JPS6157595A - ポリデオキシリボヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチドの酵素標識化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はリン酸結合の少なくとも１個以上がチオリン酸
結合であるポリデオキシリボヌクレオチドまたはポリリ
ボヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチドと総称する）
のチオリン酸結合のチオール基に共有結合性酵素標識化
合物を反応させることからなるポリヌクレオチドの酵素
標識化法に関するものであり、本発明により得られる酵
素標識化された特定の塩基配列を有するポリヌクレオチ
ドは標的遺伝子の同定および抽出に使用され、遺伝子工
学、臨床診断および食品等の分野で幅広く利用式れ得る
ものでおる。

（発明の背景） 近年遺伝子工学の研究が盛んになるに伴い、有用物質の
生産に必要な遺伝子の検出に、特定の塩基配列を有する
ポリヌクレオチドが用いられるようになってきている。

例えば臨床診断の分野においては現在免疫学的方法およ
び生物学的方法が用いられているが、前者は検査時間が
一般に数分と短いものの交差反応や干渉作用のためにし
ばしば不明瞭な結果を与え、また後者は培養に長時間を
要するなどの欠点を有する。

これに対して、遺伝子を検出することで疾患の診断を行
なうポリヌクレオチド法は、検査時間は一般に数時間を
要するが、検出感度ばかりでなく特異性も非常に高く、
また誤差がきわめて小さいという利点を有し、感染症の
みならず免疫学的方法では検出できない潜在性ウィルス
も検出可能で６るため、これに適したポリヌクレオチド
の開発が要望されている。

（従来の技術） ポリヌクレオチド管用い、交雑法によって標的遺伝子を
検出する際は、ポリヌクレオチドを標識化する必要があ
る。標識化は放射性同位元素を用いる方法と光標識法に
大別される。現在放射性同位元素ｓｔｐを用いる方法が
最も利用されており、特開昭５８−１７０４９６号公報
には人Ｔ　Ｐ　（７−−”Ｐ　）とキナーゼでポリヌク
レオチドの５′−末漏位にｌｔｐで標識したリン識基を
導入し　ｍａｐから放射されるβ線でフィルムを感光さ
せ、その黒斑点によって標的遺伝子の存在を検出する方
法が開示されている。放射性同位元素１による標識化は
感度の点で優れている反面、使用に際して（１）取り扱
い上熟練が必要でおる、０１）法規上の規制が厳しく、
特別の施設および測定機器が必要でおり、またその限定
された場所でしか取り扱えない、（ｆｉｌ）健康上の問
題がある、（１ｖ）使用後の廃棄に問題がある、（い半
減期に合わせて予約購入するので実験の期日がそれによ
り制約嘔れる、などの難点がある。これに対して放射性
同位元素を用いない標識化法として光標識化法が提案さ
れ、特開昭５８−２３７９５号公報および特開昭５８−
４００９９号公報には化学発光、生体発光、螢光を利用
する方法が開示されている。しかし光標識法としては、
チミジンあるいはクリジンアナローブとして七のＣ−５
位にアミド結合を介してビオチンを付したジ−０−トリ
ホスフェートを酵素的ニックトランスレーションの手法
でポリヌクレオチドに組み込んで標識化し、標的遺伝子
を検出する方法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　　ｏｆ　　
Ｎａｔｌｏｎａｌ　　Ａｃａｄｅｍｙ　　ｏｆ　　８ｃ
ｉｅｎｃａ　　　　’ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　５
ｔａｔｅ　ｏｆ　Ａｆｆｌｅｒｌｃａ、　＠　８０巻、
第４０４５頁（１９８３年）〕が実用化逼れているのみ
である。

（発明が解決しようとする問題点） 核酸は核酸塩基、糖、リン酸の３つの構成要素から構成
され、それぞれの構成要素を光標識化することが可能で
あるが、その際ポリヌクレオチドが標的遺伝子とハイブ
リットする性質を損うことのないよう標識化合物を導入
する必要がある。しかし、核酸塩基部を光標識化する場
合、ピＩ）　ミジン系塩基ではＣ−５位に標識化合物を
導入することが可能であるが、プリン系塩基については
立体化学的に標識化合物を導入可能なのはＣ−８位とＮ
−７位のみであり、Ｃ−８位に導入すると塩基と糖がＳ
ｙｎ型配座をとるために一般的には二重ら線が右巻きで
ある場合はハイゾリット能を失い、またＮ−７位に導入
する場合は窒素が四級となり糖と塩基部のグリコシド結
合が切れる、いわゆる説プリッ反応が生起しやすくなる
ためプリン系塩基を光標識化することはきわめて困難で
ある。従って核酸塩基部の光標識化はぎ、リミジン系塩
基の場合のみ有効であり、ポリヌクレオチドの塩基配列
がプリン系塩基のまの場合は光標識化ができ難いという
不都合を生じる。次に、糖部を光標識化する場合、Ｉリ
デオキシリ〆ヌクレオチドでは両末端の水酸基しか利用
できず、４すＩ７　／ヌクレオチドでは理論的にはグー
位水酸基も利用可能でるるか、この位置に光標識化合物
の如き大きさの分子を導入するとノ１イゾリット形成に
影響を及ぼすため、ボーリデオキシリゼヌクレオテドと
同様に両末端の水酸基しか利用できず検出感度が低下す
る。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは光標識法にエリ標識化したポリヌクレオチ
ドの検出感度を向上式せるため種々検討を加えた結果、
核酸構成要素のリン酸部に光標識化合物を導入すること
により、ポリヌクレオチドの任意の位置に任意の数の光
標識化合物の導入が可能になることを見い出すと共に、
リン酸結合の代わシにチオリン酸結合を選択し、このチ
オリン酸結合のチオール基と光標識化合物を反応させて
チオリン酸結合を光標識化することにより、リン酸結合
を光標識化するときに生ずる（イ）合成法によるポリヌ
クレオチド合成後の脱保護工程での標識化合物の脱離あ
るいはインターヌクレオチド結合の切断、幹）リン原子
がキラリティーを有することによる得られた光標識ポリ
ヌクレオチドのリン原子の立体化学の不統一、という問
題も解決し、また、“光標識化合物としてチオール基と
特異的に反応する共有結合性酵素標識化合物を用いるこ
とにより所期の目的を達成することを見い出し本発明を
完成したものである。

（ポリヌクレオチドの酵素標識化） 本発明のポリヌクレオチドの酵素標識化は、ポリヌクレ
オチドのリン酸結合に代えてチオリン酸結合とし、この
チオリン酸結合のチオール基と特異的化反応する共有結
合性酵素標識化合物を反応させることにより酵素標識化
するものである。

本発明におけるチオリン酸結合を有するポリヌクレオチ
ドは有機合成的方法あるいは酵素的方法によって合成さ
れ得る。有機合成的方法では、ポリヌクレオチドの両末
端水駿基にチオリン酸基を導入するのが最も容易であり
、チオリン酸、チオホスホリルクロリドあるいはその誘
導体を公知の条件下に反応嘔せればよい。しかし更に検
出感度を向上させるためには、両末端にチオリン酸基を
導入し酵素標識化するのみでなく、インターヌクレオチ
ド結合部にチオリン酸基を導入し酵素標識化するのが望
ましい。なお、この障碍られる酵素標識化てれたポリヌ
クレオチドが、立体化学的に標的遺伝子とノ・イブリッ
ト可能であることが必要である。有機合成的にインター
ヌクレオチド結合部にチオリン酸基を導入するには、ホ
スホトリエステル法〔Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔ
ｔｅｒｓ　、第１１５７頁（１９６７年〕、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、第２巻、第１頁
（１９７５年）〕とホスファイト法（：　Ｔｅｔｒａ−
ｈａｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　、　第３８３５頁（１
０７８年）および第２１巻、第１１２１頁（１９８０年
）および第２３巻、第４２８９頁（１９８２年）、日本
化学会４９春季年会ａｓｓ３）が利用され得るが、後者
の方が高い収率を与える。たとえば、ヌクレオシド（反
応式ＣＩ）の化合物■）に亜リン酸誘導体（反応式〔■
〕の化合物■）を反応させて単量体（反応式〔■〕の化
合物■）とし、次いで化合物■とダー水酸基が保護され
ていないヌクレオシド（反応式（１）の化合物■）を縮
合させて二量体（反応式ＣＩ）の化合物■）とする。こ
の際３′−水酸基の保護基であるＲ４はＲ１，Ｒ”、　
　Ｒ”の保護基とは別異であす選択的に除去できる保護
基であることが望ましいが、Ｒ１の保護基と同一の条件
で除去できる保護基でもよく、また場合によっては保護
基を有するリン酸基でもよい。次に化合物■で示される
二量体にヨウ素−水で酸化する代わやに硫黄を反応させ
て、イノターヌクレオチド結合としてチオリン識結合を
有する二量体（反応式ＣＩ’ｌの化合物Ｏ）とする。化
合物■で水式れる二量体のリン原子は結合している基が
全て異なるためキラリティーを有するようになり、絶対
表示法で８体と８体の２個のジアステレオマーの混合物
となるが、この２個のジアステレオマーはシリカゲルク
ロｉトゲラフイーで分離し、立体化学的に単一の二量体
とすることができる。また几４が保護基を有するリーン
酸基の場合はジエステルの形に誘導したのち、液相ある
いは固相法によるポリヌクレオチドの合成に用いられる
が、化合物■で示される二量体ではキラリティーを有す
るリン原子が２個となり、４個のジアステレオマーが生
成し立体異性体の分離が困難となるので、Ｒ４は３′−
末端水酸基が遊離の二量体（反応式ＣＩ）の化合物■）
に誘導できる保護基、すなわちＲ＋’、ｗ、Ｒ”の保護
基とは別異であり選択的に除去できるか、または部の保
護基と同一の条件で除去できる保護基であることが望ま
しい。後者の場合は３′、ダー両末端水酸基を遊離の形
にしたのち、５′−末端水酸基のみを再保護することに
より化合物■で示てれる二量体とする。

（以下余白） 反応式ＣＩ） ■　　　　　　　　　　　■ ■ （反応式ＣＩ）において、「は保護基を有することもあ
る塩基残基金、Ｘはハロゲン原子または二級アミン基を
、部は水素原子またはモノメトキシトリチル基、ジメト
キシ）　ＩＪアシル基どの保護基を、謬は水素原子また
は保護基を有することもある水酸基を　Ｂｉは水素原子
またはメチル基、シアノエチル基、トリクロロエチル基
、トリクロロジメチルエチル基などの保護基を、Ｒ４は
水素原子またはモノメトキシトリチル基、ジメトキシト
リチル基、アシル基、ターシャリ−ジチル−ジメチルシ
リル基などのＷやＢｓの保護基と別異で６１３選択的に
除去できる保護Ｍまたは保！ｉ基を有するリン酸基を示
す。） ＤＮＡおよび几ＮＡはそれぞれ４８１［類のヌクレオシ
ドＺ）−らなり、化合物■で示される１６種類の二量体
を予め調製しておくことにより、いかなる塩基配列のポ
リヌクレオチドの合成も可能である。化合物■は３′−
末端水酸基をリン酸化または亜リン酸化したのち、固相
あるいは液相トリエステル法で希望する塩基配列のポリ
ヌクレオチド合成化用いられるが、変型ホスファイト法
（Ｔｅｔｒａｈａｄｒｏｎ　Ｌａｔｔｅｒｓ　、第２４
巻、第１０１９頁（１９８３年）〕を利用すれば、化合
物■の３′−末端水酸基を予めリン酸化または亜リン酸
化することなくポリヌクレオチドの合成に用いることが
できる。二量体−二量体間のリン酸結合は完全脱保護後
キラリティーをもたず、従って化合物■で示される８体
または８体いずれか一方のジアステレオマー二量体を用
いて合成、脱保護、精製されたインターヌクレオチド結
合に部分的にチオリン酸結合を含むポリヌクレオチドは
、立体化学的に単一である。この場合チオリン酸結合は
最大限１個置きに導入される。ただし、標的遺伝子との
ノ・イゾリット形成に影響を及ぼさない限り、リン原子
のキラリティーは統一てれていなくてもよい。ｉた硫黄
の導入は縮合毎でもよいし、所定の長さのポリヌクレオ
チドを合成したあと一度に行なってもよい。ポリヌクレ
オチドに含まれるチオリン酸結合の個数は、ポリヌクレ
オチドの鎖長、検出感度、ハイブリット県外等に合わせ
て自由に選択することができる。このほか、ポリヌクレ
オチドの両末端の酵素標識化法として、一般的にリン酸
エステル類は）！Ｊエステルカラジエステルになるとそ
れ以上加水分解を受けにくくなること、従ってポリヌク
レオチドをトリエステル法で合成した場合に、最終工程
の脱保護反応条件下でもリン酸ジエステルの段階で加水
分解がとどまり、さらｔζ反応が進んでインターヌクレ
オチド結合が切断するのは稀であることを利用して一般
式［１１１のようにポリヌクレオチドの両末端リン酸に
ジエステルの形で醪素ｓＲ化合物を導入することも可能
である。

一般式（［） （一般式（Ｉ）において、Ｂは塩基残基管、Ｒ″は水素
原子または水酸基を、Ｙは酵素標識化合物を、ｎは任意
の整数を示す。）また、チオリン酸結合を有するポリヌ
クレオチドは、一般式ＣＩ）で示されるヌクレオシドー
ダー０−（１−チオトリホスフェイト）ｔ−基質として
酵素法によっても合成できる。

一般式（１） （一般式（１）において、ＢおよびＲ１１は前記と同一
である。） このヌクレオシド−５’−０−（１−チオトリホスフェ
イト）は、α位のリン原子に関して絶対表示法で８体と
８体のジアステレオマーの混合物でもよ（、ＤＮＡおよ
びＲＮ人ポリメ２−ゼは混合物のうち８体を基質として
立体反転を伴って取り込み、リン原子に関してＲＫｔ−
もつ立体化学的に単一のポリヌクレオチドを与える。

導入されるチオリン酸結合の数は、４種類のヌクレオシ
ドトリホスフェイトのうちどれをチオトリホスフェイト
に置き換えるかで自由に選択できるが、４種類のヌクレ
オシドーダー０−（１−チオトリホスフェイト）ｔ−反
応液中に加えることで、全てのリン酸結合をチオリン酸
結合に代え、しかもリン原子のキラリティーについて統
一されたポリヌクレオチドを得ることができる。このほ
か一般式ＣＩ）の基質を用いニックトランスレーション
の手法を用いてもチオリン酸結合の導入は可能であり、
また３／、　　ＳＦ−両末端水酸基のチオリン酸化はア
デノシン−５′−〇−（３−チオホス７エイト）とキナ
ーゼ、チオリン酸とりガーゼを用いてそれぞれ可能であ
る。

本発明で用いられる酵素標識化合物とは、一端がチオリ
ン酸結合のチオール基と特異的な共有結合性をもつ官能
基、すなわちマレイミド基やジテオ基でめり、もう一端
が酵素中のアミン基、メルカプト基と反応する官能基を
もつ架橋剤と、アミノ基、メルカプト基を有する酵素、
例えばガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グ
ルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフエラ
ーゼ、カタラーゼなどよりなるもので、代表的な酵素標
識化合物としてはなどが例示されるが、酵素と架橋剤の
組合せはこれらに限定されるものではない。

チオリン酸結合のチオール基と共有結合性酵素標識化合
物の反応はきわめて容易に進行し、−リヌクレオチドと
酵素標識化合物を室温または室温以下において混合、攪
拌することにより薄紫標識化は容易に完了する。

なお、本発明におけるポリヌクレオチドとは、少なくと
も１個のチオリン酸結合を有する２個以上の単量体より
なり、ポリヌクレオチドの鎖長やその塩基配列は限定さ
れることなく、目的に応じて自由に選択できる。

実施例１ 〔ガラクトシダーゼ標識化合物の調製〕Ｑ、　ｌ　ｍｏ
ｌリン酸ナトリウム―衝液（ｐＨ６，０）０．２−に溶
解したガラクトシダーゼ１　ｍｇと、ジメチルホルムア
ミド０．２　ｔＪ　、！：　０．１　ｍｏｌ　＋７７酸
緩衝液（１）Ｈ６，ｓ　）　０．２ゴに溶解したＮ、　
Ｎ−〇−７二二レンジマレイミド０．１　ｍｇ　ｆ混合
し、３０℃で２００分間反応せる。反応液をセファデッ
クスＧ−２５力ジムを用い、Ｑ、　ｌ　ｍｏｌリン酸ナ
トナトリウム緩衝液ｐＨ６，０）で溶出したガラクトシ
ダーゼ活性部分を冷時濃縮して、ガラクトシダーゼ標識
化合物を得る。

〔二量体のガラクトシダーゼ標識化〕

チミジル（３′、ダ）−チミジルホスホロチオエイ）　
０．１　ｍｇをＯ，ｌ−の水に溶解し、これにガラクト
シダーゼ標識化合物を混合したのち０．４ｍｏｌリン敗
緩衝液（ｐＨ６，８５）を加え、４℃で５時間反応させ
る。反応液をセファローズ６Ｂカラムを用い、０．１ｍ
ｍｏｌ塩化マグネシウム、０、１　ｍｏｌ塩化ナトリウ
ム、Ｑ、ｌ　ｍｏｌリン酸ナトナトリウム緩衝液ｐＨ７
，０）で溶出して、核酸部分の紫外吸収とガラクトシダ
ーゼ活性を有するフラクションを得た。

実施例２ 〔アルカリホスファターゼ標識化合物の調製〕アルカリ
ホスファターゼ１０　ｍｇを０．１ｍｏｌリン酸ナトジ
ナトリウム緩衝液Ｈ７，０）　１−に溶解し、これにジ
オキサン０，１ｄに溶解したＮ−（４−力／Ｉ／ホキジ
シクロヘキシルメチル）マレイミドのＮ−ヒドロキシサ
クシンイミドエステル１．５　ｍｇを５分間隔で５回に
分けて加え、３０″Ｃで反応させる。。反応液をセファ
デックスＧ−２５カラムを用い、１ｍｍｏｌエチレンジ
アミン四酢酸を含む０．１ｍｏｌリン酸ナトジナトリウ
ム緩衝液７．０）で溶出したアルカリホスファターゼ活
性部分を冷時濃縮して、アルカリホスファターゼ標識化
合物を得る。

（１５ｆｔ一体の合成〕 コハク酸を介してチミジンを担持（３０μｍｏｌ以下／
ｇ・シリカゲル）したシリカゲル３３０ｍｇを、（１）
＝）ロメタ／−メタノールに溶解した臭化亜鉛で処理し
て５′−水酸基の保護基ｔ−ａずし、争）ニトロメタン
、メタノール、テトラヒドロフクンで洗浄したのち、（
Ｃ）約２０当量のメトキシホスホロジテトラゾリドの０
．３ｍｏｌｍｏｌリンロフラン溶液を加えて５分間反応
させる。

（ｄ）過剰のリン酸化剤を濾過したのち、Ｃｅ）　ＩＪ
ン原子に関し３体の立体配置をもつ約５当量の５−ジメ
トキシトリチルチミジル（３′、ダ）−チミジル−〇−
メトキシホスホロチオエートを少ｔのテトラヒドロフラ
ンに溶解して加え、５分間反応させる。（ｆ）テトラヒ
ドロフラン−水−ルチジ：／（２：２：１）で洗浄し、
［有］）ヨウ素の０．１ｍｏｌテトラヒドロフランー水
−ルチールチジン２：１）溶液を加え１分間酸化したの
ち、０１）アセトニトリル、テトラヒドロフランで洗浄
する。

（ｉ）ジメチルアミノピリジンの０．１　ｍｏｌテトラ
ヒドロ７ラン溶液および無水酢酸−ルチジ７（１：　２
　Ｖ／Ｖ　）　ｉ加えて未反応のダー水酸基を保護した
のち、（ｊ）メタノール、ニトロメタンで洗浄する。次
いで、（ａ）から０〕までの操作ｔ−７回繰り返して１
５量体を合成した。これをジオキサン中でトリエチルア
ミンおよびチオフェールで処理してメトキシ基を除去し
、次にアンモニアで処理してシリカゲルからはずした１
５ｊｌ一体を、セファデックスＧ−５０カラム（０，１
ｍｏｌ）リエチルアミンビカーゼネート）、逆相シリカ
ゲルカラム（０，１ｍｏｌ　トリエチルアンモニウムア
セテート−アセトニトリル直線濃度勾配）で精製し、８
０％酢酸で処理してジメトキシトリチル基を除去したの
ち、再び逆相シリカゲルカラムで精製して、リン原子の
立体配置が３体であり、１つおきにチオリン酸結合でめ
る１５量体１０　０Ｄ（２６０ｎｍ）ｔ”得た。

〔１５量体のアルカリホスファターゼ標識化〕と１７）
１５ｉｊ体５０Ｄ（２６０ｎｍ）を０．１−の水に溶解
し、これに前記のアルカリホスファターゼ標識化合物を
混合したのちＱ、　４　ｍｏｌリン酸緩衝液（ｐＨ６，
８５）　０．３ゴを加え、４°Ｃで５時間反応させる。

反応液をセファローズ６Ｂ力２ムを用い、Ｑ、　ｌ　ｍ
　ｍｏｌ塩化マグネシウム、０．１ｍｏｌ塩化ナトリウ
ム、０．１ｍｏｌリン酸ナトジナトリウム緩衝液Ｈ７，
０）で溶出して、核酸部分の紫外吸収とアルカリホスフ
ァターゼ活性を有する７ラクシヨンを得た。

特許出願人　　　有機合成薬品工業株式会社６、補正の
内容 手続補正書 昭和５９年１０月３１日 昭和５９年特許願第１７８９１６号 ２、　発明の名称 ポリデオキシリボヌクレオチドまたは ポリリボヌクレオチドの酵素標識化法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 東京都中央区京橋二丁目１７番４号 有機合成薬品工業株式会社 代表者　玉　重　雅　雄 ４、代理人 （１）明細書第２２頁第１４行（７）　ｒｌｏ　　ＯＤ
Ｊ　ヲＩｒ１０　　並ｊに訂正する。

（２）同書同頁第１６行のｒ５　０ＤＪを「５　ｐ」口
に訂正する。

以上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、リン酸結合の少なくとも１個以上がチオリン酸結合
   であるポリデオキシリボヌクレオチドまたはポリリボヌ
   クレオチドのチオリン酸結合のチオール基に共有結合性
   酵素標識化合物を反応させることを特徴とするポリデオ
   キシリボヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチドの酵
   素標識化法。