JPS5953500A - オリゴヌクレオチドを固体支持体上に合成する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明を丁固什多持イ４・十にデＡキシリボ刊りゴヌク
レオチドおＪ二びリボメリコ゛ヌクｌ／オ′／１゛ろ・
自１１νする方法に関ずる。 近＋４Ｅ、ｆ’ｔ　’？　者達Ｌｊ−、ｒｌ　＋−Ｉ　
Ａ　：ｔｒ　、Ｊ：び１（１４ΔイＩ４　、１ハｌ’！
　ｌ’＋；してｉＩｌ用することができる明ｎＲ′に：
定めもねたシーケンスを有するオリゴヌクレオチド 開発して来た。たとえば、＠１イズが１）ｒ４Δのｎ成
片ｌＯ乃至１４ユニツ１・から成ろものを貝什的々酵：
・κ的４に法Ｆ−　Ｊ：つて万いＨ７糸−１０さ狭て遺
伝子κ二ｆｌ。 を形成するか、あるいは所望ＤＮＡシークンスの同定を
補助すイ）プローブとして４ｊＪ　ｆｉｌ五さ・ｌ｝　
７，ことがテキル。合成オリゴヌクレオチｌ’　｛ｌ’
ｌけ１１　Ｎ　Ａハを互イニスプラインングする際また
は組換えられたＤＮＡ分子を構成する際これらを補助す
るリンカ−として機能しイｌるものである。 コーラナ（Ｋｈｏｒａｎａ）他のジエステル合成によっ
て１キリゴヌクレオチドは巾初に合成サレタ（「シャー
ナル、オブ、モレキユラー、パイコロシ−Ｊ７２：２５
１（１９７２年））。ナーラング他はトリエステ７＋合
成の開発により、この方法ヲ拡張した（「ジャーナル、
オブ、バイオロジカル、ケミ　ス　ト　リ　ー　、Ｊ　
　２　　５　　０　　：　　４５９２（１９７５　　年
　）　）　。　これらの初期の方法は回熱であり、また
非相に時間を浪費するものであった。ヌクレオチドを互
いにうまく結合して、縮合用の試薬を調製し、生成物を
和製した拶各２１１合工程な杓い、そして最終ヌクレオ
チドシーケンスを単離かつ精製するためには多くの時間
を要Ｌ．た。 レツチンガー他は「亜すン酸トリ：Ｌステル」法の開示
によってオリゴヌクレオチドの合成方法を改良した（「
ジャーナル、オブ、アメリカン、ケミカル、ソサエティ
Ｊ　９　７　：　３２７８〜７　９　（　１９７５年）
〕。後からの、この亜すン酪］リエスーｊルへのアプロ
ーチが，４リゴヌクレオ千ドの固相合成に発展した。固
｛ｐ−！たは「ポリマー支持体」合成法は、該方法が分
離および絹製工程を＠鴇にするどいう虚で便利である。 梗η、非膨潤性シリカゲルコロイドは支Ｒ　｛４＝とじ
てしにｊ”しげ用いられる。固相法においては、保護さ
わたヌクレオシ１゛を化リン酸エステル化剤、たと、＋
．　Ｕ　Ｚトキ’ｉ　：；　クロロホスフィンと尺斤１
，させろ。次に得られたヌクシン４シド・ホスホモノク
［＋リダイト（　１１＋１（ＩＦＩＩ山ｎｍｏ＋＋ｎｃ
ｂｌｏｒｉｄｉ　ｔｅａ）を支持イ．ｌ＝に結合した第
２の促べμヌクレオチドとＪシ応させる。テトラヒドＴ
・７ラン中ｉ．ヨウイ１を用いるｉ」一やか々ｔ１々化
に引ｆ１１：いて、Ａチヅンと汁カｌｌｉリンＣ！′２
エステルなリン酸コ，ス′ヅノ１しこ転１（＝．すＺ》
。この方法は先Ｌｒする方法．Ｖりも（・するかに、斗
いものであるが、反応を一７８℃で１ｊい、そしてヌク
レオシド対面リン酸エステル什削の割合を江蒼υ（：　
＜　：ｔ！Ｉ　ｒＩｔｌｌする１易・自においてずし）
川成りの［１１の：３’ー：３’異［トｆ４・が化成窟
れろ，　｛ｌｊ４の欠小け、空気による加水ろ）ｆ」『
および酸化Ｖ（一対−ｆ−る１ｖ応ｔ１中間（ｊ．ｏ＞
不安シミ二ｉ’Ｊ＝　’ｉ！ある。 カル用−ズ他は、ヌクレオシド亜リン酸エステルの「テ
トラゾリド」誘導体を導入することによってこの方法を
変更した（「ジャーナル、オプ、。 アメリカン、ケミカル、ソサエティＪ　ｌ　（１３：３
１８５〜３１９１（１９８１年））。しかし、この中間
体は非常に安定で、÷）るという訳ではなく、またこの
誘導体の調製は、−７８℃で？ｊうべき付加的々工程を
もたらすものでｔ）る。 カルサーズ他は、更に基本的な方法を、亜リン酸エステ
ル化剤であるメトギンジクロロホスフィンがＮ　、　Ｎ
’−ジアルキルアミノ誘導体に転換されるように変更し
、この場合Ｎ　、　Ｎ’−ジアルキルアミノ誘導体はヌ
クレオシドと反応させたとき、司成り安定な「ヌクレオ
シド亜リン酸エステル」を生成するものでル）る（［テ
トラヘドロン、レターズＪ２２，１８５９〜６２　（１
９８１年））。ぴに、この生成物をテトラゾールの存在
−Ｆヌクレオシドを担時するシリカゲルと反応させる。 この方法は１メ前のものに１ｔべ１１ば高い安定性を示
す中間体をもたらすものであるが、この長所はＩＩ！　
’；ｌ’ｉ旧ネ１σ〕ＴＩ、冒１１１のがかる訴１駆す
法によって相殺さｆ１乙ものであイ１゜従って、比較的
節片かつ容でに？：ｉ對る固イ（、伎（テ体上のオリゴ
ヌクレオチ１゛を合成する方法でｋ）って、上記の問題
を回避すて、もののｊＩＺ要ｆロ丁イ？・然として縦縁
：している。そＪ１ｔｒ６、本発明の１的は、容易かつ
Ｕ済的に？ｊうことができ、また安定な（１成物をｌｆ
　２）ことができるＡリコヌクＬ・オチドの固相合成方
法ケ開発することにｔ、る。 固体支持体を亜すン酸エステル什剤でり！理し、引Ｕ、
、イ゛〔ヌクｌ／オシドで処理する工程を伴う方法によ
り固体支持イト土ｔｒオリゴヌクレオチドをイ）成する
ことが見出された。この方法は、■１！リン酸エステル
化剤でヌクレオシドを６り１胛し、引続いて支持体で処
理する丁和を伴う広く行われている方法と＆Ｊ、ヌ・」
量的でｔ）ろ。 オ・発すｊは、°］−としてシリカゲルでｔ・る固相支
持体止ニオリゴヌクし・メチドを合成する新却な方法に
関する。ヌクレオシドは、その３′−ヒドロキシル基に
おい゛〔固（１］支持什Ｖｒ、Ｌ′、６１．ティ口。ｓ
ｔ　りｌ／オンドの５′−ヒドロキシル基は伊膿基によ
って保Ｆされている。このイ♀晒基は除去され、そし、
て遊離の５′−ヒドロキシルは二官肚性亜すン酸ゴスチ
ル什剤と反応する。次に、支持体を保膜さ才またヌクレ
オシドで処理する。亜すン酸ズステル〃よは酸什プれて
リン酸エヌテルとなり、そじて５′−ヒトクキシル保護
基は第２のヌクレオシドから除去される。次いで、同一
サイクルの反

【、ず彦わち亜すン醪エステル什剤による
処理、他のヌクレオシドによる処理および酸什によって
遼錯延長が行われる。合成の最彼では、オリゴヌクレオ
チドを支持体からはか［１、デブロッキング〔封鎖解除
〕し、そして精製する、 この方法により、オリゴヌクレオチドは中８度の温度で
合成することが可訃である。この合成は単一の容器内で
？ｉらことが可能であり、そしてオートメーションに適
合させることが容易である。 更に大過剰の反応物費を用いることができ、そして反応
後に容易に回ＩＩｖできる。 本発明に、ｖｊｔげ、オリゴヌクレオチドを固相支持体
上に合成１−ることかできる。木明粁１デ：中−Ｃ）ｎ
いるように、術語「オリゴヌクレオチドＪ　）ｊ、　ｒ
リボオリゴヌクレオチド」ｉらびに「デメキシリボオリ
ゴヌクレオチド」の双方を含むことをＸり：口するもの
で１）る。 本発明方法の紀１工程においては、ヌクレオシドが固ｔ
１・渋長体に結合される。一般原則として、固体支持［
１：目その中にう、）子を自由に波計させく、が、試薬
を非可逆的には吸１［ンしないものを本発明方法の支持
伺・とじて用い１１るものとする。好ましい支持体はシ
リカゲルである。結合はヌクレオシドの３′−ヒドロキ
シノ１基と支持体との間で起り、一方５′−ヒドロキシ
ル基はモノメトキシトリチルまたけヅメ１．キシトリプ
ル基のようなケ膜基によりイ〒藝きわているが、ジメト
キシトリチル基の方が好′牛しい。この保獲基（、ｒ、
除去され、そしてヌク１ノオシドは二′目能住亜すン酸
エステル化剤で処即さ１１て支持イ１に結合シタヌクし
／オシド・ホスホモノクロリグイｌを。 生成する。凡ゆるアルキルまたはアリールポスポジクロ
リダイト力・亜すン酸エステル什削とし゛（使用できる
が、メトキシジクロロホスフィンが好ましい。 この二官能性亜リン酸エステル化剤はヌクレオシドに直
接添加することもできるし、あるいはそれを最初にテト
ラゾール誘導体に転換することによって変性することも
ＯＪ能でｔ〕る。この方法によって亜リン酸エステル化
剤を変性することは２個の隣接するオリゴヌクレオチド
か間に牛じＷる５′−５′架橋結合の生成を阻止し得る
ものである。この秤の架橋は固体支持体に対するヌクレ
オシドの配合が節度のある少量（約３（）μモル／ｆ）
では大きな問題とはならないと居われるが、ヌクレオシ
ドの配合がより大きくなれば、重大な問題となる可能性
がある。亜リン酸エステル化剤の転換はヌクレオシドに
添加する以前にそれをテトラゾールと直接反応させるか
、またはヌクレオシドを亜リン酸エステル化剤で処理す
る以前にテトラゾールをそのヌクレオシドに添加するこ
とによって？ｊうことかできる。 ヌクレオシド対面リン酸エステル化剤のモル比は通常的
１：１０乃至約１：２０、好ましくは約１＝１５である
。反応渭合物は商機に振とうおよび遠心分離して良く、
そして過剰のホスホジクロリダイトを除去する。全反応
時間は一般に約２乃至約１０５）間の範囲にある。 亜すン酸エステル什剤をテトラゾールで変性する場も、
亜すン酸エステル什剤対テトラゾールのモル比は通常的
１＝２乃至約】：１０で夛、す、好ましくは約１＝３で
ある。本発明の実施態様についての反応条件ＬＬ通ツマ
；−１温 約１５分間である。 亜リン酸コースチル化剤による夕ｎ１理に続いて、支持
体を過剰の第２ヌク１．−オシドと反応させる。一般に
この１え応は約２７℃で約１（）乃至１５分間進行さぜ
る。第２のヌクレオシドによる反応に引続いて、ヌクレ
オチド亜すン酸エステル間結自（１１１ｔｃｔｎｕｃｌ
ｒ！ｏｔ　１ｃｌｃ　ｐｈｏｓｐｂｉ　ｔｅ　ｂｏｎｄ
ｓ　）は・ｌＰｔ用の技法、たとえばテ］・ラヒドロフ
ジンとルチジンの水溶液中σ）ヨウ素によってリン酸エ
ステルに酸化される。う−トラヒドロフラン対ルチジン
対水の割合は約２：ｌ＝１であるのが好オしい。 次いで、第２タクレオシドの保護基を除去する。 所望によりダイマーは支持体からはがし、デブロッキン
グし、そして精製してもよい。この反応の収率は代表的
には約９５％である。 ａ１鎖延艮は、土に概略述べた引続く同一ザイクルの反
応、すなわち亜リン酸エステル化剤によるヌクレオシド
の処：Ｎｌ！　％他のヌクレオシドによる処理、および
亜リン酸エステル基の酸化によって行えばよい。合成の
ｉｔでは、オリゴヌクレチドを支持体からはがし、デブ
ロッキングし、ソシて精製するのが有利である。 過剰の亜リン酸ニスデル化剤を除去するための中間の遠
心分離工程は水分を反応ｍ合物中に導入する可能性がｔ
，る。そしてシリカおよび亜リン酸エステル化剤をＳ４
ｊする反応漬合物を遠心分離することは必ずしも所望の
最終メリゴヌクレオチドの高収率を保１１ｉｆするもの
ではないことが児用された。従って、操作は遠心分離工
程を省略して、上に略ｍｌくしたように？）えばよい。 とべいで、オリゴヌクレオチドを慣用の醸化技法によっ
て酸化した徴、支持材を！１機溶剤で数回に亘り十分子
洗浄すればよい。好ましい実施態様に１・いて、支持体
け５（）チテトラヒドロフラン水溶液で洗浄し、久いて
テトラビトロフランおよび最稜にエーテルで洗浄−罐る
。前述のように、所望のダイマーの収出は約９に乃至１
　１１　＋１％である。このような高収率は、たとえ過
剰の亜リン酸エステル化剤か存在したどし又も、所望の
５’−　３’結冶は過剰のヌクレオシドを用いることに
よって達成し？Ｕることを示１，ていイ）。 更に、尺応渭合部よりの士澄み圧ついての薄１（ン；ク
ロマトクラフィー（　Ｔ’　Ｌ　Ｃ　）分析は添加した
ヌクレオシドの少々くとも約８（１％がその一＆　ｉ　
ｆｌ　普していることを示唆しており、Ｋｉｒって所望
によりこれを回；１７し、かつ可使用することが可能で
羽、る。 」−アＦしたように、先行技術により教示色オしたｒ一
点からすれば、この方法には多ぐの利巧がｋ・イ１．。 すなわち、この方法は伺らの予備成形した出発イ］料を
も！Ｖ要と・せず、また従来用ｎＦでｋ）つたσ）より
もはるかに穏−やかな温度で行うことができ、更に単−
の容器で行うことが用油である。該方法はまた、オート
メーションに容易に通塔させることができる。リポオリ
ゴヌクレオチドおよびデオギシリボオリゴヌクレオチド
の両者を、この方法で合成することができる。最後に、
過剰のヌクレオノドを一度反上己を行ってから回ｊ国で
きるので、これによって本方法は非ルにｌ、テ済的とな
る。。 下記の実施例は本発明の方法を例示するものであるが、
これを限定しようとするものではない。 〔実施例■〕 −の調製 チオギンチミジン（・１μモル）を担持″４−イ、ンリ
カ〔［パイダク（Ｖ３ｚｒｌａｌ＜）　ＴＰ　Ｊ、１　
（１１１＋＋＋４　］　’＋’無水ピリジン（（１，２
ｍｌ）　中のメトキシジクロロホス−Ｉイン（６０μモ
ル）により室Ｉｎで処理した。反応混合物は急激に振と
うし、かつ遠心分離した（遠心分離を含む全反応時間は
昂温で２分間であったぁ上澄みを除去し、そして１０倍
過剰の５′−ジノＩ・キントリチルシチ；ニンをピリジ
ン（１１，２ｍｔ　　）　中でシリカに添加した。室温
で１ｏ分稜、反応混合物ヲ、テトラヒドロフラン／ルチ
ジン／水（２：１　：　１　）１合物中のヨウ累で酸化
した。デプ〔νツキングした彼、トリチル基およびＨＰ
　Ｌ　Ｃの１すを去によって力出したこの反応の収ｘ４
ま９５％”Ｔ’　、ＤＩ　１゜ことが判明した。 〔実施例■１ 一〇Ｎ”ｄ　Ａ’ソ デオキシチミジン（４μモル）をＪＩ＋１．’７″１７
−シリカ（［パイダクＴ　１１４１　＋１１１　ｍ９）
をピリジン（（１，２ｍ１）中のメトキシジクロロボス
フィン（６（＋μ千ル）で０　℃、１０勺間、まＬ−け
室温１で１〜２勺間処理しＩ、−０次に、ピリジン（＋
１．２乃至０．２５川ｔ）中の５′−ジノｌ−キ／）−
リー：ｆ　Ｊｌ／　シチジン（２ｔｌ　Ｑ　７（モル）
な遠心うｄｌｌなし゛て°反応ｍ合物に添加した１゜室
温で１１３分俵に、テトラヒト ン／水（２：１：１）中σ）ヨウ？うによー）゛〔酸化
））Ｘ行われた。次いで、シリジノを５１）乃テトラヒ
１゛１７フラン水溶液、テトラヒトぽコフ′ンン、子（
５てろごｊにエーテルで十分に洗浄した。収率は４　９
　８　ｎｍにおけるトリチルカチオンの吸収によって９
５％とｎ出きれた。更に、この収率をデブロッキング仕
の逆相Ｈ　Ｐ　Ｌ　Ｃ分析により確認した。（　５　０
　℃で、ｌｌＱ＆ｉｊ水酸化アルミニウムにより、引続
き８。 チ酢酪による処理、１２〜１６時間。）ダイマーのピー
クはＨＰＬＣ分析の間にまとめられ、またＵ　Ｖスペク
トルはコンビューク生成スペクトルによって大変良好で
））ることがｈ３められた。 〔実施例■〕 曲のダイマーを実施例■の方法により１ｍ　？！した。 各ダイマーの個別の収率を１表に示す。 第　１　表 化合物　　　　　　　　　　個別１ヌ皐（％） ｄ−ＣＰＣ　　　　　　　　　　　　Ｑ　６ｄ−ＧＰＴ
　　　　　　　　　　　　Ｒ　７ｄ−ＣＰＴ９５ ｄ−ＧＰｏ　　　　　　　　　　　　９　８ｄ−ＣＩ）
Ｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　８４ｄ
−ＧＰＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
８　　１［実施例ＩＶ　］ Ｎ　−　ヘンジイルデオキシシチジン（４。２μモル）
をｉｉｉ持するンリノノ（１パイダク゛１゛Ｐ」、１　
（１　（ｌ　ｒル？〕ｊ？よびテトラゾール（６３０μ
モル）をピリジンで共ＨトｒＪｔ合させた。このシリカ
およびテトラゾールをピリジン（ｏ．３ｍ？）中のメト
キシジクロロボスフィン（６３μモル〕によつ１０Ｘ：
で１０う）間処理した。次に、５′−ジメトキシ！・リ
ヂ／ｌ州イミジン（　２　１　＋１　、ｏモル）をこの
ｌｖ応ｐ合物に添加した。ｎ（温で１５う）後、反応混
合物を′ｒ［′）ビトロフラン／ルチジン／水（２：ｌ
：１）中のヨウ（により酸化した。シリカを５（）襲テ
トラヒドロフラン水Ｒ＋　液、テトラヒドロフラン、モ
してｉ　Ｖｔ　＋／Ｃエーテルで十う）Ｖこ洗浄した。 ＩＩＸＩ率は、４９８旧】１におけるトリチルカチオン
の吸収により９８ダらであることが）１出された。 〔実施例■］ の合成 Ｎ−ベンゾイルデオキシシチジン（４，２μモル）をＪ
旦持するシリカ（［バイダクＴＰＪ、ｉｏｏｍＦ）およ
びテトラソール（６３０μモル）をピリジンで共沸混合
させた。θζいで、このシリカおよびテトラゾールをピ
リジン（１１，３ｎＬｊ）中１５倍量のメトキシジクロ
ロボスフィン（６３μモル）により０℃で１０分間処理
した。この反応混合物にピリジン（０、３ｍ　ｌ）中５
（）１音量の５′−ジメトキシトリチルサイミジンを添
加した。室温で１５分後、テトラヒドロフラン／ルチジ
ン／水（２：ｌ：ｌ）中のヨウ累によって酸化を行った
。次にシリカを丈す山側ＩＶにおけろように洗浄した。 トリチル基をりｒｌｊＯポルノ・中５％トリクロロ酢酸
で処理することによって除去ｌまた。このシリカをクロ
ロホルムで十分に洗浄した、。 このサイクルを反覆して鎖をペンタマーシーケンスＴ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−ＣＫ延長させた。試薬の割合は、全合成を
通じ′Ｃ一定の゛ま１としたが、ピリジンの容量は必要
に応じて調整した。 ・Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃペンタマーの合成に関する全収率
は５３％であった。 〔実施例ＶＴＩ 全収率２４％をもってオクタマーＣ−Ａ−へ一〇−Ｃ−
Ｔ−Ａ−Ｇを実施例ｙの方法シτより合成した。 〔実施例ｖｎ） Ｎ−イソブチルテオキシクγノシン（２，９μモル）を
４［１す寺するシリカ（１゛バ・ｆ、タフ’ｌ’　ＩＩ
　Ｊ、１旧１ｍＷ）および４５倍量のテトラゾール（１
３（ｌμ七ル〕をピリジンで共ｓｉ自−きせた。シリカ
を１５倍量のメトキシジクロロボスフィン（４３μモル
）によって０　℃で１０分間処理する以前に、シリカ−
テトラゾール混合物に無水ピリジン（（１、１ｍ　７　
）を添加Ｉ７た。 ピリジン（１、２ｍｌＪ［１の５′−ジメトキシトリチ
ル−Ｎ−ペンゾイルデオキシアテノンンを添加した。 室温で１５分俵、テトラヒト［ｌフラン／′ルチ７；ン
／水（２：ｌ：ｌ）中のヨウ累により酸化が行われた。 次に、このシリカを５０％テトラヒドロフラン水溶液、
デトラヒ倉°ロフランおよびエーテルで洗浄した。収１
′け４９８　ｎｍにおりるトリチルカチオンのトリ千ル
吸１しに基づいて約１（）０％であると泗出きれた。 〔実施例■〕 Ｎ−イソブラリルデオキシグγノシン（２，９μモル）
を担持１−るシリカ（［バイダクＴ　Ｐ　Ｊ　、Ｈｌｔ
）ｍＶ）をメトギシジクロロホスフ・イン（４３，５μ
モル）を含有するピリジン＜１．２ｍｌむよびテトラゾ
ール（１３０マイクｒノモル）によりに１℃で１５分間
処理した。この反応ｍ合物に、ピリジンＵ−２ｍｔ中の
５′−ジメトキシトリチル−１１−ペンゾイルアテノシ
ンを添加した。室温で１５ｚ）Ｍ、この反応ｍ合物を、
上述のツ、！ｈ印例に従って酸化かつ洗浄した。この＋
１５．率１ｊ、　、１つｌ　１１　＋１％であることか
初出された。 実施例 −Ａ　−Ｇ　ｏ）合成 Ｎ　−−１ンブチリルヂオキシクアノンン（１４，５μ
モル）を１旦持するシリカ（「バイダク””　Ｊ　、４
ｉｔｌｌ１ｍｆＩ）を無水ピリジン（２×１１１　ｍ、
／）ｉｓヨび劫、ノ）＜ジエづノ１エーテル（１（ｌ　
ｍｌ）で洗浄することにより乾を゛にした。このシリカ
は更に、ｆｊ・月１′するル１兵空テシケータ中で乾す
ユした。 −１５倍訃過剰のテトラソール（６５２μモル〕を（ｉ
　℃゛でピリジン１　ｍｌ中に溶解【７た。１５イＡ　
ｆｉｉ過剰のメＩ、キ７ジクロロホスフィン（ｚ　１７
　ｔｔ七ル）ｔ、・子トランールーピリジン溶液に添加
し、次いでこの溶液なシＩＪ　ノ＋に添加した。０℃１
′１５つ）後、ピリジン１．０ｍｌ中の、５０　’ｌｆ
’ｆ貴過剰の５’　　（’−（ジメトキシトリチル）−
Ｎ−ペンゾイルデ思キシアデノシンを添加した。Ｊゾ応
は室瀞１で１５う）間継ｔ’ｊｃＬ　、次いでその反応
ｒＲ合駿１を上述の実音Ｊ例による方法に従って酸化お
よＯ−ｂ〜、浄した。シリカはりＩｊ　ｃＪポルム中５
％トリクロ【・酢酸Ｆｉ−，ｉり処理してジメトキシト
リチル基を除ムする。りυロホルノ、スＩＩＧ水ヒリジ
ンおよびり１）１ｒ水ニー・プル１！汐、浄した後、こ
の溶液は次のヌクレオシドの添加に対し準備が整ったこ
とになる。 残りの１１飼のヌクレオシドを上に示したように厳密に
添加した。全合成を通じて、試薬の量と＠度は同一に僅
持した。 収率の定性的計画は、名添加彼に５係トリクロ。 ０酢酸処理により？１１られるオレンジ色に基づいて↑
ｊわれた。全１の場合Ｖこおいて、収Ｔは優秀であつ　
Ｉこ０ Ｄｉ−の定ｆ的な５）出６１）−ｒセトニトリル中の２
％ベンゼンマルホン１官によって厳密に秤量した量のシ
リカを処理し、そしてｒ１９８　ｎｍにふ・けるトリチ
ルプツチオンの吸１［Ｓ（をｆｉ、Ｖ、　１１川するこ
とにより行われた。数段階における軛ｊし率を下に示す
。 ２　　　　　　　　　　１０１） ５　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９　（）９
　　　　　　　　７８〜８３ １３　　　　　　　　６０〜７（）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１（ａ）　５’−ヒドロキシル基が保鰻基により保
   穫されている第１ヌクレオシドを該第１ヌクレオシドの
   ３′−ヒドロキシル基をブ１して固相支持体に結合させ
   、 （ｂｊ前記第１スクレオシドの５′−ヒドロキシル上の
   保護基を餘去し、 （ＣＪ前記５′−ヒドロキシル基を二官能性亜リン酸エ
   ステル化基と反応さ・辻、 （ｄ）５’−ヒドロキシ／Ｌが仙；数基で促護されてい
   る次のヌクレオシドを、該次のヌクレオシドの３′−ヒ
   ドロキシル基を前ＮＬｉ　ｔｒｒ　１ヌクレオシドの５
   ′−ヒドロキシル基に連Ｔ’Ｒ１することによって、前
   記支持体に結合させ、 （ｅ）前記両ヌクレオシド間忙形成された亜リン酸エス
   テル結合を酸化し、 （ｆ）前記支持体に対し所望数のヌクレオシドか・付は
   加えられるまで、上記工程ｂ）乃至ｅ過ｌν１′−シ、
   （−前記支持体からオリゴヌクＬ・オチドをは力；し、
   そして （ｈ）　前記オリゴヌクレオチドをデブロッキングし、
   かつ精製する工程を含んで成る。ことを特徴とするオリ
   ゴヌクレオチドを固体支持体にに自戒する方法。 （２１前記工程（（り中のＴ　”ｌ−ｒ　１ｉ［’：　
   ４’を亜リン酸エソチル化剤を、ヌクレオシドの前記５
   ′−ヒドロキシルと１ゾ応させる以前に、テトラゾール
   の誘導体に転換させる特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ＋３１前記二官能性亜リン酸ニスデル什剤で処理される
   以前に、Ｆ＋ｉＪ記ヌクジヌクレオシドラゾールと混合
   される特許請求の範囲第１項記載の方法。 （４）前記固体支持体がシリカである特￥ｌｌ１ｌｆｉ
   求の範囲＠１、ｌＪ２または第３ＪＪｉ記載の方法。 （５）前記保護基がモノメトキシトリチル基てあイ）特
   許請求の範囲第１、第２′または第３珀ｆｔｉ：岐のＪ
   ｊ法。 （６１前記保膵基がジメトキシトリチルである特許請求
   の範囲ｔＲ１、ｆｌｒ　２“またけ第３０記軟の方法。 （刀前記二官能性亜リン酸エステル化剤がアルキルｔ？
   、−はアリ−Ａ・ホスポジクロロダイトである特ｒ：”
   ｒ　１１！”！求の範囲第１、ＳＩＴ　２または第３項
   記載の方法。 （８）前記二管能１・“ｌ：化リン酸エステル化剤がメ
   トキシジクロロポスフィンである特許請求の範囲第１、
   第２または第３項記載の方法。 （９）ヌクレオシド対面リン酸エステル化削のモル比が
   約１　：　１　（ｌ乃至約１＋２０の範υ１１に及ぶ特
   許請求の範囲＃ｎ　１　％　”ＩＴ　２または第３項記
   載の方法。 （１１ヌクレオシド対亜リン酸エステル化剤のモル比が
   約１　：　１５　テ（ｂｒ　ル４’Ｆ　ＦＦ　！ｉ’ｌ
   　求］節囲２ｆＴ　１　％　ｒｎ　２または第３項ＩＷ
   載の方法。 ０１）亜すン酸エステル化剤対テトラゾールのモル比が
   約ｌ：２乃至約１　：　１　（Ｉの範囲に及ぶ特１ｉｆ
   ｔ°請求の範囲第２項゛またはｓｅｘ　３ｍ記載の方法
   。 （１３亜リン酸エステル化剤対テトラゾールのモル比が
   約１＝３である特８′１’請求の範囲１！　２　ｇＪ−
   または第３項記載の方法。 ０ｊ反応が約（１℃乃至約２７℃Ｔ　ｒ−ｉわねｉ＋　
   ’ｌ’ｒ　ｆ′ｌ　ｆｉｌ’！求］範ｆｉｌｌ　ＰｉＴ
   　ｌ、　Ｊｌ￥２１　’ｊ’ニー　１’、ｔ、　ｆｎ　
   ３　〕’Ｅ　記１１ｉνの方法、１０００反応が（１℃
   でイｊわれＺｒ　Ｑ’ｉ　ｔｈ’ｒ　Ｎｉ’ｌ　７Ｊｈ
   　ｃｎ　範囲ｔ１￥１、第２または第３項■１１載の方
   法。 （１鴇過剰のヌクレオシドが抽出法により回１１■１″
   き、そして再使用できる特旧Ｌ１１求の範囲ｒ４Ｔ　１
   　、　ｒｌ’ｓ　２　’！たけ、第３項記載の方法。