JPH067166A - 核酸配列のクローニング方法 - Google Patents

核酸配列のクローニング方法

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JPH067166A JP4177761A JP17776192A JPH067166A JP H067166 A JPH067166 A JP H067166A JP 4177761 A JP4177761 A JP 4177761A JP 17776192 A JP17776192 A JP 17776192A JP H067166 A JPH067166 A JP H067166A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 試験試料中に存在する核酸配列を増幅し、そ
れをクローニングする方法を提供する。 【構成】 与えられたＤＮＡ又はＲＮＡ配列から初期に
存在する量に比較してより大量の任意の特定の核酸配列
を生成せしめ、該配列をクローニングする方法に関す
る。該ＤＮＡ又はＲＮＡは単鎖又は二重鎖であってもよ
く、比較的純粋であっても核酸の混合物の一成分であっ
てもよい。この方法では、所望の核酸配列の増幅を達成
するために反応を繰返し行うようにする。 【効果】 微量の試料から目的とする核酸配列を効果的
にクローニングすることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、試験試料中に存在する
ならばその存在する核酸配列を増幅し、そしてそれをク
ローニングする方法に関する。より詳細には本発明は、
与えられたＤＮＡ又はＲＮＡ配列から初期に存在する量
に比較してより大量の任意の特定の核酸配列を生成せし
め、該配列をクローニングする方法に関する。該ＤＮＡ
又はＲＮＡは単鎖又は二重鎖であってもよく、比較的純
粋であっても核酸の混合物の一成分であってもよい。本
発明の方法では、所望の核酸配列の増幅を達成するため
に反応を繰り返し行うようにする。
【０００２】
【従来の技術】特に診断上の用途のためには、標的核酸
配列は問題のＤＮＡ又はＲＮＡのほんの僅かな部分であ
ることがあり、非同位体標識又は末端標識オリゴヌクレ
オチドプローブを使用するのではその存在を検出するこ
とは困難である。プローブ検出システムの感度を向上さ
せるために多くの労力が費やされているが、現在利用で
きる方法を用いて容易に検出できるに充分な量を得るた
めに、標的配列を増幅するような研究は殆ど行われてい
ない。核酸を初めから、あるいは既存の配列から合成す
る方法がいくつかの文献に記載されている。これらの方
法は、完全に特定された配列の与えられた核酸を大量に
生産することを可能にするものである。
【０００３】核酸を初めから合成する１つの既知方法
は、ヌクレオシド誘導体からの核酸の有機合成を含むも
のである。この合成は溶液中又は固体担体上で行われ
る。有機合成の１つのタイプはリン酸トリエステル法で
あり、これは遺伝子断片又は短い遺伝子を調製するため
に利用される。リン酸トリエステル法では、オリゴヌク
レオチドが調製され、次にこれは結合されてより長鎖の
核酸を形成する。この方法は、Ｓ．Ａ．ナーランクらに
より、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８巻９０頁（１９
７９年）及び米国特許第４，３５６，２７０号に開示さ
れている。該特許はソマトスタチン遺伝子の合成とクロ
ーニングを開示している。
【０００４】有機合成の第２のタイプはリン酸ジエステ
ル法であり、これはトランスファーＲＮＡ遺伝子の調製
に利用されている。この方法はＥ．Ｌ．ブラウンらによ
りＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８巻１０９頁（１９７
９年）に開示されている。リン酸トリエステル法と同じ
ように、リン酸ジエステル法もオリゴヌクレオチドの合
成を含み、これらが実質的に結合されて所望の核酸が形
成される。
【０００５】上記した初めからの合成法は核酸の長鎖を
合成するために利用されるが、核酸を大量合成するため
の実用的方法ではない。両法とも労力と時間を消費し高
価な装置と試薬を必要としかつ全体収率が低い。全体収
率が低いのは、オリゴヌクレオチドの合成とそれらを結
合する反応が非効率的であることに起因する。長鎖の核
酸を合成する際あるいは短鎖の核酸を大量に合成する場
合でさえも、多くのオリゴヌクレオチドを合成し多くの
結合反応を行うことが要求される。従ってこれらの方法
は任意で所望の核酸を大量に合成するには実用的ではな
い。
【０００６】初めに存在する少量の核酸から大量の核酸
を生産する方法も存在する。これらの方法は好適な宿主
系内での核酸のクローニングを含み、ここでは所望の核
酸は宿主の形質変換に使用される好適なベクター中に挿
入される。宿主が培養されるとベクターが複製され、所
望の核酸のコピーが生産される。核酸断片のサブクロー
ニングについては、Ｔ．マニアチスらにより、コールド
・スプリング・ラボラトリーのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ ３９０−４０１頁（１９８２年）に簡単
に記述されている。この技術については米国特許第４，
４１６，９８８号及び４，４０３，０３６号にも記述さ
れている。
【０００７】米国特許第４，２９３，６５２号に記載さ
れている核酸の第３の合成法は、上述の有機合成と分子
クローニング法を合わせたものである。該法では、所望
の核酸配列を作り上げるのに必要な好適な数のオリゴヌ
クレオチドを初めに合成し、次にこれらを次の挿入の前
に増殖により増幅されるベクターに挿入する。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、この分子ク
ローニング法に幾らかの類似性を有している。しかし本
発明はいかなる生物の繁殖も必要とせず、従って繁殖に
伴って起こり得る危険や不都合を回避することができ
る。本発明は所望の核酸と関連しない核酸の合成を必要
とせず、従って本発明によれば複雑な生物学的混合物か
らコストをかけて生成物を精製することも回避できる。
【０００９】本発明はプライマーと重合試薬を用いて１
種の核酸又は複数の核酸の混合物中に存在する１又は２
以上の特定の核酸配列を増幅し、かつ増幅した配列を検
出する方法である。プライマーは、そして１つのプライ
マーの伸長生成物は、他のプライマーとハイブリダイズ
したときに所望の特定の核酸配列の生成のための鋳型と
なり、又その逆も起こる。そしてこのプロセスは所定量
の配列が生成するまで必要なだけ繰り返される。標的配
列から大量の核酸を比較的短時間で生産するためには、
本方法は上記の従来法より効率的であると期待される。
本方法は核酸混合物に僅かしか含まれていない核酸種を
増幅し、該種を効率的に検出するために特に有用であ
る。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は特に、１種の核
酸又は複数の核酸の混合物中に含まれる特定の核酸配列
をベクター中へクローニングする方法であって、 （ａ）増幅されるべきそれぞれの異なった特定の配列の
各ストランド用のオリゴヌクレオチドプライマーによ
り、増幅されるべきそれぞれの異なった特定の配列の各
ストランドについて各核酸螺旋に相補的な各プライマー
の伸長生成物が合成されるような条件下、前記核酸を処
理し、かつここで前記プライマーは、各特定の配列のス
トランドに実質的に相補的であるように選択され、１つ
のプライマーから合成された伸長生成物が、それが相補
体から分離されたときに他のプライマーの伸長生成物合
成の鋳型としての役割を果たすものであり、更に該プラ
イマーはそれぞれその５′末端に、他のプライマーの制
限部位と同じか異なった制限部位を有するものであり； （ｂ）その上で単鎖分子が合成された鋳型からプライマ
ーの伸長生成物を分離するし； （ｃ）オリゴヌクレオチドにより、ステップ（ｂ）で生
産された単鎖分子を、ステップ（ｂ）で生成された各単
鎖を鋳型として使用してプライマーの伸長生成物が合成
されるように処理し、ここで増幅されるべき特定の配列
に依存してステップ（ａ）と（ｃ）を０から有効量まで
のジメチルスルフォキシドの存在下、あるいは約４５℃
までの温度のもとで行い； （ｄ）ステップ（ｃ）の生成物に各制限部位用の制限酵
素を加えて、制限消化中に開裂した生成物を得る；そし
て （ｅ）開裂した生成物を１又は２以上のクローニングベ
クターに連結する； ことから成る方法に関する。
【００１１】更に他の態様では、本発明は、合成すべき
核酸断片より少ないヌクレオチドを有する既存の核酸断
片と２つのオリゴヌクレオチドとから核酸断片を合成す
る方法であって、該合成すべき核酸は左方のセグメン
ト、中央のセグメント及び右方のセグメントから成り、
該中央のセグメントは少なくとも実質的に前記既存の核
酸断片のヌクレオチド配列を意味し、左右のセグメント
は２つのプライマーの５′末端に存在するヌクレオチド
配列を意味し、これらの３′末端は前記既存の核酸のス
トランドを分離することにより生ずる単鎖の３′末端に
相補的かあるいは実質的に相補的であり；そして （ａ）各核酸のストランドに相補的である各プライマー
の伸長生成物が合成されるような条件下で、前記既存断
片のストランドを２つのオリゴヌクレオチドプライマー
で処理し、ここで、該２つのプライマーは、一方のプラ
イマーから合成される伸長生成物が相補体から分離され
たときに他のプライマーの伸長生成物の合成のための鋳
型としての役割を果たすように、前記既存の断片の各ス
トランドの３′末端と実質的に相補的であるように選択
され、そして各プライマーはその５′末端において前記
既存断片と相補的でなく、合成すべき核酸断片の２つの
末端に対応するヌクレオチドの配列を含むものであり； （ｂ）その上でプライマー伸長生成物が生産さた鋳型か
らプライマー伸長生成物を分離して単鎖分子を生成せし
め；そして （ｃ）ステップ（ｂ）において生成した各単鎖をプライ
マーとして用いてプライマー伸長生成物が合成される条
件下で、ステップ（ｂ）から生じた単鎖分子をステップ
（ａ）のプライマーにより処理し、こうして２つの中間
二重鎖核酸分子（このそれぞれにはオリゴヌクレオチド
プライマーの一方の５′末端の核酸配列が導入されてい
る）と２つの十分な長さの二重鎖核酸分子（このそれぞ
れには、オリゴヌクレオチドプライマーの両方の５′末
端の核酸配列が導入されている）とを生成せしめ； （ｄ）前記十分な長さの二重鎖分子の有効量を生産する
のに十分な回数ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）を繰り
返し； （ｅ）ステップ（ｄ）の生成物のストランドを２つのプ
ライマーで処理して、ステップ（ｄ）の生成物が両末端
において伸びるように処理し；そして （ｆ）中央セグメントとしてのステップ（ｄ）の生成物
及び、ステップ（ｄ）の生成物の鎖を分離することによ
り生産される単鎖の３′末端と相補的か実質的に相補で
ある２つのオリゴヌクレオチドプライマーをして使用し
ながらステップ（ａ）からステップ（ｄ）までを繰り返
す； ことから成る方法に関する。
【００１２】前記中央断片は、 （ａ）他方のオリゴヌクレオチドの３′末端と相補的で
ある核酸配列を３′末端に有し、かつ両５′末端は相互
に相補的でない２つのオリゴヌクレオチドを、重合試薬
及び４つのヌクレオチド三リン酸と、各核酸ストランド
と相補的である各オリゴヌクレオチドの伸長生成物が合
成されるような条件下で反応させる； （ｂ）該伸長生成物を、それらがその上で合成された鋳
型から分離して、単鎖分子を得； （ｃ）ステップ（ｂ）で生じた単鎖分子を、ステップ
（ｂ）で生産された単鎖を鋳型として使用することによ
りプライマーの伸長生成物が合成されるような条件下
で、ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドで処理して中
央断片の増幅を行う； ことから成るステップにより得ることができる。本発明
はさらに、１種の核酸又は複数の核酸の混合物を含む試
料中の少なくとも１種の特定の核酸配列が存在するか否
かを検出し、あるいは試料中の２個の異なった配列を区
別する方法であって、該試料は該配列を含むと思われる
ものであり、 （ａ）前記試料を、試料中に存在すると思われるそれぞ
れの異なった特定の配列の各ストランド用のオリゴヌク
レオチドプライマーにより、検出されるべきそれぞれの
異なった特定の配列の各ストランドについて各核酸スト
ランドに相補的な各プライマーの伸長生成物が合成され
るようなハイブリダイゼーション条件下で処理し、ここ
で前記プライマーは、実質的に各特定の配列のストラン
ドに相補的であるように選択され、１つのプライマーか
ら合成された伸長生成物が、それが相補体から分離され
たときに他のプライマーの伸長生成物の合成のための鋳
型としての役割を果たし； （ｂ）検出すべき配列が存在すれば、変性条件下で前記
試料を処理して鋳型からプライマーの伸長生成物を分離
し； （ｃ）前記試料をオリゴヌクレオチドプライマーによ
り、ステップ（ｂ）で生成した各単鎖を鋳型として使用
してプライマーの伸長生成物が合成されるように処理
し、もし存在するならば前記特定の配列の増幅を生じさ
せる； （ｄ）ステップ（ｃ）の生成物に、検出されるべき配列
又はその変異体にハイブリダイズすることができる標識
されたプローブを加え； （ｅ）該ハイブリダイゼーションが生じたか否かを決定
する； ことから成る方法を提供する。ステップ（ａ）から
（ｃ）は、逐次的に行っても同時に行ってもよい。更に
ステップ（ｂ）と（ｃ）は配列の増幅が所望のレベルに
達するまで繰り返してもよい。
【００１３】他の態様では本発明は、１又は２以上の核
酸を含む試料中の少なくとも１つの特定の核酸配列（該
核酸の少なくとも１つがこの配列を含有すると思われ
る）を検出するためのキットであって、 （ａ）検出されるべきそれぞれ異なった配列の各ストラ
ンド用の１又は複数のプライマーのためのコンテナー；
（このプライマーは各特定の核酸配列の各ストランドに
実質的に相補的であって、１つのプライマーから合成さ
れた伸長生成物がその相補体から分離されたときに、他
のプライマーの伸長生成物合成用の鋳型としての役割を
果たすことができる） （ｂ）重合試薬を収容するコンテナー； （ｃ）４つの異なったヌクレオシド三リン酸用のコンテ
ナー； （ｄ）前記試料中の前記配列の存在を検出できるプロー
ブを収容するコンテナー；及び （ｅ）該プローブと該配列のハイブリドを検出する手段
を収容するコンテナー； を有するパッケージタイプの多コンテナー型ユニットか
ら成る診断用キットに関する。
【００１４】
【具体的な説明】プライマー、プローブ、検出すべきオ
リゴマー断片、オリゴマー対照体、及び標識されていな
いブロッキングオリゴマーに関して使用される「オリゴ
ヌクレオチド」という用語は、２又はそれ以上の好まし
くは３より多くのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌ
クレオチドから成る分子として定義される。その正確な
大きさは多くの因子に依存し、その因子はオリゴヌクレ
オチドの究極的な機能と用途に依存する。ここで使用さ
れる「プライマー」という用語は、精製された制限消化
物として自然に存在しあるいは合成的に調製されたオリ
ゴヌクレオチドを意味し、このプライマーは、例えば好
適な温度及びpHでヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼの
ような重合試薬が存在するような、核酸鎖に相補的なプ
ライマーの伸長生成物の合成が誘発される条件下に置か
れたときに合成開始点として機能することができる。
【００１５】該プライマーは増幅効率を最大にするため
単鎖であることが好ましいが、その代わりに二重鎖であ
ってもよい。二重鎖であると、プライマーは伸長生成物
を調製するために使用される前にまずその鎖を分離する
ために処理される。プライマーはオリゴデオキシリボオ
クレオチドであることが好ましい。プライマーは、重合
試薬の存在下で伸長生成物の合成を開始するために十分
な長さでなければならない。
【００１６】プライマーの正確な長さは、温度やプライ
マー源を含む多くの因子に依存する。例えば、目的とす
る配列の複雑さに依存してオリゴヌクレオチドプライマ
ーは典型的には１５から２５又はそれより多くのヌクレ
オチドを含むが、より少ないヌクレオチドを含むもので
あってもよい。短いプライマー分子は、鋳型とともに十
分安定なハイブリドの複合体を形成するために、より低
い温度を要求する。プライマーは増幅されるべき各特定
配列の異なる鎖と「実質的」に相補的であるように選択
される。このことはプライマーはそれぞれの鎖とハイブ
リダイズするに十分に相補的でなければならないことを
意味する。従ってプライマーの配列は鋳型の配列を正確
に反映する必要はない。
【００１７】例えば相補的でないヌクレオチド断片を、
プライマーの配列の残部が鎖に相補的であるようにプラ
イマーの５′末端に結合させてもよい。代わりに、プラ
イマーの配列が増幅されるべき鎖の配列と十分な相補性
を有していてそれらとハイブリダイズし、それによって
他方のプライマーの伸長生成物合成用鋳型を形成するな
らば、相補的でない塩基又はより長い配列がプライマー
内に散在してもよい。
【００１８】本発明で使用される「制限エンドヌクレア
ーゼ」及び「制限酵素」という用語は、二重鎖ＤＮＡを
特定の核酸配列又はその近傍で切断するような細菌性酵
素を意味する。本発明で使用される「ＤＮＡの多形現
象」という用語は、ＤＮＡ中の特定部位に２又はそれよ
り多くの異なったヌクレオチド配列が存在できる状態を
意味する。「制限断片長さの多形現象（ＲＡＬＰ）」と
いう用語は、特定の制限エンドヌクレアーゼによる消化
により形成される制限断片の長さに個体間の相違がある
ことを意味する。
【００１９】本発明は、核酸中に存在すると思われる１
又はそれ以上の所望の特定の核酸配列を増幅する方法に
関する。本法によれば大量の特定の配列を調製できるの
で、本発明はＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡのクロー
ニング効率を改良し、かつ標的配列を増幅してその検出
を容易にするために使用することができる。本発明はま
た、不完全な化学合成から生ずる核酸の混合物から所望
の配列を多量に得るためにも有用である。
【００２０】一般に、本発明の方法は、用いられる反応
ステップの数に関連して指数的な収量で少なくとも１つ
の特定の核酸配列を生産する連鎖反応を含み、該配列は
（ａ）必要とされる末端が、それとハイブリダイズする
オリゴヌクレオチドを合成できるに十分な程度に詳細に
知られており、（ｂ）連鎖反応を開始するために少量の
配列が入手可能であることが条件となる。連鎖反応で得
られる生成物は、使用した特定のプライマーの末端に対
応する末端を有するような別個の核酸のデュプレックス
である。
【００２１】精製された状態でも精製されていない状態
でもよい任意の核酸源を、所望の特定の核酸配列を含む
と思われるのであれば、出発核酸として使用できる。従
って本法では、例えば単鎖であっても二重鎖であっても
よいＤＮＡ又はＲＮＡ例えばメッセンジャーＲＮＡを使
用することができる。更にそれぞれ１つの鎖を含むＤＮ
Ａ−ＲＡＮハイブリドを使用してもよい。
【００２２】これらの核酸の混合物を使用してもよく、
又先行する増幅反応において同じか又は異なったプライ
マーを用いて生産された核酸を使用してもよい。増幅す
べき特定の核酸配列は大きな分子の一部であってもよ
く、特定の配列が核酸全体を構成するようにはじめから
個別的な分子として存在していてもよい。増幅すべき配
列は初めから純粋な状態で存在する必要はなく、該配列
は、複雑な混合物の小部分、例えば全ヒトＤＮＡ中のβ
−グロビン遺伝子、又は特定の生物的試料の極く僅かの
部分のみを構成する特定の微生物に起因する核酸配列の
部分であってもよい。
【００２３】出発物質としての核酸は、同じか又は異な
った２以上の所望の特定の核酸配列を含んでいてもよ
い。従って本発明の方法は、１つの特定の核酸配列を大
量に生産するだけでなく、同じか又は異なった核酸分子
上に位置する２以上の異なった特定の核酸配列の同時増
幅にも有用である。
【００２４】核酸は、例えばｐＢＲ３２２のようなプラ
スミド、クローン化されたＤＮＡ又はＲＮＡ、又は細
菌、酵母、ビールス及び植物や動物などの高級生物等の
自然にあるＤＮＡ又はＲＮＡ等の任意源から得ることが
できる。ＤＮＡ又はＲＮＡは、例えばマニアチスらによ
りＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇの２８０から２
８１頁（１９８２年）に記載されているような種々の技
術により、血や絨毛又は羊膜細胞等の組織物質から抽出
することができる。
【００２５】本発明方法により、任意の特定の核酸配列
を生産することができる。配列の両末端の十分な数の塩
基が十分詳細に分かっており、これにより所望の配列の
異なる複数の鎖に対し、かつ該配列に沿った次のような
相対位置にハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチ
ドプライマーを調製することができればよく、すなわ
ち、１つのプライマーから合成伸長した生成物が、鋳型
（相補体）から分離されたときに、限定された長さの核
酸中へ他のプライマーを伸長させるための鋳型としての
役割を果たせばよい。
【００２６】配列の両末端の塩基に関する知識が増加す
るほど目的とする核酸配列のためのプライマーの特異性
も大きくなり、従って本法の有効性も大きくなる。以後
使用するプライマーという用語は、特に増幅すべき断片
の末端配列に関する情報にいくらかの曖昧さがある場合
には、１より大きい数のプライマーを意味するものと理
解されるべきである。例えば、核酸配列が蛋白質配列の
情報から推測できる場合、遺伝子コードの縮重に起因す
るすべての可能なコドン変化を示す配列を含むプライマ
ーを集めて各鎖用として使用する。このような集合のう
ちの１つのプライマーは、増幅すべき所望配列の末端と
一致する。
【００２７】オリゴヌクレオチドプライマーは任意の好
適な方法、例えば上記したリン酸トリエステル法及びリ
ン酸ジエステル法又はそれらのオートメーション化され
た方法を使用して調製することができる。このようなオ
ートメーション化された方法のうちの１つによれば、ビ
ューケージらによりＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ２２巻１８５９−１８６２頁に記載されている通
り、ジエチルフォスフォロアミダイトを出発物質として
使用して合成することができる。修飾された固体担体上
でのオリゴヌクレオチド合成の１つの方法が米国特許第
４，４５８，０６６号に記載されている。生物源（例え
ば制限エンドヌクレアーゼ消化物）から分離したプライ
マーを使用することも可能である。
【００２８】特定の核酸配列は、該配列を鋳型として含
む核酸を使用して生産される。核酸が２つの鎖を含んで
いるときは、別のステップとしてでもプライマーの伸長
生成物の合成と同時じもよいが、該核酸は鋳型として使
用される前に鎖を分離する必要がある。この鎖分離は、
物理的、化学的及び酵素的方法を含む任意の好適な変性
法により行うことができる。核酸の鎖を分離する１つの
物理的方法は、完全に（９９％以上）変性されるまで核
酸を加熱することを含む。
【００２９】典型的な加熱変性は８０から１５０℃で１
から１０分間加熱することを含む。鎖の分離は、ヘリカ
ーゼ、又はヘリカーゼ活性を有し、リボＡＴＰの存在下
でＤＮＡを変性させるものとして知られる酵素ＲｅｃＡ
として知られる酵素類からの１酵素により誘発させるこ
ともできる。ヘリカーゼで核酸の鎖を分離するのに好適
な反応条件はクーン ホフマン ベーリングによりＣＳ
Ｈ−Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙの４３
から６３頁（１９７８年）に記載され、ＲｅｃＡを使用
する技術は、Ｃ．ラディングによりＡｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓの１６巻４０５から４３７頁に記載され
ている。
【００３０】増幅すべき配列を含む当初の核酸が単鎖で
あると、その相補体をそれに１つ又は２つのオリゴヌク
レオチドプライマーを加えて合成する。好適な単一プラ
イマーが加えられると、プライマー、重合試薬及び後述
する４つのヌクレオチドの存在下でプライマーの伸長生
成物が合成される。生成物は部分的に単鎖の核酸と相補
的で、核酸鎖とハイブリダイズして長さの異なるデュプ
レックスを形成し、これは上記した通り単鎖に分離さ
れ、相補的な２つの分離された鎖となる。代わりに２つ
の好適なプライマーを単鎖に加えて反応を行うこともで
きる。
【００３１】当初の核酸が増幅すべき配列を構成するな
らば、プライマーの伸長生成物は当初の核酸の鎖と完全
に相補的となり、ハイブリダイズして同じ長さの鎖から
成るデュプレックスを形成し、これは分離されて単鎖の
分子となる。核酸の相補的な鎖が分離すると、当初の核
酸が二重鎖であっても単鎖であっても、その鎖は他の核
酸鎖の合成用鋳型として容易に使用することができる。
この合成は任意の好適な方法を用いて行うことができ
る。通常それは好ましくはpHが７から９、最も好ましく
は８である緩衝水溶液中で起こる。好ましくは過剰のモ
ル比（クローン化された核酸については、通常プライマ
ー対鋳型が１０００：１、そしてゲノムの核酸について
は通常プライマー対鋳型が１０6 ：１）の２つのオリゴ
ヌクレオチドプライマーを分離された鋳型鎖を含む緩衝
水溶液中に加える。
【００３２】しかし本法を診断的用途に使用する場合に
は相補的な鎖の量は既知ではないことを理解すべきであ
り、従って相補的な鎖の量に関連するプライマーの量を
確信をもって決定することはできない。しかし実際に
は、増幅すべき配列が複雑な長鎖の核酸鎖の混合物中に
含まれる場合には、加えられるプライマーの量は相補的
な鎖（鋳型）の量よりも通常モル過剰とする。本法の効
率を改良するためには、大きな過剰モル比とすることが
好ましい。
【００３３】デオキシリボヌクレオシド三リン酸である
デオキシＡＴＰ、デオキシＣＴＰ、デオキシＧＴＰ及び
ＴＴＰの十分な量も合成混合物に加え、生成する溶液を
約９０−１００℃で約１から１０分、好ましくは１から
４分間加熱する。この加熱時間の後、溶液の温度をプラ
イマーのハイブリダイゼーションに好適な２０−４０℃
まで下げる。
【００３４】この冷却した混合物に重合試薬を加え、従
来知られている条件下で反応を行わせる。この合成反応
は、室温からそれを越えると重合試薬が効率的に機能し
ない温度までの間で行わせることができる。従って例え
ばＤＮＡポリメラーゼを重合試薬として使用するとき
は、温度を通常４５℃以上に上昇させない。シグナルを
検出するのに有効な量のジメチルスルフォキシド（ＤＭ
ＳＯ）を存在させ、又は温度を３５〜４０℃とすること
が好ましい。
【００３５】最も好ましいのは、５−１０容量％のＤＭ
ＳＯを存在させ、温度を３５−４０℃とすることであ
る。増幅すべき配列がＨＬＡ ＤＱ−α又は−β遺伝子
のような１１０を越える塩基対断片であるような用途の
場合には、有効量（例えば１０容量％）のＤＭＳＯを増
幅用混合物に加えかつ反応を３５−４０℃で行って、検
出できる結果を得るか又はクローニングを可能にする。
【００３６】重合試薬は、プライマーの伸長生成物の合
成を達成できるものならば、酵素を含むどのような化合
物でも系でもよい。この目的のための好適な酵素は、例
えばＥ．コーリーＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．コーリー
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼ、他の入手できるＤＮＡポリメラーゼ、逆転写
酵素及び耐熱性酵素を含む他の酵素を含み、これらは好
適な態様でヌクレオチドの結合を促進し、各核酸鎖と相
補的であるプライマーの伸長生成物を形成する。
【００３７】一般に合成は各プライマーの３′末端から
始まり、合成が終了するまで鋳型鎖に沿って５′末端方
向に向かって進行し、異なった長さの分子を生成する。
しかし上述の方法と同じ方法を用いて５′末端で合成を
始め、他の方向に向かって反応を進行させる試薬があろ
う。新たに合成された鎖とそれと相補性を有する核酸鎖
は、本法のその後のステップにおいて使用される二重鎖
分子を形成する。次のステップでは、二重鎖分子の鎖は
上述の任意の手順を用いて分離され、単鎖分子を提供す
る。
【００３８】新たな核酸が該単鎖分子上で合成される。
追加の誘導試薬、ヌクレオチド及びプライマーを、上記
に規定した条件下で反応を進行させるために必要ならば
加えてもよい。オリゴヌクレオチドプライマーの一末端
から再度合成が始まり、そして鋳型の単鎖に沿って進行
して他の核酸を生成する。このステップの後における伸
長生成物の半分は２つのプライマーが結合した特定の核
酸配列から成っている。鎖分離と伸長生成物合成のステ
ップは、特定の核酸配列を所定量生産するまで必要なだ
けの回数繰り返すことができる。後により詳細に記載す
るように、特定の核酸配列は指数的に蓄積する。
【００３９】最初の核酸又は核酸の混合物から２以上の
特定の核酸配列を生産することが望ましい場合は、好適
な数の異なったオリゴヌクレオチドプライマーを使用す
る。例えば２つの異なった特定の核酸配列を生成する場
合には、４つのプライマーを使用する。プライマーのう
ちの２つは特定の核酸配列のうちの１つに関するもの
で、他の２つのプライマーは第２の特定の核酸配列に関
するものである。これにより、２つの異なった特定の配
列が本法を用いて指数的に生産され得る。本発明は、各
ステップ後に新しい試薬を加える段階的方法、又は全て
の試薬を初期のステップで加える同時的方法、又はある
与えられた数のステップの後に新しい試薬を加える一部
段階的で一部同時的である方法のいずれによっても行う
ことができる。
【００４０】熱処理のように重合試薬を不活性化する鎖
分離方法を採用した場合には、熱に対して不安定である
酵素の場合がそうであるように、各鎖分離ステップ後に
重合試薬を補充することが必要である。ヘリカーゼのよ
うな酵素的手段を含む多数の精製された成分を鎖分離ス
テップで使用する場合は、同時的方法を使用することが
できる。
【００４１】同時的方法では、反応混合物は、所望の配
列を含む核酸鎖の他に、鎖分離酵素（例えばヘリカー
ゼ）、ｒＡＴＰのような鎖分離酵素への適切なエネルギ
ー供給源、４つのヌクレオチド、モル過剰のオリゴヌク
レオチドプライマー及びＥ．コーリーＤＮＡポリメラー
ゼＩのクレノー断片のような誘導試薬を含むことができ
る。同時的方法で変性のために熱を使用するときは、誘
導試薬に依存するが好ましくは ６５−９０℃の高温で
機能する熱安定性ポリメラーゼ等の熱安定性誘導試薬を
使用し、この温度で核酸は平衡状態にある単鎖と二重鎖
から成っている。
【００４２】長さの短い核酸には、約５０℃程度の低温
が採用される。どの程度の高温が使用できるかは、その
温度で酵素が失活するかあるいはプライマーのハイブリ
ダイゼーションが不十分な程度しか起こらないかどうか
に依存する。このような熱安定性酵素は、例えばＡ．
Ｓ．カレディンらによりＢｉｏｋｈｉｍｉｙａ４５巻６
４４−６５１頁（１９８０年）に記載されている。本法
の各ステップは、全ての試薬が始めから存在するにもか
かわらず、続いて起こる。必要ならば追加の試薬を加え
てもよい。適切な長さの時間が経過して所望量の特定の
核酸配列が生成した後、任意の公知方法で酵素を失活さ
せるか反応成分を分離するかして反応を停止させる。
【００４３】本発明方法は連続的に行ってもよい。オー
トメーション化された方法の一態様として、反応を、変
性区域、試薬添加区域及び反応区域を通ってサイクルさ
せるような方法がある。他の態様では、プライマーの伸
長生成物の合成に使用する酵素をカラム中で固定化する
ことができる。他の反応成分は連続するカラムと加熱用
コイルを通るようにポンプを使って連続的に循環され、
これにより、生成した核酸が酵素を失活させることなく
繰り返し変性される。
【００４４】本発明の概略が下記に示され、ここでは相
補的な鎖〔Ｓ+ 〕と〔Ｓ- 〕から成る所望配列〔Ｓ〕を
含む二重鎖ＤＮＡが核酸として使用されている。第１の
及び引き続いて起こる反応サイクルでは、当初の鋳型上
の各オリゴヌクレオチドプライマーの伸長は、プライマ
ーの１つとともにのみ終了する制限のない長さの、１つ
の新しいｓｓＤＮＡ分子生成物を生成する。以後「長鎖
生成物」と呼ぶこれらの生成物は直線的に蓄積し、つま
り任意数のサイクルの後に存在する量はサイクル数に比
例する。
【００４５】このように生産される長鎖生成物は、引き
続いて起こるサイクルの間一方又は他方のオリゴヌクレ
オチドプライマーの鋳型として機能し、所望配列
〔Ｓ+ 〕又は〔Ｓ- 〕の分子を生成する。これらの分子
も一方又は他方のオリゴヌクレオチドプライマーの鋳型
として機能し、更に他の〔Ｓ+ 〕及び〔Ｓ- 〕を生成
し、従ってサイクル数に関連して指数的に〔Ｓ〕の蓄積
を生じさせる連鎖反応が維持される。オリゴヌクレオチ
ドのハイブリダイゼーションにより形成される意図され
ない副生成物は、それ自身触媒活性がなく（稀な例を除
く）、従って直線的に蓄積する。
【００４６】
【表１】
【００４７】
【表２】
【００４８】
【表３】
【００４９】
【表４】
【００５０】一方のプライマーのオリゴヌクレオチド配
列と共に終る鎖及び他方の相補的配列の各鎖は、生産す
ることが望まれている特定の核酸配列〔Ｓ〕であること
が分かる。本法のステップは、プライマー１及び２、重
合試薬及び存在するヌクレオチドの量によってのみ限定
される以外、無限に繰り返すことができる。検出のため
には、例えば試料の特性に依存する量である検出できる
シグナルを発生させるために要求される回数のサイクル
を実施する。例えば試料が純粋か希釈されたものなら
ば、複雑な混合物であるものよりも、少ない回数しか要
求されない。試料がヒトのゲノムＤＮＡであると、サイ
クルの回数は、約１０−５０回が好ましい。
【００５１】最初の核酸は複製されないので、その量は
全工程中一定である。長鎖生成物は最初の核酸からのみ
生産されるので、その量は直線的に増加する。特定の配
列の量は指数的に増加する。従って特定の配列はその量
が増加して優勢な成分となる。このことは次表に示さ
れ、該表は各サイクルの効率が１００％であるとした場
合のｎサイクル後の理論的に存在する成分量を比較した
ものである。
【００５２】 ０からｎサイクル後の二重鎖の数 サイクル数 鋳型 長鎖生成物 特定配列〔Ｓ〕 ０ １ −− −− １ １ １ ０ ２ １ ２ １ ３ １ ３ ４ ５ １ ５ ２６ １０ １ １０ １，０１３ １５ １ １５ ３２，７５２ ２０ １ ２０ １，０４８，５５５ ｎ １ ｎ ２n −ｎ−１
【００５３】単鎖の核酸を鋳型として使用すると、サイ
クルあたり１つの長鎖生成物が生成する。本法は好適な
発現ベクターに特定の核酸配列を挿入するためにクロー
ン化するのに使用できる。該ベクターは適切な宿主生物
を形質転換して標準的な組み換え体ＤＮＡ技術により遺
伝子生成物を生産する際に使用できる。通常このような
クローニングはベクターへの直接の連結反応又はオリゴ
ヌクレオチドリンカーの付加とそれに引き続く制限酵素
による開裂を含んでいる。しかし両法とも反応性が不十
分である平滑末端の連結反応を含んでいる。更に両法と
もクローニングベクターへの増幅された生成物を挿入す
る際の位置とその数を制御することができない。
【００５４】本増幅工程では、最初の鋳型核酸、期待さ
れる標的増幅生成物及び種々のバックラウンド非標的生
成物に由来する核酸の混合物が得られる。最初の鋳型Ｄ
ＮＡが、例えばヘテロ接合二量体遺伝子中におけるよう
な多数の標的配列を含むか、又は一連の関連した遺伝子
群がある場合にも、増幅された生成物は混合物となる。
本法のプライマーを、増幅反応で生産されるＤＮＡ混合
物の迅速かつ特異的なクローニングを補助するために修
飾してもよい。このような修飾では、同じか又は異なっ
た制限部位がプライマーの５′末端に導入されて増幅さ
れた生成物の２つの末端に制限部位が生じる。好適な酵
素で切断すると、増幅された生成物は容易にプラスミド
又はベクター中に挿入されクローニングされる。このク
ローニングは、混合物ではなく、個々の増幅された生成
物分析又は発現を可能にする。
【００５５】同じ制限部位を両プライマーに使用するこ
とができるが、異なった制限部位を使用すると生成物を
特定の方向にベクターに挿入することができ、かつ２つ
のプライマーのうちの１つのみに起因する増幅から生ず
る挿入だけでなく多数の挿入も抑制することができる。
単鎖配列決定用ベクターへクローニングする場合、単鎖
ハイブリダイゼーションプローブが使用される場合、及
びクローン化された生成物が発現されるべき場合には、
特定方向へ挿入することが有用である。
【００５６】プライマーを調製する１つの方法は、標的
配列と僅かしか異ならないプライマー配列を選択するこ
とである。各プライマーが位置すべき領域は、所望のベ
クターに好適な制限部位に相同であるようにスクリーニ
ングされる。例えば“CAGTATCCGA... " という標的配列
は、ＢａｍＨＩ部位を含む配列と僅かに一塩基が異なる
にすぎない。プライマー配列はその３′末端において目
的物に正確にマッチしかつその５′末端の近傍に変形し
た配列と制限部位を有するように選択される（例えば
“CAGgATCCGA..”の小文字は標的配列とマッチしていな
いことを意味する）。この僅かに変化した配列は最初の
標的配列とハイブリダイズし重合を開始するプライマー
の能力を妨げるものではない。第１の増幅サイクルの
後、プライマーはコピーされ、標的となり、かつ新しい
プライマーと正確にマッチする。
【００５７】増幅工程後、生成物は適切な制限酵素で開
裂され、そして必要ならば脱塩カラム又は分子量クロマ
トグラフィーカラムを通してヌクレオチド三リン酸や塩
等の連結阻害剤から分離され、そして連結反応によりバ
クテリオファージＭ１３のようなクローニングベクター
に挿入される。遺伝子は、周知の技術を用いて配列決定
され、そして／又は発現される。
【００５８】プライマーを調製する第２の方法は、プラ
イマーの３′末端を標的配列から採用し、そしてプライ
マーの５′末端に所望の制限部位を付加することを含
む。この例としてＨｉｎｄIII が配列“cgaagcttCAGTAT
CCGA... ”を形成するために付加され、ここで小文字の
意味は上記の通りである。加えられた塩基は増幅の第１
サイクルのハイブリダイゼーションには寄与しないが、
その後のサイクルにおいてマッチする。増幅された最終
生成物は制限酵素で切断され、上記の通りクローニング
され、そして発現される。増幅される遺伝子は、例えば
ヒトのβ−グロビン、又はヒトのＨＬＡ ＤＱ，ＤＲも
しくはＤＰ−α及び−β遺伝子である。
【００５９】更に本法はインビトロの突然変異用として
使用することができる。オリゴデオキシリボヌクレオチ
ドは増幅されるべきＤＮＡ配列と正確に相補的である必
要はない。これらは、ポリメラーゼ酵素や他に使用され
るいずれかの誘導試薬によって伸長されるために十分な
程度に、鎖とハイブリダイズすることができればよい。
使用するプライマーが最初の鋳型と正確に相補的でない
場合のポリメラーゼ連鎖反応の生成物は鋳型よりむしろ
プライマー配列を有し、これによりインビトロの突然変
異を可能にする。
【００６０】引き続くサイクルでは、より以上のミスペ
アープライミングが必要とされないので、この突然変異
が減ることのない効率下で増幅される。このように生産
された突然変異体は標準的な分子生物学的技術により適
切なベクター中へ挿入され、変化した蛋白質を生産する
能力等の変化した特質をこのベクターに与える。
【００６１】上述した変化したＤＮＡ配列を形成する方
法は、より以上の配列変化を誘発させるために異なった
プライマーを使用して該変化したＤＮＡに対して繰り返
すことができる。この方法では、一連の突然変異配列が
徐々に生成され、ここでこの一連のものに新しく加えら
れるものは、最後のものと僅かに異なることができる
が、最初のＤＮＡ源配列とは非常に大きく異なることが
できる。この方法では、非常に大きなミスマッチの場合
にプライマーが機能しないために単一ステップでは行う
ことのできない変化を、最終的には作り出すことができ
る。
【００６２】更に、十分な量のプライマーが増幅される
鎖に相補的である配列を含むのであれば、プライマーは
その配列の一部として相補的でない配列を含むことがで
きる。例えば鋳型配列に相補的でない核酸配列（例えば
プロモーター、リンカー、コード配列等）を、１つ又は
両方のプライマーの５′末端に結合させることができ、
これにより増幅工程の生成物にこれを付加することがで
きる。伸長プライマーを添加した後、相補的でない核酸
挿入部を含む新しい鋳型の所望量を得るために十分な数
のサイクルを実施する。これにより簡単な技術を用いて
比較的短時間（例えば２時間又はそれ以下）内に組合わ
された断片を大量に生産することが可能になる。
【００６３】更に本法においては、最初の短い核酸断片
の鎖を分離することにより生成する単鎖の３′末端に相
補的かあるいは実質的に相補である３′末端を有し、か
つ５′末端が中央切片に付加されるべき配列の情報を含
むものであるプライマーを使用して、生成物より短鎖で
ある既存の核酸断片（これを中央セグメントという）か
ら核酸断片を合成することができる。この方法は、 （ａ）各核酸鎖に相補的である、各プライマーの伸長生
成物が合成される条件下で、該既存の断片の鎖を２つの
オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、ここで該２つ
のプライマーは、一方のプライマーから合成される伸長
生成物がその相補体から分離されたときに他方のプライ
マーの伸長生成物の合成のための鋳型としての役割を果
たすことができるように、前記既存断片の各鎖の３′末
端と実質的に相補的であるように選択され、そして各プ
ライマーはその５′末端において前記既存断片と相補的
でなくかつ合成される核酸断片の２つの末端に対応する
ヌクレオチド配列を含むものであり； （ｂ）その上でプライマーの伸長生成物が合成された鋳
型からプライマーの伸長生成物を分離して単鎖分子を生
成せしめ； （ｃ）ステップ（ｂ）から生じた単鎖分子をステップ
（ａ）のプライマーによりステップ（ｂ）において生成
した各単鎖を鋳型として用いてプライマー伸長生成物が
合成される条件下で処理し、こうして２つの中間二重鎖
核酸分子（このそれぞれには、オリゴヌクレオチドプラ
イマーの一方の５′末端に存在する核酸配列が導入され
ている）と２つの十分に長い二重鎖核酸分子（このそれ
ぞれには、オリゴヌクレオチドプライマーの両者の５′
末端に存在するヌクレオチド配列が導入されている）を
生成せしめ； （ｄ）前記十分な長さの二重鎖分子の有効量を生産する
のに十分な回数ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）を繰り
返し； （ｅ）ステップ（ｄ）の生成物の鎖を２つのプライマー
で処理して、ステップ（ｄ）の生成物が両末端において
伸びるようにし；そして （ｆ）中央セグメントとしてのステップ（ｄ）の生成物
及びステップ（ｄ）の生成物の鎖を分離することにより
生成する単鎖の３′末端と相補的か実質的に相補的であ
る２つのオリゴヌクレオチドプライマーをして使用しな
がらステップ（ａ）からステップ（ｄ）までを繰り返
す； ことから成る方法である。
【００６４】ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）は必要な
だけ通常少なくとも５回繰り返して、最終生成物を合成
するために必要な量（すなわち、有効量）の十分に長い
二重鎖生成物を生産する。更に中央のセグメントを、先
行する増幅サイクルの生成物として得ることができる。
ステップ（ｄ）の生成物は伸長又は増幅の新たなサイク
ルの前に精製され、又は生成物を含む反応混合物とし直
接使用する。
【００６５】プライマーの３′末端が最初の一層短い鎖
野核酸の単鎖の３′末端と正確に相補的でないときは、
生成物の中央のセグメントは該最初の一層短い鎖の核酸
にある配列情報と正確に同じではない。従って最初の核
酸の変異体を、その３′末端が最初の一層短い鎖の核酸
の単鎖の３′末端と実質的に相補的であるプライマーを
用いて作り出すことができる。
【００６６】制限部位リンカーがプライマーに導入され
ると、増幅された二重鎖生成物が適切な制限酵素で消化
され、迅速なクローニング及び配列決定のためにＭ１３
ベクター中に直接連結される。特定の増幅された標的配
列を有するＭ１３溶菌斑は、標的配列に特異的なプロー
ブと溶菌斑のリフトフィルターをハイブリダイズせしめ
ることにより同定することができる。
【００６７】本法は、伝染性疾患、遺伝性疾患又は細胞
性疾患、例えば癌、と関連する特定の核酸配列、例えば
発癌遺伝子、の検出及び／又は特徴付けを可能にするた
めに使用される。増幅は、例えば胎児細胞から得られる
ＤＮＡを用いる鎌状赤血球貧血の胎児診断等、分析に利
用できる核酸の量が非常に小さい場合に有用である。増
幅は、本来的に感度の良くない非放射性検出技術を用い
て少量の試料を分析する場合、又は放射性技術を用いる
が迅速な検出が望ましい場合に特に有用である。
【００６８】本発明の目的のためには、遺伝子疾患は、
例えば鎌状赤血球貧血、嚢胞性繊維症、α−サラセミ
ア、β−サラセミア等の、任意の生物体からのゲノムＤ
ＮＡ中の特定の欠損及び／又は変異を含む。鎌状赤血球
貧血は本法による好適なＤＮＡ配列の増幅の後のオリゴ
マー制限分析又はＲＦＬＰ状分析を経て容易に検出する
ことができる。α−サラセミアは配列が存在しないこと
により検出することができ、β−サラセミアは疾患を起
こさせる変異に近接してリンクする多形性（ｐｏｌｙｍ
ｏｒｐｌｉｃ）制限部位の存在により検出することがで
きる。
【００６９】これら全ての遺伝子疾患は適切な配列を増
幅し、それを放射性プローブを使用せずにサザンプロッ
ト法により分析して検出することができる。このような
方法では、例えば非常に少量の所望配列を含む羊水から
のＤＮＡの少量の試料を増幅し、制限酵素で切断し、そ
してサザンブロット法で分析する。増幅シグナルをハイ
レベルとすることにより、非放射性標体を使用すること
が容易になる。
【００７０】他の態様では、少量のＤＮＡを便利なレベ
ルまで増幅し、次に更に伸長反応を行うが、この場合容
易に検出できるヌクレオチド誘導体（例えば32Ｐ又はビ
オチンでラベルしたヌクレオチド三リン酸）を直接最終
のＤＮＡ生成物に導入し、これを制限分析及び電気泳動
分析あるいは任意の他の好適な方法を用いて分析する。
この技術のモデル系の例を図１２に示してある。
【００７１】図３のモデル系に示した更に他の態様で
は、核酸は増幅の前に特定の制限エンドヌクレアーゼに
暴露する。切断された配列は増幅できないので、予め制
限酵素で処理したＤＮＡ試料の存在にもかかわらず増幅
された断片が現れることは増幅された配列中にエンドヌ
クレアーゼの部位がないことを暗示する。増幅された配
列が存在するか否かは適当な方法で検出することができ
る。
【００７２】この技術の実際的な適用方法は、本明細書
とサイキらによるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３巻１０
０８−１０１２頁に記載されているオリゴマー制限技術
を用いて鎌状赤血球貧血の検出を容易にする使用により
例示することができる。鎌状赤血球貧血はβ−グロビン
遺伝子の第６コドンの１つの塩基対の変化により生ずる
ヘモグロビンの疾患である。
【００７３】図１３は多形現象（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉ
ｓｎ）領域中の正常及び鎌状赤血球貧血のβ−グロビン
遺伝子の配列を示すもので、一本線は正常遺伝子にのみ
存在するＤｄｅＩ部位の位置を示し、二本線は正常及び
鎌状赤血球貧血対立遺伝子の両方に存在する非多形性の
ＨｉｎｆＩ部位の位置を示す。図１４は両制限部位部位
間にわたり星印で示された部分がラベルされているプロ
ーブを用いて正常のβ−グロビンＤＮＡをオリゴマー制
限開裂する方法を示すものである（プローブは、制限部
位からの塩基対の数が、制限部位から他の末端までの塩
基対の数より少なくなる方の末端にラベルすることが好
ましい）。
【００７４】前に記載したようにして増幅されたＤＮＡ
が変性され、ラベルされたプローブとアニールされる。
増幅は、２次構造の形成を最小に抑えるためにジメチル
スルフォキシドの存在下温度を上げて（３５−４０℃）
実施する。酵素ＤｄｅＩはＤＮＡを再構成されたＤｄｅ
Ｉ部位で開裂させ、ラベルされたオクタマーを生じさせ
る。テストに使用した条件下では、オクタマーはデュプ
レックスから離れるのに十分な短さである。
【００７５】引き続く酵素ＨｉｎｆＩの添加は今や単鎖
であるオクタマーに何の影響も与えない。図１５はβ−
グロビンＤＮＡの鎌状赤血球対立遺伝子に適用した前記
と同じ方法を示す。酵素ＤｄｅＩは、Ａ−Ａの塩基対が
ミスマッチしたものであるため、増幅されたＤＮＡとラ
ベルされたプローブとで形成されたデュプレックスを開
裂させることはできない。
【００７６】しかし酵素ＨｉｎｆＩはハイブリッド制限
開裂せしめ、ラベルされたトリマーが生成される。実際
にはこの方法は、特定のシグナルがいずれかの対立遺伝
子の存在と関連するので、個体のＤＮＡが野性型のホモ
接合体か、鎌状赤血球貧血型のホモ接合体か又は鎌状赤
血球貧血形質を有するヘテロ接合体であるかを検診する
ことができる。上述の方法を使用して適切な配列を増幅
させることにより１つの32Ｐラベルのみを有するプロー
ブを用いて単コピー遺伝子を迅速に分析することができ
る。
【００７７】種々の伝染性疾患は、原因となる微生物に
特異的である特定のＤＮＡ配列の臨床試料中での存在に
より診断することができる。これらはサルモネラ、クラ
ミジア、ネイセリア等の細菌、肝炎ビールス等のビール
ス、マラリアの原因となるプラスモジウム（Ｐｌａｓｍ
ｏｄｉｕｍ）等の寄生体を含む。ファルコーに与えられ
た米国特許第４，３５８，５３５号は、伝染性疾患の診
断用の特別なＤＮＡハイブリダイゼーションプローブの
使用につき記述している。
【００７８】ファルコー法に固有の問題は、感染した患
者からの臨床試料中には比較的少ない数の病原生物しか
存在せず、これらから抽出されたＤＮＡは試料中の全Ｄ
ＮＡの非常に小さな部分を構成するのみであるというこ
とである。ＤＮＡ試料を固定化しハイブリダイゼーショ
ン検出する前に問題となっている配列を特異的に増幅す
ることは、これらの方法の感度と特異性を大きく改良す
る。
【００７９】伝染性疾患の診断用にＤＮＡプローブを臨
床的にルーチン化して使用することは、ワードのヨーロ
ッパ特許第６３，８７９号に記載されたいるように非放
射的にラベルされたプローブを使用するのならば、大い
に簡略化される。この方法では、ビオチンを含むＤＮＡ
プローブがアビジン又はビオチンに特異的な抗体に結合
した色素体（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ）酵素により検出
される。この型の検出は便利であるが、比較的低感度で
ある。本法による特異的なＤＮＡ増幅と安定にラベルさ
れたプローブを組み合わせることにより、ファルコー及
びワードの方法をルーチン化した臨床における有用な方
法に実施するのに要求される便利さと感度を提供するこ
とができる。
【００８０】更にプローブは、ビオチンが次式のスペー
サーアーム
【化１】 に結合したビオチン化したプローブとしてもよく、ここ
でＹは、Ｏ，ＮＨ又はＮ−ＣＨＯ，ｘは１から４までの
数、そしてｙは２から４までの数である。そして次にス
ペーサーアームは次式のプソラレン成分に結合してい
る。
【００８１】
【化２】 プソラレン成分は、クラージ・テッベによりＢｉｏｃ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，６９７巻１−５頁（１
９８２年）に記載されているように“ギャップのある環
状”のプローブに挿入しかつ架橋し、ここでギャップの
ある環の単鎖ハイブリダイゼーション領域はプライマー
に含まれる領域にわたる。
【００８２】この増幅工程は単一コピーのヒト遺伝子か
ら十分な量のＤＮＡを調製するのに利用することもで
き、これにより臭化エチジウムのような簡単な非特異的
なＤＮＡ染色によりそれを検出でき、直接ＤＮＡ診断を
行うことができる。伝染性疾患及び生物体のゲノム中の
病原的異常性を検出するほか、本法は任意の病原状態と
関連しないＤＮＡ多形現象（ポルモルフィズム）を検出
するために使用することもできる。
【００８３】次の実施例は例示のために提示するもの
で、どのようにも本発明を限定することを意図するもの
ではない。これらの実施例で全てのパーセントは固体の
場合は重量で、液体の場合は容量であり、他に指定がな
い限り温度は摂氏温度である。
【００８４】実施例１ 次のヌクレオチド配列を有する２５塩基対配列 ５′CCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCT ３′ ３′GGAGCCGTGGCAGTGGGACCTACGA ５′ （ＡＴＣＣから得られるｐＢＲ３２２の４７塩基対Ｆｏ
ｋＩ制限断片上に含まれる）を次のように調製した。４
７塩基対断片を含むｐＢＲ３２２のＦｏｋＩ消化物を供
給者であるニューイングランド社の指示による条件に従
ってｐＢＲ３２２をＦｏｋＩで消化することにより調製
した。使用したプライマーは、５′d(CCTCGGCACCG)３′
と５′d(AGCATCCAGGGTG)３′であり、通常の技術により
調製した。２５ｍＭのリン酸カリウムと１０ｍＭの塩化
マグネシウム、及び１００ｍＭの塩化ナトリウムから成
る緩衝液（pH７．５）３３μｌに２４３３ピコモルの上
述の各プライマー、２．４ピコモルのｐＢＲ３２２のＦ
ｏｋＩ消化物、２２ナノモルのデオキシＡＴＰ、２２ナ
ノモルのデオキシＣＴＰ：１９ナノモルのデオキシＧＴ
Ｐ及び１０ナノモルのＴＴＰを加えた。
【００８５】混合物を８５℃で５分間加熱し、室温まで
冷却した。Ｅ．コーリーＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ
ー断片の５単位を加え、温度を１５分間維持した。その
後再度８５℃で５分間加熱し、冷却した。クレノー断片
の５単位を再度加え、１５分間反応を行った。加熱、冷
却及び反応の各ステップを更に１１回繰り返した。
【００８６】最後の繰り返しの後、５μｌを反応混合物
から取り出した。これを８５℃で３分間加熱し、室温に
冷却した。１２．５ピコモルのα−Ｐ32−デオキシシチ
ジン三リン酸と５単位のクレノー断片を加え反応を１５
分間進行させた。ラベルされた生成物をポリアクリルア
ミドゲルの電気泳動で確認した。１３サイクル後に見え
る強くラベルされたバンドのみが、意図する２５塩基対
配列であった。
【００８７】実施例２ 増幅されるべき所望の配列は、ヒトのβ−グロビン遺伝
子に含まれかつ鎌状赤血球貧血に関するＭｓｔII部位に
伸びる９４塩基対の配列であった。該配列は図１に示す
ヌクレオチド配列を有している。
【００８８】Ｉ．プライマーの合成 次の２つのオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
を下記する方法を用いて調製した。 ５′CACAGGGCAGTAACG ３′プライマーＡ、及び ３′TTTGCTTCTGACACA ３′プライマーＢ
【００８９】オートメーション化された合成法 ビューケージとカルサース法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔｅｒｓ２２巻１８５９−１８６２頁（１９８
１年）に従って合成したジエチルフォスフォロアミダイ
トを、バイオサーチＳＡＭ−１を使用して制御した多孔
ガラス担体から誘導したヌクレオシドへ次々と濃縮し
た。この方法は、ジクロルメタン中でのトリクロル酢酸
による脱トリチル化と活性のある水素供与体としてベン
ゾトリアゾールを使用する縮合、及びテトラハイドロフ
ラン及びピリジン中での無水酢酸とジメチルアミノピリ
ジンによるキャッピングを含んでいた。１サイクルの時
間は約３０分であった。各ステップの収率は実質的に当
量的であり、脱トリチル化の間に解離するジメトキシト
リチルアルコールを集め分光器による検査で決定した。
【００９０】オリゴデオキシリボヌクレオシドを脱保護
化し、精製する方法 固体担体をカラムから取り出し、１mlの濃水酸化アンモ
ニウムに閉鎖管中室温で４時間曝した。担体を濾過で取
り除き、一部が保護されたオリゴデオキシリボヌクレオ
チドを含む溶液の温度を５５℃に上昇させ、５時間維持
した。アンモニアを取り除き、残渣を調製用ポリアクリ
ルアミドゲルに適用した。３０ボルト／cmで９０分間電
気泳動を行い、生成物を含むバンドを螢光プレート上の
ＵＶシャドウイングで同定した。
【００９１】該バンドを切り取り、１mlの蒸留水で一晩
かけて４℃で溶出した。この溶液をアルテックＲＰ１８
カラムにかけ、pH６．０の１％酢酸アンモニウム緩衝液
中７−１３％のアセトニトリルで溶出した。この溶出液
は２６０nmの紫外吸収でモニターし、適切なフラクショ
ンを集め、固定した量での紫外吸収で定量分析し、かつ
室温下で減圧遠心機中で蒸発させ乾燥した。
【００９２】オリゴデオキシリボヌクレオチドの特徴付け 精製したオリゴヌクレオチドのテスト溶液をポリヌクレ
オチドキナーゼ及びγ32Ｐ−ＡＴＰで32Ｐラベルした。
このラベルした化合物を５０ボルト／cmで４５分間電気
泳動にかけた後、１４−２０％のポリアクリルアミドゲ
ルのオートラジオグラフィーで確認した。この方法では
分子量を確認することができる。ヘビ毒ジエステラーゼ
と細菌性アルカリフォスファターゼを使用してオリゴデ
オキシリボヌクレオチドをヌクレオシドに消化し、そし
て次に、逆相ＨＰＬＣカラム、並びに１０％アクリロニ
トリル及び１％酢酸アンモニウム移動相を使用して、誘
導されたヌクレオシドを分離し定量することにより塩基
組成を決定した。
【００９３】II．ＤＮＡ源 Ａ．全ヒト野性型ＤＮＡの抽出 正常のβ−グロビンのヒトゲノムＤＮＡホモ接合体を、
ステットラーらによりＰｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．の７２巻５９６６−５９７０頁に記載された技術
を用いてセルラインＭｏｌｔ４（ヒューマン・ジェネテ
ィック・ミュータント・セル・レポジトリーから入手
し、ＧＭ２２１９ｃと同定した）から抽出した。
【００９４】 Ｂ．クローン化したグロビン遺伝子の造成 正常のβ−グロビン遺伝子の１．９kbのＢａｍＨＩ断片
をコスミドｐＦＣ１１から分離し、ｐＢＡ３２２のＢａ
ｍＨＩ部位に挿入した（ソベロンらのＧｅｎｅ９巻２８
７−３０５頁（１９８０年））。合成４０塩基対プロー
ブとハイブリダイズする領域を含むこの断片は、第１及
び第２のエクソン、第２のイントロン、並びに遺伝子の
５′のフランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列を含む
（ローンらのＣｅｌｌ１５巻１１５７−１１７４頁）。
このクローンはｐＢＲ３２８：ＨｂＡと名付けられ、Ａ
ＴＣＣ第３９，６９８号として１９８４年５月２５日に
寄託された。
【００９５】β−グロビンの鎌状赤血球貧血対立遺伝子
の対応する１．９kbのＢａｍＨＩ断片はコスミドｐＦ１
２から分離され、上述の通りクローン化された。このク
ローンはｐＢＲ３２８：Ｈｂｓと名付けられ、ＡＴＣＣ
第３９，６９９号として１９８４年５月２５日に寄託さ
れた。各組み換えプラスミドをＥ．コーリーＭＭ２９４
（ＡＴＣＣ第３９，６０７号）へ形質変換し、そして増
殖せしめた。
【００９６】Ｃ．クローン化されたグロビン遺伝子のＭ
ｓｔIIによる消化 それぞれの全量が１００μｇであるｐＢＲ３２８：Ｈｂ
ＡとＰｂｒ３２８：ＨｂＳを単独で２０単位のＭｓｔII
（ニューイングランドバイオラブ社）とともに１６時間
３７℃、１５０ｍＭＮａＣｌ，１２ｍＭのＴｒｉｓ Ｈ
Ｃｌ（pH７．５），１２ｍＭのＭｇＣｌ2 ，１ｍＭのジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）及び１００μｇ／mlのウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）中で消化した。生成物はそれ
ぞれｐＢＲ３２８：ＨｂＡ／ＭｓｔII及びとｐＢＲ３２
８：ＨｂＳ／ＭｓｔIIと名付ける。
【００９７】III ．ポリメラーゼの連鎖反応 ６０ｍＭ酢酸ナトリウム、３０ｍＭトリス−アセテート
及び１０ｍＭ酢酸マグネシウムを含むpH８．０の緩衝液
１００μｌへ１００ピコモルのプライマーＡ（d(CACAGG
GCACTAACG)の配列）、１００ピコモルのプライマーＢ
（d(TTTGCTTCTGACACA)の配列）及び１０００ピコモルの
デオキシＡＴＰ、デオキシＣＴＰ、デオキシＧＴＰ及び
ＴＴＰを含む２μｌの溶液を加えた。更に上述した、下
記のＤＮＡ源の１つを加えた。
【００９８】 １０μｇの全ヒト野性型ＤＮＡ（反応Ｉ） ０．１ピコモルのｐＢＲ３２８：ＨｂＡ（反応II） ０．１ピコモルのｐＢＲ３２８：ＨｂＳ（反応III ） ０．１ピコモルのｐＢＲ３２８：ＨｂＡ／ＭｓｔII（反
応IV） ０．１ピコモルのｐＢＲ３２８：ＨｂＢ／ＭｓｔII（反
応Ｖ） 非標的ＤＮＡ（反応VI）
【００９９】得られる各溶液を１００℃で４分間加熱し
２分間で室温まで冷却し、その後Ｅ．コーリーＤＮＡポ
リメラーゼのクレノー断片の４単位を含む１μｌを加え
た。各反応は１０分間行い、その後プライマー、ヌクレ
オチド及びＤＮＡを加え、加熱し、冷却し、ポリメラー
ゼを加え、そして反応させるサイクルを反応Ｉについて
は１９回、反応II−VIについては４回繰り返した。
【０１００】第１サイクルの前及び各反応の最後のサイ
クルの後で取り出された反応Ｉ及びIIのアリコート４マ
イクロリットルをpH８．３の０．０８９Ｍトリス硼酸塩
緩衝液中で、２．５ｍＭＥＤＴＡ中で、１２％ポリアク
リルアミドゲルに加えた。このゲルを２５ボルト／cm、
４時間電気泳動させ、固相担体として機能するナイロン
膜へ移し、そしてpH７．４で３０％のフォルムアミド、
３ｘＳＳＰＥ，５ｘデンハルツ及び５％のドデシル硫酸
ナトリウム中で、標準的技術を用いて調製した次式： ５′d(TCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAG) ３′ の32Ｐでラベルされた４０塩基対の合成断片で検知し
た。
【０１０１】図２は反応Ｉ及びII用の検知されたナイロ
ン膜のオートラジオグラフである。レーン１は０．１ピ
コモルの５８塩基対の対照合成断片で、そのうちの１つ
の鎖は上記プローブと相補的である。レーン２は第１の
増幅サイクルの前の４μｌの反応１の液である。レーン
３は２０回の増幅サイクル後の４μｌの反応１の液であ
る。レーン４は５回の増幅サイクル後の４μｌの反応II
の液である。
【０１０２】レーン５はα−32Ｐ−デオキシＮＴＰ及び
ポリメラーゼでラベルされたｐＢＲ３２２（ニューイン
グランドバイオラブ社）のＦｏｋＩ（ニューイングラン
ドバイオラブ社）から成る分子量標準である。レーン３
は、２０サイクル後反応混合物Ｉは適切な分子量を有す
る特定の配列を大量に含み、他の検出できる生成物がな
いことを示している。５サイクル後の反応混合物IIもレ
ーン４に示す通り出発物質である核酸と他の生成物の他
にこの生成物も含んでいる。
【０１０３】５サイクル後の反応IIからVIの液５．０μ
ｌに上述の各プライマー５ピコモルを加えた。溶液を４
分間１００℃に加熱し室温へ戻した。それぞれ３ピコモ
ルのα−32Ｐ−デオキシＡＴＰ，α−32Ｐ−デオキシＣ
ＴＰ，α−32ＰデオキシＧＴＰ及びα−32Ｐ−ＴＴＰ、
並びに４単位のクレノー断片を加えた。最終的な容積が
１０μｌであり塩濃度が上記した通りである反応を１０
分間行わせた。ポリメラーゼ活性は６０℃で２０分間加
熱すると失われた。反応II−VIの反応液４μｌを、０．
０８９Ｍトリス硼酸塩緩衝液、２．５ｍＭＥＤＴＡ中で
１２％ポリアクリルアミドゲルに加えた。このゲルを２
５ボルト／cm、４時間電気泳動させ、その後オートラジ
オグラフ処理した。
【０１０４】図３は、電気泳動のオートラジオグラフで
ある。レーン１は分子量標準、レーン２は反応II、レー
ン３は反応III 、レーン４は反応IV及びレーン５は反応
Ｖである。対照としてのＤＮＡを伴わない反応VIのレー
ンはレーンのどこにもイメージを有さない。
【０１０５】図から、標的ＤＮＡから予想される９４塩
基対断片は、無傷のβ−グロブリンＤＮＡ配列が増幅用
に使用できるときのみ存在できることが分かる（つまり
レーン２のｐＢＲ３２８：ＨｂＡ、レーン３のｐＢＲ３
２８：ＨｂＳ及びレーン５のｐＢＲ３２８：ＨｂＳ／Ｍ
ｓｔII）。ＭｓｔIIによる消化はｐＢＲ３２８：ＨｂＡ
を９４塩基対配列中で切断し、それを増幅できないよう
にし、９４塩基対のバンドはレーン４に現れない。これ
に対し、ｐＢＲ３２８：ＨｂＳの９４塩基対配列はプラ
スミドがＭｓｔIIで消化されても切断せず、従って図１
２に示すように増幅に利用できる。
【０１０６】図５〜図１０は９４塩基対配列を増幅する
３サイクルの連鎖反応を示すものである。ＰＣ０１とＰ
Ｃ０２はプライマーＡ及びＢである。右の数はサイクル
を示し、左の数は特定の分子が生産されたサイクル数を
示す。
【０１０７】実施例３ 本実施例は、ヒトヘモグロビン遺伝子中の対立遺伝子Ｍ
ｓｔII部位を含む１１０塩基対配列の増幅を示すもので
ある。プライマーは実施例２の技術で調製されたもので
ある。１．０マイクログラムの全ヒトＤＮＡ，１００ピ
コモルのd(ACACAACTGTGTTCACTAGC) 及び１００ピコモル
のd(CAACTTCATCCACGTTCACC) を以下のような１００μｌ
の溶液に溶解させた。
【０１０８】１．５ｍＭ各４つのデオキシリボヌクレオ
シド三リン酸 ３０ｍＭpH７．９のトリスアセテート緩衝液 ６０ｍＭ酢酸ナトリウム １０ｍＭ酢酸マグネシウム ２５ｍＭジチオスレイトール
【０１０９】この溶液を１００℃で１分間加熱し、迅速
に２５℃に下げて１分間加熱し、その後ＤＮＡポリメラ
ーゼのクレノー断片２．５単位を加えた。ポリメラーゼ
の反応が２５℃で２分間行い、その後加熱、冷却、クレ
ノー断片の添加及び反応を望むだけ繰り返した。各サイ
クルの効率が７０℃で、１５サイクル行って、β−グロ
ビン遺伝子の所望の１１０塩基対断片１．４フェトモル
を合成した。
【０１１０】実施例４ 本実施例は、ヒトヘモグロビン遺伝子の対立遺伝子中の
ＭｓｔII部位を含む２４０塩基対配列の増幅を示すもの
である。この配列は、ＮｃｏＩ，ＨｉｎｆＩ及びＭｓｔ
II制限部位を含んでいる。pHが８．０で、６０ｍＭ酢酸
ナトリウム、３０ｍＭトリスアセテート及び１０ｍＭ酢
酸マグネシウムの混合物（０．１ピコモルのｐＢＲ３２
８：ＨｂＡを含む）に、 １００ピコモルのd(GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG) プライマ
ー、 １００ピコモルのd(TAACCTTGATACCAACCTGCCC) プライマ
ー、 各１０００ピコモルのデオキシＡＴＰ、デオキシＣＴ
Ｐ、デオキシＧＴＰ及びＴＴＰを含む２μｌの溶液Ａを
加えた。
【０１１１】２つのプライマーは実施例２に記載した技
術で調製した。溶液を１００℃で４分間加熱し、空気中
で２分間冷却し、その後Ｅ．コーリーＤＮＡポリメラー
ゼのクレノー断片４単位を含む液１μｌを加えた。反応
を１０分間進行させ、その後溶液Ａの添加、加熱、冷
却、ポリメラーゼの添加及び反応からなるサイクルを３
回繰り返した。反応液５．０μｌに、上記の各オリゴヌ
クレオチドプライマー５ピコモルを加えた。溶液を１０
０℃で４分間加熱し、室温まで下げ、その後それぞれ３
ピコモルのα−32Ｐ−ラベルされたデオキシリボヌクレ
オシド三リン酸及び４単位のクレノー断片を加えた。最
終的な容量が１０μｌで塩濃度が上記の通りである反応
を１０分間進行させる。
【０１１２】ポリメラーゼ活性は６０℃で２０分間加熱
すると失活した。２μｌのアリコートをＮｃｏＩ、Ｈｉ
ｎｆＩ及びＭｓｔIIで消化し、pH８．３の０．０８９Ｍ
トリスアセテート緩衝液、０．２５ｍＭＥＤＴＡ中で１
２％ポリアクリルアミドゲルに加えた。ゲルを２５ボル
ト／cmで４時間電気泳動させ、オートラジオグラフ処理
した。図１２は電気泳動のオートラジオグラフを示し、
ここでレーン１は分子量標準、レーン２は酵素の消化を
伴わないもの（無傷の２４０塩基対）、レーン３はＮｃ
ｏＩによる消化（１３１及び１０９塩基対）、レーン４
はＭｓｔIIによる消化（１４９及び９１塩基対）、そし
てレーン５はＨｉｎｆＩによる消化（１４４及び９６塩
基対）である。オートラジオグラフは２４０塩基対反応
の増幅したものと一致する。
【０１１３】実施例５ 本実施例は、逐次的消化による鎌状赤血球貧血を検出す
るための本発明の方法の使用を示すものである。オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成及びリン酸化 ５′* CTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGG ３′ の配列のラベルされたＤＮＡプローブ（* がラベルを意
味する）ＲＳ０６、及びＲＳ０６と３つの塩基対がミス
マッチしている ３′GACAGAGGTCACCTCTTCAGACGGCAATGACGGGACACCC ５′ の配列のラベルされていないブロックオリゴマーＲＳ１
０を、実施例２（Ｉ）の方法に従って合成した。
【０１１４】プローブＲＳ０６は、その５ピコモルを、
７０ｍＭトリス緩衝液（pH７．６），１０ｍＭＭｇＣｌ
2 ，１．５ｍＭスペルミン及び２．５ｍＭジチオスレイ
トールを含む反応容量４０μｌ中の４単位のＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼ（ニューイングランドバイオラブ
社）及び５０ピコモルのγ−32Ｐ−ＡＴＰ（ニューイン
グランドニュークレア社、約７２００Ｃｉ／ミリモル）
と接触させることによりラベルした。
【０１１５】全容量を２５ｍＭＥＤＴＡで１００μｌに
調節し、トリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液（１０ｍＭト
リス緩衝液、０．１ｍＭＥＤＴＡ，pH８．０）により平
衡化されたバイオラッド製の１mlのＢｉｏ Ｇｅｌ Ｐ
−４スピン透析カラム上でマニアティスらがＭｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ４６４−４６５頁（１９８２
年）に記載している方法に従って精製した。ラベルされ
たプローブは、トリス−硼酸−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝
液（８９ｍＭトリス、８９ｍＭ硼酸、２．５ｍＭＥＤＴ
Ａ，pH８．３）中１８％のポリアクリルアミドゲル（１
９：１のアクリルアミド：ＢＩＳとバイオラッド）上で
５００ｖｈｒにて電気泳動してさらに精製した。
【０１１６】オートラジオグラフによる位置きめの後、
ラベルされたプローブを含む部分を切り取り、粉砕し、
０．２mlのＴＥ緩衝液中へ一晩かけて４℃で溶出させ
た。反応生成物のＴＣＡ沈澱は比活性が４．９Ｃｉ／ミ
リモルであり、最終的濃度が２０ピコモル／mlであるこ
とを示している。ラベルされないＲＳ１０ブロッキング
オリゴマーは２００ピコモル／mlの濃度で使用した。細胞系からのヒトゲノムＤＮＡの分離 実質的にステットラーらのＰＮＡＳ７９巻５９６６−５
９７０頁（１９８２年、Ｍｏｌｔ４について）に記載の
方法及びマニアティスらのＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｉｎｇ２８０−２８１頁（１９８２年）に記載の方法を
使用して、Ｍｏｌｔ４、ＳＣ−１及びＧＭ２０６４のリ
ンパ球系から高分子のゲノムＤＮＡを分離した。
【０１１７】Ｍｏｌｔ４（ヒューマン・ミュータント・
セル・デポジトリー、ＧＭ２２１９Ｃ）は正常のβ−グ
ロビンについてホモ接合体のＴ細胞系であり、そしてＡ
ＴＣＣに１９８５年３月１９日に寄託されたＳＣ−１は
鎌状赤血球貧血対立遺伝子についてホモ接合体のＥＢＶ
で形質変換されたＢ細胞系である。ＧＭ２０６４（ヒュ
ーマン・ミュータント・セル・デポジトリー、ＧＭ２０
６４）は胎児ヘモグロビンの遺伝的な永続性（ＨＰＦ
Ｈ）についてホモ接合体である個体当初単離され、β−
又はδ−グロビン遺伝子配列を含んでいない。全ての細
胞系は１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０中
に維持された。
【０１１８】臨床血液試料からのヒトゲノムＤＮＡの単離 既知の鎌状細胞キャリヤー（ＡＳ）からのＣＨ１２と名
付けられた臨床血液試料をカルフォルニア州オークラン
ドの小児病院のベルトラム・ルビン博士から得た。ヌン
ベルグらのＰｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５
巻５５５３−５５５６頁（１９７８年）に記載されてい
る方法の変法を使用して、主に末梢の血液リンパ球から
成るバフィーコート部分からゲノムＤＮＡを調製した。
【０１１９】細胞を、５mlのトリス−ＥＤＴＡ−ＮａＣ
ｌ（ＴＥＮ）緩衝液（pH８の１０ｍＭトリス、pH８，１
ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＮａＣｌ）中に再懸濁し、０．
２mg／mlのプロテイナーゼ、０．５％のＳＤＳに調節
し、そして３７℃で一晩インキュベートした。過塩素酸
ナトリウムを０．７Ｍに加え、そして細胞溶解物を室温
で１−２時間穏やかに振とうした。
【０１２０】細胞溶解物をフェノールとクロロフォルム
の１：１混合物３０mlで抽出し、続いてクロロフォルム
３０mlで抽出し、次にエタノールで核酸を沈澱させた。
ペレットを２mlのＴＥ緩衝液に再懸濁させ、ＲＮａｓｅ
を０．００５mg／mlに加えた。３７℃で１時間消化させ
た後、ＤＮＡを同量のフェノール、フェノール／クロロ
フォルム、及びクロロフォルムでそれぞれ一度ずつ抽出
し、エタノールで沈澱させた。ＤＮＡを０．５mlのＴＥ
緩衝液に再懸濁させ、２６０nmの吸収により濃度を決定
した。
【０１２１】β−グロビン配列を選択的に増幅するため
のポリメラーゼ連鎖反応 ２マイクログラムのゲノムＤＮＡを、１０ｍＭトリス緩
衝剤（pH７．５），５０ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭＭｇＣ
ｌ2 ，１５０ピコモルの配列d(CACAGGGCACTAACG)のプラ
イマーＡ、及び配列d(CTTTGCTTCTGACACA) のプライマー
Ｂを含む反応容量１００μｌの当初溶液中で増幅し、か
つ蒸発を防ぐため約１００μｌ厚の鉱油で被覆した。各
ＤＮＡ試料につき、１サイクルが次の３ステップから成
る増幅のための１５サイクルを行った。
【０１２２】（１）２分間９５℃で熱ブロックセット中
で変性する。 （２）熱ブロックセットを直ちに３０℃に移し２分間プ
ライマーとゲノムＤＮＡがアニーリングするようにす
る。 （３）Ｅ．コーリーＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断
片（ニューイングランドバイオラブ）５単位とデオキシ
ＡＴＰ、デオキシＣＴＰ、デオキシＧＴＰ及びＴＴＰそ
れぞれ１ナノモルを含む２μｌの溶液（１０ｍＭトリス
（pH７．５）、５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣ
ｌ2 、及び４ｍＭジチオスレイトールから成る緩衝液
中）を加える。この伸長反応を３０℃にて１０分間行っ
た。 最後のサイクルの後、９５℃に２分間維持して反応を停
止させた。鉱油は０．２mlのクロロフォルムで抽出して
廃棄した。最後の反応液の容量は１３０μｌであった。
【０１２３】プローブ及びＤｄｅＩ／ＨｉｎｆＩによる
増幅したゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション／消化 ２５マイクロリットルの増幅されたゲノムＤＮＡをエタ
ノールで沈澱させ、同量のＴＥ緩衝液中に再懸濁した。
１０マイクロリットル（１５４ngのゲノムＤＮＡと同等
の前増幅体を含む）を１．５mlのマイクロフュージ管に
入れ、そして２０μｌのＴＥ緩衝液により最後の容量を
３０μｌとした。試料を鉱油で被覆して９５℃で１０分
間変性した。ラベルされたＲＳ０６プローブ０．０２ピ
コモルを含む０．６ＭＮａＣｌ１０マイクロリットルを
管に加え、穏やかに混合し、直ちに５６℃の熱ブロック
に移して１時間おいた。
【０１２４】ラベルしていないＲＳ１０ブロッキングオ
リゴマー４マイクロリットル（０．８ピコモル）を加
え、更に１０分間同じ温度でハイブリダイゼーションを
続けた。５マイクロリットルの６０ｍＭＭｇＣｌ2 ／
０．１％ＢＳＡ及び１μｌのＤｅｌＩ（１０単位、ニュ
ーイングランドバイオラブ）を加え、再アニーリングさ
れたＤＮＡを５６℃で３０分間消化した。１マイクロリ
ットルのＨｉｎｆＩ（１０単位、ニューイングランドバ
イオラブ）を加え、更に３０分インキュベートした。４
μｌの７５ｍＭＥＤＴＡと６μｌのトラッキング染料を
最終容積が６１μｌになるように反応混合物に加えて反
応を終了した。
【０１２５】鉱油を０．２mlのクロロフォルムで抽出
し、１８μｌの反応混合物（４５nmのゲノムＤＮＡ）を
ヘーファーＳＥ２００装置中の３０％ポリアクリルアミ
ドのミニゲル（１９：１、バイオラド）に負荷した。こ
のゲルをブロモフェノールブルー染料の前端が当初の位
置から３．０cm動くまで約３００ボルトで１時間電気泳
動させた。該ゲルの前端の１．５cmは取り除かれ、残り
のゲルは４日間−７０℃で強化スクリーンに曝される。
【０１２６】写真の検討（図１６） 各レーンは４５ngの増幅されたゲノムＤＮＡを含んでい
る。レーンＡはＭｏｌｔ４ＤＮＡを、レーンＢはＣＨ１
２を、レーンＣはＳＣ−１を、又レーンＤはＧＭ２０６
４を含んでいる。Ｍｏｌｔ４は、細胞当たり２コピーの
βA 遺伝子を有する正常の個体の遺伝子型ＣＡＡであ
り、ＣＨ１２は、細胞当たり１個のβA と１個のβS 遺
伝子を有する鎌状細胞キャリアからの臨床用試料（Ａ
Ｓ）であり、そしてＳＣ−１は細胞当たり２コピーのβ
S を有する鎌状血球血貧血個体の遺伝子型を意味する。
ＧＭ２０６４はβ−又はδ−グロビン配列を含有せず、
ネガティブ対照として存在する。
【０１２７】写真から分かるようにＤｄｅＩで開裂され
た、βA 特異的であるオクタマーはβA 遺伝子を含むＤ
ＮＡにのみ存在し（レーンＡ及びＢ）、ＨｉｎｆＩで開
裂された、βS 特異性を有するトリマーは、βS 遺伝子
を含むＤＮＡにのみ存在する（レーンＢ及びＣ）。トリ
マー及びオクタマーの両者の存在（レーンＢ）は鎌状赤
血球貧血キャリアを示すものであり、オクタマーのみを
生ずる正常の個体（レーンＡ）及びトリマーのみを示す
鎌状赤血球貧血にかかっている個体（レーンＣ）から区
別される。比較のため、上記実験を増幅されていないゲ
ノムＤＮＡを用いて繰り返し行い、増幅を行うと検出感
度が少なくとも１０００倍増加することが分かった。
【０１２８】実施例６ 本実施例は、ラベルされたプローブを使用することなく
全ヒトＤＮＡ中の全く精製されていない単一コピー遺伝
子をゲル上で直接検出する方法を示すものである。実施
例３に記載した技術を用い、β−グロブリン遺伝子の第
１エクソン中の配列からの１１０塩基対断片を、全ヒト
ＤＮＡ１０マイクログラムから２０サイクルで増幅し
た。この２０サイクル後に生産される１１０塩基対断片
は、臭化エチジウムにより容易に染色されてゲル上で見
ることができた。配列は、最初に制限酵素ＤｄｅＩによ
り切断されると、配列がβ−グロビンのＳ対立遺伝子中
における場合のように酵素により認識される制限部位を
含まないものでない限り、増幅されなかった。
【０１２９】実施例７ Ａ．ヒトβ−グロビンＡ対立遺伝子からの１．９kb挿入
部を含有する合計１００フェムトモルのｐＢＲ３２８，
５００Ｃｉ／モルである各α−32Ｐ−デオキシＮＴＰを
５０ナノモルずつ、及び実施例３で使用した各プライマ
ー１ナノモルを、１００μｌの３０ｍＭトリス−アセテ
ート（pH７．９）、６０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍ
Ｍジチオスレイトール及び１０ｍＭ酢酸マグネシウムを
含む溶液中に溶かした。
【０１３０】この溶液を１００℃にして２分加熱し、２
５℃にて１分冷却した。４．５単位のＥ．コーリーＤＮ
ＡポリメラーゼＩ及び０．０９単位の無機ピロフォスフ
ァターゼを加えて反応混合物中でピロリン酸が生ずるの
を防止し、その後反応を２５℃で２分間進行させ、更に
加熱、冷却、酵素の添加及び反応のサイクルを９回繰り
返した。
【０１３１】各合成サイクルの後、１０μｌのアリコー
トを取り出し１μｌの６００ｍＭＥＤＴＡに加えた。そ
れぞれを、９０ｍＭのトリスボレート及び２．５ｍＭＥ
ＤＴＡ中、pH８．３で１４％のポリアクリルアミドゲル
上で２４ボルト／cm、２．５時間で分析した。操作の終
了したゲルは、０．５μｇ／mlの臭化エチジウムを加え
た同じ緩衝液に２０分浸し、当初の緩衝液で洗浄し、赤
フィルターを用いて紫外線中で写真を撮影した。
【０１３２】生産された１１０塩基対断片は紫外線でゲ
ルから切り出し、そしてクレンコフ放射により計数し
た。Ｎがサイクル数を意味し、ｙがサイクル毎の部分的
収率である式 ｐｍｏｌｅｓ／１０μｌ＝０．０１（（１＋ｙ）N −ｙ
Ｎ−１）、 にデータを一致させようとする試みは、ｙが０．６１９
であるときに楽観的なものとなる。これは、十分な増幅
が起こっていることを暗示している。
【０１３３】Ｂ．各デオキシＮＴＰを１００ナノモルず
つ１００μｌの反応溶液に加え、放射性ラベルを行わ
ず、各サイクル毎に液を取り出さなかった以外は、上記
実験を繰り返した。１０サイクル後に反応物を２分間沸
騰させて反応を停止させ、５７℃，１時間で再ハイブリ
ダイゼーションを行った。１１０塩基対生成物の配列
を、その８μｌのアリコートを、１μｌのウシ血清アル
ブミン（２５mg／ml）と１μｌの好適な制限酵素（Ｈｉ
ｎｆＩ，ＭｎｌＩ，ＭｓｔII，ＮｃｏＩ）を加えて制限
分析し、３７℃で１５時間反応させて確認した。ＰＡＧ
Ｅは、上述の通り行った。
【０１３４】実施例８ 本実施例は、ｐＢＲ３２８とｐＢＲ３２２の種々の断片
を増幅するために異なったプライマーを使用する例を示
す。 Ａ．次のプライマーを使いｐＢＲ３２８の１３０塩基対
断片を調製すること以外は実施例７Ａと同じように実験
を繰り返した。 d(TTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC) 及び d(GCCTCACCACCAACTTCATCCACGTTCACC)
【０１３５】Ｂ．次のプライマーを用いたこと以外は実
施例７Ａと同じように実験を繰り返しｐＢＲ３２８の２
６２塩基対断片を調製した。反応時間はサイクル当たり
２０分であった。 d(GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG) 及び d(TGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG)
【０１３６】Ｃ．ヒトβ−グロビンＳ対立遺伝子からの
１．９kbの挿入部を含む１００フェムトモルのｐＢＲ３
２８のＭｓｔII消化物を当初の鋳型として用いた以外
は、実施例８Ｂと同様に実験を行った。該プラスミドは
ＭｓｔIIにより数回切断されたが、増幅すべき配列の内
側では切断が起こらなかった。更に、使用したプライマ
ーは次の通りで、２４０塩基対断片を生産した。 d(GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG) 及び d(TAACCTTGATACCAACCTGCCC)
【０１３７】Ｄ．１００フェムトモルのｐＢＲ３２２の
ＮｒｕＩ消化物を鋳型として用い、１００μｌの反応液
中で各デオキシＮＴＰを２００ナノモル使用し、次のプ
ライマーを使用してｐＢＲ３２２から５００塩基対断片
を生産した以外は実施例７Ｂと同様に実験を行った。 d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT) 及び d(CTTCCCCATCGGTGATGTCG) 反応時間は３７℃でサイクル当たり２０分であった。最
後の再ハイブリダイゼーションは５７℃で１５時間行っ
た。電気泳動は４％アガロースゲル上で行った。
【０１３８】実施例９ 本実施例は、インビトロ変異が増幅されたセグメントに
導入されるような本発明方法を例示するものである。 Ａ．ＮｒｕＩで直線化したｐＢＲ３２２合計１００フェ
ムトモル、１ナノモルの７５塩基対断片を生成するよう
に設計されたそれぞれ次式 d(CGCATTAAAGCTTATCGATG) 及び d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT) のプライマー、それぞれ１００ナノモルの各デオキシＮ
ＴＰを、pH８の４０ｍＭトリス、２０ｍＭＭｇＣｌ2 ，
５ｍＭジチオスレイトール及び５mg／mlのウシ血清アル
ブミンの溶液１００μｌ中で混合した。
【０１３９】この混合物を１００℃にして１分間加熱
し、水浴中２３℃，０．５分間冷却し、次に４．５単位
のクレノー断片と０．０９単位の無機ピロフォスファタ
ーゼを加え、反応を３分間行った。加熱、冷却、酵素添
加及び反応のサイクルを９回繰り返した。１０回目の反
応サイクルは凍結により終了させ、反応混合物のアリコ
ート８μｌを４％アガロースゲルに適用し、臭化エチジ
ウムにより視覚化した。
【０１４０】Ｂ．オリゴヌクレオチドプライマーとして
次式のものを使用した以外は実施例９Ａと同様の実験を
繰り返した。 d(CGCATTAAAGCTTATCGATG) 及び d(AATTAATACGACTCACTATAGGGAGATAGGCGTATCACGAGGCCCT) これらのプライマーは１０１塩基対を生産するように設
計され、その（２番目のプライマー中の）２６ヌクレオ
チドはｐＢＲ３２２には存在しない。
【０１４１】これらのヌクレオチドはＴ７プロモーター
の配列を表すもので、これを、ｐＢＲ３２２からの７５
塩基対配列に、２０の相補的塩基と２６塩基の５′側伸
長部とを有するプライマーを使用して連結した。この方
法は２時間より少ない時間で実施することができ、１０
０フェムトモルのｐＢＲ３２２から比較的純粋な１０１
塩基対断片２ピコモルを生産することができた。Ｔ７プ
ロモーターはＲＮＡ転写を開始させるために使用でき
る。Ｔ７ポリメラーゼを１０１塩基対断片に加えて単鎖
ＲＮＡを生成せしめることができる。
【０１４２】Ｃ．オリゴヌクレオチドプライマーとして
下記のものを使用して、ｐＢＲ３２２から１０００塩基
対断片を調製した以外は実施例８Ｄと同様に実験を繰り
返した。 d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT) 及び d(CCAGCAAGACGTAGCCCAGC)
【０１４３】Ｄ．上記９Ｃと同様の実験を繰り返した。
但し、オリゴヌクレオチドプライマーとして下記のも
の、 d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT) 及び d(AATTAATACGACTCACTATAGGGAGATAGGCGTATCACGAGGCCCT) を使用して１０２６対断片を調製した。２番目のプライ
マーの２６ヌクレオチドはｐＢＲ３２２には存在せず、
上記のＴ７プロモーターを示すものである。このプロモ
ーターは、ｐＢＲ３２２からの１０００塩基対断片に隣
接して挿入された。
【０１４４】これらの結果は、鋳型鎖と完全にマッチし
ていないがそれにもかかわらず十分にハイブリダイズし
て酵素的に伸長するプライマーは、当初の鋳型に対応す
る鎖よりむしろプライマーの鎖を含む長鎖生成物を生成
せしめるということを暗示する。長鎖生成物はインビト
ロ変異を生じさせる第２のプライマー用の鋳型としての
役割を果たす。その後のサイクルでは、更に多くのミス
ペアしたプライミングが要求されないので、効率が減少
することなくこの変異は増幅される。この場合、その
５′末端に相補的でない伸長部分があるプライマーが、
複製されるべき鋳型に隣接して生成物中に新しい配列を
挿入するために使用された。
【０１４５】実施例１０ 本実施例は単コピー遺伝子を増幅させる際にバックグラ
ウンドを減少させるためにネスト状に（ｎｅｓｔｅｄ）
セットしたプライマーを使用することを例示するもので
ある。野性型β−グロビン対立遺伝子についてホモ接合
体である全ヒトＤＮＡに対して、２０サイクルの増幅を
次のように行った。
【０１４６】１０μｇのＤＮＡ、それぞれ２００ピコモ
ルの次式のプライマー、 d(ACACAACTGTGTTCACTAGC) 及び d(CAACTTCATCCACGTTCACC) 並びに１００ナノモルずつのｄＮＴＰを、１００μｌの
３０ｍＭトリス−アセテート、６０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、１０ｍＭジチオスレイトール、及び１０ｍＭ酢酸マ
グネシウム中で１００℃にて１分間加熱し、２５℃に１
分間下げて、そして２単位のクレノー断片とともに２分
間処理した。加熱、冷却、クレノー試薬の添加のサイク
ルを１９回繰り返した。
【０１４７】１０μｌの液体を反応混合物から取り出
し、更に１０回の増幅のためのサイクルを次の各プライ
マーを用いて行った。 d(CAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTG)及び d(CCCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCC) これらは、上記で生産された１１０塩基対断片中に含ま
れる５８塩基対断片を増幅した。増幅すべき最後の１０
回のサイクルは、１０μｌのアリコートを、上記した各
デオキシＮＴＰ １００ナノモルと各プライマー２００
ピコモルを含む９０μｌの新しいトリス−アセテート緩
衝液に希釈することにより達成することができた。
【０１４８】反応条件は上記の通りとした。１０サイク
ルの後１０μｌのアリコート（当初のＤＮＡの１００ナ
ノグラムに対応）を６％のＮｕシーブ（ＦＭＣ社）アガ
ロースゲルに加え、臭化エチジウムを使って視覚化し
た。図１７は、紫外線で発光させた従来法の通り赤いフ
ィルターを通して写真撮影した上記ゲルを示すものであ
る。レーン１は分子量のマーカーである。レーン２は上
記反応のアリコートである。レーン３は当初の野性型Ｄ
ＮＡが増幅の前にＤｄｅＩにより開裂されたこと以外は
上記したものと同じ反応のアリコートである。
【０１４９】レーン４は鎌状赤血球貧血β−グロビン対
立遺伝子についてホモ接合体であるヒトＤＮＡを増幅の
前にＤｄｅＩで処理したこと以外は上記と同様な反応の
アリコートである（鎌状赤血球貧血対立遺伝子は増幅さ
れる断片内にＤｄｅＩ部位を含まない）。レーン５は鮭
の精子ＤＮＡでヒトＤＮＡを置き換えた以外は上記と同
様の反応のアリコートである。レーン６は増幅後反応液
をＤｄｅＩで処理したこと以外は上記と同様な反応のア
リコートである（ＤｄｅＩは５８塩基対の野性型生成物
を２７塩基対及び３４塩基対の断片に変換する）。レー
ン７は増幅後ＤｄｅＩで処理したレーン４の材料のアリ
コートである（５８塩基対の鎌状赤血球貧血生成物はＤ
ｄｅＩを含まない）。
【０１５０】アガラーセゲルの臭化エチジウム染色のみ
を使用してヒトＤＮＡの１マイクログラムからの単コピ
ー遺伝子を代表する５８塩基対断片を検出するために
は、約５００，０００倍に増幅することが必要である。
これは、ここで２つのオリゴヌクレオチドのネスト状セ
ットを使用して達成することができる。第１のセットは
１１０塩基対断片を増幅し、そして内部のネスト状セッ
トは、図１７に示すように便利に検出できるレベルにな
るまでこの生成物のサブ−断片を増幅する。
【０１５１】先行する増幅工程で増幅された配列中に含
まれ、又他のプライマーの伸長生成物中にも含まれるよ
り小さな配列をプライマーを使って増幅する本法は、例
えばコナーらのＰＮＡＳ８０巻２７８頁（１９８３年）
及びレアリーらのＰＮＡＳ８０巻４０４５頁（１９８３
年）に記載されているように放射性同位体又は非放射性
同位体プローブのハイブリダイゼーションの方法論に頼
ることなく、β−グロビンの座における野性型を鎌状赤
血球貧血対立遺伝子から区別することを可能にする。
【０１５２】実施例１１ 本法は、患者のＤＮＡ試料中の例えばクラミジアのよう
な伝染性疾患と関連する特定の配列を、所望の増幅され
た配列を含むビオチン化されたハイブリダイゼーション
プローブを使用しかつ前述の米国特許第４，３５８，５
３５号に記載された方法を使用して検出する際に有用で
あることが期待される。ビオチン化されたハイブリダイ
ゼーションプローブは、一部が二重鎖となったＤＮＡ
に、次式のスペーサーアームを介してビオチンに結合し
た４′−メチレン置換−４，５′−８−トリメチルプソ
ラレンを挿入しかつ光を照射することにより調製するこ
とができる。
【０１５３】Ｙ−（ＣＨ2 ）2 −Ｏ〔（ＣＨ2 ）x Ｏ〕
y −ＣＨ2 ＣＨ2 ＮＨ- 式中Ｙは、Ｏ，ＮＨ又はＮ−ＣＨＯ，ｘは１から４まで
の数、そしてｙは２から４までの数である。プローブ上
のビオチニル基の検出には、エンゾバイオケム社により
市販されているストレプタビジン−酸性フォスファター
ゼ複合体を用いて、パンフレットに製造者が示している
検出方法により達成することができる。ハイブリダイゼ
ーションプローブは、検出用複合体との結合、及びそれ
に続く酸性ホスファターゼにより触媒される反応（この
反応が沈澱性色素を生成する）に基く沈澱した染色スポ
ットとして見ることができる。
【０１５４】実施例１２ 本実施例では、実施例７の方法を基本的には使用し、ヒ
トβ−グロビン遺伝子上の１１９塩基対断片を次のプラ
イマーを使用して増幅させた。 ５′-CTTCTGcagCAACTGTGTTCACTAGC- ３′(GH18) ５′-CACaAgCTTCATCCACGTTCACC- ３′ (GH19) ここで小文字は野性型配列とミスマッチし、制限酵素部
位を生成する。全スキームは表５に示してある。表５は
ヒトβ−グロビン遺伝子の１１９塩基対断片をクローン
化しかつ配列決定するために使用され、又内部制限部位
を含むよう設計されているプライマーＧＨ１８及びＧＨ
１９を図解したものである。出発コドンＡＴＧにはアン
ダーラインが引かれている。ＧＨ１８は、負鎖と相補的
な２６塩基対のオリゴヌクレオチドでかつ内部にＰｓｔ
Ｉ部位を有している。
【０１５５】ＧＨ１９は正鎖に相補的である２３塩基対
のオリゴヌクレオチドであり、内部にＨｉｎｄIII 認識
部位を含んでいる。矢印は、ＤＮＡポリメラーゼＩによ
る伸長方向を示す。四角で囲った配列は各プライマーの
制限酵素認識配列を示す。これらのプライマーは、バク
テリオファージＭ１３のＰｓｔＩとＨｉｎｄIII 制限部
位に対して相同である遺伝子領域を第１にスクリーニン
グして選択された。次に、プライマーは先行する実施例
で記載した通りに調製された。
【０１５６】
【表５】
【０１５７】増幅及びクローニング 実施例２に述べたように細胞系Ｍｏｌｔ４から単離した
１マイクログラムのヒトゲノムＤＮＡの増幅を２０サイ
クル行った後、反応生成物の１４分の１を、ラベルした
β−グロビンに特異的であり、その配列が、５′-CTGAC
TCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGG-３′であるオリ
ゴヌクレオチドプローブＲＳ０６に上述のオリゴマー制
限法を用いてハイブリダイズさせた。
【０１５８】溶液ハイブリダイゼーションの後、反応混
合物を上述した制限消化条件下でＤｄｅＩにより処理し
て８塩基対オリゴヌクレオチドを生成せしめた。この８
塩基対の生成物の量は、増幅され生成された生成物の量
に比例する。この消化生成物は３０％のポリアクリルア
ミドゲル上で分離し、オートラジオグラフィーで視覚化
した。オートラジオグラムを分析した結果、該増幅は野
性型β−グロビン遺伝子の正鎖及び負鎖のそれぞれと相
補的であるプライマーＰＣ０３（５′-ACACAACTGTGTTCA
CTAGC-３′）及びＰＣ０４（５′-CCACTTGCACCTACTTCAA
C-３′）による増幅と増幅効率において匹敵するもので
あることが分かった。
【０１５９】増幅された生成物はエタノールで沈澱して
脱塩しそして濃縮し、そしてサンプルを１０ｍＭトリ
ス、１０ｍＭＭｇＣｌ2 ，１ｍＭＤＴＴ，１００ｍＭＮ
ａＣｌから成る制限緩衝液（pH８）に再溶解し、Ｐｓｔ
Ｉ及びＨｉｎｄIII で同時に消化した。その消化後、試
料をセントリコン１０濃縮装置で脱塩し、ベーリンガー
・マンハイム社から入手できるＰｓｔＩ／ＨｉｎｄIII
で消化されたベクターＭ１３ｍｐ１０ｗの０．３マイク
ログラムと、１２℃で一晩連結した。全部の結合混合物
がメリーランド州ベテスダのＢＲＬから入手できるＥ．
コーリー株ＪＭ１０３へ形質転換された。形質転換株を
調製するための方法は、Ａ．ワルトンによりMessing,
J. Third Cleveland Symposium on Macromolecules:Rec
ombinant DNA 143-153 頁に記載されている。
【０１６０】形質転換混合物を、ナイロンフィルターを
用いるプラークハイブリダイゼーションによるスクリー
ニングのため、ｘ−ゲル培地上に移した。フィルター
を、β−グロビンに特異的な、配列が ５′-CCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGTCAG-３′ であるオリゴヌクレオチドプローブＲＳ２４により検知
して、β−グロビン挿入部の数を決定した。フィルター
はプライマーＰＣ０４で再度標識され、全挿入数を決定
した。
【０１６１】プレーティング及びスクリーニング 表Ａは、プレーティングとプラークハイブリダイゼーシ
ョンのデータを纏めたものである。フィルターをプライ
マーＰＣ０４で検知し、増幅とクローニングに起因する
挿入部のパーセントを決定した。１２０６個のクリアー
なプラーク（クリアーなプラークの全数の９０％）がプ
ライマーにハイブリダイズした。１５のプラークがβ−
グロビンに特異的なプラークＲＳ０４にハイブリダイズ
した。増幅されたプライマーに陽性なプラークのうちβ
−グロビンに陽性なプラークは約１％である。
【０１６２】 表Ａ プレート 青 色 挿入部 挿入部 β−グロビン No. プラーク なし* あり** 挿入部有り １ ２８ ２５ ２４６ １ ２ ２９ １８ ２２２ ２ ３ １１ ２６ １８０ ０ ４ ２４ ２０ １９２ ５ ５ ２２ ２７ １８５ ５ ６ ３９ ２１ １８１ ３ 合計 １５８ １３２ １２０６ １５
【０１６３】増幅された配列を含有するプラークに対す
るβ−グロビン挿入部を含有するプ ラークの％＝１５／１２０６×１００＝１．２４％。 全プラークに対するβ−グロビン挿入部を含有するプラ
ークの％＝１５／１４ ９６×１００＝約１％。 全プラークに対する増幅された配列を含有するプラーク
の％＝１２０６／１４９６×１００＝８０％。* プライマーＰＣ０４とハイブリダイズしないクリアー
なプラーク。** プライマーＰＣ０４とハイブリダイズするクリアーな
プラーク。
【０１６４】制限酵素及びサザン分析法 ３つのβ−グロビン陽性プラークと２つのβ−グロビン
陰性プラーク（しかしＰＣ０４プライマー陽性）のファ
ージＤＮＡから少し調製したＤＮＡを制限酵素分析法で
分析した。増幅したβ−グロビン断片を含むＭ１３クロ
ーンからのＤＮＡのＭｓｔII消化は特徴的な２８３塩基
対断片を生ずる。ＭｓｔII消化の後、３つのβ−グロビ
ン陽性クローンは全て予想のとおり２８３塩基対断片を
生成し、一方プライマーとのみ陽性であった２つのクロ
ーンは大きい断片を生成した。
【０１６５】この分析からのゲルをＭＳＩナイロンフィ
ルターに移し、リグビーらによりＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
１１３巻２３７−５１頁（１９７７年）に記載された
標準的なニックトランスレーション法により調製した放
射性ラベルを行ったニックトランスレーションしたβ−
グロビンプローブとハイブリダイズさせた。β−グロビ
ンプローブとハイブリダイズできるバンドは、３つのβ
−グロビン陽性クローンのみであった。２つの他のクロ
ーンはβ−グロビンプローブにハイブリダイズしない挿
入部を有していた。
【０１６６】配列の分析 β−グロビン挿入部を含むことが制限酵素分析により示
された１０個のβ−グロビン陽性クローンを、Ｍ１３ジ
デオキシ配列決定法を用いて配列決定した。１０の内９
つはβ−グロビンの野性型配列と同一であった。他のク
ローンは、β−グロビンプライマーでは非常に僅かしか
増幅しないことが示されているδ−グロビン遺伝子と同
じであった。
【０１６７】結論として、β−グロビン配列の増幅にお
いて、変形されたリンカープライマーは変形されていな
いプライマーとほぼ等しい効率を有していた。プライマ
ーは、増幅されたＤＮＡのクローニングベクターへの挿
入を容易にすることができた。ゲノムの他のセグメント
の増幅のため、１％のクローンのみがヘモグロビン配列
を有していた。１０の内９つが公にされているβ−グロ
ビン配列と同じであることが分かり、該技術はゲノムＤ
ＮＡを高い忠実度で増幅することを示した。１つのクロ
ーンは公表されているδ−グロビンと同一であったこと
が分かり、このことはプライマーがδ−グロビンに対す
る有意な配列相同性を持っているにもかかわらず、β−
グロビン遺伝子に特異的であることを証明した。
【０１６８】クローニングをβ−グロビンの２６７塩基
対断片を用いて行う場合、このクローニングはジメチル
スルフォキシドが増幅工程に存在（３７℃で１０容量
％）するときのみ効果的であることが分かった。制限部
位−修飾プライマーを使用して、ヒトＮ−ｒａｓ腫瘍遺
伝子を増幅し、クローン化し、一部を配列決定すること
ができ、更にＨＬＡ−ＤＱ−α及びＤＱ−β遺伝子の２
４０塩基対断片をクローン化することもできた。
【０１６９】これら全ての増幅は１０容量％のジメチル
スルフォキシドの存在下３７℃で行った。ＨＬＡ ＤＱ
−α及びＤＱ−β遺伝子を増幅するためのプライマー
は、臭化エチジウムで染色したアガロースゲル上に具体
的なバンドを与えるというよりも汚れを生ずるにすぎな
いβ−グロビンやＤＲ−βプライマーに比べて、それら
の意図する標的物に対して遙かに特異的であった。更に
ＨＬＡ ＤＱ−αプライマーは、所望のＨＬＡ標的断片
を含む増幅される挿入部を有する２０％までのクローン
を生成し、ところがβ−グロビンクローンの１％が標的
配列を含んでいた。ＨＬＡ ＤＱ−α及びＤＱ−β遺伝
子クローニングはＤＭＳＯが存在し高温のときにのみ効
果的であった。
【０１７０】実施例１３ 本実施例は、それぞれ７４塩基対の２つのオリゴヌクレ
オチドから出発して４９４塩基対のＴＮＦ遺伝子を調製
するために本法を使用することを例示するものである。プライマー 使用したプライマーは実施例２に記載した方法で調製
し、それぞれ７４塩基対を有し、下記に示すものであ
る。
【０１７１】
【表６】
【０１７２】全体的手順 Ｉ．下記に示す１０サイクルのプロトコールを、プライ
マーとして下記ステップ（ａ）に概略を示すように相互
作用をするプライマーＴＮ１０及びＴＮ１１を用いて行
った。 II．上記パートＩからの反応混合物全２μｌをプライマ
ーＬＬ０９及びＬＬ１２に加えた。下記のプロトコール
を１５サイクル行い、これにより下記ステップ（ｂ）で
概略を示すように、プライマーがパートＩの生成物と相
互作用する。 III. パートIIからの反応混合物全２μｌをプライマー
ＴＮ０８及びＴＮ１３に加えた。下記のプロトコールを
１５サイクル行い、これにより、下記ステップ（ｃ）で
概略を示すように、プライマーがパートIIの生成物と相
互作用する。 IV. 上記パートIII からの反応混合物全２μｌをプライ
マーＬＬ０７及びＬＬ１４に加えた。下記のプロトコー
ルを１５サイクル行い、これにより、下記ステップ
（ｄ）で概略を示すように、プライマーがパートIII の
生成物と相互作用をする。
【０１７３】プロトコール 各反応は１００μｌの、 各２ｍＭのデオキシＡＴＰ、デオキシＣＴＰ、デオキシ
ＧＴＰ及びＴＴＰ；３μＭの各ステップで使用する各プ
ライマー；１×ポリメラーゼ緩衝液（３０ｍＭのトリス
アセテート、６０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭの酢
酸マグネシウム、２．５ｍＭのジチオスレイトール）；
を含んでいる。
【０１７４】各ステップは、 １）沸騰水中で１分、 ２）室温冷却１分、 ３）ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片１μｌ（５単
位）添加、 ４）重合反応の２分間の進行、 から成る。次のサイクルは再度ステップ１）から始め
る。
【０１７５】
【表７】
【０１７６】
【表８】
【０１７７】材料の寄託 細胞系ＳＣ−１（ＣＴＣＣ＃００８２）は、１９８５年
３月１９日、米国、２０８５２、メリーランド州ロック
ビルパークローンドライブ１２３０１に所在するアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）
にＡＴＴＴ受理番号第ＣＲＬ８７５６号として寄託され
た。ＳＣ−１の寄託は、ＡＴＣＣと本特許出願人のシー
タス・コーポレーションとの間の契約に従って行われ
た。
【０１７８】ＡＴＣＣとの契約は、本寄託を記載しかつ
特定する米国特許が発行された場合又は米国又は外国特
許出願が公衆に公告された場合又は公開された場合のい
ずれか早い方が来たときにこの細胞系の子孫を公衆がそ
れを永続的に利用できるようにするために提供し、更に
本細胞系を利用させることについては、米国特許商標局
長官が米国特許法第１２２条及びそれに関する長官のル
ール（３７ ＣＦＲ１，１４条も特に８８６ ＯＧ ６
３８に関連して含む）に従って権限を持って決定した人
間に対しても行う。
【０１７９】本出願の譲受人はもし寄託した細胞系が好
適な条件下で培養したにもかかわらず、死滅し、失わ
れ、損傷したときは通知を受けてから迅速に同じ細胞系
の育成培養基と置き換えることに同意する。纏めると、
本発明はまず１つ又はそれ以上の特定の核酸を、プライ
マーの伸長により生産される生成物が引き続き次のプラ
イマーの伸長反応の鋳型としての役割を果たすような連
鎖反応を用いて増幅させることにより核酸中の配列を検
出するようにした方法を提供する。本法は当初にほんの
僅かの量しか含まれていない核酸配列を検出するために
特に有用である。更に増幅法は分子クローニングにも使
用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、増幅されることが望まれるヒト−β−
グロビンの９４塩基対長の配列を示すものであり、鎌状
赤血球貧血に伴う単一塩基対変化を９４ｍｅｒの下方に
描いてある。
【図２】図２は、ヒトの野性型ＤＮＡ中、及び正常のβ
−グロビン遺伝子の１．９kbのＢａｍＨＩ断片を含むプ
ラスミド（ｐＢＲ３２８：ＨｂＡと示される）中に含ま
れる上記９４ｍｅｒの増幅を示す臭化エチジウムで染色
されたポリアクリルアミドのゲルの写真であり、電気泳
動図である。
【図３】図３は、ｐＢＲ３２８：ＨｂＡ、及びβ−グロ
ビンの鎌状赤血球貧血対立遺伝子の１．９kbのＢａｍＨ
Ｉ断片を含有するプラスミド（ｐＢＲ３２８：ＨｂＳと
称する）中に存在する特定の標的９４ｍｅｒ配列のいず
れかの増幅を示すポリアクリルアミドゲル電気泳動図の
オートラジオグラフを示し、ｐＢＲ３２８：ＨｂＡでは
増幅されるべき配列がＭｓｔIIにより開裂され、そして
ｐＢＲ３２８：ＨｂＳでは増幅されるべき配列が処理さ
れたがＭｓｔIIにより開裂されなかった。
【図４】図４は図５〜図１０の相互位置関係を示す図で
ある。
【図５】図５は、２つのオリゴヌクレオチドプライマー
を用いる３サイクルについて、ヒトβ−グロビンの所望
の９４ｍｅｒ配列の増幅のためのポリメラーゼの連鎖反
応のステップと生成物の詳細を示すものである。
【図６】図６は、２つのオリゴヌクレオチドプライマー
を用いる３サイクルについて、ヒトβ−グロビンの所望
の９４ｍｅｒ配列の増幅のためのポリメラーゼの連鎖反
応のステップと生成物の詳細を示すものである。
【図７】図７は、２つのオリゴヌクレオチドプライマー
を用いる３サイクルについて、ヒトβ−グロビンの所望
の９４ｍｅｒ配列の増幅のためのポリメラーゼの連鎖反
応のステップと生成物の詳細を示すものである。
【図８】図８は、２つのオリゴヌクレオチドプライマー
を用いる３サイクルについて、ヒトβ−グロビンの所望
の９４ｍｅｒ配列の増幅のためのポリメラーゼの連鎖反
応のステップと生成物の詳細を示すものである。
【図９】図９は、２つのオリゴヌクレオチドプライマー
を用いる３サイクルについて、ヒトβ−グロビンの所望
の９４ｍｅｒ配列の増幅のためのポリメラーゼの連鎖反
応のステップと生成物の詳細を示すものである。
【図１０】図１０は、２つのオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いる３サイクルについて、ヒトβ−グロビンの
所望の９４ｍｅｒ配列の増幅のためのポリメラーゼの連
鎖反応のステップと生成物の詳細を示すものである。
【図１１】図１１は図５〜図１０に示す増幅におけるサ
イクル数とＤＮＡコピー数との関係を示す。
【図１２】図１２は、ｐＢＲ３２８：ＨｂＡ中の２４０
ｍｅｒ配列の４サイクル後の増幅を示す臭化エチジウム
で染色されたポリアクリルアミドのゲルを示す電気泳動
図の写真であり、ここはアリコートがＮｃｏＩ（レーン
３）、ＭｓｔII（レーン４）又はＨｉｎｆＩ（レーン
５）により消化される。レーン１は分子量の基準で、レ
ーン２は無傷の２４０ｂｐの生成物を含んでいる。
【図１３】図１３は、ＤｄｅＩ及びＨｉｎｆＩ制限部位
間にある正常な（βA ）β−グロビン遺伝子及び鎌状赤
血球（βS ）β−グロビン遺伝子の配列を示すもので、
βA についての１本線はＤｄｅＩ部位（CTGAG)の位置を
示し、βA 及びβS についての２重線はＨｉｎｆＩ部位
（GACTC)の位置を示している。
【図１４】図１４は、４０ｍｅｒプローブ、並びにＤｄ
ｅＩ及びこれに続くＨｉｎｆＩ制限酵素を用いる正常β
−グロビンの逐次的な消化の結果を示すものである。
【図１５】図１５は、図１４と同じ４０ｍｅｒプローブ
並びにＤｄｅＩ及びこれに続くＨｉｎｆＩ制限酵素を使
用する鎌状β−グロビンの逐次的な消化の結果を示すも
のである。
【図１６】図１６は、増幅、プローブとのハイブリダイ
ゼーション、及びＤｄｅＩとＨｉｎｆＩによる逐次的消
化を受けた全ヒトＤＮＡの試料中に存在するβ−グロビ
ン対立遺伝子を特異的に特徴付けるための、図９と同じ
４０ｍｅｒプローブの使用を示す、臭化エチジウムで染
色されたポリアクリルアミドのゲルを示す電気泳動図の
写真である。
【図１７】図１７は、臭化エチジウムと紫外線を用いて
視覚化した６％のＮｕシーブアガロースゲルの電気泳動
図の写真を示すものである。この写真は、１１０−ｂｐ
増幅生成物のサブ−フラグメントの増幅を示し、このサ
ブ−フラグメントは１１０ｂｐ断片内の内部ネストであ
る。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１月１４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正内容】
フロントページの続き (72)発明者 ヘンリー アンソニー エルリッヒ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94602, オークランド，ローダ アベニュ 3936 (72)発明者 ノーマン アンヘイム アメリカ合衆国，カリフォルニア 91364, ウッドランド ヒルズ，ドゥ カルブ 22322 (72)発明者 グレン トマス ホーン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94608, エメリイビル，アドミラル ドライブ エ フ370，３ (72)発明者 ランダル ケイチ サイキ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94805, リッチモンド，サーティナインス ストリ ート 320 (72)発明者 ステファン ジョエル スカーフ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94709, バークレイ，フランシスコ ストリート 2028 １／２

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 １種類の核酸又は複数種類の核酸の混合
    物中に含まれる特定の二重鎖核酸配列をベクター中にク
    ローニングする方法であって、 （ａ）増幅されるべき各異なる特定の配列のための２種
    類のオリゴヌクレオチドプライマーにより、増幅される
    べき各異なる特定の配列の各鎖について該核酸鎖に相補
    的なプライマーの伸長生成物が合成されるように、前記
    核酸を処理し、ここで、前記プライマーは各特定の配列
    の鎖に実質的に相補的であって１つのプライマーから合
    成された伸長生成物がその相補体から分離されたときに
    該伸長生成物が他のプライマーの伸長生成物の合成鋳型
    として機能するように選択され、更に該プライマーはそ
    れぞれ５′末端に、他のプライマーの制限部位と同じか
    異なる制限部位を有しており； （ｂ）プライマー伸長生成物をそれらがその上で合成さ
    れた鋳型から分離して単鎖分子を生成せしめ； （ｃ）ステップ（ｂ）で生産された単鎖分子をオリゴヌ
    クレオチドにより処理して、ステップ（ｂ）で生成され
    た各単鎖を鋳型として使用してプライマー伸長生成物が
    合成されるようにし、ここで増幅されるべき特定の配列
    に依存してステップ（ａ）と（ｃ）を０から有効量まで
    のジメチルスルフォキシドの存在下、あるいは約４５℃
    までの温度のもとで行い； （ｄ）ステップ（ｃ）の生成物に各制限部位用の制限酵
    素を加えて、制限酵素消化物中に開裂した生成物を得、
    そして、 （ｅ）開裂した生成物を１又は２以上のクローンニング
    ベクターに連結する； ことを含んで成る方法。
  2. 【請求項２】 該核酸が単鎖ＲＮＡ又は単鎖ＤＮＡから
    合成される特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】 ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡである特
    許請求の範囲第２項に記載の方法。
  4. 【請求項４】 合成すべき核酸断片より少ないヌクレオ
    チドを有する既存の核酸断片と２種類のオリゴヌクレオ
    チドプライマーとから核酸断片を合成する方法であっ
    て、該合成すべき核酸は左方のセグメント、中央のセグ
    メント及び右方のセグメントから成り、該中央のセグメ
    ントは少なくとも実質的に前記既存の核酸断片のヌクレ
    オチド配列に相当し、左右のセグメントは前記２種類の
    プライマーの５′末端に存在するヌクレオチド配列に相
    当し、これらの３′末端は前記既存の核酸の鎖を分離す
    ることにより生ずる単鎖の３′末端に相補的かあるいは
    実質的に相補的であり；そして （ａ）各核酸鎖に相補的である各プライマーの伸長生成
    物が合成されるような条件下で、前記既存断片の鎖を２
    種類のオリゴヌクレオチドプライマーで処理し、ここ
    で、該２種類のプライマーは、前記既存断片の各鎖の
    ３′末端と実質的に相補的であって、一方のプライマー
    から合成された伸長生成物がその相補体から分離された
    ときに該伸長生成物が他方のプライマーの伸長生成物の
    合成のための鋳型として機能するように選択され、そし
    て各プライマーはその５′末端に、前記既存断片と相補
    的でなく且つ合成すべき核酸断片の２つの末端に対応す
    るヌクレオチドの配列を含むものであり； （ｂ）その上でプライマー伸長生成物が生成された鋳型
    からは該プライマー伸長生成物を分離して単鎖分子を生
    成せしめ；そして （ｃ）ステップ（ｂ）において生成した各単鎖を鋳型と
    して用いてプライマー伸長生成物が合成される条件下
    で、ステップ（ｂ）から生じた単鎖分子をステップ
    （ａ）のプライマーにより処理し、こうして２つの中間
    二重鎖核酸分子（このそれぞれは、オリゴヌクレオチド
    プライマーの一方の５′末端に存在する核酸配列が導入
    されている）と２つの十分な長さの核酸分子（このそれ
    ぞれには、オリゴヌクレオチドプライマーの両方の５′
    末端に存在する核酸配列が導入されている）とを生成せ
    しめ； （ｄ）前記十分なながさの二重鎖分子の有効量を生産す
    るのに十分な回数ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）を繰
    り返し； （ｅ）ステップ（ｄ）の生成物の鎖を２つのプライマー
    で処理して、ステップ（ｄ）の生成物が両末端において
    伸びるように処理し；そして、 （ｆ）中央セグメントとしてのステップ（ｄ）の生成物
    と、ステップ（ｄ）の生成物の鎖を分離することにより
    生成する単鎖の３′末端と相補的か実質的に相補的であ
    る２つのオリゴヌクレオチドプライマーとを使用しなが
    らステップ（ａ）からステップ（ｄ）までを繰り返す； ことを含んで成る方法。
JP4177761A 1985-03-28 1992-06-12 核酸配列のクローニング方法 Expired - Lifetime JP2546576B2 (ja)

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US06/828,144 US4683195A (en) 1986-01-30 1986-02-07 Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences

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