JPH02142472A - 二本鎖ｄｎａ配列の調製方法 - Google Patents

二本鎖ｄｎａ配列の調製方法

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JPH02142472A
JPH02142472A JP1235901A JP23590189A JPH02142472A JP H02142472 A JPH02142472 A JP H02142472A JP 1235901 A JP1235901 A JP 1235901A JP 23590189 A JP23590189 A JP 23590189A JP H02142472 A JPH02142472 A JP H02142472A
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double
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dna
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JP1235901A
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Krishna Jayaraman
クリシュナ　ジャヤラマン
Brent Arthur Burdick
ブレント　アーサー　バーディック
Fred Terry Oakes
フレッド　テリー　オークス
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Original Assignee
Eastman Kodak Co
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、二本鎖ＤＮＡ配列の調製方法およびその配列
の特性決定法に関する。
〔従来の技術〕
遺伝情報は、コーディング鎮と相補的鎖からなる二本鎖
デオキシ核酸（ＤＮＡ）上にコードされている。特有の
反復ヌクレオチド塩基順に従ってコーディング領土にコ
ードされる遺伝情報が存在する。
このＤＮＡコーディング鎮は、特殊なビットの情報をコ
ードする「コドン」と称されるヌクレオチド）　ＩＪブ
レットの長い配列を含んでなる。例えば、ＡＴＧ　（ア
デニン−チミン−グアニジン）として読み取られる３個
のヌクレオチドは、「翻訳開始」として解釈されるシグ
ナルをｍＲＮＡにもたらす。終止コドンＴＡＡおよびＴ
ＡＧは、「翻訳停止」として解釈される。開始コドンと
終止コドンとの間には、アミノ酸配列を特定するコドン
を有するいわゆる構造遺伝子が存在する。
合成遺伝子は最適な発現およびその後の換作に適応性を
もたせるように設計することが可能であることから、そ
れらのクローン化対照物を凌駕する数々の利点を提供す
る。さらに、それらは突然変異誘発を介して突然変異を
効率的に行うことができるので蛋白質における構造と機
能の関係に対する研究を促進する。しかしながら、合成
遺伝子は、それが対応する相補的ＤＮＡを単離する方法
に比しかなり短時間で合成できる場合にのみ生存選択性
である。
合成遺伝子を調製する多様な方法が知られている。例え
ば、ホスホトリエステル法またはホスホジエステル法が
時々使用されてオリゴデオキシリボヌクレオチド断片が
調製されている。次に、これらの断片を一緒に結合して
長鎖の反復核酸が形成されている。米国特許第４．３５
６．２７０号明細書は、約５６個の塩基対を含んでなる
ソマトスフチン遺伝子の合成およびクローニングを記載
する。
この遺伝子合成のホスホジエステル法は、Ｂｒｏｗｎ、
　　ε、しらによりＭｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　　６
８．　１０９　（１９７９）こ公表されている。この方
法はまた、引き続き一緒に結合され目的の核酸配列が形
成されるオリコヌクレオチド（オリゴ）の合成も含む。
少量から多量の遺伝子調製方法が存在する。
般に、これらの方法には組換えＤＮＡ技術を使用する適
当な止宿系へ遺伝子をクローニングすることを含む。こ
れらの技術では、主宿生物体を形質転換するために使用
される適当なベクターに遺伝子が挿入されている。主宿
生物体が培養された場合に、ベクターが複製され、それ
により目的遺伝子の多数コピーが産生される。このよう
な方法は、しａｂｏｒａｔｏｒｙ）３９０〜４０１ペー
ジ（１９８２）および前記米国特許第４．３５６．２７
０号明細書に記載されている。
〔発明が解決しようとする課題〕
遺伝子を調製するための現在の合成方法は、幾多の短所
を含む。これらの方法は、労働集約的であり、多数の反
応工程および単離工程を必要とする。化学合成を通じて
膨大な副反応が起こるので、このような方法で１．００
０塩基対以上の長さの二本ｉｌｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列を調
製することは困難である。
多量に遺伝子を産生ずるために使用されるクローング方
法は、また、労働集約的で高価であり、そして遺伝子の
構築およびベクターへのその遺伝子の挿入、クローニン
グおよびクローン化遺伝子の分離の多数の工程を必要と
している。
明らかに、二本鎖ＤＮＡの合成品において遺伝コードを
含む二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ配列の製品を、複数の反応、クロ
ーニングおよび単離工程が削除された方法により増加せ
しめることは、現在も必要である。
〔課題を解決するための手段〕
従来技術の前記短所は、本発明により実質的に改善され
る。本発明は、 （ａ）適切な配列に結合した場合に、ＤＮＡコーディン
グ鎖を形成する第１シリーズのオリゴデオキシリボヌク
レオチド断片を調製する工程、（ｂ）適切な配列に結合
した場合に、前記コーディング鎖に相補的なＤＮＡ鎖を
形成する第２シリーズのオリゴデオキシリボヌクレオチ
ド断片を調製する工程、 （ｃ）単一の反応により工程（ａ）および（ｂ）で調製
された第１および第２シリーズのオリゴデオキシリボヌ
クレオチド断片間を水素結合させ、そして適切な配列と
連結反応させて完全な二本鎖ＤＮＡ配列を生成する工程
、 （ｄ）ハイブッド化条件下で前記二本ｍｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ
配列を８鎮に対する一のオリゴヌクレオチドプライマー
で処理する工程、 （ｅ）プライマー・エクステンション生成物を形成する
ための鋳型となる前記二本鎖ＤＮＡ配列の８鎮に相補的
である各ブライマーの伸長生成物を重合する工程、 （ｆ）工程（ｅ）の生成物を変性し、それらの個々の鋳
型からプライマー・エクステンション生成物を分離して
４個の独立した一本鎖ＤＮＡ配列を形成する工程、 （ｇ）二本鎖ＤＮＡ配列の増幅をもたらす鋳型として工
程（ｆ）で生成されたそれぞれの一本鎖を使用してプラ
イマー・エクステンションが合成されるように、（ｆ）
の変性生成物をオリゴヌクレオチドブライマーで処理す
る工程、ならびに（ｈ）工程（ｄ）、　（ｅ）、　（ｆ
）および（ｇ）を目的量の二本鎖ＤＮＡ配列が形成され
るまで繰り返えすこと、を含んでなる二本鎖ＤＮＡ配列
の調製方法を提供する。
必要があれば、得られた二本ｉｌｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列の
分離を実施してもよい。しかしながら、工程（ｈ）の生
成物は、クローニングのような工程で直接使用するがで
きる。また、工程（ｄ）で処理する前に、工程（ｃ）で
得られる混合物から目的の二本鎖ＤＮＡ配列を単離する
ことも可能である。この単離は、低融解ゲルにより実施
することができる。
配列を含有するこのゲルは、工程（ｄ）で直接使用して
もよい。
前記の方法はまた、特に、実施者がどのような二本鎖配
列が存在するにちがいないとの知見を有する場合には、
二本ｉｌｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列の特性決定手段をも提供す
る。この特性決定法は次の工程を含んでなる： （ａ）鋳型として特性付けされ使用される二本鎖ＤＮＡ
配列を提供する工程； （ｂ）適切な配列に結合した場合に、予期したコーディ
ング鎖の二本鎖ＤＮＡ配列を与える第１シリーズのオリ
ゴブライマーを調製する工程；（ｃ）適切な配列に結合
した場合に、前記コーディング鎮に対して相補的なり　
Ｎ　Ａ　＃ｌ！を与える第２シリーズのオリゴプライマ
ーを調製する工程：（ｄ）前記コーディング鎮について
の第１オリゴプライマーおよび前記相補的鎖についての
第２オリゴブライマーを任意に選択する工程；（ｅ）ハ
イブリッド化条件下でそれぞれの鎖について選ばれたオ
リゴプライマーで二本＃Ｊ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列を処理する
工程： （ｆ）プライマー・エクステンション生成物を形成する
ための鋳型となる二本鎖ＤＮＡ配列のそれぞれの鎮の少
なくとも一部に対して、相補性である各ブライマーの伸
長生成物を重合させる工程；（ｇ）工程（ｆ）の生成物
を変性し、それらの個々の鋳型からプライマー・エクス
テンション生成物を単離して４個の独立した一本鎖ＤＮ
Ａ配列を形成する工程； （ｈ）二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ配列の増幅をもたらす鋳型とし
て工程（ｇ）で生成されたそれぞれの一本鎖を使用して
プライマー・エクステンション生成物を合成するように
オリゴプライマーで（ｇ）の変性生成物を処理する工程
； （１）目的量のプライマー・エクステンション生成物が
形成されるまで工程（ｅ）、　　（ｆ）、　　（ｇ）お
よび（ｈ）を繰り返す工程； （ｊ）そのプライマー・エクステンション生成物を、予
期するサイズおよび組成を有する標準と比較することに
より予期したサイズおよび組成であるか否かを測定する
工程：ならびに （ｋ）工程（ｂ）および（ｃ）で調製された残りのオリ
ゴプライマーのそれぞれについて工程（ａ）〜（ｊ）を
繰り返す工程。
本質的に、本発明の方法は、合成遺伝子を調製した後に
それらを増幅することを含んでなる。
この方法は、１）単一工程でオリゴヌクレオチド断片か
ら遺伝子が構築され、２）その構築遺伝子を増幅するの
にポリメラーゼ連鎖反応が使用される点で新規かつ非自
明である。
〔遺伝子の調製〕
正確に構築された断片を増幅するために使用されるオリ
ゴ断片およびプライマーは、いずれかの適当な方法、例
えば、従来法または自動化法の亜リン酸トリエステル、
ホスホトリエステルおよびホスホジエステル法を使用し
て１１５１することができる。このような自動化法の一
つでは、出発原料としてジエチルホスホラミシトが使用
されている。
これらは、Ｌ、Ｊ、　ＭｃＢｒ　ｉｄｅ　ら、Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ。
２４　：　２５（１９８３）、米国特許第４．４５８．
０６６号明細書およびＢｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１）。
２２　：　１８５９〜１８６２により公表されている。
修飾固体支持体上でのオリゴの合成方法もまた、米国特
許第４．４５８．０６６号明細書に記載されている。
本発明では、第１および第２シリーズすべての断片が単
一の反応容器中で一緒に組み合わされ、単一工程で水素
結合および連結反応が行われる。
この工程中に多くの池の反応も起こり、様々な長さや量
の二本鎖ＤＮＡ配列も形成される。
既知のアミノ酸配列のすべてのポリペプチドをコードす
るＤＮＡが、その遺伝暗号に従うコドンを選択すること
により調製されうる。精製の簡略化の目的で、例えば５
０〜２００種のヌクレオチドが別々に調製され、次いで
目的の配列に−の反応容器で構築される。こうして、一
つのものから都合のよいサイズを有する第１および第２
シリーズのオリゴデオキシリボヌクレオチド（オリゴ）
断片が調製される。適切な配列に結合した場合に、第１
シリーズはポリペプチド発現ＤＮＡコーディング鎖を与
える。同様に適切な配列に結合した場合に、第２シリー
ズは前記コーディング鎖に対して相補的な鎖を与える。
それぞれの鎖の断片は、好ましくは、断片ブロックの粘
着末端の水素結合を介して相補性がそれら自体での構築
を促進するように重ね合う。この単一工程中に構造遺伝
子が連結反応により完成される。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） オリゴ断片の完全な第１および第２シリーズの水素結合
化および連結反応を含む、前述の単一工程で生成される
少量の二本鎖ＤＮＡ配列は、米国特許第４．３９４．４
４３号明細書に記載されるポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）の
変法を使用して増幅される。この反応は、プライマーと
重合試薬を使用する。
ＰＣＲ法は、概念的に核酸を増幅するための非常に簡単
な方法である。これは、生体内でのＤＮＡ１製に類似し
た方法で、ポリメラーゼ連鎖反応により生じたＤＮＡ分
子の数が各サイクル後に２倍になるような自然界のＤＮ
Ａ複製を幾分模倣したものである。
この方法は、三つの工程が一組になって反復することを
基礎とし、若干相違する制御された温度条件下ですべて
が連続的に実施される。これらの工程は、変性、アニー
リングおよびプライマー伸長反応である。
本明細書で使用する場合の「プライマー」の梧は、サー
マス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉ
ｃｕｓ）　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼを包含するＤＮＡポ
リメラーゼのような重合試薬が、そのプライマーがアニ
ールされるヌクレオチド配列く鋳型）に対して相補性と
なるようにヌクレオチドの付加を可能とする末端を提供
するオリゴ配列をいう。この付加は、適当な温度および
ｐＨにてヌクレオチドの存在下で生ずる。プライマーは
、増幅に際して最大の効率を挙げるためには一本鎖であ
る。プライマーは、重合用試薬の存在下でエクステンシ
ョン生成物の合成を開始するための十分な長さを有して
いなければならない。プライマーの正確な長さは、温度
やプライマー源を含む多（の因子により左右されうる。
例えば、標的配列の複雑さを基準にすると、典型的にオ
リゴプライマーは１５〜２５個以上のヌクレオチドを含
むが、より少ないヌクレオチドを含んでもよい。一般に
短かいプライマー分子は、鋳型と十分安定な）＼イブリ
ッド複合体を形成するためにより低い温度が要求される
。
プライマーは、それらの鋳型に対して「実質的」に相補
性であるものが選ばれる。これは、プライマーがそれら
の鋳型とハイブリダイズするのに十分相補性であること
を意味する。従って、プライマーは鋳型の厳密な配列を
考慮する必要がない。
例えば、非相補的ヌクレオチド断片は、その鎖に相補性
であるブライマー配列の残余部を有するプライマーの５
′末端に結合されうるであろう。また、非相補性塩基の
より長い配列をプライマー中に散在させることができ、
これによりプライマー配列が一緒にハイブリダイズ化し
て増幅する鎖の配列と十分な相補性を有するようになり
、従って、別のプライマーのエクステンション生成物合
成用の鋳型を形成する。
同一方法により調製されるプライマーを使用して遺伝子
が調製されるオリゴ断片を調製する。
変性 目的の二本鎖ＤＮＡ配列の単離後、それらの各々を鋳型
として独立して使用しろるように各鎮を分離する必要が
ある。これらの鎮の分離は、分離工程によるか、または
プライマー・エクステンション生成物の合成と同時に生
じうる。この鎖の分離は、いずれか適当な物理的、化学
的または酵素的手段により達成することができる。
核酸鎖を分離せしめる物理的方法の一つは、それが完全
（〉９９％）に変性されるまで核酸を加熱する方法を含
む。典型的な加熱変性は、約１〜１０分の時間内、約８
０°〜１０５℃の温度範囲内を必要とする。鎖分離はま
た、ヘリカーゼとして既知の酵素類に属する酵素によっ
て誘発してもよい。ヘリカーゼで核酸鎖を分離するのに
適する反応条件は、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒａｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ　Ｓｙｍｐｏｓ＋ａ　ａｎ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔ＋
ｖｅＢｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏ、ＸＬＩＩＩ″ＤＮＡ　：
　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄＲｅｃｏｍｂｉｎａ
ｔ＋ｏｎ”（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　：Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　ＨａｒｂｅｒＬａｂｏｒａｔｏｔｙ、　　１９７
ｇ）、　　Ｂ、Ｋｕｈｎ　　ら、”ＤＮＡ　Ｈｅ！１ｃ
ａｓｅ　。
６３〜６７ページ、に記載されており、ＲｅＣＡの使用
方法は、Ｃ，Ｒａｄｄｉｎｇ、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ、　１６　：４０５〜４３７ページ（１９
８２）に概説されている。
−度分離した二本鎖は、温度がアニーリングするのに十
分低くなるまで溶液中で遊離したままであろう。
エクステンション・プライマーのアニーリング核酸また
は核酸類の相補釣用が分離されると、その鎖を別の核酸
鎖を合成するための鋳型として使用する準備が整う。
エクステンション・プライマーは、増幅するために鋳型
のフランキング領域上の部位にアニールする合成オリゴ
対である。この対における各プライマーは、Ｄ　Ｎ　Ａ
　６１の一本とのみアニール化しうる。このブライマー
配列は、増幅される境界領域でＤＮＡ鋳型の配列により
決定される。プライマーは逆向きの鎖にアニールするの
で、それらは相互に向い合ったそれらの３′末端を有す
るようなものも見い出しうる。典型的には、プライマー
は別異の配列を有し、相互に相補性でない。
一般に、プライマーは、そのＤＮＡ鋳型を遥かに越える
大きさで存在する。このことは、温度が低下した場合に
プライマーのアニーリング部位における２つのＤＮＡ鎖
の再会合を通じて、プライマーと鋳型の複合体が形成さ
れることを有利にする。
一般に、アニーリングはｐＨ７〜９、好ましくはｐＨ８
の水性緩衝溶液中で起こる。好ましくは、別々に鋳型用
を含有する緩衝液に対して、過剰モル濃度〔クローン化
核酸については、１０００：１（ブライマー／鋳型）が
−船釣であり、ゲノム核酸については、１０６：　１　
　（プライマー／鋳型）が−船釣である〕の２つのオリ
ゴヌクレオチドプライマーが添加される。
プライマー・エクステンション（増幅）前記手順の第３
工程は、ＤＮＡポリメラーゼ促進性（５′→３′）プラ
イマー・エクステンションである。このエクステンショ
ン工程が実施される条件は、使用されるＤＮＡポリメラ
ーゼの種類に直接左右される。この工程を通して、エク
ステンション・プライマーが増幅生成物中に組み込まれ
るようになる。
ＰＣＲ法では、３工程（すなわち、変性、アニーリング
、エクステンション）の典型的な一組が、「サイクル」
と称される。米国特許第４．３９４．４４３号明細書に
より示されるように、この方法は長い断片のＤＮＡにつ
いて実施されている。増幅生成物の挿入物は、「短鎖生
成物」と称され、エクステンション・プライマーの５′
末端間を占める領域として限定される。プライマーは、
十分に限定された配列を有するので、短鎖生成物はブラ
イマー配列に対応する別々の末端を有するであろう。
サイクル数を増加させるにつれ、短鎖生成物はエクステ
ンション・プライマーがアニールしうる鋳型が急速に優
勢になってくる。理論上、短鎖生成物は各サイクル後に
２倍になり、指数関数的な蓄積をもたらす。
本発明では、遺伝子合成にＰＣＲが使用されて目的の遺
伝コードを含む「長鎖生成物」と称される目的の生成物
が増幅される。２〜３サイクル後には、遺伝子合成中に
生成される中間体である短鎖生成物を越える長鎖生成物
が優先的に増幅される。数個のオリゴ断片が単一工程で
連結される場合には、その生成物より短いサイズを有す
る中間体断片もまた、同様に生成される。目的の遺伝コ
ードを末端に配置するプライマーを使用することにより
、中間体副生成物を凌駕する遺伝コードを含有する長鎖
生成物が優先的に増幅される。長鎖生成物に優先して「
短鎖生成物」を増幅させる方法は、合成遺伝子の特性決
定に使用され（後述の例２）、その節では単に全体の遺
伝子が増幅されるにすぎない。
実際的なプライマー・エクステンションと増幅は、以下
のように実施される。合成混合物に適当量のデオキシリ
ボヌクレオチド、ｄＡＴＰ　、　ｄＣＴＰｄＧＴＰおよ
び［］ＴＴＰも加え、得られた溶液を１〜１０分間、好
ましくは１〜４分間９０°〜１００℃に加熱する。この
加熱期間終了後、ブライマーハイプリゼーションに適す
る２０°〜５５℃に溶液を冷却する。
この冷却混合物に重合用試薬を添加する。反応は、当該
技術分野で既知の条件下で起こりうる。この合成反応は
、室温から重合用試薬がもはや有効な作用を失う温度を
越えない温度で起こり得る。従って、例えばＤＮＡポリ
メラーゼが重合用試薬として使用される場合には、一般
に温度は約４５℃未満である。
重合用試薬は、酵素を包含するプライマー・エクステン
ション生成物の合成を遂行する作用のすべての化合物ま
たは系であり得る。この目的に適する酵素としては、例
えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１１大腸菌Ｄ　Ｎ　Ａ
ポリメラーゼ■のフレノウ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼ、および熱安定性で各核酸Ｓ共に対して相補性である
プライマー・エクステンション生成物を形成するのに適
切な態様でヌクレオチドの組み合わせを促進しうる他の
有用なＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。６５°〜７５
℃までの高温では、熱安定性重合試薬であるサーマス・
アクアティクス（Ｔｈｅｒ＋＋＋ｕｓ　ａｑｕａｔｉｃ
ｕｓ）　（Ｔａｑ）のＤＮＡポリメラーゼが使用される
。−船釣に、合成は各プライマーの３′末端で開始され
、鋳型鎖に沿って５′方向に合成が停止するまで進めら
れる。
しかしながら、前述と同様な方法を使用して５′末端で
合成を開始しもう一方の方向に進める試薬も存在するか
も知れない。
新規な合成鎮とその鋳型は、前記方法に続く工程で使用
される二本鎖の分子を形成する。前記方法に続く工程は
、３工程（変性、アニーリングおよびプライマー・エク
ステンション）の−組の反復適用を再び伴う。
新規な核酸が一本鎖分子上で合成される。反応のために
必要があるならば、前述の条件を進める上で追加の誘発
剤、ヌクレオチドおよびプライマーを、添加してもよい
。さらに、合成はオリゴブライマーの一端で開始され、
鋳型の一本鎖に沿って進み、追加の核酸が生成する。こ
の工程後、エクステンション生成物の半分は２つのプラ
イマーにより結合される特異的な核酸配列から成る。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、各工程に新な試薬
が添加された後に段階的方式で行うことができる。また
、それはすべての試薬を初期段階で加えて同時に行うか
、または新鮮な試薬を与えられた数の段階後に加えて部
分的には段階的にそして部分的は同時に行うこともでき
る。
重合用試薬を不活化するのに加熱のような錫分離方法が
使用されるならば、熱安定性重合試薬の場合では、各ス
トランド分離工程後にその試薬を補充することが必要で
ある。
ヘリカーゼのような酵素的手段を含む多数の精製成分が
鎖の分離工程に使用される場合には、同時法が有用であ
ろう。同時法では、反応混合物は目的の配列を含む核酸
鎖に加え、（１）相分離酵素（例えば、ヘリカーゼ）、
（２）鎮分離酵素用の適当なエネルギー源、例えばｒＡ
ＴＰ、（３）４種のヌクレオチド、（４）過剰モル濃度
のオリゴヌクレオチドプライマーおよび（５）重合試薬
を含んでもよい。
同時法の変性に加熱が使用される場合には、前述した熱
安定性ポリメラーゼのような熱安定性誘発剤が使用され
うる。その工程の各段階は、初期にすべての試薬が存在
するにもかかわらず、連続的に生ずる。必要に応じて、
追加の材料を添加してもよい。
適当な長さの時間が経過して目的量の特異的な核酸配列
が生成した後、いずれか既知の方法で酵素を不活化させ
るか、または反応成分を分離することによりその反応を
停止させてもよい。
ＤＮＡ配列の特性決定 ポリメラーゼ連鎖反応では、数度の増幅工程後に優勢と
なるプライマー・エクステンション生成物の長さは、そ
の鋳型上のプライマーの初期の位置に依存する。反応の
この性質は、鋳型上のプライマーの位置に対して５′の
方向に伸びる鋳型の予想されるサイズおよび組成に基づ
き予期されるプライマー・エクステンション生成物のサ
イズおよび組成の予測を可能にする。鋳型上の様々な位
置で様々なプライマーを使用すれば、ＤＮＡ配列は前記
ポリメラーゼ連鎖反応によりＤＮＡ鎮の特性決定をする
ことができる。
例１ マグロおよびウマ心臓シトクロムＣならびにワサビペル
オキシダーゼ（ＨＲＰ）遺伝子の合成。
オリゴ断片の製造 各遺伝子のＤＮＡ配列は、酵母に好ましいコドンを使用
してそれらのアミノ酸配列から誘導された。各遺伝子の
アミノ酸配列は、Ｅ、　Ｎａｒｇｏｌｉａｓｈら、Ｎａ
ｔｕｒｅ、　　１９２．　１１２５〜１１２７ページ（
１９６１）　（ウマ・シトクロムＣ）　　；　Ｇ、Ｋｒ
１ｅｌら、Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、。
３３４、　１５３〜１６６ページ（１９６３）　（マグ
ロ・シトクロムＣ）　：およびに、Ｇ、Ｗｅｌｉｄｎｅ
ｒ、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ。
７２、１９〜２３ページ（１９７６）　（ワサビ・ペル
オキシダーゼ）に記載されている。
鎖長４０〜６０塩基の１６種の個別のオリゴ断片からな
る一組を、マグロ・シトクロムＣ遺伝子合成用として生
成した。鎖長１００〜１３０塩基の６種の個別のオリゴ
断片からなる一組をウマ心臓シトクロムＣ遺伝子合成用
として生成した。鎖長７８〜１３５塩基の１８種の個別
のオリゴ断片からなる一組をＨＲＰ遺伝遺伝子用成用て
生成した。これらの断片の各組は、以下の特性を有して
いた。各組は、ａ）遺伝子のコーディング鎮を調製する
ための第１シリーズとｂ）相補鎖の調製するための第２
シリーズを含んでなる。
ホスホラミシト化学を使用するオリゴヌクレオチド断片
の調製 各オリゴ断片は、下記のホスホラミシト化学に基づく方
法で具体的に説明するようにＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙ
ｓｔｅｍ’ｓ　Ｍｏｄｅｌ　３８０−８かまたは８ｉｏ
ｓｅａｒｃｈＭｏｄｅｌ　８７５０　ＤＮＡシンセサイ
ザーのいずれかにより０．２マイクロモルのスケールで
合成した。
使用した段階的方法は以下のとおりである：１）支持体
は、０．２マイクロモルまたは１マイクロモルのいずれ
かに調整した多孔質ガラスカラム（細孔サイズ：　ＣＰ
Ｇ５００または１．０００人）を使用した。ヌクレオシ
ド（ＡまたはＧまたはＣまたはＴ）を、ヌクレオシドの
３′−ヒドロキシル基を介して支持体に共有結合した。
このヌクレオシドは、５′−ジメトキシトリチル基とヌ
クレオシドＡ、ＧおよびＣの場合には塩基保護基（ベン
ゾイル基またはインブチリル基）を含む。
２）ジクロロメタン９２％トリクロロ酢酸により５′−
ジメトキシトリチル基を除去する。
３）無水アセトニトリルで前記カラムを十分に洗浄する
。
４）次に、適当なヌクレオシド−３′−β−シアノエチ
ルホスホラミシト＜０．１Ｍ、１０倍過剰モル濃度）お
よびテトラゾール（０，２Ｍ、　２０倍過剰モル濃度）
を添加し、次いで室温下３０秒間反応させて中間体ヌク
レオチドホスフィツトを形成する。
５）アセトニ）　ＩＪルでカラムを洗浄して過剰のホス
ホラミシトを除去する。
６）無水酢酸／ルチジン／テトラヒドロフラン（１：　
ｌ　：　８）とテトラヒドロフラン中ジメチルアミノピ
リジン（６，５％Ｗ　／　Ｖ　）の等１混合物で未反応
５′　ヒドロキンル基をキャップする。
７）アセトニ）　ＩＪルでカラムを洗浄して過剰のキャ
ンピング試薬を除去する。
８）水／ピリジン／テトラヒドロフラン（１；１０：４
０）混合液中０．ＩＭヨード混合物で中間体ヌクレオチ
ドホスフィンドをホスフェートに酸化した。
９）アセトニトリルでカラムを洗浄して過剰の酸化剤を
除去する。
次のヌクレオチドを付加するために、再度工程２〜９を
続けた。完全な断片が構築されるまで工程２〜９を繰り
返した。合成の最後に、オリゴの５′−ジメトキシトリ
チル基を開裂させ、次いでアセトニトリルで洗浄した。
次に、カラムを室温で２時間濃水酸化アンモニウムで処
理し、支持体からオリゴヌクレオチドを開裂させた。こ
こまで記載したすべての工程は自動化されており、ＤＮ
Ａンンセサイザーにより実施した。
次に、前記断片を含有する溶液に新鮮な水酸化アンモニ
ウム溶液を加え、５５℃で６〜１６時間インキュベーシ
ョンして塩基の保護基を除去した。次に、得られた溶液
中の脱保護化断片を、セファデックスＧ−２５またはＧ
−５０カラムを通過させて、水酸化アンモニウムおよび
ベンズアミドを除去した［Ｋ、Ｊａｙａｒａｍａｎ、　
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　５．６２７ページ（１９
８７）、参照〕。部分精製オリゴヌクレオチド約２００
Ｉ１ｇを、７Ｍ尿素含有１５％のポリアクリルアミドゲ
ルを通して電気泳動した。生成物バンドをＵＶ増影法に
より可視化し、標準的な手段を使用してそのバンドを溶
離した。生成物をＣｌ８ＳｅｐＰａｋカラムで脱塩して
精製ヌクレオチド断片を得た。各断片は、同様な方法で
調製された。
オリゴヌクレオチドのホスホリル化反応５３　ｍ　：、
Ｉのトリス−ＨＣｆｆ　　（ｐＨ２，０）　、ｌＯｍ：
４の！１１ｇＣＣ，１００ｍ　＋、（のジチオスレイト
ール（ＤＴＴ）、アデノシン５′−三リン酸（ＡＴＰ）
５００〜１０００ピコモルおよびＴ４　ポリヌクレオチ
ドキナーゼ１〜２単位の含有混合物中でオリゴ（２５ピ
コモル）を５′−ホスホリル化した。この工程は、続い
て連結反応が可能である。インキュベーションを３７℃
で３０〜４５分間行った。
４）オリゴヌクレオチド断片のアニーリングと連結反応 ホスホリル化反応後、すべてのオリゴヌクレオチドを一
緒にプールし、約５分間で９０℃まで加熱し、次いて約
１．５時間かけて室温まで徐々に冷却シタ。冷却後、新
鮮な１０ＩＩ］ｍＡＴＰ　／　１００ｍｍＤＴＴを最＃
濃度が１　ｍｍＡＴＰ　／１０ｍｍＤＴＴになるまで添
加し、続（すて４０％の８０００　！、＋　１’ｌポリ
エチレングリコール（Ｐ巳Ｇ）を最終濃度が５％になる
まで添加し、ＤＮＡ！Ｊガーゼ１０単位を添加しそして
室温で２時間かまたは１２°〜１６℃で一夜インキユベ
ーションした。
５）連結反応混合物の分析 連結反応混合物をエタノールで沈殿させ、乾燥しそして
水２０ｕ１に溶解し、次いで２％アガロースゲルを通し
て電気泳動した。ＵＶ増影法で生成物が可視化できるか
否かにかかわらず、生成物に対応する帯域をカキとりそ
して電気溶離（ｅｌｅｃｔｒ。
ｅｌｕｔｅ）　した。
ＰＣＲ増幅 前記の電気溶離物質を水２０ｐ１に溶解した。この物質
０．５Ｊｉｌを水で２００〜１０００ｄに希釈し、５１
１１のアリコートを増幅用標的として使用した。
オリゴ１および１６（マグロ・シトクロムＣ遺伝子が構
築されたものに由来）を、マグロ・シトクロムＣ遺伝子
に対するプライマーとして使用した。
プライマー１ ５′　ＧＧＡＴ　　ＣＣＧ　　ＡへＴＴ　　ＣＡＴ　　
八ＡＴ　　ＧＧＧ　　ＴＧＡ　　ＴＧＴ　　ＴＧＣＴＡ
ＡＡ　　ＧＧＴ　　ＡＡＧ　　ＡＡＡＡ　　ＣＣＴＴＣ
３’プライマー１６ ５’　　ＧＧＡＴ　　ＣＣＧ　　ＡＧＣＴＣＴＴＡ　　
ＣＴＴＡＧ　　八ＡＧ　　ＴＧＧ　　ＣＴＧＡＴＴＴ　
ＣＡＡ　ＧＴＡＧ　３’ ウマ心臓シトクロム玉遺伝子用のプライマーは、次のＤ
ＮＡ配列を有していた： １　）　ＧＡＡ　ＴＴ　ＣＡＴ　ＡＡＴ　ＧＧＧ　ＴＧ
Ａ　ＣＧ　ＴＴＴ　ＧＡＡ　　２５　ｍｅｒ２　）　Ｇ
ＡＧ　ＣＴＣＴＴＡ　ＴＴＣＧＴＴ　ＡＧＴ　ＡＧ　Ｃ
ＣＴＴ　　　２４　ｍｅｒＨＲＰ遺伝子用のプライマー
は、次のＤＮＡ配列を有していたニ プライマー１ ＧＡＡＴＴ　ＣＡＴ　ＡＡＴ　ＧＣＡ　ＡＴＴ　ＧＡＣ
ＴＣＣＡプライマー２ ＧＡＧ　ＣＴＣＴＣＡ　ＴＴＡ　ＧＧＡ　ＧＴＴ　ＧＧ
Ａ　ＣＴＴ前記ブライマーの各々は、それらが使用され
る遺伝子のコーディング鎮または相補鎖の３′末端に相
補性を有するＤＮＡ配列を有していた。
本明細書および米国特許第４．６８３．１９５号明細書
に記載されるＰＣＲ反応は、５０ｍ容量で加ポリメラー
ゼを使用して実施された。３０サイクルおよび４５サイ
クル後、反応混合物を４％アガロースゲルで分析した。
それぞれの場合に、予測した生成物バンドが観察された
。
例２　合成遺伝子の特性決定 合成遺伝子の予備的な特性決定にＰＣＲを使用すること
ができる。いろいろな組み合わせのプライマーを使用し
て増幅後の生成物のサイズを検査することにより、ある
ものが計画通りに遺伝子が構築されているかを定性的に
決定することができる。その遺伝子を構成するオリゴヌ
クレオチドおよび／または断片が手間のかかるクローニ
ングや配列決定前でさえも予期した順序で連結し得るこ
とを見い出すことは非常に有用である。これをＨＲＰ遺
伝子を用いて説明する。例１で得たＨＲＰ遺伝子を１：
２００に希釈し、アリコート５１１１を増幅用として使
用した。
第１図にＨＲＰ遺伝子の略図を示した。この遺伝子はコ
ーディング鎖１と相補釣用２からなる。
コーディング鋼上の数字は、コーディング鎖１配列中の
ヌクレオチドの位置番号である。位置番号付けは、遺伝
子の５′末端から始まり３′末端の下流方向に行われて
いる。同様な位置番号付けが相補的鎮２についても示し
ている。プライマー３゜４および５の位置も示している
。
特性決定を目的とするＰＣＲは、例証するためにプライ
マー３を使用する以下の機構により進めた。増幅反応を
通じてプライマー・エクステンション生成物は、プライ
マーの５′末端と相補的鎮の５′末端との間の領域を包
含するであろう。このプライマー・エクステンション生
成物は、位置９５３（プライマーの５′）から位置１　
（相補鎖の末端）までの相補的鎮の補体（ｃｏｍｐｌｅ
ｍｅｎｔ）であろう。
このプライマー・エクステンション生成物は、位置７か
ら９６０までのコーディング鎮と同一のヌクレオチド配
列を有するであろう。従って、プライマー４は、プライ
マー・エクステンションのその後の増幅物をコーディン
グ鎖の位置７〜３３８の間のＤＮＡ配列に限定するであ
ろう。この同じ機構は各使用プライマーについても寸分
たがわない。
この機構が前述の「短鎖生成物」の優勢さに対する根拠
である。
プライマー３および４を使用してＰＣＲを実施した。プ
ライマー４は、その５′末端から開始し塩基３３８まで
を含む。予期されたプライマー・エクステンション生成
物サイズは約３３０ｂ、　ｐ、　（３３８〜７）である
。プライマー３および５が使用される場合には、予期さ
れたプライマー・エクステンション生成物サイズは約６
６０ｂ、　ｐ、　（６６３〜７）である。
オリゴヌクレオチドおよび／または断片が正しくない順
序で連結されたならば、それらの増幅物に由来する予期
された生成物サイズは得られないであろう。完全な遺伝
子のコーディング鎮および相補釣用を包含する凝集体（
ａｇｇｒｅｇａｔｅ　）について、複数のプライマーを
用い前記手順を繰り返した。
すべての場合に予期された生成物サイズが得られた。
本明細書で開示される発明は、例として挙げた３種の特
定の遺伝子に関する成功例を示してきたとはいえ、本発
明は、事実上既知のアミノ酸配列をコードする異種ＤＮ
Ａに必要な変更を加えて、ポリロイシンおよびポリアラ
ニンのようなポリアミノ酸：酵素；血清蛋白質；疼痛の
閾値を変えるβ−エンドロフィンのような鎮痛ポリペプ
チド；哺乳類ホルモンまたはその中間体、例えばソマト
スタチン、ヒトインスリン、ヒトおよびウシ成長ホルモ
ン、黄体形成ホルモン、ＡＣ刊、膵臓ポリペプチドなど
；ならびに、例えばヒトプレプロインスリン、ヒトプロ
インスリン、ヒトインスリンのＡｌ１およびＢ鎮などを
含む中間体の生産に適用することができる。また、本発
明の方法で調製される二本鎖ＤＮＡ配列は、通常の組換
えＤＮＡ法を使用してクローン化も可能であることが理
解されるであろう。
ベクターやクローニングを伴う煩雑な組換えＤ　ＮＡ技
術の使用を必要とすることなく前述のような二本４ｍ　
Ｄ　Ｎ　Ａ配列を多量に提供する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ワサビ・ベルオキシダーセ遺伝子を本発明に
より提供されるＤＮＡ特性決定法を例証するために例２
で使用したブライマーと一緒に図示したものである。 〔発明の効果〕

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）適切な配列に結合した場合に、ＤＮＡコーデ
    ィング鎖を形成する第１シリーズのオリゴデオキシリボ
    ヌクレオチド断片を調製する工程、（ｂ）適切な配列に
    結合した場合に、前記コーディング鎖に相補的なＤＮＡ
    鎖を形成する第２シリーズのオリゴデオキシリボヌクレ
    オチド断片を調製する工程、 （ｃ）単一の反応により工程（ａ）および（ｂ）で調製
    された第１および第２シリーズのオリゴデオキシリボヌ
    クレオチド断片間を水素結合させ、そして適切な配列と
    連結反応させて完全な二本鎖ＤＮＡ配列を生成する工程
    、 （ｄ）ハイブッド化条件下で前記二本鎖ＤＮＡ配列を各
    鎖に対して一のオリゴヌクレオチドプライマーで処理す
    る工程、 （ｅ）プライマー・エクステンション生成物を形成する
    ための鋳型となる前記二本鎖ＤＮＡ配列の各鎖に相補性
    である各プライマーの伸長生成物を重合する工程、 （ｆ）工程（ｅ）の生成物を変性し、それらの個々の鋳
    型からプライマー・エクステンション生成物を分離して
    ４個の独立した一本鎖ＤＮＡ配列を形成する工程、 （ｇ）二本鎖ＤＮＡ配列の増幅をもたらす鋳型として工
    程（ｆ）で生成されたそれぞれの一本鎖を使用してプラ
    イマー・エクステンションが合成されるように、（ｆ）
    の変性生成物をオリゴヌクレオチドプライマーで処理す
    る工程、ならびに（ｈ）工程（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）お
    よび（ｇ）を目的量の二本鎖ＤＮＡ配列が形成されるま
    で繰り返えすこと、を含んでなる二本鎖ＤＮＡ配列の調
    製方法。
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