的谱，所述变型的化学结构包括作为免疫调节寡核糖核苷酸的一部分的变型的碱基、变型的糖、主链、接头、键和/或帽。
在一个实施方式中，本发明提供了免疫调节化合物，其包含在它们的3′端或者通过核苷间键或官能化的核碱基或糖连接至非核苷酸接头的至少两个RNA基寡核苷酸。本发明的该实施方式可以具有至少一个可接近的5′端，其可以是加帽或未加帽的。已确定这种结构在不需要脂肪结合或其它保护的情况下为TLR7特异性SIMRA化合物提供了进一步的稳定性(例如，核酸外切酶活力的抑制)。“可接近的5′端”表示未以防止TLR7特异性SIMRA化合物调节通过TLR7的免疫应答的方式变型TLR7特异性SIMRA的5′末端。
在本发明该方面的另一个实施方式中，包含至少两个寡核糖核苷酸，其中免疫调节化合物所具有的结构包括(但不限于)表2中的式I-IV。
表2寡核糖核苷酸式I-IV
Figure BPA00001421721000131
域A、B和C的长度可以独立地为约2至约35个核糖核苷酸，并且在一些实施方式中，为约2至约20个，或者约2至约12个，或者约2至约11个，或者约2至约8个核糖核苷酸。域A、B和C可以是相同的或者可以是不同的。域A、B和C可以独立地为具有或不具有自互补域的5′-3′或2′-5′RNA、同型或异型核糖核苷酸序列或接头。如式IV中所使用的，“n”可以从1至无限大的数。
“X”是可以通过3′或5′键连接域A、B和/或C或对它们加帽的接头、磷酸基团、核碱基、非RNA核苷酸、或可以是脂肪族、芳族、芳基、环状、手性、非手性的非核苷酸接头、肽、碳水化合物、脂肪、脂肪酸、单乙二醇、三聚或六聚乙二醇或杂环部分，或它们的组合。
在其它实施方式中，本发明提供了TLR7特异性SIMRA化合物，其包含通过非核苷酸接头连接的至少两个寡核糖核苷酸，其中所述免疫调节寡核糖核苷酸的序列可以是至少部分自互补的。寡核糖核苷酸的互补序列允许分子间氢键键合，借此使寡核糖核苷酸具有二级结构。其它的寡核糖核苷酸可以结合在一起，借此产生了根据本发明的寡核糖核苷酸链或多聚体，例如式IV中所示的。
类似的考虑适用于具有不同碱基序列的免疫调节寡核糖核苷酸之间的分子间碱基配对。因此，在多个免疫调节寡核糖核苷酸一起使用的情况下，所述多个免疫调节寡核糖核苷酸可以(但不需要)包含至少部分彼此互补的序列。在一个实施方式中，所述多个免疫调节寡核糖核苷酸包含具有第一序列的免疫调节寡核糖核苷酸和具有第二序列的免疫调节寡核糖核苷酸，其中所述第一序列和所述第二序列至少40％或至少50％互补。例如，在至少50％互补的两个8聚体之间，它们可以形成4、5、6、7或8个G-C、A-U和/或G-U摆动碱基对。这些碱基对可以(但不必需)包含位于互补免疫调节寡核糖核苷酸的任一端的碱基。互补性的程度可以取决于免疫调节寡核糖核苷酸之间的比对，并且这种比对可以或可以不包含单个或多个核苷突出。在其它实施方式中，互补性的程度为至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。
如本领域技术人员将认识到的，所示免疫调节化合物可以具有二级结构，这是因为域序列是互补的，从而允许分子间氢键键合。此外，如表2中式III和IV所指明的，其它连接的RNA基寡核苷酸可以通过分子间氢键键合结合，借此产生了链或多聚体，其中可以掺入任意数目的连接的RNA基寡核苷酸。
在另一个实施方式中，本发明提供了免疫调节化合物，其包含在它们的3′或5’端或者通过核苷间键或官能化的核碱基或糖连接至非核苷酸接头的至少两个RNA基寡核苷酸，并且其中接头(例如，帽)连接到至少一个5′端。已确定这种结构为TLR7特异性SIMRA化合物提供了进一步的稳定性(例如，核酸外切酶活力的抑制)。未以防止TLR7特异性SIMRA化合物调节通过TLR7的免疫应答的方式变型TLR7特异性SIMRA的5′末端。
在一些实施方式中，寡核糖核苷酸的每一个均独立地具有约2至约35个核糖核苷残基。因此，在某些实施方式中，所述寡核糖核苷酸可以独立地为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核糖核苷酸长。优选地，所述寡核糖核苷酸为约4至约30个核糖核苷残基，更优选地，为约4至约20个核糖核苷残基或约4至约11个核糖核苷残基。在一些实施方式中，免疫调节寡核糖核苷酸包含具有约1至约18、或约1至约11，或约5至约14个核糖核苷残基的寡核糖核苷酸。在一些实施方式中，一个或多个所述寡核糖核苷酸具有11个核糖核苷酸或约8至约14个核糖核苷酸或约10至约12个核糖核苷酸。在免疫调节寡核糖核苷酸的情况下，优选的实施方式具有约1至约35个核糖核苷酸，优选地具有约5至约26个核糖核苷酸，更优选地具有约13至约26个核糖核苷酸。优选地，所述免疫调节寡核糖核苷酸包含至少一个磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯核糖核苷间键。
在示例性实施方式中，每个核糖核苷单元包含杂环碱基和戊呋喃糖基、海藻糖、阿拉伯糖、2′-脱氧-2′-取代的阿拉伯糖、2′-O-取代的核糖或阿拉伯糖或己糖基团。核糖核苷残基可以通过任何多种已知的核糖核苷间键彼此连接。这些核糖核苷间键无限制地包括磷酸二酯核糖核苷间键(Po)、硫代磷酸酯核糖核苷间键(Ps)、二硫代磷酸酯核糖核苷间键、烷基膦酸酯核糖核苷间键、烷基硫代膦酸酯核糖核苷间键、磷酸三酯核糖核苷间键、氨基磷酸酯核糖核苷间键、硅氧烷核糖核苷间键、碳酸酯核糖核苷间键、烷氧羰基核糖核苷间键、乙酰亚胺核糖核苷间键、氨基甲酸酯核糖核苷间键、吗啉代核糖核苷间键、硼烷核糖核苷间键、硫醚核糖核苷间键、桥连的氨基磷酸酯核糖核苷间键、桥连的亚甲基膦酸酯核糖核苷间键、桥连的硫代磷酸酯核糖核苷间键和磺基核糖核苷间键或它们的任意组合。
另外，示例性寡核糖核苷酸可以通过这些核糖核苷间键的任意组合进行连接，其无限制地包括交替的磷酸二酯键和硫代磷酸酯键(例如，N1PoN2PsN3PoNnPs，其中N是根据本发明的核糖核苷)、磷酸二酯键片段接着硫代磷酸酯键片段(例如，N1PoN2PoN3PoNnPoN1PsN2PsN3PsNnPs，其中N是根据本发明的核糖核苷)和硫代磷酸酯键片段接着磷酸二酯键片段(例如，N1PsN2PsN3PsNnPsN1PoN2PoN3PoNnPo，其中N是根据本发明的核糖核苷)。
在下式V中指明了核糖核苷酸的可能共轭位点，其中B表示杂环碱基。
Figure BPA00001421721000161
本发明的TLR7特异性SIMRA化合物可以包括天然存在的核糖核苷、变型的核糖核苷或它们的混合物。
在本发明中，通过掺入某些化学变型从而导致引起免疫应答，由人TLR7识别了新型TLR7特异性SIMRA化合物。这些化学变型包括(但不限于)鸟嘌呤类似物，如7-去氮-G、阿拉伯糖-G、6-硫代-G、肌苷、异-G、洛索立宾(loxoribine)、TOG(7-硫代-8-氧)-G、8-溴-G、8-羟基-G、5-氨基间型霉素B、氧代间型霉素、7-甲基-G、9-对氯苯基-8-氮杂-G、9-苯基-G、9-己基-鸟嘌呤、7-去氮-9-苯甲基-G、6-氯-7-去氮鸟嘌呤、6-甲氧基-7-去氮鸟嘌呤、8-氮杂-7-去氮-G(PPG)、2-(二甲基氨基)鸟苷、7-甲基-6-硫代鸟苷、8-苄氧基鸟苷、9-去氮鸟苷和1-(B-D-呋喃核糖基)-2-氧-7-去氮-8-甲基-嘌呤。化学变型还包括(但不限于)腺嘌呤类似物，如9-苯甲基-8-羟基-2-(2-甲氧乙氧基)腺嘌呤、2-氨基-N2-O-、甲基腺苷、8-氮杂-7-去氮-A、7-去氮-A、阿拉伯糖-A、阿糖腺苷(Vidarabine)、2-氨基腺苷、N1-甲基腺苷、8-氮杂腺苷和5-碘杀结核菌素。化学变型还包括(但不限于)胞嘧啶和尿嘧啶类似物，如假尿苷、阿拉伯糖-C、阿拉伯糖-U、5-甲基胞苷、4-硫代尿苷、N4-乙基尿苷、折布拉林(zebularine)、5-氨基烯丙基尿苷、N3-甲基尿苷和5-氟尿苷。
根据本发明的“免疫调节寡核糖核苷酸”是TLR7特异性SIMRA化合物，其包含通过非核苷酸或核苷酸接头在它们的3′-或2′-端或官能化核糖或官能化核糖核碱基上共价或非共价连接的至少两个寡核糖核苷酸。非共价键包括(但不限于)静电相互作用、疏水性相互作用、π堆积相互作用和氢键键合。
在一些实施方式中，非核苷酸接头可以包括(但不限于)表3中所列的那些。
表3代表性非核苷酸接头
Figure BPA00001421721000171
在一些实施方式中，小分子接头为甘油或化学式HO-(CH2)o-CH(OH)-(CH2)p-OH所表示的甘油同系物，其中o和p独立地为1至约6，1至约4或1至约3的整数。在一些其它实施方式中，小分子接头是1，3-二氨基-2-羟基丙烷的衍生物。这类衍生物中的一些用化学式HO-(CH2)m-C(O)NH-CH2-CH(OH)-CH2-NHC(O)-(CH2)m-OH表示，其中m为0至约10，0至约6，2至约6或2至约4的整数。
根据本发明的一些非核苷酸接头允许连接不止两个寡核糖核苷酸，如表2中化学式II所示的。例如，小分子接头甘油具有三个羟基，在这三个羟基上可以共价连接寡核糖核苷酸。因此，根据本发明的一些免疫调节寡核糖核苷酸包含在它们的3′端连接至非核苷酸接头的不止两个寡核糖核苷酸(例如，域C等，其它的域包含如上对域A、B、C和D所定义的寡核糖核苷酸)。
使用自动合成仪和亚磷酰胺法可以方便地合成本发明的免疫调节寡核糖核苷酸。在一些实施方式中，所述免疫调节寡核糖核苷酸是通过线性合成法合成的。替代性的合成模式为“平行合成”，其中合成是从中间接头部分向外合成的(参见图1)。连接了固体载体的接头可用于平行合成，如美国专利No.5912332中所述的。作为另外一种选择，可以使用通用固体载体(如连接了磷酸盐的可控孔度玻璃)。
与线性合成相比，免疫调节寡核糖核苷酸的平行合成具有几个优点：(1)平行合成允许掺入相同的单体单元；(2)与线性合成不同，两个(或全部)单体单元是同时合成的，从而合成的步骤数以及合成所需的时间与单体单元的相同；和(3)合成步骤的减少改善了最终免疫调节寡核糖核苷酸产品的纯度和得率。
在合成方案结束时，如果掺入了变型的核苷，则用浓缩的氨溶液或如亚磷酰胺供应商所推荐的，可以方便地对免疫调节寡核糖核苷酸脱保护。优选地，通过反相HPLC纯化免疫调节寡核糖核苷酸产品，并对它们进行去三苯甲基化、脱盐和透析。
表4显示了根据本发明的TLR7特异性SIMRA化合物。除非另作说明，否则所有核苷均为核糖核苷，并且所有键均为硫代磷酸酯键。
Figure BPA00001421721000191
Figure BPA00001421721000201
在第二个方面，本发明提供了包含根据本发明的TLR7特异性SIMRA化合物和药物可用载体的药物制剂。
在第三个方面，本发明提供了在脊椎动物中产生TLR7介导的免疫应答的方法，该类方法包括向所述脊椎动物施用根据本发明的TLR7特异性SIMRA化合物。在一些实施方式中，所述脊椎动物为哺乳动物。在优选的实施方式中，将根据本发明的TLR7特异性SIMRA化合物施用于需要免疫调节的脊椎动物。
在第四个方面，本发明提供了治疗性治疗患有疾病或病症的患者的方法，该类方法包括向所述患者施用根据本发明的TLR7特异性SIMRA化合物。在多种实施方式中，所治疗的疾病或病症是其中免疫调节可以是所期望的那一种，其包括(但不限于)癌、自体免疫病症、传染病、气道炎症、炎性病症、过敏症、哮喘或由病原体引起的疾病。病原体包括细菌、寄生虫、真菌、病毒、类病毒和朊病毒。
在第五个方面，本发明提供了预防疾病或病症的方法，该类方法包括向患者施用根据本发明的TLR7特异性SIMRA化合物。在多种实施方式中，所预防的疾病或病症是其中免疫调节可以是所期望的那一种，其包括(但不限于)癌、自体免疫病症、气道炎症、炎性病症、传染病、过敏症、哮喘或由病原体引起的疾病。病原体包括细菌、寄生虫、真菌、病毒、类病毒和朊病毒。
在第六个方面，本发明提供了预防或治疗病症的方法，该类方法包括分离能够产生细胞因子或趋化激素的细胞(包括(但不限于)免疫细胞、B细胞、调节性T细胞、B-细胞，PBMC、pDC和淋巴样细胞)、在标准细胞培养条件下培养这些细胞、用TLR7特异性SIMRA离体处理这些细胞从而使所分离的细胞产生或分泌较高水平的细胞因子或趋化激素，和向需要细胞因子或趋化激素疗法的患者施用或再施用所处理的细胞以用于疾病的预防或治疗。本发明的该方面将根据标准继承性细胞免疫疗法技术进行以产生激活的免疫细胞。
在本发明的该方面的一些实施方式中，可以从患有或未患有疾病或病症的受试者中分离能够产生细胞因子或趋化激素的细胞。这种分离可以包括鉴别和选择并且可以使用标准细胞分离程序进行，其包括以下具体实施例中所说明的那些。根据标准细胞培养程序并使用标准细胞培养条件培养这些分离的细胞，其可以包括以下具体实施例中所说明的培养程序和条件。在本发明的该实施方式的其它方面，在存在至少一种根据本发明的TLR7特异性SIMRA的情况下，以与不存在根据本发明的一种或多种TLR7特异性SIMRA的情况下培养的分离的细胞相比足以引起、提高或增强细胞因子和/或趋化激素的产生和/或分泌的量和时间段来培养所分离的细胞。该时间可以从秒至分、至小时、至天。这些分离的TLR7特异性SIMRA处理的细胞可以在向供体再施用后或向第二组织学相容患者施用后使用，其中该供体或第二患者需要细胞因子和/或趋化激素引起的、提高的或增强的产生和/或分泌。例如，向供体再施用或向患有癌、自体免疫病症、气道炎症、炎性病症、传染病、过敏症、哮喘或由病原体引起的疾病的第二患者施用。可以使用多种模式完成这种再施用或施用，包括导管或注射施用或者任何其它有效的途径。本发明的该方面还可以在引起免疫应答能力有限或不完全的患者或者缺乏免疫性的患者(例如，感染HIV的患者和骨髓移植患者)中使用。本发明的该方面还可以与向施用或再施用了分离的TLR7特异性SIMRA处理的细胞的患者施用根据本发明的TLR7特异性SIMRA结合使用。
在根据本发明的任何方法中，本发明的TLR7特异性SIMRA化合物可以通过单独产生直接免疫调节作用或结合用于治疗或预防疾病或病况但不消除TLR7特异性SIMRA化合物的免疫调节作用的任何其它试剂来不同地作用。在根据本发明的任何方法中，用于治疗或预防疾病或病况的试剂包括(但不限于)疫苗、抗原、抗体(优选单克隆抗体)、细胞毒素剂、变态反应原、抗生素、siRNA、小RNA、反义寡核苷酸、TLR激动剂(例如，TLR9的激动剂和/或TLR7的激动剂和/或TLR8的激动剂)、化学疗法剂(常规化学疗法和现代靶标疗法)、靶标治疗剂、激活细胞、肽、蛋白质、基因疗法载体、肽疫苗、蛋白质疫苗、DNA疫苗、佐剂和共刺激分子(例如，细胞因子、趋化激素、蛋白质配体、反式激活因子、肽或包含变型的氨基酸的肽)或它们的组合。例如，在癌的治疗中，据考虑可以将根据本发明的TLR7特异性SIMRA化合物与一种或多种化学疗法化合物、靶标治疗剂和/或单克隆抗体结合施用。作为另外一种选择，所述试剂可以包括编码抗原或变态反应原的DNA载体。作为另外一种选择，可以将根据本发明的TLR7特异性SIMRA化合物与其它佐剂结合施用以增强对TLR7特异性SIMRA化合物的免疫应答的特异性或强度。
在根据本发明的任何方法中，可以通过任何适合的途径单独或结合任何其它试剂施用根据本发明的TLR7特异性SIMRA化合物，所述途径无限制地包括肠胃外施用、粘膜递送、口服、舌下施用、经皮施用、局部施用、吸入、鼻内施用、气雾剂、眼内施用、气管内施用、直肠内施用、阴道施用、通过基因枪、皮肤贴片或以滴眼液或嗽口水的形式施用。可以使用已知程序以药物有效量并且以能够有效减轻症状或替代疾病标志物的时间段实施根据本发明的TLR7特异性SIMRA化合物的治疗组合物的施用。例如，用于治疗疾病和/或病症的根据本发明的TLR7特异性SIMRA化合物的药物有效量可以是缓解或减轻症状，或者延缓或改善肿瘤、癌或者细菌、病毒或真菌感染所必须的量。用作疫苗佐剂的药物有效量可以是对促进受试者对疫苗或抗原产生免疫应答有用的量。在施用调节对共施用抗原的免疫应答的组合物的情况下，根据本发明的TLR7特异性SIMRA化合物的药物有效量是与单独施用所述抗原时所获得的免疫应答相比足以达到所需调节的量。对于任何特定应用的有效量可以根据以下因素而不同，如所治疗的疾病或病况、所施用的特定寡核苷酸、受试者的体型或者疾病或病况的严重程度。本领域的技术人员可以在不需要进行过多实验的情况下通过经验确定特定寡核苷酸的药物有效量。
当全身施用时，优选地以能够使根据本发明的TLR7特异性SIMRA化合物的血液水平达到约0.0001微摩尔至约10微摩尔的足够剂量施用治疗组合物。对于局部施用，比该浓度低得多的浓度可以是有效的，并且高得多的浓度是可以耐受的。优选地，根据本发明的TLR7特异性SIMRA化合物的总剂量在约0.001mg/患者/天至约200mg/kg体重/天的范围内。同时或顺序地将治疗有效量的一种或多种本发明的治疗组合物作为单个治疗事件(Treatment episode)施用于个体可以是所希望的。
根据本发明的TLR7特异性SIMRA化合物可以任选地连接到一个或多个变态反应原和/或抗原(自体抗原或外源抗原)、免疫原性蛋白质或肽，如钥孔血蓝素(KLH)、霍乱毒素B亚基或任何其它免疫原性载体蛋白。根据本发明的TLR7特异性SIMRA化合物还可以结合其它化合物(例如，佐剂)使用，其无限制地包括TLR激动剂(例如，TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和/或TLR9的激动剂)、弗氏不完全佐剂、KLH、单磷酸脂质A(MPL)、明矾和包括QS-21和咪喹莫特的皂苷，或它们的组合。
根据本发明该方面的方法对于免疫系统模型研究是有用的。该类方法还对人或动物疾病的预防性和治疗性治疗是有用的。例如，该类方法对于儿童、成人和兽医疫苗应用是有用的。
以下实施例旨在进一步说明本发明的某些示例性实施方式，而不意欲限制本发明的范围。
实施例
实施例1
免疫调节寡核糖核苷酸的合成
使用亚磷酰胺化学在自动DNA/RNA合成仪上化学合成了免疫调节寡核糖核苷酸。N-乙酰基保护的(除U以外)2′-O-TBDMS RNA单体、A、G、C和U均购自Sigma-Aldrich。7-去氮-G，即肌苷，购自ChemGenes Corporation。0.25M5-乙硫基-1H-四唑、PAC酸酐封端剂A(Cap A)和封端剂B(Cap B)购自GlenResearch。3％三氯乙酸(TCA)在二氯甲烷(DCM)中的溶液和5％3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮-1，1-二氧化物(硫化试剂(Beaucage reagent))是在实验室中制备的。
使用标准RNA合成方案，以1-2μM的范围合成了免疫调节寡核糖核苷酸。
切割和碱基脱保护
从固体载体上切割免疫调节寡核糖核苷酸，并且在甲胺和氢氧化铵溶液中除去环外胺的保护基团。将所得溶液在SpeedVac中彻底干燥。
IE HPLC纯化
免疫调节寡核糖核苷酸是通过离子交换HPLC纯化的。
使用Dionex DNAPac 100柱。将粗免疫调节寡核糖核苷酸溶液进样到HPLC中。执行以上梯度并收集馏分。将含有超过90％所需产品的所有馏分混合，然后通过RotoVap将溶液浓缩至基本干燥。加入不含RNA酶的水以使得最终体积为10ml。
C-18反相脱盐
将10ml乙腈、10ml 0.5M的醋酸钠通过色谱柱以清洗购自Waters的C-18Sep-Pak柱。然后，将10ml免疫调节寡核糖核苷酸溶液加载到色谱柱上。然后，使用15ml水将盐清洗出。最后，使用1ml 50％的乙腈水溶液洗脱免疫调节寡核糖核苷酸。将溶液放置在SpeedVac中30分钟。将剩余的溶液通过0.2微米过滤器过滤，然后冻干。接着，将固体再溶解到不含RNA酶的水中以制备所需的浓度。将最终溶液储存在0℃以下。通过毛细管电泳、离子交换HPLC和PAGE分析来分析寡核糖核苷酸的纯度，并通过MALDI-ToF质谱法分析分子量。
实施例2
表达TLR的HEK293细胞的测定方案
将HEK293或HEK293XL/人TLR7或者HEK293或HEK293XL/人TLR8细胞(InvivoGen，位于加利福尼亚圣地亚哥)在48孔板中，在添加了10％热灭活FBS的250μl/孔的DMEM中，在5％CO2培养箱中培养。
报道基因转化
将稳定表达人TLR7或TLR8的HEK293或HEK293XL细胞(InvivoGen，San Diego，CA)在48孔板中，在添加了10％热灭活FBS的250μl/孔的DMEM中，在5％CO2培养箱中培养。在汇合度80％时，用400ng/ml的SEAP(人胚胎碱性磷酸酶的分泌形式)报道质粒(pNifty2-Seap)(Invivogen)在存在4μl/ml细胞转染试剂lipofectamine(Invitrogen，Carlsbad，CA)的情况下在培养基中瞬时转染培养物。将质粒DNA和lipofectamine分别在不含血清的培养基中稀释并在室温下培育5分钟。培育后，将稀释的DNA和lipofectamine混合，并将混合物在室温下培育20分钟。将含有100ng质粒DNA和1μl lipofectamine的DNA/lipofectamine混合物的25μl等份加入到细胞培养板的每个孔中，并继续培养4小时。
IMO处理
转染后，用新鲜培养基替换培养基。用50μg/ml的根据本发明的TLR7特异性SIMRA或PBS对照刺激表达人TLR7或TLR8的HEK293或HEK29XL细胞，并且继续培养18至20小时。在TLR7特异性SIMRA处理结束时，从每个处理中取出30μl培养上清液并按照生产商的方案(InvivoGen)用于SEAP测定。
SEAP(人胚胎碱性磷酸酶的分泌形式)测定
简要地，将培养上清液与对硝基磷酸苯酯底物一起培育，并通过读板仪在405nm测量所产生的黄色颜色。
表5中显示了表达人TLR7和TLR8的HEK293细胞中的TLR7和TLR8活力。表5中所示数据是通过用50μg/ml的根据本发明的TLR7特异性SIMRA刺激HEK293细胞18小时并使用SEAP(人胚胎碱性磷酸酶的分泌形式)测定确定NF-κB水平所产生的。与PBS对照相比，数据显示NF-κB活力成倍增加。(Putta，M.R.等人(2006)Nucleic Acids Res.34：3231-38)。表5中所示数据表明根据本发明的TLR7特异性SIMRA的施用产生了独特并且特异的TLR7介导的免疫应答谱。
Figure BPA00001421721000271
Figure BPA00001421721000281
实施例3
人细胞培养方案
人PBMC分离
通过聚蔗糖密度梯度离心法(Histopaque-1077，Sigma)分离了来自新鲜抽取的健康志愿者血液(CBR Laboratories，位于马萨诸塞州波士顿)的周围血液单核细胞(PBMC)。
人pDC分离
通过聚蔗糖密度梯度离心法(Histopaque-1077，Sigma)可以分离来自新鲜抽取的健康志愿者血液(CBR Laboratories，Boston，MA)的周围血液单核细胞(PBMC)。根据生产商的说明，使用BDCA4细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)可以通过阳性选择从PBMC中分离pDC。
人mDC的分离
通过聚蔗糖密度梯度离心法(Histopaque-1077，Sigma)可以分离来自新鲜抽取的健康志愿者血液(CBR Laboratories，Boston，MA)的周围血液单核细胞(PBMC)。根据生产商的说明，使用BDCA4细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)可以通过阳性选择从PBMC中分离髓样树突状细胞(mDC)。
多重细胞因子测定
使用5×106个细胞/ml，将人PBMC在48孔板中铺板。使用1×106个细胞/ml，将pDC在96孔板中铺板。加入溶解于DPBS(pH 7.4；Mediatech)中的根据本发明的TLR7特异性SIMRA化合物至在细胞培养物中的最终浓度为50或100μg/ml。然后，将细胞在37℃培育24小时，并收集上清液用于液态芯片(luminex)多重测定或酶联免疫吸附测定。在三个重复的孔中进行实验。通过夹心ELISA测量IFN-α、IL-6或TNF-α的水平。包括细胞因子抗体和标准品的所需试剂均购自PharMingen。
在Luminex 100/200型仪器上，使用Biosource人多重细胞因子测定试剂盒进行Luminex多重测定，并且使用由Applied Cytometry Systems(Sacramento，CA)提供的StarStation软件分析数据。
表6中显示了来自人PBMC的细胞因子浓度。表6中所示的数据是通过从新鲜获得的健康人志愿者血液中分离PBMC并与100μg/ml剂量的TLR7特异性SIMRA培养24小时产生的；收集上清液并通过细胞因子浓度的Luminex多重测定进行分析。表6中所示结果表明根据本发明的TLR7特异性SIMRA寡核苷酸的施用产生了独特的细胞因子和趋化激素谱。
Figure BPA00001421721000301
实施例4
用TLR7激动剂化合物处理的小鼠模型中细胞因子的体内分泌
5-6周大的C57BL/6小鼠得自Taconic Farms，Germantown，NY并根据IderaPharmaceutical′s IACUC批准的动物协定进行饲养。对小鼠(n＝3)皮下(s.c.)注射25mg/kg(单次剂量)的根据本发明的单独的TLR7特异性SIMRA化合物。在施用TLR7特异性SIMRA后2小时，通过眼眶后出血采集血清并通过夹心ELISA或Luminex多重测定确定细胞因子和趋化激素水平。表7中所示结果表明体内施用根据本发明的TLR7特异性SIMRA寡核苷酸产生了独特的细胞因子和趋化激素谱。包括细胞因子和趋化激素抗体以及标准品的所有试剂均购自PharMingen(San Diego，CA)。
表7以25mg/kg的剂量由TLR7特异性SIMRA化合物在小鼠体内引起的IL-12
Figure BPA00001421721000321
G1＝7-去氮-G；X＝1，2，3-丙二醇(甘油)
实施例5
血清稳定性测定
将约0.5OD的根据本发明的示例性TLR7特异性SIMRA化合物单独在1％人血清的PBS溶液中在37℃培育30分钟。在1％人血清中培育30分钟后，在阴离子交换HPLC上分析TLR7特异性SIMRA化合物以确定剩余的全长TLR7特异性SIMRA化合物与血清处理前存在的TLR7特异性SIMRA化合物的量相比较的百分比。期望结果表明对RNA基化合物所进行的根据本发明的化学变型可以增强它们的稳定性。
等同内容
尽管出于清楚和理解的目的详细说明了上述发明，但是本领域的技术人员通过阅读本发明公开将理解，可以在不背离本发明和所附权利要求的真实范围的情况下对形式和细节进行各种改变。

Claims (19)

1.一种TLR7特异性SIMRA化合物，其选自SIMRA#1、SIMRA#2、SIMRA#3、SIMRA#4、SIMRA#5、SIMRA#6、SIMRA#7、SIMRA#8、SIMRA#9、SIMRA#10、SIMRA#11、SIMRA#12、SIMRA#13、SIMRA#14、SIMRA#15、SIMRA#16、SIMRA#17、SIMRA#18、SIMRA#19、SIMRA#20、SIMRA#21、SIMRA#22、SIMRA#23、SIMRA#24、SIMRA#25、SIMRA#26、SIMRA#27、SIMRA#28、SIMRA#29、SIMRA#30和SIMRA#31。
2.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的TLR7特异性SIMRA化合物和生理学可用载体。
3.一种在个体中产生免疫应答的方法，该方法包括向脊椎动物施用根据权利要求1所述的TLR7特异性SIMRA化合物。
4.一种治疗性治疗患有疾病或病症的脊椎动物的方法，其中在该疾病或病症下，调节免疫应答是有益的，该方法包括向所述脊椎动物施用药物有效量的根据权利要求1所述的TLR7特异性SIMRA化合物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述疾病或病症为癌、自体免疫病症、气道炎症、炎性病症、传染病、皮肤病、过敏症、哮喘或由病原体引起的疾病。
6.根据权利要求4所述的方法，还包括施用一种或多种化学治疗化合物。
7.根据权利要求4所述的方法，还包括施用靶标治疗剂。
8.根据权利要求4所述的方法，还包括施用抗体。
9.根据权利要求4所述的方法，还包括施用疫苗，该疫苗选自DNA疫苗、蛋白质疫苗和肽疫苗。
10.根据权利要求4所述的方法，还包括施用抗原。
11.根据权利要求4所述的方法，还包括佐剂。
12.一种预防性治疗患有疾病或病症的个体的方法，其中在该疾病或病症下，调节免疫应答是有益的，该方法包括向脊椎动物施用药物有效量的根据权利要求1所述的TLR7特异性SIMRA化合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述疾病或病症为癌、自体免疫病症、气道炎症、炎性病症、传染病、皮肤病、过敏症、哮喘或由脊椎动物中的病原体引起的疾病。
14.根据权利要求13所述的方法，还包括施用一种或多种化学治疗化合物。
15.根据权利要求13所述的方法，还包括施用靶标治疗剂。
16.根据权利要求13所述的方法，还包括施用抗体。
17.根据权利要求13所述的方法，还包括施用疫苗，该疫苗选自DNA疫苗、蛋白质疫苗和肽疫苗。
18.根据权利要求13所述的方法，还包括施用抗原。
19.根据权利要求13所述的方法，还包括施用佐剂。
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