JPS61152695A - 長鎖ｄｎａの合成法 - Google Patents
長鎖ｄｎａの合成法Info
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- JPS61152695A JPS61152695A JP59281645A JP28164584A JPS61152695A JP S61152695 A JPS61152695 A JP S61152695A JP 59281645 A JP59281645 A JP 59281645A JP 28164584 A JP28164584 A JP 28164584A JP S61152695 A JPS61152695 A JP S61152695A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は特定の蛋白合成の情傾を担う長鎖ＤＮＡの新し
い合成法に関し、更に詳しくは、４ないし８個の塩基配
列を有するブロックを原料として、いわゆる固相法を用
いることにより、アミノ化ＣＰＧを担体として使用して
、酵素の力に依ることなく純化学的に長鎖ＤＮＡを合成
する方法に関するものである。
い合成法に関し、更に詳しくは、４ないし８個の塩基配
列を有するブロックを原料として、いわゆる固相法を用
いることにより、アミノ化ＣＰＧを担体として使用して
、酵素の力に依ることなく純化学的に長鎖ＤＮＡを合成
する方法に関するものである。
（従来の技術）
合成遺伝子を用いる遺伝子工学的手法によるポリペプチ
ドの合成は、■構造遺伝子の合成、■この遺伝子の適当
なプラスミドへの組み換え、■生成キメラプラスミドに
よる適当な宿主の形質転換、及び■形質転換体の培養に
よる目的ポリペプチドの取得、という工程により可能と
なることが知られている。
ドの合成は、■構造遺伝子の合成、■この遺伝子の適当
なプラスミドへの組み換え、■生成キメラプラスミドに
よる適当な宿主の形質転換、及び■形質転換体の培養に
よる目的ポリペプチドの取得、という工程により可能と
なることが知られている。
また、近来ＤＮＡプローブの開発が新しい遺伝子工学の
手法として注目されるようになった。これは、ＤＮＡや
ＲＮＡが鋳型と鋳物との関係のように相補的な相手を見
つけて自ら二本鎖となる性質（ハイブリダイゼーション
）を応用し、既知の一本鎖ＤＮＡやＲＮＡとのハイブリ
ダイゼーションを起こさせることによって未知のＤＮＡ
やＤＮＡの転写産物であるＲＮＡを同定する手法である
が、このハイブリダイゼーションの応用によって感度の
優れた迅速的確な同定が可能となるから、病原菌、疾病
患者の血液や細胞から特定のＤＮＡやＲＮＡを遺伝子レ
ベルで検出することにより、正確な病名の診断に応用す
ることができる。従って、ＤＮＡはＤＮＡプローブとし
ての応用によつて診断薬としても重要な価値を見いだす
ことができるものである。
手法として注目されるようになった。これは、ＤＮＡや
ＲＮＡが鋳型と鋳物との関係のように相補的な相手を見
つけて自ら二本鎖となる性質（ハイブリダイゼーション
）を応用し、既知の一本鎖ＤＮＡやＲＮＡとのハイブリ
ダイゼーションを起こさせることによって未知のＤＮＡ
やＤＮＡの転写産物であるＲＮＡを同定する手法である
が、このハイブリダイゼーションの応用によって感度の
優れた迅速的確な同定が可能となるから、病原菌、疾病
患者の血液や細胞から特定のＤＮＡやＲＮＡを遺伝子レ
ベルで検出することにより、正確な病名の診断に応用す
ることができる。従って、ＤＮＡはＤＮＡプローブとし
ての応用によつて診断薬としても重要な価値を見いだす
ことができるものである。
上記した構造遺伝子としてのＤＮＡ、ＤＮＡプローブへ
の応用素源としてのＤＮＡは、その性質上その塩基配列
が長くなれば長くなるほど情報源として重要となりまた
ＤＮＡプローブへの応用範囲が拡大するが、その塩基配
列が長（なればなるほど合成することが難しくなるもの
であることが知られている。
の応用素源としてのＤＮＡは、その性質上その塩基配列
が長くなれば長くなるほど情報源として重要となりまた
ＤＮＡプローブへの応用範囲が拡大するが、その塩基配
列が長（なればなるほど合成することが難しくなるもの
であることが知られている。
従って出来るだけ長鎖のＤＮＡを出来るだけ容易に合成
する技術の開発が望まれていた。
する技術の開発が望まれていた。
ＤＮＡの合成においては、これまでは塩基の個数が１０
〜２０残基程度の比較的短いＤＮＡフラグメントをまず
化学的に合成し、これらを組み合わせることによって目
的とするペプチド合成の情報を担う二本鎖ＤＮＡの構造
全体を有するフラグメントの集合とし、しかる後これら
を適当な水溶液条件下にＤＮＡリガーゼという酵素によ
って結合するものであった。
〜２０残基程度の比較的短いＤＮＡフラグメントをまず
化学的に合成し、これらを組み合わせることによって目
的とするペプチド合成の情報を担う二本鎖ＤＮＡの構造
全体を有するフラグメントの集合とし、しかる後これら
を適当な水溶液条件下にＤＮＡリガーゼという酵素によ
って結合するものであった。
この方法によっては、ブロック縮合する元の単位が塩基
数１ （モノマー）、２ （ダイマー）又は３ （トリ
マー）の比較的短いフラグメントであり、８０残基程度
の長鎖ＤＮＡを直接合成することができなかった。
数１ （モノマー）、２ （ダイマー）又は３ （トリ
マー）の比較的短いフラグメントであり、８０残基程度
の長鎖ＤＮＡを直接合成することができなかった。
また、この方法によってはＤＮＡリガーゼという酵素を
使用することが必須であるため、遺伝子としての二本鎖
ＤＮＡを合成する場合には、二本鎖ＤＮＡを構成するす
べての塩基配列を一度に合成しなければならず、二本鎖
ＤＮＡを合成する過程においても必ずしも効率の良い方
法ではなかった。
使用することが必須であるため、遺伝子としての二本鎖
ＤＮＡを合成する場合には、二本鎖ＤＮＡを構成するす
べての塩基配列を一度に合成しなければならず、二本鎖
ＤＮＡを合成する過程においても必ずしも効率の良い方
法ではなかった。
本発明者らは上記の技術的欠陥を克服する目的で研究を
続けて来たが、いわゆる固相法のうちトリエステル法と
よばれる方法を応用することにより、支持体として１％
ポリスチレンを使用して、ブロック縮合する元の単位が
塩基数４ （テトラマー）又は５ （ペンタマー）のも
のを原料として縮合を繰り返すことにより、塩基数４６
程度のＤＮＡを合成することが出来た。
続けて来たが、いわゆる固相法のうちトリエステル法と
よばれる方法を応用することにより、支持体として１％
ポリスチレンを使用して、ブロック縮合する元の単位が
塩基数４ （テトラマー）又は５ （ペンタマー）のも
のを原料として縮合を繰り返すことにより、塩基数４６
程度のＤＮＡを合成することが出来た。
しかしながら、この方法によっても得られるＤＮＡはた
かだか塩基数５０程度であり、これを超える、例えば８
０ないし１５０残基程度の長鎖のＤＮＡの合成をするこ
とには技術的困難性があった。
かだか塩基数５０程度であり、これを超える、例えば８
０ないし１５０残基程度の長鎖のＤＮＡの合成をするこ
とには技術的困難性があった。
（発明が解決しようとする問題点）
上記の事実に鑑み、本発明者らは、
■より多くの遺伝情報を担うことができる長鎖ＤＮＡを
合成すること、 ■しかも有利な条件下に合成すること、に留意しつつ研
究を重ねた結果、ついに本発明に想到したものである。
合成すること、 ■しかも有利な条件下に合成すること、に留意しつつ研
究を重ねた結果、ついに本発明に想到したものである。
（問題点を解決するための手段）
本発明の要旨は、以下の諸点にある。
■ブロック縮合する元の単位が塩基数４ないし８（オク
タマー）のものであること。
タマー）のものであること。
■いわゆる固相法のうちトリエステル法を使用すること
。
。
■支持体としてアミノ化ＣＰＧ担体を使用すること。
以下に本発明の詳細な説明する。
縮合の元となる各ブロックは、従来の方法により各塩基
を液相合成することにより得ることができる。
を液相合成することにより得ることができる。
本発明に使用するアミノ化ＣＰ Ｇ （Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌｅｄＰｏｒｅ Ｇｌａｓｓ （Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２４＋ ７４７−７５０（１９
８３） ”）は、固相法の担体として使用する。このも
ののアミノ基に、デオキシチミジンを常法によす３′−
コハク酸エステルとしたものを結合させる。これがヌク
レオシド担体となる。この樹脂に順次目的とする各ブロ
ックを５′末端方向に伸長させる。縮合剤としては例え
ばメシチレンスルホニル−３−ニトロトリアゾリド（Ｍ
ＳＮＴ）を用いることができる。このようにして得られ
たＤＮＡは一本鎖であるが、二本鎖ＤＮＡとするために
必要な相補鎖側ＤＮＡは同様の方法によってたやすく得
ることができるし、また得られた一本鎖ＤＮＡの３′末
端領域に相補する短いフラグメン） （１０ｂ、ｐ。
ｌｅｄＰｏｒｅ Ｇｌａｓｓ （Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２４＋ ７４７−７５０（１９
８３） ”）は、固相法の担体として使用する。このも
ののアミノ基に、デオキシチミジンを常法によす３′−
コハク酸エステルとしたものを結合させる。これがヌク
レオシド担体となる。この樹脂に順次目的とする各ブロ
ックを５′末端方向に伸長させる。縮合剤としては例え
ばメシチレンスルホニル−３−ニトロトリアゾリド（Ｍ
ＳＮＴ）を用いることができる。このようにして得られ
たＤＮＡは一本鎖であるが、二本鎖ＤＮＡとするために
必要な相補鎖側ＤＮＡは同様の方法によってたやすく得
ることができるし、また得られた一本鎖ＤＮＡの３′末
端領域に相補する短いフラグメン） （１０ｂ、ｐ。
前後）をテンプレートとしてＤＮＡポリメラーゼを用い
ることによって二本鎖ＤＮＡを掘めて容易に得ることが
できる。このようにＤＮＡポリメラ−ゼを利用すること
ができるのは、本発明が従来から繁用されているＤＮＡ
リガーゼの力を借りずに縮合反応を終えることの最大の
利点であるということができる。
ることによって二本鎖ＤＮＡを掘めて容易に得ることが
できる。このようにＤＮＡポリメラ−ゼを利用すること
ができるのは、本発明が従来から繁用されているＤＮＡ
リガーゼの力を借りずに縮合反応を終えることの最大の
利点であるということができる。
上記のようにして得られた二本鎖ＤＮＡは、常法に従っ
てヘクタープラスミドヘ連結し、常法により大腸菌株等
へ形質転換した後、菌株を培養することによって目的と
するポリペプチドの発現をみることができるのである。
てヘクタープラスミドヘ連結し、常法により大腸菌株等
へ形質転換した後、菌株を培養することによって目的と
するポリペプチドの発現をみることができるのである。
これらの過程においては、既に確立された遺伝子工学的
手法を応用することができる。
手法を応用することができる。
本発明によれば、残基数８０ないし１５０程度の長鎖Ｄ
ＮＡを合成することができるから、従来の遺伝子工学的
手法によってこれらのＤＮＡからアミノ酸数１５ないし
３０のポリペプチドを合成することができる。従って例
えば成長ホルモン放出抑制剤ソマトスタチン（アミノ酸
数１４）、胃酸分泌刺激剤ガストリン（アミノ酸数１７
）、十二指腸潰瘍治療剤セクレチン（アミノ酸数２７）
、血糖上昇、インシュリン、成長ホルモン分泌促進剤グ
ルカゴン（アミノ酸数２９）、モルヒネ様作用薬β−エ
ンドルフィン（アミノ酸数３１）、高カルシウム面症治
療薬カルシトニン（アミノ酸数３２）等のポリペプチド
を合成することができる。
ＮＡを合成することができるから、従来の遺伝子工学的
手法によってこれらのＤＮＡからアミノ酸数１５ないし
３０のポリペプチドを合成することができる。従って例
えば成長ホルモン放出抑制剤ソマトスタチン（アミノ酸
数１４）、胃酸分泌刺激剤ガストリン（アミノ酸数１７
）、十二指腸潰瘍治療剤セクレチン（アミノ酸数２７）
、血糖上昇、インシュリン、成長ホルモン分泌促進剤グ
ルカゴン（アミノ酸数２９）、モルヒネ様作用薬β−エ
ンドルフィン（アミノ酸数３１）、高カルシウム面症治
療薬カルシトニン（アミノ酸数３２）等のポリペプチド
を合成することができる。
本発明に係る長鎖ＤＮＡはまた、単に構造遺伝子部位の
ＤＮＡ塩基配列だけでなく、広（調節部位、特異配列等
を含む一般のＤＮＡやまたそれらの構造を認識する長鎖
ＤＮＡプローブ等の製造にも利用することができるから
、診断薬の開発等に積極的に応用することができるもの
である。
ＤＮＡ塩基配列だけでなく、広（調節部位、特異配列等
を含む一般のＤＮＡやまたそれらの構造を認識する長鎖
ＤＮＡプローブ等の製造にも利用することができるから
、診断薬の開発等に積極的に応用することができるもの
である。
（発明の効果）
本発明によれば、長鎖ＤＮＡを簡便にしかも大量に合成
することができる。本発明に係る長鎖ＤＮＡは、上記し
たように■ポリペプチド合成に係る遺伝情報源としてま
た■ＤＮＡプローブの応用への素源として、遺伝子工学
上有効に利用することができるものである。
することができる。本発明に係る長鎖ＤＮＡは、上記し
たように■ポリペプチド合成に係る遺伝情報源としてま
た■ＤＮＡプローブの応用への素源として、遺伝子工学
上有効に利用することができるものである。
これまで１０ツト当たり、たかだか０．１００ （１０
Ｄは約５０μｇ）だったＤＮＡ合成が、本発明の活用に
よって１０フト当たり３０〜５００Ｄもの大量生産が可
能となった。これにより、遺伝子としテマたＤＮＡプロ
ーブへの応用源としての長鎖ＤＮＡの利用領域の拡大を
望むことができる。
Ｄは約５０μｇ）だったＤＮＡ合成が、本発明の活用に
よって１０フト当たり３０〜５００Ｄもの大量生産が可
能となった。これにより、遺伝子としテマたＤＮＡプロ
ーブへの応用源としての長鎖ＤＮＡの利用領域の拡大を
望むことができる。
（実施例）
以下に中框に対する鎮痛作用、内分泌ホルモン作用等の
生理活性が知られているエンドルフィン類の合成に関す
る実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明する。
生理活性が知られているエンドルフィン類の合成に関す
る実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明する。
（１）エンドルフィン類遺伝子を含む塩基配列を構成す
る各ブロックの合成 エンドルフィン類のアミノ酸配列は公知のものであり、
これに対応するＤＮＡ塩基配列はコードンｕｓａｇｅの
表を拾うことによって任意に選択することができるもの
である。これらと、本発明において用いられたＤＮＡ塩
基配列を構成する各ブロックとの関係を以下に掲げる（
上段が各ブロック（数字はブロックナンバー）、中段が
塩基配列、下段が対応するアミノ酸配列を示す）。なお
、ここにおいてはＤＮＡ塩基配列の両末端にプラスミド
挿入時に活用する制限酵素部位を設けている。
る各ブロックの合成 エンドルフィン類のアミノ酸配列は公知のものであり、
これに対応するＤＮＡ塩基配列はコードンｕｓａｇｅの
表を拾うことによって任意に選択することができるもの
である。これらと、本発明において用いられたＤＮＡ塩
基配列を構成する各ブロックとの関係を以下に掲げる（
上段が各ブロック（数字はブロックナンバー）、中段が
塩基配列、下段が対応するアミノ酸配列を示す）。なお
、ここにおいてはＤＮＡ塩基配列の両末端にプラスミド
挿入時に活用する制限酵素部位を設けている。
■α−エンドルフィン
■α−（Ｌｅｕ’ ） −エンドルフィン■γ−（Ｌ
ｅｕ５） −エンドルフィン■Ｔ−エンドルフィン 上記したエンドルフィン類遺伝子を構成する各ブロック
のうちブロック７は、以下に示す手順によって合成した
。
ｅｕ５） −エンドルフィン■Ｔ−エンドルフィン 上記したエンドルフィン類遺伝子を構成する各ブロック
のうちブロック７は、以下に示す手順によって合成した
。
（以下次頁）
ｄ （ＤＭＴｒ） ＡＥ’ＡＥ’ＡＰＣＥ’ＴＥ’ＣＥ
’ＣＥ’ＡＰｏ−−一旧ｏｃｋ ７エンドルフイン類
遺伝子を構成するその他のブロック（１〜６．８〜１７
）も同様の方法により合成した。おのおのの収率を以下
に掲げる。
’ＣＥ’ＡＰｏ−−一旧ｏｃｋ ７エンドルフイン類
遺伝子を構成するその他のブロック（１〜６．８〜１７
）も同様の方法により合成した。おのおのの収率を以下
に掲げる。
（以下次頁）
（２）エンドルフィン類遺伝子の合成
制限酵素部位を含むα−エンドルフィン遺伝子（ｄｅｏ
ｘｙ ８０ｍｅｒ ）は、以下のように固相合成した。
ｘｙ ８０ｍｅｒ ）は、以下のように固相合成した。
■デオキシチミジンＣＰＧ樹脂をＣＨ２Ｃｌ２ ／Ｍｅ
ＯＨで洗浄する。
ＯＨで洗浄する。
■２％ＢＳ＾／ Ｃ）（２ＣＩ ２− Ｍｅａｌ冒で説
トリチル化する（発色が消えるまで、短時間で素早（繰
り返す）。
トリチル化する（発色が消えるまで、短時間で素早（繰
り返す）。
■ピリジンで置換し、共沸乾固する。これに、各ブロッ
クのピリジン溶液を加え共沸乾固後、ＭＳＮＴと反応用
ピリジンを加える。室温放置後、ピリジンで洗う。
クのピリジン溶液を加え共沸乾固後、ＭＳＮＴと反応用
ピリジンを加える。室温放置後、ピリジンで洗う。
００．１Ｍジメチルアミノピリジン／ピリジン溶液と無
水酢酸を加える、室温放置後、ピリジンで洗う。
水酢酸を加える、室温放置後、ピリジンで洗う。
以上の操作を計１３回繰り返した。この反応の平均収率
は、８４％であった。その後、樹脂を０．１Ｍテトラメ
チルグアニジン−ピリジンアルドキシム（Ｃ１Ｂ、 Ｒ
ｅｅｓｅ ら。Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ｔ、ｅｔｔ、
＋ ２７２７ （１９７Ｂ） ）のジオキサン水溶液
で室温で脱保護し、ピリジン水で洗浄後、洗液を濃縮乾
固し、濃アンモニア水を加え加温する。アンモニア留去
後、ジメキシトリチル基を指標に、一部分を取って最終
段階の収率を算出する。
は、８４％であった。その後、樹脂を０．１Ｍテトラメ
チルグアニジン−ピリジンアルドキシム（Ｃ１Ｂ、 Ｒ
ｅｅｓｅ ら。Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ｔ、ｅｔｔ、
＋ ２７２７ （１９７Ｂ） ）のジオキサン水溶液
で室温で脱保護し、ピリジン水で洗浄後、洗液を濃縮乾
固し、濃アンモニア水を加え加温する。アンモニア留去
後、ジメキシトリチル基を指標に、一部分を取って最終
段階の収率を算出する。
残りの反応液は、逆相（ウォーターズ社製Ｐｒｅｐ５０
０用Ｃ１８シリカゲル）、イオン交換（ＤＥＡＥ−トヨ
バール）、逆相（ＣＩ８シリカゲルＴＳＫ−Ｇｅｌ
１０〜２０μｍ）のオープンクロマトを行い、純粋なα
−エンドルフィン遺伝子（制限酵素部位を含む）（＝ｄ
ｅｏｘｙ ８０ｍｅｒ ）を得た。
０用Ｃ１８シリカゲル）、イオン交換（ＤＥＡＥ−トヨ
バール）、逆相（ＣＩ８シリカゲルＴＳＫ−Ｇｅｌ
１０〜２０μｍ）のオープンクロマトを行い、純粋なα
−エンドルフィン遺伝子（制限酵素部位を含む）（＝ｄ
ｅｏｘｙ ８０ｍｅｒ ）を得た。
純度はＨＰＩ、Ｃ（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ３００−７
Ｃ１ｇ ） 、電気泳動にて確認し、その塩基配列はＭ
ａｘａｎ＋−Ｇｉｌｂｅｒｔ法により確認した。これら
の結果を、第１図乃至第３図に示した。
Ｃ１ｇ ） 、電気泳動にて確認し、その塩基配列はＭ
ａｘａｎ＋−Ｇｉｌｂｅｒｔ法により確認した。これら
の結果を、第１図乃至第３図に示した。
同様にして、α−（Ｌｅｕ’ ）−エンドルフィン遺伝
子（制限酵素部位を含む） （ｄｅｏｘｙ ７７ｍａ
ｒ ）、ｒ−（Ｌｅｕ’）−エンドルフィン遺伝子（制
限酵素部位を含む） （ｄｅｏｘｙ ７７ｍｅｒ ）
、及びγ−エンドルフィン遺伝子（制限酵素部位を含
む） ｄｅｏｘｙ８０ｍｅｒ ）を合成した。
子（制限酵素部位を含む） （ｄｅｏｘｙ ７７ｍａ
ｒ ）、ｒ−（Ｌｅｕ’）−エンドルフィン遺伝子（制
限酵素部位を含む） （ｄｅｏｘｙ ７７ｍｅｒ ）
、及びγ−エンドルフィン遺伝子（制限酵素部位を含
む） ｄｅｏｘｙ８０ｍｅｒ ）を合成した。
（３）二本鎖ＤＮＡの合成とベクタープラスミドへの連
結 ｄｅｏｘｙ ８０ｍｅｒの３′末端と相補性のある合成
ヌクレオチドプライマーを等モルずっ混合し、６５℃で
３０分間加熱し、そのまま室温まで冷却してｄｅｏｘｙ
８０ｍｅｒとブライマーをアニールさせた。次に常法に
より大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■ （クレノーフラグメ
ント）を加え、３７℃で３０分間反応させ、ＤＮＡを二
本鎖化した。
結 ｄｅｏｘｙ ８０ｍｅｒの３′末端と相補性のある合成
ヌクレオチドプライマーを等モルずっ混合し、６５℃で
３０分間加熱し、そのまま室温まで冷却してｄｅｏｘｙ
８０ｍｅｒとブライマーをアニールさせた。次に常法に
より大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■ （クレノーフラグメ
ント）を加え、３７℃で３０分間反応させ、ＤＮＡを二
本鎖化した。
ＤＮＡをエタノールに沈澱として回収した後、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼを用い、３７℃で３０分間反応さ
せ、二本鎖ＤＮＡの両５′末端をリン酸化した。
ヌクレオチドキナーゼを用い、３７℃で３０分間反応さ
せ、二本鎖ＤＮＡの両５′末端をリン酸化した。
次にベクタープラスミドｐＵｃ８ＤＮＡを制限酵素Ｐｓ
ｔｌで切断後、先の二本鎖ＤＮＡ溶液に加え、Ｔ４ Ｄ
ＮＡリガーゼを加えて１６℃で一晩反応させ、ベクター
プラスミドに二本鎖ｄ ８０ ｍｅｒ ＤＮＡを連結し
た。
ｔｌで切断後、先の二本鎖ＤＮＡ溶液に加え、Ｔ４ Ｄ
ＮＡリガーゼを加えて１６℃で一晩反応させ、ベクター
プラスミドに二本鎖ｄ ８０ ｍｅｒ ＤＮＡを連結し
た。
（４）エンドルフィン遺伝子を含むプラスミドのクロー
ニング 上記のように調製したプラスミドを常法に従い大腸菌Ｊ
Ｍ１０３株へ形質転換した後、このものをｐｕｃ ｓに
存在するβ−ガラクトシダーゼ活性の欠損の有無により
選別し、得られた菌株よりプラスミド分子をクローニン
グして集める。
ニング 上記のように調製したプラスミドを常法に従い大腸菌Ｊ
Ｍ１０３株へ形質転換した後、このものをｐｕｃ ｓに
存在するβ−ガラクトシダーゼ活性の欠損の有無により
選別し、得られた菌株よりプラスミド分子をクローニン
グして集める。
目的とする正しい方向と位置にエンドルフィン遺伝子が
挿入されたプラスミドが得られたことをＭａｘａｍ−Ｇ
ｉｌｂｅｒｔ法により確認した。
挿入されたプラスミドが得られたことをＭａｘａｍ−Ｇ
ｉｌｂｅｒｔ法により確認した。
（５）エンドルフィン類の取得
形質転換した大腸菌ＪＭ１０３株をＬＢ培地で−晩前培
養し、２ＹＴ培地に植菌した後３９℃で振盪培養する。
養し、２ＹＴ培地に植菌した後３９℃で振盪培養する。
対数増殖初期、中期、後期に、ＩＰＴＧを０．５ｍＭと
なるように加え、エンドルフィン合成を誘導した。
なるように加え、エンドルフィン合成を誘導した。
ＩＰＴＧで誘導した後、融合蛋白を抽出し、高速液体ク
ロマトグラフィーで解析したところ、対数増殖初期に誘
導をかけた場合に適当量の蛋白発現が認められた（１〜
５．０Ｘ１０”分子／ｃｅｌｌ）。
ロマトグラフィーで解析したところ、対数増殖初期に誘
導をかけた場合に適当量の蛋白発現が認められた（１〜
５．０Ｘ１０”分子／ｃｅｌｌ）。
分子内にメチオニン残基を有する天然型のα−エンドル
フィン、Ｔ−エンドルフィンについては通常の方法によ
りトリプシン処理を行い、またメチオニンの代わりにロ
イシン残基を有するα−〔Ｌｅｕ５） −エンドルフィ
ン、Ｔ ＣＬｅｕ’ ） −エンドルフィンにつ
いてはＢｒＣＮ処理を行い、それぞれ目的とするエンド
ルフィン蛋白を一般的な蛋白精製法に従ったカラムクロ
マトグラフィーにより単離、精製した。
フィン、Ｔ−エンドルフィンについては通常の方法によ
りトリプシン処理を行い、またメチオニンの代わりにロ
イシン残基を有するα−〔Ｌｅｕ５） −エンドルフィ
ン、Ｔ ＣＬｅｕ’ ） −エンドルフィンにつ
いてはＢｒＣＮ処理を行い、それぞれ目的とするエンド
ルフィン蛋白を一般的な蛋白精製法に従ったカラムクロ
マトグラフィーにより単離、精製した。
得られた各エンドルフィン頬分子が目的とするアミノ酸
配列を有していることは、既にペプチド合成によって得
られている標品と逆相担体を用いた高速液体クロマトグ
ラフィーにおいて完全に一致することにより確認した。
配列を有していることは、既にペプチド合成によって得
られている標品と逆相担体を用いた高速液体クロマトグ
ラフィーにおいて完全に一致することにより確認した。
第１図は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法により合成し
たα−エンドルフィン遺伝子を含むｄｅｏｘｙ ８０ｍ
ｅｒの、２０％ポリアクリルアミド電気泳動の結果を示
す。 第２図は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法により合成し
たα−エンドルフィン遺伝子を含むｄＢｏＸｙ ８０ｍ
ｅｒの、８％ポリアクリルアミド電気泳動の結果を示す
。 第３図は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法により合成し
たα−エンドルフィン遺伝子を含むｄｅｏｘｙ ８０ｍ
ｅｒの、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ３００−７ Ｃ＋ｅ高速
液体クロマトグラフィーの結果を示す。縦軸は吸光度を
、横軸は時間を表わす。溶媒系はトリエチルアミン酢酸
塩−アクリロニトリルで流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎであ
った。
たα−エンドルフィン遺伝子を含むｄｅｏｘｙ ８０ｍ
ｅｒの、２０％ポリアクリルアミド電気泳動の結果を示
す。 第２図は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法により合成し
たα−エンドルフィン遺伝子を含むｄＢｏＸｙ ８０ｍ
ｅｒの、８％ポリアクリルアミド電気泳動の結果を示す
。 第３図は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法により合成し
たα−エンドルフィン遺伝子を含むｄｅｏｘｙ ８０ｍ
ｅｒの、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ３００−７ Ｃ＋ｅ高速
液体クロマトグラフィーの結果を示す。縦軸は吸光度を
、横軸は時間を表わす。溶媒系はトリエチルアミン酢酸
塩−アクリロニトリルで流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎであ
った。
Claims (1)
- ４ないし８個の塩基配列を有するブロックを、いわゆる
固相法（トリエステル法）を用いかつアミノ化ＣＰＧを
担体として使用することにより純化学的に結合させるこ
とを特徴とする、長鎖ＤＮＡの合成法。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59281645A JPS61152695A (ja) | 1984-12-26 | 1984-12-26 | 長鎖ｄｎａの合成法 |
| GB8530915A GB2169605B (en) | 1984-12-26 | 1985-12-16 | A method of synthesizing long chain dna |
| DE3544459A DE3544459C2 (de) | 1984-12-26 | 1985-12-16 | Verfahren zum Synthetisieren von langkettiger Desoxyribonucleinsäure (DNA) |
| IT8548954A IT1208725B (it) | 1984-12-26 | 1985-12-18 | Metodo per la sintesi di dna a catena lunga |
| FR858518965A FR2575162B1 (fr) | 1984-12-26 | 1985-12-20 | Procede de synthese d'un dna a longue chaine |
| CH5457/85A CH672791A5 (ja) | 1984-12-26 | 1985-12-20 | |
| CA000498535A CA1295558C (en) | 1984-12-26 | 1985-12-23 | Synthesis of long chain dna |
| ES550390A ES8802330A1 (es) | 1984-12-26 | 1985-12-24 | Un metodo para sintetizar acido desoxirribonucleico (adn) de cadena. |
| KR1019850009935A KR940000543B1 (ko) | 1984-12-26 | 1985-12-26 | 장쇄 dna의 합성법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59281645A JPS61152695A (ja) | 1984-12-26 | 1984-12-26 | 長鎖ｄｎａの合成法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61152695A true JPS61152695A (ja) | 1986-07-11 |
| JPH0586400B2 JPH0586400B2 (ja) | 1993-12-10 |
Family
ID=17641986
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59281645A Granted JPS61152695A (ja) | 1984-12-26 | 1984-12-26 | 長鎖ｄｎａの合成法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61152695A (ja) |
| KR (1) | KR940000543B1 (ja) |
| CA (1) | CA1295558C (ja) |
| CH (1) | CH672791A5 (ja) |
| DE (1) | DE3544459C2 (ja) |
| ES (1) | ES8802330A1 (ja) |
| FR (1) | FR2575162B1 (ja) |
| GB (1) | GB2169605B (ja) |
| IT (1) | IT1208725B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5114839A (en) * | 1988-05-24 | 1992-05-19 | Gesellschaft Fur Biotechnologische Forsching Mbh | Process for dna sequencing using oligonucleotide bank |
| EP0638089B2 (en) * | 1992-04-15 | 2008-03-05 | The Johns Hopkins University | Synthesis of diverse and useful collections of oligonucleotides |
| US5516664A (en) * | 1992-12-23 | 1996-05-14 | Hyman; Edward D. | Enzymatic synthesis of repeat regions of oligonucleotides |
| US6479262B1 (en) | 2000-05-16 | 2002-11-12 | Hercules, Incorporated | Solid phase enzymatic assembly of polynucleotides |
| US7205399B1 (en) | 2001-07-06 | 2007-04-17 | Sirna Therapeutics, Inc. | Methods and reagents for oligonucleotide synthesis |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58180500A (ja) * | 1982-03-26 | 1983-10-21 | モンサント・コンパニ− | Ｄｎａの化学的合成方法 |
| JPS59172500A (ja) * | 1983-01-20 | 1984-09-29 | ゲゼルシャフト・フユア・ビオテクノロギッシエ・フオルシュンク・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 固相上のいくつかのオリゴヌクレオチドの同時合成方法 |
Family Cites Families (6)
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|---|---|---|---|---|
| BR7807288A (pt) * | 1977-11-08 | 1979-06-12 | Genentech Inc | Processo para sintese de polinucleotidos |
| EP0173356B1 (en) * | 1980-02-29 | 1990-09-19 | University Patents, Inc. | Process for preparing modified inorganic polymers |
| EP0102995A1 (en) * | 1982-03-08 | 1984-03-21 | Celltech Limited | Polynucleotide synthesis |
| IL69196A0 (en) * | 1982-08-20 | 1983-11-30 | Genex Corp | Solid phase synthesis of oligonucleotides |
| EP0155950B1 (en) * | 1983-09-02 | 1990-01-17 | Molecular Biosystems, Inc. | Oligonucleotide polymeric support system |
| PT79519B (en) * | 1983-11-21 | 1986-12-11 | Ciba Geigy Ag | Process for preparing protease inhibitors based on egline compounds |
-
1984
- 1984-12-26 JP JP59281645A patent/JPS61152695A/ja active Granted
-
1985
- 1985-12-16 GB GB8530915A patent/GB2169605B/en not_active Expired
- 1985-12-16 DE DE3544459A patent/DE3544459C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-12-18 IT IT8548954A patent/IT1208725B/it active
- 1985-12-20 FR FR858518965A patent/FR2575162B1/fr not_active Expired
- 1985-12-20 CH CH5457/85A patent/CH672791A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1985-12-23 CA CA000498535A patent/CA1295558C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-24 ES ES550390A patent/ES8802330A1/es not_active Expired
- 1985-12-26 KR KR1019850009935A patent/KR940000543B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58180500A (ja) * | 1982-03-26 | 1983-10-21 | モンサント・コンパニ− | Ｄｎａの化学的合成方法 |
| JPS59172500A (ja) * | 1983-01-20 | 1984-09-29 | ゲゼルシャフト・フユア・ビオテクノロギッシエ・フオルシュンク・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 固相上のいくつかのオリゴヌクレオチドの同時合成方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES8802330A1 (es) | 1988-05-01 |
| GB2169605B (en) | 1989-06-07 |
| ES550390A0 (es) | 1988-05-01 |
| IT8548954A0 (it) | 1985-12-18 |
| FR2575162A1 (fr) | 1986-06-27 |
| KR860005025A (ko) | 1986-07-16 |
| KR940000543B1 (ko) | 1994-01-24 |
| CA1295558C (en) | 1992-02-11 |
| GB8530915D0 (en) | 1986-01-29 |
| DE3544459C2 (de) | 1993-12-16 |
| IT1208725B (it) | 1989-07-10 |
| FR2575162B1 (fr) | 1989-05-05 |
| GB2169605A (en) | 1986-07-16 |
| DE3544459A1 (de) | 1986-07-03 |
| JPH0586400B2 (ja) | 1993-12-10 |
| CH672791A5 (ja) | 1989-12-29 |
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