JPH0812697A - 新規ポリヌクレオチド - Google Patents

新規ポリヌクレオチド

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JPH0812697A
JPH0812697A JP7059116A JP5911695A JPH0812697A JP H0812697 A JPH0812697 A JP H0812697A JP 7059116 A JP7059116 A JP 7059116A JP 5911695 A JP5911695 A JP 5911695A JP H0812697 A JPH0812697 A JP H0812697A
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

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Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規ポリヌクレオチドを提供する。 【構成】 【化１】 (式中、Ｙは対イオン、nは１またはそれ以上、そしてＭ
はヌクレオシドを表わす)で示されるポリヌクレオチ
ド。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はオリゴヌクレオチドのイ
ンビトロ合成に関する。さらに詳しくは、組換え宿主−
ベクター系に用いられるデオキシオリゴヌクレオチド、
あるいは診断分析用の標識化オリゴヌクレオチド調製に
おける中間体として用いられるデオキシオリゴヌクレオ
チドの合成に関するものである。
【０００２】
【従来技術】今日、オリゴヌクレオチドは、一般的に普
及している２方法、即ち、ホスホラミダイト法(phospho
ramidite method)[アダムスら(Ａdams)１９８３“ジャ
ーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテイ
(Ｊ．Ａm．Ｃhem．Ｓoc．)"１０５:６６１およびフレー
ラーら(Ｆroehler)１９８３“テトラヘドロンレターズ
(Ｔetrahedron Ｌetts．)"２４:３１７１等参照]、並
びにホスホトリエステル法[ドイツ特許公開公報２６４
４４３２]のいずれかの方法によって製造されている。
両方法共、有効であって広く受け入れられているが、高
価なモノマーを大量に用いる方法である。またこれらの
方法は複雑である。ホスホラミダイト法は各縮合反応の
後に水性の系中での酸化工程を必要とし、他方、トリエ
ステル法は、失敗した(aborted)オリゴヌクレオチド(あ
る反応サイクル内でモノマーが付加されなかったもの)
の亜集団(サブポピューレーション)を、以後のサイクル
において、オリゴヌクレオチドを伸長させないために、
個々の段階で“キャップ(cap)する"必要がある。
【０００３】
【発明の目的および構成】本発明は、今日利用し得る方
法よりも経済的であり、かつ信頼性の高いオリゴヌクレ
オチド合成法を提供することを目的とするものである。
ヌクレオシドとりん酸とを、アリール・スルホニル・ク
ロリド[セキネら(Ｓekine)１９７９“テトラヘドロンレ
ターズ"２０:１１４５]またはカーボジイミド[ショフィ
ールドら(Ｓchofield)、１９６１“ジャーナル・オブ・
アメリカン・ケミカル・ソサエテイ"、p２３１６]を用
いて縮合させ、ヌクレオシドホスホネートを製造する方
法は既知である。ハールら(Ｈall)[(１９７５)“ジャー
ナル・オブ・ケミカル・ソサエテイ"ヌクレオチド、パ
ートＸＬＩ、p．２３１６]は、ヌクレオシドＨ−ホスホ
ネートをジフェニルクロロホスフェートで処理した後、
酸化して対応するジヌクレオチドホスフェートにするこ
とにより、対応するジヌクレオチドホスホネートを得
た。この様に、１９５７年から、ジヌクレオチドホスフ
ェートの製造に関する知識が当該技術分野に存在してお
り、その間に、複雑で高価につく、オリゴヌクレオチド
の合成法が２種類開発されたにもかかわらず、このハー
ルらの開示内容はオリゴヌクレオチドの製造に利用され
ていない。
【０００４】ガレッグら(Ｇaregg)[“ケミカ・スクリプ
タ(Ｃhemica Ｓcripta)"２５:２８０−２８２(１９８
５)]は、５'−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン３'−ハ
イドロゲンホスホネートと３'−Ｏ−ベンゾイルチミジ
ンとは、ジフェニルホスホロクロリデート(ジフェニル
クロロホスフェートとしても知られている)、２,４,６
−トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロライドまた
は２,４,６−トリイソプロピルベンゼンスルホニルテト
ラゾライドの如き活性化剤の存在下において迅速に反応
し、ホスホネートジエステル(りん酸ジエステル)結合を
定量的に形成することを見い出した。ガレッグらによる
と、３'−ホスホネートの安定性を対応する３'−ホスホ
ラミダイトのそれと比較したとき、活性化した場合、そ
れらがホスホラミダイトに匹敵する反応性を有すること
も伴わせて考慮し、オリゴヌクレオチド合成の出発物質
としてこれらの化合物は適当であるといえる。本発明の
発明者らは、ガレッグの活性化剤は得られる収率が低
く、実際のオリゴヌクレオチド合成に適さないことを見
出したが、このことが、３０年間、オリゴヌクレオチド
合成の対象としてホスホネート化学が利用されなかった
ことを説明する上で役立つと思われる。
【０００５】ヌクレオチド間ホスフェート(internuclot
ide phosphate)同族体含有ＤＮＡの合成は大きい関心
の寄せられている分野である。ミラー(Ｍiller)および
Ｔ'soはＤＮＡのメチルホスホネート同族体が細胞膜を
容易に通り抜け、タンパク合成を阻止することを見い出
したが、これは、おそらくmＲＮＡの翻訳阻害によるも
のと思われている[ブレークら(Ｂlake)、バイオケミス
トリイ(Ｂiochemistry)２４ ６１３９(１９８５)、ス
ミスら(Ｓmith)、プロシーデイングス・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミィ・オブ・サイエンスイズ(Ｐroc．Ｎ
atl．Ａcad．Ｓci．)８３ ２７８７(１９８６)]。ジヌ
クレオチドのホスホラミデート同族体は相補的なポリヌ
クレオチドと結合することから、種々のリガンドをＤＮ
Ａに結合させるのに利用できることが知られている[レ
ットシンガーら(Ｌetsinger)、ヌクレイック・アシッズ
・リサーチ(Ｎucl．Ａcids Ｒes．)１４、３４８７(１
９８６)］。アミンの存在下でジヌクレオシドＨ−ホス
ホネートを酸化することにより、対応するジヌクレオチ
ドホスホラミデートを高収率で得ることができる。[ネ
ーマーら(Ｎemer)テトラヘドロンレターズ(Ｔetrahedro
n Ｌett．)２１ ４１４９(１９８０)]、アサートンら
(Ａtherton)、ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサエテ
イ、６６０(１９４５)]。オリゴヌクレオチドのホスホ
ラミデート、トリホスフェートおよびホスフェートトリ
エステル同族体の簡便な製造方法が必要とされている。
【０００６】本発明の目的は、(a)担体と結合したヌク
レオシドを調製し、(b)脱水剤の存在下、保護したヌク
レオシドＨ−ホスホネートと、担体と結合したヌクレオ
シドの５'ヒドロキシル基とを縮合させ、(c)ステップ
(b)のヌクレオシドＨ−ホスホネートの５'保護基を除去
し、(d)２以上のヌクレオチドを有するポリヌクレオチ
ドＨ−ホスホネートが得られるまで、選択したヌクレオ
シドＨホスホネートを用いてステップ(b)および(c)を連
続的に繰返し、(e)ポリヌクレオチドＨ−ホスホネート
を酸化して対応するポリヌクレオチドを形成させ、次い
で、(f)ポリヌクレオチドを担体から分離することから
なるポリヌクレオチド合成法により達成された。ポリヌ
クレオシドＨホスホネートはホスホラミデート(phospho
ramidate)、チオホスフェートおよびホスフェートトリ
エステルオリゴヌクレオチドの新規な合成における出発
物質として有用である。
【０００７】
【詳しい記述】本発明方法を実施するに際しての出発物
質は、担体と結合したヌクレオシドモノマーと保護され
たヌクレオシドＨホスホネートモノマーである。担体と
結合しているヌクレオシドの５'ヒドロキシル基は保護
されていない。本発明に用いられるヌクレオシドはＲＮ
ＡまたはＤＮＡのモノマー、あるいはそれらの誘導体で
ある。リボース含有ヌクレオシドには、例えば、アデノ
シン、グアノシン、イノシン、シチジン、チミンリボヌ
クレオシドおよびウリジンが含まれる。デオキシリボー
ス含有ヌクレオシドにはデオキシアデノシン、デオキシ
シチジン、デオキシグアノシン、およびチミジンが含ま
れる。前者のヌクレオシド群は、mＲＮＡやtＲＮＡの合
成に、後のヌクレオシド群は、ＤＮＡの製造に用いられ
る。
【０００８】好適に保護したヌクレオシドＨホスホネー
トモノマーは、核酸を構成しているヌクレオチドの同族
体である。保護基は、通常、リボース、あるいはデオキ
シリボースのヒドロキシ置換分のトリフェニルメチルエ
ステルである。それらの機能は、縮合反応を、担体と結
合したヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの５'ヒ
ドロキシル基に限定することである。オリゴデオキシヌ
クレオチドの製造出発物として好ましいホスホネート類
並びに対応するヌクレオシド類(括弧で表示)は、５'ジ
メトキシトリチル−３'−チミジンＨ−ホスホネート(チ
ミジン)、５'ジメトキシトリチル−３'−[−Ｎ6−ベン
ゾイルデオキシアデノシン]Ｈホスホネート(デオキシア
デノシン)、５'ジメトキシトリチル−３'−[Ｎ4−ベン
ゾイルシチジン]Ｈ−ホスホネート(デオキシシチジ
ン)、および５'ジメトキシトリチル−３'−[Ｎ2−イソ
ブチルデオキシグアノシン]Ｈホスホネート(デオキシグ
アノシン)である。同様に、オリゴリボヌクレオチドの
製造出発物質は、例えば、アデノシン、５'ジメトキシ
トリチル−２'−ジメチルt−ブチルシリル−[Ｎ6−ベン
ゾイルアデノシン]−３'Ｈ−ホスホネートである。ホス
ホネート出発物質は自体既知の方法で調製される[例、
セキネら、“テトラヘドロンレターズ(Ｔetr．Ｌet
t．)"１６:１７１１(１９７３)参照]。ホスホネート出
発物質の他の製造方法(好ましい方法である)では、トリ
ス(１,２,４−トリアゾイル)ホスファイト(ＴＴＰ)を用
いる。ＴＴＰは三塩化りん(ＰＣl3)、１,２,４−トリア
ゾールおよびＮ−メチルモルホリンから、無水塩化メチ
レン(ＣＨ2Ｃl2)中で、常法通り系中で生成される。
【０００９】担体は、オリゴヌクレオチドの合成に用い
る試薬に不溶性のものを選択し、各縮合サイクル後にお
けるポリヌクレオチドの回収の便宜を図る。また、担体
は、反応体が入り易く、また生産物並びに反応体が溶離
し易い様、充分多孔性のものを用いる。好ましい担体は
調整(コントロールされた)多孔性ガラスであり、シリカ
ゲルおけるポリスチレンも用いることができる。担体−
結合ヌクレオシドはチョウら(Ｃhow)“ヌクレイック・
アシッズ・リサーチ(Ｎucl．Ａcids Ｒes．)"９:２８
０７(１９８１)の方法等、既知の方法で調製される。
【００１０】ヌクレオシドＨ−ホスホネートは、正(プ
ラス)に荷電している対イオンを伴なった陰イオンの形
で存在している。対イオンとしては、トリエチルアンモ
ニウム(ＴＥＡＨ+)や１,８−ジアザビシクロ[５．４．
０]ウンデカン−７エン−オニウム(ＤＢＵＨ+)が好まし
い。ホスホネート類のＤＢＵＨ塩は、無水溶媒中での安
定性が増加されている。
【００１１】担体と結合したヌクレオシドおよびヌクレ
オシド３'Ｈ−ホスホネートは、３'ヌクレオシドを担体
に結合させ、予め定められた配列のオリゴヌクレオチド
を合成することができる様、順次(in seriatim)選択さ
れる。この予め定められた配列と一致させて順番に縮合
させ、オリゴマーに他のヌクレオシドを付加することに
より、オリゴヌクレオチド鎖の延長を行う。
【００１２】縮合反応の第１回目は、担体結合ヌクレオ
シドと、オリゴヌクレオチド中の第２番目のヌクレオシ
ドとの縮合である。この、並びに以後の反応において重
要な試薬は脱水剤である。適当な脱水剤は、一般に、ホ
スホリル化剤またはアシル化剤のクラスに含まれ、それ
らには、イソブチルクロロホルメート、ジフェニルクロ
ロホスフェート、無水酢酸、無水イソ酪酸および無水ト
リメチル酢酸の如き有機酸無水物、並びにピバロイルク
ロライド、ピバロイルブロマイドおよびベンゾイルクロ
ライドの如き有機酸ハロゲン化物が含まれる。ジフェニ
ルクロロホスフェート、カーボジイミド、アリールスル
ホニルクロライドおよびアリールスルホニルテトラゾラ
イドは、本発明者の行った実験では極めて低い収率しか
与えなかった。オリゴヌクレオチドの製造において最も
重要なアシル化剤ホスホリル化剤の性質は、各サイクル
毎に、実質上、全ての新生(nascent)担体−結合鎖にヌ
クレオシドを付加させる能力である。もしも追加のヌク
レオシドが鎖の亜集団(subpopulation)と結合しなかっ
たならば、即ち、その亜集団について反応サイクルが失
敗したならば、この亜集団に以後の付加がなされた結果
生成するオリゴヌクレオチドは、塩基１個分短かいこと
になる。このことは、該オリゴヌクレオチドの、組換え
培養中で発現されるべきＤＮＡ中の成分としての有用性
を失なわせるものである。何故ならば、この様な欠失に
よってＤＮＡがリーデイングフレームから外れることに
なると共に、長いオリゴヌクレオチド生産物中に混在す
る欠失突然変異体を見出すことは困難であるからであ
る。この様に、分子生物学に用いるオリゴヌクレオチド
を製造するには、鎖の延長に高い忠実性を示す、即ち、
各サイクルにおける付加収率の高い脱水剤を選択するこ
とが重要である。本明細書中に特に示したもの以外の、
その様な優れた試薬の選択は、スクリーニングアッセイ
によって行うことができる。
【００１３】採用されるスクリーニングアッセイについ
ては、実施例２にさらに詳しく述べられている。担体−
結合ヌクレオシドに、４サイクルでヌクレオシドＨ−ホ
スホネート(Ｎ)を縮合させ(最後のサイクルにおいては
必ずＮ5を得る)、次いで、担体からポリヌクレオチドＨ
−ホスホネートを分離してオリゴヌクレオチドに変換
し、ＨＰＬＣにかけて分離し、Ｎ2からＮ5までのオリゴ
マーの分布を調べる。もしも選択した脱水剤が、オリゴ
マーの吸光係数について修正した分光光度法に基づく吸
収の測定により、約８０モル％以上(通常、約９０％以
上)のＮ5を含むオリゴマー混合物を産生しているなら
ば、この試薬は本発明の目的に好ましいものとみなされ
る。あるいはまた、ステップd)を４９サイクル行った
後、ステップe)およびf)を行い、得られた組成物中に所
望の５０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド組成
物を、他のオリゴヌクレオチド種よりも多量のモル数で
含有するオリゴヌクレオチド組成物が得られる様な脱水
剤を選択する。当該技術分野においてジヌクレオシドの
製造に用いられてきた試薬はホスホリル化剤またはスル
ホニル化剤である。これら当業者に用いられてきた試
薬、とりわけ、ジフェニルクロロホスフェート、２,４,
６−トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロライドま
たは２,４,６−トリイソプロピルベンゼンスルホニルテ
トラゾライドの如き試薬は本発明の厳密な標準に合致し
ない。
【００１４】好ましい活性化剤はアシル化剤である。特
に好ましいアシル化剤は、式:
【化２】 [式中、Ａはアリールまたは、式：
【化３】 (式中、Ｒは、好ましくは直鎖または分枝鎖状アルキ
ル、アリール、ヘテロアルキルまたはヘテロアリールか
ら選ばれる同一または異なる不活性な置換基を表わす)
で示される基、Ｘはハロゲンあるいは異項環２級アミン
または活性エステル等の偽似(pseudo)ハロゲンを表わ
す]で示される構造を有するものである。Ｒはアルキル
であることが好ましく、Ｘは塩素または臭素であること
が好ましい。式中ＲがＣＨ3であってＸが塩素である塩
化ヒパロイルがアシル化剤として好ましい。
【００１５】代表的な異項環アミンのＸ基はテトラゾー
ルである。この種の代表的な例は式：
【化４】 で示される化合物である。このものは自体既知の方法に
従い、
【化５】 とテトラゾールとを反応させることにより、得られる。
【００１６】代表的な活性エステルは、式:
【化６】 で示される化合物であって、
【化７】 とヒドロキシベンズトリアゾールとの反応によって製造
される。その他の適切な脱離基は当業者にとって自明で
ある。
【００１７】通常、脱水剤は約２５mＭ〜１００mＭの濃
度で用いられる。塩化ピバロイルは、約５０mＭの濃
度、あるいはホスホネートモノマーに対し、塩化ピバロ
イルが５モル当量存在する量で用いることが好ましい。
１０当量を用いるとオリゴヌクレオチドの収率が低下す
る。このことは、競合的アシル化によって収率が限定さ
れること、および余分のキャッピング工程を必要としな
いことを示唆している。塩化ピバロイルは反応に失敗し
た鎖の小部分と反応し、以後の縮合に関与し得ないピボ
レート(pivolate)エステルを生成させる。この様に、不
完全な鎖は別の工程、または余分の試薬を加える必要な
しに、キャップ(閉鎖)されるのである。
【００１８】縮合に必要なホスホネートの量は、一般
に、約５mＭ〜２０mＭの濃度域であり、約１０mＭ[相対
的に５'−ＯＨ成分の５eq．(当量)に相当]が普通であ
る。これは、通常、約５０mＭを要する既知のオリゴヌ
クレオチド合成法で用いられるモノマー量に比べてかな
り少量である。縮合反応の溶媒は無水有機溶媒、好まし
くは無水ピリジン／アセトニトリル(容量比１:１)の混
合物である。
【００１９】反応は、一般に、脱水剤と選択したホスホ
ネート溶液とを混合した後、得られた混合物を担体−結
合オリゴヌクレオチド鎖と接触させることにより行われ
る。通常、担体は粒状であり、これをカラムに詰めた
後、その上から、モノマーと脱水剤の溶液を通す。接触
時間は通常約０．５〜５分間であり、約１．５分間が好
ましい。反応温度は約１０℃〜３０℃、好ましくは２０
℃である。
【００２０】各サイクルの後に、アセトニトリルの如き
有機溶媒で洗浄することにより担体から残存する脱水剤
およびヌクレオシドＨ−ホスホネート含有溶液を除去す
る。その後、好ましくは、２．５v／v％のジクロロ酢酸
／ＣＨ2Ｃl2溶液で処理することにより付加されたヌク
レオシドを脱保護する(但し、１w／v％トリクロル酢酸
／ＣＨ2Ｃl2またはＺnＢr飽和ニトロメタンも有用であ
る)。その他の既知の保護基に関する適当な脱保護法は
当業者にとって自明であろう。次いで、好ましくは担体
を無水ピリジン／アセトニトリル(１／１v／v)で洗浄
し、この縮合反応を、予め定められたオリゴヌクレオチ
ドの製造に必要な回数、繰返して行う。
【００２１】必要な数の合成サイクルを行った後、ポリ
ヌクレオチドＨ−ホスホネートを酸化して核酸にする。
ホスホラミデート・ヌクレオチド間結合を有するオリゴ
ヌクレオチドを調製するために、１級または２級アミ
ン、並びに、好ましくは四塩化炭素の存在下で酸化を行
う。ヌクレオチド結合内にホスフェートジエステルを生
成させる上で好ましい酸化剤はヨウ素水である。その
他、代表的な酸化剤には、Ｎ−クロロスクシンイミド、
Ｎ−ブロモスクシンイミド、または過ヨウ素酸の塩類が
含まれる。次いで、オリゴヌクレオチドを担体から分離
するが、濃水酸化アンモニウムとインキュベーションし
た後、残存するシリカゲルを濾去し、オリゴヌクレオチ
ド−含有溶液を蒸発させる方法によることが好ましい。
所望により、このオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣ、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動、あるいはその他の通常の
方法で精製し、核酸配列決定法によって生産物の忠実度
を確認する。
【００２２】上記の議論はモノヌクレオシドホスホネー
トの逐次付加についてなされているが、特定のサイクル
においては、ポリ(ヌクレオシドホスホネート)、通常ジ
−またはトリ−ヌクレオシドホスホネートを用い、１以
上のヌクレオシドを付加することもできることは理解さ
れるであろう。これらの反応物は、可溶性のヌクレオシ
ド(担体と結合していても、いなくても良い)を、上記の
鎖の開始におけるヌクレオシドホスホネート以外のヌク
レオシドホスホネートに縮合させることにより、容易に
調製される。次いで、その様なジヌクレオシドジホスホ
ネートをモノヌクレオシドホスホネートの代りに用いる
か、あるいは、他のポリ(ヌクレオシドホスホネート)の
製造に用いる。これらの新規な中間体は、式:
【化８】 (式中、ＹはＤＢＵＨ+の如き対イオン、nは１またはそ
れ以上であって、通常２、Ｍはヌクレオシドを表わす)
で示される構造式を有する。通常、ヌクレオシドは保護
される。その様な化合物の例として５'ジメトキシトリ
チル−３'−チミジル−５'−Ｈ−ホスホネート−３'−
チミジン−Ｈ−ホスホネートがある。これらの反応物
は、精製し、無水固形物として保存すべきである。
【００２３】以下に実施例を挙げ、本発明を説明する
が、これらの実施例は本出願の発明の範囲を制限するも
のと解釈されるべきでない。
【００２４】実施例１ エイコサチミジル酸(Ｔ２０)お
よびテトラコンタチミジル酸(Ｔ４０)の製造 ５'−ジメトキシトリチル−３'−チミジン−Ｈ−ホスホ
ネート(１)の合成上の有用性は、シリカゲル上でのＴ２
０およびＴ４０の合成により示された。５'−ジメトキ
シトリチル−３'−チミジン−Ｈ−ホスホネートを既述
の如く製造し、31Ｐ ＮＭＲ(δ−０．２７ppm、Ｊ(Ｐ−
Ｈ)＝６０５Ｈz)[31Ｐ ＮＭＲスペクトルは無水Ｐyr(ピ
リジン)／ＣＨ3ＣＮ(１／１)溶液中、で得られ、化学シ
フトは、５％りん酸／Ｄ2Ｏ(外部基準)との相対関係に
基づいて示されている]により特性化された。反応は下
記の反応式(１)で示される。式中、ＤＭＴはジメトキシ
トリチル、Ｐyrはピリジン、ＤＣＡはジクロロ酢酸、そ
してＲはスクシニル・シリカを表わす。
【００２５】
【化９】
【００２６】既述の如く(チョウら、前掲)、シリカゲル
１g当り３'−スクシニルチミジン２５μモルを用いてポ
リマー支持体(シリカゲル)を誘導体化した。この合成サ
イクルは、２、１０mＭの１(２の５'−ＯＨ成分の５当
量に相当)および５０mＭ塩化ピバロイルを無水ピリジン
／アセトニトリル(１／１)中、２０℃で５分間縮合反応
させた後、２．５％ＤＣＡ／ＣＨ2Ｃl2を用いて(２分
間)３のジメトキシトリチルを脱保護することからな
る。必要な回数、合成サイクルを行った後、ポリチミジ
ンＨホスホネート産物３をテトラヒドロフラン／Ｐyr／
Ｈ2Ｏ(９０／５／５)中０．２ＭＩ2で酸化し(２分間)、
ポリチミジル酸４を得た。固体支持体から４を除去し
(濃ＮＨ4ＯＨ／５時間／５５℃)、蒸発させた。粗生成
物Ｔ２０をＨＰＬＣ分析にかけたところ、この生成物の
ピークは、ホスホラミダイト法で調製したＴ２０標準品
と同時に溶離することが分った。Ｔ２０およびＴ４０粗
生成物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、
Ｕ．Ｖ．照射下に観察して評価した。分析データーか
ら、Ｔ２０およびＴ４０の両者が高収率で合成されるこ
とが明らかにされた。Ｔ４０を、さらに、ポリヌクレオ
チドＴ４キナーゼを用い、r−32Ｐ−ＡＴＰによる５'末
端の標識化を行った後、ヘビ毒ホスホジエステラーゼに
より完全に分解することによって評価した。あらゆる判
断基準において、合成Ｔ４０はＴ４０標準品と同じであ
った。
【００２７】実施例２ 好ましい脱水剤の同定 ジフェニルクロロホスフェート(ＤＰＣＰ)を脱水剤とす
る並行(パラレル)サイクルを行うと共に、ペンタチミジ
ル酸(Ｔ５)を得るまで、４サイクルまで反応を行うこと
を除き、実施例１の方法を繰返して行った。カラムから
の粗溶出液をＨＰＬＣ分析に付し、未成熟な鎖で終って
いるオリゴヌクレオチドの割合(％)を調べた。ＨＰＬＣ
樹脂はゾルバックス(Ｚorbax)−ＮＨ2(商標)を用いた。
流速は２．５ml／分であり、１５v／v％ＣＨ3ＣＮ中、
２５mＭ〜２５０mＭＫＨ2ＰＯ4(pＨ５．５)のリニアー
グラデイエントを用いた。１５分間、フラクションを集
め、２５４nmにおける吸収を測定した。ＨＰＬＣチャー
トから、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５各々の１個の実質
上対称的なピークの高さを測り、各オリゴマーについて
の吸光度係数を補正し(各ピークの値に、それぞれ２．
５、１．７５、１．２５および１を掛ける)、各粗溶出
液中の全ポリチミジンに対する割合(％)に変換した。結
果を下記の表に示す。
【００２８】
【表１】 オリゴマー(％) オリゴマー ＤＰＤＣ 塩化ピバロイル Ｔ２ ２５ ２．５ Ｔ３ ２３ ３．５ Ｔ４ ４４ ５ Ｔ５ ８ ８９ これらの結果は、塩化ピバロイルが、４サイクル反応に
おいて約１１％の未成熟に終結したオリゴマーを与える
にすぎず、従って、好ましい脱水剤であることを証明す
るものである。
【００２９】ＤＰＤＣを用いたＴ５の収率は塩化ピバロ
イルを用いた場合の約１０％にすぎない。アリールスル
ホニルクロライドおよびカーボジイミド類ではＴ５の生
成を検出できなかった。この様に、好ましいアシル化剤
を用いる本発明の方法は、予想外の高い収率をもたらす
と共に、未成熟な鎖の終結を減少させる結果を与えた。
【００３０】実施例３ ヌクレオシドＨホスホネートの
製造 本発明に用いるデオキシヌクレオシドの製造は下記の反
応式２に従って行われた。
【化１０】 Ｂ＝a) チミン b) Ｎ6−ベンゾイルアデニン c) Ｎ4−ベンゾイルシトシン d) Ｎ2−イソブチリルグアニン e) Ｎ6−ジイソブチルホルムアミジンアデニン
【００３１】無水ＣＨ2Ｃl2７５０ml中のＰＣl3(７５ミ
リモル)およびＮ−メチルモルホリン(７５０ミリモル)
の撹拌溶液に１,２,４−トリアゾール(２５０ミリモル)
を室温で加えた。３０分後、反応混合物を０℃に冷却
し、５'−ジメトキシトリチルチミジン(Ｉa、１５ミリ
モル、ＣＨ3ＣＮから共沸蒸留して乾燥)を無水ＣＨ2Ｃl
2２００ml中に入れ、これを２０分間で滴下し、１０分
間撹拌した後、１．０Ｍトリエチルアンモニウムビカー
ボネート水溶液(ＴＥＡＢ、pＨ８．５)６００ml中に注
ぎ入れ、振盪した後、分離させた。水層をＣＨ2Ｃl2２
００mlで抽出し、有機層を一緒にしてＮa2ＳＯ4で乾燥
し、蒸発させて泡状体とした。シリカゲルカラムクロマ
トグラフィー(２％Ｅt3Ｎ／ＣＨ2Ｃl2−＞２％ Ｅt3Ｎ
／１０％ＭeＯＨ／ＣＨ2Ｃl2)にかけた後、ＴＥＡＢで
抽出し、蒸留することにより、５'−ジメトキシトリチ
ル−３'−チミジンＨ−ホスホネート(１a)を収率９０％
で得た。その他のデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネー
ト類は全て同様の方法で得られた。個々の収率と31Ｐ
ＮＭＲデーターを表２に示す。
【００３２】
【表２】 31Ｐ ＮＭＲ1) ヌクレオシド ケミカル Ｈ−ホスホネート シフト Ｊ(Ｐ−Ｈ) 収率2) (％) チミジン(１a) −０．３ppm ６０５Ｈz ９０ デオキシアデノシン(１b) −０．３ppm ６００Ｈz ８５ デオキシシチジン(１c) −０．３ppm ６０３Ｈz ８６ デオキシグアノシン(１d) −０．６ppm ６０５Ｈz ７７ １) 31Ｐ ＮＭＲスペクトルは無水Ｐyr／ＣＨ3ＣＮ(１／１)溶液中で得られ 、ケミカルシフトは、５％りん酸／Ｄ2Ｏ(外部基準)との相対値として示されて いる。 ２) 各々の収率は保護されたデオキシヌクレオシド(Ｉa−Ｉd)に基づいてい る。
【００３３】実施例４ デオキシオリゴヌクレオチドの
合成 ここに示す方法は、本発明の実施における最も優れた方
法である。合成はバイオサーチモデル(Ｂiosearch Ｍo
del)８６００ＤＮＡ合成装置を用いて行われた。トリメ
チルアセチルクロライド(塩化ピバロイル)を大気圧下で
蒸留し、アルゴン(Ａr)下に保存した。ピリジン(Ｐyr)
をＰ−トルエンスルホニルクロライドから蒸留した後、
水素化カルシウムから新らたに蒸留した。アセトニトリ
ル(ＣＨ3ＣＮ)を、活性化した３オングストロームのモ
レキュラーシーブで乾燥した。デオキシ−ヌクレオシド
Ｈ−ホスホネート(１a−１d)を無水ＣＨ3ＣＮから共沸
蒸留して乾燥し、無水Ｐyr／ＣＨ3ＣＮ(１:１)中で再構
成した。合成は、調整(コントロール)多孔性ガラス
(０．１μモルのスケール)上で、以下のプロトコールに
従って行った。
【００３４】合成サイクル(実施例１の反応式１) １) 洗浄:無水ＣＨ3ＣＮ(４５秒間)。 ２) 脱保護:２．５％ジクロロ酢酸(ＤＣＡ)／ＣＨ2Ｃl
2(１分間)。 ３) 洗浄:無水Ｐyr／ＣＨ3ＣＮ(４５秒間)。 ４) 結合(カップリング):１０mＭデオキシヌクレオシ
ドＨ−ホスホネート(１a−１d)、無水Ｐyr／ＣＨ3ＣＮ
(１／１v／v)中５０mＭ塩化ピバロイル(１．５分間)。 ５) ヌクレオチド配列が完成するまでステップ１−４
を繰返す。 ６) 脱保護:２．５％ＤＣＡ／ＣＨ2Ｃl2(１分間)。 ７) Ｈ−ホスホネートＤＮＡの酸化:Ｐyr／ＮＭＩ／
Ｈ2Ｏ／ＴＨＦ(容量比５／１／５／９０)中０．１ＭＩ2
(２．５分間)、Ｅt3Ｎ／Ｈ2Ｏ／ＴＨＦ(容量比５／５
／９０)中０．１ＭＩ2(２．５分間)による。ポリマーか
らＤＮＡを除き、脱保護(濃ＮＨ4ＯＨ、５５℃、５時
間)し、蒸留する。
【００３５】デオキシヌクレオシドＨホスホネート(１a
−１d)を、長さ１０７塩基までのデオキシオリゴヌクレ
オチド(ＤＮＡ)の合成に用いたが、これが合成の許容範
囲の上限ではない。上記の合成プロトコールでは、簡便
かつ迅速な方法(４分／サイクル)に於いて、最少量のデ
オキシヌクレオシドＨホスホネート(２．５mg／結合)を
用いている。ヌクレオシド間のりん原子は、それが酸化
状態にあることで望ましくない副反応から保護されてお
り、固有のホスフェートジエステルはヨウ素水による酸
化合成反応の後に生成する。
【００３６】ポリマーと結合したポリヌクレオシドＨホ
スホネート(３)のＰyr／Ｈ2Ｏ／ＴＨＦ(５／５／９０)
中０．１ＭＩ2溶液による酸化は、首尾一貫した結果を
得るには不適当であった。ジアルキルホスホネートのヨ
ウ素水による酸化には一般的な塩基性触媒に委ねられて
おり[ルイス(Ｌewis,Ｅ．Ｓ．)およびスペアーズ(Ｓpea
rs,Ｌ．Ｇ．)ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル
・ソサエテイ(Ｊ．Ａmer．Ｃhem．Ｓoc．)１０７,３９
１８(１９８５)]、このことから、本発明者らは、Ｎ−
メチルイミダゾール(ＮＭＩ)またはより強力な塩基[即
ち、Ｎ−メチルモルホリンまたはトリエチルアミン(Ｅt
3Ｎ)]を加えると酸化速度が増大し、従って長いデオキ
シオリゴヌクレオシドＨホスホネート(３、＞４０塩基)
の酸化にそれが必須であると断定した。ジアルキルＨ−
ホスホネートはアルカリ加水分解を受け易いとされてお
り[クメ(Ｋume,Ａ)、フジイ(Ｆujii,Ｍ)、(Ｓekine,
Ｍ．)およびハタ(Ｈata,Ｔ)、ジャーナル・オブ・オー
ガニック・ケミストリイ(Ｊ．Ｏrg．Ｃhem)４９、２１
３９(１９８４)]、本発明者らはＥt3Ｎを用いたポリヌ
クレオシドＨホスホネート(３)の水中での酸化は競合的
加水分解により複雑化していることを見い出した。長い
デオキシオリゴヌクレオシドＨホスホネート(３)(＞４
０塩基)のヨウ素酸化においては、まず弱塩基性溶液(Ｐ
yr／ＮＭＩ)、次いで強塩基性溶液(Ｅt3Ｎ)で酸化する
と、生成物デオキシオリゴヌクレオチド(４)を最も高い
収率で得ることができることが分った。さらに、本発明
者らは、ヨウ素(Ｉ2)水溶液はＩＯ3 -とＩ-とに不均衡化
されていることを見出したが(ルイス、前掲)、このアル
カリ性ＩＯ3 -溶液はジヌクレオシドＨ−ホスホネート
(３)を酸化しないであろうと思われる[ブラウン(Ｂrow
n,Ｄ．Ｍ．）およびハモンド(Ｈammond,Ｐ．Ｒ．)、ジ
ャーナル・オブ・ケミカル・ソサエテイ(Ｊ．Ｃhem．Ｓ
oc．)４２２９(１９６０)]。従って、別々の溶液を調製
し[Ａ＝０．２ＭＩ2／ＴＨＦ、Ｂ＝塩基／Ｈ2Ｏ／ＴＨ
Ｆ(１／１／８)]、デオキシオリゴヌクレオシドＨ−ホ
スホネート(３)の首尾一貫して迅速な酸化を行う直前に
これらを混合する必要がある。
【００３７】デオキシオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネ
ート結合(３)の、デオキシオリゴヌクレオチド合成に用
いた試薬に対する安定性を評価するための実験を行っ
た。２４量体を製造し、デオキシヌクレオシドＨ−ホス
ホネート(３)の酸化に先立ち、固体支持体の一部を、
１)無水Ｐyr／ＣＨ3ＣＮ(１／１)、２)無水ＣＨ3ＣＮ、
３)無水Ｐyr／ＣＨ3ＣＮ(１／１)中１００mＭ塩化ピバ
ロイル、および４)２．５％ＤＣＡ／ＣＨ2Ｃl2で４時間
処理し、次いで、ＣＨ3ＣＮ洗浄、酸化、洗浄、脱保護
(濃ＮＨ4ＯＨ／５時間／５５℃)、および蒸留を行っ
た。ポリヌクレオチドＴ４キナーゼを用い、γ−32Ｐ−
ＡＴＰで５'末端を標識した後、試料をゲル電気泳動と
オートラジオグラフィー(データーは示されていない)に
よって分析した。これらの条件下ではポリヌクレオシド
Ｈ−ホスホネート(３)の検出し得る程度の分解は認めら
れなかったが、ＣＨ3ＣＮまたはＰyr／ＣＨ3ＣＮ溶液に
水を加えて１％とすると４時間の間に、検出し得る分解
が起きた。これらの結果は、Ｈ−ホスホネート結合が、
合成の間中、りん保護基として作用することを示唆して
いる。
【００３８】３'または５'−ホスフェートリンエステル
がデオキシアデノシンのグリコシド結合を、酸によって
触媒される脱プリン化から安定化することが示された
[タナカ(Ｔanaka,Ｔ．)およびレツツインガー(Ｌetsing
er,Ｒ．Ｌ．)ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Ｎuc
l．Ａcids Ｒes．)１０ ３２４９(１９８２)]。ヌク
レオシド間Ｈ−ホスホネート結合(３)が脱プリン化速度
に及ぼす影響を評価した。Ｎ6−ベンゾイルアミド(３
b、a)またはＮ6−ジイソブチルホルムアミジン(３e、a)
で保護された、ポリマーと結合している３'−チミジン
−５'−デオキシアデノシンジヌクレオシドＨ−ホスホ
ネートを２．５％ＤＣＡ／ＣＨ2Ｃl2で２４時間処理
し、分析した。Ｈ−ホスホネートジエステル(３)とメチ
ルホスフェートトリエステルの間には脱プリン化速度に
おいて検出可能な差異を認めなかった(データーは記載
されていない。また、この実験では、Ｎ6−ベンゾイル
アミドで保護されたデオキシアデノシンと比較して、Ｎ
6−アミジンで保護されたデオキシアデノシンの方がよ
り安定であることが確認された。記載のプロトコールを
用いてＤＮＡの特定の配列を合成し、粗生成物の特性を
調べた。
【００３９】合成されたデオキシオリゴヌクレオチド
【化１１】
【００４０】デオキシオリゴヌクレオチド７８a、７８b
および９９をメトキシジイソプロピルアミノホスホラミ
ダイトを用いて合成し、比較のために表に示した。アミ
ダイト合成は、存在し得るホスファイト−異項環塩基生
成物を酸化して加水分解する前に３０秒間の水洗を行う
ことを除き、標準的なプロトコールを用いて行った。表
に示したデーターは、デオキシヌクレオシドＨ−ホスホ
ネート中間体を用いて生産物デオキシオリゴヌクレオチ
ドが高収率で合成されることを明白に示している。この
時点では、Ｈ−ホスホネートＤＮＡの配列における忠実
度は、ホスホラミダイト法により生産されたものよりも
低いが、この短所は、合成サイクルがより単純であり、
合成に必要なデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート濃
度が低いということによって十分相殺される。
【００４１】実施例５ まず、ジヌクレオチドホスホラミデート２eおよび２f
(反応式３参照)を製造するため、ポリマーと結合したジ
ヌクレオシドＨ−ホスホネート１を、対応するアミン
(１０％)とテトラヒドロフラン(ＴＨＦ)との溶液中、
０．０５ＭＩ2で５分間酸化した。
【００４２】
【化１２】 生成したアミダイトを固体支持体から除去し(５０％濃
水酸化アンモニウム(ＮＨ4ＯＨ)／ジオキサン、８時
間、r．t．)、蒸留した。両生成物の31Ｐ ＮＭＲスペク
トルは、略同量のジアステリオマー(diasteriormer)が
存在することを示していた[31Ｐ ＮＭＲスペクトルはＣ
ＤＣl3中で得られ、ケミカルシフトは５％りん酸／Ｄ2
Ｏ(外部基準)との相対値で示されている;２e δ−９．
１、−８．８ppm;２f δ−７．９、−７．６ppm]。Ｈ
−ホスホネートジエステルのホスホラミデートへの酸化
は、競合的加水分解によりジエステル２aが生成し複雑
であった。Ｈ−ホスホネートジエステルを四塩化炭素で
酸化してホスホラミデートを得る方法[アサートンら(Ａ
therton)、ジャーナル・オブ・ケミカルソサエテイ
(Ｊ．Ｃhem．Ｓoc．)６６０(１９４５)、ツヴイアーザ
ック(Ｚwierzak,Ａ．)シンセシス(Ｓynthesis)５０７
(１９７５)]は、ＣＣl4への水の溶解度が低いという利
点がある。全てのジヌクレオチドホスホラミデート(２b
−g)は、対応するアミンのＣＣl4中１０％溶液を用いて
(５分間)調製した(対応するホスホラミデートを調製す
るには、ジオキサン／ＣＣl4(１／４)中、アンモニアま
たはメチルアミン飽和溶液を用いた)。試料の高速液体
クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)は、競合的加水分解は極
く少量で、生産物ホスホラミデートが高収率で得られて
いることを示していた(ジチミジンホスフェートジエス
テル２a＜３％)。
【００４３】ホスホラミデート結合の濃ＮＨ4ＯＨに対
する安定性をそれぞれについて調べ、その結果、ホスホ
ラミデート２c−２gは、通常の異項環Ｎ−アシル保護基
の除去に必要な条件(５５℃、５時間)下に安定であるこ
とが示された。この様な条件下、ホスホラミデート２b
は迅速に分解(t１／２＝１５分)し、３'ホスホラミン酸
モノエステルと５'ホスホラミン酸モノエステルの混合
物となった[トマス(Ｔomasz,Ｊ．)、ヌクレオシドとヌ
クレオチド(Ｎucleosides and Ｎucleotides)２ ５
１(１９８３)]。ジヌクレオチドホスホラミデート(２b
−g)の、エキソヌクレアーゼによる酸素分解に対する安
定性を、膵臓のホスホジエステラーゼとヘビ毒のホスホ
ジエステラーゼを用いて調べた。ジヌクレオチド(２a−
g)と対応する酵素／バッファー溶液とを３７℃で１時間
インキュベーションすると、ホスフェートジエステル
(２a)は完全に分解されたが、ホスホラミデート(２b−
g)の分解は検出されなかった(逆相ＨＰＬＣによる評
価)。観察されたジヌクレオチドホスホラミデート２bの
酵素学的安定性は、オギルビー(Ｏgilvie)[ネーマーら
(Ｎener)、テトラヘドロン・レター(Ｔetrahedron Ｌe
tt．)２１ ４１４９(１９８０)]の説に反するが、レッ
シンガー(Ｌetzinger)[レッシンガーら、ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ(Ｎucl．Ａcids Ｒes．)１４
３４８７(１９８６)]の報告とは一致する。
【００４４】この酸化工程の範囲をさらに追求するため
に、１〜９個のホスホモルホリデート(phosphormorphol
idate)結合を含有するウンデカチミジル酸(Ｔ１１)を調
製した。上記のプロトコールを用い、調整多孔ガラス上
でポリチミジンＨ−ホスホネート合成を行った。反応式
４によってその概略が示されている方法は、１個のホス
フェート・ジエステル結合に付随し、９個のホスホモル
ホリデート結合を含有するＴ１１の合成に関するもので
ある。この方法は、３'ホスホラミデート結合を含有す
るＴ１１産物の全てについて用いられた。
【００４５】反応式４ １個のホスフェートジエステル
結合(５'末端)に付随する９個のホスホモルホリデート
結合(３'末端)を含有するＴ１１の合成(＊はホスホモル
ホリデート結合を示す)
【化１３】
【００４６】濃ＮＨ4ＯＨ(２時間／r．t．)によって生
成物を固体支持体から除去し、蒸留した。ポリアクリル
アミドゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)およびＵ．Ｖ．像(シャ
ドウイング)は、各々の主生成物バンドを示唆してい
た。バンドを切り取り、粉砕してＨ2Ｏ抽出し、逆相Ｈ
ＰＬＣ(Ｃ18)によって単離した。これらの生成物をＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼとγ−32Ｐ ＡＴＰで処理し
て５'末端を標識した後、ＰＡＧＥ(１７％ポリアクリル
アミド／７Ｍ尿素)に付してオートラジオグラムを得
た。種々のＴ１１生成物の電気泳動的易動度は極めて顕
著であり、モルホリデートが付加される毎に質量が増大
し、電荷が減少した。様々なＴ１１生成物の電気泳動的
易動度は厳密には質量／電荷比に依存していないという
点は興味深い。多くのホスホラミデート結合を含有して
いる生産物(高質量／電荷比)は、ホスホラミデート結合
のより少ないＴ１１生産物の易動度に基づく予想よりも
大きい易動度を有する。これらのポリチミジンホスホモ
ルホリデート類の各々を８５％ギ酸で処理すると(９５
℃、１５分間)、全てのジエステル結合を含有するＴ１
１が生成した。
【００４７】チオホスフェート同族体の前駆物質として
ヌクレオシドＨ−ホスホネートジエステルが用いられて
いる[フジイら(Ｆujii)、テトラヘドロン・レター(Ｔet
rahedron Ｌett．)２６、９３５(１９８６)]。この変
換は、ポリマーと結合したオリゴヌクレオシドＨ−ホス
ホネート・ジエステル(１)をトリエチルアミン(ＴＥＡ)
／二硫化炭素(１／９)中０．１ＭＳ8溶液で処理する(５
分間)ことにより、直接、高収率で達成された(＞９８
％)。ハイブリダイゼーション用のプローブとして用い
る上で極めて高い比活性を有する放射性同位体で標識し
たオリゴヌクレオチドを調製するために、35Ｓ放射性同
位体を一部含むＳ8を用いる。
【００４８】酸素のトリエステルは、オリゴヌクレオシ
ドＨ−ホスホネート(１)と対応するアルカノール[ＲＯ
Ｈ(ここに、Ｒは通常、炭素原子数１０以下のアリー
ル、アルキル、ヘテロアルキルまたはヘテロアリールを
表わす)で示され、好ましくはＭeＯＨまたは、n−ＢuＯ
Ｈである]のＮ−メチルイミダゾール／ＴＥＡ／ＣＣl
4(５／５／９０)中１０％溶液とを反応させることによ
り得られる。この反応は競合的加水分解を極めて受け易
いので、無水条件下で行う様、注意する必要がある。
【００４９】b) −g)の１級および２級アミン類は単な
る例示である。一般式
【化１４】 (式中、ＸおよびＹは水素、アルキル、ヘテロアルキ
ル、ヘテロアリールまたはアリールからなる群から選ば
れる同一または異なる基であるか、あるいは一緒になっ
てシクロアルケン、シクロアルカンまたは異項環を形成
していてもよい)で示される置換基を用いてもよく、こ
れもまた本発明の範囲内に含まれる。ＸまたはＹ、ある
いはこれらが一緒になってヘテロアルキルおよびヘテロ
アリール置換基を形成している種は、インビトロでのハ
イブリダイゼーションプローブとして用いるのに好まし
く、ＸまたはＹがアルキルまたはアリール置換基である
種は、インビボでのハイブリダイゼーションに好まし
い。
【００５０】ヘテロアリールＲＯＨ、ＸまたはＹ中のヘ
テロ(異種)原子はＳ、ＮまたはＯからなる群から選ば
れ、ヘテロアリール基中に約１〜５個存在している。イ
ンビトロでの診断に特に有用なヘテロアリール種は蛍光
性であって、例えば、パルス蛍光に用いられる希土類金
属のキレート類や、偏光蛍光ハイブリダイゼーションア
ッセイに用い得ることが分っている他の置換基である、
ヘテロアリール基を有する種であるる。その様な蛍光標
識オリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡとのハイブリダイ
ゼーションに際し、例えば、偏光の変化、発光の波長に
おける変化、発光強度の変化等の蛍光の変化を検出する
ことにより、相の分離を行わずにハイブリダイゼーショ
ンアッセイを行うことができるので、このアッセイにお
いて、特に有用である。本明細書に示した方法によれ
ば、その様な蛍光種でかなりの程度に置換されており、
従って高い比活性を示すオリゴヌクレオチドを容易に得
ることができる。
【００５１】以上に示した結果は、ポリヌクレオシドＨ
−ホスホネートが種々のヌクレオチド間ホスフェート同
族体の価値ある前駆体であることを証明するものであ
る。アミンの存在下、ポリヌクレオシドＨ−ホスフェー
トを酸化すると、対応するポリヌクレオチドホスホラミ
デートが高収率で得られる。ＤＮＡ合成におけるＨ−ホ
スホネート法は、簡便かつ迅速で試薬効率的な方法であ
り、ヌクレオチド間ホスフェート同族体を含有するＤＮ
Ａの迅速な合成に適用することができる。この方法は、
天然に存在するヌクレオチドを含有するＤＮＡの、種々
のヌクレオチド間ホスフェート同族体のための容易かつ
有効な合成ルートを与えるものである。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 【化１】 (式中、Ｙは対イオン、nは１またはそれ以上、そしてＭ
    はヌクレオシドを表わす)で示されるポリヌクレオチ
    ド。
  2. 【請求項２】 Ｍが保護されたヌクレオシドである請求
    項１記載のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 保護基がジアルキルホルムアミジンであ
    る請求項２記載のポリヌクレオチド。
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