JP2006131596A - ヌクレオチド及びその誘導体の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ホスホロアミダイト法を改良し、大量合成を行うことを考慮したヌクレオチド及びその誘導体の製造方法を提供すること。
【解決手段】ヌクレオシド誘導体とホスホロアミダイト誘導体と非プロトン性有機化合物から選択される反応溶媒と前記ヌクレオシド誘導体及び前記ホスホロアミダイト誘導体の間を縮合させてヌクレオチド又はその誘導体を生成する反応を活性化する、有機酸から選択される活性化剤とを混合することを特徴とする。活性化剤としてカルボン酸などの有機酸を採用することで高い反応性が得られた。カルボン酸としてはｐＫａが１６以下、ＯＨ基を有しないことが好ましい。反応溶媒としてはアセトニトリルが望ましい。
【選択図】なし

Description

本発明は、活性化剤として有機酸を用いてホスホロアミダイト誘導体とヌクレオシド誘導体とを縮合させてヌクレオチド及びその誘導体を製造する方法に関する。

近年、核酸、特に核酸の小断片であるオリゴヌクレオチドに関して、重要な生理活性が相次いで発見され、遺伝子としてだけでなく、生体機能分子としての重要性が着目されている。それに付随し、生体機能発現機構の分子レベルでの解明、また、その結果に基づく機能性有用人工核酸（生体分子の集合系において天然型核酸がもたない新機能或いは天然型核酸本来の機能を改善した機能をもつ）の創製が重要な研究課題となり、現在これらの研究が、広く、活発に行われている。

ところでこれらの研究を効率よく、また精密に行うには、高純度の天然型及び非天然型人工オリゴヌクレオチドを大量に供給する必要がある。この要望に応えうるのが化学合成であるが、現在、オリゴヌクレオチドの化学合成には、以下に示す反応式のような経路を経る「ホスホロアミダイト法」が最も有効な方法として多用される。

ホスホロアミダイト法の鍵となる反応は、ヌクレオシドホスホロアミダイト（１）とヌクレオシド（２）との縮合によるヌクレオシドホスファイト形成反応である。この反応には、反応を温和な条件下（常温）、速やか（５分以内が望ましい）且つ収率良く（９５％以上、理想的には９８％以上）行わせるために適当な活性化剤が通常使用されている。

活性化剤としては、現在、１Ｈ−テトラゾール（以下、単に「テトラゾール」と称することがある。）や特許文献１にて開示されているベンズイミダゾールトリフルオロメタンスルホン酸塩（以下、「ＢＩＴ」と略称する）が一般的に使用され、その量はヌクレオシドホスホロアミダイトと当モル数必要である。
特開２００３−１２６９０号公報

しかしながら、テトラゾールは高価であるほか、爆発性及び人体に対する毒性を有するなど取り扱い性が良くない化合物である。加えて、アセトニトリルなどの反応溶媒に対する溶解性が必ずしも高くないので、反応には大量の反応溶媒が必要になる。そして、ＢＩＴも高価で、アセトニトリルに対する溶解性が低い化合物である。

従って、ヌクレオチドの大量合成、すなわち、大量の活性化剤の使用を必要とする合成には、必ずしも好ましい活性化剤とは言い難い。また、活性化剤としての能力も充分でないことがあるので、反応性が低いヌクレオシドホスホロアミダイト（人工核酸合成の原料として用いるヌクレオシドホスホロアミダイトには反応性が低いものもある。）を用いる合成では、反応完結に必要な時間が長くなるか、或いは適度な反応時間内では満足できる収率で、合成しようとする標的化合物を与えないなどの欠点をもつ。そこで、テトラゾールなど従来の活性化剤がもつこれらの課題を改善でき、大量合成に適した活性化剤の開発が強く望まれている。

本発明は上記実情に鑑みなされたものであり、新規活性化剤を用いることで、ホスホロアミダイト法を改良し、大量合成を行うことを考慮した（低コスト、高反応性など）ヌクレオチド及びその誘導体の製造方法を提供することを解決すべき課題とする。

上記課題を解決する目的で本発明者は鋭意検討を行った結果、活性化剤としてカルボン酸などの有機酸が有効であることを発見した。従来、ホスホロアミダイト法の活性化剤として有機酸を使用することは不可能であると考えられていた。すなわち、反応に供する以外のＯＨ基などを保護する保護基は酸により容易に分解されることが知られており、目的とする反応以外の多数の副反応が競合的に進行することが予想され、反応が適正に制御できるとは考えられていなかった。

ところが、近年、利用に供されるようになり汎用されているアセトニトリルを溶媒として採用した反応系においては酸による保護基の分解がほとんど無視できることを本発明者は見いだした。そこで、有用な活性化剤の探索研究の一環として、活性化剤として有機酸などの酸を用いたホスホロアミダイト法の検討を行ったところ、高い活性を有することを発見した。本発明は以上の知見に基づき完成されたものである。

すなわち、本発明のヌクレオチド及びその誘導体の製造方法は、ヌクレオシド誘導体と、ホスホロアミダイト誘導体と、非プロトン性有機化合物から選択される１以上の化合物である反応溶媒と、前記ヌクレオシド誘導体及び前記ホスホロアミダイト誘導体の間を縮合させてヌクレオチド又はその誘導体を生成する反応を活性化する、有機酸から選択される活性化剤と、を混合することを特徴とする。

ここで、前記活性化剤はカルボン酸、ジカルボン酸及びそれらの誘導体から選択される１以上の化合物であることが望ましい。

特に、反応性向上の観点からは以下の(1)〜(3)の構成を採用することが好ましい。(1)前記有機酸としては塩基性官能基（ＯＨ基など）を分子構造中に含まないことが望ましい。(2)更に、ｐＫａが１８．７未満であることが望ましく、１７未満であることが更に望ましい。(3)前記反応溶媒としてはアセトニトリルが望ましい。

前記ホスホロアミダイト誘導体は下記一般式（１）で表される化合物が例示される。

（式（１）中、Ｂは核酸塩基又はその誘導体から選択され；Ｘ¹は水素、ハロゲン原子、保護基で置換されたＯＨ基、炭素数１〜６のアルコキシ基から選択され；Ｘ²、Ｘ³及びＸ⁵はそれぞれ独立してハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基、フェニル基、−Ｃ_nＨ_2nＣＮ、−Ｓｉ（Ｘ⁸）₃、−Ｃ_nＨ_2nＳｉ（Ｘ⁸）₃、−Ｃ_nＨ_2nＯＳｉ（Ｘ⁸）₃及び−Ｃ_nＨ_2n−Ｓ−Ｓｉ（Ｘ⁸）₃から選択され；Ｘ⁴は−Ｏ−、−Ｓ−及び−Ｎ（Ｘ⁸）−から選択され；Ｘ⁶はＯＨ基の保護基であり；Ｘ⁷は水素原子、炭素数１〜６のアルキル基及び芳香族性の置換基から選択される。；上述のＸ⁸はそれぞれ独立して炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基及びフェニル基から選択される。；なお、前述のアルコキシ基、アルキル基、アルケニル基及びＣ_nＨ_2nには直鎖状及び分枝を有するもの並びに水素原子の一部がハロゲンで置換されたものも含む。また、Ｘ¹がアルコキシ基で且つＸ⁷がアルキル基の場合には、Ｘ¹とＸ⁷とを結合させて環を形成しても良い。）

非プロトン性有機化合物から選択される１以上の化合物である反応溶媒（特に、含窒素化合物及び含酸素化合物からなる反応溶媒）では保護基分解のおそれがほとんど無視できるという知見に基づき、活性の高い有機酸を用いて有用性の高いヌクレオチド及びその誘導体の製造方法を提供できた。有機酸は反応性が高いことはもちろん、廉価であること、反応溶媒に対する溶解性が良好であること、高い安全性を有することなどの利点がある。反応性が高いことで反応時間を低減できるとともに反応を高い収率で進行することができる。反応溶媒への溶解性が良好であることで反応容器の大きさを小さくすることができる。以上説明したように、反応に要するコストを低減することができる。

本発明のヌクレオチドの製造方法はヌクレオシド誘導体(a)とホスホロアミダイト誘導体(b)とを縮合させる反応を有する。この反応は活性剤(c)の存在下、反応溶媒(d)中にて行われる。本製造方法はいわゆる固相反応にて行うことも可能である。

(a)ヌクレオシド誘導体
ヌクレオシド誘導体はプリン塩基又はピリミジン塩基が糖の還元基に結合した配糖体状化合物であり、後述するホスホロアミダイト誘導体(b)と反応させるＯＨ基以外のＯＨ基が保護基などにて保護されている化合物である。本製造方法に採用される化学反応は本ヌクレオシド誘導体(a)の５位の炭素原子に結合するＯＨ基を延長する方向に順次進行する反応である。従って、反応を充分に完結させる目的で、本ヌクレオシド誘導体(a)は、後述するホスホロアミダイト誘導体(b)が等モル乃至はわずかに過剰となる程度の量として反応に供する。

ヌクレオシド誘導体(a)としては、デオキシリボヌクレオシドやリボヌクレオシドが例示される。その他の部分の構造は、最終的に製造を目的とする化学構造に応じて構造を決定する。その場合に必要でない部分が反応しないように保護基を結合させる。

望ましい構造をもつヌクレオシド誘導体としては、一般式（２）で表される化合物が例示される。本化合物は（デオキシ）リボースの誘導体を糖として有する化合物であり、その（デオキシ）リボースの５位の炭素に結合したＯＨ基が反応に直接供される基である。保護基が結合されていないＯＨ基の位置によってホスホロアミダイト誘導体(b)と結合を生じる位置は容易に制御できる。

式（２）中のＢ、Ｙ¹、Ｙ²及びＹ³は以下の通りである。本発明においては糖骨格の５位に結合したＯＨ基が反応に供されることが重要であり、その他、Ｂ、Ｙ¹〜Ｙ³などで示される部分の化学構造は、活性剤が発揮する活性作用の有無に本質的な影響を与えないと推測されるので、ここに示した構造をもつ化合物に限定する趣旨ではない。

Ｂは核酸塩基又はその誘導体から選択される。Ｂで表される核酸塩基は、ピリミジン、プリン、アザプリンおよびデアザプリンからなる群から選択された天然型の塩基である。そして、核酸塩基の誘導体は、それらの核酸塩基について、一部置換基をハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基又はシアノ基になどによって修飾したものである。また、核酸塩基の誘導体には、前述の核酸塩基及びその誘導体が有する官能基に保護基を結合させた化合物も含む。例えば、ＯＨ基やＮＨ₂基などが本製造方法の反応により影響を受けないように保護基を結合することがある。

ピリミジン塩基を具体的に例示すれば、シトシン、ウラシル、５−フルオロシトシン、５−フルオロウラシル、５−クロロシトシン、５−クロロウラシル、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヨ−ドシトシン、５−ヨ−ドウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル（チミン）、５−エチルシトシン、５−エチルウラシル、５−フルオロメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−トリフルオロシトシン、５−トリフルオロウラシル、５−ビニルウラシル、５−ブロモビニルウラシル、５−クロロビニルウラシル、５−エチニルシトシン、５−エチニルウラシル、５−プロピニルウラシル、ピリミジン−２−オン、４−ヒドロキシアミノピリミジン−２−オン、４−アミノオキシピリミジン−２−オン、４−メトキシピリミジン−２−オン、４−アセトキシピリミジン−２−オン、４−フルオロピリミジン−２−オン、５−フルオロピリミジン−２−オンなどが挙げられる。

プリン塩基を具体的に例示すれば、プリン、６−アミノプリン（アデニン）、６−ヒドロキシプリン、６−フルオロプリン、６−クロロプリン、６−メチルアミノプリン、６−ジメチルアミノプリン、６−トリフルオロメチルアミノプリン、６−ベンゾイルアミノプリン、６−アセチルアミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−アミノオキシプリン、６−メトキシプリン、６−アセトキシプリン、６−ベンゾイルオキシプリン、６−メチルプリン、６−エチルプリン、６−トリフルオロメチルプリン、６−フェニルプリン、６−メルカプトプリン、６−メチルメルカプトプリン、６−アミノプリン−１−オキシド、６−ヒドロキシプリン−１−オキシド、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン（グアニン）、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２−アミノ−６−ヨ−ドプリン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−メルカプトプリン、２−アミノ−６−メチルメルカプトプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシアミノプリン、２−アミノ−６−メトキシプリン、２−アミノ−６−ベンゾイルオキシプリン、２−アミノ−６−アセトキシプリン、２−アミノ−６−メチルプリン、２−アミノ−６−サイクロプロピルアミノメチルプリン、２−アミノ−６−フェニルプリン、２−アミノ−８−ブロモプリン、６−シアノプリン、６−アミノ−２−クロロプリン（２−クロロアデニン）、６−アミノ−２−フルオロプリン（２−フルオロアデニン）などが挙げられる。

アザプリン塩基およびデアザプリン塩基を具体的に例示すれば、６−アミノ−３−デアザプリン、６−アミノ−８−アザプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシ−８−アザプリン、６−アミノ−７−デアザプリン、６−アミノ−１−デアザプリン、６−アミノ−２−アザプリンなどが挙げられる。

Ｙ¹は水素原子、アルキル基及び芳香族性の置換基から選択される。アルキル基は直鎖状、分枝状などの構造については限定しない。芳香族性の置換基としてはフェニル基、ナフチル基及びその誘導体などの一般的な構造が例示できる。

Ｙ²はＯＨ基の保護基である。ＯＨ基の保護基とは、酸処理、塩基処理、加水素分解、加水分解、光分解のような化学的方法によって脱離される保護基を指す。例えば、ホルミル基、アシル基、シリル基、アルキル基、アラルキル基、カルボニル基、シアノアルキル基、シリルアルキル基があり、中でも好ましくは、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、シリル基、アルコキシアルキル基、アリル基、アラルキル基、置換トリチル基、アルキルオキシカルボニル基、置換シアノエチル基、シアノエチル基、トリアルキルシリルエチル基が挙げられる。更に好ましくは、メトキシエチル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基、アリル基、シアノエチル基、トリメチルシリルエチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基などが挙げられる。また、固相合成を目的として、リンカーへの結合を意図として使用する保護基も使用可能である。そして、本製造方法を複数回行って３以上のヌクレオシド誘導体が結合したヌクレオチド誘導体を得る場合には前の反応にて得られた化合物（ヌクレオチド誘導体）を本ヌクレオチド誘導体として用いることができる。その場合にはＹ²の部分として、前段階までにて結合させたヌクレオチド誘導体の構造を反映した化学構造を有することになる。更に、固相に担持したヌクレオシドやヌクレオチド誘導体あるいはそれらのオリゴマーなども適用可能である。

Ｙ³は水素、ハロゲン原子、保護基で置換されたＯＨ基、アルコキシ基から選択される。ハロゲン原子は塩素、フッ素、ヨウ素、臭素が例示される。保護基で置換されたＯＨ基における保護基は先にＹ²の説明にて述べた保護基と同様である。アルコキシ基の炭化水素部分（アルキル基やアルケニル基に相当）は直鎖状、分枝状などの構造については限定しない。

(b)ホスホロアミダイト誘導体
本実施形態におけるホスホロアミダイト誘導体(b)は、化学構造中に有する３価のリンの３つの化学結合のうち、１つがヌクレオシド誘導体に、他の１つが窒素原子を介して置換基が結合している化合物である。残りの１つの化学結合は特に限定されない。ここでいうヌクレオシド誘導体はデオキシリボヌクレオシドやリボヌクレオシドが例示される。ホスホロアミダイト誘導体の部分構造は、最終的に製造を目的とする化学構造に応じて構造を決定する。その場合に必要でない部分が反応しないように保護基を結合させる。

望ましい構造をもつホスホロアミダイト誘導体としては、一般式（１）で表される化合物が例示される。本化合物は（デオキシ）リボースの誘導体を糖として有するヌクレオシド誘導体として含む化合物である。

式（１）中のＢ、Ｘ¹〜Ｘ⁷は以下の通りである。本発明においては糖骨格の３位の炭素に酸素を介してホスホロアミダイト構造が結合することが重要であり、その他、Ｂ、Ｘ¹〜Ｘ⁷などで示される部分の化学構造は、活性剤が発揮する活性作用の有無に本質的な影響を与えないと推測されるので、ここに示した構造をもつ化合物に限定する趣旨ではない。

Ｂは核酸塩基又はその誘導体から選択される。Ｘ¹は水素、ハロゲン原子、保護基で置換されたＯＨ基、アルコキシ基から選択される。具体的には式（２）におけるものと同様である。

Ｘ²、Ｘ³及びＸ⁵はそれぞれ独立してハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、フェニル基、−Ｃ_nＨ_2nＣＮ、−Ｓｉ（Ｘ⁸）₃、−Ｃ_nＨ_2nＳｉ（Ｘ⁸）₃、−Ｃ_nＨ_2nＯＳｉ（Ｘ⁸）₃及び−Ｃ_nＨ_2n−Ｓ−Ｓｉ（Ｘ⁸）₃から選択される。Ｘ⁴は−Ｏ−、−Ｓ−及び−Ｎ（Ｘ⁸）−から選択される。Ｘ²、Ｘ³及びＸ⁵はそれぞれ結合された元素（Ｘ²及びＸ³は窒素原子、Ｘ⁵はＸ⁴の選択に応じて酸素、硫黄及び窒素原子となる）に応じて、ＯＨ基、ＳＨ基又はＮＨ₂基に対する保護基的な作用を発揮する。ハロゲン原子及びアルキル基については式（２）において説明したものと同様である。アルケニル基としては例えばビニル基、アリル基などが挙げられる。Ｘ⁸としてはそれぞれ独立してアルキル基、アルケニル基及びフェニル基から選択される。アルキル基、アルケニル基については前述の基と同様である。ここで、ｎは自然数であり、１、２及び３などが例示される。−Ｘ⁴が酸素又は硫黄である場合にはＸ⁵は−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＮ、−ＯＳｉＲ₃、−ＯＣＨ₂ＳｉＲ₃、−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＯＳｉＲ₃、−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＳｉＲ₃が好適に採用できる。なお、Ｒは直鎖状又は分枝状のアルキル基、例えばメチル基、エチル基、プロピル基などである。

Ｘ⁶はＯＨ基の保護基である。ＯＨ基の保護基としては式（２）にて説明した保護基とほぼ同様である。(a)のＹ²にて説明したように、本製造方法の化学反応終了後、Ｘ⁶で表される保護基を脱離することで、本製造方法により得られたヌクレオチド誘導体を次段階の反応におけるヌクレオシド誘導体として用いることができる。

Ｘ⁷は水素原子、アルキル基及び芳香族性の置換基から選択される。アルキル基については前述の式（２）にて説明したものと同様である。芳香族性の置換基とは前述したようにフェニル基、ナフチル基及びそれらの基の一部水素が置換されたものなどが例示できる。

また、Ｘ¹がアルコキシ基で且つＸ⁷がアルキル基の場合には、Ｘ¹とＸ⁷とを結合させて環を形成しても良い。

(c)活性化剤
活性化剤は有機酸から選択される１以上の化合物から構成される。活性化剤は、ホスホロアミダイト誘導体(b)が等モル乃至はわずかに過剰となる程度の量を添加することが望ましい。

活性剤として好ましい有機酸としては、カルボキシ基を有する化合物、リン酸基を有する化合物、スルホ基を有する化合物などが例示でき、カルボン酸、ジカルボン酸及びそれらの誘導体が特に好ましい。

そして、有機酸としてはＯＨ基を分子構造中に含まない化合物が好ましい。また、ｐＫａが１８．７未満であることが望ましく、１７未満であることがより望ましく、１６未満であることが更に望ましい。ｐＫａの測定は使用される反応溶媒中で行い、電気伝導度や¹³Ｃ−ＮＭＲなどから測定できる。

具体的に好ましい有機酸としてはトリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、２，４−ジニトロ安息香酸、３，５−ジニトロ安息香酸、２，６−ジクロロ安息香酸、２−ニトロ安息香酸、４−ニトロ安息香酸及び安息香酸が好ましい例として挙げることができ、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、２，４−ジニトロ安息香酸、３，５−ジニトロ安息香酸、２，６−ジクロロ安息香酸及び２−ニトロ安息香酸がより好ましく、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸及び２，４−ジニトロ安息香酸が更に好ましい。モノカルボン酸の他にも、シュウ酸、フタル酸、マレイン酸、コハク酸などのジカルボン酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸などのＲＳＯ₃Ｈ型スルホン酸（Ｒ＝メチル、エチル、フェニル、トリル）、ジフェニルリン酸、ジメチルリン酸、ジエチルリン酸などの（ＲＯ）₂ＰＯＯＨ型有機リン酸（Ｒ＝メチル、エチル、フェニル）、Ｒ（ＲＯ）ＰＯＯＨ型ホスホン酸モノエステル（Ｒ＝メチル、エチル、フェニル）が好ましい。特に採用した反応溶媒中でのｐＫａが１６以下になる有機酸が保護基を分解することなく、好ましい。

(d)反応溶媒
本実施形態の反応溶媒は非プロトン性有機化合物から選択される１以上の化合物から構成できる。また、含窒素化合物及び含酸素化合物から選択される１以上の化合物を採用することもできる。窒素若しくは酸素原子を含有することで、活性化剤(c)として添加される有機酸がＯＨ基の保護基を脱離させる作用を弱めることができ、ヌクレオシド誘導体(a)及びホスホロアミダイト誘導体(b)の縮合反応中におけるＯＨ基に結合させた保護基を安定化できる。

具体的にはアセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの非塩基性非プロトン性含窒素有機化合物、エーテル化合物（ジエチルエーテルなどの鎖式エーテル化合物、テトラヒドロフラン、オキシド、ジオキサンなどの環式エーテル化合物）、ジメチルスルホキシドなどの非塩基性非プロトン性含酸素有機化合物、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素などの非プロトン性有機化合物が望ましい。

・化学反応及び操作について
本実施形態の製造方法に係る縮合反応は、ヌクレオシド誘導体(a)とホスホロアミダイト誘導体(b)とを活性化剤(c)の存在下、反応溶媒(d)中にて行われる。例えば、ヌクレオシド誘導体(a)とホスホロアミダイト誘導体(b)とを反応溶媒(d)中に溶解した後に活性化剤を添加して行う均一系での反応のほか、ヌクレオシド誘導体(a)をリンカーに結合させた状態で、ホスホロアミダイト誘導体(b)及び活性化剤(c)を溶解させた反応溶媒(c)にて処理する固相反応などがある。反応系内には、系内の水分を除去する目的で、脱水剤を添加しても良い。脱水剤としては、モルキュラーシーブスなど通常用いられる脱水剤が使用できるが、特に限定されるものではない。反応温度は、−２０℃から反応溶媒の沸点までで行うことができ、好ましくは０から３０℃である。

反応終了後、通常用いられる抽出洗浄操作や精製操作により、目的物を３価のリン化合物として単離することもできるし、所望により、一旦単離することなく、通常用いられる酸化剤などで処理し、反応系内で５価のリン酸エステル誘導体などに変換してから単離することも可能である。更に、得られた生成物の所望のＯＨ基（例えば５’末端のＯＨ基）の保護基を脱離した後、次なる反応に用いるヌクレオシド誘導体(a)として利用することができる。

・その他（付記）
本明細書中で説明する化合物が有するアルキル基（−Ｃ_nＨ_2n+1）としては、炭素数（ｎ）１〜６程度が好ましく、炭素数１〜４程度が更に好ましい。例えば、メチル基、エチル基、（ｎ−、ｉｓｏ−）プロピル基、（ｎ−、ｉｓｏ−、ｓｅｃ−、ｔｅｒｔ−）ブチル基などである。そして、アルケニル基としては、メチル基をのぞくこれらアルキル基に対応する基において任意の水素が除かれた基（−Ｃ_nＨ_2n-1）であり、炭素数（ｎ）２〜６程度が好ましく、炭素数２〜４程度が更に好ましい。また、これらのアルキル基、アルケニル基などは適宜水素原子をハロゲン原子にて置換したハロアルキル基、ハロアルケニル基を採用可能である。ハロアルキル基としては、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、ブロモメチル、ブロモエチルなどが例示される。ハロアルケニル基としては、ブロモビニル、クロロビニルなどが例示される。

試験１：ジデオキシリボヌクレオシドホスフェート（ヌクレオチド誘導体）の合成（下式）

２０ｍＬのシュレンク型反応管にモルキュラーシーブス３Ａ（ＭＳ３Ａ）（６０ｍｇ）を入れ、減圧下（１〜３ｍｍＨｇ）、４００℃で乾燥した。室温まで放冷後、ホスホロアミダイト誘導体３（４８μｍｏｌ）、ヌクレオシド誘導体４（４０μｍｏｌ）、無水アセトニトリル（反応溶媒：０．８ｍＬ）を加え３０分間撹拌した。この混合物に活性化剤としての表１に示す有機酸を４８μｍｏｌをアセトニトリル（０．２ｍＬ）に溶解させた溶液を加え、室温下、１分間及び５分間撹拌した。

その後、反応液に１Ｍ ｔ−ＢｕＯＯＨ／トルエン溶液（０．０８ｍＬ、０．０８ｍｍｏｌ）を加え、１〜５分間撹拌した。撹拌後、反応液中の不溶物をろ過して取り除いた。ろ液を濃縮した後、カラムクロマトグラフィー（溶離溶媒：ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＭｅＯＨ（２０／１））により目的物を得た。反応が進行することの確認はＨＲＭＳ（ＥＳＩ⁺）、¹Ｈ−ＮＭＲ及び³¹Ｐ−ＮＭＲにて確認し、それらのスペクトルはすでに報告されている値と一致した。表１に反応時間１分間及び５分間において、活性化剤の種類による反応性（収率）の値を示す。収率の値は³¹Ｐ−ＮＭＲにて測定した。更に、活性化剤の反応溶媒としてのアセトニトリル中でのｐＫａを表１に併せて示す。ｐＫａの値は、電気伝導度や¹³Ｃ−ＮＭＲなどから測定できるものであり、表１に示す値は下記文献から引用したものである。

なお、使用したそれぞれの活性化剤は使用前に減圧下（１〜３ｍｍＨｇ）、室温で２時間以上乾燥してから使用した。

表１から明らかなように、上記カルボン酸のうち、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、２，４−ジニトロ安息香酸、３，５−ジニトロ安息香酸、２，６−ジクロロ安息香酸及び２−ニトロ安息香酸が、従来汎用されている活性化剤であるテトラゾールと比較しても遜色ない反応性を有することがわかった。また、上記有機酸の中では、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸及び２，４−ジニトロ安息香酸を採用することがより好ましい。そして、従来技術の活性化剤であるＢＩＴとの比較でも、トリクロロ酢酸を採用することが上記カルボン酸の中で更に好ましいことがわかった。なお、４−ニトロ安息香酸及び安息香酸についてもある程度の反応性が認められた。

表１に示した結果より、活性化剤として好ましい有機酸（特にカルボン酸）は、第一にヒドロキシ基をその化学構造中に含まないものが挙げられ、第二に反応溶媒（本実験ではアセトニトリル）中でのｐＫａが小さいものが挙げられる。ｐＫａの好ましい範囲としては、上記カルボン酸のうち好ましい反応性を示す、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、２，４−ジニトロ安息香酸、３，５−ジニトロ安息香酸、２，６−ジクロロ安息香酸及び２−ニトロ安息香酸が含まれる１８．７未満が挙げられる。更に好ましいｐＫａの範囲としては、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸及び２，４−ジニトロ安息香酸が含まれる１７．０未満（更には１６．０以下）が挙げられる。

ここで、従来より危惧されている保護基の脱離分解（例えばホスホロアミダイト誘導体３におけるデオキシリボース部分の５位のＯＨ基に結合したＤＭＴｒ基などの脱離）は、本反応条件で採用したアセトニトリル中では認められなかった。同様のカルボン酸を採用した場合でも反応溶媒としてジクロロメタンを採用したような場合には速やかに保護基が分解される場合があった。

以下に、活性化剤としての、トリクロロ酢酸及びトリフルオロ酢酸（本発明範囲に含まれる活性化剤）と、テトラゾール及びＢＩＴ（従来技術を代表する活性化剤）とについて総合的に評価した結果を表２に示す。

表２より明らかなように、本発明範囲に含まれる活性化剤であるトリクロロ酢酸及びトリフルオロ酢酸と、テトラゾールとを比較すると、反応性はテトラゾールの５．５倍〜６．６倍と非常に高く、その上、アセトニトリルに対する溶解性も倍以上あって、充分に満足のいくものであった。そして、本発明の活性化剤は、テトラゾールと比較して、値段も現在の市価で２０分の１〜４０分の１以下と非常に大きな差があるとともに、爆発性もなく、取扱性にも優れ、低コスト化にも寄与できることが明らかになった。

また、本発明範囲に含まれる活性化剤であるトリクロロ酢酸及びトリフルオロ酢酸と、ＢＩＴとを比較すると、反応性は同等であるものの、アセトニトリルに対する溶解性は倍以上あって、充分に満足のいくものであった。そして、本発明の活性化剤は、値段も現在の市価で２０分の１〜１０分の１以下、活性化剤の必要量乃至製造量いかんでは１００分の１以上の非常に大きな差が想定され、低コスト化にも大きく寄与できることが明らかになった。

なお、トリクロロ酢酸及びトリフルオロ酢酸は、テトラゾール及びＢＩＴが有しない性質である吸湿性及び腐食性を有するが、他の好ましい性質を著しく毀損するものではないと考えられ、総合的にはコスト低減に大きく寄与できるものと考えられる。

試験２：核酸塩基の種類による反応性の変化について。ジデオキシリボヌクレオシドホスフェートの合成その２（下式）

２０ｍＬのシュレンク型反応管にモルキュラーシーブス３Ａ（ＭＳ３Ａ）（６０ｍｇ）を入れ、減圧下（１〜３ｍｍＨｇ）、４００℃で乾燥した。室温まで放冷後、ホスホロアミダイト誘導体３（８９．２ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、ヌクレオシド誘導体４（３５．６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、無水アセトニトリル（反応溶媒：０．８ｍＬ）を加え３０分間撹拌した。この混合物に活性化剤としての、トリクロロ酢酸（１８．０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）又は２，４−ジニトロ安息香酸（２５．６ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．２ｍＬ）を加え、５分間撹拌した。

その後、反応液に１Ｍ ｔ−ＢｕＯＯＨ／トルエン溶液（０．２４ｍＬ、０．２４ｍｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌した。撹拌後、反応液中の不溶物をろ過して取り除いた。ろ液を濃縮した後、カラムクロマトグラフィー（溶離溶媒：ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＭｅＯＨ（２０／１））により目的物を得た（９８６ｍｇ、収率９７％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ⁺）：Ｃ₅₀Ｈ₆₂Ｎ₅Ｏ₁₄ＰＳｉの計算値（［Ｍ＋Ｈ］⁺）１０３８．３７、実測値１０３８．３７で良い一致を示した。¹Ｈ−ＮＭＲと³¹Ｐ−ＮＭＲのスペクトルはすでに報告されている値と一致した。なお、トリクロロ酢酸は使用前に減圧下（１〜３ｍｍＨｇ）、室温で２時間以上乾燥してから使用した。

その他のデオキシリボヌクレオシドホスフェート（ホスホロアミダイト誘導体５、６及び７のうちの１つとヌクレオシド誘導体３とを組み合わせた化合物）も同様にして合成した。反応性（収率）を表３に示す。なお、収率は左列が³¹Ｐ−ＮＭＲにて測定した値であり、右列がカラムにて単離した化合物の質量から求めた値である。

表３より明らかなように、核酸塩基部分の構造変化によっては、若干の収率変化が認められるのみで、ホスホロアミダイト誘導体とヌクレオシド誘導体との間の縮合反応性には大きな影響を与えないことがわかった。また、ＤＮＡを構成するすべての核酸塩基について充分な反応性を有することがわかった。

試験３：オリゴデオキシリボヌクレオチド（5'GpApCpTpCpTpCpTpTpApGpCpTpApApT3'）の合成（固相合成）
活性化剤としてトリクロロ酢酸を、ヌクレオシドホスホロアミダイト誘導体として前述の３、５、６及び７を用い、オリゴヌクレオチドとしてのＤＮＡ１６量体、5'GpApCpTpCpTpCpTpTpApGpCpTpApApT3'の合成を行った。

合成（固相合成）は、表４に示す反応サイクル１〜９を用いて、０．２μｍｏｌスケールでオリゴデオキシリボヌクレオチドの鎖伸長を行った。段階１〜９まで反応が進行する毎にオリゴデオキシリボヌクレオチドの鎖が１つ伸長する。段階４にて加えるホスホロアミダイト誘導体の種類を変えることで伸長する鎖が有する核酸塩基部分の構造を制御する。

合成終了後、保護基の残っているオリゴヌクレオチドを濃アンモニア水で２５℃／２時間処理し、次いで、５５℃／１２時間の処理を行い、目的物を得た。ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ：Ｃ₁₅₆Ｈ₁₉₆Ｎ₅₄Ｏ₉₆Ｐ₁₅の計算値（［Ｍ−３Ｈ］³⁺）１６０８．９５５６、実測値１６０８．９３２４で良い一致を示した。通算収率は８８％（一塩基鎖長伸長時の平均収率９９％程度）であった。

生成物を未精製の状態でＨＰＬＣにて分析した結果、未精製状態にもかかわらず、非常に高い純度を有することがわかった（図１）。

以上の結果より、本発明方法は、トリクロロ酢酸やトリフルオロ酢酸は、固相上における比較的長鎖のヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）合成の活性化剤としても有効であることが裏付けられた。

なお、ＨＰＬＣの測定条件は、カラムがＣＯＳＭＯＳＩＬ５Ｃ₁₈−ＡＲ−ＩＩ（直径４．６ｍｍ×長さ２５ｃｍ）、温度４０℃、流速が１．０ｍＬ／分、溶離溶媒及び濃度勾配としてＡ＝０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム溶液、Ｂ＝水とアセトニトリルとの２０：８０混合液を０〜６０分でＡ／Ｂが１００／０〜７０／３０まで変化させた条件を採用し、検出波長は２５４ｎｍであった。

未精製のオリゴヌクレオチドについてＨＰＬＣにて分析した結果を示した図である。

Claims (8)

1. ヌクレオシド誘導体と、
   ホスホロアミダイト誘導体と、
   非プロトン性有機化合物から選択される１以上の化合物である反応溶媒と、
   前記ヌクレオシド誘導体及び前記ホスホロアミダイト誘導体の間を縮合させてヌクレオチド又はその誘導体を生成する反応を活性化する、有機酸から選択される活性化剤と、
   を混合することを特徴とするヌクレオチド及びその誘導体の製造方法。
2. 前記活性化剤はカルボン酸、ジカルボン酸及びそれらの誘導体から選択される１以上の化合物である請求項１に記載のヌクレオチド及びその誘導体の製造方法。
3. 前記有機酸はｐＫａが１８．７未満で、ＯＨ基を分子構造中に含まない請求項１又は２に記載のヌクレオチド及びその誘導体の製造方法。
4. 前記有機酸のｐＫａは１７未満である請求項３に記載のヌクレオチド及びその誘導体の製造方法。
5. 前記反応溶媒はアセトニトリルである請求項１〜４のいずれかに記載のヌクレオチド及びその誘導体の製造方法。
6. 前記ホスホロアミダイト誘導体は下記一般式（１）で表される化合物である請求項１〜５のいずれかに記載のヌクレオチド及びその誘導体の製造方法。
   

   

   （式（１）中、Ｂは核酸塩基又はその誘導体から選択され；Ｘ¹は水素、ハロゲン原子、保護基で置換されたＯＨ基、炭素数１〜６のアルコキシ基から選択され；Ｘ²、Ｘ³及びＸ⁵はそれぞれ独立してハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基、フェニル基、−Ｃ_nＨ_2nＣＮ、−Ｓｉ（Ｘ⁸）₃、−Ｃ_nＨ_2nＳｉ（Ｘ⁸）₃、−Ｃ_nＨ_2nＯＳｉ（Ｘ⁸）₃及び−Ｃ_nＨ_2n−Ｓ−Ｓｉ（Ｘ⁸）₃から選択され；Ｘ⁴は−Ｏ−、−Ｓ−及び−Ｎ（Ｘ⁸）−から選択され；Ｘ⁶はＯＨ基の保護基であり；Ｘ⁷は水素原子、炭素数１〜６のアルキル基及び芳香族性の置換基から選択される。；上述のＸ⁸はそれぞれ独立して炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基及びフェニル基から選択される。；なお、前述のアルコキシ基、アルキル基、アルケニル基及びＣ_nＨ_2nには直鎖状及び分枝を有するもの並びに水素原子の一部がハロゲンで置換されたものも含む。また、Ｘ¹がアルコキシ基で且つＸ⁷がアルキル基の場合には、Ｘ¹とＸ⁷とを結合させて環を形成しても良い。）
7. 前記有機酸はトリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、２，４−ジニトロ安息香酸、３，５−ジニトロ安息香酸、２、６−ジクロロ安息香酸及び２−ニトロ安息香酸から選択される１以上の化合物である請求項１〜６のいずれかに記載のヌクレオチド及びその誘導体の製造方法。
8. 前記反応溶媒は含窒素化合物及び含酸素化合物から選択される１以上の化合物である請求項１〜７のいずれかに記載のヌクレオチド及びその誘導体の製造方法。

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