JP4348044B2 - 立体規則性の高いジヌクレオシドホスホロチオエートの製造法 - Google Patents
立体規則性の高いジヌクレオシドホスホロチオエートの製造法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、ジヌクレオシドホスホロチオエートの製造法に関し、更に詳しくは、立体制御された光学純度の高いジヌクレオシドホスホロチオエートの製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ジヌクレオシドホスホロチオエートは、近年、重要なアンチセンス薬として注目されており、更に多くの病気についても臨床試験が行われている。ジヌクレオシドホスホロチオエートは、リン原子上に不斉中心を有しており、その絶対立体配置の相違によりアンチセンス効果が異なる。また、近年のin vitro研究では、ジヌクレオシドホスホロチオエートの性質として、例えばＲＮＡｓとの雑種形成能やヌクレアーゼ耐性、ＲＮaseＨ能などはリン原子上のキラリティーに影響されることが報告されており(Med. Chem. Lett. 2000, 8, 275-284)、リン原子上の立体を制御したジヌクレオシドホスホロチオエートの効率的な合成法が求められている。
【０００３】
しかし、従来、ジヌクレオシドホスホロチオエートは、ホスホロアミダイト法等により合成されており(Beaucage, S.L. ; Iyer, R. P. Tetrahedron, 1992, 48, 2223-2311)、これらの合成法では、リン原子上の立体制御を行うことは困難であったため、合成されたジヌクレオシドホスホロチオエートは、Ｒ体とＳ体のジアステレオマーの混合物であった。
【０００４】
本発明の課題は、リン原子上の立体を制御した、立体規則性の高いジヌクレオシドホスホロチオエートの効率的な合成法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、求核性のないアニオン種を有する新規活性化剤を用いた反応の開発を検討し、本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明は、式（Ｉ）
【０００７】
【化９】
【０００８】
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又は炭素数６〜１４のアリール基、Ｒ3は炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ4は水酸基の保護基、Ｂは式
【０００９】
【化１０】
【００１０】
で表されるチミン、アデニン、シトシン、グアニンあるいはそれらの誘導体から誘導される基を示す。］
で表される光学活性なヌクレオシド３’−ホスホロアミダイト（以下ホスホロアミダイト（Ｉ）という）と、式(II)
【００１１】
【化１１】
【００１２】
［式中、Ｒ5は水酸基の保護基、Ｂは前記と同じ意味を示す。］
で表されるヌクレオシド（以下ヌクレオシド(II)という）とを、式(III)
【００１３】
【化１２】
【００１４】
［式中、Ｘ-はＢＦ4 -、ＰＦ6 -、ＴｆＯ-（ＴｆはＣＦ3ＳＯ2−を示す。以下同じ）、Ｔｆ2Ｎ-、ＡｓＦ6 -又はＳｂＦ6 -を示す。また、環状構造Ａは窒素原子と共に形成する炭素数３〜１６のモノシクロ又はビシクロ構造を示す。］
で表される活性化剤（以下活性化剤(III)という）を用いて縮合した後、硫化及び脱保護を行うことを特徴とする、式(IV)又は（Ｖ）で表される立体規則性の高いジヌクレオシドホスホロチオエートの製造法を提供するものである。
【００１５】
【化１３】
【００１６】
［各式中、Ｙ+はアンモニウムイオン、Ｂは前記と同じ意味を示し、各式中の２個のＢは同一でも異なっていても良い。］
【００１７】
【発明の実施の形態】
ホスホロアミダイト（Ｉ）は、適当な１，２−アミノアルコールから公知の方法で合成することができる(Tetrahedron:Asymmetry, 1995, 6, 1051-1054)。例えば、式(VI)
【００１８】
【化１４】
【００１９】
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又はアリール基、Ｒ3は炭素数１〜３のアルキル基を示す。］
で表される光学活性な１，２−アミノアルコール（以下アミノアルコール(VI)という）を三塩化リンと反応させて得られる、式(VII)
【００２０】
【化１５】
【００２１】
［式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は前記と同じ意味を示す。］
で表される光学活性なホスフィチル化剤（以下ホスフィチル化剤(VII)という）を、式(VIII)
【００２２】
【化１６】
【００２３】
［式中、Ｒ4は水酸基の保護基、Ｂは式
【００２４】
【化１７】
【００２５】
で表されるチミン、アデニン、シトシン、グアニンあるいはそれらの誘導体から誘導される基を示す。］
で表されるヌクレオシド（以下ヌクレオシド(VIII)という）と反応させることにより得られる。
【００２６】
アミノアルコール(VI)としては、（Ｓ）−及び（Ｒ）−２−メチルアミノ−１−フェニルエタノール、（１Ｒ，２Ｓ）−エフェドリン、（１Ｒ，２Ｓ）−２−メチルアミノ−１，２−ジフェニルエタノール等が挙げられる。
【００２７】
ヌクレオシド(VIII)において、Ｂはチミン、アデニン、シトシン又はグアニンあるいはそれらの誘導体から誘導される基を示すが、誘導体としては、アデニン、シトシン及びグアニンのアミノ基を保護基で保護したもの等が挙げられ、具体的には、下記式で表される化合物が挙げられる。
【００２８】
【化１８】
【００２９】
（式中、Ｒ6は炭素数１〜１５のアルキル基、アリール基、アラルキル基、アリールオキシアルキル基を示し、中でもメチル基、イソプロピル基、フェニル基、ベンジル基、フェノキシメチル基が好ましく、特にフェニル基が好ましい。また、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ炭素数１〜４のアルキル基を示し、特にメチル基が好ましい。）
ヌクレオシド(VIII)は、チミジン、アデノシン、シチジン、グアノシン又はそれらの誘導体の5'位の水酸基を、tert-ブチルジフェニルシリル基（ＴＢＤＰＳ）、tert-ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、４，４’−ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）、４−メトキシトリチル基（ＭＭＴｒ）等の保護基で保護したものである。
【００３０】
上記のような方法で得られる、ホスホロアミダイト（Ｉ）において、Ｒ1及びＲ2としては、Ｒ1及びＲ2のいずれか一方が水素原子で他方がフェニル基、Ｒ1及びＲ2のいずれか一方がメチル基で他方がフェニル基、あるいはＲ1及びＲ2が共にフェニル基の組み合わせが好ましく、Ｒ1がフェニル基、Ｒ2が水素原子の組み合わせが更に好ましい。Ｒ3はメチル基が好ましい。Ｒ4はＴＢＤＰＳ、ＴＢＤＭＳが好ましく、ＴＢＤＰＳが更に好ましい。
【００３１】
ヌクレオシド(II)は、チミジン、アデノシン、シチジン、グアノシン又はそれらの誘導体の3'位の水酸基を保護したものであり、Ｂで示されるチミン、アデニン、シトシン、グアニン又はそれらの誘導体から誘導される基は、ヌクレオシド(VIII)で例示したものが挙げられる。ヌクレオシド(II)とヌクレオシド(VIII)のＢは、同一でも異なっていても良い。Ｒ5で示される水酸基の保護基としては、ＴＢＤＰＳ、ＴＢＤＭＳ、アセチル基（Ａｃ）、ベンジル基（Ｂｚ）、ＤＭＴｒ、ＭＭＴｒ等が挙げられ、ＴＢＤＭＳが好ましい。
【００３２】
本発明の方法では、まず、ホスホロアミダイト（Ｉ）とヌクレオシド(II)とを、活性化剤(III)の存在下で反応させて、式(IX)
【００３３】
【化１９】
【００３４】
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＢは前記と同じ意味を示す。］
で表されるホスファイト（以下ホスファイト(IX)という）を得る。
【００３５】
ここで用いる活性化剤(III)は、ホスホロアミダイト（Ｉ）のチッソ原子に対するプロトン供給能力を有し、求核試薬としては働かないものである。活性化剤(III)中、Ｘ-としては、ＢＦ4 -、ＰＦ6 -、ＴｆＯ-、Ｔｆ2Ｎ-が好ましい。また、環状構造Ａは窒素原子と共に形成する炭素数３〜１６のモノシクロ又はビシクロ構造を示し、特に式(III-1)で表されるモノシクロ構造を有するものが好ましい。
【００３６】
【化２０】
【００３７】
（式中、Ｘ-は前記と同じ意味を示す。ｎは３〜７の数を示し、４又は５が好ましい。）
活性化剤(III)は、式(X)
【００３８】
【化２１】
【００３９】
（式中、環状構造Ａは前記と同じ意味を示す。）
で表されるアミンと、式(XI)
ＨＸ (XI)
（式中、Ｘは前記の意味を示す。）
で表される化合物とを反応させることにより容易に得ることができる。活性化剤(III)は特にアセトニトリルに良い溶解性を示すので、ホスホロアミダイト（Ｉ）とヌクレオシド(II)の反応は、アセトニトリル等の溶媒中で行うのが好ましい。
【００４０】
ホスホロアミダイト（Ｉ）とヌクレオシド(II)とは、ホスホロアミダイト（Ｉ）に対し、ヌクレオシド(II)を、０．５〜１．０当量倍の割合で反応させることが好ましい。活性化剤(III)は、ホスホロアミダイト（Ｉ）に対し、１〜５当量倍の割合で用いるのが好ましい。反応温度は０〜４０℃が好ましく、反応圧力は１気圧が好ましい。
【００４１】
次に、得られたホスファイト(IX)を、無水酢酸等でＮ−アセチル化した後、硫化剤により硫化し、式(XII)
【００４２】
【化２２】
【００４３】
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＢは前記と同じ意味を示し、Ｒ9はアセチル基を示す。］
で表される化合物（以下化合物(XII)という）を得る。硫化剤としては、硫黄、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルチウラムジスルフィド、１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（Beaucage試薬）等が挙げられ、Beaucage試薬が好ましい。
【００４４】
硫化後、化合物(XII)のキラル補助物質を１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）等で処理して除き、式(XIII)
【００４５】
【化２３】
【００４６】
［式中、Ｒ4、Ｒ5、Ｂ及びＹ+は前記と同じ意味を示す。］
で表される保護されたジヌクレオシドホスホロチオエートを得る。最後に、水酸基の保護基を、（ＣＨ3ＣＨ2）3Ｎ・３ＨＦ等で除き、式(IV)又は（Ｖ）で表される立体規則性の高いジヌクレオシドホスホロチオエートを得ることができる。
【００４７】
式(IV)、（Ｖ）又は(XIII)において、Ｙ+で表されるアンモニウムイオンとしては、Ｒ4Ｎ+（Ｒは、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を示し、４個のＲは、同一でも異なっていても良い）で表されるアンモニウムイオン、又は１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムイオン（ＨＤＢＵ+）等が挙げられる。
【００４８】
本発明の方法によると、立体制御された光学純度の高いジヌクレオシドホスホロチオエートを効率的に得ることができる。
【００４９】
【実施例】
例中の％は特記しない限り重量％である。
【００５０】
＜活性化剤(III-1)の合成例＞
合成例1-1：Ｎ−シアノメチルピロリジニウムテトラフルオロボレイトの合成
アルゴン雰囲気下、Ｎ−シアノメチルピロリジン０．５５１ｇ（５．００mmol）のエチルエーテル（５．００ml）溶液を−７８℃に冷却し、攪拌しつつ５４％四フッ化硼素酸エチルエーテル溶液０．６８９ml（５．００mmol）を滴下した。溶液を室温に戻した後、減圧下濃縮、乾燥し、残渣にエチルエーテル（５ml）を加えて激しく攪拌し、シリンジを用いて溶媒を除去した。この洗浄操作を５回繰り返した後、真空乾燥し、目的物（式(III-1) において、ｎ＝４、Ｘ-＝ＢＦ4 -の活性化剤）０．９９０ｇ（５．００mmol）を得た。
収率定量的。白色粉末。潮解性大。
・融点：１１３．０〜１１４．０℃
・ＩＲ（ＫＢｒ）νmax：2988, 2950, 2825, 2527, 2445, 1451, 1407, 1374, 1298, 1119, 929 cm-1
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤ3ＣＮ）δ：7.17(br,1H), 4.30(s,2H), 3.51(br,4H), 2.13〜2.08(m,4H)
・13Ｃ−ＮＭＲ（７５MHz, ＣＤ3ＣＮ）δ：112.0, 55.9, 41.8, 23.2。
【００５１】
合成例1-2：Ｎ−シアノメチルピロリジニウムヘキサフルオロホスフェートの合成
６１％ヘキサフルオロリン酸水溶液１．２０ｇ（５．００mmol）に水５．００mlを加え、攪拌しつつＮ−シアノメチルピロリジン０．５５１ｇ（５．００mmol）を滴下した後、溶液を凍結乾燥した。残渣にエチルエーテル（１０ml）を加え、激しく攪拌し、シリンジを用いて溶媒を除去した。この洗浄操作を３回繰り返した後、真空乾燥し、目的物（式(III-1)において、ｎ＝４、Ｘ-＝ＰＦ6 -の活性化剤）１．２８ｇ（５．００mmol）を得た。収率定量的。白色粉末。潮解性大。
・融点：５６．０〜５７．０℃
・ＩＲ（ＫＢｒ）νmax：2988, 2828, 2532, 2448, 1626, 1457, 1296, 1082, 987, 834 cm-1
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤ3ＣＮ）δ：8.27(br,1H), 4.24(s,2H), 3.48(br,4H), 2.12〜2.08(m,4H)
・13Ｃ−ＮＭＲ（７５MHz, ＣＤ3ＣＮ）δ：112.1, 56.0, 42.1, 23.5
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤ3ＣＮ）δ：-146.0(septet, 1ＪPF=707Hz)。
【００５２】
合成例1-3：Ｎ−シアノメチルピロリジニウムトリフルオロメタンスルホネートの合成
Ｎ−シアノメチルピロリジン０．５５１ｇ（５．００mmol）のジクロロメタン（５．００ml）溶液を０℃に冷却し、攪拌しつつトリフルオロメタンスルホン酸０．４４２ml（５．００mmol）を滴下した後、エチルエーテル（１０ml）を加えた。生じた固体を吸引ろ過によって集め、エチルエーテル（１ml×３）で洗浄した後、減圧下乾燥して、目的物（式(III-1)において、ｎ＝４、Ｘ-＝ＴｆＯ-の活性化剤）１．１１ｇ（４．２７mmol）を得た。収率８５％。白色粉末。潮解性小。
・融点：６７．０〜６７．５℃
・ＩＲ（ＫＢｒ）νmax：2996, 2841, 2651, 2477, 2347, 2282, 1637, 1462, 1437, 1269, 1228, 1168, 1033, 985, 911, 849, 761, 641 cm-1
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤ3ＣＮ）δ：8.16(br,1H), 4.30(s,2H), 3.50(br,4H), 2.14〜2.09(m,4H)
・13Ｃ−ＮＭＲ（７５MHz, ＣＤ3ＣＮ）δ：121.2(q,1JCF=320Hz), 55.9, 42.0, 23.5。
【００５３】
合成例1-4：Ｎ−シアノメチルピペリジニウムテトラフルオロボレートの合成
Ｎ−シアノメチルピペリジン１．２４ｇ（１０．０mmol）のジクロロメタン（１０．０ml）溶液に対し、攪拌しつつ５４％四フッ化硼素酸エチルエーテル溶液１．３８ml（１０．０mmol）を滴下した。溶液をエチルエーテル（２０ml）で希釈し、生じた固体を吸引ろ過によって集め、エチルエーテル（１０ml×２）で洗浄した後、減圧下乾燥して、目的物（式(III-1)において、ｎ＝５、Ｘ-＝ＢＦ4 -の活性化剤）２．０１ｇ（９．４８mmol）を得た。収率９５％。白色粉末。潮解性なし。
・融点：１０３．０〜１０３．５℃
・ＩＲ（ＫＢｒ）νmax：3149, 2997, 2952, 2876, 2591, 2570, 2491, 2372, 1457, 1422, 1296, 1074, 980, 935, 850, 641 cm-1
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤ3ＣＮ）δ：6.74(br,1H), 4.22(s,2H), 3.58(br,2H), 3.15(br,2H), 1.97〜1.51(m,6H)
・13Ｃ−ＮＭＲ（７５MHz, ＣＤ3ＣＮ）δ：111.2, 54.6, 44.0, 23.0, 20.5。
【００５４】
合成例1-5：Ｎ−シアノメチルピペリジニウムヘキサフルオロホスフェートの合成
６１％ヘキサフルオロリン酸水溶液１．２０ｇ（５．００mmol）に水５．００mlを加え、攪拌しつつＮ−シアノメチルピペリジン０．６２１ｇ（５．００mmol）を滴下した後、溶液を凍結乾燥した。残渣にジクロロメタン（５ml）、エチルエーテル（１０ml）を加え、−７８℃に冷却し、激しく攪拌すると固体が生じたので、室温に昇温した後、シリンジを用いて溶媒を除去した。残渣にエチルエーテル（５ml）を加え、激しく攪拌した後、シリンジを用いて溶媒を除去した。この洗浄操作を３回繰り返した後、真空乾燥し、目的物（式(III-1)において、ｎ＝５、Ｘ-＝ＰＦ6 -の活性化剤）１．３１ｇ（４．８５mmol）を得た。収率９７％。白色粉末。潮解性大。
・融点：５４．０〜５５．０℃
・ＩＲ（ＫＢｒ）νmax：2997, 2953, 2876, 2589, 2570, 2490, 2372, 1655, 1455, 1422, 1297, 1192, 1142, 1084, 1037, 981, 953, 837, 746 cm-1
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤ3ＣＮ）δ：7.94(br,1H), 4.15(s,2H), 3.31(br,4H), 1.92〜1.83(m,4H), 1.63(br,2H)
・13Ｃ−ＮＭＲ（７５MHz, ＣＤ3ＣＮ）δ：111.5, 54.5, 44.2, 23.1, 20.8
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤ3ＣＮ）δ：-145.9(septet, 1ＪPF=707Hz)。
【００５５】
合成例1-6：Ｎ−シアノメチルピペリジニウムトリフルオロメタンスルホネートの合成
Ｎ−シアノメチルピペリジン０．６２１ｇ（５．００mmol）のジクロロメタン（５．００ml）溶液を０℃に冷却し、攪拌しつつトリフルオロメタンスルホン酸０．４４２ml（５．００mmol）を滴下した。溶液を室温に昇温し、エチルエーテル（１０ml）を加えた後、固体を吸引ろ過によって集め、エチルエーテル（１ml×３）で洗浄した後、減圧下乾燥して、目的物（式(III-1)において、ｎ＝５、Ｘ-＝ＴｆＯ-の活性化剤）１．３７ｇ（５．００mmol）を得た。収率定量的。白色粉末。潮解性小。
・融点：１１０．０〜１１０．５℃
・ＩＲ（ＫＢｒ）νmax：2999, 2723, 1460, 1289, 1226, 1168, 1083, 1027, 978, 936, 762, 641 cm-1
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤ3ＣＮ）δ：8.12(br,1H), 4.19(s,2H), 3.58(br,2H), 3.09(br,2H), 2.21(br,4H), 1.50(br,1H)
・13Ｃ−ＮＭＲ（７５MHz, ＣＤ3ＣＮ）δ：120.9(q, 1ＪCF=319Hz), 111.4, 54.5, 44.2, 23.0, 20.7。
【００５６】
＜ホスフィチル化剤(VII)の合成＞
合成例2-1：（５Ｓ）−２−クロロ−３−メチル−５−フェニル−１，３，２−オキサアザホスホリジンの合成
（Ｓ）−２−メチルアミノ−１−フェニルエタノール３．０２ｇ（１５．０mmol）、トリエチルアミン５．５８ml（４０．０mmol）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２０．０ml）溶液を０℃に冷却した三塩化リン１．７５ml（２０．０mmol）のＴＨＦ（２０．０ml）溶液に対して、攪拌しつつ滴下し、温度を室温にして３０分間攪拌した。生じた塩を、グラスフィルターでアルゴン雰囲気下ろ過し、塩をＴＨＦ（１０ml×３）で洗浄した。ろ液を濃縮し、残渣を減圧下蒸留することにより、目的物（式(VII)において、Ｒ1＝フェニル基、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝メチル基である化合物の５Ｓ体）２．５９ｇ（１２．０mmol）を得た。収率６０％。８９〜９０℃／０．２mmＨg。無色透明液体。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤＣｌ3）δ：7.54〜7.34(m,5H), 5.83, 5.44(br,br,1H), 3.60〜3.42(m,1H), 3.22〜3.12(m,1H), 2.77(d,3JHP=15.6Hz,3H)
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤＣｌ3）δ：172.4(br), 171.3(br)。
【００５７】
合成例2-2：（５Ｒ）−２−クロロ−３−メチル−５−フェニル−１，３，２−オキサアザホスホリジンの合成
（Ｒ）−２−メチルアミノ−１−フェニルエタノール２．２７ｇ（１５．０mmol）を用い、合成例2-1と同様の手法により目的物（式(VII)において、Ｒ1＝フェニル基、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝メチル基である化合物の５Ｒ体）を合成した。収率６５％。８１〜８２℃／０．２mmHg。無色透明液体。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤＣｌ3）δ：7.55〜7.35(m,5H), 5.84, 5.46(br,br,1H), 3.58〜3.43(m,1H), 3.22〜3.13(m,1H), 2.78(d,3JHP=16.5Hz,3H)
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤＣｌ3）δ：172.4(br), 171.4(br)
合成例2-3：（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−クロロ−３−メチル−４，５−ジフェニル−１，３，２−オキサアザホスホリジンの合成
（１Ｒ，２Ｓ）−２−メチルアミノ−１，２−ジフェニルエタノール２．２７ｇ（１０．０mmol）、トリエチルアミン２．７９ml（２０．０mmol）のＴＨＦ（１０．０ml）溶液を、０℃に冷却した三塩化リン０．８７２ml（１０．０mmol）のＴＨＦ（１０．０ml）溶液に対して、攪拌しつつ滴下した後、１時間加熱環流した。溶液を室温まで放冷し、生じた塩を、グラスフィルターでアルゴン雰囲気下ろ過し、塩をＴＨＦ（１０ml×２）で洗浄した後、ろ液を減圧下濃縮して、目的物（式(VII)において、Ｒ1＝フェニル基、Ｒ2＝フェニル基、Ｒ3＝メチル基である化合物の２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ体）３．１７ｇ（１０．０mmol）を得た。収率定量的（純度９２％）。乳白色固体。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤＣｌ3）δ：7.08〜7.05(m,6H), 6.91〜6.81(m,4H), 6.15(d,3J=8.3Hz,1H), 4.64(dd,3JHH=8.3Hz,3JHP=4.2Hz,1H), 2.64(d,3JHP=15.3Hz,3H)
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤＣｌ3）δ：171.7。
【００５８】
＜ホスホロアミダイト（Ｉ）の合成＞
合成例3-1：（２Ｓ，５Ｓ）−２−（５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン−３’−イル）−３−メチル−５−フェニル−１，３，２−オキサアザホスホリジンの合成
５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン０．２４０ｇ（０．５００mmol）をピリジン（１ml×３）、トルエン（１ml×３）で共沸乾燥し、ＴＨＦ（２．５０ml）に溶かした後、ジイソプロピルエチルアミン０．４２５ml（２．５０mmol）を加え、−７８℃に冷却した。これに対し、合成例2-1で得られたホスフィチル化剤０．１１９ｇ（０．５５２mmol）のＴＨＦ（０．５００ml）溶液を滴下し、室温で３０分間攪拌した。溶液をクロロホルム（１５ml）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１５ml×３）で洗浄した後、水相をクロロホルム（１５ml）で逆抽出した。集めた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル−トリエチルアミン、５０：５０：３、v/v/v）によって精製することにより、目的物（式（Ｉ）において、Ｒ1＝フェニル基、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝メチル基、Ｒ4＝ＴＢＤＰＳである化合物の２Ｓ，５Ｓ体）０．２５７ｇ（０．３９０mmol）を得た。収率７８％、白色粉末。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤＣｌ3）δ：8.96(br,1H), 7.71〜7.65(m,4H), 7.46〜7.33(m,12H), 6.42(dd,3J=8.2,5.6Hz,1H), 5.60(dd,3J=7.2,7.2Hz,1H), 4.91〜4.85(m,1H), 4.06〜4.05(m,1H), 4.01(dd,2J=11.4Hz,3J=2.7Hz,1H), 3.86(dd,2J=11.4Hz,3J=2.7Hz,1H), 3.53(ddd,2J=9.0Hz,3JHH=7.2Hz,3JHP=3.3Hz,1H), 2.91(dd,2J=9.0Hz,3J=7.2Hz,1H), 2.71(d,3JHP=12.0Hz,3H), 2.42(ddd,2J=13.5Hz,3J=5.6,2.3Hz,1H), 2.20(ddd,2J=13.5Hz,3J=8.2,6.3Hz,1H), 1.61(s,3H), 1.11(s,9H)
・13Ｃ−ＮＭＲ（７５MHz, ＣＤＣｌ3）δ：163.7, 150.4, 140.3(d,3JCP=3.4Hz), 135.5, 135.3, 135.1, 132.8, 132.3, 130.2, 130.0, 128.5, 128.1, 128.0, 128.0, 125.9, 111.3, 86.5(d,2JCP=5.5Hz), 84.3, 81.9(d,2JCP=9.8Hz), 72.3(d,3JCP=14.9Hz), 63.6, 57.0(d,2JCP=4.9Hz), 40.2(d,3JCP=1.4Hz), 31.8(d,2JCP=22.7Hz), 27.0, 19.4, 12.0
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤＣｌ3）δ：143.9。
【００５９】
合成例3-2：（２Ｒ，５Ｒ）−２−（５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン−３’−イル）−３−メチル−５−フェニル−１，３，２−オキサアザホスホリジンの合成
５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン０．７２１ｇ（１．５０mmol）をピリジン（２ml×３）、トルエン（２ml×３）で共沸乾燥し、ＴＨＦ（５．００ml）に溶かした後、ジイソプロピルエチルアミン１．２８ml（７．５３mmol）を加え、−７８℃に冷却した。これに対し、合成例2-2で得られたホスフィチル化剤０．３５６ｇ（１．６５mmol）のＴＨＦ（３．００ml）溶液を滴下し、室温で３０分間攪拌した。溶液をクロロホルム（３０ml）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ml×３）で洗浄した後、水相をクロロホルム（３０ml）で逆抽出した。集めた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル−トリエチルアミン、５０：５０：３、v/v/v）によって精製することにより、目的物（式（Ｉ）において、Ｒ1＝フェニル基、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝メチル基、Ｒ4＝ＴＢＤＰＳである化合物の２Ｒ，５Ｒ体）０．７３５ｇ（１．１１mmol）を得た。収率７４％。白色粉末。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤＣｌ3）δ：9.00(br,1H), 7.68〜7.65(m,4H), 7.49〜7.32(m,12H), 6.43(dd,3J=8.1,5.8Hz,1H), 5.58(dd,3J=7.4,7.4Hz,1H), 4.95〜4.90(m,1H), 4.05〜4.04(m,1H), 3.98(dd,2J=11.7Hz,3J=2.3Hz,1H), 3.88(dd,2J=11.7Hz,3J=2.3Hz,1H), 3.51(ddd,2J=8.6Hz,3JHH=7.4Hz,3JHP=3.5Hz,1H), 2.90(dd,2J=8.6Hz,3J=7.4Hz,1H), 2.74(d,3JHP=12.0Hz,3H), 2.44(ddd,2J=13.5Hz,3J=5.8,2.1Hz,1H), 2.24(ddd,2J=13.5Hz,3J=8.1,6.6Hz,1H), 1.59(s,3H), 1.11(s,9H)
・13Ｃ−ＮＭＲ（７５MHz, ＣＤＣｌ3）δ：163.8, 150.4, 140.3(d,3JCP=3.2Hz), 135.5, 135.2, 135.2, 132.9, 132.2, 130.1, 130.0, 128.5, 128.1, 128.0, 128.0, 125.8, 111.3, 86.4(d,2JCP=2.0Hz), 84.4, 81.8(d,2JCP=9.8Hz), 72.5(d,3JCP=15.8Hz), 63.5, 57.1(d,2JCP=4.9Hz), 40.4(d,3JCP=4.9Hz), 31.8(d,2JP=23.0Hz), 27.0, 19.4, 12.0
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤＣｌ3）δ：144.6。
【００６０】
合成例3-3：（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン−３’−イル）−３−メチル−４，５−ジフェニル−１，３，２−オキサアザホスホリジンの合成
５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン０．９６１ｇ（２．００mmol）をピリジン（５ml×３）、トルエン（５ml×３）で共沸乾燥し、ＴＨＦ（５．００ml）に溶かした後、ジイソプロピルエチルアミン１．７０ml（１０．０mmol）を加え、−７８℃に冷却した。これに対し、合成例2-3で得られたホスフィチル化剤０．８７５ｇ（３．００mmol）のＴＨＦ（３．００ml）溶液を滴下し、室温で３０分間攪拌した。溶液をクロロホルム（６０ml）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（６０ml×３）で洗浄した後、水相をクロロホルム（６０ml）で逆抽出した。集めた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル−トリエチルアミン、６７：３３：２〜０：１００：２、v/v/v）によって精製することにより、目的物（式（Ｉ）において、Ｒ1＝フェニル基、Ｒ2＝フェニル基、Ｒ3＝メチル基、Ｒ4＝ＴＢＤＰＳである化合物の２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ体）１．４１ｇ（１．９２mmol）を得た。収率９６％。白色粉末。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤＣｌ3）δ：7.99(br,1H), 7.69〜7.65(m,4H), 7.50(d,4J=1.1Hz,1H), 7.44〜7.32(m,6H), 7.08〜7.03(m,6H), 6.91〜6.88(m,2H), 6.82〜6.79(m,2H), 6.45(dd,3J=8.5,5.7Hz,1H), 5.88(d,3J=7.0Hz,1H), 5.06〜5.01(m,1H), 4.52(dd,3J=7.0,2.3Hz,1H), 4.10〜4.07(m,1H), 3.98(dd,2J=11.8Hz,3J=2.3Hz,1H), 3.91(dd,2J=11.8Hz,3J=2.3Hz,1H), 2.60(d,3JHP=11.1Hz,3H), 2.49(ddd,2J=13.4Hz,3J=5.7,2.1Hz,1H), 2.30(ddd,2J=13.4Hz,3J=8.5,6.3Hz,1H), 1.59(d,4J=1.1Hz,3H), 1.12(s,9H)
・13Ｃ−ＮＭＲ（７５MHz, ＣＤＣｌ3）δ：163.7, 150.5, 137.0(d,3JCP=3.7Hz), 136.0(d,3JCP=3.8Hz), 135.5, 135.2, 135.2, 132.9, 132.2, 130.1, 130.0, 128.2, 128.0, 127.9, 127.7, 127.5, 127.3, 126.6, 111.3, 86.5(d,4J=1.7Hz), 85.2(d,2JCP=8.9Hz), 84.4, 72.7(d,2JCP=18.2Hz), 68.8(d,3JCP=4.9Hz), 63.5, 40.5(d,3JCP=4.8Hz), 29.5(d,2JCP=19.3Hz), 27.0, 19.4, 12.0
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤＣｌ3）δ：142.3
＜ジヌクレオシドホスホロチオエートの合成＞
実施例1-1：トリエチルアンモニウム ５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン−３’−イル ３’−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルチミジン−５’−イル ホスホロチオエートの合成
ＮＭＲサンプルチューブ中に、合成例3-3で得られた化合物４４．２mg（６０．１μmol）、３’−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルチミジン１７．８mg（４９，９μmol）、合成例1-4で得られた活性化剤２１．２mg（１００μmol）を入れ、減圧下、五酸化二リン上で１２時間乾燥した。これに対し、アルゴン雰囲気下、アセトニトリル（０．４００ml）と、アセトニトリル−３ｄ（０．１００ml）を加え、５時間後より、31Ｐ−ＮＭＲ（外部標準、８５％リン酸）による測定を開始した。その後、得られたホスファイト（式(IX)において、Ｒ1＝フェニル基、Ｒ2＝フェニル基、Ｒ3＝メチル基、Ｒ4＝ＴＢＤＰＳ、Ｒ5＝ＴＢＤＭＳである化合物）に対し、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン １，１−ジオキサイド１２．０mg（６０．０μmol）を加え、３分後、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン７４．６μｌ（５００μmol）を加え、５０℃で４時間放置した。室温に放冷後、クロロホルム（３ml）で希釈し、ｐＨ７．０リン酸緩衝液（３ml）で洗浄し、水相をクロロホルム（３ml×２）で逆抽出した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下濃縮し、残渣を薄層クロマトグラフィー（ジクロロメタン中、メタノール１〜４％、トリエチルアミン０．５％）で精製し、目的物（式(XIII)において、Ｒ4＝ＴＢＤＰＳ、Ｒ5＝ＴＢＤＭＳ、Ｙ+＝トリエチルアンモニウムイオンである化合物のＳｐ体）４０．３mg（３９．７μmol）を得た。収率８０％。白色粉末。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤＣｌ3）δ：11.7(br,1H), 9.12(br,1H), 8.94(br,1H), 7.80, 7.78(s,s,1H), 7.72〜7.66(m,4H), 7.54, 7.50(s,s,1H), 7.44〜7.37(m,6H), 6.43〜6.33(m,2H), 5.36〜5.31(m,1H), 4.54〜4.51, 4.43〜4.42(m,m,1H), 4.36〜4.34, 4.28〜4.25(m,m,1H), 4.17〜3.91(m,4H), 3.10(q,3J=7.2Hz,6H), 2.63, 2.50(dd,2J=13.5Hz,3J=4.8Hz,dd,2J=12.5Hz,3J=4.7Hz,1H), 2.26〜2.03(m,3H), 1.99(s,3H), 2.03〜1.95(m,2H), 1.56, 1.51(s,s,3H), 1.33(t,3J=7.2Hz,9H), 1.09(s,9H), 0.89, 0.87(s,s,9H), 0.08, 0.06(s,s,6H)
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤＣｌ3）δ：58.0(Rp, Sp) 。
【００６１】
実施例1-2：アンモニウム チミジン−３’−イル チミジン−５’−イル ホスホロチオエートの合成
実施例1-1で得られた化合物４０．３mg（３９．７μmol）をトリエチルアミントリヒドロフルオライド（０．４００ml）に溶かし、室温で１５時間放置した。これに対し、０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（３ml）を加え、エチルエーテル（３ml×３）で洗浄し、有機相を０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（３ml）で逆抽出した。集めた水相を減圧下濃縮し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液中アセトニトリル０〜１０％）で精製することにより目的物（式(IV)において、Ｙ+＝Ｈ4Ｎ+である化合物）を得た。収率７０％。白色粉末。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，Ｄ2Ｏ）δ：7.75(d,4J=1.1Hz,1H), 7.68(d,4J=1.1Hz,1H), 6.33(dd,3J=6.9,6.9Hz,1H), 6.22(dd,3J=6.5,6.5Hz,1H), 5.00〜4.92(m,1H), 4.63〜4.59(m,1H), 4.24〜4.17(m,4H), 3.89〜3.77(m,2H), 2.57(ddd,2J=14.0Hz,3J=6.5,3.6Hz,1H), 2.45〜2.35(m,3H), 1.93(d,4J=1.1Hz,3H), 1.89(d,4J=1.1Hz,3H)
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，Ｄ2Ｏ）δ：55.6(Rp, 13％), 55.3(Sp, 87％)。
【００６２】
実施例２：31Ｐ−ＮＭＲによる縮合反応の追跡
ＮＭＲサンプルチューブ中に、合成例3-2で得られた化合物３３．０mg（５０．０μmol）、３’−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルチミジン１７．８mg（４９．９μmol）を入れ、減圧下、五酸化二リン上で１２時間乾燥した。これに対し、モレキュラーシーブ３Ａで８時間乾燥した、合成例1-1~1-6で得られた活性化剤(III)（１００μmol）のアセトニトリル（０．４００ml）溶液と、アセトニトリル−３ｄ（０．１００ml）を加え、縮合反応させ、ホスファイト（式(IX)において、Ｒ1＝フェニル基、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝メチル基、Ｒ4＝ＴＢＤＰＳである化合物）を得た。反応物の化学シフトを31Ｐ−ＮＭＲ（外部標準：８５％リン酸）により測定した。その結果を表１に示す。
【００６３】
【表１】
【００６４】
実施例３：（Ｓ）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム ５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン−３’−イル ３’−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルチミジン−５’−イル ホスホロチオエートの合成
合成例3-2で得られた化合物３９．６mg（６０．０μmol）、３’−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルチミジン１７．８mg（４９，９μmol）を減圧下、五酸化二リン上で１２時間乾燥し、モレキュラーシーブ３Ａで８時間乾燥した、合成例1-3で得られた活性化剤(III)２６．０mg（１００μmol）のアセトニトリル（０．５０ml）溶液を加え、室温で５分間放置した。これに対し、ピリジン４３．０μｌ（５００μmol）、無水酢酸１４．９μｌ（１００μmol）を加え、３０秒放置した後、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン １，１−ジオキサイド１２．０mg（６０．０μmol）を加え、更に３分後、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）７４．６μｌ（５００μmol）を加え、５０℃で３０分間放置した。室温に放冷後、クロロホルム（３ml）で希釈し、ｐＨ７．０リン酸緩衝液（３ml）で洗浄し、水相をクロロホルム（３ml×２）で逆抽出した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下濃縮し、残渣を薄層クロマトグラフィー（ジクロロメタン中メタノール１〜４％、トリエチルアミン０．５％）で精製した。得られたトリエチルアミン塩を０．２Ｍ １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム ビカーボネート緩衝液（３ml）で洗浄することにより、目的物（式(XIII)において、Ｒ4＝ＴＢＤＰＳ、Ｒ5＝ＴＢＤＭＳ、Ｙ+＝ＨＤＢＵ+である化合物のＳｐ体）５０．４mg（４７．２μmol）を得た。収率９５％。白色粉末。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤＣｌ3）δ：7.85(s,1H), 7.73〜7.67(m,4H), 7.53(s,1H), 7.44〜7.36(m,6H), 6.41〜6.37(m,2H), 5.36(dd,3J=9.0,5.7Hz,1H), 4.52〜4.47(m,1H), 4.28〜4.24(m,1H), 4.16〜4.10(m,1H), 4.01〜3.94(m,4H), 2.84〜2.77(m,2H), 2.56〜2.10(m,4H), 1.99(s,3H), 2.02〜1.93(m,2H), 1.76〜1.62(m,6H), 1.55(s,3H), 1.09(s,9H), 0.87(s,9H), 0.06(s,6H)
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤＣｌ3）δ：57.4。
【００６５】
実施例４：（Ｒ）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム ５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン−３’−イル ３’−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルチミジン−５’−イル ホスホロチオエートの合成
合成例3-1で得られた化合物３９．６mg（６０．０μmol）を用い、実施例３と同様の方法により、目的物（式(XIII)において、Ｒ4＝ＴＢＤＰＳ、Ｒ5＝ＴＢＤＭＳ、Ｙ+＝ＨＤＢＵ+である化合物のＲｐ体）５２．１mg（４８．８μmol）を得た。収率９８％。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤＣｌ3）δ：7.95(s1H), 7.73〜7.66(m,4H), 7.52(s,1H), 7.43〜7.38(m,6H), 6.47〜6.39(m,2H), 5.35(dd,3J=9.9,5.4Hz,1H), 4.60〜4.57(m,1H), 4.43〜4.40(m,1H), 4.19〜4.13(m,2H), 4.09(d,2J=11.1Hz,1H), 3.99(d,2J=11.1Hz,1H), 3.49〜3.39(m,6H), 2.84〜2.82(m,2H), 2.55〜2.17(m,4H), 2.00(s,3H), 2.02〜1.95(m,2H), 1.76〜1.63(m,6H), 1.49(s,3H), 1.09(s,9H), 0.89(s,9H), 0.09(s,6H)
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤＣｌ3）δ：57.6。
【００６６】
実施例５：（Ｓ）−アンモニウム チミジン−３’−イル チミジン−５’−イル ホスホロチオエートの合成
実施例３で得られた化合物５０．４mg（４７．２μmol）をピリジン（１ml×３）、トルエン（１ml×３）で減圧下共沸乾燥し、トリエチルアミントリヒドロフルオライド０．５００mlを加えて室温で１５時間放置した。これに対し、０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（３ml）を加え、エチルエーテル（３ml×３）で洗浄し、有機相を０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（３ml）で逆抽出した。集めた水相を減圧下濃縮し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液中アセトニトリル０〜１０％）で精製することにより、目的物（式(IV)において、Ｙ+＝Ｈ4Ｎ+である化合物）２０．５mg（３５．４mmol）を得た。収率７５％。白色粉末。Ｒｐ：Ｓｐ＝０．５以下：９９．５以上。逆相ＨＰＬＣの結果を図１に示す。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，Ｄ2Ｏ）δ：7.69(s,1H), 7.63(s,1H), 6.28(dd,3J=6.9,6.9Hz,1H), 6.18(dd,3J=6.9,6.9Hz,1H), 4.95〜4.88(m,1H), 4.58〜4.53(m,1H), 4.19〜4.10(m,4H), 3.79(ddd,2JHH=19.0Hz,3JHP=12.7Hz,3JHH=4.0Hz,2H), 2.52(ddd,2J=14.1Hz,3J=6.0,3.6Hz,1H), 2.40〜2.31(m,3H), 1.88(s,3H), 1.84(s,3H)
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，Ｄ2Ｏ）δ：55.2。
【００６７】
実施例６：（Ｒ）−アンモニウムチミジン−３’−イル チミジン−５’−イル ホスホロチオエートの合成
実施例４で得られた化合物５２．１mg（４８．８μmol）を原料として用い、実施例５と同様の方法により目的物（式（Ｖ）において、Ｙ+＝Ｈ4Ｎ+である化合物）２０．６mg（３５．５μmol）を得た。収率７３％。白色粉末。Ｒｐ：Ｓｐ＝９９．５以上：０．５以下。逆相ＨＰＬＣの結果を図２に示す。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，Ｄ2Ｏ）δ：7.74(d,4J=1.4Hz,1H), 7.66(d,4J=1.4Hz,1H), 6.33(dd,3J=6.8,6.8Hz,1H), 6.22(dd,3J=6.9,6.9Hz,1H), 5.01〜4.94(m,1H), 4.62〜4.57(m,1H), 4.24〜4.12(m,4H), 3.85(ddd,2JHH=20.0Hz,3JHP=12.6Hz,3JHH=4.0Hz,2H), 2.57(ddd,2J=12.0Hz,3J=6.3,3.9Hz,1H), 2.41〜2.32(m,3H), 1.94(d,4J=1.4Hz,3H), 1.89(d,4J=1.4Hz,3H)
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，Ｄ2Ｏ）δ：55.6。
【００６８】
＜Ｈ−ホスホネート法を用いたチミジル酸二量体の合成＞
比較例１：１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム ５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン−３’−イル ３’−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルチミジン−５’−イル ホスホロチオエートの合成
５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン−３’−イル Ｈ−ホスホネート０．６９０ｇ（０．９９０mmol）、３’−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルチミジン０．３２１ｇ（０．９００mmol）をピリジン（２ml×３）で減圧下共沸乾燥した後、ピリジン（１０．０ml）溶液とした。これに対し、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスホニッククロライド（Ｂｏｐ−Ｃｌ）０．４５８ｇ（１．８０mmol）を加え、室温で２０分間攪拌した。ピリジンを減圧留去した後、クロロホルム（３０ml）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ml×３）で洗浄し、クロロホルム（３０ml）で逆抽出した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。残渣をピリジン（２ml×３）で減圧下共沸乾燥し、ピリジン（９．００ml）に溶かした。これに対し、粉末状の硫黄０．１４４ｇ（４．４９mmol）を加え、室温で２時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、残渣をクロロホルム（５０ml）に溶かして１Ｍトリエチルアンモニウム ビカーボネート緩衝液（５０ml）で洗浄し、水相をクロロホルム（５０ml×２）で逆抽出した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中メタノール０〜３％、トリエチルアミン０．５％）で精製した。得られたトリエチルアンモニウム ５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン−３’−イル ３’−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルチミジン−５’−イル ホスホロチオエートをクロロホルム（５０ml）に溶かし、０．２Ｍ １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム ビカーボネート緩衝液（５０ml）で洗浄し、水相をクロロホルム（５０ml×２）で逆抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を留去することにより、目的物（式(XIII)において、Ｒ4＝ＴＢＤＰＳ、Ｒ5＝ＴＢＤＭＳ、Ｙ+＝ＨＤＢＵ+である化合物）０．９０１ｇ（０．８４４mmol）を得た。収率８４％。白色粉末。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤＣｌ3）δ：7.94, 7.89(s,s,1H), 7.73〜7.66(m,4H), 7.55, 7.52(s,s,1H), 7.44〜7.36(m,6H), 6.47〜6.36(m,2H), 5.40〜5.32(m,1H), 4.59〜4.56, 4.51〜4.48(m,m,1H), 4.42〜4.40, 4.29〜4.26(m,m,1H), 4.19〜3.95(m,5H), 3.49〜3.39(m,6H), 2.86〜2.80(m,2H), 2.63, 2.48(dd,2J=13.2Hz,3J=5.7Hz,dd,2J=13.4Hz,3J=5.3Hz,1H), 2.27〜2.10(m,3H), 2.00(s,3H), 2.03〜1.95(m,2H), 1.76〜1.64(m,6H), 1.55,1.49(s,s,3H), 1.09(s,9H), 0.89, 0.87(s,s,9H), 0.08, 0.06(s,s,6H)
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤＣｌ3）δ：57.5(Rp, 46%), 57.3(Sp, 54％)。
【００６９】
比較例２：アンモニウム チミジン−３’−イル チミジン−５’−イル ホスホロチオエートの合成
比較例１で得られた化合物４０．２mg（３９．６μmol）をトリエチルアミントリヒドロフルオライド０．３９６mlに溶かし、室温で３時間攪拌した後、水１mlを加え、逆相カラムクロマトグラフィー（０．１Ｍリン酸アンモニウム緩衝液中アセトニトリル０〜１０％）で精製することにより、目的物（式(IV)及び（Ｖ）において、Ｙ+＝Ｈ4Ｎ+である化合物の混合物）１５．７mg（２７．１mmol）を得た。収率６８％。白色粉末。Ｒｐ：Ｓｐ＝４１：５９。逆相ＨＰＬＣの結果を図３に示す。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，Ｄ2Ｏ）δ：6.73(s,1H), 6.66(s,1H), 6.31(dd,3J=6.6,6.6Hz,1H), 6.21(dd,3J=6.6,6.6Hz,1H), 4.99〜4.91(m,1H), 4.63〜4.56(m,1H), 4.22〜4.15(m,4H), 3.89〜3.76(m,2H), 2.59〜2.51(m,1H), 2.43〜2.34(m,3H), 1.93, 1.91(s,s,3H), 1.87(s,3H)
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，Ｄ2Ｏ）δ：55.6(Rp, 42%), 55.2(Sp, 58％)
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例５の逆相ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図２】 実施例６の逆相ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図３】 比較例２の逆相ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【発明の属する技術分野】
この発明は、ジヌクレオシドホスホロチオエートの製造法に関し、更に詳しくは、立体制御された光学純度の高いジヌクレオシドホスホロチオエートの製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ジヌクレオシドホスホロチオエートは、近年、重要なアンチセンス薬として注目されており、更に多くの病気についても臨床試験が行われている。ジヌクレオシドホスホロチオエートは、リン原子上に不斉中心を有しており、その絶対立体配置の相違によりアンチセンス効果が異なる。また、近年のin vitro研究では、ジヌクレオシドホスホロチオエートの性質として、例えばＲＮＡｓとの雑種形成能やヌクレアーゼ耐性、ＲＮaseＨ能などはリン原子上のキラリティーに影響されることが報告されており(Med. Chem. Lett. 2000, 8, 275-284)、リン原子上の立体を制御したジヌクレオシドホスホロチオエートの効率的な合成法が求められている。
【０００３】
しかし、従来、ジヌクレオシドホスホロチオエートは、ホスホロアミダイト法等により合成されており(Beaucage, S.L. ; Iyer, R. P. Tetrahedron, 1992, 48, 2223-2311)、これらの合成法では、リン原子上の立体制御を行うことは困難であったため、合成されたジヌクレオシドホスホロチオエートは、Ｒ体とＳ体のジアステレオマーの混合物であった。
【０００４】
本発明の課題は、リン原子上の立体を制御した、立体規則性の高いジヌクレオシドホスホロチオエートの効率的な合成法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、求核性のないアニオン種を有する新規活性化剤を用いた反応の開発を検討し、本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明は、式（Ｉ）
【０００７】
【化９】
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又は炭素数６〜１４のアリール基、Ｒ3は炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ4は水酸基の保護基、Ｂは式
【０００９】
【化１０】
で表されるチミン、アデニン、シトシン、グアニンあるいはそれらの誘導体から誘導される基を示す。］
で表される光学活性なヌクレオシド３’−ホスホロアミダイト（以下ホスホロアミダイト（Ｉ）という）と、式(II)
【００１１】
【化１１】
［式中、Ｒ5は水酸基の保護基、Ｂは前記と同じ意味を示す。］
で表されるヌクレオシド（以下ヌクレオシド(II)という）とを、式(III)
【００１３】
【化１２】
［式中、Ｘ-はＢＦ4 -、ＰＦ6 -、ＴｆＯ-（ＴｆはＣＦ3ＳＯ2−を示す。以下同じ）、Ｔｆ2Ｎ-、ＡｓＦ6 -又はＳｂＦ6 -を示す。また、環状構造Ａは窒素原子と共に形成する炭素数３〜１６のモノシクロ又はビシクロ構造を示す。］
で表される活性化剤（以下活性化剤(III)という）を用いて縮合した後、硫化及び脱保護を行うことを特徴とする、式(IV)又は（Ｖ）で表される立体規則性の高いジヌクレオシドホスホロチオエートの製造法を提供するものである。
【００１５】
【化１３】
［各式中、Ｙ+はアンモニウムイオン、Ｂは前記と同じ意味を示し、各式中の２個のＢは同一でも異なっていても良い。］
【００１７】
【発明の実施の形態】
ホスホロアミダイト（Ｉ）は、適当な１，２−アミノアルコールから公知の方法で合成することができる(Tetrahedron:Asymmetry, 1995, 6, 1051-1054)。例えば、式(VI)
【００１８】
【化１４】
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又はアリール基、Ｒ3は炭素数１〜３のアルキル基を示す。］
で表される光学活性な１，２−アミノアルコール（以下アミノアルコール(VI)という）を三塩化リンと反応させて得られる、式(VII)
【００２０】
【化１５】
［式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は前記と同じ意味を示す。］
で表される光学活性なホスフィチル化剤（以下ホスフィチル化剤(VII)という）を、式(VIII)
【００２２】
【化１６】
［式中、Ｒ4は水酸基の保護基、Ｂは式
【００２４】
【化１７】
で表されるチミン、アデニン、シトシン、グアニンあるいはそれらの誘導体から誘導される基を示す。］
で表されるヌクレオシド（以下ヌクレオシド(VIII)という）と反応させることにより得られる。
【００２６】
アミノアルコール(VI)としては、（Ｓ）−及び（Ｒ）−２−メチルアミノ−１−フェニルエタノール、（１Ｒ，２Ｓ）−エフェドリン、（１Ｒ，２Ｓ）−２−メチルアミノ−１，２−ジフェニルエタノール等が挙げられる。
【００２７】
ヌクレオシド(VIII)において、Ｂはチミン、アデニン、シトシン又はグアニンあるいはそれらの誘導体から誘導される基を示すが、誘導体としては、アデニン、シトシン及びグアニンのアミノ基を保護基で保護したもの等が挙げられ、具体的には、下記式で表される化合物が挙げられる。
【００２８】
【化１８】
（式中、Ｒ6は炭素数１〜１５のアルキル基、アリール基、アラルキル基、アリールオキシアルキル基を示し、中でもメチル基、イソプロピル基、フェニル基、ベンジル基、フェノキシメチル基が好ましく、特にフェニル基が好ましい。また、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ炭素数１〜４のアルキル基を示し、特にメチル基が好ましい。）
ヌクレオシド(VIII)は、チミジン、アデノシン、シチジン、グアノシン又はそれらの誘導体の5'位の水酸基を、tert-ブチルジフェニルシリル基（ＴＢＤＰＳ）、tert-ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、４，４’−ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）、４−メトキシトリチル基（ＭＭＴｒ）等の保護基で保護したものである。
【００３０】
上記のような方法で得られる、ホスホロアミダイト（Ｉ）において、Ｒ1及びＲ2としては、Ｒ1及びＲ2のいずれか一方が水素原子で他方がフェニル基、Ｒ1及びＲ2のいずれか一方がメチル基で他方がフェニル基、あるいはＲ1及びＲ2が共にフェニル基の組み合わせが好ましく、Ｒ1がフェニル基、Ｒ2が水素原子の組み合わせが更に好ましい。Ｒ3はメチル基が好ましい。Ｒ4はＴＢＤＰＳ、ＴＢＤＭＳが好ましく、ＴＢＤＰＳが更に好ましい。
【００３１】
ヌクレオシド(II)は、チミジン、アデノシン、シチジン、グアノシン又はそれらの誘導体の3'位の水酸基を保護したものであり、Ｂで示されるチミン、アデニン、シトシン、グアニン又はそれらの誘導体から誘導される基は、ヌクレオシド(VIII)で例示したものが挙げられる。ヌクレオシド(II)とヌクレオシド(VIII)のＢは、同一でも異なっていても良い。Ｒ5で示される水酸基の保護基としては、ＴＢＤＰＳ、ＴＢＤＭＳ、アセチル基（Ａｃ）、ベンジル基（Ｂｚ）、ＤＭＴｒ、ＭＭＴｒ等が挙げられ、ＴＢＤＭＳが好ましい。
【００３２】
本発明の方法では、まず、ホスホロアミダイト（Ｉ）とヌクレオシド(II)とを、活性化剤(III)の存在下で反応させて、式(IX)
【００３３】
【化１９】
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＢは前記と同じ意味を示す。］
で表されるホスファイト（以下ホスファイト(IX)という）を得る。
【００３５】
ここで用いる活性化剤(III)は、ホスホロアミダイト（Ｉ）のチッソ原子に対するプロトン供給能力を有し、求核試薬としては働かないものである。活性化剤(III)中、Ｘ-としては、ＢＦ4 -、ＰＦ6 -、ＴｆＯ-、Ｔｆ2Ｎ-が好ましい。また、環状構造Ａは窒素原子と共に形成する炭素数３〜１６のモノシクロ又はビシクロ構造を示し、特に式(III-1)で表されるモノシクロ構造を有するものが好ましい。
【００３６】
【化２０】
（式中、Ｘ-は前記と同じ意味を示す。ｎは３〜７の数を示し、４又は５が好ましい。）
活性化剤(III)は、式(X)
【００３８】
【化２１】
（式中、環状構造Ａは前記と同じ意味を示す。）
で表されるアミンと、式(XI)
ＨＸ (XI)
（式中、Ｘは前記の意味を示す。）
で表される化合物とを反応させることにより容易に得ることができる。活性化剤(III)は特にアセトニトリルに良い溶解性を示すので、ホスホロアミダイト（Ｉ）とヌクレオシド(II)の反応は、アセトニトリル等の溶媒中で行うのが好ましい。
【００４０】
ホスホロアミダイト（Ｉ）とヌクレオシド(II)とは、ホスホロアミダイト（Ｉ）に対し、ヌクレオシド(II)を、０．５〜１．０当量倍の割合で反応させることが好ましい。活性化剤(III)は、ホスホロアミダイト（Ｉ）に対し、１〜５当量倍の割合で用いるのが好ましい。反応温度は０〜４０℃が好ましく、反応圧力は１気圧が好ましい。
【００４１】
次に、得られたホスファイト(IX)を、無水酢酸等でＮ−アセチル化した後、硫化剤により硫化し、式(XII)
【００４２】
【化２２】
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＢは前記と同じ意味を示し、Ｒ9はアセチル基を示す。］
で表される化合物（以下化合物(XII)という）を得る。硫化剤としては、硫黄、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルチウラムジスルフィド、１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（Beaucage試薬）等が挙げられ、Beaucage試薬が好ましい。
【００４４】
硫化後、化合物(XII)のキラル補助物質を１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）等で処理して除き、式(XIII)
【００４５】
【化２３】
［式中、Ｒ4、Ｒ5、Ｂ及びＹ+は前記と同じ意味を示す。］
で表される保護されたジヌクレオシドホスホロチオエートを得る。最後に、水酸基の保護基を、（ＣＨ3ＣＨ2）3Ｎ・３ＨＦ等で除き、式(IV)又は（Ｖ）で表される立体規則性の高いジヌクレオシドホスホロチオエートを得ることができる。
【００４７】
式(IV)、（Ｖ）又は(XIII)において、Ｙ+で表されるアンモニウムイオンとしては、Ｒ4Ｎ+（Ｒは、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を示し、４個のＲは、同一でも異なっていても良い）で表されるアンモニウムイオン、又は１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムイオン（ＨＤＢＵ+）等が挙げられる。
【００４８】
本発明の方法によると、立体制御された光学純度の高いジヌクレオシドホスホロチオエートを効率的に得ることができる。
【００４９】
【実施例】
例中の％は特記しない限り重量％である。
【００５０】
＜活性化剤(III-1)の合成例＞
合成例1-1：Ｎ−シアノメチルピロリジニウムテトラフルオロボレイトの合成
アルゴン雰囲気下、Ｎ−シアノメチルピロリジン０．５５１ｇ（５．００mmol）のエチルエーテル（５．００ml）溶液を−７８℃に冷却し、攪拌しつつ５４％四フッ化硼素酸エチルエーテル溶液０．６８９ml（５．００mmol）を滴下した。溶液を室温に戻した後、減圧下濃縮、乾燥し、残渣にエチルエーテル（５ml）を加えて激しく攪拌し、シリンジを用いて溶媒を除去した。この洗浄操作を５回繰り返した後、真空乾燥し、目的物（式(III-1) において、ｎ＝４、Ｘ-＝ＢＦ4 -の活性化剤）０．９９０ｇ（５．００mmol）を得た。
収率定量的。白色粉末。潮解性大。
・融点：１１３．０〜１１４．０℃
・ＩＲ（ＫＢｒ）νmax：2988, 2950, 2825, 2527, 2445, 1451, 1407, 1374, 1298, 1119, 929 cm-1
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤ3ＣＮ）δ：7.17(br,1H), 4.30(s,2H), 3.51(br,4H), 2.13〜2.08(m,4H)
・13Ｃ−ＮＭＲ（７５MHz, ＣＤ3ＣＮ）δ：112.0, 55.9, 41.8, 23.2。
【００５１】
合成例1-2：Ｎ−シアノメチルピロリジニウムヘキサフルオロホスフェートの合成
６１％ヘキサフルオロリン酸水溶液１．２０ｇ（５．００mmol）に水５．００mlを加え、攪拌しつつＮ−シアノメチルピロリジン０．５５１ｇ（５．００mmol）を滴下した後、溶液を凍結乾燥した。残渣にエチルエーテル（１０ml）を加え、激しく攪拌し、シリンジを用いて溶媒を除去した。この洗浄操作を３回繰り返した後、真空乾燥し、目的物（式(III-1)において、ｎ＝４、Ｘ-＝ＰＦ6 -の活性化剤）１．２８ｇ（５．００mmol）を得た。収率定量的。白色粉末。潮解性大。
・融点：５６．０〜５７．０℃
・ＩＲ（ＫＢｒ）νmax：2988, 2828, 2532, 2448, 1626, 1457, 1296, 1082, 987, 834 cm-1
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤ3ＣＮ）δ：8.27(br,1H), 4.24(s,2H), 3.48(br,4H), 2.12〜2.08(m,4H)
・13Ｃ−ＮＭＲ（７５MHz, ＣＤ3ＣＮ）δ：112.1, 56.0, 42.1, 23.5
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤ3ＣＮ）δ：-146.0(septet, 1ＪPF=707Hz)。
【００５２】
合成例1-3：Ｎ−シアノメチルピロリジニウムトリフルオロメタンスルホネートの合成
Ｎ−シアノメチルピロリジン０．５５１ｇ（５．００mmol）のジクロロメタン（５．００ml）溶液を０℃に冷却し、攪拌しつつトリフルオロメタンスルホン酸０．４４２ml（５．００mmol）を滴下した後、エチルエーテル（１０ml）を加えた。生じた固体を吸引ろ過によって集め、エチルエーテル（１ml×３）で洗浄した後、減圧下乾燥して、目的物（式(III-1)において、ｎ＝４、Ｘ-＝ＴｆＯ-の活性化剤）１．１１ｇ（４．２７mmol）を得た。収率８５％。白色粉末。潮解性小。
・融点：６７．０〜６７．５℃
・ＩＲ（ＫＢｒ）νmax：2996, 2841, 2651, 2477, 2347, 2282, 1637, 1462, 1437, 1269, 1228, 1168, 1033, 985, 911, 849, 761, 641 cm-1
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤ3ＣＮ）δ：8.16(br,1H), 4.30(s,2H), 3.50(br,4H), 2.14〜2.09(m,4H)
・13Ｃ−ＮＭＲ（７５MHz, ＣＤ3ＣＮ）δ：121.2(q,1JCF=320Hz), 55.9, 42.0, 23.5。
【００５３】
合成例1-4：Ｎ−シアノメチルピペリジニウムテトラフルオロボレートの合成
Ｎ−シアノメチルピペリジン１．２４ｇ（１０．０mmol）のジクロロメタン（１０．０ml）溶液に対し、攪拌しつつ５４％四フッ化硼素酸エチルエーテル溶液１．３８ml（１０．０mmol）を滴下した。溶液をエチルエーテル（２０ml）で希釈し、生じた固体を吸引ろ過によって集め、エチルエーテル（１０ml×２）で洗浄した後、減圧下乾燥して、目的物（式(III-1)において、ｎ＝５、Ｘ-＝ＢＦ4 -の活性化剤）２．０１ｇ（９．４８mmol）を得た。収率９５％。白色粉末。潮解性なし。
・融点：１０３．０〜１０３．５℃
・ＩＲ（ＫＢｒ）νmax：3149, 2997, 2952, 2876, 2591, 2570, 2491, 2372, 1457, 1422, 1296, 1074, 980, 935, 850, 641 cm-1
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤ3ＣＮ）δ：6.74(br,1H), 4.22(s,2H), 3.58(br,2H), 3.15(br,2H), 1.97〜1.51(m,6H)
・13Ｃ−ＮＭＲ（７５MHz, ＣＤ3ＣＮ）δ：111.2, 54.6, 44.0, 23.0, 20.5。
【００５４】
合成例1-5：Ｎ−シアノメチルピペリジニウムヘキサフルオロホスフェートの合成
６１％ヘキサフルオロリン酸水溶液１．２０ｇ（５．００mmol）に水５．００mlを加え、攪拌しつつＮ−シアノメチルピペリジン０．６２１ｇ（５．００mmol）を滴下した後、溶液を凍結乾燥した。残渣にジクロロメタン（５ml）、エチルエーテル（１０ml）を加え、−７８℃に冷却し、激しく攪拌すると固体が生じたので、室温に昇温した後、シリンジを用いて溶媒を除去した。残渣にエチルエーテル（５ml）を加え、激しく攪拌した後、シリンジを用いて溶媒を除去した。この洗浄操作を３回繰り返した後、真空乾燥し、目的物（式(III-1)において、ｎ＝５、Ｘ-＝ＰＦ6 -の活性化剤）１．３１ｇ（４．８５mmol）を得た。収率９７％。白色粉末。潮解性大。
・融点：５４．０〜５５．０℃
・ＩＲ（ＫＢｒ）νmax：2997, 2953, 2876, 2589, 2570, 2490, 2372, 1655, 1455, 1422, 1297, 1192, 1142, 1084, 1037, 981, 953, 837, 746 cm-1
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤ3ＣＮ）δ：7.94(br,1H), 4.15(s,2H), 3.31(br,4H), 1.92〜1.83(m,4H), 1.63(br,2H)
・13Ｃ−ＮＭＲ（７５MHz, ＣＤ3ＣＮ）δ：111.5, 54.5, 44.2, 23.1, 20.8
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤ3ＣＮ）δ：-145.9(septet, 1ＪPF=707Hz)。
【００５５】
合成例1-6：Ｎ−シアノメチルピペリジニウムトリフルオロメタンスルホネートの合成
Ｎ−シアノメチルピペリジン０．６２１ｇ（５．００mmol）のジクロロメタン（５．００ml）溶液を０℃に冷却し、攪拌しつつトリフルオロメタンスルホン酸０．４４２ml（５．００mmol）を滴下した。溶液を室温に昇温し、エチルエーテル（１０ml）を加えた後、固体を吸引ろ過によって集め、エチルエーテル（１ml×３）で洗浄した後、減圧下乾燥して、目的物（式(III-1)において、ｎ＝５、Ｘ-＝ＴｆＯ-の活性化剤）１．３７ｇ（５．００mmol）を得た。収率定量的。白色粉末。潮解性小。
・融点：１１０．０〜１１０．５℃
・ＩＲ（ＫＢｒ）νmax：2999, 2723, 1460, 1289, 1226, 1168, 1083, 1027, 978, 936, 762, 641 cm-1
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤ3ＣＮ）δ：8.12(br,1H), 4.19(s,2H), 3.58(br,2H), 3.09(br,2H), 2.21(br,4H), 1.50(br,1H)
・13Ｃ−ＮＭＲ（７５MHz, ＣＤ3ＣＮ）δ：120.9(q, 1ＪCF=319Hz), 111.4, 54.5, 44.2, 23.0, 20.7。
【００５６】
＜ホスフィチル化剤(VII)の合成＞
合成例2-1：（５Ｓ）−２−クロロ−３−メチル−５−フェニル−１，３，２−オキサアザホスホリジンの合成
（Ｓ）−２−メチルアミノ−１−フェニルエタノール３．０２ｇ（１５．０mmol）、トリエチルアミン５．５８ml（４０．０mmol）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２０．０ml）溶液を０℃に冷却した三塩化リン１．７５ml（２０．０mmol）のＴＨＦ（２０．０ml）溶液に対して、攪拌しつつ滴下し、温度を室温にして３０分間攪拌した。生じた塩を、グラスフィルターでアルゴン雰囲気下ろ過し、塩をＴＨＦ（１０ml×３）で洗浄した。ろ液を濃縮し、残渣を減圧下蒸留することにより、目的物（式(VII)において、Ｒ1＝フェニル基、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝メチル基である化合物の５Ｓ体）２．５９ｇ（１２．０mmol）を得た。収率６０％。８９〜９０℃／０．２mmＨg。無色透明液体。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤＣｌ3）δ：7.54〜7.34(m,5H), 5.83, 5.44(br,br,1H), 3.60〜3.42(m,1H), 3.22〜3.12(m,1H), 2.77(d,3JHP=15.6Hz,3H)
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤＣｌ3）δ：172.4(br), 171.3(br)。
【００５７】
合成例2-2：（５Ｒ）−２−クロロ−３−メチル−５−フェニル−１，３，２−オキサアザホスホリジンの合成
（Ｒ）−２−メチルアミノ−１−フェニルエタノール２．２７ｇ（１５．０mmol）を用い、合成例2-1と同様の手法により目的物（式(VII)において、Ｒ1＝フェニル基、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝メチル基である化合物の５Ｒ体）を合成した。収率６５％。８１〜８２℃／０．２mmHg。無色透明液体。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤＣｌ3）δ：7.55〜7.35(m,5H), 5.84, 5.46(br,br,1H), 3.58〜3.43(m,1H), 3.22〜3.13(m,1H), 2.78(d,3JHP=16.5Hz,3H)
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤＣｌ3）δ：172.4(br), 171.4(br)
合成例2-3：（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−クロロ−３−メチル−４，５−ジフェニル−１，３，２−オキサアザホスホリジンの合成
（１Ｒ，２Ｓ）−２−メチルアミノ−１，２−ジフェニルエタノール２．２７ｇ（１０．０mmol）、トリエチルアミン２．７９ml（２０．０mmol）のＴＨＦ（１０．０ml）溶液を、０℃に冷却した三塩化リン０．８７２ml（１０．０mmol）のＴＨＦ（１０．０ml）溶液に対して、攪拌しつつ滴下した後、１時間加熱環流した。溶液を室温まで放冷し、生じた塩を、グラスフィルターでアルゴン雰囲気下ろ過し、塩をＴＨＦ（１０ml×２）で洗浄した後、ろ液を減圧下濃縮して、目的物（式(VII)において、Ｒ1＝フェニル基、Ｒ2＝フェニル基、Ｒ3＝メチル基である化合物の２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ体）３．１７ｇ（１０．０mmol）を得た。収率定量的（純度９２％）。乳白色固体。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤＣｌ3）δ：7.08〜7.05(m,6H), 6.91〜6.81(m,4H), 6.15(d,3J=8.3Hz,1H), 4.64(dd,3JHH=8.3Hz,3JHP=4.2Hz,1H), 2.64(d,3JHP=15.3Hz,3H)
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤＣｌ3）δ：171.7。
【００５８】
＜ホスホロアミダイト（Ｉ）の合成＞
合成例3-1：（２Ｓ，５Ｓ）−２−（５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン−３’−イル）−３−メチル−５−フェニル−１，３，２−オキサアザホスホリジンの合成
５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン０．２４０ｇ（０．５００mmol）をピリジン（１ml×３）、トルエン（１ml×３）で共沸乾燥し、ＴＨＦ（２．５０ml）に溶かした後、ジイソプロピルエチルアミン０．４２５ml（２．５０mmol）を加え、−７８℃に冷却した。これに対し、合成例2-1で得られたホスフィチル化剤０．１１９ｇ（０．５５２mmol）のＴＨＦ（０．５００ml）溶液を滴下し、室温で３０分間攪拌した。溶液をクロロホルム（１５ml）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１５ml×３）で洗浄した後、水相をクロロホルム（１５ml）で逆抽出した。集めた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル−トリエチルアミン、５０：５０：３、v/v/v）によって精製することにより、目的物（式（Ｉ）において、Ｒ1＝フェニル基、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝メチル基、Ｒ4＝ＴＢＤＰＳである化合物の２Ｓ，５Ｓ体）０．２５７ｇ（０．３９０mmol）を得た。収率７８％、白色粉末。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤＣｌ3）δ：8.96(br,1H), 7.71〜7.65(m,4H), 7.46〜7.33(m,12H), 6.42(dd,3J=8.2,5.6Hz,1H), 5.60(dd,3J=7.2,7.2Hz,1H), 4.91〜4.85(m,1H), 4.06〜4.05(m,1H), 4.01(dd,2J=11.4Hz,3J=2.7Hz,1H), 3.86(dd,2J=11.4Hz,3J=2.7Hz,1H), 3.53(ddd,2J=9.0Hz,3JHH=7.2Hz,3JHP=3.3Hz,1H), 2.91(dd,2J=9.0Hz,3J=7.2Hz,1H), 2.71(d,3JHP=12.0Hz,3H), 2.42(ddd,2J=13.5Hz,3J=5.6,2.3Hz,1H), 2.20(ddd,2J=13.5Hz,3J=8.2,6.3Hz,1H), 1.61(s,3H), 1.11(s,9H)
・13Ｃ−ＮＭＲ（７５MHz, ＣＤＣｌ3）δ：163.7, 150.4, 140.3(d,3JCP=3.4Hz), 135.5, 135.3, 135.1, 132.8, 132.3, 130.2, 130.0, 128.5, 128.1, 128.0, 128.0, 125.9, 111.3, 86.5(d,2JCP=5.5Hz), 84.3, 81.9(d,2JCP=9.8Hz), 72.3(d,3JCP=14.9Hz), 63.6, 57.0(d,2JCP=4.9Hz), 40.2(d,3JCP=1.4Hz), 31.8(d,2JCP=22.7Hz), 27.0, 19.4, 12.0
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤＣｌ3）δ：143.9。
【００５９】
合成例3-2：（２Ｒ，５Ｒ）−２−（５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン−３’−イル）−３−メチル−５−フェニル−１，３，２−オキサアザホスホリジンの合成
５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン０．７２１ｇ（１．５０mmol）をピリジン（２ml×３）、トルエン（２ml×３）で共沸乾燥し、ＴＨＦ（５．００ml）に溶かした後、ジイソプロピルエチルアミン１．２８ml（７．５３mmol）を加え、−７８℃に冷却した。これに対し、合成例2-2で得られたホスフィチル化剤０．３５６ｇ（１．６５mmol）のＴＨＦ（３．００ml）溶液を滴下し、室温で３０分間攪拌した。溶液をクロロホルム（３０ml）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ml×３）で洗浄した後、水相をクロロホルム（３０ml）で逆抽出した。集めた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル−トリエチルアミン、５０：５０：３、v/v/v）によって精製することにより、目的物（式（Ｉ）において、Ｒ1＝フェニル基、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝メチル基、Ｒ4＝ＴＢＤＰＳである化合物の２Ｒ，５Ｒ体）０．７３５ｇ（１．１１mmol）を得た。収率７４％。白色粉末。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤＣｌ3）δ：9.00(br,1H), 7.68〜7.65(m,4H), 7.49〜7.32(m,12H), 6.43(dd,3J=8.1,5.8Hz,1H), 5.58(dd,3J=7.4,7.4Hz,1H), 4.95〜4.90(m,1H), 4.05〜4.04(m,1H), 3.98(dd,2J=11.7Hz,3J=2.3Hz,1H), 3.88(dd,2J=11.7Hz,3J=2.3Hz,1H), 3.51(ddd,2J=8.6Hz,3JHH=7.4Hz,3JHP=3.5Hz,1H), 2.90(dd,2J=8.6Hz,3J=7.4Hz,1H), 2.74(d,3JHP=12.0Hz,3H), 2.44(ddd,2J=13.5Hz,3J=5.8,2.1Hz,1H), 2.24(ddd,2J=13.5Hz,3J=8.1,6.6Hz,1H), 1.59(s,3H), 1.11(s,9H)
・13Ｃ−ＮＭＲ（７５MHz, ＣＤＣｌ3）δ：163.8, 150.4, 140.3(d,3JCP=3.2Hz), 135.5, 135.2, 135.2, 132.9, 132.2, 130.1, 130.0, 128.5, 128.1, 128.0, 128.0, 125.8, 111.3, 86.4(d,2JCP=2.0Hz), 84.4, 81.8(d,2JCP=9.8Hz), 72.5(d,3JCP=15.8Hz), 63.5, 57.1(d,2JCP=4.9Hz), 40.4(d,3JCP=4.9Hz), 31.8(d,2JP=23.0Hz), 27.0, 19.4, 12.0
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤＣｌ3）δ：144.6。
【００６０】
合成例3-3：（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン−３’−イル）−３−メチル−４，５−ジフェニル−１，３，２−オキサアザホスホリジンの合成
５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン０．９６１ｇ（２．００mmol）をピリジン（５ml×３）、トルエン（５ml×３）で共沸乾燥し、ＴＨＦ（５．００ml）に溶かした後、ジイソプロピルエチルアミン１．７０ml（１０．０mmol）を加え、−７８℃に冷却した。これに対し、合成例2-3で得られたホスフィチル化剤０．８７５ｇ（３．００mmol）のＴＨＦ（３．００ml）溶液を滴下し、室温で３０分間攪拌した。溶液をクロロホルム（６０ml）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（６０ml×３）で洗浄した後、水相をクロロホルム（６０ml）で逆抽出した。集めた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル−トリエチルアミン、６７：３３：２〜０：１００：２、v/v/v）によって精製することにより、目的物（式（Ｉ）において、Ｒ1＝フェニル基、Ｒ2＝フェニル基、Ｒ3＝メチル基、Ｒ4＝ＴＢＤＰＳである化合物の２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ体）１．４１ｇ（１．９２mmol）を得た。収率９６％。白色粉末。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤＣｌ3）δ：7.99(br,1H), 7.69〜7.65(m,4H), 7.50(d,4J=1.1Hz,1H), 7.44〜7.32(m,6H), 7.08〜7.03(m,6H), 6.91〜6.88(m,2H), 6.82〜6.79(m,2H), 6.45(dd,3J=8.5,5.7Hz,1H), 5.88(d,3J=7.0Hz,1H), 5.06〜5.01(m,1H), 4.52(dd,3J=7.0,2.3Hz,1H), 4.10〜4.07(m,1H), 3.98(dd,2J=11.8Hz,3J=2.3Hz,1H), 3.91(dd,2J=11.8Hz,3J=2.3Hz,1H), 2.60(d,3JHP=11.1Hz,3H), 2.49(ddd,2J=13.4Hz,3J=5.7,2.1Hz,1H), 2.30(ddd,2J=13.4Hz,3J=8.5,6.3Hz,1H), 1.59(d,4J=1.1Hz,3H), 1.12(s,9H)
・13Ｃ−ＮＭＲ（７５MHz, ＣＤＣｌ3）δ：163.7, 150.5, 137.0(d,3JCP=3.7Hz), 136.0(d,3JCP=3.8Hz), 135.5, 135.2, 135.2, 132.9, 132.2, 130.1, 130.0, 128.2, 128.0, 127.9, 127.7, 127.5, 127.3, 126.6, 111.3, 86.5(d,4J=1.7Hz), 85.2(d,2JCP=8.9Hz), 84.4, 72.7(d,2JCP=18.2Hz), 68.8(d,3JCP=4.9Hz), 63.5, 40.5(d,3JCP=4.8Hz), 29.5(d,2JCP=19.3Hz), 27.0, 19.4, 12.0
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤＣｌ3）δ：142.3
＜ジヌクレオシドホスホロチオエートの合成＞
実施例1-1：トリエチルアンモニウム ５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン−３’−イル ３’−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルチミジン−５’−イル ホスホロチオエートの合成
ＮＭＲサンプルチューブ中に、合成例3-3で得られた化合物４４．２mg（６０．１μmol）、３’−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルチミジン１７．８mg（４９，９μmol）、合成例1-4で得られた活性化剤２１．２mg（１００μmol）を入れ、減圧下、五酸化二リン上で１２時間乾燥した。これに対し、アルゴン雰囲気下、アセトニトリル（０．４００ml）と、アセトニトリル−３ｄ（０．１００ml）を加え、５時間後より、31Ｐ−ＮＭＲ（外部標準、８５％リン酸）による測定を開始した。その後、得られたホスファイト（式(IX)において、Ｒ1＝フェニル基、Ｒ2＝フェニル基、Ｒ3＝メチル基、Ｒ4＝ＴＢＤＰＳ、Ｒ5＝ＴＢＤＭＳである化合物）に対し、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン １，１−ジオキサイド１２．０mg（６０．０μmol）を加え、３分後、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン７４．６μｌ（５００μmol）を加え、５０℃で４時間放置した。室温に放冷後、クロロホルム（３ml）で希釈し、ｐＨ７．０リン酸緩衝液（３ml）で洗浄し、水相をクロロホルム（３ml×２）で逆抽出した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下濃縮し、残渣を薄層クロマトグラフィー（ジクロロメタン中、メタノール１〜４％、トリエチルアミン０．５％）で精製し、目的物（式(XIII)において、Ｒ4＝ＴＢＤＰＳ、Ｒ5＝ＴＢＤＭＳ、Ｙ+＝トリエチルアンモニウムイオンである化合物のＳｐ体）４０．３mg（３９．７μmol）を得た。収率８０％。白色粉末。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤＣｌ3）δ：11.7(br,1H), 9.12(br,1H), 8.94(br,1H), 7.80, 7.78(s,s,1H), 7.72〜7.66(m,4H), 7.54, 7.50(s,s,1H), 7.44〜7.37(m,6H), 6.43〜6.33(m,2H), 5.36〜5.31(m,1H), 4.54〜4.51, 4.43〜4.42(m,m,1H), 4.36〜4.34, 4.28〜4.25(m,m,1H), 4.17〜3.91(m,4H), 3.10(q,3J=7.2Hz,6H), 2.63, 2.50(dd,2J=13.5Hz,3J=4.8Hz,dd,2J=12.5Hz,3J=4.7Hz,1H), 2.26〜2.03(m,3H), 1.99(s,3H), 2.03〜1.95(m,2H), 1.56, 1.51(s,s,3H), 1.33(t,3J=7.2Hz,9H), 1.09(s,9H), 0.89, 0.87(s,s,9H), 0.08, 0.06(s,s,6H)
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤＣｌ3）δ：58.0(Rp, Sp) 。
【００６１】
実施例1-2：アンモニウム チミジン−３’−イル チミジン−５’−イル ホスホロチオエートの合成
実施例1-1で得られた化合物４０．３mg（３９．７μmol）をトリエチルアミントリヒドロフルオライド（０．４００ml）に溶かし、室温で１５時間放置した。これに対し、０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（３ml）を加え、エチルエーテル（３ml×３）で洗浄し、有機相を０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（３ml）で逆抽出した。集めた水相を減圧下濃縮し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液中アセトニトリル０〜１０％）で精製することにより目的物（式(IV)において、Ｙ+＝Ｈ4Ｎ+である化合物）を得た。収率７０％。白色粉末。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，Ｄ2Ｏ）δ：7.75(d,4J=1.1Hz,1H), 7.68(d,4J=1.1Hz,1H), 6.33(dd,3J=6.9,6.9Hz,1H), 6.22(dd,3J=6.5,6.5Hz,1H), 5.00〜4.92(m,1H), 4.63〜4.59(m,1H), 4.24〜4.17(m,4H), 3.89〜3.77(m,2H), 2.57(ddd,2J=14.0Hz,3J=6.5,3.6Hz,1H), 2.45〜2.35(m,3H), 1.93(d,4J=1.1Hz,3H), 1.89(d,4J=1.1Hz,3H)
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，Ｄ2Ｏ）δ：55.6(Rp, 13％), 55.3(Sp, 87％)。
【００６２】
実施例２：31Ｐ−ＮＭＲによる縮合反応の追跡
ＮＭＲサンプルチューブ中に、合成例3-2で得られた化合物３３．０mg（５０．０μmol）、３’−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルチミジン１７．８mg（４９．９μmol）を入れ、減圧下、五酸化二リン上で１２時間乾燥した。これに対し、モレキュラーシーブ３Ａで８時間乾燥した、合成例1-1~1-6で得られた活性化剤(III)（１００μmol）のアセトニトリル（０．４００ml）溶液と、アセトニトリル−３ｄ（０．１００ml）を加え、縮合反応させ、ホスファイト（式(IX)において、Ｒ1＝フェニル基、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝メチル基、Ｒ4＝ＴＢＤＰＳである化合物）を得た。反応物の化学シフトを31Ｐ−ＮＭＲ（外部標準：８５％リン酸）により測定した。その結果を表１に示す。
【００６３】
【表１】
実施例３：（Ｓ）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム ５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン−３’−イル ３’−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルチミジン−５’−イル ホスホロチオエートの合成
合成例3-2で得られた化合物３９．６mg（６０．０μmol）、３’−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルチミジン１７．８mg（４９，９μmol）を減圧下、五酸化二リン上で１２時間乾燥し、モレキュラーシーブ３Ａで８時間乾燥した、合成例1-3で得られた活性化剤(III)２６．０mg（１００μmol）のアセトニトリル（０．５０ml）溶液を加え、室温で５分間放置した。これに対し、ピリジン４３．０μｌ（５００μmol）、無水酢酸１４．９μｌ（１００μmol）を加え、３０秒放置した後、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン １，１−ジオキサイド１２．０mg（６０．０μmol）を加え、更に３分後、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）７４．６μｌ（５００μmol）を加え、５０℃で３０分間放置した。室温に放冷後、クロロホルム（３ml）で希釈し、ｐＨ７．０リン酸緩衝液（３ml）で洗浄し、水相をクロロホルム（３ml×２）で逆抽出した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下濃縮し、残渣を薄層クロマトグラフィー（ジクロロメタン中メタノール１〜４％、トリエチルアミン０．５％）で精製した。得られたトリエチルアミン塩を０．２Ｍ １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム ビカーボネート緩衝液（３ml）で洗浄することにより、目的物（式(XIII)において、Ｒ4＝ＴＢＤＰＳ、Ｒ5＝ＴＢＤＭＳ、Ｙ+＝ＨＤＢＵ+である化合物のＳｐ体）５０．４mg（４７．２μmol）を得た。収率９５％。白色粉末。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤＣｌ3）δ：7.85(s,1H), 7.73〜7.67(m,4H), 7.53(s,1H), 7.44〜7.36(m,6H), 6.41〜6.37(m,2H), 5.36(dd,3J=9.0,5.7Hz,1H), 4.52〜4.47(m,1H), 4.28〜4.24(m,1H), 4.16〜4.10(m,1H), 4.01〜3.94(m,4H), 2.84〜2.77(m,2H), 2.56〜2.10(m,4H), 1.99(s,3H), 2.02〜1.93(m,2H), 1.76〜1.62(m,6H), 1.55(s,3H), 1.09(s,9H), 0.87(s,9H), 0.06(s,6H)
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤＣｌ3）δ：57.4。
【００６５】
実施例４：（Ｒ）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム ５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン−３’−イル ３’−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルチミジン−５’−イル ホスホロチオエートの合成
合成例3-1で得られた化合物３９．６mg（６０．０μmol）を用い、実施例３と同様の方法により、目的物（式(XIII)において、Ｒ4＝ＴＢＤＰＳ、Ｒ5＝ＴＢＤＭＳ、Ｙ+＝ＨＤＢＵ+である化合物のＲｐ体）５２．１mg（４８．８μmol）を得た。収率９８％。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤＣｌ3）δ：7.95(s1H), 7.73〜7.66(m,4H), 7.52(s,1H), 7.43〜7.38(m,6H), 6.47〜6.39(m,2H), 5.35(dd,3J=9.9,5.4Hz,1H), 4.60〜4.57(m,1H), 4.43〜4.40(m,1H), 4.19〜4.13(m,2H), 4.09(d,2J=11.1Hz,1H), 3.99(d,2J=11.1Hz,1H), 3.49〜3.39(m,6H), 2.84〜2.82(m,2H), 2.55〜2.17(m,4H), 2.00(s,3H), 2.02〜1.95(m,2H), 1.76〜1.63(m,6H), 1.49(s,3H), 1.09(s,9H), 0.89(s,9H), 0.09(s,6H)
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤＣｌ3）δ：57.6。
【００６６】
実施例５：（Ｓ）−アンモニウム チミジン−３’−イル チミジン−５’−イル ホスホロチオエートの合成
実施例３で得られた化合物５０．４mg（４７．２μmol）をピリジン（１ml×３）、トルエン（１ml×３）で減圧下共沸乾燥し、トリエチルアミントリヒドロフルオライド０．５００mlを加えて室温で１５時間放置した。これに対し、０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（３ml）を加え、エチルエーテル（３ml×３）で洗浄し、有機相を０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（３ml）で逆抽出した。集めた水相を減圧下濃縮し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液中アセトニトリル０〜１０％）で精製することにより、目的物（式(IV)において、Ｙ+＝Ｈ4Ｎ+である化合物）２０．５mg（３５．４mmol）を得た。収率７５％。白色粉末。Ｒｐ：Ｓｐ＝０．５以下：９９．５以上。逆相ＨＰＬＣの結果を図１に示す。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，Ｄ2Ｏ）δ：7.69(s,1H), 7.63(s,1H), 6.28(dd,3J=6.9,6.9Hz,1H), 6.18(dd,3J=6.9,6.9Hz,1H), 4.95〜4.88(m,1H), 4.58〜4.53(m,1H), 4.19〜4.10(m,4H), 3.79(ddd,2JHH=19.0Hz,3JHP=12.7Hz,3JHH=4.0Hz,2H), 2.52(ddd,2J=14.1Hz,3J=6.0,3.6Hz,1H), 2.40〜2.31(m,3H), 1.88(s,3H), 1.84(s,3H)
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，Ｄ2Ｏ）δ：55.2。
【００６７】
実施例６：（Ｒ）−アンモニウムチミジン−３’−イル チミジン−５’−イル ホスホロチオエートの合成
実施例４で得られた化合物５２．１mg（４８．８μmol）を原料として用い、実施例５と同様の方法により目的物（式（Ｖ）において、Ｙ+＝Ｈ4Ｎ+である化合物）２０．６mg（３５．５μmol）を得た。収率７３％。白色粉末。Ｒｐ：Ｓｐ＝９９．５以上：０．５以下。逆相ＨＰＬＣの結果を図２に示す。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，Ｄ2Ｏ）δ：7.74(d,4J=1.4Hz,1H), 7.66(d,4J=1.4Hz,1H), 6.33(dd,3J=6.8,6.8Hz,1H), 6.22(dd,3J=6.9,6.9Hz,1H), 5.01〜4.94(m,1H), 4.62〜4.57(m,1H), 4.24〜4.12(m,4H), 3.85(ddd,2JHH=20.0Hz,3JHP=12.6Hz,3JHH=4.0Hz,2H), 2.57(ddd,2J=12.0Hz,3J=6.3,3.9Hz,1H), 2.41〜2.32(m,3H), 1.94(d,4J=1.4Hz,3H), 1.89(d,4J=1.4Hz,3H)
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，Ｄ2Ｏ）δ：55.6。
【００６８】
＜Ｈ−ホスホネート法を用いたチミジル酸二量体の合成＞
比較例１：１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム ５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン−３’−イル ３’−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルチミジン−５’−イル ホスホロチオエートの合成
５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン−３’−イル Ｈ−ホスホネート０．６９０ｇ（０．９９０mmol）、３’−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルチミジン０．３２１ｇ（０．９００mmol）をピリジン（２ml×３）で減圧下共沸乾燥した後、ピリジン（１０．０ml）溶液とした。これに対し、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスホニッククロライド（Ｂｏｐ−Ｃｌ）０．４５８ｇ（１．８０mmol）を加え、室温で２０分間攪拌した。ピリジンを減圧留去した後、クロロホルム（３０ml）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ml×３）で洗浄し、クロロホルム（３０ml）で逆抽出した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。残渣をピリジン（２ml×３）で減圧下共沸乾燥し、ピリジン（９．００ml）に溶かした。これに対し、粉末状の硫黄０．１４４ｇ（４．４９mmol）を加え、室温で２時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、残渣をクロロホルム（５０ml）に溶かして１Ｍトリエチルアンモニウム ビカーボネート緩衝液（５０ml）で洗浄し、水相をクロロホルム（５０ml×２）で逆抽出した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中メタノール０〜３％、トリエチルアミン０．５％）で精製した。得られたトリエチルアンモニウム ５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン−３’−イル ３’−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルチミジン−５’−イル ホスホロチオエートをクロロホルム（５０ml）に溶かし、０．２Ｍ １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム ビカーボネート緩衝液（５０ml）で洗浄し、水相をクロロホルム（５０ml×２）で逆抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を留去することにより、目的物（式(XIII)において、Ｒ4＝ＴＢＤＰＳ、Ｒ5＝ＴＢＤＭＳ、Ｙ+＝ＨＤＢＵ+である化合物）０．９０１ｇ（０．８４４mmol）を得た。収率８４％。白色粉末。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，ＣＤＣｌ3）δ：7.94, 7.89(s,s,1H), 7.73〜7.66(m,4H), 7.55, 7.52(s,s,1H), 7.44〜7.36(m,6H), 6.47〜6.36(m,2H), 5.40〜5.32(m,1H), 4.59〜4.56, 4.51〜4.48(m,m,1H), 4.42〜4.40, 4.29〜4.26(m,m,1H), 4.19〜3.95(m,5H), 3.49〜3.39(m,6H), 2.86〜2.80(m,2H), 2.63, 2.48(dd,2J=13.2Hz,3J=5.7Hz,dd,2J=13.4Hz,3J=5.3Hz,1H), 2.27〜2.10(m,3H), 2.00(s,3H), 2.03〜1.95(m,2H), 1.76〜1.64(m,6H), 1.55,1.49(s,s,3H), 1.09(s,9H), 0.89, 0.87(s,s,9H), 0.08, 0.06(s,s,6H)
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，ＣＤＣｌ3）δ：57.5(Rp, 46%), 57.3(Sp, 54％)。
【００６９】
比較例２：アンモニウム チミジン−３’−イル チミジン−５’−イル ホスホロチオエートの合成
比較例１で得られた化合物４０．２mg（３９．６μmol）をトリエチルアミントリヒドロフルオライド０．３９６mlに溶かし、室温で３時間攪拌した後、水１mlを加え、逆相カラムクロマトグラフィー（０．１Ｍリン酸アンモニウム緩衝液中アセトニトリル０〜１０％）で精製することにより、目的物（式(IV)及び（Ｖ）において、Ｙ+＝Ｈ4Ｎ+である化合物の混合物）１５．７mg（２７．１mmol）を得た。収率６８％。白色粉末。Ｒｐ：Ｓｐ＝４１：５９。逆相ＨＰＬＣの結果を図３に示す。
・1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz，Ｄ2Ｏ）δ：6.73(s,1H), 6.66(s,1H), 6.31(dd,3J=6.6,6.6Hz,1H), 6.21(dd,3J=6.6,6.6Hz,1H), 4.99〜4.91(m,1H), 4.63〜4.56(m,1H), 4.22〜4.15(m,4H), 3.89〜3.76(m,2H), 2.59〜2.51(m,1H), 2.43〜2.34(m,3H), 1.93, 1.91(s,s,3H), 1.87(s,3H)
・31Ｐ−ＮＭＲ（１２１MHz，Ｄ2Ｏ）δ：55.6(Rp, 42%), 55.2(Sp, 58％)
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例５の逆相ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図２】 実施例６の逆相ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図３】 比較例２の逆相ＨＰＬＣの結果を示す図である。
Claims (4)
- 下記式(III-1)
で表される化合物。 - 式（Ｉ）
は式
で表される光学活性なヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトと、式(II)
で表されるヌクレオシドとを、式(III-1)
で表される活性化剤を用いて縮合した後、硫化及び脱保護を行うことを特徴とする、式(IV)又は（Ｖ）で表される立体規則性の高いジヌクレオシドホスホロチオエートの製造法。
同一でも異なっていても良い。］ - 式（Ｉ）中のＢのアデニン、シトシン、グアニンのアミノ基を保護基で保護した誘導体が、下記式で表される化合物群から選ばれるいずれか１つの化合物である請求項２記載の立体規則性の高いジヌクレオシドホスホロチオエートの製造法。
- 式（Ｉ）で表される光学活性なヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトが、式(VI)
で表される光学活性な１，２−アミノアルコールを三塩化リンと反応させて得られる、式(VII)
で表される光学活性なホスフィチル化剤を、式(VIII)
で表されるヌクレオシドと反応させることにより得られるものである請求項２又は３記載の製造法。
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