JPS6157595A - ポリデオキシリボヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチドの酵素標識化法 - Google Patents

ポリデオキシリボヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチドの酵素標識化法

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JPS6157595A
JPS6157595A JP17891684A JP17891684A JPS6157595A JP S6157595 A JPS6157595 A JP S6157595A JP 17891684 A JP17891684 A JP 17891684A JP 17891684 A JP17891684 A JP 17891684A JP S6157595 A JPS6157595 A JP S6157595A
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compound
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polynucleotide
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Nobutaka Sugimoto
杉本 宣敬
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YUKI GOSEI YAKUHIN KOGYO KK
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YUKI GOSEI YAKUHIN KOGYO KK
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明はリン酸結合の少なくとも1個以上がチオリン酸
結合であるポリデオキシリボヌクレオチドまたはポリリ
ボヌクレオチド(以下、ポリヌクレオチドと総称する)
のチオリン酸結合のチオール基に共有結合性酵素標識化
合物を反応させることからなるポリヌクレオチドの酵素
標識化法に関するものであり、本発明により得られる酵
素標識化された特定の塩基配列を有するポリヌクレオチ
ドは標的遺伝子の同定および抽出に使用され、遺伝子工
学、臨床診断および食品等の分野で幅広く利用式れ得る
ものでおる。
(発明の背景) 近年遺伝子工学の研究が盛んになるに伴い、有用物質の
生産に必要な遺伝子の検出に、特定の塩基配列を有する
ポリヌクレオチドが用いられるようになってきている。
例えば臨床診断の分野においては現在免疫学的方法およ
び生物学的方法が用いられているが、前者は検査時間が
一般に数分と短いものの交差反応や干渉作用のためにし
ばしば不明瞭な結果を与え、また後者は培養に長時間を
要するなどの欠点を有する。
これに対して、遺伝子を検出することで疾患の診断を行
なうポリヌクレオチド法は、検査時間は一般に数時間を
要するが、検出感度ばかりでなく特異性も非常に高く、
また誤差がきわめて小さいという利点を有し、感染症の
みならず免疫学的方法では検出できない潜在性ウィルス
も検出可能で6るため、これに適したポリヌクレオチド
の開発が要望されている。
(従来の技術) ポリヌクレオチド管用い、交雑法によって標的遺伝子を
検出する際は、ポリヌクレオチドを標識化する必要があ
る。標識化は放射性同位元素を用いる方法と光標識法に
大別される。現在放射性同位元素stpを用いる方法が
最も利用されており、特開昭58−170496号公報
には人T P (7−−”P )とキナーゼでポリヌク
レオチドの5′−末漏位にltpで標識したリン識基を
導入し mapから放射されるβ線でフィルムを感光さ
せ、その黒斑点によって標的遺伝子の存在を検出する方
法が開示されている。放射性同位元素1による標識化は
感度の点で優れている反面、使用に際して(1)取り扱
い上熟練が必要でおる、01)法規上の規制が厳しく、
特別の施設および測定機器が必要でおり、またその限定
された場所でしか取り扱えない、(fil)健康上の問
題がある、(1v)使用後の廃棄に問題がある、(い半
減期に合わせて予約購入するので実験の期日がそれによ
り制約嘔れる、などの難点がある。これに対して放射性
同位元素を用いない標識化法として光標識化法が提案さ
れ、特開昭58−23795号公報および特開昭58−
40099号公報には化学発光、生体発光、螢光を利用
する方法が開示されている。しかし光標識法としては、
チミジンあるいはクリジンアナローブとして七のC−5
位にアミド結合を介してビオチンを付したジ−0−トリ
ホスフェートを酵素的ニックトランスレーションの手法
でポリヌクレオチドに組み込んで標識化し、標的遺伝子
を検出する方法(Proceedings  of  
Natlonal  Academy  of  8c
ienca    ’of the United 5
tate of Afflerlca、 @ 80巻、
第4045頁(1983年)〕が実用化逼れているのみ
である。
(発明が解決しようとする問題点) 核酸は核酸塩基、糖、リン酸の3つの構成要素から構成
され、それぞれの構成要素を光標識化することが可能で
あるが、その際ポリヌクレオチドが標的遺伝子とハイブ
リットする性質を損うことのないよう標識化合物を導入
する必要がある。しかし、核酸塩基部を光標識化する場
合、ピI) ミジン系塩基ではC−5位に標識化合物を
導入することが可能であるが、プリン系塩基については
立体化学的に標識化合物を導入可能なのはC−8位とN
−7位のみであり、C−8位に導入すると塩基と糖がS
yn型配座をとるために一般的には二重ら線が右巻きで
ある場合はハイゾリット能を失い、またN−7位に導入
する場合は窒素が四級となり糖と塩基部のグリコシド結
合が切れる、いわゆる説プリッ反応が生起しやすくなる
ためプリン系塩基を光標識化することはきわめて困難で
ある。従って核酸塩基部の光標識化はぎ、リミジン系塩
基の場合のみ有効であり、ポリヌクレオチドの塩基配列
がプリン系塩基のまの場合は光標識化ができ難いという
不都合を生じる。次に、糖部を光標識化する場合、Iリ
デオキシリ〆ヌクレオチドでは両末端の水酸基しか利用
できず、4すI7 /ヌクレオチドでは理論的にはグー
位水酸基も利用可能でるるか、この位置に光標識化合物
の如き大きさの分子を導入するとノ1イゾリット形成に
影響を及ぼすため、ボーリデオキシリゼヌクレオテドと
同様に両末端の水酸基しか利用できず検出感度が低下す
る。
(問題点を解決するための手段) 本発明者らは光標識法にエリ標識化したポリヌクレオチ
ドの検出感度を向上式せるため種々検討を加えた結果、
核酸構成要素のリン酸部に光標識化合物を導入すること
により、ポリヌクレオチドの任意の位置に任意の数の光
標識化合物の導入が可能になることを見い出すと共に、
リン酸結合の代わシにチオリン酸結合を選択し、このチ
オリン酸結合のチオール基と光標識化合物を反応させて
チオリン酸結合を光標識化することにより、リン酸結合
を光標識化するときに生ずる(イ)合成法によるポリヌ
クレオチド合成後の脱保護工程での標識化合物の脱離あ
るいはインターヌクレオチド結合の切断、幹)リン原子
がキラリティーを有することによる得られた光標識ポリ
ヌクレオチドのリン原子の立体化学の不統一、という問
題も解決し、また、“光標識化合物としてチオール基と
特異的に反応する共有結合性酵素標識化合物を用いるこ
とにより所期の目的を達成することを見い出し本発明を
完成したものである。
(ポリヌクレオチドの酵素標識化) 本発明のポリヌクレオチドの酵素標識化は、ポリヌクレ
オチドのリン酸結合に代えてチオリン酸結合とし、この
チオリン酸結合のチオール基と特異的化反応する共有結
合性酵素標識化合物を反応させることにより酵素標識化
するものである。
本発明におけるチオリン酸結合を有するポリヌクレオチ
ドは有機合成的方法あるいは酵素的方法によって合成さ
れ得る。有機合成的方法では、ポリヌクレオチドの両末
端水駿基にチオリン酸基を導入するのが最も容易であり
、チオリン酸、チオホスホリルクロリドあるいはその誘
導体を公知の条件下に反応嘔せればよい。しかし更に検
出感度を向上させるためには、両末端にチオリン酸基を
導入し酵素標識化するのみでなく、インターヌクレオチ
ド結合部にチオリン酸基を導入し酵素標識化するのが望
ましい。なお、この障碍られる酵素標識化てれたポリヌ
クレオチドが、立体化学的に標的遺伝子とノ・イブリッ
ト可能であることが必要である。有機合成的にインター
ヌクレオチド結合部にチオリン酸基を導入するには、ホ
スホトリエステル法〔Tetrahedron Let
ters 、第1157頁(1967年〕、Nucle
ic Ac1d Re5earch 、第2巻、第1頁
(1975年)〕とホスファイト法(: Tetra−
hadron Letters 、 第3835頁(1
078年)および第21巻、第1121頁(1980年
)および第23巻、第4289頁(1982年)、日本
化学会49春季年会ass3)が利用され得るが、後者
の方が高い収率を与える。たとえば、ヌクレオシド(反
応式CI)の化合物■)に亜リン酸誘導体(反応式〔■
〕の化合物■)を反応させて単量体(反応式〔■〕の化
合物■)とし、次いで化合物■とダー水酸基が保護され
ていないヌクレオシド(反応式(1)の化合物■)を縮
合させて二量体(反応式CI)の化合物■)とする。こ
の際3′−水酸基の保護基であるR4はR1,R”、 
 R”の保護基とは別異であす選択的に除去できる保護
基であることが望ましいが、R1の保護基と同一の条件
で除去できる保護基でもよく、また場合によっては保護
基を有するリン酸基でもよい。次に化合物■で示される
二量体にヨウ素−水で酸化する代わやに硫黄を反応させ
て、イノターヌクレオチド結合としてチオリン識結合を
有する二量体(反応式CI’lの化合物O)とする。化
合物■で水式れる二量体のリン原子は結合している基が
全て異なるためキラリティーを有するようになり、絶対
表示法で8体と8体の2個のジアステレオマーの混合物
となるが、この2個のジアステレオマーはシリカゲルク
ロiトゲラフイーで分離し、立体化学的に単一の二量体
とすることができる。また几4が保護基を有するリーン
酸基の場合はジエステルの形に誘導したのち、液相ある
いは固相法によるポリヌクレオチドの合成に用いられる
が、化合物■で示される二量体ではキラリティーを有す
るリン原子が2個となり、4個のジアステレオマーが生
成し立体異性体の分離が困難となるので、R4は3′−
末端水酸基が遊離の二量体(反応式CI)の化合物■)
に誘導できる保護基、すなわちR+’、w、R”の保護
基とは別異であり選択的に除去できるか、または部の保
護基と同一の条件で除去できる保護基であることが望ま
しい。後者の場合は3′、ダー両末端水酸基を遊離の形
にしたのち、5′−末端水酸基のみを再保護することに
より化合物■で示てれる二量体とする。
(以下余白) 反応式CI) ■           ■ ■ (反応式CI)において、「は保護基を有することもあ
る塩基残基金、Xはハロゲン原子または二級アミン基を
、部は水素原子またはモノメトキシトリチル基、ジメト
キシ) IJアシル基どの保護基を、謬は水素原子また
は保護基を有することもある水酸基を Biは水素原子
またはメチル基、シアノエチル基、トリクロロエチル基
、トリクロロジメチルエチル基などの保護基を、R4は
水素原子またはモノメトキシトリチル基、ジメトキシト
リチル基、アシル基、ターシャリ−ジチル−ジメチルシ
リル基などのWやBsの保護基と別異で613選択的に
除去できる保護Mまたは保!i基を有するリン酸基を示
す。) DNAおよび几NAはそれぞれ481[類のヌクレオシ
ドZ)−らなり、化合物■で示される16種類の二量体
を予め調製しておくことにより、いかなる塩基配列のポ
リヌクレオチドの合成も可能である。化合物■は3′−
末端水酸基をリン酸化または亜リン酸化したのち、固相
あるいは液相トリエステル法で希望する塩基配列のポリ
ヌクレオチド合成化用いられるが、変型ホスファイト法
(Tetrahadron Latters 、第24
巻、第1019頁(1983年)〕を利用すれば、化合
物■の3′−末端水酸基を予めリン酸化または亜リン酸
化することなくポリヌクレオチドの合成に用いることが
できる。二量体−二量体間のリン酸結合は完全脱保護後
キラリティーをもたず、従って化合物■で示される8体
または8体いずれか一方のジアステレオマー二量体を用
いて合成、脱保護、精製されたインターヌクレオチド結
合に部分的にチオリン酸結合を含むポリヌクレオチドは
、立体化学的に単一である。この場合チオリン酸結合は
最大限1個置きに導入される。ただし、標的遺伝子との
ノ・イゾリット形成に影響を及ぼさない限り、リン原子
のキラリティーは統一てれていなくてもよい。iた硫黄
の導入は縮合毎でもよいし、所定の長さのポリヌクレオ
チドを合成したあと一度に行なってもよい。ポリヌクレ
オチドに含まれるチオリン酸結合の個数は、ポリヌクレ
オチドの鎖長、検出感度、ハイブリット県外等に合わせ
て自由に選択することができる。このほか、ポリヌクレ
オチドの両末端の酵素標識化法として、一般的にリン酸
エステル類は)!Jエステルカラジエステルになるとそ
れ以上加水分解を受けにくくなること、従ってポリヌク
レオチドをトリエステル法で合成した場合に、最終工程
の脱保護反応条件下でもリン酸ジエステルの段階で加水
分解がとどまり、さらtζ反応が進んでインターヌクレ
オチド結合が切断するのは稀であることを利用して一般
式[111のようにポリヌクレオチドの両末端リン酸に
ジエステルの形で醪素sR化合物を導入することも可能
である。
一般式([) (一般式(I)において、Bは塩基残基管、R″は水素
原子または水酸基を、Yは酵素標識化合物を、nは任意
の整数を示す。)また、チオリン酸結合を有するポリヌ
クレオチドは、一般式CI)で示されるヌクレオシドー
ダー0−(1−チオトリホスフェイト)t−基質として
酵素法によっても合成できる。
一般式(1) (一般式(1)において、BおよびR11は前記と同一
である。) このヌクレオシド−5’−0−(1−チオトリホスフェ
イト)は、α位のリン原子に関して絶対表示法で8体と
8体のジアステレオマーの混合物でもよ(、DNAおよ
びRN人ポリメ2−ゼは混合物のうち8体を基質として
立体反転を伴って取り込み、リン原子に関してRKt−
もつ立体化学的に単一のポリヌクレオチドを与える。
導入されるチオリン酸結合の数は、4種類のヌクレオシ
ドトリホスフェイトのうちどれをチオトリホスフェイト
に置き換えるかで自由に選択できるが、4種類のヌクレ
オシドーダー0−(1−チオトリホスフェイト)t−反
応液中に加えることで、全てのリン酸結合をチオリン酸
結合に代え、しかもリン原子のキラリティーについて統
一されたポリヌクレオチドを得ることができる。このほ
か一般式CI)の基質を用いニックトランスレーション
の手法を用いてもチオリン酸結合の導入は可能であり、
また3/、  SF−両末端水酸基のチオリン酸化はア
デノシン−5′−〇−(3−チオホス7エイト)とキナ
ーゼ、チオリン酸とりガーゼを用いてそれぞれ可能であ
る。
本発明で用いられる酵素標識化合物とは、一端がチオリ
ン酸結合のチオール基と特異的な共有結合性をもつ官能
基、すなわちマレイミド基やジテオ基でめり、もう一端
が酵素中のアミン基、メルカプト基と反応する官能基を
もつ架橋剤と、アミノ基、メルカプト基を有する酵素、
例えばガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グ
ルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフエラ
ーゼ、カタラーゼなどよりなるもので、代表的な酵素標
識化合物としてはなどが例示されるが、酵素と架橋剤の
組合せはこれらに限定されるものではない。
チオリン酸結合のチオール基と共有結合性酵素標識化合
物の反応はきわめて容易に進行し、−リヌクレオチドと
酵素標識化合物を室温または室温以下において混合、攪
拌することにより薄紫標識化は容易に完了する。
なお、本発明におけるポリヌクレオチドとは、少なくと
も1個のチオリン酸結合を有する2個以上の単量体より
なり、ポリヌクレオチドの鎖長やその塩基配列は限定さ
れることなく、目的に応じて自由に選択できる。
実施例1 〔ガラクトシダーゼ標識化合物の調製〕Q、 l mo
lリン酸ナトリウム―衝液(pH6,0)0.2−に溶
解したガラクトシダーゼ1 mgと、ジメチルホルムア
ミド0.2 tJ 、!: 0.1 mol +77酸
緩衝液(1)H6,s ) 0.2ゴに溶解したN、 
N−〇−7二二レンジマレイミド0.1 mg f混合
し、30℃で200分間反応せる。反応液をセファデッ
クスG−25力ジムを用い、Q、 l molリン酸ナ
トナトリウム緩衝液pH6,0)で溶出したガラクトシ
ダーゼ活性部分を冷時濃縮して、ガラクトシダーゼ標識
化合物を得る。
〔二量体のガラクトシダーゼ標識化〕
チミジル(3′、ダ)−チミジルホスホロチオエイ) 
0.1 mgをO,l−の水に溶解し、これにガラクト
シダーゼ標識化合物を混合したのち0.4molリン敗
緩衝液(pH6,85)を加え、4℃で5時間反応させ
る。反応液をセファローズ6Bカラムを用い、0.1m
mol塩化マグネシウム、0、1 mol塩化ナトリウ
ム、Q、l molリン酸ナトナトリウム緩衝液pH7
,0)で溶出して、核酸部分の紫外吸収とガラクトシダ
ーゼ活性を有するフラクションを得た。
実施例2 〔アルカリホスファターゼ標識化合物の調製〕アルカリ
ホスファターゼ10 mgを0.1molリン酸ナトジ
ナトリウム緩衝液H7,0) 1−に溶解し、これにジ
オキサン0,1dに溶解したN−(4−力/I/ホキジ
シクロヘキシルメチル)マレイミドのN−ヒドロキシサ
クシンイミドエステル1.5 mgを5分間隔で5回に
分けて加え、30″Cで反応させる。。反応液をセファ
デックスG−25カラムを用い、1mmolエチレンジ
アミン四酢酸を含む0.1molリン酸ナトジナトリウ
ム緩衝液7.0)で溶出したアルカリホスファターゼ活
性部分を冷時濃縮して、アルカリホスファターゼ標識化
合物を得る。
(15ft一体の合成〕 コハク酸を介してチミジンを担持(30μmol以下/
g・シリカゲル)したシリカゲル330mgを、(1)
=)ロメタ/−メタノールに溶解した臭化亜鉛で処理し
て5′−水酸基の保護基t−aずし、争)ニトロメタン
、メタノール、テトラヒドロフクンで洗浄したのち、(
C)約20当量のメトキシホスホロジテトラゾリドの0
.3molmolリンロフラン溶液を加えて5分間反応
させる。
(d)過剰のリン酸化剤を濾過したのち、Ce) IJ
ン原子に関し3体の立体配置をもつ約5当量の5−ジメ
トキシトリチルチミジル(3′、ダ)−チミジル−〇−
メトキシホスホロチオエートを少tのテトラヒドロフラ
ンに溶解して加え、5分間反応させる。(f)テトラヒ
ドロフラン−水−ルチジ:/(2:2:1)で洗浄し、
[有])ヨウ素の0.1molテトラヒドロフランー水
−ルチールチジン2:1)溶液を加え1分間酸化したの
ち、01)アセトニトリル、テトラヒドロフランで洗浄
する。
(i)ジメチルアミノピリジンの0.1 molテトラ
ヒドロ7ラン溶液および無水酢酸−ルチジ7(1: 2
 V/V ) i加えて未反応のダー水酸基を保護した
のち、(j)メタノール、ニトロメタンで洗浄する。次
いで、(a)から0〕までの操作t−7回繰り返して1
5量体を合成した。これをジオキサン中でトリエチルア
ミンおよびチオフェールで処理してメトキシ基を除去し
、次にアンモニアで処理してシリカゲルからはずした1
5jl一体を、セファデックスG−50カラム(0,1
mol)リエチルアミンビカーゼネート)、逆相シリカ
ゲルカラム(0,1mol トリエチルアンモニウムア
セテート−アセトニトリル直線濃度勾配)で精製し、8
0%酢酸で処理してジメトキシトリチル基を除去したの
ち、再び逆相シリカゲルカラムで精製して、リン原子の
立体配置が3体であり、1つおきにチオリン酸結合でめ
る15量体10 0D(260nm)t”得た。
〔15量体のアルカリホスファターゼ標識化〕と17)
15ij体50D(260nm)を0.1−の水に溶解
し、これに前記のアルカリホスファターゼ標識化合物を
混合したのちQ、 4 molリン酸緩衝液(pH6,
85) 0.3ゴを加え、4°Cで5時間反応させる。
反応液をセファローズ6B力2ムを用い、Q、 l m
 mol塩化マグネシウム、0.1mol塩化ナトリウ
ム、0.1molリン酸ナトジナトリウム緩衝液H7,
0)で溶出して、核酸部分の紫外吸収とアルカリホスフ
ァターゼ活性を有する7ラクシヨンを得た。
特許出願人   有機合成薬品工業株式会社6、補正の
内容 手続補正書 昭和59年10月31日 昭和59年特許願第178916号 2、 発明の名称 ポリデオキシリボヌクレオチドまたは ポリリボヌクレオチドの酵素標識化法 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 東京都中央区京橋二丁目17番4号 有機合成薬品工業株式会社 代表者 玉 重 雅 雄 4、代理人 (1)明細書第22頁第14行(7) rlo  OD
J ヲIr10  並jに訂正する。
(2)同書同頁第16行のr5 0DJを「5 p」口
に訂正する。
以上

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1、リン酸結合の少なくとも1個以上がチオリン酸結合
    であるポリデオキシリボヌクレオチドまたはポリリボヌ
    クレオチドのチオリン酸結合のチオール基に共有結合性
    酵素標識化合物を反応させることを特徴とするポリデオ
    キシリボヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチドの酵
    素標識化法。
JP17891684A 1984-08-28 1984-08-28 ポリデオキシリボヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチドの酵素標識化法 Pending JPS6157595A (ja)

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