JPS5993100A - オリゴヌクレオチド誘導体 - Google Patents
オリゴヌクレオチド誘導体Info
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- JPS5993100A JPS5993100A JP58204306A JP20430683A JPS5993100A JP S5993100 A JPS5993100 A JP S5993100A JP 58204306 A JP58204306 A JP 58204306A JP 20430683 A JP20430683 A JP 20430683A JP S5993100 A JPS5993100 A JP S5993100A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
発明の前章
技術分野
本発明は、一般に、新規オリゴヌクレオチド誘導体に関
する。さらに具体的には、本発明は、ヌクレオチドの５
１−末端リン酸基延長上に適度な長すノスベーサーを介
して一級アミノ基を導入してなるオリゴヌクレオチド誘
導体に関する。本発明は、また、このようなオリゴヌク
レオチド誘導体の製造法にも関する。 先行技術 近年、核酸の化学合成は新しい保誇基の導入あるいはト
リエステルｌ：、ボスファイト法等の新しい縮合法の開
発により飛躍的に進歩している。また、遺伝子工学の急
速な進歩とあいまって、核酸の化学合成がこの分野でも
重要ｔｃ意将をもつようになってきた。例えば人工遺伝
子を合成し、遺伝子組換え操作を利用して有用物質の産
生が行なわれている（インターフェｏ ７ ： Ｎａｔ
ｕｒｅ 、 ２８１ 、５４４（１９７９） 、白血球
由来インターフェロン； Ｎａｔｕｒｅ、μ！７．４１
１（１９８０） ）。また、ハイブリッド法のためのプ
ローブ（Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄ６Ｒｅｓ、 ９．８７９
（１９８１） ）とじでやｍＲＮＡ あるいは一本領Ｄ
ＮＡから逆転写酵素ｋ〕るいはＤＮＡポリメラーゼによ
っで、二本鎧ＤＮＡを合成ずろ際に必要な鋳型ＤＮＡに
相補的なりＮＡ断片（ブライマー）として利用（Ｎｕｃ
ｌ、Ａｃ１６−ｅＲｅｓ、 ８．４０５７（１９８０）
）等の応用例もある。 このように、核酸の有機化学的合成手段は、生体から単
離できない特殊な配列をもつオリゴヌクレオチドの合成
を用能にし、分子生物学、遺伝子工学僧の研究に多大な
寄与をするものである。 本発明者らは現在まで、オリゴヌクレオチドの有機化学
的合成分野で固相法を有力な合成手段とし７て、種々の
オリゴヌクレオチドの合叡を行なってその応用を検討し
てきたが、特にアフィニティクロマトグラフィー用樹脂
あるいは非放射性アフィ二ティブローブ等を開発すべく
鋭意努力を重ねた結果、これらの製造の際に有用な中間
体であるオリゴヌクレオチド誘導体を見出した。 工１在まで開発あるいは市販さ牙１ているアフィニイテ
ィクロマトグラフィー甲樹脂（Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ。 Ｂｉｏｐｈｙｓ、、 １６８ 、５６１（１９７４）、
Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ８３ 。 ７８３（１９７８） 、特開昭５２−２５７９５号、回
５３−１０１３９６号、同５３−１３３２８３号および
同５５−３６２７７号各公報）や非放射性用アフィニテ
ィプローブ（Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ 、 ７８ 、６６３３
−６６３７（１９８１） ）に用いられているオリゴ
ヌクレオチド誘導体は、一般に合成がめんどうであると
いう共通のｌ１ｌｉをかかえている。 非数ｌ＼［件アフィニティブロープにおいては、シトシ
ン誘導体の合成が困難であり（上記文献より）、任意で
かつ定められた塩基配列なもつＤＮＡの合成が困難であ
る等の問題点がある。また、アフィニティ樹脂合成に際
して下記に示す文献のものは、リガンドの合成に手間が
かかる等の鄭点がある。 Ｊ、Ｏｈｒｏｍａｔｏｇ６．９７ 、３３（１９７４Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、
３０ｊ、 ２３１（１９７３）Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、、 ７１．４７１（１９７６）これらの理由に
よって、上記のプローブや樹脂合成の際に有用なオリゴ
ヌクレオチド誘導体の提供が望まれているのが親状であ
る。 発明の概要 要旨 本発明は上記の点に解決を力えることを目的とし、目的
物にのみ他の担体を結合できる官能基（−Ｍアミノ基）
を、ヌクレオチドの５′−末端延長上に適度の長さのス
ペーサーを介して導入してなるオリゴヌクレオチド誘導
体によってこの目的を達成しようというものである。 従って、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、下
式〔Ｖ〕で示されるものであること、を特徴とするもの
である。 また、本発明による１式（Ｖｌで示されるオリゴヌクレ
オチド誘導体の製造法は、下式［ＴＶ’ｌで示される化
合物の５１−末端延長上のアミノ基の保護基Ｒ２，３１
−末端のＯＯＲ’基、塩基部分およびリン酸部分の保護
基をすべて除去すること、を特徴とするものである。 〔ただし、ｍおよびｎはそれぞれ０または任意の自然数
であり ＲＯはリン酸基を保護する置換基で通算置換さ
れたフェニル基であり Ｒ１は二価の直鎖または分岐鎖
の炭化水素残基であり、Ｒはア、）基の保詣基であり、
ＯＯＲ’基はヌクレオチドの３Ｉ−末端水酸基の保護
基であり、Ｂ′はヌクレオチドをＷｔ成する保護された
塩基であって必要に応じてきは、それらは同一でも”ｌ
？ｔｃっでもよい）。〕効果 本発明者らの合成したオリゴデオキシリボヌクレオチド
は、ｈ１１記アフィニティクロマトグラフィー用樹脂あ
るいは核酸用非Ｆｉｔ’射性アフィニティブロープの短
所を回避できるものであり、下記のような長所を有する
ものである。 （イ）いかなる塩基配列をも有する上記樹脂やプローブ
を製造することができろ。 （ロ）合５ｙが非常にｆｆｉ′ｉ坪であって、大賭合截
が可能である。 （ハ）オリゴヌクレオチド中に存在才る他の官能基リボ
ヌクレオチドをｎＭせずに相体との縮合に用いろことが
できる。すなわち、反応条件等の設定により選択的にア
ミノ基部分と結合可ｔｊｈである。 に）固相法、液相法およびいかなる方法で合成されたオ
リゴヌクレオチド唐ｆｉ、化することがｕｆ能である。 本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、前記の式〔
■〕で示されるものである。 式中、記号に、 ２’−デオキシリポヌクレオシドの３
１−および５１−水酸基を除いたデオキシリボヌクレオ
シド残者、を示すのに慣用されているものであって、具
体的には下記の構造のものである。 置換基Ｂはヌクレオチドを構成する塩基を示し、ｉ？に
はアデニン、チミン、シトシンまたはグアニンである。 化合物〔ｖ〕中にＢが複数個存在するときは、それらは
同一でも異なってもよい。 ｍおよびｎは、それぞれＯまたは自然数を７１よす。 本発明オリゴヌクレオチド誘導体の重合度がｍ＋ｎで表
示され、ているのし土、本発明の好まし７い製造法で重
合度がそハ５ぞれｍおよびｎＬりフラクションを縮合さ
せていることによるものである（詳細後記）、その場合
のｍは実用的にばＯ〜６、特に１〜４、ｎは実用的にば
Ｏ〜４０、特に０〜２０、である。 基Ｒ１け化合物〔Ｖ〕のヌクレオチド部分の５１−末端
リン酸基とアミン基部分とを押結する二価の直鎖または
分岐鎖の炭化水素残火である。これは、特に炭素数２〜
２０秤度の直銹または分岐鎖のアルキレン基が適当であ
る。好まし７いＲ１は、炭素数２〜６のアルキレン基で
ある。 化合物〔■〕の合成 一般的説明 化合物〔Ｖ〕、すなわち本発明によるオリゴヌクレオチ
ド話導体、は合目的的な任意の方法によって合成するこ
とができる。 一つの好ましい方法は、前記の式Ｑｖｌのオリゴヌクレ
オチド誘導体、すなわちオリゴデオキシヌクレオチドの
５１−末端リン酸基に基Ｒ１を介して保ｄφされた一級
アミノ基を導入し、ヌクレオチドの塩基部分およびリン
酸基部分が保護され、３１−末端に結合した水酸基の水
素原子がＯＯＲ’基で買換されたもの、のすべての保護
基を除去することからなるものである。 一方、式［＋Ｖ］の化合物は、他の官能基部分が保護さ
れたオリゴヌクレオチドの５１−水酸基延長上での保詳
された一級アミノ基の導入からなる方法で合成すること
ができる。 ｉＩ１図は、この好ましい合成法の一例を示すフローチ
ャートである。フローチャート中の記号は、下記の意味
を持つ（その意義ないし詳細は、後記した通りである）
。 ＲＯＩＪン酸基を保護する置換基であって、通常オ／ｌ
／）クロロフェニル基が用いられる。 Ｒ１二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基である。 Ｒ２アミノ基の保浄基であって、通常ジメトキシトリチ
ル基が用いられる。 Ｒ３他のすべての保護基が安定な条件で容易に脱離され
て、リン酸ジエステルを与えることができる置換基であ
って、通常ンアノエチル基が用いられる。 ００Ｒ’通常のオリゴヌクレオチド合成法に用いられる
３′−水酸基の保護基である。具体的には、Ｒ４が低級
アルキル基、了り−ル基（特に、フェニル基、またはメ
チル慟換フェニル）、あるいは固相合成法の際に用いら
れる適当なスペーサーを持つ担体（ポリスチレン樹脂、
ポリアミド樹脂）であるもの、がある。 Ｒ５５１−末端水酸基の保護基であって、通常メトキシ
トリチル基が用いられる。 ｍｏまたは任意の自然数。 ｎｏまたは任意の自然数。 Ｂ 塩基を示す。 Ｂ１ 保護された塩基を示すが、通常はＲ６−ベンゾ
イルアデニン、Ｎ−イソブチリルグアニン Ｒ６−ベン
ゾイルシトシンおよびチミン（すなわち保護不要）より
選択される。 式Ｑｖ〕で示される化合物は、他の官能基部分が保許さ
れたメリゴヌクレオチドの５１−水酸基延長上での保護
された一級アミノ基の導入から１、ｒる合目的的な任意
の方法によって合成′１−ることかできる。 化合物〔ｌｖ〕の合成炉をその一実施態杆（第１１図）
について示せば、下記の通りである。第１図において、
５１−水酸基化合物〔ｏ〕にリン酸化剤（たとえば、ホ
スポジトリアゾリド、ホスホジクロリドまたはホスホベ
ンシトリアゾリド等）を作用させてリン酸化し、ついで
アミノ基が保護されているアミノアルコール化合物〔Ｉ
〕（この化合物はアミノアルキレンアルコール（ＮＨ２
−Ｒ’ −ＯＨ）のアばノ基をＲ２で保「値することに
より得ることができる）を縮合させることにより化合物
（ｒｌ’Ｊを得る。 なお、化合物
する。さらに具体的には、本発明は、ヌクレオチドの５
１−末端リン酸基延長上に適度な長すノスベーサーを介
して一級アミノ基を導入してなるオリゴヌクレオチド誘
導体に関する。本発明は、また、このようなオリゴヌク
レオチド誘導体の製造法にも関する。 先行技術 近年、核酸の化学合成は新しい保誇基の導入あるいはト
リエステルｌ：、ボスファイト法等の新しい縮合法の開
発により飛躍的に進歩している。また、遺伝子工学の急
速な進歩とあいまって、核酸の化学合成がこの分野でも
重要ｔｃ意将をもつようになってきた。例えば人工遺伝
子を合成し、遺伝子組換え操作を利用して有用物質の産
生が行なわれている（インターフェｏ ７ ： Ｎａｔ
ｕｒｅ 、 ２８１ 、５４４（１９７９） 、白血球
由来インターフェロン； Ｎａｔｕｒｅ、μ！７．４１
１（１９８０） ）。また、ハイブリッド法のためのプ
ローブ（Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄ６Ｒｅｓ、 ９．８７９
（１９８１） ）とじでやｍＲＮＡ あるいは一本領Ｄ
ＮＡから逆転写酵素ｋ〕るいはＤＮＡポリメラーゼによ
っで、二本鎧ＤＮＡを合成ずろ際に必要な鋳型ＤＮＡに
相補的なりＮＡ断片（ブライマー）として利用（Ｎｕｃ
ｌ、Ａｃ１６−ｅＲｅｓ、 ８．４０５７（１９８０）
）等の応用例もある。 このように、核酸の有機化学的合成手段は、生体から単
離できない特殊な配列をもつオリゴヌクレオチドの合成
を用能にし、分子生物学、遺伝子工学僧の研究に多大な
寄与をするものである。 本発明者らは現在まで、オリゴヌクレオチドの有機化学
的合成分野で固相法を有力な合成手段とし７て、種々の
オリゴヌクレオチドの合叡を行なってその応用を検討し
てきたが、特にアフィニティクロマトグラフィー用樹脂
あるいは非放射性アフィ二ティブローブ等を開発すべく
鋭意努力を重ねた結果、これらの製造の際に有用な中間
体であるオリゴヌクレオチド誘導体を見出した。 工１在まで開発あるいは市販さ牙１ているアフィニイテ
ィクロマトグラフィー甲樹脂（Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ。 Ｂｉｏｐｈｙｓ、、 １６８ 、５６１（１９７４）、
Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ８３ 。 ７８３（１９７８） 、特開昭５２−２５７９５号、回
５３−１０１３９６号、同５３−１３３２８３号および
同５５−３６２７７号各公報）や非放射性用アフィニテ
ィプローブ（Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ 、 ７８ 、６６３３
−６６３７（１９８１） ）に用いられているオリゴ
ヌクレオチド誘導体は、一般に合成がめんどうであると
いう共通のｌ１ｌｉをかかえている。 非数ｌ＼［件アフィニティブロープにおいては、シトシ
ン誘導体の合成が困難であり（上記文献より）、任意で
かつ定められた塩基配列なもつＤＮＡの合成が困難であ
る等の問題点がある。また、アフィニティ樹脂合成に際
して下記に示す文献のものは、リガンドの合成に手間が
かかる等の鄭点がある。 Ｊ、Ｏｈｒｏｍａｔｏｇ６．９７ 、３３（１９７４Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、
３０ｊ、 ２３１（１９７３）Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、、 ７１．４７１（１９７６）これらの理由に
よって、上記のプローブや樹脂合成の際に有用なオリゴ
ヌクレオチド誘導体の提供が望まれているのが親状であ
る。 発明の概要 要旨 本発明は上記の点に解決を力えることを目的とし、目的
物にのみ他の担体を結合できる官能基（−Ｍアミノ基）
を、ヌクレオチドの５′−末端延長上に適度の長さのス
ペーサーを介して導入してなるオリゴヌクレオチド誘導
体によってこの目的を達成しようというものである。 従って、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、下
式〔Ｖ〕で示されるものであること、を特徴とするもの
である。 また、本発明による１式（Ｖｌで示されるオリゴヌクレ
オチド誘導体の製造法は、下式［ＴＶ’ｌで示される化
合物の５１−末端延長上のアミノ基の保護基Ｒ２，３１
−末端のＯＯＲ’基、塩基部分およびリン酸部分の保護
基をすべて除去すること、を特徴とするものである。 〔ただし、ｍおよびｎはそれぞれ０または任意の自然数
であり ＲＯはリン酸基を保護する置換基で通算置換さ
れたフェニル基であり Ｒ１は二価の直鎖または分岐鎖
の炭化水素残基であり、Ｒはア、）基の保詣基であり、
ＯＯＲ’基はヌクレオチドの３Ｉ−末端水酸基の保護
基であり、Ｂ′はヌクレオチドをＷｔ成する保護された
塩基であって必要に応じてきは、それらは同一でも”ｌ
？ｔｃっでもよい）。〕効果 本発明者らの合成したオリゴデオキシリボヌクレオチド
は、ｈ１１記アフィニティクロマトグラフィー用樹脂あ
るいは核酸用非Ｆｉｔ’射性アフィニティブロープの短
所を回避できるものであり、下記のような長所を有する
ものである。 （イ）いかなる塩基配列をも有する上記樹脂やプローブ
を製造することができろ。 （ロ）合５ｙが非常にｆｆｉ′ｉ坪であって、大賭合截
が可能である。 （ハ）オリゴヌクレオチド中に存在才る他の官能基リボ
ヌクレオチドをｎＭせずに相体との縮合に用いろことが
できる。すなわち、反応条件等の設定により選択的にア
ミノ基部分と結合可ｔｊｈである。 に）固相法、液相法およびいかなる方法で合成されたオ
リゴヌクレオチド唐ｆｉ、化することがｕｆ能である。 本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、前記の式〔
■〕で示されるものである。 式中、記号に、 ２’−デオキシリポヌクレオシドの３
１−および５１−水酸基を除いたデオキシリボヌクレオ
シド残者、を示すのに慣用されているものであって、具
体的には下記の構造のものである。 置換基Ｂはヌクレオチドを構成する塩基を示し、ｉ？に
はアデニン、チミン、シトシンまたはグアニンである。 化合物〔ｖ〕中にＢが複数個存在するときは、それらは
同一でも異なってもよい。 ｍおよびｎは、それぞれＯまたは自然数を７１よす。 本発明オリゴヌクレオチド誘導体の重合度がｍ＋ｎで表
示され、ているのし土、本発明の好まし７い製造法で重
合度がそハ５ぞれｍおよびｎＬりフラクションを縮合さ
せていることによるものである（詳細後記）、その場合
のｍは実用的にばＯ〜６、特に１〜４、ｎは実用的にば
Ｏ〜４０、特に０〜２０、である。 基Ｒ１け化合物〔Ｖ〕のヌクレオチド部分の５１−末端
リン酸基とアミン基部分とを押結する二価の直鎖または
分岐鎖の炭化水素残火である。これは、特に炭素数２〜
２０秤度の直銹または分岐鎖のアルキレン基が適当であ
る。好まし７いＲ１は、炭素数２〜６のアルキレン基で
ある。 化合物〔■〕の合成 一般的説明 化合物〔Ｖ〕、すなわち本発明によるオリゴヌクレオチ
ド話導体、は合目的的な任意の方法によって合成するこ
とができる。 一つの好ましい方法は、前記の式Ｑｖｌのオリゴヌクレ
オチド誘導体、すなわちオリゴデオキシヌクレオチドの
５１−末端リン酸基に基Ｒ１を介して保ｄφされた一級
アミノ基を導入し、ヌクレオチドの塩基部分およびリン
酸基部分が保護され、３１−末端に結合した水酸基の水
素原子がＯＯＲ’基で買換されたもの、のすべての保護
基を除去することからなるものである。 一方、式［＋Ｖ］の化合物は、他の官能基部分が保護さ
れたオリゴヌクレオチドの５１−水酸基延長上での保詳
された一級アミノ基の導入からなる方法で合成すること
ができる。 ｉＩ１図は、この好ましい合成法の一例を示すフローチ
ャートである。フローチャート中の記号は、下記の意味
を持つ（その意義ないし詳細は、後記した通りである）
。 ＲＯＩＪン酸基を保護する置換基であって、通常オ／ｌ
／）クロロフェニル基が用いられる。 Ｒ１二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基である。 Ｒ２アミノ基の保浄基であって、通常ジメトキシトリチ
ル基が用いられる。 Ｒ３他のすべての保護基が安定な条件で容易に脱離され
て、リン酸ジエステルを与えることができる置換基であ
って、通常ンアノエチル基が用いられる。 ００Ｒ’通常のオリゴヌクレオチド合成法に用いられる
３′−水酸基の保護基である。具体的には、Ｒ４が低級
アルキル基、了り−ル基（特に、フェニル基、またはメ
チル慟換フェニル）、あるいは固相合成法の際に用いら
れる適当なスペーサーを持つ担体（ポリスチレン樹脂、
ポリアミド樹脂）であるもの、がある。 Ｒ５５１−末端水酸基の保護基であって、通常メトキシ
トリチル基が用いられる。 ｍｏまたは任意の自然数。 ｎｏまたは任意の自然数。 Ｂ 塩基を示す。 Ｂ１ 保護された塩基を示すが、通常はＲ６−ベンゾ
イルアデニン、Ｎ−イソブチリルグアニン Ｒ６−ベン
ゾイルシトシンおよびチミン（すなわち保護不要）より
選択される。 式Ｑｖ〕で示される化合物は、他の官能基部分が保許さ
れたメリゴヌクレオチドの５１−水酸基延長上での保護
された一級アミノ基の導入から１、ｒる合目的的な任意
の方法によって合成′１−ることかできる。 化合物〔ｌｖ〕の合成炉をその一実施態杆（第１１図）
について示せば、下記の通りである。第１図において、
５１−水酸基化合物〔ｏ〕にリン酸化剤（たとえば、ホ
スポジトリアゾリド、ホスホジクロリドまたはホスホベ
ンシトリアゾリド等）を作用させてリン酸化し、ついで
アミノ基が保護されているアミノアルコール化合物〔Ｉ
〕（この化合物はアミノアルキレンアルコール（ＮＨ２
−Ｒ’ −ＯＨ）のアばノ基をＲ２で保「値することに
より得ることができる）を縮合させることにより化合物
（ｒｌ’Ｊを得る。 なお、化合物
〔０〕はオリゴヌクレオチドであって、通
常のオリゴヌクレオチド合成法で製造可能である。合成
法としては、トリエステル法、ホスファイト法およびそ
れぞれの固相法および液相法がある。 一方、通常のオリゴヌクレオチド合成法、好ましくけ本
発明者らの固相合叡法（ＴｅｔｒａｈθｄｒｏｎＬｅｔ
ｔθｒｓ １９７９ ３６３５（１９７９）、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ ８． ５４７
３（１９８０） 、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｌｃ
ｌ日 Ｒｅ５ｅ−ａｒｃｈ ８． ５４９１（１９８
０） 、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ日 Ｒｅｎ
ｅａｒｃｈ８、 ５５０７（１９８０） 、 Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｂ１日 ＲｅｓｅａｒｃｈＳｙｍｐ
ｏｑｉｕｍ ５ｅｒｊ、ｅｓユ、 ２８１（１９８０）
に従って合成した化合物Ｑｌ＋〕の５１−末端を水酸基
化した化合物〔ｍ’〕と先姓二合成した化合物ＣＩＩ）
とを縮合剤を用いて縮合させろことにより化合物（ＩＶ
）を得ることができる。縮合剤としてはトシルクロリド
、メシチレンスルホニルクロリド、メシチレンスルホニ
ルテトラゾリドおよびメシチレンスルホニルニトロトリ
アゾリド等があるが、メシチレンスルホニルニトロトリ
アゾリドが好ましい。なお、反応条件笠の詳細は後記実
験例を参照されたい。 化合物（Ｖ’Ｊの合成 化合物〔ｖ〕は、手記化合物〔ＩＶ〕の保護基をすべて
除去することによって得ること力□−できる。 １ 保護基００Ｒ’才（、リン酸トリニスデル中のオルトク
ロロフェニル基および塩基部分のアシル基ハ、０．５Ｍ
のテトラメチルグアニジン−ピリジン−２−カルボアル
ドキシムのジオキサン−水（９：１（ｖ／ｖ ） ）溶
液で処理後、アルカリ処理（ｐアンモニア水）を行なう
ことより除去される。Ｒ２がトリフルオロアセチル基の
場合は、アンモニア処理にヨリ充分脱離されるが、オル
トニトロフェニルスルフェニル基である場合はメルカプ
トエタノール処理が必要である。Ｒ２として他の保護基
を用いた場合は、オリゴヌクレオチド部分が安定な条件
で、さらに別の処理を加えることも回部である。なお、
デオキシオリゴリボヌクレチオドの合成法は既に各種の
ものが公知であって、保護基のｆＩ類およびその導入１
にいし除去ならひに縮合その他について上記以外の詳細
は核酸の化学合成に関する成冑や総説たとえば「ヌクレ
オシド・ヌクレオチドの合成」（丸竹１９７７年）、「
核酸有機化学」 （化学同人１９７９年）、「核酸」（
朝食書店１９７９年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、 ３
４．３１ （１９７８）、有合化、３４．７２３（１９
７８）および化学の領域、阻、 ５６６ （１９７９）
等を参照することができる。 第２図のフローチャートに従って、本発明の化合物（同
ン１の化合物０次製造した。 第２図で、記号は次の童昧を持つ。 Ｂ１ ベンゾイル化アデニン Ｂ アデニン ＤＭＴｒ ジ、メトキシトリチル Ｒ０オルトクロロフェニル Ｅｔ エチル ＣＥ −シアンエチル ２ モし一軸− １２ 化合物〔Ｖ〕（第２図００）の合成 実験１−１ ジメトキシトリチルアデノシン／樹脂（１）（樹脂は担
体に過ぎないが、樹脂に担持さ第１た目的化合物は外観
的には樹脂そのものと変らｔｘいので、樹脂に担持され
た当該化合物を以下において単に樹脂と呼ぶことにする
） ３００ ｍｇ（０，０３３ｍｍｏｌ ）をイソプロ
パノ−ルー塩化゛メチレン”（１５： ８り、Ｖ／Ｖ
）溶液ｉｏ ｍｌ、で３回洗浄後、臭化亜鉛の１．０Ｍ
のイソプロパノ−ルー塩化メチレン溶液８ｍ１で５分間
ずつ４回反応（脱トリチル化）させて樹脂〔■〕を得ろ
。樹脂〔■〕をイソプロパノ−ルー塩化メチレン溶液１
０ｍ１で３回洗浄し、これにジヌクレオチド〔■〕１５
０ ｍｇ（０，１ｍｍｏｌ ）のピリジン溶液を添加後
、共沸させて系を無水とし、メシチレンスルホニルニト
ロトリアゾリド（以下ＭＳＮＴと記す） １５０ ｍｇ
（ｏ、５ｍｍｏｌ）と無水ピリジン２ｍｌとを添加して
９０分間反応（縮合）させる。反応後、ピリジンｌｔ１
ｍｌで３回洗浄し、触媒量（約１ｏｍｇ）のジメチルア
ミノピリジン（以下ＤＭＡＰ ）を含む無水酢酸−ピリ
ジン（１：９、（Ｖ、’Ｖ） ’）溶液１０ ｍｌを添
加し１０分間反応させて未反応５＋−水酸基をアセチル
化して保腸し、これをピリジンで洗浄して、化合物〔■
”］（ｎ−２）を得る。以十のような操作を６回くり返
して、化合物〔■］（ｎ−１２）を得る。 一方、５′−ヒドロキシ−ジヌクレオチド〔■〕８００
ｍｇ （０，７１ｍｍｏｌ ）とオルトクロロフェニ
ルホスホジトリアゾリドとを後者のジオキサン溶液（１
、Ｑ ｍｍｏｌ、６ｍ１）中で２時間反応させ、−続い
てトリフルオロアセチル−６−アミイヘキサノール３０
０ ｍｇ （１，４ｍｍｏｌ ）および１−メチル−イ
ミダゾール１１５ ｍｇ （１，４ｍｍｏｌ ）を加え
てさらに２時間反応させる。反応終了後、溶媒を留去し
、残渣をクロロホルムに溶解した後、水、０．５Ｍリン
酸二水素ナトリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水
溶液および５チの塩化ナトリウム水溶液でそれぞれ洗浄
し、無水硫酸す） ＩＪウムで乾燥する。クロロホルム
層を濃縮後、シリカゲルカラムで精製（溶出液としてθ
〜４係のメタノール含有クロロホルムを使用）し、溶出
液を濃縮後ペンタン中に滴下し粉末状の化合物〔■〕を
得る。 上記で合成した化合物〔■） （ｎ−１２） １１５
ｍｇ。 （３，４５μｍｏｂ ）を前述と同様の方法で脱トリチ
ル化したもの〔の〕に、化合物〔■：］ ６ｏ ｍｇ
（０，０４ｍｍｏｌ）をトリエチルアミン−ピリジン−
水（１：３：１、ｖ７ｖ ）溶液３ｍｌで処理（脱シア
ノエチル化）した化合物〔■〕を加え、無水にしたのち
、ＭＳＮＴ５ｏ ｍｇ（０，２ｍｍｏｌ）およびビリジ
ｙｔｍ１を加え９０分間反応（縮合）させ、反応終了後
ピリジンおよびメタノールで洗浄し、乾燥して、完全に
保護されたオリゴヌクレオアト誘導体〔■〕を得る。 オリゴヌクレオチド誘導体〔■〕１５Ｉｎｇを０．５Ｍ
テトラメチルグアニジン−ピリジン−２−カルボアルド
キシメイトのジオキサン−水（９： ｌ 、 （′ｖ／
Ｖ）溶液２００μｍを加え、遠沈管中、室温で２４時間
反応させる。反応後、濃アンモニア水（２，５ｍ１）を
加えて密閉し、５０℃で一夜反応させる。反応終了後、
１過し、ｆ液を濃縮後、水に溶解させてからエーテルで
抽出を行なう。水層を濃縮後、セファデックスＧ −５
０（φ１．５ ｘ １２０ ａｍ、溶出液は０．０５
Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液ｐＨ７，５）
で脱塩精製しペンタデカアデニル酸誘導体
常のオリゴヌクレオチド合成法で製造可能である。合成
法としては、トリエステル法、ホスファイト法およびそ
れぞれの固相法および液相法がある。 一方、通常のオリゴヌクレオチド合成法、好ましくけ本
発明者らの固相合叡法（ＴｅｔｒａｈθｄｒｏｎＬｅｔ
ｔθｒｓ １９７９ ３６３５（１９７９）、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ ８． ５４７
３（１９８０） 、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｌｃ
ｌ日 Ｒｅ５ｅ−ａｒｃｈ ８． ５４９１（１９８
０） 、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ日 Ｒｅｎ
ｅａｒｃｈ８、 ５５０７（１９８０） 、 Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｂ１日 ＲｅｓｅａｒｃｈＳｙｍｐ
ｏｑｉｕｍ ５ｅｒｊ、ｅｓユ、 ２８１（１９８０）
に従って合成した化合物Ｑｌ＋〕の５１−末端を水酸基
化した化合物〔ｍ’〕と先姓二合成した化合物ＣＩＩ）
とを縮合剤を用いて縮合させろことにより化合物（ＩＶ
）を得ることができる。縮合剤としてはトシルクロリド
、メシチレンスルホニルクロリド、メシチレンスルホニ
ルテトラゾリドおよびメシチレンスルホニルニトロトリ
アゾリド等があるが、メシチレンスルホニルニトロトリ
アゾリドが好ましい。なお、反応条件笠の詳細は後記実
験例を参照されたい。 化合物（Ｖ’Ｊの合成 化合物〔ｖ〕は、手記化合物〔ＩＶ〕の保護基をすべて
除去することによって得ること力□−できる。 １ 保護基００Ｒ’才（、リン酸トリニスデル中のオルトク
ロロフェニル基および塩基部分のアシル基ハ、０．５Ｍ
のテトラメチルグアニジン−ピリジン−２−カルボアル
ドキシムのジオキサン−水（９：１（ｖ／ｖ ） ）溶
液で処理後、アルカリ処理（ｐアンモニア水）を行なう
ことより除去される。Ｒ２がトリフルオロアセチル基の
場合は、アンモニア処理にヨリ充分脱離されるが、オル
トニトロフェニルスルフェニル基である場合はメルカプ
トエタノール処理が必要である。Ｒ２として他の保護基
を用いた場合は、オリゴヌクレオチド部分が安定な条件
で、さらに別の処理を加えることも回部である。なお、
デオキシオリゴリボヌクレチオドの合成法は既に各種の
ものが公知であって、保護基のｆＩ類およびその導入１
にいし除去ならひに縮合その他について上記以外の詳細
は核酸の化学合成に関する成冑や総説たとえば「ヌクレ
オシド・ヌクレオチドの合成」（丸竹１９７７年）、「
核酸有機化学」 （化学同人１９７９年）、「核酸」（
朝食書店１９７９年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、 ３
４．３１ （１９７８）、有合化、３４．７２３（１９
７８）および化学の領域、阻、 ５６６ （１９７９）
等を参照することができる。 第２図のフローチャートに従って、本発明の化合物（同
ン１の化合物０次製造した。 第２図で、記号は次の童昧を持つ。 Ｂ１ ベンゾイル化アデニン Ｂ アデニン ＤＭＴｒ ジ、メトキシトリチル Ｒ０オルトクロロフェニル Ｅｔ エチル ＣＥ −シアンエチル ２ モし一軸− １２ 化合物〔Ｖ〕（第２図００）の合成 実験１−１ ジメトキシトリチルアデノシン／樹脂（１）（樹脂は担
体に過ぎないが、樹脂に担持さ第１た目的化合物は外観
的には樹脂そのものと変らｔｘいので、樹脂に担持され
た当該化合物を以下において単に樹脂と呼ぶことにする
） ３００ ｍｇ（０，０３３ｍｍｏｌ ）をイソプロ
パノ−ルー塩化゛メチレン”（１５： ８り、Ｖ／Ｖ
）溶液ｉｏ ｍｌ、で３回洗浄後、臭化亜鉛の１．０Ｍ
のイソプロパノ−ルー塩化メチレン溶液８ｍ１で５分間
ずつ４回反応（脱トリチル化）させて樹脂〔■〕を得ろ
。樹脂〔■〕をイソプロパノ−ルー塩化メチレン溶液１
０ｍ１で３回洗浄し、これにジヌクレオチド〔■〕１５
０ ｍｇ（０，１ｍｍｏｌ ）のピリジン溶液を添加後
、共沸させて系を無水とし、メシチレンスルホニルニト
ロトリアゾリド（以下ＭＳＮＴと記す） １５０ ｍｇ
（ｏ、５ｍｍｏｌ）と無水ピリジン２ｍｌとを添加して
９０分間反応（縮合）させる。反応後、ピリジンｌｔ１
ｍｌで３回洗浄し、触媒量（約１ｏｍｇ）のジメチルア
ミノピリジン（以下ＤＭＡＰ ）を含む無水酢酸−ピリ
ジン（１：９、（Ｖ、’Ｖ） ’）溶液１０ ｍｌを添
加し１０分間反応させて未反応５＋−水酸基をアセチル
化して保腸し、これをピリジンで洗浄して、化合物〔■
”］（ｎ−２）を得る。以十のような操作を６回くり返
して、化合物〔■］（ｎ−１２）を得る。 一方、５′−ヒドロキシ−ジヌクレオチド〔■〕８００
ｍｇ （０，７１ｍｍｏｌ ）とオルトクロロフェニ
ルホスホジトリアゾリドとを後者のジオキサン溶液（１
、Ｑ ｍｍｏｌ、６ｍ１）中で２時間反応させ、−続い
てトリフルオロアセチル−６−アミイヘキサノール３０
０ ｍｇ （１，４ｍｍｏｌ ）および１−メチル−イ
ミダゾール１１５ ｍｇ （１，４ｍｍｏｌ ）を加え
てさらに２時間反応させる。反応終了後、溶媒を留去し
、残渣をクロロホルムに溶解した後、水、０．５Ｍリン
酸二水素ナトリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水
溶液および５チの塩化ナトリウム水溶液でそれぞれ洗浄
し、無水硫酸す） ＩＪウムで乾燥する。クロロホルム
層を濃縮後、シリカゲルカラムで精製（溶出液としてθ
〜４係のメタノール含有クロロホルムを使用）し、溶出
液を濃縮後ペンタン中に滴下し粉末状の化合物〔■〕を
得る。 上記で合成した化合物〔■） （ｎ−１２） １１５
ｍｇ。 （３，４５μｍｏｂ ）を前述と同様の方法で脱トリチ
ル化したもの〔の〕に、化合物〔■：］ ６ｏ ｍｇ
（０，０４ｍｍｏｌ）をトリエチルアミン−ピリジン−
水（１：３：１、ｖ７ｖ ）溶液３ｍｌで処理（脱シア
ノエチル化）した化合物〔■〕を加え、無水にしたのち
、ＭＳＮＴ５ｏ ｍｇ（０，２ｍｍｏｌ）およびビリジ
ｙｔｍ１を加え９０分間反応（縮合）させ、反応終了後
ピリジンおよびメタノールで洗浄し、乾燥して、完全に
保護されたオリゴヌクレオアト誘導体〔■〕を得る。 オリゴヌクレオチド誘導体〔■〕１５Ｉｎｇを０．５Ｍ
テトラメチルグアニジン−ピリジン−２−カルボアルド
キシメイトのジオキサン−水（９： ｌ 、 （′ｖ／
Ｖ）溶液２００μｍを加え、遠沈管中、室温で２４時間
反応させる。反応後、濃アンモニア水（２，５ｍ１）を
加えて密閉し、５０℃で一夜反応させる。反応終了後、
１過し、ｆ液を濃縮後、水に溶解させてからエーテルで
抽出を行なう。水層を濃縮後、セファデックスＧ −５
０（φ１．５ ｘ １２０ ａｍ、溶出液は０．０５
Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液ｐＨ７，５）
で脱塩精製しペンタデカアデニル酸誘導体
〔０〕を得た
。 また、同様の方法で実験】−２，１−３，１−４，１−
５および１−６のオリゴヌクレオチド誘導体を得た。実
験例１−１〜１−６の化合物の塩基配列その仙を第１Ｐ
に示す。 ただし、この表でＡはアデニン、Ｔはチミン、Ｇはグア
ニン、Ｃはシトシンを示す。 実験例１−１．１−２および１−３についてのセファデ
ックスおよび高速液体クロマトグラフィーの結果を第３
〜４．５〜６および７〜８図に示す。これらの結果より
、゛化合物［Ｖ’ｌが生成していることがわかる。
。 また、同様の方法で実験】−２，１−３，１−４，１−
５および１−６のオリゴヌクレオチド誘導体を得た。実
験例１−１〜１−６の化合物の塩基配列その仙を第１Ｐ
に示す。 ただし、この表でＡはアデニン、Ｔはチミン、Ｇはグア
ニン、Ｃはシトシンを示す。 実験例１−１．１−２および１−３についてのセファデ
ックスおよび高速液体クロマトグラフィーの結果を第３
〜４．５〜６および７〜８図に示す。これらの結果より
、゛化合物［Ｖ’ｌが生成していることがわかる。
第１図は、本発明の化合物１を合成する方法の一例を示
すフローブーヤードである。 第２図は、実ＩＫ例で示した本化合物のフローチャート
である。 第３．５およ０７図は、化合物〔Ｖ〕（それぞれ実（験
例１−１．１−２およびｌ−４）Ｋついてのセファデッ
クスＧ−５０での溶出パターンを示したものである。 第４．６および８図は、化合物〔Ｖ〕（それぞれ実験例
１−１，１−’！および１−４）についての高速液体ク
ロマトグラフィーの溶出パターンを示したものである。 出願人代理人 猪 股 清１１ 鬼３図 分 画 数 率４区 イン１４ｎＢデ１ 間 （“づ）・）児５図 分 画 数 児６図 イボ １−１０づ１ 間 （’Ｏ）鬼７図 分 画 数 訛８図
すフローブーヤードである。 第２図は、実ＩＫ例で示した本化合物のフローチャート
である。 第３．５およ０７図は、化合物〔Ｖ〕（それぞれ実（験
例１−１．１−２およびｌ−４）Ｋついてのセファデッ
クスＧ−５０での溶出パターンを示したものである。 第４．６および８図は、化合物〔Ｖ〕（それぞれ実験例
１−１，１−’！および１−４）についての高速液体ク
ロマトグラフィーの溶出パターンを示したものである。 出願人代理人 猪 股 清１１ 鬼３図 分 画 数 率４区 イン１４ｎＢデ１ 間 （“づ）・）児５図 分 画 数 児６図 イボ １−１０づ１ 間 （’Ｏ）鬼７図 分 画 数 訛８図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、下式〔Ｖ〕で示されるものであることを特徴とする
、オリゴヌクレオチド誘導体。 〔ただし、ｍおよびｎはそれぞれＯまたは任意の自然数
であり、Ｒ１は二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基
であり、Ｂはヌクレオチドを槽成イる塩基である（Ｂが
複数個存在するときは、それらは同一でも異なってもよ
い）。〕２、塩基Ｂがアデニン、チミン、シトシンおよ
びグアニンからなる群より選ばれたものである、喝許請
求の範囲第１項記載のオリゴヌクレオチド誘導体。 ３、Ｒ１が炭素数２〜２０の直鎖または分岐鎖のアルキ
レン基である、特許請求の範囲第１項または第２項記載
のオリゴヌクレオチド誘導体。 ４、 ｍが０または６までの自然数、ｎがＯまたは４０
までの自然数である、特許請求の範囲第１〜３項のいず
れか１項に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。 ５、下式［ＩＶ］で示される化合物の５゛−末端延長上
のアミン基の保護基Ｒ２，３１−末端のＯＯＲ’基、塩
基部分およびリン酸部分の保護基をすべて除去すること
を特徴とする、下式［Ｖ〕で示されるオリゴヌクレオチ
ド誘導体の製造法。 〔ただし、ｍおよびｎはそれぞれＯまたは任意の自然数
であり ＲＯはリン酸基を保護する置換基てｊｆ−ｆ１
歴をれ嚢ヲーｒ逼→し基であり Ｒ１は二価の直鎖また
は分岐鎖の炭化水素残基であり、Ｒ２はアミノ基の保護
基であり、００Ｒ４基はヌクレオチドの３１−末端水酸
基の保蒔基であり、Ｂ１はヌクレオチドを構成する保護
された塩基であって必要に応じて保護されたものであり
、Ｂば
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58204306A JPS5993100A (ja) | 1983-10-31 | 1983-10-31 | オリゴヌクレオチド誘導体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58204306A JPS5993100A (ja) | 1983-10-31 | 1983-10-31 | オリゴヌクレオチド誘導体 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57138136A Division JPS5927900A (ja) | 1982-08-09 | 1982-08-09 | 固定化オリゴヌクレオチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5993100A true JPS5993100A (ja) | 1984-05-29 |
| JPH0374239B2 JPH0374239B2 (ja) | 1991-11-26 |
Family
ID=16488294
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58204306A Granted JPS5993100A (ja) | 1983-10-31 | 1983-10-31 | オリゴヌクレオチド誘導体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5993100A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5821058A (en) * | 1984-01-16 | 1998-10-13 | California Institute Of Technology | Automated DNA sequencing technique |
| WO2007142202A1 (ja) | 2006-06-06 | 2007-12-13 | Panasonic Corporation | ヌクレオチド鎖修飾方法 |
| USRE43096E1 (en) | 1984-01-16 | 2012-01-10 | California Institute Of Technology | Tagged extendable primers and extension products |
| US8097405B1 (en) | 1982-06-23 | 2012-01-17 | Enzo Biochem, Inc. | Nucleic acid sequencing processes using non-radioactive detectable modified or labeled nucleotides or nucleotide analogs, and other processes for nucleic acid detection and chromosomal characterization using such non-radioactive detectable modified or labeled nucleotides or nucleotide analogs |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57106696A (en) * | 1980-12-25 | 1982-07-02 | Teijin Ltd | 1-(beta-d-arabinofuranosyl)cytosine derivative and its preparation |
-
1983
- 1983-10-31 JP JP58204306A patent/JPS5993100A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57106696A (en) * | 1980-12-25 | 1982-07-02 | Teijin Ltd | 1-(beta-d-arabinofuranosyl)cytosine derivative and its preparation |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8097405B1 (en) | 1982-06-23 | 2012-01-17 | Enzo Biochem, Inc. | Nucleic acid sequencing processes using non-radioactive detectable modified or labeled nucleotides or nucleotide analogs, and other processes for nucleic acid detection and chromosomal characterization using such non-radioactive detectable modified or labeled nucleotides or nucleotide analogs |
| US5821058A (en) * | 1984-01-16 | 1998-10-13 | California Institute Of Technology | Automated DNA sequencing technique |
| US6200748B1 (en) | 1984-01-16 | 2001-03-13 | California Institute Of Technology | Tagged extendable primers and extension products |
| USRE43096E1 (en) | 1984-01-16 | 2012-01-10 | California Institute Of Technology | Tagged extendable primers and extension products |
| WO2007142202A1 (ja) | 2006-06-06 | 2007-12-13 | Panasonic Corporation | ヌクレオチド鎖修飾方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0374239B2 (ja) | 1991-11-26 |
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