JPH064670B2 - 酵素標識化されたポリヌクレオチドおよびその製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、酵素標識化されたポリヌクレオチドおよびそ
の製法に関するものであり、本発明により得られる酵素
標識化された特定の塩基配列を有するポリヌクレオチド
は標的遺伝子の同定および抽出、遺伝子配列の決定に使
用され、遺伝子工学、臨床診断および食品等の分野で幅
広く利用され得るものである。

（発明の背景） 近年遺伝子工学の研究が盛んになるに伴い、有用物質の
生産に必要な遺伝子の検出に、特定の塩基配列を有する
ポリヌクレオチドが用いられるようになってきている。
例えば臨床診断の分野においては現在免疫学的方法およ
び生物学的方法が用いられているが、前者は検査時間が
一般に数分と短いものの交差反応や干渉作用のためにし
ばしば不明瞭な結果を与え、また後者は培養に長時間を
要するなどの欠点を有する。これに対して、遺伝子を検
出することで疾患の診断を行なうポリヌクレオチド法
は、検査時間は一般に数時間を要するが、検出感度ばか
りでなく特異性も非常に高く、また誤差がきわめて小さ
いという利点を有し、感染症のみならず免疫学的方法で
は検出できない潜在性ウィルスやウイロイドも検出可能
であるため、これに適したポリヌクレオチドの開発が要
望されている。

（従来の技術） ポリヌクレオチドを用い、交雑法によって標的遺伝子を
検出さる際は、ポリヌクレオチドを標識化する必要があ
る。標識化は放射性同位元素を用いる方法と光標識法に
大別される。現在放射性同位元素³²Pを用いる方法が最
も利用されており、特開昭58-170496号公報にはＡＴＰ
（γ−³²P）とキナーゼでポリヌクレオチドの5′−末端
基に³²Pで標識したリン酸基を導入し、³²Pから放射され
るβ線でフィルムを感光させ、その黒斑点によって標的
遺伝子の存在を検出する方法が開示されている。放射性
同位元素による標識化は感度の点で優れている反面、使
用に際して(i)取り扱い上熟練が必要である、(ii)法規
上の規制が厳しく、特別の施設および測定機器が必要で
あり、またその限定された場所でしか取り扱えない、(i
ii)健康上の問題がある、(iv)使用後の廃棄に問題があ
る、(v)半減期に合わせて予約購入するので実験の期日
がそれにより制約される、などの難点がある。これに対
して放射性同位元素を用いない標識化法として光標識化
法が提案され、特開昭58-23795号公報および特開昭58-4
0099号公報には化学発光、生体発光、螢光を利用する方
法が開示されている。しかし光標識法としては、チミジ
ンあるいはウリジンアナローグとしてそのＣ−５位にア
ミド結合を会してビオチンを付した5′−Ｏ−トリホス
フェートを酵素的ニックトランスレーションの手法でポ
リヌクレオチドに組み込んで標識化し、標的遺伝子を検
出する方法〔Proceedings of National Academy of Sci
ence of the United State of America、第８０巻、第
４０４５頁（１９８３年）〕が実用化されているのみで
ある。

（発明が解決しようとする問題点） ヌクレオシドは核酸を構成する一単位であり糖およびプ
リンまたはピリミジン塩基がグリコシド結合しているも
のであり〔共立出版（株）、化学大辞典６、第８３６
頁〕、糖の種類によりリボヌクレオシドとデオキシリボ
ヌクレオシドに分けられる。

リボヌクレオシドは式 で示され、これは通常 と略記されている（式中、Ｂは保護基を有することもあ
る塩基残基）。

デオキシリボヌクレオシドは、式 で示され、これは通常 と略記されている。

このようなヌクレオシドをリン酸エステル化された形の
ものがヌクレオチドであり、核酸を構成する構造的単位
であって、ブリンまたはピリミジン塩基、糖およびりん
酸からなるものである。なお前記プリンまたはピリミジ
ン塩基は表１に示すとおりである。

そのうち、リボヌクレオチドは、リボヌクレオシドの
３′又は５′のＯＨがリン酸エステル化された形のもの
であり、例えば、３′−ＯＨがリン酸エステル化された
ものは式 で示され、デオキシリボヌクレオチドはデオキシリボヌ
クレオシドの３′または５′のＯＨがリン酸エステル化
されたものであり、例えば、３′−ＯＨがリン酸エステ
ル化されたものは式 で示される。

これらの構成要素である塩基、糖、リン酸の３つは、そ
れぞれ光標識化することが可能であるが、その際ポリヌ
クレオチドが標的遺伝子とハイブリットする性質を損う
ことのないよう標識化合物を導入する必要がある。しか
し、核酸塩基部を光標識化する場合、ピリミジン系塩基
ではＣ−５位に標識化合物を導入することが可能である
が、プリン系塩基については立体化学的に標識化合物を
導入可能なのはＣ−８位とＮ−７位のみであり、Ｃ−８
位に導入すると塩基と糖がSyn型配座をとるために一般
的には二重ら線が右巻きである場合はハイブリット能を
失い、またＮ−７位に導入する場合は窒素が四級となり
糖と塩基部のグリコシド結合が切れる、いわゆる脱プリ
ン反応が生起しやすくなるためプリン系塩基を光標識化
することはきわめて困難である。従って核酸塩基部の光
標識化はピリミジン系塩基の場合のみ有効であり、ポリ
ヌクレオチドの塩基配列がプリン系塩基のみの場合は光
標識化ができ難いという不都合を生じる。次に、糖部を
光標識化する場合、ポリデオキシリボヌクレオチドでは
両末端の水酸基しか利用できず、ポリリボヌクレオチド
では理論的には2′−位水酸基も利用可能であるが、こ
の位置に光標識化合物の如き大きさの分子を導入すると
ハイブリット形成に影響を及ぼすため、ポリデオキシリ
ボヌクレオチドと同様に両末端の水酸基しか利用できず
検出感度が低下する。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは光標識化により標識化したポリヌクレオチ
ドの検出感度を向上させるため種々検討を加えた結果、
核酸構成要素のリン酸部に架橋剤と結合した酵素を導入
することにより、ポリヌクレオチドの任意の位置に任意
の数の架橋剤と結合した酵素の導入が可能になることを
見い出したものである。

すなわち本発明の第１は、ポリヌクレオチドのリン酸結
合の少なくとも１個以上が、官能基を有する式〔Ｉ〕 （式中、Ｒは炭素数１ないし２０の分岐鎖を有すること
もある脂肪族炭化水素を、Ｘは保護基を有することもあ
るアミノ基よりなる官能基を示す） で表わされるホスホン酸結合で置換されており、前記ホ
スホン酸結合の官能基Ｘに架橋剤と結合した酵素が共有
結合していることを特徴とする酵素標識化されたポリヌ
クレオチド化合物に関する。

本発明の酵素標識化されたポリヌクレオチドは、相当す
る標的遺伝子と立体化学的にハイブリットすることがで
き、遺伝子の検出に有用である。

なお、前記ポリヌクレオチドはポリリボヌクレオチドと
ポリデオキシリボヌクレオチドを包含するものである。

本発明の第２は、ポリヌクレオチドのリン酸結合の少な
くとも１個以上が、官能基を有する式〔Ｉ〕 （式中、Ｒは炭素数１ないし２０の分岐鎖を有すること
もある脂肪族炭化水素を、Ｘは保護基を有することもあ
るアミノ基よりなる官能基を示す） で表わされるホスホン酸結合で置換されているポリヌク
レオチドに、前記ホスホン酸結合の官能基Ｘと共有結合
しうる架橋剤と結合した酵素を反応させることを特徴と
する酵素標識化されたポリヌクレオチド化合物の製法に
関する。

（ポリヌクレオチドの酵素標識化） ポリヌクレオチドの製法は、たとえばヌクレオチドを１
個ずつ逐次結合させて、目的とする核酸構造に相当する
ポリヌクレオチドとするホスファイト法などが公知であ
りその結果、式 で表わされるポリヌクレオチドとすることができるが、
本発明では標識化したい個所の のかわりに、 を導入することにより、酵素標識化用ポリヌクレオチド
をつくり、これに酵素標識化合物を結合させて標識化を
達成することができる。

本発明の酵素標識化されたポリヌクレオチドの１例を示
せばつぎのようになる。

また のかわりに を導入することにより一度に標識化を達成することもで
きるが、反応性、その他を考えると前者の方法の方が汎
用性があり、かつ安定的であり、優れている。

酵素標識化用ポリヌクレオチドと、架橋剤と結合した酵
素（以下、酵素標識化合物という）との反応は、酵素標
識化合物と特異的に反応する官能基Ｘを、分岐鎖を有す
ることもある脂肪族炭化水素を間に挾んでホスホン酸結
合させたのち、この官能基Ｘに酵素標識化合物を反応さ
せる。この際用いる官能基Ｘとしては保護基を有するこ
ともあるアミノ基が用いられる。この官能基Ｘはポリヌ
クレオチド合成の際副反応を起こすことが考えられるの
で、トリフルオロアセチル基、ベンゾイル基などの保護
基により保護することが望ましく、アンモノリシス、酸
処理などの最終脱保護工程でヌクレオチドの塩基部や水
酸基の保護基と同時に除去さるものであればよい。

本発明で用いられる酵素標識化合物とは、(a)一端がホ
スホン酸結合のアミノ基と特異的な共有結合性をもつ官
能基、すなわちマレイミド基やジチオ基であり、もう一
端が酵素中のアミノ基、メルカプト基と反応する官能基
をもつ架橋剤に、(b)アミノ基、メルカプト基を有する
酵素、例えばガラクトシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ルシ
フェラーゼ、カタラーゼなどよりなる酵素を結合したも
のであり、前記(a)の架橋剤と(b)の酵素との結合により
得られた代表的な酵素標識化合物としては などが例示されるが、酵素と架橋剤の組み合せはこれら
に限定されるものではない。

本発明において用いられるホスホン酸の合成はHouben W
eyls Methoden der Organischen Chemie,Ｅ．Ｍller,
Editor,Vol.XII/1,2,Georg Thieme Verlag,Stuttgart.
（１９６３〜６４年）に記載されているが、亜リン酸シ
リルエステルと臭化アルキルのアーブゾフ（Arbuzov）
反応を利用する合成法〔有機合成化学協会誌、第３９
巻、第９１８頁（１９８１年）〕は副反応も少なく収率
も良好である。

本発明におけるポリヌクレオチドは、ヌクレオシド（反
応式〔１〕の化合物）と官能基Ｘを有するホスホン酸
（反応式〔１〕の化合物）を、縮合剤例えばジシクロ
ヘキシルカルボジイミド、アルキルベンゼンスルホニル
クロリド、アルキルベンゼンスルホニルアゾール、アル
キルベンゼンスルホニルニトロアゾールなどの存在下に
反応させることによりホスホン酸化された単量体（反応
式〔１〕の化合物）が得られる。化合物で示される
単量体は5′−水酸基が保護されていないヌクレオシド
（反応式〔１〕の化合物）と縮合剤の存在下に縮合さ
せて二量体（反応式〔１〕の化合物）とする。化合物
においてＲ³はＸ，Ｒ¹，Ｒ²の保護基とは別異であり
選択的に除去できる保護基であることが望ましいが、Ｒ
¹の保護基と同一の条件で除去できる保護基でもよく、
また場合によっては保護基を有するリン酸基でもよい。
化合物で示される二量体のホスホン酸リン原子は結合
している基が全て異なるためキラリティーを有するよう
になり、絶対表示法でＲ体とＳ体の２個のジアステレオ
マーの混合物となるが、この２個のジアステレオマーは
シリカゲルクロマトグラフィーで分離し、立体化学的に
単一の二量体とすることができる。化合物で示される
二量体のＲ³が保護基を有するリン酸基である場合は、
キラリティーを有するリン原子が２個となり、４個のジ
アステレオマーが生成して立体異性体の分離が困難とな
るので、Ｒ³は3′−末端水酸基が遊離の二量体（反応式
〔１〕の化合物）に誘導できる保護基、すなわちＸ，
Ｒ¹，Ｒ²の保護基とは別異であり選択的に除去が可能で
あるか、またはＲ¹の保護基と同一の条件で除去できる
保護基であることが望ましい。後者の場合は３′，５′
−両末端水酸基を遊離の形にしたのち、5′−末端水酸
基のみを再保護することにより化合物で示される二量
体とする。化合物は3′−末端水酸基をリン酸化する
ことにより二量体（反応式〔１〕の化合物）とする。
化合物はＲ³が保護基を有するリン酸基である化合物
からも誘導でき、この際化合物の3′−末端リン酸
基のキラリティーが消失してジアステレオマーが２個と
なるので、シリカゲルあるいは逆相シリカゲルクロマト
グラフィーによりＲ体とＳ体に分離できる。

（反応式〔Ｉ〕において、Ｂは保護基を有することもあ
る塩基残基を、Ｒ¹は水素原子またはトリチル基、モノ
メトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基などの保護
基を、Ｒ²は水素原子または保護基を有することもある
水酸基を、Ｒ³はＸ，Ｒ¹およびＲ²の保護基とは別異で
あり選択的に除去できる保護基、またはＲ¹の保護基と
同じ条件で除去できる保護基、または保護基を有するリ
ン酸基を、Ｒ⁴はリン酸保護基を示し、ＲおよびＸは前
記と同一である。） 次に、化合物で示される単量体のホスホン酸をリン酸
保護基Ｒ⁵で保護した単量体（反応式〔II〕の化合物
）としたのち、酸性条件下で化合物のＲ¹の保護基
を除去し、5′−水酸基が遊離である単量体（反応式〔I
I〕の化合物）に誘導し、次いで化合物で示される
単量体と化合物で示される単量体を縮合剤の存在下に
反応させて二量体（反応式〔II〕の化合物 ）とする。なお、この化合物 は化合物で示される二量体のホスホン酸化によっても
得られる。

反応式〔II〕 （反応式〔II〕において、Ｒ⁵はＲ⁴と同一または異なる
リン酸保護基を示し、Ｂ，Ｘ，Ｒ，Ｒ¹およびＲ²は前記
と同一である。） ＤＮＡおよびＲＮＡはそれぞれ４種類のヌクレオシドか
らなり、化合物、化合物または化合物 で示される１６種類の二量体を予め調製しておくことに
より、いかなる塩基配列のポリヌクレオチドの合成も可
能である。これらの二量体は固相あるいは液相法〔Nucl
eic Acids Research、第１１巻、第５１８９頁および第
６２２５頁（１９８３年）、Biochemistry、第２０巻、
第１８７４頁（１９８１年）〕で希望する塩基配列のポ
リヌクレオチドの合成に用いられ、また化合物は変型
ホスファイト法〔Tetrahedron Letters、第２４巻、第
１０１９頁（１９８３年）〕を利用することによって
3′−末端水酸基が遊離のままでポリヌクレオチドの合
成に用いることができる。ポリヌクレオチド中に含まれ
るホスホン酸結合の個数は、ポリヌクレオチドの鎖長、
検出感度、ハイブリッド条件等に合わせて自由に選択す
ることができる。化合物で示される単量体または化合
物 で示される二量体を原料として用いた場合は、立体化学
の統一をはかることは困難であるが、全てのリン酸結合
をホスホン酸結合に代えたポリヌクレオチドを得ること
ができる。しかし精製の容易さを考慮すると化合物 を使うほうが好ましい。標的遺伝子とのハイブリッド形
成に影響を及ぼさない限りリン原子のキラリティーは統
一されなくともよいが、立体化学的に統一されたポリヌ
クレオチドの合成はＲ体とＳ体に分離した化合物ある
いは化合物で示される二量体のいずれか一方のジアス
テレオマーを原料として用いることにより達成できる。
二量体−二量体間のリン酸結合は完全脱保護後ジエステ
ルとなり、そのキラリティーが消失するのでこの問題は
解消される。この場合ホスホン酸結合は最大限１個置き
に導入されることになる〔Journal of Biological Chem
istry、第２５５巻、第９６５９頁（１０８０年）、Bio
chemistry、第２１巻、第２５０７頁（１９８２
年）〕。

また、反応式〔Ｉ〕および反応式〔II〕で示された二量
体あるいはポリヌクレオチドは、反応式〔III〕−(1)の
如きホスファイト中間体からのアーブゾフ反応を経る方
法、あるいは反応式〔III〕−(2)の如きアルキルジクロ
ロホスホンをホスホン酸化剤としてホスファイト法の手
法を利用する方法でも合成可能であるが、前者はアーブ
ゾフ反応の際分解する可能性があるので、後者の方が望
ましい。

反応式〔III〕 （反応式〔III〕において、Ｌは脱離基を、Ｙはハロゲ
ン原子を、Ｚはハロゲン原子、二級アミンまたはアゾー
ル類を示し、Ｂ，Ｘ，Ｒ，Ｒ¹およびＲ²は前記と同一で
ある。） 上記の方法により得られたホスホン酸結合を含有し特定
の塩基配列を有するポリヌクレオチドの全ての保護基を
通常の脱保護操作により除去し精製したのち、標的遺伝
子とのハイブリッド形成の前あるいは後に、ポリヌクレ
オチド中のホスホン酸結合の官能基Ｘと特異的に反応す
る共有結合性酵素標識化合物を反応させて酵素標識化す
る。この反応はきわめて容易に進行し、ポリヌクレオチ
ドと酵素標識化合物を室温または室温以下において混
合、攪拌することにより酵素標識化は容易に完了する。

なお、本発明におけるポリヌクレオチドとは、少なくと
も１個のホスホン酸結合を有する２個以上の単量体より
なり、ポリヌクレオチドの鎖長やその塩基配列は限定さ
れることなく、目的に応じて自由に選択できる。

実施例１ 〔アルカリホスファターゼ標識化合物の調製〕 アルカリホスファターゼ１０mgを0.1molリン酸ナトリウ
ム緩衝液(pH7.0)1ｍに溶解し、これにジオキサン0.1
ｍに溶解したＮ−（４−カルボキシシクロヘキシルメ
チル）マレイミドのＮ−ヒドロキシサクシンイミドエス
テル1.5mgを、５分間隔で５回に分けて加え、３０℃で
反応させる。反応液をセファデックスＧ−２５カラムを
用い、１mmolエチレンジアミン四酢酸を含む0.1molリン
酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)で溶出したアルカリホスフ
ァターゼ活性部分を冷時濃縮して、アルカリホスファタ
ーゼ標識化合物を得る。

〔１０量体の合成〕 臭化２−Ｎ−ベンゾイルエチルとトリス（トリメチルシ
リル）ホスファイトのアーブゾフ反応により得られる２
−Ｎ−ベンゾイルエチルホスホン酸ピリジン塩４０mmol
および5′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン２０mmol
を、ダウエックスピリジニウムレジン0.5gとジシクロヘ
キシルカルボジイミド２００mmolの存在下に、１００ｍ
のピリジン中で３７℃、３日間反応させたのち、シア
ノエノール１００ｍを加え、さらに２日間反応する。
反応終了後、含水ピリジン２００ｍを加え、ジシクロ
ヘキシルウレアを瀘別し、瀘液を濃縮する。残渣を250
ｍのクロロホルムに溶解し、シリカゲルクロマト（溶
出液：メタノール−クロロホルム）で精製したのち、ヘ
キサン中に滴下して粉末化する。次いでアセトニトリル
中でトリエチルアミンで処理してシアノエチル基を除去
し、5′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジル−3′−Ｏ−
（２−Ｎ−ベンゾイルエチル）ホスホネートトリエチル
アンモニウム塩を得る。

次に、コハク酸を介してチミジンを担持（１００μmol
以下／ｇ・樹脂）したポリスチレン樹脂（１％クロスリ
ンクド）１００mgを用い、5′−Ｏ−ジメトキシトリチ
ルチミジル−3′−Ｏ−（２−Ｎ−ベンゾイルエチル）
ホスホネートトリエチルアンモニウム塩を、Nucleic Ac
ids Research、第１１巻、第６２２５頁（１９８３年）
に記載された方法に従い順次に９回縮合させて１０量体
を合成した。ポリスチレン樹脂を１０ｍのエチレンジ
アミン−エタノール（１：１）と１０時間振とう後、瀘
別し、瀘液を濃縮して逆相（Ｃ₁₈）シリカゲルクロマト
（水−アセトニトリル直線濃度勾配）で精製し、８０％
酢酸で処理して5′−末端の保護基を除去したのち、一
部を再び逆相（Ｃ₁₈）シリカゲルクロマトで精製し、ア
ミノエチルホスホン酸結合をもつ１０量体１０OD（２６
０ｎｍ）を得た。

〔１０量体のアルカリホスファターゼ標識化〕 この１０量体５ODを0.5molホウ酸ナトリウム緩衝液（pH
8.5)3.6ｍおよびアセトニトリル1.0ｍに溶解し、こ
れに前記のアルカリホスファターゼ標識化合物を混合し
て、４℃で５時間反応させる。反応液をセファローズ６
Ｂカラムを用い、0.1mmol塩化マグネシウム、0.1mol塩
化ナトリウム、0.1molリン酸緩衝液（pH7.0）で溶出し
て、核酸部分の紫外吸収とアルカリホスファターゼ活性
を有するフラクションを得た。

実施例２ (1)二量体アミダイトの調整 ２−（Ｎ−トリフルオロアセチルアミド）エチルホスホ
ン酸２４mmolおよび5′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミ
ジン１mmolとをメシチレンスルホニル−３−ニトロトリ
アゾール３６mmolの存在下にピリジン中で室温、１時間
反応したのち、トリエチルアミンで処理して、5′−Ｏ
−ジメトキシトリチルチミジン−3′−Ｏ−〔２−（Ｎ
−トリフルオロアセチルアミド）〕エチルホスホネート
トリエチルアンモニウム塩６mmolを得た。次に、この
5′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン−3′−Ｏ−〔２
−（Ｎ−トリフルオロアセチルアミド）〕エチルホスホ
ネートトリエチルアンモニウム塩４mmolと3′−Ｏ−ア
セチルチミジン６mmolとをメシチレンスルホニル−３−
ニトロトリアゾール１６mmolの存在下にピリジン中で室
温、１時間脱水縮合反応を行い、つぎの式で示される、
5′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン−3′−Ｏ−〔２
−（Ｎ−トリフルオロアセチルアミド）〕エチルホスホ
ネートトリエチルアンモニウム塩と3′−Ｏ−アセチン
チミジンとの3′→5′縮合生成物（以下ＴＴ二量体とい
う）とした。

次にこのＴＴ二量体を０．１４規定ＮａＯＨにより加水
分解しつぎの式で示される3′ヒドロキシＴＴ二量体に
した。

次に逆相（Ｃ１８）シリカゲルカラムクロマトグラフィ
ー（溶出液；アセトニトリル−水）により異性体を分離
し、アセトニトリル留去後クロロホルムにて抽出しヘキ
サン中に滴下して粉末化した（収量１．０５ｇ、収率２
１．２％）。粉末化した3′ヒドロキシＴＴ二量体に
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホンアミダイトを無
水アセトニトリル中、室温にて３０分間反応させつぎの
式で示すＴＴ二量体アミダイトを得た。

（２）単量体アミダイトの調整 5′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン１８．４mmolに
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホンアミダイト２
０．２mmolを無水アセトニトリル中で室温、３０分間反
応させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出
液；ジクロロメタン）により精製し、5′−Ｏ−ジメト
キシトリチルチミジンアミダイト（以下、Ｔアミダイト
という）５．５mmolを得た。

同様の方法によりＮ⁶−ベンゾイル−5′−Ｏ−ジメトキ
シトリチル−2′−デオキシアデノシン、Ｎ²−イソブチ
リル−5′−Ｏ−ジメトキシトリチル−2′−デオキシグ
アノシンおよびＮ⁴−ベンゾイル−5′−Ｏ−ジメトキシ
トリチル−2′−デオキシシチジンをそれぞれアミダイ
ト化を行い、Ｎ⁶−ベンゾイル−5′−Ｏ−ジメトキシト
リチル−2′−デオキシアデノシンアミダイト（以下、
Ａアミダイトという）、Ｎ²−イソブチリル−5′−Ｏ−
ジメトキシトリチル−2′−デオキシグアノシンアミダ
イト（以下、Ｇアミダイトという）およびＮ⁴−ベンゾ
イル−5′−Ｏ−ジメトキシトリチル−2′−デオキシシ
チジン（以下、Ｃアミダイトという）を得た。

（３）１７量体の合成 上記(1)および(2)で得たＴＴ二量体アミダイト、Ａアミ
ダイト、Ｇアミダイト、ＣアミダイトおよびＴアミダイ
トを用い、アプライド・バイオシステムズ社製の自動Ｄ
ＮＡ合成機により次式の塩基配列であるオリゴマー（１
７量体）を合成した。なお、この１７量体は部分にア
ミノエチルホスホン酸結合を有する。^５′ ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ^３′ （式中、Ａ，Ｇ，ＣおよびＴは、オリゴマーを構成する
単位単量体をその塩基残基により示したもので、Ａはア
デニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであ
り、保護基を有することもある。） 合成終了した１７量体は２５％アンモニア水、室温、１
時間の処理により担体より切り出し、６５℃にて処理す
ることによりジメトキシトリチル基以外の保護基を除い
た。脱保護した１７量体は逆相（Ｃ１８）シリカゲルカ
ラムクロマトグラフィー（溶出液；アセトニトリル−ト
リエチルアミン・酢酸緩衝液）にて精製し、７０％酢
酸、室温、１時間の処理によりジメトキシトリチル基を
除いた。ジメトキシトリチル基を除いたオリゴマーは再
度、逆相（Ｃ１８）シリカゲルカラムクロマトグラフィ
ー（溶出液；アセトニトリル−トリエチルアミン・酢酸
緩衝液）にて精製した（収量；４ＯＤ）。

（４）酵素標識化合物の調製 アルカリフォスファターゼ０．６mgを０．２molリン酸
緩衝液０．１ｍに溶解し、０〜４℃に冷却した。これ
にジスクシンイミジルスベラート２mgを加え、同温度で
１０分間反応した。この反応液を、セファデックスＧ−
５０カラムを用い手、水で溶出した最初の７〜１０ｍ
を分散した。主留分を限外ろ過（分画分子量３万の膜使
用）で約０．１ｍまで濃縮して、アルカリフォスファ
ターゼ標識化合物を得た。

（５）１７量体のアルカリフォスファターゼ標識化 上記（３）で得た１７量体１ＯＤを０．１mol炭酸緩衝
液（pH８．５）に溶解し、これに上記（４）で得たアル
カリフォスファターゼ標識化合物０．１ｍを加え、０
〜４℃で一晩反応した。この反応液を実施例１と同様の
方法で精製し、核酸部分の紫外吸収とアルカリフォスフ
ァターゼ活性を有するフランクションを得た。得られた
目的物の収量は蛋白換算で０．１mg、収率はアルカリフ
ォスファターゼを基準として１６％であった。

ここで得られた反応液を下記の分析条件で液体クロマト
グラフ法により分析した結果を図２に示す。

図中、〔Ａ２〕はアミノエチルホスホン酸結合を有する
１７量体の存在を示すピークであり、〔Ｂ〕は酵素標識
化合物の存在を示すピークである。〔Ｃ〕は前記反応原
料のいずれにも相当しない成分の存在を示すものであ
り、これはアミノエチルホスホン酸結合を有する１７量
体と酵素標識化合物との反応によって生じた生成物と推
定される。

分析条件 カラム：ＤＥＡＲ−５ＰＷ ７．５mm×７０mm 溶離液：Ａ液 ２０ｍＭのトリス−塩酸pH８ Ｂ液 Ａ液＋１ＭのＮａＣｌ Ｂ液 ０％→１００％／３０ｍｉｎ 流速 ：１ｍ／ｍｉｎ 検出器：ＵＶ ２８０ｎｍ 実施例３ 実施例２の（３）で合成した１７量体と同様の配列をも
ち、かつアミノエチルホスホン酸結合を有しない天然型
である１７量体を合成し、実施例２の（５）と同様の処
理により、アルカリフォスファターゼ標識化合物との反
応を行った。反応終了後、反応液を液体クロマトグラフ
法により分析した結果を図１に示す。分析条件は前述の
とおりである。

その結果、アルカリフォスファターゼ標識化合物と天然
型である１７量体との混合系においては反応生成物は認
められず、原料を回収したのみであった。

これに対して、アルカリフォスファターゼ標識化合物と
アミノエチルホスホン酸結合を有する１７量体との反応
系においては明らかに反応生成物が認められた。

この結果から、アルカリフォスファターゼ標識化合物
は、アミノエチルホスホン酸結合のアミノ基に共有結合
していることが確認された。

【図面の簡単な説明】

図１は、実施例３で得たアミノエチルホスホン酸結合を
有しない天然型の１７量体［Ａ１］と酵素標識化合物
［Ｂ］との反応液を液体クロマトグラフ法で分析した結
果を示す。 図２は、実施例２の（５）で得たアミノエチルホスホン
酸結合を有する１７量体［Ａ２］と酵素標識化合物
［Ｂ］との反応液を液体クロマトグラフ法で分析して目
的物［Ｃ］の生成を確認した結果を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ポリヌクレオチドのリン酸結合の少なくと
   も１個以上が、官能基を有する式〔Ｉ〕 （式中、Ｒは炭素数１ないし２０の分岐鎖を有すること
   もある脂肪族炭化水素を、Ｘは保護基を有することもあ
   るアミノ基よりなる官能基を示す） で表わされるホスホン酸結合で置換されており、前記ホ
   スホン酸結合の官能基Ｘに架橋剤と結合した酵素が共有
   結合していることを特徴とする酵素標識化されたポリヌ
   クレオチド化合物。
2. 【請求項２】ポリヌクレオチドのリン酸結合の少なくと
   も１個以上が、官能基を有する式〔Ｉ〕 （式中、Ｒは炭素数１ないし２０の分岐鎖を有すること
   もある脂肪族炭化水素を、Ｘは保護基を有することもあ
   るアミノ基よりなる官能基を示す） で表わされるホスホン酸結合で置換されているポリヌク
   レオチドに、前記ホスホン酸結合の官能基Ｘと共有結合
   しうる架橋剤と結合した酵素を反応させることを特徴と
   する酵素標識化されたポリヌクレオチド化合物の製法。