DK171871B1 - Fremgangsmåder til kloning af vektor med en specifik nukleinsyresekvens, der er indeholdt i en nukleinsyre, og til syntetisering af et nukleinsyrefragment ud fra et eksisterende nukleinsyrefragment - Google Patents

Fremgangsmåder til kloning af vektor med en specifik nukleinsyresekvens, der er indeholdt i en nukleinsyre, og til syntetisering af et nukleinsyrefragment ud fra et eksisterende nukleinsyrefragment Download PDF

Info

Publication number
DK171871B1
DK171871B1 DK026595A DK26595A DK171871B1 DK 171871 B1 DK171871 B1 DK 171871B1 DK 026595 A DK026595 A DK 026595A DK 26595 A DK26595 A DK 26595A DK 171871 B1 DK171871 B1 DK 171871B1
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
nucleic acid
primer
primers
fragment
sequence
Prior art date
Application number
DK026595A
Other languages
English (en)
Other versions
DK26595A (da
Inventor
Kary Banks Mullis
Norman Arnheim
Randall Keichi Saiki
Henry Anthony Erlich
Glenn Thomas Horn
Stephen Joel Scharf
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27418965&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DK171871(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US06/791,308 external-priority patent/US4683202A/en
Priority claimed from US06/828,144 external-priority patent/US4683195A/en
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of DK26595A publication Critical patent/DK26595A/da
Application granted granted Critical
Publication of DK171871B1 publication Critical patent/DK171871B1/da

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00495—Means for heating or cooling the reaction vessels
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/0059—Sequential processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00722—Nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B60/00—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries
    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries

Description

DK 171871 B1
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til kloning i en vektor af en specifik nukleinsyresekvens samt en fremgangsmåde til syntetisering af et nukleinsyrefragment udfra et eksisterende, kortere nukleinsyrefragment. Opfindel-5 sen bygger på en fremgangsmåde til multiplikation (amplifika-tion) af eksisterende nukleinsyresekvenser, hvis disse er til stede i en testprøve. Nærmere bestemt bygger opfindelsen på en fremgangsmåde til fremstilling af en hvilken som helst bestemt nukleinsyresekvens ud fra en given sekvens af DNA 10 eller RNA i mængder, som er store sammenlignet med den oprindeligt tilstedeværende mængde. DNA'et og RNA'et kan være enkeltstrenget eller dobbeltstrenget og kan enten foreligge i relativt ren form eller som en komponent af en blanding af nukleinsyrer. Fremgangsmåderne ifølge opfindelsen anvender en 15 gentagen omsætning til udførelse af multiplikationen af den ønskede nukleinsyresekvens.
Navnlig til diagnostiske anvendelser kan mål-nukleinsyre-sekvensen være blot en lille del af det pågældende DNA eller RNA, således at det kan være vanskeligt at påvise dets til-20 stedeværelse under anvendelse af ikke-isotopisk mærkede eller ende-mærkede oligonukleotidprober. Der bruges mange kræfter på at forøge sensitiviteten af probedetektionssystemerne, men der er ikke udført megen forskning på at multiplicere målsekvensen, således at den er til stede i mængder, der er til-25 strækkelig til let at kunne påvises under anvendelse af de metoder, der for tiden er til rådighed.
Flere metoder er blevet beskrevet i litteraturen vedrørende de novo syntese af nukleinsyrer eller syntese af nukleinsyrer ud fra en eksisterende sekvens. Disse metoder er 30 i stand til at frembringe store mængder af en given nukleinsyre med fuldstændig specificeret sekvens.
Én kendt metode til de novo syntetisering af nukleinsyrer omfatter organisk syntese af en nukleinsyre ud fra nukleosid-derivater. Denne syntese kan udføres i opløsning eller på et 35 fast bæremateriale. Én type af organisk syntese er phos- photriestermetoden, som er blevet anvendt til fremstilling af genfragmenter eller korte gener. I phosphotriestermetoden fremstilles oligonukleotider, som derefter kan sammenføjes DK 171871 B1 2 til dannelse af lange nukleinsyrer. For en beskrivelse af denne metode se Narang, S.A. et al., Meth. Enzymol.. 68. 90 (1979) og US patent nr. 4.356.270. I patentet beskrives syntesen og kloningen af somatostatingenet.
5 En anden type af organisk syntese er phosphodiesterme- toden, som er blevet anvendt til fremstilling af et tRNA-gen.
Se Brown, E.L. et al., Meth. Enzvmol.. 68. 109 (1979) for en beskrivelse af denne metode. Som i phosphotriestermetoden omfatter phosphodiestermetoden syntese af oligonukleotider, 10 som efterfølgende sammenføjes til dannelse af den ønskede nukleinsyre.
Skønt ovennævnte fremgangsmåder for de novo syntese kan anvendes til syntese af lange strenge af nukleinsyre, er de ikke særligt praktiske at anvende til syntese af store mæng-15 der af en nukleinsyre. Begge fremgangsmåder er arbejdskrævende og tidsrøvende, kræver dyrt udstyr og dyre reagenser og har en lav samlet effektivitet. Den lave samlede effektivitet kan skyldes ineffektiviteter i syntesen af oligonukleotiderne og i sammenføjningsreaktionerne. I syntesen af en lang nu-20 kleinsyre eller endog i syntesen af en stor mængde af en kort nukleinsyre vil det være nødvendigt at syntetisere mange oligonukleotider, og der vil være behov for mange sammenføj ningsreaktioner. Som følge heraf vil disse metoder ikke være praktiske til syntese af store mængder af en hvilken som 25 helst ønsket nukleinsyre.
Der eksisterer også fremgangsmåder til fremstilling af nukleinsyrer i store mængder ud fra små mængder af den oprindeligt foreliggende nukleinsyre. Disse fremgangsmåder omfatter kloning af en nukleinsyre i et péissende værtssystem, 30 hvor den ønskede nukleinsyre indsættes i en passende vektor, som anvendes til transformering af værten.. Når værten dyrkes, replikeres vektoren, og således frembringes flere kopier af den ønskede nukleinsyre. For en kort beskrivelse af subklo-ning af nukleinsyrefragmenter se Maniatis T. et al., Molecu-35 lar Cloning; A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, s. 390-401 (1982). Se også teknikkerne beskrevet i US patent nr. 4.416.988 og nr. 4.403.036.
DK 171871 B1 3
En tredie fremgangsmåde til syntetisering af nukleinsyrer, som er beskrevet i US patent nr. 4.293.652, er en hybrid mellem den ovenfor beskrevne organiske syntese og metoder til molekylær kloning. I denne fremgangsmåde bliver 5 et passende antal oligonukleotider til dannelse af den ønskede nukleinsyresekvens syntetiseret organisk og indsat sekventielt i en vektor, som multipliceres ved vækst forud for hver efterfølgende indsætning.
I Kleppe et al., J. Mol. Biol. 56: 341 (1971) beskrives 10 en metode til syntetisering af DNA under anvendelse af primerinitieret, template-rettet "repair-replikation", og det foreslås, at replikationscykler kan gentages ved hver gang at tilsætte en ny dosis DNA-polymerase. Der er imidlertid ingen hentydning til, at primerforlængelsesprodukter skal være 15 tilstrækkeligt komplette til at kunne indgå i stabile primer-template -komplekser for at kunne fungere som templater for primere i efterfølgende runder af primerforlængelse, og at der kun kan opnås eksponentiel in vitro multiplicering ved dannelse af sådanne komplekser og ved at primerforlængelses-20 produkter fungerer som templater i efterfølgende runder.
I Panet A. og Khorana H. G., J. Biol. Chem. 249: 5213-5221 (1974) beskrives kobling af poly(dT) ved 3'-enden til cellulose, efterfulgt af kovalent binding mellem 5'-enden af den cellulosekoblede poly(dT)-kæde og et ved 3'-enden thymi-25 dinyleret E. coli-deriveret tRNA. Det derved fremkomne produkt (5'-C-C-C-C-A-C-C-poly(dT)-cellulose) anvendes derefter som template i en replikationsproces, hvor poly(dA) eller (rA)n anvendes som primere. For hver cyklus af annealing og DNA-polymerisering fremstilles der enkeltstrengede komplemen-30 tære strenge til af templaten, og der fremstilles hver gang maksimalt det samme antal komplementære strenge som det oprindelige antal templates. Der nævnes således intet om anvendelsen af flere end én primer, og der nævnes således intet om muligheden for eksponentiel multiplikation af nu-35 kleinsyresekvenser.
Den foreliggende opfindelse bærer nogen lighed med metoden til molekylær kloning, men den omfatter imidlertid ikke formering af nogen organisme og undgår derved de mulige farer DK 171871 B1 4 eller upraktiske forhold, som dette medfører. Den foreliggende opfindelse kræver heller ikke syntese af nukleinsyrese-kvenser, som er ubeslægtede med den ønskede sekvens, og derved undgår man med den foreliggende opfindelse behovet for 5 omfattende oprensning af produktet ud fra en kompliceret biologisk blanding.
Opfindelsen er baseret på en fremgangsmåde til multi-plicering af en eller flere specifikke nukleinsyresekvenser, der er til stede i en nukleinsyre eller en blanding heraf 10 under anvendelse af primere og midler til polymerisering og derefter påvisning af den multiplicerede sekvens. Forlængelsesproduktet af én primer bliver, når den hybridiseres til den anden, en template for produktionen af den ønskede specifikke nukleinsyresekvens og vice versa, og fremgangsmåden kan 15 gentages så ofte som nødvendigt for at producere den ønskede mængde af sekvensen. Denne fremgangsmåde er mere effektiv end de ovenfor beskrevne metoder til dannelse af store mængder nukleinsyre ud fra en mål-sekvens og til produktion af sådanne nukleinsyrer på en ved sammenligning kort tid. Den fore-20 liggende fremgangsmåde er navnlig nyttig til multiplicering af sjældne nukleinsyrer, der er til stede i en blanding af nukleinsyrer, til effektiv påvisning af sådanne sjældne nukleinsyrer.
Nærmere bestemt tilvejebringer den foreliggende opfindel-25 se en fremgangsmåde til kloning i en vektor af i det mindste én specifik nukleinsyresekvens indeholdt i en nukleinsyre eller i en blanding af nukleinsyrer, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, (a) at nukleinsyren (nukleinsyrerne) behandles med en 30 oligonukleotidprimer for hver streng af hver sekvens, der skal klones, og med andre nødvendige komponenter under sådanne betingelser, at der for hver streng af hver primer syntetiseres et forlængelsesprodukt, som er komplementært til hver streng, ved hvilken frem-35 gangsmåde primeren eller primerne udvælges således, at de i det væsentlige er komplementære til hver streng af hver specifik sekvens og afgrænser enderne af den nukleinsyresekvens, der skal klones, således DK 171871 B1 5 at det forlængelsesprodukt, der syntetiseres fra én primer, når det er separeret fra dets komplement, kan tjene som en template for syntese af forlængelsesproduktet af den anden primer, og hvor primeren eller 5 primerne hver indeholder informationen for et re striktionssted i 5'-enden, som er identisk med eller forskellig fra restriktionsstedet (-stederne) på den anden primer (på de andre primere), (b) at primerforlængelsesprodukterne adskilles fra tem- 10 plateme, på hvilke de er syntetiseret, til frem bringelse af enkeltstrengede molekyler, (c) at de enkeltstrengede molekyler, der er frembragt i trin (b) behandles som i trin (a) med oligonukleotid-primere og andre nødvendige komponenter, således at 15 der syntetiseres et primerforlængelsesprodukt under anvendelse af hver af enkeltstrengene, der er frembragt i trin (b), som en template, ved hvilken fremgangsmåde trinnene (a) og (c) afhængig af den bestemte sekvens, der skal multipliceres, udføres i 20 nærværelse af fra 0 og op til en effektiv mængde af dimethylsulfoxid eller ved en temperatur på op til ca. 45°C, (d) at der til produktet fra trin (c) tilsættes et restriktionsenzym for hvert af restriktionsstederne til 25 opnåelse af spaltede produkter i en restriktionsfor døjelse, og (e) at det spaltede produkt (de spaltede produkter) ligeres ind i én eller flere kloningsvektorer.
I en anden udførelsesform angår den foreliggende opfin-30 delse en fremgangsmåde til syntetisering af et nukleinsyre-fragment ud fra et eksisterende nukleinsyrefragment med færre nukleotider end det fragment, som bliver syntetiseret, og 2 oligonukleotidprimere, hvor det nukleinsyrefragment, der bliver syntetiseret, indeholder et venstresegment, et keme-35 segment og et højresegment, og hvor kernesegmentet i det mindste i alt væsentlig repræsenterer nukleinsyresekvensen af det eksisterende nukleinsyrefragment, og højre- og venstre-segmenterne repræsenterer nukleinsyresekvensen, der er til DK 171871 B1 6 stede i 5'-enderne af de to primere, hvis 3'-ender er komplementære eller i alt væsentligt komplementære til 3'-enderne i de enkeltstrenge, der produceres ved at separere strengene af det eksisterende nukleinsyrefragment, hvilken fremgangsmåde 5 er ejendommelig ved, (a) at strengene fra det eksisterende fragment behandles med to oligonukleotidprimere og andre nødvendige komponenter under sådanne betingelser, at der af hver primer syntetiseres et forlængelsesprodukt, som er 10 komplementært til hver nukleinsyrestreng, ved hvilken fremgangsmåde primerne udvælges således, at de i alt væsentligt er komplementære til 3'-enden af hver streng af det eksisterende fragment, således at det forlængelsesprodukt, som syntetiseres ud fra én 15 primer, når det er separeret fra dets komplement, kan tjene som en template for syntesen af forlængelses-produktet af den anden primer, og hvorved hver primer i 5'-enden indeholder en sekvens af nukleotider, som ikke er komplementære til det eksisterende fragment, 20 og som svarer til de to ender af det nukleinsyrefrag ment, der bliver syntetiseret, (b) at primerforlængelsesprodukterne adskilles fra de templater, på hvilke de blev syntetiseret, til frembringelse af enkeltstrengede molekyler, 25 (c) at de enkeltstrengede molekyler, der er frembragt i trin (b), behandles med primerne og de nødvendige komponenter fra trin (a) under sådanne betingelser, at der syntetiseres et primerforlængelsesprodukt under anvendelse af hver enkeltstreng, der er frem-30 bragt i trin (b), som en template, således at der produceres to intermediære dobbeltstrengede nuklein-syremolekyler, i hvilke der er blevet inkorporeret den nukleotidsekvens, som er til stede i 5'-enden af én af oligonukleotidprimerne, og to fuldlængde dob-35 beltstrengede nukleinsyremolekyler, i hvilke der er inkorporeret den nukleinsyresekvens, der er til stede i 5'-enderne af begge oligonukleotidprimerne, og DK 171871 B1 7 (d) at trinnene (b) og (c) gentages et tilstrækkeligt antal gange til at producere dobbeltstrengede molekyler i fuld længde i en effektiv mængde.
Eventuelt kan trinnene (a) - (d) gentages under anvendel-5 se af produktet fra trin (d) som kernefragment og to yderligere oligonukleotidprimere, som er komplementære til eller i alt væsentligt komplementære til 3'-enderne af de enkeltstrenge, der frembringes ved at separere strengene fra produktet i trin (d).
10 Keraefragmentet kan opnås ved følgende trin: (a) omsætning af to oligonukleotider, som hver ved deres 3'-ender indeholder en nukleotidsekvens, som er komplementær til den anden oligonukleotid ved dens 3'-ende, og som er ikke-komplementær til hinanden ved deres 5'-ender, med et 15 middel til polymerisering og 4 nukleotidtriphosphater under sådanne betingelser, at der syntetiseres et forlængelsesprodukt af hver oligonukleotid, som er komplementær til hver nukleinsyrestreng, (b) separering af forlængelsesprodukterne fra de 20 templater, på hvilke de blev syntetiseret til dannelse af enkeltstrengede molekyler og (c) behandling af de enkeltstrengede molekyler, der frembragtes i trin (b), med oligonukleotiderne i trin (a) under sådanne betingelser, at der syntetiseres et primerfor- 25 længelsesprodukt under anvendelse af hver af de i trin (b) producerede enkeltstrenge som en template, hvorved der opnås en multiplikation af kernefragmentet.
Fig.l viser en 94 basepar lang sekvens af human jS-globin, der ønskes multipliceret. Enkeltbasepar-ændringen, som følger 30 med seglcelleanæmi, er angivet under 94-meren.
Fig. 2 viser et fotografi af en ethidiumbromidfarvet polyacrylamidgel demonstrerende multiplikation af 94-meren, der indeholdes i human vildtype-DNA og i et plasmid, der indeholder et 1,9 kb BamHI fragment af det normale j8-globin-35 gen (betegnet pBR328:HbA).
Fig. 3 viser et fotografi af en ethidiumbromidfarvet polyacrylamidgel demonstrerende multiplikation af enhver af de specifikke 94-mere målsekvenser, der er til stede i DK 171871 B1 8 pBR328:HbAf et plasmid, der indeholder et 1,9 kb BamHI-fraa-ment af seglcelleallelen af Ø-globin (betegnet pBR328:HbS) , pBR328:HbA, hvor sekvensen, der skal multipliceres, er spaltet med Mstll. og pBR328:HbS, hvor sekvensen, der skal multi-5 pliceres, er blevet behandlet med, men ikke spaltet med Mstll.
Pig.4 viser i detaljer trinnene og produkterne af poly-merasekædereaktionen til multiplicering af den ønskede 94-mere sekvens af human j8-globin i 3 cyklusser under anvendelse 10 af to oligonukleotidprimere.
Pig. 5 viser et fotografi af en ethidiumbromidfarvet polyacrylamidgel demonstrerende multiplikation efter 4 cyklusser af en 240-mer sekvens i pBR328:HbA, hvor alikvoterne er fordøjet med Ncol (bane 3), Mstll (bane 4) eller HinfI 15 (bane 5). Bane 1 er molekylvægtsstandarden, og bane 2 indeholder det intakte 240 bp lange produkt.
A
Fig. 6 viser sekvensen af de normale (β ) og seglcelle
O
(j8 ) j8-globingener i Ddel og Hinf I restriktionsstedområdet, hvor de enkelte linier for βA markerer positionen af Ddel-20 stedet (CTGAG) og dobbeltstregerne for β^ og /3S markerer positionen for HinfI-stedet (GACTC).
Fig. 7 viser resultaterne af sekventiel fordøjelse af normal /J-globin under anvendelse af en 40-mer probe og Ddel-restriktionsenzymet efterfulgt af HinfI-restriktionsenzymet.
25 Fig. 8 viser resultaterne af sekventiel fordøjelse af seglcelle /5-globin under anvendelse af den samme 40-mere probe som i fig. 7 og Ddel-restriktionsenzymet efterfulgt af HinfI-restriktionsenzymet.
Fig. 9 viser et fotografi af en ethidiumbromidfarvet 30 polyacrylamidgel demonstrerende anvendelsen af den samme 40-mere probe som i fig. 7 til specifik karakterisering af tilstedeværende beta-globinalleler i prøven af hel human DNA, som er blevet udsat for multiplikation, hybridisering med proben og sekventiel fordøjelse med Ddel og HinfI.
35 Fig. 10 viser et fotografi af en 6% NuSieve agarosegel visualiseret ved anvendelse af ethidiumbromid og UV-lys.
Dette fotografi demonstrerer multiplikationen af et sub- DK 171871 B1 9 fragment af et 110-bp multiplikationsprodukt, hvilket sub-fragment er en indre beliggende del af 110-bp fragmentet.
Udtrykket "oligonukleotid" som her anvendt under henvisning til primere, prober, oligomerfragmenter, der skal 5 påvises, oligomerkontroller og umærkede blokerende oligo-merer, er defineret som et molekyle, der består af 2 eller flere deoxyribonukleotider eller ribonukleotider, fortrinsvis mere end tre. Dets eksakte størrelse vil afhænge af mange faktorer, som på sin side anhænger af den ultimative funktion 10 eller anvendelse af oligonukleotidet.
Udtrykket "primer" som her anvendt refererer til et oligonukleotid, hvad enten dette forekommer naturligt, som i en oprenset restriktionsfordøjelse, eller er produceret syntetisk, hvilken oligonukleotid er i stand til at virke som et 15 initieringspunkt for syntese, når den placeres under betingelser, i hvilke syntese af et primerforlængelsesprodukt, som er komplementært til en nukleinsyrestreng, er induceret, dvs. under tilstedeværelse af nukleotider og et middel for polyme-risering, såsom DNA-polymerase, og ved en egnet temperatur og 20 pH. Primeren er for maximal effektivitet ved multiplikation fortrinsvis enkeltstrenget, men kan alternativt være dobbeltstrenget. Hvis den er dobbeltstrenget, behandles primeren først til separering af dets strenge, før den anvendes til dannelse af forlængelsesprodukter. Primeren er fortrinsvis et 25 oligodeoxyribonukleotid. Primeren må være tilstrækkelig lang til at prime syntesen af forlængelsesprodukterne under tilstedeværelse af polymerisationsmidlet. De eksakte længder af primerne vil afhænge af mange faktorer, inklusiv temperatur og primerkilden. Afhængig af kompleksiteten af målsekvensen 30 indeholder oligonukleotidprimeren f.eks. typisk 15-25 eller flere nukleotider, omend den kan indeholde færre nukleotider. Korte primermolekyler kræver generelt set lavere temperaturer for at danne tilstrækkeligt stabile hybridkomplekser med templaten.
35 De her omtalte primere udvælges til at være "i alt væ sentligt" komplementære til de forskellige strenge af hver specifik sekvens, der skal multipliceres. Dette betyder, at primerne må være tilstrækkeligt komplementære til at hybridi- DK 171871 B1 10 sere med deres respektive strenge. Primersekvensen behøver derfor ikke at reflektere den eksakte sekvens af templaten. F.eks. kan et ikke-komplementært nukleotidfragment være tilhæftet til 5'-enden af primeren, medens resten af primer-5 sekvensen er komplementær til strengen. Alternativt kan ikke-komplementære baser eller længere sekvenser være anbragt spredt i primeren, forudsat at primersekvensen har tilstrækkelig komplementaritet med sekvensen af den streng, der skal multipliceres til at hybridisere dermed og derved danne en 10 template for syntese af forlængelsesproduktet af den anden primer.
Som anvendt her betegner "restriktionsendonukleaser" og "restriktionsenzymer" bakterieenzymer, der hver skærer dobbeltstrenget DNA ved eller nær en specifik nukleotidsekvens.
15 Som anvendt her betegner "DNA-polymorfisme" det forhold, i hvilket to eller flere forskellige nukleotidsekvenser kan forekomme på et bestemt sted i DNA'et.
Betegnelsen "restriktionsfragmentlængdepolymorfi" ("RFLP") betegner forskellene hos forskellige individer i 20 længderne af restriktionsfragmenter, der dannes ved fordøjelse med en speciel restriktionsendonuklease.
Den foreliggende opfindelse er baseret på en fremgangsmåde til multiplikation af enhver af en eller flere specifikke nukleinsyresekvenser, der mistænkes for at være i en 25 nukleinsyre. Fordi store mængder af en specifik sekvens kan produceres ved denne fremgangsmåde, kan den foreliggende opfindelse anvendes til forbedring af effektiviteten af DNA-eller mRNA-kloning og til multiplikation af en målsekvens for at lette påvisningen heraf.
30 Generelt set omfatter den foreliggende fremgangsmåde en kædereaktion for i eksponentielle mængder i forhold til antallet af de involverede omsætningstrin at producere mindst én specifik nukleinsyresekvens under forsætning af, at (a) enderne af den krævede sekvens er kendt i tilstrækkelige 35 detaljer til at oligonukleotider, som vil hybridisere med dem, kan syntetiseres og (b) at en lille mængde af sekvensen er tilgængelige til initiering af kædereaktionen. Produktet fra kædereaktionen vil være en adskilt nukleinsyreduplex med DK 171871 B1 11 ender, der svarer til enderne af de anvendte specifikke primere.
Enhver kilde af nukleinsyre kan i oprenset eller ikke-oprenset form anvendes som udgangsnukleinsyre eller -syrer, 5 forudsat at den formodes at indeholde den ønskede, specifikke nukleinsyresekvens. Fremgangsmåden kan f.eks. således anvende DNA eller RNA, inklusiv mRNA, hvilket DNA eller RNA kan være enkeltstrenget eller dobbeltstrenget. Desuden kan en DNA-RNA -hybrid, som indeholder en streng af hver, anvendes. En bland-10 ing af enhver af disse nukleinsyrer kan også anvendes, eller nukleinsyreme, der er produceret ud fra en heri tidligere anvendt multiplikationsreaktion, linder anvendelse af den samme eller forskellige primere, kan anvendes således. Den specifikke nukleinsyresekvens, der skal multipliceres, kan 15 være blot en fraktion af et større molekyle eller kan være initielt til stede som et særskilt molekyle, således at den specifikke sekvens udgør hele nukleinsyren. Det er ikke nødvendigt, at sekvensen, der skal multipliceres, i begyndelsen er til stede i ren form; det kan være en mindre fraktion 20 af en kompleks blanding, såsom en del af |S-globingenet, der findes i hel human DNA, eller en del af en nukleinsyresekvens på grund af en speciel mikroorganisme, hvilken organisme blot kan udgøre en meget lille del af en speciel biologisk prøve. Udgangsnukleinsyren kan indeholde mere end én ønsket specifik 25 nukleinsyresekvens, som kan være den samme eller forskellig. Den foreliggende fremgangsmåde er derfor ikke blot anvendelig til produktion af store mængder af en specifik nukleinsyresekvens, men også til samtidig multiplicering af mere end én forskellig, specifik nukleinsyresekvens, der er lokaliseret 30 på samme eller forskellige nukleinsyremolekyler.
Nukleinsyren eller -syrerne kan være opnået fra enhver kilde, f.eks. fra plasmider såsom pBR322, fra klonet DNA eller RNA, eller fra naturlig DNA eller RNA fra en hvilken som helst kilde, inklusiv bakterier, gær, vira eller højere 35 organismer, såsom planter eller dyr. DNA eller RNA kan være ekstraheret fra blod, vævsmateriale, såsom chorion-villi eller amniumceller ved forskellige metoder, såsom den, der DK 171871 B1 12 beskrives af Maniatis et al., Molecular Cloning. (1982), 280-281.
En hvilket som helst specifik nukleinsyresekvens kan produceres ved den foreliggende fremgangsmåde. Det er kun 5 nødvendigt, at et tilstrækkeligt antal baser ved begge ender af sekvensen er kendt i tilstrækkelige detaljer, således at der kan fremstilles to oligonukleotidprimere, som vil hybri-disere til forskellige strenge af den ønskede sekvens og på relative positioner langs sekvensen, således at et forlæng-10 elsesprodukt, der er syntetiseret fra en primer, kan tjene som template, når den er separeret fra dens template (komplement) , for forlængelse af den anden primer i en nukleinsyre af defineret længde. Jo større viden man har om baserne ved begge ender af sekvensen, jo mere specifik kan primeren for 15 målnukleinsyresekvensen gøres og jo mere effektiv kan fremgangsmåden derfor være. Det vil forstås, at betegnelsen "primer", som anvendt her, henviser til mere end én primer, navnlig i det tilfælde, hvor der er nogen tvetydighed i informationen vedrørende endesekvenserne af fragmentet, der 20 skal multipliceres. I tilfældet, hvor en nukleinsyresekvens f.eks. er udledt fra proteinsekvensinformation, vil en samling af primere, der indeholder sekvenser, som repræsenterer alle mulige codonvariationer baseret på degenereringen af den genetiske kode, anvendes for hver streng. Én primer fra denne 25 samling vil være homolog med enden af den ønskede sekvens, der skal multipliceres.
Oligonukleotidprimerne kan fremstilles under anvendelse af en hvilken som helst egnet fremgangsmåde, såsom f.eks. de ovenfor beskrevne phosphotriester- og phosphodiestermetoder, 30 eller automatiserede udførelsesformer deraf. I én således automatiseret udførelsesform er diethylphosphoramiditer anvendt som udgangsmateriale og kan syntetiseres som beskrevet af Beaucage et al., Tetrahedron Let- ters (1981), 22: 1859-1862. Én fremgangsmåde til syntetisering af oligonukleo-35 tider på et modificeret, fast bæremateriale er beskrevet i US patent nr. 4.458.066. Det er også muligt at anvende en primer, som er blevet isoleret fra en biologisk kilde (såsom ved en restriktionsendonukleasefordøjelse).
DK 171871 B1 13
Den specifikke nukleinsyresekvens produceres ved anvendelse af nukleinsyren, der indeholder denne sekvens som en template- Hvis nukleinsyren indeholder to strenge, er det nødvendigt at separere strengene af nukleinsyren, før den kan 5 anvendes som template, enten ved et separat trin eller samtidigt med syntese af primerforlængelsesprodukterne. Denne strenge-separation kan udføres ved en hvilken som helst egnet denatureringsmetode, inklusiv fysiske, kemiske eller enzymatiske metoder. Én fysisk metode til separering af strengene 10 af nukleinsyren involverer opvarmning af nukleinsyren, til den er fuldstændig (>99%) denatureret. Typisk varmedena-turering kan omfatte temperaturer i området på fra 80 til 105°C i tidsperioder på fra ca. 1 til 10 minutter. Strengeseparation kan også induceres med et enzym fra den klasse af 15 enzymer, der kendes som helicaser, eller enzymet RecA, som har helicaseaktivitet, og som ved tilstedeværelse af riboATP vides at denaturere DNA. De egnede omsætningsbetingelser for separering af nukleinsyrestrengene ved hjælp af helicaser er beskrevet af Kuhn Hoffmann-Berling, CSH-Quantitative Bi-20 olocry. 43: 63 (1978) og der gives en oversigt over metoderne ved anvendelse af RecA i C.Radding, Ann.Rev.Genetics.. 16: 405-37 (1982).
Hvis den oprindelige nukleinsyre, der indeholder sekvensen, der skal multipliceres, er enkeltstrenget, syntetiseres 25 dens komplementære streng ved at tilføre en eller to oligo-nukleotidprimerne dertil. Hvis en passende enkelt-primer tilsættes, syntetiseres et primerforlængelsesprodukt under tilstedeværelse af primeren, et polymeriseringsmiddel og de 4 nedenfor beskrevne nukleotider. Produktet vil være delvis 30 komplementært til den enkeltstrengede nukleinsyre og vil hybridisere med nukleinsyrestrengen til dannelse af en duplex af strenge med ulige længde, som derefter kan separeres til enkeltstrenge, som beskrevet ovenfor til dannelse af to enkelte, separerede komplementære strenge. Alternativt kan to 35 passende primere tilsættes til den enkeltstrengede nukleinsyre, og omsætningen udføres.
Hvis den oprindelige nukleinsyre udgør sekvensen, der skal multipliceres, vil det producerede primerforlængelses- DK 171871 B1 14 produkt (de producerede primerforlængelsesprodukter) være fuldstændig komplementært til strengene af den oprindelige nukleinsyre og vil hybridisere dermed til dannelse af en duplex af strenge med samme længde, som kan separeres til 5 enkeltstrengede molekyler.
Når de komplementære strenge af nukleinsyren eller -syrerne er separeret - hvad enten nukleinsyren oprindelig var dobbeltstrenget eller enkeltstrenget - er strengene parate til at blive anvendt som en template for syntesen af yderlig-10 ere nukleinsyrestrenge. Denne syntese kan udføres ved at anvende en hvilken som helst egnet metode. Generelt set foregår det i en puffret vandig opløsning, fortrinsvis ved et pH på 7-9, mest fortrinsvis ca. 8. Det foretrækkes, at et molært overskud (for klonet nukleinsyre almindeligvis 1000:1 15 primer: template, og for genomisk nukleinsyre almindeligvis 10^:1 primer: template) af de to oligonukleotidprimere tilsættes til pufferen, der indeholder de separerede template-strenge. Det skal imidlertid forstås, at mængden af komplementær streng ikke nødvendigvis, hvis den her angivne frem-20 gangsmåde anvendes til diagnostiske anvendelser, således at mængden af primer i forhold til mængden af komplementær streng ikke kan bestemmes med sikkerhed. Af praktiske grunde vil mængden af tilsat primer imidlertid generelt set være i molært overskud i forhold til mængden af komplementær streng 25 (template), når sekvensen, der skal multipliceres, findes i en blanding af komplicerede, langkædede nukleinsyrestrenge.
Et stort molært overskud foretrækkes til forbedring af fremgangsmådens effektivitet.
Deoxyribonukleosidtriphosphaterne dATP, dCTP, dGTP og TTP 30 tilsættes også til synteseblandingen i tilstrækkelige mængder, og den resulterende opløsning opvarmes til ca. 90-100°C i fra ca. 1 til 10 minutter, fortrinsvis fra 1 til 4 minutter. Efter denne opvarmningsperiode får opløsningen lov at afkøle til 20-40°C, hvilket er foretrukket for primerhybridi-35 sering. Til den afkølede blanding tilsættes et polymeri-seringsmiddel, og omsætningen får lov at foregå under betingelser, som er kendte inden for fagområdet. Denne syntese-omsætning kan foregå ved fra stuetemperatur op til en tem- DK 171871 B1 15 peratur over hvilken polymeriseringsmidlet ikke længere fungerer effektivt. Hvis DNA-polymerasen således f.eks. anvendes som polymeriseringsmiddel, er temperaturen generelt set ikke højere end ca. 45°C. En mængde dimethylsulfoxid 5 (DMSO) er fortrinsvis til stede, hvilket er effektivt til påvisning af signalet, eller temperaturen er 35-40°C. Mest foretrukken er tilstedeværelse af 5-10 volumenprocent DMSO, og temperaturen er 35-40°C. Til visse anvendelser, hvor sekvenserne, der skal multipliceres, er over 110 basepar 10 lange fragmenter, såsom HLA DQ-α- eller -j8-gener, tilsættes en effektiv mængde (f.eks. 10 volumenprocent) DMSO til multiplikationsblandingen, og omsætningen udføres ved 35-40°C for at opnå påviselige resultater eller for at muliggøre kloning.
Polymeriseringsmidlet kan være en hvilket som helst 15 forbindelse eller system, som vil fungere til udførelse af syntese af primerforlængelsesprodukter, inklusiv enzymer.
Egnede enzymer til dette formål indbefatter f.eks. B.coli DNA polymerase I, Klenow fragment af E.coli DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, andre tilgængelige DNA-polymeraser, revers 20 transkriptase og andre enzymer, inklusiv varmestabile enzymer, som vil lette kombinationen af nukleotiderne på en korrekt måde til dannelse af primerforlængelsesprodukter, som er komplementære til hver nukleinsyrestreng. Generelt set vil syntesen blive initieret ved 3'-enden af hver primer og 25 forløbe i 5'-retningen langs templatestrengen, indtil syntesen ender, frembringende molekyler af forskellige længder.
Der kan imidlertid være midler, som initierer syntesen ved 5'-enden og forløber i den anden retning under anvendelse af den samme fremgangsmåde som ovenfor beskrevet.
30 Den nysyntetiserede streng og dens komplementære nuklein syrestreng danner et dobbeltstrenget molekyle, som anvendes i de efterfølgende trin af fremgangsmåden. I det næste trin separeres strengene af det dobbeltstrengede molekyle under anvendelse af et hvilket som helst af de ovenfor beskrevne 35 procedurer til dannelse af enkeltstrengede molekyler.
Ny nukleinsyre syntetiseres på de enkeltstrengede molekyler. Yderligere inducerende middel, nukleotider og primere kan tilsættes, hvis det er nødvendigt, for at processen kan DK 171871 B1 16 forløbe under de ovenfor foreskrevne betingelser. Syntesen vil igen blive initieret ved én ende af oligonukleotidprimer-ne og vil forløbe langs templatens enkelte streng til frembringelse af yderligere nukleinsyre. Efter dette trin vil 5 halvdelen af forlængelsesproduktet bestå af den specifikke nukleinsyresekvens afgrænset af de to primere.
Trinnene vedrørende strengeseparation og forlængelsesproduktsyntese kan gentages så ofte, som det behøves til frembringelse af en ønsket mængde af den specifikke nukleinsyre-10 sekvens. Som det vil blive beskevet i yderligere detaljer nedenfor, vil mængden af den producerede specifikke nukleinsyresekvens akkumulere på eksponentiel måde.
Når det ønskes at producere mere end én specifik nukleinsyresekvens ud fra den første nukleinsyre eller blanding af 15 nukleinsyrer, anvendes et passende antal af forskellige oligonukleotidprimere. Hvis f.eks. to forskellige specifikke nukleinsyresekvenser skal produceres, anvendes 4 primere. To af primerne er specifikke for én af de specifikke nukleinsyresekvenser, og de to andre primere er specifikke for den 20 anden specifikke nukleinsyresekvens. På denne måde kan hver af de to forskellige specifikke sekvenser produceres eksponentielt ved den foreliggende fremgangsmåde.
Den foreliggende opfindelse kan udføres på trinvis måde, hvor nye reagenser tilsættes efter hvert trin, eller samtid-25 igt, hvor alle reagenser tilsættes i begyndelsestrinnet, eller delvist trinvis og delvis samtidigt, hvor frisk reagens tilsættes efter et givent antal trin. Hvis der anvendes en fremgangsmåde til strengeseparation der, som f.eks. varme, vil inaktivere polymeriseringsmidlet, hvilket er tilfældet 30 med et varmelabilt enzym, er det nødvendigt at tilføre polymeriseringsmidlet igen efter hvert strenge-separationstrin.
Den samtidige metode kan anvendes, når et antal oprensede komponenter, inklusiv et enzymatisk middel såsom helicase, anvendes til strengeseparationstrinnet. I den samtidige 35 fremgangsmåde kan reaktionsblandingen ud over nukleinsyre-strengen (-strengene), der indeholder den ønskede sekvens, også indeholde det strengeseparerende enzym (f.eks. helicase) , en passende energikilde for det strenge-separerende DK 171871 B1 17 enzym, såsom rATP, de fire nukleotider, oligonukleotidprimerne i molært overskud og det inducerende middel, f.eks. Kle-now-fragment af E.coli DNA polymerase I. Hvis varme anvendes til denaturering i en samtidig proces kan der anvendes et 5 varmestabilt, inducerende middel, såsom en termostabil polymerase, som vil fungere ved hævede temperaturer, fortrinsvis 65-90°C, afhængig af det inducerende middel, ved hvilken temperatur nukleinsyrer vil består af enkelt- og dobbeltstrenge i ligevægt. For mindre længder af nukleinsyre kan 10 lavere temperaturer på ca. 50°C anvendes. Den øvre temperatur vil afhænge af temperaturen, ved hvilken enzymet vil nedbrydes, eller den temperatur, over hvilken primerhybridise-ring vil ske i utilstrækkeligt omfang. Et sådant varmestabilt enzym er beskrevet, f.eks. af A.S.Kaledin et al., Biokhimiya.
15 45, 644-651 (1980). Hvert trin af processen vil foregå se kventielt uanset den initielle tilstedeværelse af alle reagenserne. Yderligere materialer kan tilsættes om nødvendigt. Efter at en passende tid er forløbet til dannelse af den ønskede mængde af den specifikke nukleinsyresekvens, kan 20 reaktionen standses ved inaktivering af enzymerne på en hvilken som helst kendt måde eller ved separering af komponenterne i reaktionen.
Multiplikationsfremgangsmåden kan udføres kontinuerligt.
I én udførelsesform af en automatiseret proces kan reaktionen 25 føres i cyklus gennem et denaturerende område, et reagenstilsætningsområde og et omsætningsområde. I en anden udførelsesform kan enzymet, der anvendes til syntese af primerforlængelsesprodukterne, immobiliseres i en søjle. De andre omsætningskomponenter kan ved hjælp af en pumpe cirkuleres 30 kontinuerligt gennem søjlen og en varmespiral i serie, og de producerede nukleinsyrer kan således blive denatureret gentagne gange uden inaktivering af enzymet.
Den foreliggende opfindelse demonstreres skematisk nedenfor, hvor dobbeltstrenget DNA, der indeholder den ønskede 35 sekvens [S] bestående af komplementære strenge [S+] og [S'], anvendes som nukleinsyren. Under den første og hver efterfølgende omsætningscyklus vil forlængelse af hver oligonukleot idprimer på den oprindelige template producere ét nyt DK 171871 B1 18 ssDNA-molekyleprodukt af ikke nærmere bestemt længde, som terminerer med kun en af primerne. Disse produkter, der herefter henvises til som "lange produkter", vil akkumulere på liniær måde, dvs. at mængden, der er til stede efter et 5 vilkårligt antal cyklusser, vil være proportional med antallet af cyklusser.
De lange produkter, der således er produceret, vil virke som templater for den ene eller den anden af oligonukleotid-primerne i efterfølgende cyklusser og vil producere molekyler 10 af den ønskede sekvens [S+] eller [S]. Disse molekyler vil også fungere som templater for den ene eller den anden af oligonukleotidprimerne, frembringende yderligere [S+] og [S-] , og en kædereaktion kan således vedligeholdes, som vil resultere i akkumuleringen af [S] med en eksponentiel hastig-15 hed i forhold til antallet af cyklusser.
Biprodukter dannet ved andre oligonukleotidhybridiseringer end de tilsigtede er ikke selv-katalytiske (undtagen i sjældne tilfælde) og akkumulerer således med liniær hastighed.
20 Den specifikke sekvens, der skal multipliceres, [S], kan angives skematisk som: [S+] 5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC 3' 25 De passende oligonukleotidprimere ville være:
Primer 1: GGGGGGGGGG
Primer 2: AAAAAAAAAA
således at hvis DNA, der indeholder [S] ...zzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzz. . .
30 ...zzzzzzzzzzΤΤΤΤΤΤΤΤΤΊΎ YYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzz...
separeres i enkeltstrenge og dets enkeltstrenge hybridiseres til primere 1 og 2, kan de efterfølgende forlængelsesreaktioner katalyseres ved DNA-polymerase under tilstedeværelse af de fire deoxyribonukleosidtriphosphater: DK 171871 B1 19 3' 5' forlængelse <- GGGGGGGGGG primer 1 ....zzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzz.... oprindelig template-streng+ 5 oprindelig template-streng" ....zzzzzzzz TTTTTTTTTTYYYYYYYYYY GGGGGGGGGGzzzzzzzzz... .
primer 2 AAAAAAAAAA -> forlængelse 5' 3'
Efter denaturering af de to dannede duplexer er produkterne: 10 3' 5'
____zzzzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG
nylig syntetiseret langt produkt 1 5' ____zzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzz____ 15 oprindelig templatestreng+ 3' oprindelig templatestreng" 5' 3' 20 AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzz____ nylig syntetiseret langt produkt 2
Hvis disse 4 strenge får lov at rehybridisere med primere 1 og 2 i den næste cyklus, vil polymeriseringsmidlet katalysere de følgende reaktioner: 25 Primer 2 5' AAAAAAAAAA -> forlænges her nyligt syntetiseret langt produkt 1 DK 171871 B1 20 forlængelse <-GGGGGGGGGG 5' primer 1 5'----zzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzz____3' oprindelig templatestreng+
Primer 2 5' AAAAAAAAAA -> forlænges oprindelig templatestreng- forlængelse her <-GGGGGGGGGG 5' primer 1 5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzz____3' nyligt syntetiseret langt produkt 2 10 Hvis strengene af de fire duplexer ovenfor separeres, findes følgende strenge: 5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC 3' nyligt syntetiseret [S+] 15 første-cyklus-synthetiseret langt produkt 1 3' ____zzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5' nyligt syntetiseret langt produkt 1 5' ____zzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzz____3' oprindelig templatestreng 20 5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzz____3' nyligt syntetiseret langt produkt 2 oprindelig templatestreng 25 nyligt syntetiseret [S ] 5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzz----3' første-cyklus-syntetiseret langt produkt 2 DK 171871 B1 21
Det ses, at hver streng, som ender med oligonukleotidsekvensen af én primer og den komplementære sekvens af den anden, er den specifikke nukleinsyresekvens [S], som det ønskes at producere.
5 Trinnene i denne fremgangsmåde kan gentages uendeligt, og er kun begrænset af mængden af primere 1 og 2, polymeri-seringsmidlet og tilstedeværende nukleotider. Antallet af cyklusser anvendt til påvisning er de, der kræves til frembringelse af et påviselig signal, en mængde, som f.eks. vil 10 afhænge af prøvens natur. Hvis f.eks. prøven er ren eller fortyndet, kan færre cyklusser være krævet, end hvis den er en kompleks blanding. Hvis prøven er human genomisk DNA er antallet af cyklusser fortrinsvis fra ca. 10 til 30.
Mængden af oprindelig nukleinsyre forbliver konstant i 15 hele fremgangsmåden, fordi den ikke replikeres. Mængden af de lange produkter forøges liniært, fordi de kun produceres ud fra den oprindelige nukleinsyre. Mængden af den specifikke sekvens forøges eksponentielt. Den specifikke sekvens vil således blive den dominerende. Dette vises i den følgende 20 tabel, som indicerer de relative mængder af de teoretiske typer, der er til stede efter n cyklusser, idet 100% effektivitet antages for hver cyklus:
Antal af dobbeltstrenge efter 0 til n cykler 25 Specifik
Cvklus antal Template Lange produkter sekvens [S] 0 1 - - 1 110 2 12 1 30 3 1 3 4 5 1 5 26 10 1 10 1013 15 1 15 32.752 20 1 20 1.048.555 35 η 1 n (2n-n-l) DK 171871 B1 22 Når en enkeltstrenget nukleinsyre anvendes som templaten dannes kun 1 langt produkt pr. cyklus.
Den heri beskrevne fremgangsmåde kan ifølge opfindelsen anvendes til kloning af en speciel nukleinsyresekvens for 5 indføjelse i en egnet ekspressionsvektor. Vektoren kan derefter anvendes til transformering af en passende værtsorganisme til dannelse af genproduktet af sekvensen ved standardmetoder af rekombinant DNA teknologi.
Normalt vil sådan kloning enten involvere direkte lige-10 ring i en vektor eller tilsætningen af oligonukleotidlinkere efterfulgt af restriktionsenzymspaltning. Begge disse metoder involverer imidlertid den ineffektive stump-endede ligeringsreaktion. Ingen af teknikkerne vil desuden styre orienteringen eller multipliceringen af indføjelsen af det multipli-15 cerede produkt i kloningsvektoren.
Den heri beskrevne multiplikationsproces kan give en blanding af nukleinsyrer, hidrørende fra den oprindelige template-nukleinsyre, de forventede målmultiplikationsprodukter og forskellige ikke-mål-baggrundsprodukter. Det multi-20 plicerede produkt kan også være en blanding, hvis den oprindelige template-DNA indeholder multiple målsekvenser, såsom i et heterozygotisk diploidgenom, eller når der er en familie af beslægtede gener.
De heri beskrevne primere kan være modificeret til at 25 hjælpe til hurtig og specifik kloning af blandingen af DNA, der produceres ved multiplikationsreaktion. I en sådan modifikation er den samme eller forskellige restriktionssteder inkorporeret ved 5'-enderne af primerne, hvilket resulterer i restriktionssteder ved de to ender af det multiplicerede 30 produkt. Når det udskæres med de passende enzymer kan det multiplicerede produkt derefter let indsættes i plasmid-eller virusvektorer og klones. Denne kloning tillader analyse eller ekspression af individuelle multiplicerede produkter, ikke en blanding.
35 Skønt det samme restriktionssted kan anvendes for begge primere, tillader anvendelsen af forskellige restriktionssteder indsætning af produktet i vektoren med en specifik orientering og undertrykker multiple indsætninger såvel som DK 171871 B1 23 indsætninger, der stammer fra multiplikationer, der kun er baseret på en af de to primere. Den specifikke orientering er nyttig, når der klones i enkeltstrengsekventerende vektorer, når enkeltstrenghybridiseringsprober anvendes eller når det 5 klonede produkt udtrykkes.
Én metode til fremstilling af primerne er at vælge en primersekvens, som adskiller sig minimalt fra målsekvensen. Områder, i hvilke hver af primerne skal placeres, bliver screenet for homologi til restriktionssteder, der er passende 10 for den ønskede vektor. Målsekvensen "CAGTATCCGA..." adskiller sig f.eks. med kun en base fra en, der indeholder et BamHI-sted. En primersekvens udvælges til at passe målet præcist ved dets 3' ende og at indeholde den ændrede sekvens og restriktionssted nær dets 5'-ende (f.eks. "CAGgATCCGA...", 15 hvor det lille bogstav symboliserer en enhed, der ikke passer med målsekvensen). Denne minimalt ændrede sekvens vil ikke interferere med primerens evne til at hybridisere til den originale målsekvens og til initiering af polymeriseringen. Efter den første multiplikationscyklus kopieres primeren, 20 bliver selv målet og parrer eksakt med nye primere. Efter multiplikationsprocessen spaltes produkterne med passende restriktionsenzymer, der eventuelt er separeret fra ligationsinhibitorer, såsom nukleotidtriphosphater og salte ved passage over en afsaltende søjle eller molekylvægtkromato-25 grafisøj le og indsættes ved ligering i en klonende vektor, såsom bakteriofag M13. Genet kan derefter sekventeres og/el-ler udtrykkes under anvendelse af kendte metoder.
Den anden metode til fremstilling af primerne involverer at tage 3'-enden af primerne fra målsekvensen og tilsætte det 30 ønskede restriktionssted (-steder) til 5'-enden af primeren.
For det ovenfor anførte eksempel kunne et Hindlll-sted tilsættes til dannelse af sekvensen "cgaagcttCAGTATCCGA., hvor små bogstaver er som beskrevet ovenfor. De tilsatte baser ville ikke bidrage til hybridiseringen i den første 35 multiplikationscyklus, men ville passe i efterfølgende cyklusser. De endelige multiplicerede produkter udskæres derefter med restriktionsenzym (-enzymer), klones og udtrykkes som beskrevet ovenfor. Genet, der multipliceres, kan f.eks.
DK 171871 B1 24 være human β-hæmoglobin eller human HLA DQ, DR eller DP-or og -j8-gener.
Fremgangsmåden heri kan desuden anvendes til in vitro mutagenisering. Oligodeoxyribonucleotidprimerne behøver ikke 5 at være præcis komplementære til DNA-sekvensen, som skal multipliceres. Det er blot nødvendigt, at de er i stand til at hybridisere tilstrækkeligt godt til sekvensen til at blive forlænget af polymeraseenzymet eller ved et hvilket som helst andet anvendt inducerende middel. Produktet af en polymerase-10 kædereaktion, hvor de anvendte primere ikke er præcis komplementære til den oprindelige template vil indeholde sekvensen af primeren snarere end sekvensen af templaten, og derved indføre en in vitro mutation. I yderligere cyklusser vil denne mutation blive multipliceret med en ubegrænset effekti-15 vitet, fordi ingen yderligere ikke-parrede primerreaktioner kræves. Den således fremstillede mutant kan indsættes i en passende vektor ved molekylærbiologiske standardteknikker og kan eventuelt overføre mutantegenskaber til denne vektor, såsom produktionspotentialet af et ændret protein.
20 Fremgangsmåden til fremstilling af en ændret DNA-sekvens som beskrevet ovenfor kan gentages på det ændrede DNA under anvendelse af forskellige primere for således at inducere yderligere sekvensændringer. På denne måde kan en serie af muterede sekvenser gradvis produceres, hvori hver ny til-25 føj else til serierne kan adskille sig fra den forrige i ringe grad, men fra den oprindelige DNA-kildes sekvens i stadig større grad. På denne måde kan der i sidste ende laves ændringer, som ikke er mulige i et enkelt trin på grund af den manglende funktionsevne hos en meget alvorlig fejlparrende 30 primer.
Primeren kan desuden som en del af dens sekvens indeholde en ikke-komplementær sekvens, forudsat at en tilstrækkelig mængde af primeren indeholder en sekvens, som er komplementær til strengen, som skal multipliceres. En nukleotidsekvens, 35 som ikke er komplementær til templatesekvensen (såsom f.eks. en promotor, linker, kodende sekvens osv) kan f.eks. blive tilføjet til 5'-enden af en eller begge primerne og derved tilhæftet til produktet fra multiplikationsprocessen. Efter DK 171871 B1 25 at forlængelsesprimeren er tilsat gennemføres tilstrækkeligt mange cyklusser til opnåelse af den ønskede mængde af ny template, der indeholder den ikke-komplementære nukleotidind-føjelse. Dette tillader produktion af store mængder af de 5 kombinerede fragmenter på relativ kort tid (f.eks. to timer eller mindre) under anvendelse af en simpel teknik.
Den her anførte fremgangsmåde kan ifølge opfindelsen desuden anvendes til at syntetisere et nukleinsyrefragment ud fra et eksisterende nukleinsyrefragment, som er kortere end 10 dets produkt (kaldet kernesegmentet) under anvendelse af visse primere, hvis 3'-ender er komplementære til eller i alt væsentligt komplementære til 3'-enderne af enkeltstrengene, som er frembragt ved at separere strengene af de oprindelige, kortere nukleinsyrefragmenter, og hvor 5'-enderne af primerne 15 indeholder sekvensinformation, som skal tilføjes til kernesegmentet. Fremgangsmåden omfatter: (a) at strengene fra det eksisterende fragment behandles med to oligonukleotidprimere og andre nødvendige komponenter under sådanne betingelser, at der af 20 hver primer syntetiseres et forlængelsesprodukt, som er komplementært til hver nukleinsyrestreng, ved hvilken fremgangsmåde primerne udvælges således, at de i alt væsentligt er komplementære til 3'-enden af hver streng af det eksisterende fragment, således at 25 det forlængelsesprodukt, som syntetiseres ud fra én primer, når det er separeret fra dets komplement, kan tjene som en template for syntesen af forlængelsesproduktet af den anden primer, og hvorved hver primer i 5'-enden indeholder en sekvens af nukleo-30 tider, som ikke er komplementære til det eksisteren de fragment, og som svarer til de to ender af det nukleinsyrefragment, der bliver syntetiseret, (b) at primerforlængelsesprodukterne adskilles fra de templater, på hvilke de blev syntetiseret, til frem- 35 bringelse af enkeltstrengede molekyler, (c) at de enkeltstrengede molekyler, der er frembragt i trin (b), behandles med primerne og de nødvendige komponenter fra trin (a) under sådanne betingelser, DK 171871 B1 26 at der syntetiseres et primerforlængelsesprodukt under anvendelse af hver enkeltstreng, der er frembragt i trin (b), som en template, således at der produceres to intermediære dobbeltstrengede nuklein-5 syremolekyler, i hvilke der er blevet inkorporeret den nukleotidsekvens, som er til stede i 5'-enden af én af oligonukleotidprimerne, og to fuldlængde dob-beltstrengede nukleinsyremolekyler, i hvilke der er inkorporeret den nukleinsyresekvens, der er til 10 stede i 5'-enderne af begge oligonukleotidprimerne, og (d) at trinnene (b) og (c) gentages et tilstrækkeligt antal gange til at producere dobbeltstrengede molekyler i fuld længde i en effektiv mængde.
15 Eventuelt kan trinnene (a) - (d) gentages under anvendel se af produktet fra trin (d) som kernefragment og to yderligere oligonukleotidprimere, som er komplementære til eller i alt væsentligt komplementære til 3'-enderne af de enkeltstrenge, der frembringes ved at separere strengene fra pro-20 duktet i trin (d).
Trinnene (b) og (c) gentages så ofte som nødvendigt, almindeligvis mindst 5 gange, til frembringelse af den krævede mængde af det dobbeltstrengede produkt af fuld længde til syntetisering af slutproduktet (dvs. den effektive mæng-25 de). Kernesegmentet kan yderligere opnås som produktet af en tidligere multiplikationscyklus. Produktet frembragt i trin (d) kan oprenses før en ny forlængelses- og multiplikations-cyklus eller kan anvendes direkte ved at anvende reaktions-blandingen, der indeholder produktet.
30 Hvis 3'-enderne af primerne ikke er præcis komplementære til 3'-enderne af de enkelte strenge af den oprindelige, kortere nukleinsyre, vil kernefragmentet af produktet ikke være præcis det samme som sekvensinformationen, der er nedlagt i den oprindelige, kortere nukleinsyre. Mutanter af den 35 oprindelige nukleinsyre kan derfor laves ved at anvende primere, som i alt væsentligt er komplementære ved deres 3'-ender til 3'-enderne af enkeltstrengene af den oprindelige, kortere nukleinsyre.
DK 171871 B1 27
Hvis restriktionsstedlinkere inkorporeres i primerne, kan de multiplicerede, dobbeltstrengede produkter fordøjes med de passende restriktionsenzymer og ligeres direkte i en M13-vektor til hurtig kloning og sekventering. M13-plaques, der 5 indeholder de specifikke multiplicerede målsekvenser, kan identificeres ved at hybridisere plaque-løftefiltrere med en probe, som er specifik for målsekvensen.
De efterfølgende eksempler illustrerer opfindelsen nærmere. I disse eksempler er alle procenter angivet i vægtpro-10 center for faste stoffer og i volumenprocenter for væsker, og alle temperaturer er i grader Celcius med mindre andet angives .
Eksempel 1
En 25-baseparsekvens med nukletidsekvensen 15 5' CCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCT 3' 3' GGAGCCGTGGCAGTGGGACCTACGA 5' indeholdt på et 47 basepar Fokl-restriktionsfragment af pBR322, som var opnået fra ATCC, blev fremstillet som følger. En Fokl-fordøjelse af pBR322 indeholdende det 47 bp lange 20 fragment blev fremstillet ved at fordøje pBR322 med Fokl i overensstemmelse med betingelserne, som er foreslået af leverandøren, New England Biolabs Inc. Primerne, som blev anvendt, var 5' d(CCTCGGCACCG) 3' og 5' d(AGCATCCAGGGTG) 3' og blev fremstillet under anvendelse af traditionelle metod-25 er. De efterfølgende ingredienser tilsattes til 33 μΐ puffer, som bestod af 25 mM kaliumphosphat, 10 mM magnesiumchlorid og 100 mM natriumchlorid ved pH 7,5: 2433 pmol af hver af de ovenfor beskrevne primere, 2,4 pmol af det Fokl- fordøj ede pBR322, 12 nmol dATP, 22 nmol dCTP, 19 nmol dGTP og 10 nmol 30 TTP.
Blandingen blev opvarmet til 85°C i 5 minutter og fik lov at afkøle til omgivelsestemperatur. Fem enheder Klenow-fragment af E.coli DNA polymerase I tilsattes, og temperaturen blev holdt i 15 minutter. Efter denne tid blev blandingen 35 igen opvarmet til 85°C i 5 minutter og fik lov at afkøle. Fem enheder Klenow-fragment blev igen tilsat, og reaktionen blev DK 171871 B1 28 udført i 15 minutter. Opvarmnings-, afkølings- og syntesetrinnene blev gentaget yderligere 11 gange.
Efter den sidste gentagelse blev en 5 μΐ delprøve udtaget fra reaktionsblandingen. Denne blev opvarmet til 85°C i 3 5 minutter og fik lov at afkøle til omgivelsestemperatur. 12,5 32 pmol α-P -deoxycytidintriphosphat og 5 enheder Klenow-fragment blev tilsat, og reaktionen fik lov at forløbe i 15 minutter. De mærkede produkter blev undersøgt ved polyacryl-amidgelelektroforese. Fokl- fordøj elsen blev mærket på lignen-10 de måde og tjente som kontrol og molekylvægtmarkører. Det eneste stærkt mærkede bånd, der var synligt efter de 13 cyklusser, var den tilsigtede 25-basepar lange sekvens.
Eksempel 2
Sekvensen, som ønskedes multipliceret, var en 94 basepar 15 lang sekvens, der var indeholdt i det humane /3-gi obi ngen og spændte over Mstll-stedet, der er involveret i seglcelleanæmi. Sekvensen har den i figur 1 viste nukleotidsekvens.
I. Syntese af primere Følgende to oligodeoxyribonukleotidprimere fremstilledes 20 ved den nedenfor beskrevne metode:
5' CACAGGGCAGTAACG 3' Primer A
og
5' TTTGCTTCTGACACA 3' Primer B
Automatiseret synteseprocedure: Diethylphosphoramiditer, 25 der er syntetiseret ifølge Beaucage og Caruthers (Tetrahedron Letters (1981) 22:1859-1862) blev kondenseret sekventielt til et nukleosidderivatiseret styret poreglasbæremateriale under anvendelse af en Biosearch SAM-l. Fremgangsmåden inkluderede detritylering med trichloreddikesyre i dichlormethan, konden-30 sering under anvendelse af benzotriazol som aktiverende protondonor og afdækning (eng: capping) med eddikesyrean-hydrid og dimethylaminopyridin i tetrahydrofuran og pyridin. Cyklustid var ca. 30 minutter. Udbytte ved hvert trin var i alt væsentligt kvantitativt og blev bestemt ved opsamling og 35 spektroskopisk undersøgelse af dimethoxytritylalkohol frigjort under detritylering.
DK 171871 B1 29
Oligodeoxyribonukleotid-afbeskyttelses- og -oprensnings-procedurer: Den faste bæremateriale blev fjernet fra søjlen og eksponeret til 1 ml koncentreret ammoniumhydroxid ved stuetemperatur i 4 timer i et lukket rør. Bærematerialet blev 5 derefter fjernet ved filtrering, og opløsningen, der indeholdt det delvis beskyttede oligodeoxynukleotid, blev opvarmet til 55°C i 5 timer. Ammoniak blev fjernet, og resten blev påsat en præparativ polyacrylamidgel. Elektroforese blev udført ved 30 volt/cm i 90 minutter, hvorefter båndet, der 10 indeholdt produktet, blev identificeret ved UV-skygning af en fluorescensplade. Båndet blev udskåret og elueret med 1 ml destilleret vand natten over ved 4°C. Denne opløsning blev påført en Altech RP18 søjle og elueret med en 7-13% gradient af acetonitril i 1% ammoniumacetatbuffer ved pH 6,0. Eluatet 15 blev målt ved UV-absorption ved 260 nm, og en passende fraktion opsamledes, kvantificeredes ved UV-absorbans i et fastlagt volumen og inddampedes til tørhed ved stuetemperatur i en vakuumcentrifuge.
Karakterisering af oligodeoxyribonukleotider: Testalikvo- . 32 20 ter af de oprensede oligonukleotider blev mærket med P med 32 polynukleotidkinase og y- P-ATP. De mærkede forbindelse blev undersøgt ved autoradiografi af 14-20% polyacrylamidgeler efter elektroforese i 45 minutter ved 50 volt/cm. Denne fremgangsmåde verificerer molekylvægten. Basesammensætningen 25 blev bestemt ved fordøjelse af oligodeoxyribonukleotidet til nukleosider under anvendelse af gift-diesterase og bakteriel, alkalisk phosphatase og efterfølgende separation og kvantificering af de afledte nukleosider under anvendelse af en HPLC-søjle med omvendt fase og en 10% acetonitril, 1% ammoniumace-30 tat mobil fase.
II. DNA-kilde.
A. Ekstraktion af hel, human vildtyne-DNA
Human genomisk DNA, der er homozygotisk for normal β-globin, blev ekstraheret fra cellelinien Molt4 (opnået fra 35 Human Genetic Mutant Cell Repository og identificeret som GM2219c) under anvendelse af teknikken beskrevet af Stetler et al., Proc.Natl.Acad.Sci. (1982), 79:5966-5970.
DK 171871 B1 30 B. Konstruktion af klonede qlobingener
Et 1,9 kb langt BamHI - fragment af det normale (S-globingen isoleredes fra cosmidet pFCll og indsattes i BamHI-stedet af pBR328 (Soberon et al.. Gene (1980) £:287-305). Dette frag-5 ment, som omfatter regionen, som hybridiserer til den syntetiske 40-mer probe, inkluderer den første og anden exon, den første intron og de 5'-flankerende sekvenser af genet (Lawn et al., Cel! (1978), 15:1157-1174). Denne klon betegnedes pBR328:HbA og blev deponeret under ATCC nr. 39.698 25.maj 10 1984.
Det tilsvarende 1,9 kb lange BamHI- fragment af seglcelle-allelet af /J-globin isoleredes fra cosmidet pFC12 og klonedes som ovenfor beskrevet. Denne klon blev betegnet pBR328:HbS og deponeredes under ATCC nr. 39.699 25. maj, 1984.
15 Hver rekombinantplasmid blev transformeret ind i og opformeret i E.coli MM294 (ATCC nr. 39.607).
C. Fordøjelse af klonede qlobingener med Mstll
Et total på 100 μg af hver af pBR328:HbA og pBR328:HbS blev individuelt fordøjet met 20 enheder Mstll (New England 20 Biolabs) i 16 timer ved 37°C i 200 μΐ 150 mM NaCl, 12 mM Tris HC1 (pH 7,5), 12 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT), og 100 /*g/ml bovinserumalbumin (BSA) . Produkterne blev betegnet pBR32 8:HbA/MstI1 henholdsvis pBR328:HbS/Mstll.
III. Polymerasekadereaktion
25 Til 100 μΐ buffer bestående af 60 mM natriumacetat, 30 mM
Trisacetat og 10 mM magnesiumacetat ved pH 8,0 tilsattes 2 μΐ af en opløsning indeholdende 100 picomol Primer A (med sekvensen d(CACAGGGCACTAACG)), 100 picomol af Primer B (med sekvensen d(TTTGCTTCTGACACA)) og 1000 picomol af hver af 30 dATP, dCTP, dGTP og TTP. Desuden tilsattes en af følgende ovenfor beskrevne DNA-kilder: 10 μg hel, human, vildtype DNA (reaktion I) 0,1 picomol pBR328:HbA (reaktion II).
0,1 picomol pBR328:HbS (reaktion III).
35 0,1 picomol pBR328:HbA/MstII (reaktion IV).
0,1 picomol pBR328:HbS/Mstll (reaktion V).
DK 171871 B1 31
Intet mål-DNA (reaktion VI)
Hver resulterende opløsning opvarmedes til 100°C i 4 minutter og fik lov at afkøle til stuetemperatur i 2 minutter, hvorefter 1 μΐ indeholdende 4 enheder Klenow-fragment af 5 E.coli DNA polymerase tilsattes. Hver reaktion fik lov at forløbe i 10 minutter, hvorefter cyklussen med tilsætning af primere, nukleotider og DNA, opvarmning, afkøling, tilsætning af polymerase og reaktion blev gentaget 19 gange for reaktion I og 4 gange for reaktionerne II-VI.
10 Alikvoter på 4 mikroliter af reaktionerne I og II, der var fjernet før den første cyklus og efter den sidste cyklus af hver reaktion, blev påsat en 12% polyacrylamidgel 0,089 M i Tris-borat-buffer ved pH 8,3 og 2,5 mM i EDTA. Gelen blev elektroforesebehandlet ved 25 volt/cm i 4 timer, overført til 15 en nylonmembran, der tjente som fast-fase-bæremateriale og 32 probebehandlet med et syntetisk 5'- P-mærket 40 bp langt fragment, der var fremstillet ved standardteknik, med sekvensen: 5' d(TCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAG)3' 20 i 30% formamid, 3 x SSPE, 5 x Denhardt's, 5% natriumdodecyl-sulfat ved pH 7,4. Figur 2 er et autoradiogram af den probe-behandlede nylonmembran for reaktionerne I og II. Bane 1 er 0,1 picomol af en 58 bp langt syntetisk fragmentkontrol, hvor 1 streng er komplementær til den ovennævnte probe. Bane 2 er 25 4 μΐ af reaktion I forud for den første multiplikationscyk lus. Bane 3 er 4 μΐ af reaktion I efter den 20. multiplikationscyklus. Bane 4 er 4 μΐ af reaktion II efter fem multiplikationscyklusser. Bane 5 er en molekylvægtstandard, der består af en Fokl (New England Biolabs) fordøjelse af pBR322 32 30 (New England Biolabs) mærket med ot- P-dNTP'er og polymerase. Bane 3 viser, at efter 20 cyklusser indeholdt reaktionsblanding I en stor mængde af den specifikke sekvens af den passende molekylvægt og ingen andre påviselige produkter. Reaktionsblanding II efter 5 cyklusser indeholdt også dette 35 produkt, såvel som udgangsnukleinsyren og andre produkter, som vist ved bane 4.
DK 171871 B1 32
Til 5,0 μΐ alikvoter af reaktionerne II-VI efter den 4. cyklus tilsattes 5 pmol af hver af de ovenfor beskrevne primere. Opløsningerne blev opvarmet til 100°C i 4 minutter og fik lov at ækvilibrere til stuetempeatur. 3 pmol af hver 5 af a-32P-dATP, a-32P-dCTP, a-32P-dGTP, a-32P-dTTP og 4 enheder Klenow-fragment blev tilsat. Reaktionen fik i et slut-volumen på 10 μΐ og ved de ovenfor angivne saltkoncentrationer lov at forløbe i 10 minutter. Polymeraseaktiviteten blev afsluttet ved opvarmning i 20 minutter ved 60°C. Alikvoter på 10 4 μΐ af reaktionerne II-VI blev ladet på en 12% polyacryl- amidgel 0,089 M i Tris-borat-buffer ved pH 8,3 og 2,5 mM i EDTA. Gelen blev elektroforesebehandlet ved 25 volt/cm i 4 timer, hvorefter autoradiografi blev udført.
Figur 3 er et autoradiogram af elektroforesen. Bane 1 er 15 en molekylvægtstandard, bane 2 er reaktion II, bane 3 er reaktion III, bane 4 er reaktion IV og bane 5 er reaktion V.
En anden bane for reaktion VI som kontrol og uden tilsat DNA havde ingen markeringer i nogen af banerne. Det kan ses ud fra tegningen, at de 94 bp lange fragment, som var forudsagt 20 ud fra mål-DNA, kun var til stede, hvor intakt Ø-globin-DNA-sekvenser var tilgængelige for multiplicering, dvs. pBR328:HbA (bane 2), pBR328:HbS (bane 3) og pBR328:HbS/MstII (bane 5). Mstll-fordøj else skærer pBR328:HbA i den 94-mere sekvens, og gør den derved ude af stand til at blive multi-25 pliceret, og det 94-mere bånd viser sig ikke i bane 4. I
modsætning hertil udskæres den 94-mere sekvens i pBR328:AbS ikke, når plasmidet fordøjes med Mstll. og er således tilgængelig for multiplicering som vist i bane 5.
Figur 4 viser kædereaktionen for 3 cyklusser i multi-30 plicering af den 94 bp lange sekvens. PC01 og PC02 er primere A og B. Tallene på højre side indicerer cyklusserne, hvorimod tallene på venstre side indicerer cyklustallene, i hvilke et specielt molekyle blev produceret.
Eksempel 3 35 Dette eksempel viser multiplikationen af en 110 bp se kvens spændende over det allele Mstll-sted i det humane hæmoglobingen.
DK 171871 B1 33
Et total på 1,0 mikrogram hel, human DNA, 100 picomol d(ACACAACTGTGTTCACTAGC) og 100 picomol d (CAACTTCATCCACGTTCACC) , hvor primerne var blevet fremstillet ved metoden ifølge eksempel 2, blev opløst i 100 μΐ af en 5 opløsning, som bestod af: 1,5 mM af hver af de fire deoxyribonukleosidtriphosphater 30 mM Trisacetatbuffer ved pH 7,9 60 mM natriumacetat 10 mM magnesiumacetat 10 0,25 iriM dithiothreitol.
Opløsningen opvarmedes til 100°C i 1 minut og bragtes hurtigt til 25°C i 1 minut, hvorefter der tilsattes 2,5 enheder Klenow-fragment af DNA-polymerase. Polymerasereak-tionen fik lov at forløbe i 2 minutter ved 25°C, hvorefter 15 cyklussen bestående af opvarmning, afkøling, tilsætning af Klenow-fragment og reaktion blev gentaget så ofte som ønsket.
Men en 70% effektivitet ved hver cyklus resulterede 15 cyklusser i syntese af 1,4 femtomol af det ønskede 110 bp fragment af β-giobingenet.
20 Eksempel 4
Dette eksempel viser multiplikationen af en 240 bp sekvens, der spænder over det allele Mstll-sted i det humane hæmoglobingen. Denne sekvens indeholder Ncol. HinfI og Mstll restriktionsstederne.
25 Til 100 μΐ af en blanding af 60 mM natriumacetat, 30 mM
Tris-acetat og 10 mM magnesiumacetat ved pH 8,0 indeholdende 0,1 pmol pBR328:HbA tilsattes 2 μΐ opløsning A, der indeholdt : 100 picomol d(GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG) primer.
30 100 picomol d(TAACCTTGATACCAACCTGCCC) primer 1000 pmol af hver af dATP, dCTP, dGTP og TTP.
De to primere blev fremstillet ved metoden beskrevet i eksempel 2. Opløsningen blev opvarmet til 100°C i 4 minutter og fik lov at afkøle i omgivelsesluft i 2 minutter, hvorefter 35 der tilsattes l μΐ indeholdende fire enheder Klenow fragment af E.coli DNA polymerase. Reaktionen fik lov at forløbe i 10 DK 171871 B1 34 minutter, hvorefter cyklussen bestående af tilsætning af opløsning A, opvarmning, afkøling, tilsætning af polymerase og reaktion blev gentaget 3 gange. Til en delmængde på 5,0 μΐ af reaktionerne tilsattes 5 picomol af hver af ovennævnte 5 oligonukleotidprimere. Opløsningen blev opvarmet til 100°C i 4 minutter og fik lov at indstille sig til omgivelsestempera- 32 tur, hvorefter 3 picomol af hver af de a- P-mærkede deoxyn-bonukleosidtriphosphater og 4 enheder Klenow-fragment tilsattes. Reaktionen fik i et slutvolumen på 10 μΐ og ved de 10 ovenfor givne saltkoncentrationer lov at forløbe i 10 minutter. Polymeraseaktiviteten blev afsluttet ved opvarmning i 20 minutter ved 60°C. 2 μΐ alikvoter blev fordøjet med Ncol.
Msti eller HinfI og sat på en 12% polyacrylamidgel 0,089 M i Tris-Borat-buffer ved pH 8,3 og 2,5 mM i EDTA. Gelen blev 15 elektroforesebehandlet ved 25 volt/cm i 4 timer, og autoradiografi blev udført. Figur 5 viser autoradiogrammet af elektroforesen, hvor bane 1 er den molekylvægtstandard, bane 2 er uden fordøjelse med enzym (240 bp intakt), bane 3 er fordøjelse med Ncol (131 og 109 bp), bane 4 er fordøjelse med 20 Mstll (149 og 91 bp) og bane 5 er fordøjelse med HinfI (144 og 96 bp). Autoradiogrammet er i overensstemmelse med multiplikationen af den 240 bp lange sekvens.
Eksempel 5
Dette eksempel viser anvendelsen af fremgangsmåden be-25 skrevet heri til påvisning af seglcelleanæmi ved sekventiel fordøjelse.
Syntese og phosphorylering af oligodeoxyribonukleotider En mærket DNA-probe, RS06, med sekvensen: 5' * CTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGG 3' 30 hvor * indicerer mærkningen, og en umærket, blokerende oligomer, RS10, med sekvensen: 3' GACAGAGGTCACCTCTTCAGACGGCAATGACGGGACACCC 5' som har 3 basepar fejlparrede med RS06, blev syntetiseret ifølge fremgangsmåderne, som blev angivet i eksempel 2(1).
35 Proben RS06 blev mærket ved at kontakte 5 pmol heraf med 4 enheder T4 polynukleotidkinase (New England Biolabs) og 50 DK 171871 B1 35
pmol 7-32p_ATp (New England Nuclear, ca. 7200 Ci/mmol) i et 40 μΐ reakt ionsvolumen indeholdende 70 mM Tris-buffer (pH
7,6), 10 MM MgCl2, 1,5 mM spermin og 2,5 mM dithiothreitol i 90 minutter ved 37°C. Det totale volumen blev derefter ind-5 stillet til 100 μΐ med 25 mM EDTA og oprenset ifølge fremgangsmåden af Maniatis et al., Molecular Cloning (1982), 464-465 over en 1 ml Bio Gel P-4 spindialysesøjle fra BioRad ækvilibreret med Tris-EDTA (TE) buffer (10 mM Tris-buffer, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Den mærkede probe blev yderligere 10 oprenset ved elektroforese på en 18% polyacrylamidgel (19:1 acrylamid:BIS, BioRad) i Tris-borsyre-EDTA (TBE) buffer (89 mM Tris, 89 mM borsyre, 2,5 mM EDTA, pH 8,3) i 500 vhr. Efter lokalisering ved autoradiografi blev den del af gelen, der indeholdt den mærkede probe, udskåret, knust og elueret i 0,2 15 ml TE puffer natten over ved 4°C. TCA-præcipitation af reaktionsproduktet viste, at den specifikke aktivitet var 4,9 Ci/mmol, og slutkoncentrationen var 20 pmol/ml.
Den umærkede RS10 blokerende oligomer blev anvendt ved en koncentration på 200 pmol/ml.
20 Isolering af human oenomisk DNA fra cellelinier
Genomisk DNA med høj molekylvægt blev isoleret fra lym-foidcellelinierne Molt4, SC-1 og GM2064 under anvendelse af i alt væsentligt den metode, der beskrives af Stetler et al. i PNAS (1982) 7£; 5966-5970 (for Molt4) og Maniatis et al. i 25 Molecular Cloning (1982), 280-281.
Molt4 (Human Mutant Cell Repository, GM2219C) er en T-cellelinie, der er homozygot for normal jff-globin, og SC-1, deponeret hos ATCC 19. marts 1985, er en EBV-transformeret B-cellelinie, der er homozygot for seglcelleallelet. GM2064 30 (Human Mutant Cell Repository, GM2064) blev oprindeligt isoleret fra en individuel homozygot med arvelig persistens af føtalhæmoglobin (HPFH) og indeholeer ingen beta- eller deltaglobingensekvenser. Alle cellelinier blev opretholdt i RPMI-1640 med 10% føtal kalveserum.
DK 171871 B1 36
Isolering af human crenomisk DNA fra kliniske blodprøver
En klinisk blodprøve, betegnet CH12, fra en kendt segl-cellebærer (AS) blev opnået fra Dr. Bertram Lubin fra Children's Hospital i Oakland, Californien. Genomisk DNA blev 5 fremstillet ud fra "buffy-coat"-fraktionen, som primært er sammensat af perifer blod-lymfocytter, under anvendlese af en modifikation af fremgangsmåden, som er beskrevet af Nunberg et al. i Proc.Nat.Acad.Sci. 75, 5553-5556 (1978).
Cellerne blev resuspenderet i 5 ml Tris-EDTA-NaCl (TEN) 10 buffer (10 mM Tris buffer pH 8, 1 mM EDTA, 10 mM NaCl) og indstillet til 0,2 mg/ml proteinase K, 0,5% SDS, og inkuberet natten over ved 37°C. Natriumperchlorat blev derefter tilsat til 0,7 M, og lysatet blev forsigtigt rystet i 1-2 timer ved stuetemperatur. Lysatet blev ekstraheret med 30 ml phe-15 nol/chloroform (1:1), derefter med 30 ml chloroform og efterfulgt af ethanolpræcipitering af nukleinsyrerne. Pelleten blev resuspenderet i 2 ml TE-buffer og RNase A blev tilsat til 0,005 mg/ml. Efter fordøjelse i 1 time ved 37°C blev DNA'et ekstraheret en gang med hver af lige volumener phenol, 20 phenol/ chloroform og chloroform og blev ethanolpræcipiteret. DNA'et blev resuspenderet i 0,5 ml TE-puffer, og koncentrationen blev bestemt ved absorbtion ved 260 nm.
Polymeasekædereaktion til selektiv multiplicering af fi-glo-binsekvenser 25 To mikrogram genomisk DNA blev multipliceret i et initi- elt 100 μΐ reaktionsvolumen indeholdende 10 mM Tris-puffer (pH 7,5), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 150 pmol Primer A med sekvensen d(CACAGGGCACTAACG) og 150 pmol af Primer B med sekvensen d(CTTTGCTTCTGACACA) og dækket med ca. 100 μΐ mi-30 neralolie for at forhindre fordampning.
Hver DNA-prøve undergik 15 multiplikationscyklusser, hvor en cyklus er sammensat af 3 trin: 1) denaturering i et varmebloksæt ved 95°C i 2 minutter, 2) umiddelbar overføring til et varmebloksæt ved 30°C i 2 35 minutter for at tillade primere og genomisk DNA at anneale, 3) tilsætning af 2 μΐ af en opløsning indeholdende 5 enheder Klenow-fragment af E.coli DNA-polymerase I (New DK 171871 B1 37
England Biolabs), 1 ranol af hver af dATP, dCTP, dGTP og TTP i en puffer, der er sammensat af 10 mM Tris (pH 7,5), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2 og 4 mM dithiothreitol. Denne forlængelses-reaktion fik lov at forløbe i 10 minutter ved 30°C.
5 Efter slutcyklussen blev reaktionen afsluttet ved op varmning ved 95°C i 2 minutter. Mineralolien blev ekstraheret med 0,2 ml chloroform og bortkastet. Slutreaktionsvolumenet var 130 μΐ.
Hybridiserinq/fordøielse af multipliceret, genomisk DNA med 10 prober og Ddel/Hinfl 45 μΐ af det multiplicerede, genomiske DNA blev ethanol-præcipiteret og resuspenderet i samme volumen TE-buffer. 10 μΐ (indeholdende den præ-multiplicerede ækvivalent til 154 ng af genomisk DNA) blev overført til et 1,5 ml Microfuge-rør og 15 20 μΐ TE-buffer til et slutvolumen på 30 μΐ. Prøven blev dækket med mineralsk olie og denatureret ved 95°C i 10 minutter. 10 μΐ 0,6 M NaCl indeholdende 0,02 pmol mærket R206-probe blev tilsat til røret, blandet let og straks overført til en 56 °C varm varmeblok i 1 time. Fire mikroliter umærket 20 RS10-blokerende oligomer (0,8 pmol) blev tilsat, og hybridi-seringen fortsattes i yderligere 10 minutter ved samme temperatur. 5 μΐ 60 mM MgCl2/0,l% BSA og 1 μΐ Ddel (10 enheder, New England Biolabs) tilsattes, og det reannealede DNA blev fordøjet i 30 minutter ved 56°C. 1 μΐ HinfI (10 enheder, New 25 England Biolabs) blev derefter tilsat og inkuberet i yderligere 30 minutter. Reaktionen blev stoppet ved tilsætning af 4 μΐ 75 mM EDTA og 6 μΐ sporfarve til et slutvolumen på 61 μΐ.
Mineralolien blev ekstraheret med 0,2 ml chloroform og 18 μΐ af reaktionsblandingen (45 ng genomisk DNA) blev sat på en 30 30% polyacrylamid-minigel (19:1, Bio Rad) i et Hoeffer SE200 apparat. Gelen blev elektroforesebehandlet ved ca. 300 volt i 1 time, indtil bromphenolblå-farvefronten var vandret 3,0 cm fra påsætningsstedet. De øverste 1,5 cm af gelen fjernedes, og den resterende gel blev eksponeret i 4 dage med en inten-35 sificeringsskærm ved -70°C.
DK 171871 B1 38
Diskussion af fotografi (ficr.9)
Hver bane indeholder 45 ng multipliceret, genomisk DNA.
Bane A indeholder Molt4 DNA; bane B, CH12; bane C, SC-1 og bane D, GM2064. Molt4 repræsenterer genotypen af et normalt 5 individ med 2 kopier af βA-genet pr. celle (AA), CH12 er en klinisk prøve fra en seglcellebærer med et β^- og et /3S-gen pr. celle (AS), og SCI repræsenterer genotypen for et segl-
O
celleindivid med to kopier af β -genet pr. celle (SS).
GM2064, som ikke indeholder beta- eller deltaglobinsekvenser, 10 er tilstede som en negativ kontrol.
Som det ses på fotografiet er den Ddel-spaltede, βΑ-specifikke octamer kun tilstede i de DNA'er, der indeholder /SA-genet (baner A og B) og den Hinf I- spaltede. 0S-specifikke
Q
trimer er kun tilstede i de DNA'er, der indeholder β -genet 15 (banerne B og C). Tilstedeværelsen af både trimer og octamer (bane B) er diagnostisk for en seglcellebærer og kan skelnes fra et normalt individ (bane A) med octameren alene og fra et seglcelleplaget individ (bane C) med trimer alene.
Gentagelsen af det ovenfor beskrevne forsøg under an-20 vendelse af ikke-multipliceret, genomisk DNA viste til sammenligning at multiplikationen forøgede påvisningsfølsomheden mindst 1000 gange.
Eksempel 6
Dette eksempel illustrerer direkte påvisning af et fuld-25 stændigt uoprenset, enkeltkopigen i hel, human DNA på geler uden behov for en mærket probe.
Under anvendelse af den i eksempel 3 beskrevne metode blev et 110 bp langt fragment fra en sekvens i det første exonområde af betaglobingenet multipliceret ud fra 10 mikro-30 gram hel, human DNA efter 20 cyklusser. Dette 110 bp fragment, der var frembragt efter 20 cyklusser, kunne let ses på geler, der var farvet med ethidiumbromid.
Sekvensen multipliceredes ikke, når det først var skåret med restriktionsenzymet Ddel, undtagen, som i beta-globin-S-35 allelen, hvis sekvensen ikke indeholdt restriktionsstedet som enzymet genkender.
DK 171871 B1 39
Eksempel 7 A. Et total på 100 fmol pBR328, der indeholdt et 1,9 kb langt indsat stykke fra det humane beta-globin A allel, 50 nmol af hver af a- P-dNTP ved 500 Ci/mol og 1 nmol af hver 5 af primerne, der anvendtes i eksempel 3, blev opløst i en opløsning indeholdende 100 μΐ 30 mM Tris-acetat ved pH 7,9, 60 mM natriumacetat, 100 mM dithiothreitol og 10 mM magnesiumacetat. Opløsningen bragtes til 100°C i 2 minutter og afkøledes til 25°C i 1 minut. Et total på 1 μΐ indeholdende 10 4,5 enheder Klenow-fragment af E.coli DNA polymerase I og 0,09 enheder uorganisk pyrophosphatase tilsattes for at forhindre den mulige ophobning af pyrophosphat i reaktionsblandingen, og reaktionen fik lov at forløbe i 2 minutter ved 25°C, hvorefter cyklussen med opvarmning, afkøling, enzymtil-15 sætning og reaktion blev gentaget 9 gange. 10 μΐ delprøver udtoges og tilsattes til 1 μΐ 600 mM EDTA efter hver syntese-cyklus. Hver blev analyseret på en 14% polyacrylamidgel i 90 mM Tris-borat og 2,5 mM EDTA ved pH 8,3 og 24 volt/cm i 2,5 timer. Den færdige gel blev opblødet i 20 minutter i den 20 samme puffer med tilsætning af 0,5 μg/ml ethidiumbromid, vasket med det oprindelige puffer og fotograferet i UV-lys under anvendelse af et rødt filter.
Det fremstillede 110 bp lange fragment blev udskåret fra gelen under ultraviolet lys, og det inkorporerede P måltes 25 ved Cerenkov-bestråling. Et forsøg på at indpasse resultater-ne i ligningen med formen:pmol/l0 μΐ = 0,01 [(1+y) - yN - 1], hvor N angiver antallet af cyklusser og y er fraktionsudbyttet pr. cyklus, var optimal med y = 0,619. Dette indicerer, at en signifikant multiplicering opnåedes.
30 B. Det ovenfor angivne forsøg gentoges med undtagelse af, at 100 nmol af hver dNTP tilsattes til en 100 μΐ reaktion, ingen radioaktiv mærkning blev anvendt og delprøver blev ikke fjernet ved hver cyklus. Efter 10 cyklusser afsluttedes reaktionen ved kogning i 2 minutter og rehybridiseringen blev 35 udført ved 57°C i 1 time. Sekvensen af det 110 bp lange produkt blev bekræftet ved at udsætte 8 μΐ delprøver for restriktionsanalyse ved tilsætning af 1 μΐ bovinserumalbumin (25 mg/ml) og 1 μΐ af det passende restriktionsenzym (HinfI.
DK 171871 B1 40
Mnll. Mstll. Ncol) og ved omsætning ved 37°C i 15 timer. PAGE blev udført som ovenfor beskrevet.
Eksempel 8
Dette eksempel illustrerer anvendelsen af forskellige 5 primere til multiplicering af forskellige fragmenter af pBR328 og 322.
A. Forsøget, der er beskrevet i eksempel 7A, blev gentaget med undtagelse af, at der anvendtes følgende primere: d(TTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC) og 10 d(GCCTCACCACCAACTTCATCCACGTTCACC) til fremstilling af et 130 bp langt fragment af pBR328.
B. Forsøget, der er beskrevet i eksempel 7A, blev gentaget med undtagelse af, at der anvendtes følgende primere: d (GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG) og d (TGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG) 15 til fremstilling af et 262 bp langt fragment af pBR328. Omsætningstiden var 20 minutter pr. cyklus.
C. Forsøget, der er beskrevet i eksempel 8A, blev gentaget med undtagelse af, at 100 fmol af en Mstll-fordøjelse af pBR328 indeholdende et 1,9 kb langt indskud fra det 20 humane beta-globin S allel blev anvendt som initiel template. Dette plasmid blev spaltet flere gange med Mstll. men ikke indeni sekvensen, der skulle multipliceres. Desuden var de anvendte primere følgende: d(GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG) og d(TAACCTTGATACCAACCTGCCC) til 25 dannelse af et 240 bp langt fragment.
D. Forsøget, der er beskrevet i eksempel 7B, blev gentaget med undtagelse af, at 100 fmol af en Nrul-fordøj else af pBR328 blev anvendt som template, 200 nmol af hver dNTP blev anvendt i 100 μΐ omsætningen og primerne var: 30 d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT) og d(CTTCCCCATCGGTGATGTCG) til dannelse af et 500 bp langt fragment fra pBR328. Omsætningstider var 20 minutter pr. cyklus ved 37°C. Slut-rehybridisering var 15 timer ved 57°C. Elektroforese var på en 4% agarosegel.
DK 171871 B1 41
Eksempel 9
Dette eksempel illustrerer fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvorved en in vitro mutation introduceres i det multiplicerede segment.
5 A. Et total på 100 fmol pBR322 lineariseret med Nrul. 1 nmol af hver af primerne: d(CGCATTAAAGCTTATCGATG) og d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT) udformet til frembringelse af et 75 bp langt fragment, 100 nmol af hver af dNTP, i 100 μΐ 40 mM Tris ved pH 8, 20 mM i MgCl2, 5 mM i dithiothreitol og 5 10 mg/ml bovinserumalbumin blev kombineret. Blandingen blev bragt til 100°C i 1 minut, afkølet i 0,5 minutter i et vandbad ved 23°C, hvorefter 4,5 enheder Klenow-fragment og 0,09 enheder uorganisk pyrophosphatase blev tilsat, og en omsætning fik lov at forløbe i 3 minutter. Cyklussen med opvarm-15 ning, afkøling, tilsætning af enzymer og omsætning blev gentaget 9 gange. Den 10. omsætningscyklus blev afsluttet ved nedfrysning og en 8 μΐ delprøve af reaktionsblandingen blev sat på en 4% agarosegel visualiseret med ethidiumbromid.
B. Forsøget som er beskrevet i eksempel 9A blev gen- 20 taget med undtagelse af, at de anvendte oligonukleotidprimere var: d(CGCATTAAAGCTTATCGATG) og d(AATTAATACGACTCACTATAGGGAGATAGGCGTATCACGAGGCCCT)
Disse primere er udformet til at producere et 101 bp 25 langt fragment, hvoraf 26 nucleotider (i den primer, der er angivet som nummer to), ikke er til stede i pBR322. Disse nukleotider repræsenterer sekvensen i T7-promotoren, som blev tilføjet til den 75 bp lange sekvens fra pBR322 ved at anvende primeren med 20 komplementære baser og en 26 base lang 30 5'-forlængelse. Proceduren krævede mindre end 2 timer og producerede to picomol af det relativt rene 101 bp lange fragment fra 100 fmol af pBR322.
T7-promotoren kan anvendes til at initiere RNA-tran-skription. T7-polymerase kan tilsættes til det 101 bp lange 35 fragment til frembringelse af enkeltstrenget RNA.
C. Forsøget som er beskrevet i eksempel 8D blev gentaget med undtagelse af, at de anvendte oligonukleotidprimere var som følger: DK 171871 B1 42 d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT) og d(CCAGCAAGACGTAGCCCAGC) til frembringelse af et 1000 bp langt fragment fra pBR322.
D. Forsøget som er beskrevet i eksempel 9C blev gentaget 5 med undtagelse af, at de anvendte oligonukleotidprimere var som følger: d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT) og d(AATTAATACGACTCACTATAGGGAGATAGGCGTATCACGAGGCCCT) for således at frembringe et 1026 bp langt fragment, hvoraf 10 26 nukleotider (i den primer, der er angivet som nummer to) ikke er til stede i pBR322 og repræsenterer den ovenfor beskrevne T7-promotor. Promotoren er blevet indføjet naboliggende til et 1000 bp langt fragment fra pBR322.
Resultaterne indicerer, at en primer, som ikke er en 15 perfekt parring til templatesekvensen, som ikke desto mindre er i stand til at hybridisere tilstrækkeligt til at blive enzymatisk forlænget, producerer et langt produkt, som indeholder sekvensen af primeren snarere end den tilsvarende sekvens af den oprindelige template. Det lange produkt tjener 20 som template for den anden primer til introducering af en in vitro mutation. Denne mutation multipliceres i yderligere cyklusser med en uformindsket effektivitet, fordi ingen yderligere fejlparrede priminger kræves. I dette tilfælde blev en primer, som bærer en ikke-komplementær forlængelse på 25 dets 5'-ende anvendt til indføjelse af en ny sekvens i produktet, der er naboliggende til templatesekvensen, der kopieres.
Eksempel 10
Dette eksempel illustrerer anvendelsen af indskudte sæt 30 af primere for at nedsætte baggrunden i multiplikationen af enkeltkopigener.
Hel, human DNA, som er homozygotisk for vildtype /3-glo-binallelet, blev udsat for 20 multiplikationscyklusser på følgende måde: Ialt 10 μg DNA, 200 pmol af hver af primerne: 35 d(ACACAACTGTGTTCACTAGC) og d(CAACTTCATCCACGTTCACC) og 100 nmol af hver dNTP i 100 μΐ af 30 mM Tris-acetat pH 7,9, 60 mM natriumacetat, 10 mM dithiothreitol og 10 mM magnesiumacetat DK 171871 B1 43 blev opvarmet til 100°C i 1 minut, afkølet til 25°C i 1 minut og behandlet med 2 enheder Klenow-fragment i 2 minutter. Cyklussen med opvarmning, afkøling og tilsætning af Klenow-fragment blev gentaget 19 gange. En delprøve på 10 μΐ blev 5 fjernet fra reaktionsblandingen og udsat for yderligere 10 multiplikationscyklusser under anvendelse af hver af primerne : d(CAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTG) og d(CCCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCC), hvilket multiplicerer et 10 58 bp langt fragment indeholdt i det ovenfor fremstillede 100 bp lange fragment. Disse sidste 10 multiplikationscyklusser blev udført ved at fortynde 10 μΐ delprøven i 90 μΐ frisk Tris-acetatpuffer beskrevet ovenfor indeholdende 100 nmol af hver dNTP og 200 pmol af hver primer. Reaktionsbetingelserne 15 var som ovenfor anført. Efter 10 cyklusser blev en 10 μΐ delprøve (svarende til 100 ng af det oprindelige DNA) påsat en 6% NuSieve (FMC Corp.) agarosegel og blev visualiseret under anvendelse af ethidiumbromid.
Figur 10 illustrerer denne gel belyst med UV-lys og 20 fotograferet gennem et rødt filter, hvilket er kendt inden for fagområdet. Bane 1 er molekylvægtsmarkører. Bane 2 er en delprøve af den ovenfor beskrevne reaktions. Bane 3 er en delprøve af en reaktion identisk med den ovenfor beskrevne med undtagelse af, at det oprindelige vildtype-DNA blev 25 spaltet med Ddel forud for multiplikationen. Bane 4 er en delprøve af en reaktion identisk med den ovenfor beskrevne med undtagelse af, at human DNA homozygot for seglcellebeta-globinallelet blev behandlet med Ddel før multiplikationen (seglcelleallelet indeholder ikke et Ddel-restriktionssted i 30 det fragment, som bliver multipliceret her). Bane 5 er en delprøve af en reaktion identisk med den ovenfor beskrevne med undtagelse af, at laksesperm-DNA blev anvendt i stedet for human DNA. Bane 6 er en delprøve af en reaktion identisk med den ovenfor beskrevne med undtagelse af, at delprøven 35 blev behandlet med Ddel efter multiplikation (Ddel skulle omdanne det 58 bp lange vildtypeprodukt til 27 og 31 bp lange fragmenter). Bane 7 er en delprøve af materialet fra bane 4 DK 171871 B1 44 behandlet med Ddel efter multiplikation (det 58 bp lange seglcelleprodukt indeholder intet Ddel-restriktionssted).
Påvisning af et 58 bp langt fragment, som er repræsentativt for et enkeltkopigen, fra 1 mikrogram human DNA under 5 anvendelse af udelukkende ethidiumbromidfarvning af en agaro-segel kræver en multiplikation på ca. 500.000 gange. Dette blev opnået ved at anvende de to indskudte sæt af oligonu-kleotidprimere beskrevet her. Det første sæt multiplicerer det 110 bp lange fragment og det i det indre indskudte sæt 10 multiplicerer et subfragment af dette produkt op til et niveau, som er hensigtsmæssigt til påvisning, som vist i figur 10. Denne fremgangsmåde med at anvende primere, som multiplicerer en lille sekvens indeholdt i den sekvens, som er multipliceret i den tidligere multiplikationsproces og som 15 er indeholdt i forlængelsesprodukter af de andre primere, gør det muligt at skelne vildtypen fra seglcelleallelet ved β-globinlocusset uden at ty til hverken radioisotopiske eller ikke-radioisotopiske probehybridiseringsmetoder, såsom beskrevet af Conner et al., PNAS (USA), 8£:278 (1983) og Leary 20 et al., PNAS (USA), £0:4045 (1983).
Eksempel 11
Det forventes, at den foreliggende fremgangsmåde er nyttig til i en DNA-prøve fra en patient at påvise en specifik sekvens associeret med en infektiøs sygdom, såsom f.eks.
25 Chlamydia under anvendelse af en biotinyleret hybridiserings-probe, som spænder over den ønskede multiplicerede sekvens og under anvendelse af den i beskrivelsen til USA 4.358.535, se ovenfor, beskrevne fremgangsmåde. Den biotinylerede hybrid!-seringsprobe kan fremstilles ved interkelering og bestråling 30 af et delvis dobbeltstrenget DNA med en 4'-methylensubstitu-eret 4,5'-8-trimethylpsoralen knyttet til biotin via en afstandsarm med formlen:
H
35 -Y(CH2)2-0-[(CH2)x0]y-CH2CH2-N- DK 171871 B1 45 hvor Y er 0, NH eller N-CHO, x er et tal på fra 1 til 4 og y er et tal på fra 2 til 4. Påvisning af biotinylgrupper på proben kan opnås ved at anvende et streptavidin - sur phosphatase - kompleks, som kan opnås kommercielt fra Enzo Bio-5 chem Inc., under anvendelse af de påvisningsmetoder, som foreslås af leverandøren i dennes brochure. Den hybridiserede prøve ses som en plet af udfældet farve på grund af bindingen af påvisningskomplekset og den efterfølgende reaktion katalyseret af sur phosphatase, hvilket frembringer en udfældelig 10 farve.
Bkgempei 12 I dette eksempel anvendes stort set den i eksempel 7 beskrevne fremgangsmåde til at multiplicere et 119 basepar langt fragment på det humane β-hæmoglobingen under anvendelse 15 af primerne: 5'-CTTCTGcagCAACTGTGTTCACTAGC- 3' (GH18) 5'-CACaAgCTTCATCCACGTTCACC-3' (GH19) hvor små bogstaver betegner fejlparringer i forhold til vildtypesekvensen for at frembringe restriktionsenzymsteder.
20 Det fulde skema vises i tabel I. Tabel I illustrerer et diagram af primerne GH18 og GH19, som anvendes til kloning og sekventering af et 119-basepar langt fragment af det humane Ø-globingen, og som er udformet til at indeholde indre restriktionssteder. Startcodonnet ATG er understreget. GH18 er 25 et 26 baser langt oligonukleotid, som er komplementær med den negative streng, og som indeholder et indre Pstl-sted. GH19 er et 23 base langt oligonukleotid, som er komplementært til plusstrengen, og som indeholder en indre HindilI-genkendelsessekvens. Pile angiver forlængelsesretningen for DNA-poly-30 merase I. De indrammede sekvenser angiver restriktionsenzymets genkendelsessekvenser på hver primer. Disse primere blev udvalgt ved først at screene områderne på genet for homologi til PstI og Hindlll restriktionssteder i bakteriofag M13. Primerne blev derefter fremstillet som beskrevet i 35 tidligere eksempler.
"+ "i" 46 DK 171871 B1 you 5 O 6 jg o y σι ^ 3 u o u e i & you * g g C 3 u y o y 6 o 6
I i I
6 o 6
UOU
3 li o u
II
v u o
U O
u o 0 u
H S
o u u o u o B 2 u o
0 S
1 B
o u H S u . Q u n I li i Η H U Q Q.
0) H w o y o oj u al 3 P y. Q) o y cg
Η 3 *rl »H
U O r-i H
rfj H 0) B* u o >-· a>
O U iJ M
Bh 3 μ c
U C -H
y Φ rH
H ft > 3 H 0)
U O 00 U
U O H -n ft H ko u o λ o si
»s H
O U tn 3 E-ι h : s U O O ro es g y Q y u S E 6 3
UOU H U
O U O Η p
3 H ft O H
H 3 Η P O
u p y O U
6 l ti es g g g « g p Ni p Ni Π pi O U P OO 3 K <t H 2 i; h Do 0 p U O K Cn
p 3 H O m H
§ S g u E
3 H 3 O cn
cc S σ> u “S
y o rt ρ 3 Η υ h u
S g B u S
UOU
e s e UOU m in DK 171871 B1 47
Multiplikation og kloning
Efter 20 multiplikationscyklusser med 1 mikrogram human genomisk DNA isoleret fra cellelinien Molt 4 som beskrevet i eksempel 2 blev 1/14 af reaktionsproduktet hybridiseret til 5 den mærkede /3-globin specifikke, oligonukleotid probe, RS06, med sekvensen 5'-CTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGG-3' under anvendelse af de ovenfor beskrevne metoder til oligomer restriktion. Efter opløsningshybridisering blev reaktionsblandingen behandlet med Ddel under restriktionsfordøjeises-10 betingelser, som beskrevet ovenfor, til frembringelse af et 8-basepar langt oligonukleotid. Mængden af dette 8-basepar lange produkt er proportionalt med mængden af frembragt multipliceret produkt. Fordøjelsesprodukterne blev separeret på en 30% polyacrylamidgel og visualiseret ved autoradiogra-15 fi.
Analyse af autoradiogrammet afslørede, at multiplikationen var sammenlignelig i effektivitet med multiplikationen af primeren PC03 (5'-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3') ogPC04 (5'-CCACTTGCACCTACTTCAAC-3'), som er komplementære med den nega-20 tive henholdsvis den positive streng i vildtype j8-globin.
Det multiplicerede produkt blev ethanolpræcipiteret for at afsalte og koncentrere prøven, blev genopløst i en restriktionspuffer af 10 mM Tris pH 8, 10 mM MgC^, 1 mM DTT, 100 mM NaCl og blev samtidig fordøjet med PstI og Hindlll.
25 Efter fordøjelsen blev prøven afsaltet med en Centricon 10 koncentrator og ligeret natten over ved 12°C ved 0,3 mikrogram af den PstI/ Hindlll-fordø-iede vektor M13mpl0w, som er offentlig tilgængelig fra Boehringer-Mannheim.
Hele ligeringsblandingen blev transformeret i E.coli 30 stamme JM103, som er offentlig tilgængelige fra BRL i Bethes-da, MD. Den fremgangsmåde, som blev fulgt til fremstilling af den transformerede stamme, er beskrevet i Messing, J. (1981) Third Cleveland Symposium on Macro-molecules: Recombinant DNA. red. A.Walton, Elsevier, Amsterdam, 143-153.
35 Transformationsblandingen blev udpladet på x-gal medie til screening ved hjælp af plaquehybridisering med nylon-filtere. Filtrene blev proberet med en j8-globinspecifik oligonukleotidprobe RS24 med sekvensen 5'- DK 171871 B1 48 CCCACAGGGCAGTAACGGGAGACTTCTCCTCAGGAGTCAG- 3 ' for at bestemme antallet af jff-globinindføjelser. Filtrene blev derefter reproberet med primeren PC04 for at bestemme det totale antal af indføjelser.
5 Udpladnincr og screening
Tabel II opsummerer udpladnings- og plaquehybridiserings-resultater. Filtrene blev proberet med primeren PC04 for at bestemme procent indføjelse resulterende fra multiplikationen og kloningen; 1206 klare plaque (90% af det totale antal 10 klare plaque) hybridiserede med primeren. 15 plaque hybridi-serede med den /J-globinspecifikke probe RS24. Procentdelen af jS-globinpositive plaques blandt de multiplicerede primerpositive plaques er ca. 1%.
Tabel II
15 Blå Ingen Ø-Globin-
Plade nr. plagues indføjelser* Indføjelser** indføjelser 1 28 25 246 1 2 29 18 222 2 3 11 26 180 0 20 4 24 20 192 5 5 22 27 185 5 6 39 21 181 3
Total 158 132 1206 15 % plaque indeholdende multiplicerede sekvenser, som inde-25 holder /3-globinindføjelse = 15/1206 x 100 = 1,24%.
% total plaque, som indeholder /J-globinindføjelse = 15/1496 x 100 - ca. 1%.
% total plaque, som indeholder multiplicerede sekvenser = 1206/1496 x 100 = ca. 0,8%.
30 * Klare plaque, som ikke hybridiserer med primer PC04 ** Klare plaque, som hybridiserer med primer PC04.
Restriktionsenzymanalyse og Southern Blot Analyse DNA fra fag-DNA minipræparation af 3 j8-globinpositive og 2 /3-globinnegative (men PC04 primerpositive) plaques blev 35 analyseret ved restriktionsenzymanalyse. Mstll-fordøjelse af DNA fra M13-kloner indeholdende det multiplicerede /3-globin- DK 171871 B1 49 fragment skulle frembringe et karakteristisk 283 bp langt fragment. Efter MstII-fordøjelse producerede de tre Ø-globin-positive kloner alle det forudsagte 283 bp lange fragment, medens de to kloner, som kun var positive med primeren, 5 producerede større fragmenter.
Gelen fra denne analyse blev overført til et MSI-nylon-filter og hybridiseret med en radioaktiv mærket, nick-trans-lateret |3-globinprobe fremstillet ved nicktranslationsstan-dardmetoder, som beskrevet af Rigby et al., J.Mol.Biol.
10 (1977), 113:237-51. De eneste bånd, som hybridiserede til β- globinproben, var de tre j8-globinpositive kloner. De to andre kloner havde indføjelser, som ikke hybridiserede til j8-glo-binproben.
Sekvensanalyse 15 10 j8-globinpositive kloner, som ved restriktionsenzymana lyse blev vist at indeholde Ø-globinindf øj elsen, blev sekven-teret under anvendelse af M13-dideoxysekventeringsmetoden. Ud af de 10 kloner var 9 identiske med j8-globinvildtypesekven-sen. Den anden klon var identisk med μ-globingenet, som er 20 blevet vist at være multipliceret alene i en lille udstrækning af /3-globinprimerne.
Som konklusion var de modificerede linkerprimere næsten lige så effektive som de ikke-modificerede primere til at multiplicere jS-globinsekvensen. Primerne var i stand til at 25 lette indføjelsen af multipliceret DNA i kloningsvektorer. På grund af multipliceringen af andre segmenter af genomet indeholdt kun 1% af klonerne hæmoglobinsekvenser.
9 ud af de 10 kloner blev fundet at være identiske med den publicerede jS-globinsekvens, hvilket viser, at metoden 30 multiplicerer genomisk DNA med stor nøjagtighed. En klon blev fundet at være identisk med den publicerede μ-globinsekvens, hvilket bekræfter, at primerne er specifikke for /3-globinge-net på trods af, at de har en signifikant sekvenshomologi med 5-globin.
35 Når kloningen blev udført med et 267 bp langt fragment af β-giobin-genet, var kloningen kun effektiv, når dimethylsulf- DK 171871 B1 50 oxid var tilstede (10 volumen% ved 37°C) i multiplikations-proceduren.
Restriktionsstedmodificerede primere blev også anvendt til at multiplicere og klone og delvis sekventere det humane 5 N-ras oncogen og til at klone de 240 bp lange segmenter af HLA DQ-α og DQ-β generne. Alle disse multiplikationer blev udført i nærværelse af 10 volumenprocent dimethylsulfoxid ved 37°C. Primerne til multiplikation af HLA DQ-α og DQ-/S generne var meget mere specifikke for deres beregnede mål end /?-globin-10 og DR-β-primerne, hvilket i stedet for at give adskilte bånd på en ethidiumbromidfarvet agarosegel blot gav et smear. Ydermere frembragte HLA DQ-α primerne op til 20% kloner med multiplicerede indføjelser, som indeholdt det ønskede HLA målfragment, hvorimod 1% af β-giobinklonerne indeholdt målse-15 kvensen. HLA DQ-α- og DQ-j8-genkloningen er kun effektiv, når DMSO var til stede, og temperaturen var hævet.
Eksempel 13
Dette eksempel illustrerer anvendelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen til at fremstille TNF-genet med 494 base-20 par startende fra 2 oligonukleotider på hver 74 basepar.
Primere
De anvendte primere blev fremstillet ved den i eksempel 2 beskrevne fremgangsmåde og er identificeret neden for som hver værende 74 merer.
DK 171871 B1 51 (TN10) 5'-CCTCGTCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCGACTATGTGCTCCTCA-CCCACACCGTCAGC€-3' (TN11) 5'-GGCAGGGGCTCTTGACGGCAGAGAGGAGGTTGACCTTCTCCTGGTAGGAGATGGCGAAG-CGGCTGACGGTGTGG-3' (LL09) 5* -CCTGGCCAATGGCATGGATCTGAAAGATAACCAGCTGGTGGTGCCAGCAGATGGCCTGT-ACCTCGTCTACTCCC-3' (LL12) 5'-CTCCCTGATAGATGGGCTCATACCAGGGCTTGAGCTCAGCCCCCTCTGGGGTGTCCTTC-GGGCAGGGGCTCTTG-3' (TN08) 5' -TGTAGCAAACCATCAAGTTGAGGAGCAGCTCGAGTGGCTGAGCCAGCGGGCCAATGCCC-TCCTGGCCAATGGCA-3' (TN13) 5' -GATACTTGGGCAGATTGACCTCAGCGCTGAGTTGGTCACCCTTCTCCAGCTGGAAGACC-CCTCCCTGATAGATG-3' (LL07) 5'-CCTTAAGCTTATGCTCAGATCATCTTCTCAAAACTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATG-TTGTAGCAAACCATC-3' (TN14) 5' -GCTCGGATCCTTACAGGGCAATGACTCCAAAGTAGACCTGCCCAGACTCGGCAAAGTCG-AGATACTTGGGCAGA-3’
Samlet procedure I. 10 cyklusser af den neden for anførte protokol blev udført under anvendelse af primerne TN10 og TN11, som vekselvirker som vist på diagrammet nedenfor, trin (a).
5 II. Et total på 2 μΐ af reaktionsblandingen fra afsnit I
ovenfor blev tilsat til primerne LL09 og LL12. Den nedenfor beskrevne protokol blev udført i 15 cyklusser, således at primerne vekselvirkede med produktet fra afsnit I som vist i diagrammet nedenfor, trin (b).
10 III. Ialt 2 mikroliter af reaktionsblandingen fra afsnit II ovenfor blev tilsat til primerne TN08 og TN13. Den nedenfor beskrevne protokol blev udført i 15 cyklusser, således at primerne vekselvirkede med produktet fra afsnit II, som vist i diagrammet nedenfor, trin (c).
15 IV. Ialt 2 mikroliter af reaktionsblandingen fra afsnit III ovenfor blev tilsat til primerne LL07 og LL14. Den nedenfor beskrevne protokol blev udført i 15 cyklusser, således at DK 171871 B1 52 primerne vekselvirkede med produktet fra afsnit III som vist i diagrammet nedenfor, trin (d).
Protokol
Hver reaktion indeholdt 100 μΐ af:
5 2 iriM af hver af dATP, dCTP, dGTP og TTP
3 μΜ af hver af primerne anvendt på dette trin 1 x polymerasepuffer (30 mM Tris-acetat, 60 mM natriumacetat, 10 mM Mg-acetat, 2,5 mM dithiothreitol).
Hver cyklus bestod af: 10 1) 1 minut i kogende vand.
2) 1 minut afkøling ved stuetemperatur 3) tilsætning af 1 μΐ (5 enheder) af Klenow-fragmentet af DNA-polymerase 4) mulighed for at polymeriseringsreaktionen forløb i 2 15 minutter.
For næste cyklus start igen ved trin l.
Diagram a) 5' TN10 -> <- 5' TN11 20 * -> xxxxxxx produkt fra afsnit 1 xxxxxxxxxxxx <- b) 5' LL09 -> xxxxxxxxx<- 5' TN11 25 + 5' TN10 ->xxxxxxxx <- 5' LL12 i 5' LL09 ->xxxxxxxxxxxxxxxxxx 30 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx<- 5' TN11 intermediær tilstand + 5' TN10 ->xxxxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxxx<- 5' LL12 i kun sekvensen mellem 5' af LL09 35 og 5' af LL12 vil være fuld længde. Strengene, som indeholder TN10 og TN11, har ikke voksende 5'-ender. På denne måde...
DK 171871 B1 53 5' LL09 ->xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx<- 5' LL12
Dette er produktet fra afsnit II.
c) 5' TN08 -> 5 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx<- 5' LL12 + 5' LL09 xxxxxxxxxxxxxxxx _. _„ <- 5' TN 13 4 samme intermediære skema som (b) 10 5' TN08 ->xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx<- 5' TN13
Dette er produktet fra afsnit III.
d) 5' LL07 -> χχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχ<- 5' TN13 15 + 5' TN08 ->xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx <- 5' TN14 * samme intermediære skema som (b) og (c) 20 5' LL07 ->xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx<- 5' TN14 (TNF-genet)
Deponeringer af materialer
Cellelinien SC-1 (CTCC nr. 0082) blev deponeret 19. marts 25 1985 hos American Type Culture Collection (ATCC) 12301 Park- lawn Drive, Rockville, Maryland 20852 USA med ATCC deponeringsnummer CRL nr. 8756. Deponeringen af SC-1 var underlagt en kontrakt mellem ATCC og assignatar for den foreliggende ansøgning, Cetus corporation. Kontrakten med ATCC giver 30 offentligheden en permanent mulighed for, at afkom af denne cellelinie er tilgængelig ved udstedelse af det US patent, som beskriver og identificerer deponeringen, eller ved offentliggørelse eller fremlæggelse af en hvilken som helst US eller fremmed patentansøgning, hvad der nu kommer først, og 35 for at afkom af denne cellelinie er tilgængelig for en person, der af US Commissioner of Patents and Trademarks er udpeget til at være berettiget til dette ifølge 35 CFR §122 og Commissioners regler i medfør heraf (inklusiv 37 CFR §1,14 med speciel henvisning til 886 OG 638). Assignatar for den 40 foreliggende ansøgning har accepteret, at hvis cellelinien,

Claims (6)

1. Fremgangsmåde til kloning i en vektor af i det mindste én specifik nukleinsyresekvens indeholdt i en nukleinsyre eller i en blanding af nukleinsyrer, kendetegnet ved, 10 (a) at nukleinsyren (nukleinsyrerne) behandles med en oligo- nukleotidprimer for hver streng af hver sekvens, der skal klones, og med andre nødvendige komponenter under sådanne betingelser, at der for hver streng af hver primer syntetiseres et forlængelsesprodukt, som er 15 komplementært til hver streng, ved hvilken fremgangsmåde primeren eller primerne udvælges således, at de i det væsentlige er komplementære til hver streng af hver specifik sekvens og afgrænser enderne af den nukleinsyresekvens, der skal klones, således at det forlæng-20 elsesprodukt, der syntetiseres fra én primer, når det er separeret fra dets komplement, kan tjene som en template for syntese af forlængelsesproduktet af den anden primer, og hvor primeren eller primerne hver indeholder informationen for et restriktionssted i 5'-enden, som er 25 identisk med eller forskellig fra restriktionsstedet (-stederne) på den anden primer (på de andre primere), (b) at primerforlængelsesprodukterne adskilles fra tem- platerne, på hvilke de er syntetiseret, til frembringelse af enkeltstrengede molekyler, 30 (c) at de enkeltstrengede molekyler, der er frembragt i trin (b) behandles som i trin (a) med oligonukleotidprimere og andre nødvendige komponenter, således at der syntetiseres et primerforlængelsesprodukt under anvendelse af DK 171871 B1 55 hver af enkeltstrengene, der er frembragt i trin (b), som en template, ved hvilken fremgangsmåde trinnene (a) og (c) afhængig af den bestemte sekvens, der skal multipliceres, udføres i nærværelse af fra 0 og op til en 5 effektiv mængde af dimethylsulfoxid eller ved en tem peratur på op til ca. 45°C, (d) at der til produktet fra trin (c) tilsættes et restriktionsenzym for hvert af restriktionsstedeme til opnåelse af spaltede produkter i en restriktionsfordøjel- 10 se, og (e) at det spaltede produkt (de spaltede produkter) ligeres ind i én eller flere kloningsvektorer.
2. Fremgangsmåde til syntetisering af et nukleinsyrefragment ud fra et eksisterende nukleinsyrefragment med færre nukleo-15 tider end det fragment, som bliver syntetiseret, og 2 oligo-nukleotidprimere, hvor det nukleinsyrefragment, der bliver syntetiseret, indeholder et venstresegment, et kemesegment og et højresegment, og hvor kernesegmentet i det mindste i alt væsentlig repræsenterer nukleinsyresekvensen af det 20 eksisterende nukleinsyrefragment, og højre- og venstresegmen-terne repræsenterer nukleinsyresekvensen, der er til stede i 5'-enderne af de to primere, hvis 3'-ender er komplementære eller i alt væsentligt komplementære til 3'-enderne i de enkeltstrenge, der produceres ved at separere strengene af 25 det eksisterende nukleinsyrefragment, kendetegnet ved, (a) at strengene fra det eksisterende fragment behandles med to oligonukleotidprimere og andre nødvendige komponenter under sådanne betingelser, at der af hver primer synte-30 tiseres et forlængelsesprodukt, som er komplementært til hver nukleinsyrestreng, ved hvilken fremgangsmåde primerne udvælges således, at de i alt væsentligt er komplementære til 3'-enden af hver streng af det eksisterende fragment, således at det forlængelsesprodukt, DK 171871 B1 56 som syntetiseres ud fra én primer, når det er separeret fra dets komplement, kan tjene som en template for syntesen af forlaengelsesproduktet af den anden primer, og hvorved hver primer i 5'-enden indeholder en sekvens 5 af nukleotider, som ikke er komplementære til det ek sisterende fragment, og som svarer til de to ender af det nukleinsyrefragment, der bliver syntetiseret, (b) at primerforlængelsesprodukterne adskilles fra de tem-plater, på hvilke de blev syntetiseret, til frembringel- 10 se af enkeltstrengede molekyler, (c) at de enkeltstrengede molekyler, der er frembragt i trin (b), behandles med primerne og de nødvendige komponenter fra trin (a) under sådanne betingelser, at der syntetiseres et primerforlængelsesprodukt under anvendelse af 15 hver enkeltstreng, der er frembragt i trin (b), som en template, således at der produceres to intermediære dobbeltstrengede nukleinsyremolekyler, i hvilke der er blevet inkorporeret den nukleotidsekvens, som er til stede i 5'-enden af én af oligonukleotidprimerne, og to 20 fuldlængde dobbeltstrengede nukleinsyremolekyler, i hvilke der er inkorporeret den nukleinsyresekvens, der er til stede i 5'-enderne af begge oligonukleotidprimer-ne, og (d) at trinnene (b) og (c) gentages et tilstrækkeligt antal 25 gange til at producere dobbeltstrengede molekyler i fuld længde i en effektiv mængde.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved at følgende yderligere trin gennemføres: (e) trinnene (a) - (d) gentages under anvendelse af pro- 30 duktet fra trin (d) som kernefragment og to yderligere oligonukleotidprimere, som er komplementære til eller i alt væsentligt komplementære til 3'-enderne af de en DK 171871 B1 57 keltstrenge, der frembringes ved at separere strengene fra produktet i trin (d).
4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, 5 kendetegnet ved, at trin (b) udføres ved varmedenaturer ing.
5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at de andre nødvendige komponen-10 ter omfatter et induceringsmiddel for polymerisering samt de forskellige nukleotider.
5 PATENTKRAV
6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at induceringsmidlet for polymerisering er udvalgt blandt E. coli DNA-polymerase I, Kle-15 now-fragmentet fra E. coli DNA-polymerase I, T4 DNA-polymera-se, varmestabilt enzym eller revers transcriptase.
DK026595A 1985-03-28 1995-03-17 Fremgangsmåder til kloning af vektor med en specifik nukleinsyresekvens, der er indeholdt i en nukleinsyre, og til syntetisering af et nukleinsyrefragment ud fra et eksisterende nukleinsyrefragment DK171871B1 (da)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US71697585A 1985-03-28 1985-03-28
US71697585 1985-03-28
US79130885 1985-10-25
US06/791,308 US4683202A (en) 1985-03-28 1985-10-25 Process for amplifying nucleic acid sequences
US82814486 1986-02-07
US06/828,144 US4683195A (en) 1986-01-30 1986-02-07 Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DK26595A DK26595A (da) 1995-03-17
DK171871B1 true DK171871B1 (da) 1997-07-21

Family

ID=27418965

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK144986A DK171161B1 (da) 1985-03-28 1986-03-26 Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve
DK026595A DK171871B1 (da) 1985-03-28 1995-03-17 Fremgangsmåder til kloning af vektor med en specifik nukleinsyresekvens, der er indeholdt i en nukleinsyre, og til syntetisering af et nukleinsyrefragment ud fra et eksisterende nukleinsyrefragment
DK13296A DK175469B1 (da) 1985-03-28 1996-02-09 Fremgangsmåde til multiplikation og påvisning af nukleinsyresekvenser

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK144986A DK171161B1 (da) 1985-03-28 1986-03-26 Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK13296A DK175469B1 (da) 1985-03-28 1996-02-09 Fremgangsmåde til multiplikation og påvisning af nukleinsyresekvenser

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0200362B1 (da)
JP (1) JP2546576B2 (da)
AT (3) ATE84822T1 (da)
AU (1) AU591104B2 (da)
CA (2) CA1291429C (da)
DE (5) DE200362T1 (da)
DK (3) DK171161B1 (da)
ES (3) ES8706823A1 (da)
HK (1) HK84994A (da)
IE (1) IE61304B1 (da)
IL (1) IL78284A (da)
SG (1) SG111293G (da)

Families Citing this family (157)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4808520A (en) * 1985-03-15 1989-02-28 Molecular Diagnostics, Inc. Labelling of oligonucleotides
CA1278755C (en) * 1985-03-15 1991-01-08 William J. Knowles Labelling of oligonucleotides
AU606043B2 (en) * 1985-03-28 1991-01-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Detection of viruses by amplification and hybridization
US4965188A (en) * 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4746604A (en) * 1985-05-24 1988-05-24 Enzo Biochem, Inc. Specific binding assays utilizing a viable cell as a label
CA1339653C (en) * 1986-02-25 1998-02-03 Larry J. Johnson Appartus and method for performing automated amplification of nucleic acid sequences and assays using heating and cooling steps
US5604099A (en) * 1986-03-13 1997-02-18 Hoffmann-La Roche Inc. Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
CA1284931C (en) * 1986-03-13 1991-06-18 Henry A. Erlich Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
US5356774A (en) * 1986-04-16 1994-10-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Replicative RNA-based amplification/detection systems
AU632857C (en) * 1986-08-22 2003-10-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Purified thermostable enzyme
CA1338457C (en) * 1986-08-22 1996-07-16 Henry A. Erlich Purified thermostable enzyme
US5714380A (en) 1986-10-23 1998-02-03 Amoco Corporation Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification
US5079351A (en) * 1986-11-26 1992-01-07 Cetus Corporation Oligonucleotides and kits for detection of htlvi and htlvii viruses by hybridization
EP0272098A3 (en) * 1986-12-15 1990-06-06 City Of Hope National Medical Center Method for amplification and detection of rna sequences
ATE121794T1 (de) * 1987-02-26 1995-05-15 Univ Sydney Verfahren zum nachweis des karzinogenen menschlichen papillomavirus.
AU622104B2 (en) * 1987-03-11 1992-04-02 Sangtec Molecular Diagnostics Ab Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore
IL86724A (en) * 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
CA1317535C (en) * 1987-06-30 1993-05-11 Nanibhushan Dattagupta Assay of sequences using amplified genes
US5273879A (en) * 1987-07-23 1993-12-28 Syntex (U.S.A.) Inc. Amplification method for polynucleotide assays
US4994368A (en) 1987-07-23 1991-02-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Amplification method for polynucleotide assays
FR2629458B2 (fr) * 1987-07-31 1991-08-09 Ire Celltarg Sa Nouvelles sondes d'acides nucleiques specifiques de differents types de virus de papillome humain
IE72468B1 (en) * 1987-07-31 1997-04-09 Univ Leland Stanford Junior Selective amplification of target polynucleotide sequences
AU618965B2 (en) * 1987-07-31 1992-01-16 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Selective amplification of target polynucleotide sequences
US6090591A (en) * 1987-07-31 2000-07-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Selective amplification of target polynucleotide sequences
DE3726934A1 (de) * 1987-08-13 1989-02-23 Merck Patent Gmbh Verfahren zum nachweis von nukleinsaeure-sequenzen
US5268267A (en) * 1987-08-21 1993-12-07 The General Hospital Corporation Method for diagnosing small cell carcinoma
CA1323553C (en) * 1987-11-03 1993-10-26 Timothy George Helentjaris Method and device for improved restriction fragment length polymorphism analysis
AU2735988A (en) * 1987-12-21 1989-07-13 Amoco Corporation Target and background capture methods with amplification for affinity assays
FI79342C (fi) * 1987-12-23 1989-12-11 Orion Yhtymae Oy Apparat, del av en apparat och foerfarande foer maongfaldigande av nukleinsyror.
CA1325761C (en) * 1987-12-25 1994-01-04 Takanori Oka Method of detecting an intended nucleic acid in a sample
CA1340807C (en) * 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
WO1989009281A1 (en) * 1988-03-25 1989-10-05 Akzo N.V. Method for amplifying and detecting nucleic acid in a test liquid
US8148065B1 (en) * 1988-04-06 2012-04-03 City Of Hope Ligation amplification of nucleic acid sequences
IT1224253B (it) * 1988-04-08 1990-09-26 Sclavo Spa Oligonucleotidi sintetici utili per la determinazione di chlamydia trachomatis in un campione biologico
US5130238A (en) * 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
GB8818020D0 (en) * 1988-07-28 1988-09-01 Ici Plc Method for amplification of nucleotide sequences
AU629845B2 (en) * 1988-08-30 1992-10-15 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
US5091310A (en) * 1988-09-23 1992-02-25 Cetus Corporation Structure-independent dna amplification by the polymerase chain reaction
FR2637612B1 (fr) * 1988-10-06 1993-09-10 Pasteur Institut Sequences de nucleotides codant pour une proteine a activite ureasique
US5766847A (en) * 1988-10-11 1998-06-16 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Process for analyzing length polymorphisms in DNA regions
DE3834636A1 (de) 1988-10-11 1990-04-19 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur analyse von laengenpolymorphismen in dna-bereichen
DE3930312A1 (de) * 1988-10-24 1990-04-26 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur direkten sequenzierung von nukleinsaeureketten
US5077192A (en) * 1988-10-25 1991-12-31 The General Hospital Corporation Method of detecting antigenic, nucleic acid-containing macromolecular entities
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
DE68913555T2 (de) * 1988-11-21 1994-07-07 Dynal As Sonden aus nukleinsäuren.
BR8907830A (pt) 1988-12-16 1991-10-22 Siska Diagnostics Inc Processo para preparar uma dna de filamento duplo que codifica uma sequencia que corresponde a uma sequencia objetivada de acido nucleico e processo util para deteccao de pelo menos uma sequencia de acido nucleico objetivada especifica
GB8902689D0 (en) * 1989-02-07 1989-03-30 Ici Plc Assay method
WO1990009456A1 (de) * 1989-02-16 1990-08-23 Viktor Balazs Malignitätstest (krebs-test) mit verwendung von der polymerasekettenreaktion
EP0461155B1 (en) * 1989-03-03 1994-07-27 Genentech, Inc. Improved methods for in vitro dna amplification and genomic cloning and mapping
FR2645878B1 (fr) * 1989-04-17 1994-02-25 Institut Nal Sante Recherc Medic Sequences nucleotidiques d'actinomycetales, applications a la synthese ou a la detection d'acides nucleiques, produits d'expression de ces sequences et application en tant que compositions immunogenes
US6291159B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for producing polymers having a preselected activity
US6680192B1 (en) 1989-05-16 2004-01-20 Scripps Research Institute Method for producing polymers having a preselected activity
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US6291160B1 (en) * 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for producing polymers having a preselected activity
US6969586B1 (en) 1989-05-16 2005-11-29 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US6291161B1 (en) * 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertiore
US5504007A (en) * 1989-05-19 1996-04-02 Becton, Dickinson And Company Rapid thermal cycle apparatus
US5035996A (en) * 1989-06-01 1991-07-30 Life Technologies, Inc. Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
US5683896A (en) 1989-06-01 1997-11-04 Life Technologies, Inc. Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
DK1642987T3 (da) 1989-06-02 2008-12-01 Pasteur Institut Nucleotidsekvenser dannet ud fra genomerne af retrovirusserne HIV-1, HIV-2 og SIV samt deres anvendelse til opformering af disse virale genomer samt til en vitro-diagnose af infektioner, der stammer fra disse virusser
EP0731175A3 (en) * 1989-07-11 2004-05-26 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotide probes for HIV nucleic acid
FR2651007B1 (fr) * 1989-08-18 1992-09-04 Pasteur Institut Fragments d'acides nucleiques et reactifs de diagnostic derives du genome de hhv6/sie et procede de diagnostic des infections a hhv6
US5213961A (en) * 1989-08-31 1993-05-25 Brigham And Women's Hospital Accurate quantitation of RNA and DNA by competetitive polymerase chain reaction
GB8920097D0 (en) * 1989-09-06 1989-10-18 Ici Plc Amplification processes
US7049102B1 (en) 1989-09-22 2006-05-23 Board Of Trustees Of Leland Stanford University Multi-gene expression profile
CA2024978A1 (en) * 1989-09-22 1991-03-23 Annie L. Wu Nucleic acid detection method using unequal primer concentrations in polymerase chain reaction
GB8926269D0 (en) * 1989-11-21 1990-01-10 Dynal As Plasmid
WO1991008304A1 (en) * 1989-11-24 1991-06-13 Isis Innovation Limited Prenatal genetic determination
US5436163A (en) * 1989-12-01 1995-07-25 The Blood Center Of Southeastern Wisconsin Polymorphism of human platelet membrane glycoprotein IIb and diagnostic applications thereof
DE4001154A1 (de) * 1990-01-17 1991-07-18 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung von modifizierten nukleinsaeuren
JP3096722B2 (ja) * 1990-01-17 2000-10-10 日本ケミカルリサーチ株式会社 ポリメラーゼ・チェーン・リアクション用プライマーの作製法およびそれを用いるｄｎａの増幅法
GB9002625D0 (en) * 1990-02-06 1990-04-04 Univ Singapore Human leukocyte antigen typing
WO1991015599A1 (en) * 1990-04-05 1991-10-17 Amrad Corporation Limited A method for detecting dna
CA2062943A1 (en) * 1990-04-30 1991-10-31 Lori Lan Cho Cheung Method of establishing identity
DE69121791T2 (de) 1990-06-08 1997-01-23 Behringwerke Ag Verfahren zur quantitativen Bestimmung von DNS-Sequenzen
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
DE69128520T2 (de) * 1990-10-31 1998-07-09 Tosoh Corp Verfahren zum Nachweis oder Quantifizierung von Zielnukleinsäuren
WO1992007957A1 (en) * 1990-10-31 1992-05-14 Cimino George D Methods and compositions for minimizing inhibition of nucleic acid amplification
KR100236506B1 (ko) * 1990-11-29 2000-01-15 퍼킨-엘머시터스인스트루먼츠 폴리머라제 연쇄 반응 수행 장치
ES2108748T3 (es) 1990-12-31 1998-01-01 Promega Corp Amplificacion de acidos nucleicos con actividad de rna polimerasa dependiente de dna, de rna replicasas.
AU8997991A (en) * 1991-01-31 1992-08-06 Becton Dickinson & Company Exonuclease mediated strand displacement amplification
US5994056A (en) 1991-05-02 1999-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection
ES2116342T3 (es) * 1991-08-28 1998-07-16 Boehringer Mannheim Gmbh Cebador para sintesis enzimaticas de acidos nucleicos dependientes de la matriz.
DE4129653A1 (de) * 1991-09-06 1993-03-11 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum nachweis aehnlicher nukleinsaeuren
DE4132133A1 (de) * 1991-09-26 1993-04-01 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur spezifischen herstellung von ribonukleinsaeuren
DE4213029A1 (de) * 1991-09-26 1993-04-01 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur spezifischen vervielfaeltigung von nukleins aeuresequenzen
ATE161586T1 (de) 1991-10-11 1998-01-15 Behringwerke Ag Verfahren zur herstellung eines polynukleotids zum gebrauch in ''single-primer'' amplifizierung und phosphorothioat-enthaltende oligonukleotide als primer in nukleinsäureamplifizierung
US5612199A (en) * 1991-10-11 1997-03-18 Behringwerke Ag Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification
US5270184A (en) * 1991-11-19 1993-12-14 Becton, Dickinson And Company Nucleic acid target generation
FI915731A0 (fi) * 1991-12-05 1991-12-05 Derek Henry Potter Foerfarande och anordning foer reglering av temperaturen i ett flertal prov.
US5567583A (en) * 1991-12-16 1996-10-22 Biotronics Corporation Methods for reducing non-specific priming in DNA detection
US6033854A (en) * 1991-12-16 2000-03-07 Biotronics Corporation Quantitative PCR using blocking oligonucleotides
US5348853A (en) * 1991-12-16 1994-09-20 Biotronics Corporation Method for reducing non-specific priming in DNA amplification
DE4212555A1 (de) * 1992-04-15 1993-10-21 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren
JP4137996B2 (ja) * 1992-05-06 2008-08-20 ジェン−プローブ・インコーポレイテッド 核酸配列増幅方法，組成物及びキット
DK0652973T3 (da) * 1992-07-31 1997-09-15 Behringwerke Ag Fremgangsmåde til indføring af definerede sekvenser ved 3-enden af polynukleotider
DE4236708A1 (de) * 1992-10-30 1994-05-05 Bayer Ag Spezifische Gensonden und Verfahren zur Diagnostik von Candida albicans
DE4302459A1 (de) * 1993-01-29 1994-08-04 Bayer Ag Sulfocumarinhaltige Nukleotide und deren Verwendung in Nachweisverfahren für Nukleinsäuren
US6294323B1 (en) 1993-04-14 2001-09-25 Behringwerke Ag Self initiating single primer amplification of nucleic acids
US5491086A (en) * 1993-05-14 1996-02-13 Hoffmann-La Roche Inc. Purified thermostable nucleic acid polymerase and DNA coding sequences from pyrodictium species
EP0771320A4 (en) 1993-07-29 1998-11-25 Univ California LOCK POLYNUCLEOTIDE THAT SUPPRESSES AND USES THE MHC-II EXPRESSION
WO1995025180A1 (en) * 1994-03-16 1995-09-21 Gen-Probe Incorporated Isothermal strand displacement nucleic acid amplification
DE4420732A1 (de) 1994-06-15 1995-12-21 Boehringer Mannheim Gmbh Vorrichtung zur Behandlung von Nukleinsäuren aus einer Probe
DE4421901A1 (de) * 1994-06-23 1996-01-04 Bayer Ag Ein DNA-Schnelltest zum Nachweis von chinolonresistenten Staphylococcus aureus Erregern in klinischem Probenmaterial
EP0752474A1 (en) 1995-07-07 1997-01-08 Boehringer Mannheim Gmbh Nucleic acid coding for CMP-N-acetyl-neuraminic acid hydroxylase and its use for the production of modified glycoproteins
EP0834571A1 (en) 1996-10-03 1998-04-08 Roche Diagnostics GmbH Thermostable nucleic acid polymerase from Thermococcus gorgonarius
KR100615407B1 (ko) 1997-08-08 2006-08-25 악조 노벨 엔.브이. Ｈｉｖ-1의 모든 아형의 증폭 및 검출시 프라이머 및프로브로서 사용할 수 있는 핵산 서열
JPH11146799A (ja) * 1997-09-10 1999-06-02 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 新規プライマー及びその利用
US6103468A (en) * 1997-10-07 2000-08-15 Labatt Brewing Company Limited Rapid two-stage polymerase chain reaction method for detection of lactic acid bacteria in beer
WO1999046598A1 (en) 1998-03-10 1999-09-16 The Regents Of The University Of California Methods and tools for identifying compounds which modulate atherosclerosis by impacting ldl-proteoglycan binding
CA2354544A1 (en) 1998-10-01 2000-04-13 Variagenics, Inc. Methods for treating or identifying a subject at risk for a neurological disease by determining the presence of a variant gpiiia and/or variant gpiib allele
DE19848665A1 (de) * 1998-10-22 2000-04-27 Bayer Ag Ein automatisierbarer Schnelltest zum direkten Nachweis der APC Resistenz Mutation mit spezifischen Primern und Probes
US20020146728A1 (en) 1998-12-03 2002-10-10 Tanja Ligensa IGF-1 receptor interacting proteins
EP1006184A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 F. Hoffmann-La Roche Ag IGF-1 receptor interacting proteins (IIPs) genes coding therefor and uses thereof
DE19916929A1 (de) 1999-04-15 2000-10-19 Bayer Ag Ein automatisierbarer Schnelltest zum Nachweis von Krebserkrankungen auf der Basis von Telomerase(hTC) mRNA mit spezifischen Primern und Sonden
US20020025519A1 (en) 1999-06-17 2002-02-28 David J. Wright Methods and oligonucleotides for detecting nucleic acid sequence variations
EP1099757B1 (en) 1999-11-11 2010-02-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for the determination of CTp11 and for determining whether a tumor sample has metatastic potential
AU2001260309A1 (en) 2000-05-19 2001-12-03 F.Hoffmann-La Roche Ag A process for determining the tumoricidal potential of a sample by the use of a nucleic acid which is downregulated in human tumor cells
JP3489053B2 (ja) 2000-08-28 2004-01-19 日本航空電子工業株式会社 ケーブルコネクタ
US6866999B2 (en) 2000-10-10 2005-03-15 Richard Glenn Wunderink Method for identifying increased risk of death from community acquired pneumonia
CN1306272C (zh) 2000-11-17 2007-03-21 罗切斯特大学 筛选编码抗原特异性免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段的方法
AU2003236461B2 (en) 2002-08-29 2009-05-28 Epigenomics Ag Improved method for bisulfite treatment
US20050026168A1 (en) 2002-12-13 2005-02-03 Genesis Group Inc. Method for the detection of risk factors associated with myocardial infarction
ES2294462T5 (es) 2003-01-29 2015-05-06 Epigenomics Ag Método mejorado para el tratamiento de bisulfito
CA2547743C (en) 2003-12-02 2011-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved method for bisulfite treatment
EP1632578A1 (en) 2004-09-03 2006-03-08 Roche Diagnostics GmbH DNA decontamination method
EP1666150B1 (en) 2004-11-20 2015-01-07 Roche Diagnostics GmbH Nucleic acid preparation
US20090130662A1 (en) 2005-03-14 2009-05-21 Link Genomics, Inc Method for Diagnosis of Prostate Cancer
AU2006246975B2 (en) 2005-05-17 2011-08-11 Ozgene Pty Ltd Sequential cloning system
EP1748081A1 (en) 2005-07-28 2007-01-31 Roche Diagnostics GmbH Analytical method and device
EP1760465B1 (en) 2005-09-06 2010-06-23 Roche Diagnostics GmbH Device with a compressible matrix having a homogeneous flow profile
EP1798542A1 (en) 2005-12-19 2007-06-20 Roche Diagnostics GmbH Analytical method and instrument
EP1798650A1 (en) 2005-12-19 2007-06-20 Roche Diagnostics GmbH Analytical method and instrument
US7981606B2 (en) 2005-12-21 2011-07-19 Roche Molecular Systems, Inc. Control for nucleic acid testing
EP3561071B1 (en) 2006-02-13 2020-12-16 Fluidigm Canada Inc. Gene expression assays conducted by elemental analysis
EP1962084A1 (en) 2007-02-21 2008-08-27 Roche Diagnostics GmbH Apparatus for emitting and detecting beams of light
WO2009123565A1 (en) 2008-03-31 2009-10-08 Agency For Science, Technology And Research Fluid processing and transfer using inter-connected multi-chamber device
WO2009072987A1 (en) 2007-12-06 2009-06-11 Agency For Science, Technology And Research Integrated apparatus for conducting and monitoring chemical reactions
EP2127751B1 (en) 2008-05-19 2012-05-16 Roche Diagnostics GmbH Improved cooler / heater arrangement with solid film lubricant
KR20110091671A (ko) 2008-11-11 2011-08-12 다니스코 유에스 인크. 세린 프로테아제 변이체를 포함하는 조성물 및 방법
BRPI0922083A2 (pt) 2008-11-11 2017-05-30 Danisco Us Inc proteases compreendendo uma ou mais mutações combináveis
US20110236900A1 (en) 2008-11-27 2011-09-29 Riken Novel muts protein and method for determing mutation using the same
CN102378813B (zh) 2009-04-01 2014-05-14 丹尼斯科美国公司 包含具有改变的性质的α-淀粉酶变体的组合物和方法
CN102762222B (zh) 2009-12-09 2015-11-25 丹尼斯科美国公司 包含蛋白酶变体的组合物和方法
PL2566960T3 (pl) 2010-05-06 2017-08-31 The Procter And Gamble Company Produkty konsumenckie z odmianami proteaz
CN103764823B (zh) 2011-05-05 2018-05-11 丹尼斯科美国公司 包含丝氨酸蛋白酶变体的组合物和方法
EP2771458B1 (en) 2011-10-28 2016-12-21 Danisco US Inc. Variant maltohexaose-forming alpha-amylase variants
CN104066838A (zh) 2011-12-22 2014-09-24 丹尼斯科美国公司 变体α-淀粉酶及其使用方法
US20150141316A1 (en) 2012-06-08 2015-05-21 Danisco Us Inc. Variant alpha amylases with enhanced activity on starch polymers
WO2014059360A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Danisco Us Inc. Compositions and methods comprising a lipolytic enzyme variant
MX365323B (es) 2013-03-15 2019-05-29 Theranos Ip Co Llc Amplificación de ácidos nucléicos.
EP2970961B1 (en) * 2013-03-15 2019-04-24 Theranos IP Company, LLC Nucleic acid amplification
AU2014317990A1 (en) 2013-09-06 2016-02-25 Theranos Ip Company, Llc Systems and methods for detecting infectious diseases
EP2889382A1 (en) 2013-12-30 2015-07-01 Centrum Badan DNA Sp. z o.o. Oligonucleotides, use thereof, methods and a kit for detection of DNA Borrelia burgdorferi, Bartonella henselae, Babesia divergens, Anaplasma phagocytophilum
JP6847934B2 (ja) * 2015-10-05 2021-03-24 ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒルＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ アッセイを多重化する為のデコード方法並びに関連する流体デバイス、キット、及び固体支持体
JP7181522B2 (ja) * 2018-09-18 2022-12-01 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 プライマーセット、及びそれを用いた標的ヌクレオチド配列の増幅方法
WO2021050342A1 (en) 2019-09-13 2021-03-18 Danisco Us Inc Thermostable glucose isomerase variants

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4351901A (en) * 1980-03-24 1982-09-28 Cetus Corporation Method for single nucleotide alteration
ZA811368B (en) * 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
EP0138242A1 (en) * 1983-09-07 1985-04-24 Duphar International Research B.V Method of preparing DNA complementary to the genome of coronaviruses
WO1985001746A1 (en) * 1983-10-11 1985-04-25 Beatrice Companies, Inc. The manufacture and expression of genes for thaumatin
US4711848A (en) * 1984-03-14 1987-12-08 Zymogenetics, Inc. Site specific mutagenesis in alpha-1-antitrypsin

Also Published As

Publication number Publication date
DE200362T1 (de) 1992-04-09
ES8706823A1 (es) 1987-06-16
DK175469B1 (da) 2004-11-01
DK144986D0 (da) 1986-03-26
IL78284A0 (en) 1986-07-31
AU5532386A (en) 1986-10-02
DE3687537T2 (de) 1993-05-13
DK26595A (da) 1995-03-17
ES8800357A1 (es) 1987-10-16
ES553468A0 (es) 1987-06-16
SG111293G (en) 1994-02-25
DK144986A (da) 1986-09-29
ATE84822T1 (de) 1993-02-15
ES557287A0 (es) 1987-10-16
IE860843L (en) 1986-09-28
JPH067166A (ja) 1994-01-18
JP2546576B2 (ja) 1996-10-23
DE3650762T2 (de) 2002-07-04
DE3650763D1 (de) 2001-10-31
DK171161B1 (da) 1996-07-08
AU591104B2 (en) 1989-11-30
EP0200362B1 (en) 1993-01-20
ES8800356A1 (es) 1987-10-16
DE502589T1 (de) 1993-09-23
DK13296A (da) 1996-02-09
CA1291429C (en) 1991-10-29
DE3687537D1 (de) 1993-03-04
IL78284A (en) 1991-09-16
CA1340121E (en) 1998-11-10
ATE206169T1 (de) 2001-10-15
ATE206168T1 (de) 2001-10-15
EP0200362A2 (en) 1986-11-05
DE3650762D1 (de) 2001-10-31
EP0200362A3 (en) 1987-02-25
ES557288A0 (es) 1987-10-16
HK84994A (en) 1994-08-26
IE61304B1 (en) 1994-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK171871B1 (da) Fremgangsmåder til kloning af vektor med en specifik nukleinsyresekvens, der er indeholdt i en nukleinsyre, og til syntetisering af et nukleinsyrefragment ud fra et eksisterende nukleinsyrefragment
DK171160B1 (da) Fremgangsmåde til multiplikation af en specifik nukleinsyresekvens
US4683195A (en) Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4800159A (en) Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US6040166A (en) Kits for amplifying and detecting nucleic acid sequences, including a probe
US5629178A (en) Method for enhancing amplification in the polymerase chain reaction employing peptide nucleic acid (PNA)
US4965188A (en) Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US6197563B1 (en) Kits for amplifying and detecting nucleic acid sequences
JP2726659B2 (ja) 核酸中に存在する特定のヌクレオチド配列の検出方法及びそのためのキット
DK175806B1 (da) Oprenset termostabilt enzym og fremgangsmåde til amplifikation, påvisning og/eller kloning af nukleinsyresekvensen under anvendelse af dette enzym
WO1996013611A9 (en) A method for enhancing amplification in the polymerase chain reaction employing peptide nucleic acid (pna)
JPH0467957B2 (da)
DK175778B1 (da) Kit til multiplicering og påvisning af nukleinsyresekvenser
DK175248B1 (da) Et förste og andet oligonukleotid og anvendelse deraf til eksponentiel multiplicering ved polymerase-kædereaktion af en specifik nukleinsyresekvens indeholdt i en enkelt- eller dobbeltstrenget nukleinsyre eller i en blanding af sådanne nukleinsyrer
IE83456B1 (en) Kit for use in amplifying and detecting nucleic acid sequences
IE83464B1 (en) Process for amplifying and detecting nucleic acid sequences
IE19930227A1 (en) Kit for use in amplifying and detecting nucleic acid sequences

Legal Events

Date Code Title Description
B1 Patent granted (law 1993)
PUP Patent expired