JPH0643438B2 - 固相上のいくつかのオリゴヌクレオチドの同時合成方法 - Google Patents

固相上のいくつかのオリゴヌクレオチドの同時合成方法

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JPH0643438B2
JPH0643438B2 JP59005829A JP582984A JPH0643438B2 JP H0643438 B2 JPH0643438 B2 JP H0643438B2 JP 59005829 A JP59005829 A JP 59005829A JP 582984 A JP582984 A JP 582984A JP H0643438 B2 JPH0643438 B2 JP H0643438B2
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Description

【発明の詳細な説明】 純粋な研究成果は別として、化学的に合成されたオリゴ
ヌクレオチドは新しい生物工学的方法の工業的発展によ
りますます使用されてきている。興味ある蛋白に対する
情報を担つている遺伝子の単離、変化（突然変異）及び
全合成、又はれこれらの蛋白の表現を制御する原因とな
るＤＮＡ領域の単離、変化（突然変異）及び全合成にお
けるこのような核酸フラグメントの使用は、そのような
蛋白に微生物学的製造に対する新しい可能性を切り開く
ものである。
本明細書においては、オリゴヌクレオチドはオリゴリボ
ヌクレオチド及びオリゴデオキシリボヌクレオチドであ
るとして解するべきである。オリゴヌクレオチドの化学
的合成は１又はそれより多くのヌクレオチドから成る適
当に保護された単位又はブロックを結合させることによ
つて数段階で行われる。３′−５′−ホスホデエステル
結合を結合させる化学において互いに異なる種々の合成
方法は従来技術に属するものである。それらの例を以下
に列挙する。
(A)ホスフェードジエステル法：Nucleic Acids Researc
h １０（１９８２）６５５３〜６５７０、Ｐ．６５５
３、１０行参照 ホスフェートトリエステル法：同上、Ｐ．６５６１〜６
５６２参照 ホスフアイトトリエステル法：同上、Ｐ．６５６３参照 (B)５′−ホスフエートの３′−ヒドロキシ基への結
合、又は３′−ホスフエ−トの５′−ヒドロキシル基へ
お結合：同上、Ｐ．６５６１参照 (C)ブロツクとしてのモノヌクレオチドの使用、ブロツ
クとしてのジヌクレオチドの使用、又は２より多くのヌ
クレオチドからオリゴヌクレオチドまでのものから成る
ブロツクの使用 オリゴマーの成長する鎖が一般に化学的に結合されてい
る急速な合成は固相上でメリフイード法に従つて、延長
されていないそれらの末端によつて、肉眼で見える固体
支持体材料の形の固相に対して行われる。次いで鎖を延
長又は結合する反応が支持体材料の表面で行われ、支持
体に結合したままの反応生物及び余分な反応体や試薬は
洗浄によつて除去される。
今まで、非常の多くの支持体材料がかかる合成に使用さ
れてきたが、それらが互いに調和されることが支持体材
料及び合成方法にとつて必要であることは文献にも記載
されている。当業者はこのような調和方法に精通してい
る。これまで使用されたすべての支持体材料に共通して
いる点は、それらが顆粒の形で使用されていることであ
る。例えば、オリゴヌクレオチドはこれまで少量の顆粒
上に個々に合成されてきた。したがつて、仮にｍ個のヌ
クレオチド単位の鎖長を有するｎ個のオリゴヌクレオチ
ドがこの従来法に従つて製造されたとすると、ｎ×ｍの
合成工程が必要である。
本発明の課題は、合成工程の数を従来技術と比較して減
少することのできる、固相上のいくつかのオリゴヌクレ
オチドの同時合成方法を提供することにある。この課題
は、固相として２つ又はそれより多くの支持体を平らな
材料の断片の形で使用することによって任意に異なる配
列を有する２種以上のオリゴヌクレオチドを合成するこ
とを特徴とする、固相上のいくつかのオリゴヌクレオチ
ドの同時合成方法であって、かつ以下の特徴（ａ）〜
（ｂ）からなる該同時合成方法によって、解決される。
（ａ）各反応器に１種の出発ヌクレオチドブロックが供
給される、少なくとも１つの反応器を使用して出発ヌク
レオチドブロックと反応器当たり少なくとも１つの支持
体と反応させること、 （ｂ）該出発ヌクレオチドブロックを結合した支持体
を、各反応器に１種のモノヌクレオチドまたはヌクレオ
チドブロックを有した反応器において、合成すべき複数
種のオリゴヌクレオチドの配列に従って該モノヌクレオ
チドまたはヌクレオチドブロックと反応させること。
（ただし、（ｂ）における反応器の個数は、（ａ）にお
ける反応器が１個の場合は複数、（ａ）における反応器
が複数の場合は１個以上である。）。平らな材料とは、
互いに垂直である３次元の中の１つが実質的に残りの２
つよりも小さい場合の材料であると解するべきである。
平らな材料からなるこれらの支持体は断片（セグメン
ト）として空間的に範囲を限定された形、例えばシート
又は細片（ストリツプ）の形で使用される。平らな材料
は、例えばセルロース，合成材料又はガラス、あるいは
このタイプの補強（特に繊維補強）材料から構成されて
いてもよい。平らな材料は前記材料をベースとして紙で
あつてもよい。かかる平らな材料の例は紙又はガラス
繊維で補強した紙である。平らな材料は、例えばセル
ロースのようにそれ自体本質的に出発ヌクレオチドブロ
ツクに結合するのに適当であるか、又は当業者に公知の
方法で例えば先行技術から上記目的に対して部分的に変
えてもよい。
好ましい態様によれば、使用される平らな材料は液体反
応媒体及び（又は）そこに含有される反応体に対して浸
透性である。
本発明による平らな材料の使用は、いくつかの支持体が
１つ且つ同一の反応容器中で連続的に結合することがで
き、次いで汚染されることなく再び互いにきれいに分離
することができることを意味している。
例えば、本発明によるモノヌクレオチドからのオリゴヌ
クレオチドの合成において、その方法は次のようにして
行われる。すなわち、(a)出発ヌクレオチドに結合でき
る４群までの支持体を使用する。各群の支持体は少なく
とも１個の支持体からなる。該各群の支持体を出発ヌク
レオチドブロックとして機能する群内では同一の、群間
では互いに異なる出発モノヌクレオチドに結合させる。
（ｂ）互いに異なるモノヌクレオチドを含有する４種類
までの反応媒体を用意する。工程(a)から生じ、かつ出
発ヌクレオチドに結合した支持体を合成すべきオリゴヌ
クレオチドの配列に従つて群毎に反応媒体に導入する。
(c)選択した合成方法に従つて、脱保護工程が工程(b)に
先行してもよく、またブロツキング工程が工程(b)の後
に続いてもよい。
この方法において、合成すべきオリゴヌクレオチド鎖の
最初のヌクレオチドは、それ自体公知の且つ特有の支持
体材料に適合した方法に従つて該支持体に化学的に結合
される。一般にオリゴヌクレオチドは４種類の異なる構
成成分、すなわちリボヌクレオチドＡ，Ｃ，Ｇ及びＵ，
又はデオキシリボヌクレオチドＡ，Ｃ，Ｇ及びＴのみか
ら成る。仮にモノヌクレオチドをブロツクとして使用す
ると、異なる出発ヌクレオチドを担持した４群の支持体
フイルムが必要であり、かつ各群は１個又はそれより多
くの支持体フイルムを包含してもよい。仮にジヌクレオ
チドをブロツクとして使用すると、４２＝１６個の異な
る担持支持体フイルムが必要である。
各々のオリゴヌクレオチドは１群の支持体又は１群のセ
グメントの支持体フイルム上で合成される。この目的の
ために、出発ヌクレオチドに結合した支持体フイルムの
遊離官能甚は通常ブロツクされ、かつ出発ヌクレオチド
は脱保護される。支持体の群は、同一のブロツクが結合
されるべき支持体に対して、１種類かつ同一の液体反応
媒体に一緒に導入される。モノヌクレオチドブロツクを
用いるときは、４種類の異なる液体媒体が必要である。
結合反応は適用し得る特定の合成法に従つて行われる。
結合反応が行われた後、通常は再びブロツキング及び脱
保護反応が行われる。次いで次の結合サイクルが続き、
この目的のために支持体フイルムが合成すべき配列に従
つて群毎の４種類の異なる液体反応媒体中に再び分配さ
れる。最後の結合工程の後、すべての支持体フイルムは
分離され、オリゴヌクレオチドは支持体フイルムから分
離され、脱保護され、そして単離される。
仮に、例えば本発明に従つて２〜ｎ個のモノヌクレオチ
ドから成るヌクレオチドブロツクからオリゴヌクレオチ
ドが合成される場合には、ｎは２より大きい整数、例え
ば３〜８であり、その方法は次の通りである。すなわ
ち、 (a)出発ヌクレオチドブロツクに結合できる支持体の群
を使用し、各群は１種又はそれより多くの支持体から成
り、該各群の支持体は群内では同一の、群間では互いに
異なる出発ヌクレオチドブロツクに結合される。
(b)異なるヌクレオチドブロツクを含有する液体反応媒
体を複数用意し、工程(a)から生じ且つ出発ヌクレオチ
ドブロツクに結合される支持体を合成すべきオリゴヌク
レオチドの配列に従つて群毎に反応媒体に導入される。
(c)選択された合成方法に従つて、脱保護工程が工程(b)
に先行してもよく、またブロツキング工程が工程(b)に
続いてもよい。出発ヌクレオチドブロツクを構成するモ
ノヌクレオチドの特定数、支持体の群の特定数、反応媒
体の特定数、及びヌクレオチドブロツクを構成するモノ
ヌクレオチドの特定数は次表に示す通りである。
本発明によれば、Ｚ個のヌクレオチド単位の鎖長を有す
るＹ個のオリゴヌクレオチドのための合成工程の数はＹ
×Ｚ（従来技術）から４×Ｚ（モノマー添加の場合）
に、又はＹ×Ｚ／２から１６×Ｚ／２（ダイマー添加の
場合）等に減少する。したがつて、合成工程の数はＹに
左右されるのではなく、合成すべきオリゴヌクレオチド
の長さ及び使用されるブロツクの長さに左右される。
第１図によれば、工程(a)において４個の支持体（Tr）
が異なる出発ヌクレオチド（A(S)，C(S)，G(S)又はT
(S)）にそれぞれ結合される。第１図に示されるよう
に、工程(b)で用意すべき液体反応媒体の数は使用され
るブロツクの大きさに左右される。第１図によれば、そ
れぞれ１個のヌクレオチドを有するブロツクに対しては
４種類の反応媒体が必要であり、それぞれ２個のヌクレ
オチドを有するブロツクに対しては４２＝１６種類の反
応媒体が必要であり、それぞれ３個のヌクレオチドを有
するブロツクに対しては４３＝６４種類の反応媒体が必
要である。このことは所望ならば勿論拡大して論ずるこ
とができる。
以下、第３図に従って本願発明の方法の一例について具
体的に説明する。
１は夫々を区別可能なように１からｎまで番号が書き込
まれた支持体であり、既に出発ヌクレオチドブロックと
して１個のモノヌクレオチドが各支持体に結合されてい
ると仮定する。２は、反応媒体であり、４個の用意に収
められたＡ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニ
ン）、またはＴ（チミン）の塩基を有する各モノヌクレ
オチド溶液（以下、単にＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔで示す）が使用
されるものとする。
まず、支持体は、所望のオリゴヌクレトチド配列の２番
目の順序に従って反応媒体へ４群に分配される。即ち、
支持体−１、支持体−３、……は、Ｃへ、支持体−２、
……、支持体−（ｎ−１）は、Ａへ、支持体−４、……
支持体−ｎは、Ｔへ、支持体−５、……、はＧへ各々分
配され、各反応媒体中に少なくとも１種からなる支持体
の群が形成される。そして、各群毎に、反応を行い、鎖
長２のオリゴヌクレオチドが各支持体−１〜−ｎ上に合
成され、各反応媒体から各支持体を取り出す。その後、
３番目の塩基に対応した反応媒体へ各支持体を前記と同
様に分配し、２番目の塩基の次に３番目に塩基がくるよ
うに結合させた後、各支持体を取り出し、以下、同様に
して合計ｍサイクルの反応を行うことにより、支持体に
（ｍ＋１）個の鎖長の塩基配列を有するｎ種のオリゴヌ
クレオチドが４×ｍ回の反応で合成される。
即ち、上記４個の反応媒体は、ｍ回の反応に繰り返し使
用され、支持体は、各反応毎に各容器に少なくとも１種
以上が分配され、異なるオリゴヌクレオチド配列の支持
体が共通の反応媒体で共存され得るために反応回数の低
減化が達成されるのである。
完成したオリゴヌクレオチドの２番目以降の塩基配列を
支持体毎に以下に示す。
支持体−１ ：ＣＡ……Ｇ 支持体−２ ：ＡＧ……Ｃ 支持体−３ ：ＣＴ……Ｇ 支持体−４ ：ＴＡ……Ｃ 支持体−５ ：ＧＣ……Ａ ・ ・ 支持体−（ｎ−１）：ＡＴ……Ｇ 支持体−ｎ ：ＴＣ……Ｇ したがつて、本発明によるオリゴヌクレオチド合成のた
めに公知のオリゴヌクレオチド合成方法を使用すること
は可能である。本明細書において、用語「出発ヌクレオ
チドブロツク」は１又はそれより多くのヌクレオチドを
有するブロツクのことを言う。「出発モノヌクレオチド
ブロツク」において、ヌクレオチドのみがヌクレオシド
によつて置換されることができ、そして「出発オリゴヌ
クレオチドブロツク」において、特に支持体材料に結合
した最初のヌクレオチドがヌクレオシドによつて置換さ
れることができる。第２図は、どのようにしてセルロー
ス（例えば紙）から成る支持体材料がサクシニル出発
ヌクレオシドに結合し、次いでプロセスフリーのＯＨ基
がブロツクされるのかを示すものである。その後、出発
ヌクレオチドの５′−ＯＨ基は保護され、そして遊離の
０Ｈ基が再びブロツクされたモノマーブロツクの３′−
ホスフエート基に結合される。
本発明を次の例によつてさらに詳細に説明する。
支持体として紙フイルムを使用し、出発ヌクレオチドを
サクシニル架橋によつてこれらのフイルムに結合した。
縮合剤としてメシチレンスルホニル ニトロトリアゾリ
ド を使用するホスフエートトリエステル法をオリゴマ
ー化のために使用した。それぞれの場合においてニトロ
メタン（１％水）中の臭化亜鉛で分離される一時的な
５′−保護基としてモノメトキシトリチル基を選択し
た。鎖中に８個及びそれより多くのヌクレオチドを有す
るオリゴヌクレオチドが得られる。収量は従来技術のそ
れに匹敵するものであつた。
式図の符号の説明； Ｐ＝支持体材料（ポリマー、この場合セルロース） Ｂｎ＝ヌクレオベースＮ６−ベンゾイルアデニン Ｎ２−イソブチリルグアニン Ｎ４−アニソイルシトシンチ
ミン MeOTr＝モノメトキシトリチル ＭＳＮＴ＝メシチレンスルホニル ニトロトリアゾリド Py＝ピリジン Ac＝アセチル MeNO2＝ニトロメタン
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明によるオリゴヌクレオチドの連続的合成
方法の一実施例を示す工程(a)及び(b)の説明図、第２図
は固相としてのセルロース上でホスフエートトリエステ
ル法によるオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成方法
を示す式図である。第３図は、本願発明の方法の一態様
を説明するための図である。 符号の説明 １……支持体 ２……反応媒体
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 実開 昭58−155352（ＪＰ，Ｕ) 実開 昭58−155353（ＪＰ，Ｕ)

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】固相として２つ又はそれより多くの支持体
    を平らな材料の断片の形で使用することによって任意に
    異なる配列を有する２種以上のオリゴヌクレオチドを合
    成することを特徴とする、固相上のいくつかのオリゴヌ
    クレオチドの同時合成方法であって、かつ以下の特徴
    （ａ）〜（ｂ）からなる該同時合成方法。 （ａ）各反応器に１種の出発ヌクレオチドブロックが供
    給される、少なくとも１つの反応器を使用して出発ヌク
    レオチドブロックと反応器当たり少なくとも１つの支持
    体と反応させること、 （ｂ）該出発ヌクレオチドブロックを結合した支持体
    を、各反応器に１種のモノヌクレオチドまたはヌクレオ
    チドブロックを有した反応器において、合成すべき複数
    種のオリゴヌクレオチドの配列に従って該モノヌクレオ
    チドまたはヌクレオチドブロックと反応させること。 （ただし、（ｂ）における反応器の個数は、（ａ）にお
    ける反応器が１個の場合は複数、（ａ）における反応器
    が複数の場合は１個以上である。）
  2. 【請求項２】前記支持体は、セルロース、合成材料又は
    ガラスを基材とする任意に補強した（例えば繊維で補強
    した）平らな材料であることを特徴とする特許請求の範
    囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】前記支持体は、液体反応媒体及び（又は）
    液体反応媒体に含有された反応体に浸透性である平らな
    材料であることを特徴とする特許請求の範囲第１項又は
    第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】オリゴヌクレオチドがモノヌクレオチドか
    らそれ自体公知の方法で次の工程： （ａ）出発ヌクレオチドブロックに結合できる４群まで
    の支持体を用意し、各群の支持体は少なくとも１個の支
    持体からなり、かつ該各群の支持体を出発ヌクレオチド
    ブロックとして機能する群内では同一の、群間では互い
    に異なる出発モノヌクレオチドに結合させ、 （ｂ）互いに異なるモノヌクレオチドを含有する４種類
    までの反応媒体を用意し、工程（ａ）から生じ且つ出発
    ヌクレオチドブロックに結合した支持体を合成すべきオ
    リゴヌクレオチドの配列に従って反応媒体に導入し、そ
    して （ｃ）選択した合成方法に従って、脱保護工程を工程
    （ｂ）に先行させてもよく、またブロッキング工程を工
    程（ｂ）の後に続行させもよい、 の工程によって合成されることを特徴とする特許請求の
    範囲第１項〜第３項のいずれか１項記載の方法。
  5. 【請求項５】工程（ａ）において４２群まで又は４ｎ群
    までの支持体、及び２〜ｎ個のモノヌクレオチドから成
    る出発ヌクレオチドブロックを使用し、ｎが２より大き
    い整数、例えば３〜８であることを特徴とする特許請求
    の範囲第４項記載の方法。
  6. 【請求項６】それ自体公知の方法でオリゴヌクレオチド
    が２〜ｎ個のモノヌクレオチドから合成され、ｎが２よ
    り大きい整数、例えば３〜８であり、その方法が （ａ）出発ヌクレオチドブロックに結合できる支持体の
    群を使用し、各群が少なくとも１個の支持体から成り、
    かつ該各群の支持体は群内では同一の、群間では互いに
    異なる出発ヌクレオチドブロックに結合され、 （ｂ）異なるヌクレオチドブロックを含有する反応媒体
    を複数用意し、工程（ａ）から生じ且つ出発ヌクレオチ
    ドブロックに結合した支持体を合成すべきオリゴヌクレ
    オチドの配列に従って群毎に反応媒体に導入し、そして （ｃ）選択した合成方法に従って、脱保護工程を工程
    （ｂ）に先行させてもよく、ブロッキング工程を工程
    （ｂ）の後に続行させてもよい、 の工程から成り、出発ヌクレオチドブロックを構成する
    モノヌクレオチドの特定数、支持体の群の特定数、反応
    媒体の特定数、及びヌクレオチドブロックを構成するモ
    ノヌクレオチドの特定数が次表に示される通りであるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第３項の中のい
    ずれか１項に記載の方法。
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