DK175806B1 - Oprenset termostabilt enzym og fremgangsmåde til amplifikation, påvisning og/eller kloning af nukleinsyresekvensen under anvendelse af dette enzym - Google Patents

Description

I DK 175806 B1

Beskrivelse

Den foreliggende opfindelse angår et oprenset, termostabilt enzym med DNA-polymeraseaktivitet og en molekylvægt på ca. 86.000-90.000 5 Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til ampli - fikation af eksisterende nukleinsyresekvenser, hvis de er til stede i en prøve, samt påvisning af dem, hvis de er til stede, under anvendelse af en probe. Nærmere bestemt angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af en hvilken som helst bestemt nukleinsyre-10 sekvens ud fra en given sekvens af DNA eller RNA i mængder, som er store sammentignet med den mængde, som i begyndelsen er til stede, således at påvisningen af sekvenserne gøres lettere, ved hvilken fremgangsmåde der anvendes et termostabilt enzym til at katalysere reaktionen. DNA'et eller RNA'et kan være enkelt- eller 15 dobbelstrenget og kan være en forholdsvis ren form eller en komponent af en blanding af nukleinsyrer. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udnytter en repetitiv reaktion til udførelse af amplifi-kationen af den ønskede nukleinsyresekvens.

Der er udført omfattende forskning for at isolere DNA-polyme- i 20 raser fra mesophile mikroorganismer, såsom E. coli. Se f.eks. Bess-man et al., J. Biol. Chem. (1957) 233:171-177 samt Buttin og

Kornberg, J. Biol. Chem. (1966) 241:5419-5427.

I modsætning hertil er der foretaget meget få undersøgelser af isoleringen og oprensningen af DNA-polymeraser fra termofile mikror 25 organismer, såsom Thermus aquaticus. Kaledin et al., Biokhymlya (1980) 45:644-651 omtaler en sekstrinsisolering og oprensningsprocedure for DNA-polymerase fra celler af T_^ aquaticus, stamme YT1.

Disse trin involverer isolering af råekstrakt, DEAE-cellulosekroma-tografi, fraktionering på hydroxyapatit, fraktionering på DEAE-cel-30 lulose og kromatografi på enkeltstrenget DNA-cellulose. Puljerne fra hvert trin blev ikke screenet for kontaminering med endo- og exo-nuklease(r). Molekylvægten for det oprensede enzym blev angivet som 62.000 dalton pr. monomerenhed.

Et andet oprensningsskema for en polymerase fra aquaticus 35 omtales af A. Chien et al., J. Bacteriol. (1976) 127:1550-1557. Ved denne fremgangsmåde blev råekstraktet påsat en DEAE-Sephadex-søjle. De dialyserede, sammenhældte fraktioner blev derefter udsat j for en behandling på en phosphorcellulosesøjle. De sammenhældte I DK 175806 B1 I fraktioner blev dialyseret, og der blev tilsat bovinserumalbumin (BSA) for at forhindre tab af polymeraseaktivitet. Den fremkomne I blanding blev påsat en DNA-cellulosesøjle. Det sammenhældte mate- riale fra søjlen blev dialyseret og analyseret ved gelfiltrering og I ^ fandtes at have en molekylvægt på ca. 63.000 dalton og ca. 68.000 I dalton ved sucrosegradientcentrifugering.

Anvendelsen af et termostabilt enzym til amplifikation af eksi- sterende nukleinsyresekvenser i mængder, som er store sammenlignet jq med den mængde, som i begyndelsen er til stede, er blevet foreslået . i europæisk patentpublikation nr. 200.362, publiceret 10. december 1986. Primere, nukleotidtriphosphater og en polymerase anvendes ved denne fremgangsmåde, som involverer denaturering, syntese af H templatestrenge og hybridisering. Forlængelsesproduktet for hver *5 primer bliver en template for frembringelsen af den ønskede nu- kleinsyresekvens. i ansøgningen omtales, at hvis den anvendte polymerase er et termostabilt enzym, er det ikke nøvvendigt at tilsætte den efter hvert denatureringstrin, fordi varmen ikke øde- 2q lægger dens aktivitet. Der gives ikke andre fordele og detaljer H vedrørende anvendelsen af en oprenset, termostabil DNA-polymerase.

H Amplifikationen og påvisningsprocessen er også beskrevet af Saiki et al., Science, 230:1350-1354 (1985) og af Saiki et al., Bio/Techno- I loqy, 3:1008-1012 (1985).

H 25 Følgelig er der inden for fagområdet et ønske om at frembringe et oprenset, stabilt, termostabilt enzym, som kan anvendes til at H forbedre den ovenfor omtalte diagnostiske amplifikationsproces.

Ved den foreliggende opfindelse tilvejebringes følgelig et oprenset, termostabilt enzym med

DNA-polymeraseaktivitet, som katalyserer sammenslutningen af nukleotidtriphosphater til frem- I

^ bringelse af en nukleinsyrestreng, som er komple-mentær til en nukleinsyretemplatestreng og som I

har en molekylvægt på 86.000 til 90.000 bestemt ud fra dets vandring i SDS-PAGE, når de molære I

proteiner er phosphorylase B (92.500), bovint serumalbumin (66.200), ovalbumin (95.000), carbon- I

anhydrase (31.000), soyabønnetrypsininhibitor (21.500) og lypbzym (14.400). I en anden udføre!- I

sesform er det termostabile enzym et rekombinant enzym eller en modifikation heraf. Det oprensede I

^b enzym er fortrinsvis DNA-polymerase fra Thermus aauaticus og har en molekylvægt på ca. 86.000- I

90.000 dalton. Dette oprensede materiale kan anvendes i en temperaturcyklusamplifikationsreak- I

tion, hvorved nukleinsyresekvenser frembringes på baggrund af en bestemt nukleinsyresekvens i I

^B mæng-der, som er store sammenligned med den mængde, som er til stede i begyndelsen, således I

40 at de let kan påvises. I

Det gen, som koder for enzymet DNA-polymerase fra Thermus I

aquaticus, er også blevet identificeret og tilvejebringer endnu en I

måde til genvinding af det termostabile enzym ifølge den forelig- I

I DK 175806 B1 gende opfindelse. Udover det gen, som koder for det ca. 86.000- 90.000 dalton store enzym, præsenteres også genderivater, som koder for DNA-polymeraseaktivitet.

I Endelig omfatter opfindelsen også en stabil enzymsammensæt- I

5 ning, som omfatter et oprenset, termostabilt enzym, som ovenfor I

beskrevet, i en puffer, som indeholder én eller flere ikke-loniske, I

polymere detergenter. I

Det oprensede enzym, såvel som de enzymer, som frembringes I

ved rekombinant-DNA-teknikker, tilvejebringer meget større specifi- I

10 citet end Klenow-fragmentet, som ikke er termostabilt. Ydermere I

opviser det oprensede enzym og de enzymer, som er frembragt ved I

rekombinantmetoder, den forventede hensigtsmæssige aktivitet, når I

dTTP eller andre nukleotidtriphosphater ikke er til stede i inkube- I

ringsblandingen med DNA-templaten. De foreliggende enzymer har I

15 også en bredere pH-profil end det termostabile enzym fra Thermus I

aquaticus, som er beskrevet i litteraturen, idet de ved pH 7 har I

over 50% af aktiviteten ved pH 8. Ydermere kan det foreliggende I

termostabile enzym opbevares i en puffer med ikke-ioniske deter- I

genter, således at det er stabilt og ikke taber aktivitet i tidens løb. I

20 Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til amplifikation I

af én eller flere specifikke nukleinsyresekvenser i en nukleinsyre I

eller en blanding heraf under anvendelse af primere og et termo- I

stabilt enzym. Forlængelsesproduktet af én primer, bliver, når det I

hybridiseres med den anden, en template til frembringelsen af den I

25 ønskede, specifikke nukleinsyresékvens, og omvendt, og frem- I

gangsmåden gentages så ofte, som det er nødvendigt, til frem- . I

bringelse af den ønskede mængde af sekvensen. Den foreliggende i I

fremgangsmåde forbedrer specificiteten af amplifikationsreaktionen, I

hvilket resulterer i et meget distinkt signal for amplificeret nu- I

30 kleinsyre. Ydermere eliminerer den foreliggende fremgangsmåde I

behovet for overføring af reagenser fra én beholder til en anden I

efter hver amplifikationscyklus. En sådan overføring er ikke nød- I

vendig på grund af, at det termostabile enzym kan modstå de høje I

temperaturer, som er nødvendige for at denaturere nukleinsyre- I

35 strengene, og det er derfor ikke nødvendigt at erstatte dem. Tem- I

peraturcyklussen kan ydermere automatiseres til yderligere nedsæt- I

telse af arbejdskraft og de trin, som er nødvendige for at udføre I

amplifikationsreaktionen. I

I DK 175806 B1 I

I I

I Nærmere bestemt tilvejebringes med den foreliggende opfindelse I

I en fremgangsmåde til amplifikation af mindst én specifik nuklein- I

I syresekvens indeholdt i en nukleinsyre eller en blanding af nuklein- I

syrer, hvorhos nukleinsyren, hvis den er dobbeltstrenget, består af I

I 5 to separerede, komplementære strenge af ens eller uens længde, I

I hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved: I

I (a) at hver nukleinsyrestreng kontaktes med fire forskellige I

I nukleotidtriphosphater og én oligonukleotidprimer for hver forskellig,

specifik sekvens, som amplificeres, hvorhos hver primer er udvalgt I

I 10 til at være i det væsentlige komplementær til forskellige strenge i I

hver specifik sekvens, således at det forlængelsesprodukt, som I

syntetiseres fra én primer, kan, hår det er separeret fra dets I

H komplement, tjene som en template for syntese af forlængelsespro- I

duktet af den anden primer, hvilken kontakt udføres ved en tempe- I

15 ratur, som fremmmer hybridisering af hver primer til dens komple- I

mentære nukleinsyrestreng, I

(b) at hver nukleinsyrestreng samtidigt eller efter trin (a) I

kontaktes med et termostabilt enzym, som muliggør sammenslutningen I

af nukleotidtriphosphaterne under dannelse af primerforlængelses- I

20 produkter, som er komplementære til hver streng af hver nuklein- I

I syre, I

(c) at blandingen fra trin (b) . holdes ved en effektiv tempe- I

H ratur i en effektiv tidsperiode til aktivering af enzymet og til for I

hver forskellig sekvens, som amplificeres, at syntetisere et forr I

25 længelsesprodukt af hver primer, som er komplementær til hver I

H nukleinsyrestrengtemplate, men ikke en så høj temperatur, at hvert I

forlængelsesprodukt separeres fra dens komplementære template- I

H streng. I

(d) at blandingen fra trin (c) opvarmes i en effektiv tids- I

30 periode og ved en effektiv temperatur til at separere primerforlæn- I

gelsesprodukterne fra de templater, på hvilke de blev syntetiseret, I

til frembringelse af enkeltstrengede molekyler, men ikke en så høj I

temperatur, at enzymet denatureres irreversibelt, I

(e) at blandingen fra trin (d) afkøles ved en effektiv tempe- I

35 ratur i en effektiv tidsperiode til fremhing af hybridisering af hver I

primer til hver af de enkeltstrengede molekyler, som er frembragt i I

trin (d), og I

(f) at blandingen fra trin (e) holdes ved en effektiv temperatur I

i en effektiv tidsperiode til at fremme aktiviteten af enzymet, og til I

I DK 175806 B1 at der for hver forskellig sekvens, som amplificeres, syntetiseres et forlængelsesprodukt af hver primer, hvilket forlængelsesprodukt er komplementær til hver nukleinsyrestreng, som er frembragt ϊ trin (d), men ikke en så høj temperatur, at hvert forlængelsesprodukt 5 separeres fra dens komplementære templatestreng, hvorhos trinnene (e) og (f) udføres samtidigt eller sekventielt.

Trinnene (d), (e) og (f) kan gentages, indtil det ønskede sekvensamplifikationsniveau er opnået. Det foreliggende, foretrukne termostabile enzym er en polymerase, som er ekstraheret fra Ther-10 mus aquaticus (Taq-polymerase). Hvis enzymet er Taq-polymerase, kontaktes nukleinsyrestrengene i trin (a) mest fortrinsvis med en puffer, som omfatter ca. 1,5-2 mM af et magnesiumsalt, 150-200 μΜ af hver af nukleotiderne og 1 μΜ af hver primer, trinnene (a), (e) og (f) udføres ved ca. 45-58°C, og trin (d) udføres ved ca. 90-15 100°C.

I en foretrukken udførelsesform er nukleinsyren (-syrerne) dobbelstrenget (dobbeltstrengede), og trin (a) udføres ved (i) at hver nukleinsyre opvarmes i nærværelse af fire forskellige nukleo-tidtriphosphater , og én oligonukleotidprimer for hver forskellig spe- t 20 cifik sekvens som amplificeres, i en effektiv tidsperiode og ved en effektiv temperatur til denaturering af hver nukleinsyre, hvorhos hver primer er udvalgt til at være i det væsentlige komplementær til forskellige strenge af hver specifik sekvens, således at det forlængelsesprodukt, som syntetiseres fra én primer, kan,, når det er ! 25 separeret fra dets komplement, tjene som en template for syntese af forlængelsesproduktet af den anden primer* og ved (ii) at de denaturerede nukleinsyrer afkøles til en temperatur, som fremmer hy-bridisering mellem hver primer og dens komplementære nukleinsyrestreng.

30 I andre udførelsesformer angår opfindelsen en fremgangsmåde til påvisning af tilstedeværelsen eller fraværet af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve, som indeholder en nukleinsyre eller en blanding af nukleinsyrer, eller til at skelne mellem to forskellige sekvenser i prøven, hvilken prøve antages at indeholde sekvensen 35 eller sekvenserne, og hvor hver nukleinsyre, hvis de er dobbeltstrengede, består af to separerede komplementære strenge af ens eller uens længde, hvilken fremgangsmåde omfatter, at de ovenfor nævnte trin (a) til (f), som resulterer i amplifikation med hensyn til mængde af den specifikke nukleinsyresekvens (de specifikke nuklein-syresekvenser), hvis den (de) er tilstede, udføres,

I DK 175806 B1 I

I I

I (g) at der til produktet fra trin (f) tilsættes en mærket oli- I

I gonukleotidprobe for hver sekvens, der skal påvises, hvilken probe H

I er i stand til at hybrldisere til sekvensen eller til en mutation heraf, I

°g I

I 5 (h) at der bestemmes, om hybridiseringen har fundet sted. I

I I endnu en anden udførelsesform angår opfindelsen en frem- I

I gangmåde til påvisning af tilstedeværelsen eller fraværet af mindst I

I én nukleotidvariation i en sekvens i én eller flere nukleinsyrer, som I

I findes i en prøve, hvor nukleinsyren, hvis den er dobbeltstrenget, I

10 består af to separerede, komplementære strenge af ens eller uens I

længde, hvilken fremgangsmåde omfatter de ovenfor nævnte trin

I (a)-(f), hvor trinnene (d), (e) og (f) gentages et tilstrækkeligt I

antal gange til at resultere i påviselig amplifikation af den nuklein- I

syre, som indeholder sekvensen, hvis den er tilstede, I

15 (g) at produktet fra trin (f) fæstnes til en membran, I

(h) at membranen behandles under hybridiseringsbetingelser I

med en mærket, sekvensspecifik oligonukleotidprobe, som kun er i I

stand til hybridisere med den amplificerede nukleinsyresekvens, hvis I

en sekvens af proben er komplementær til et område af den ampli- I

H 20 ficerede sekvens, og I

(i) at det påvises, om proben har hybridlseret med en ampli- I

ficeret sekvens i nukleinsyreprøven. I

Hvis prøven omfatter celler, opvarmes de fortrinsvis før trin I

H (a) for at eksponere nukleinsyrerne deri med reagenserne. Ivied dette I

H 25 trin undgås ekstraktion af nukleinsyrerne forud for reagensti Isæt- I

ning. I

I en variation af denne fremgangsmåde mærkes primeren (pri- I

H merne) og/eller nukleotidtriphosphaterne således, at den fremkomne, I

H amplificerede sekvens er mærket. Den mærkede primer (de mærkede I

H 30 primere) og/eller nukleotidtriphosphat (-phosphater) kan være til- I

stede i reaktionsblandingen i begyndelsen eller tilsættes i en senere I

cyklus. Det sekvensspecifikke oligonukleotid (umærket) fæstnes til I

en membran og behandles under hybridiseringsbetingelser med det I

mærkede amplifikationsprodukt, således at hybridisering kun vil I

35 finde sted, hvis den membranbundne sekvens er til stede i ampli- I

fi kationsproduktet. I

I endnu en anden udførelsesform angår den foreliggende opfin- I

delse en fremgangsmåde til I en kloningsvektor at klone én eller flere I

specifikke nukleinsyresekvenser, som findes i en nukleinsyre eller i I

I DK 175806 B1 en blanding af nukleinsyrer, hvorhos nukleinsyren (nukieinsyrerne), når den (de) er dobbeltstrenget (dobbeltstrengede), består af to separerede, komplementære strennp. r>n nukleinsyrer*, (rvjkleinsy-rerne) er amplificeret i mængde før kloning, hvilken fremgangsmåde 5 omfatter, at de ovennævnte trin (a)-(f) udføres, Idet trinnene (d), (e) og (f) gentages et tilstrækkeligt antal gange til frembringelse af påviselig amplifikation af nukleinsyren (nukieinsyrerne), som findes i sekvensen (sekvenserne), (g) at der til produktet fra trin (f) tilsættes et restriktions-10 enzym for hver af restriktionsstederne til opnåelse af spaltede produkter i en restriktionsfordøjelse, og (h) at det spaltede produkt (de spaltede produkter) fra trin (g), som indeholder den specifikke sekvens (de specifikke sekvenser), som skal klones, ligeres ind i én eller flere kloningsvektorer, 15 som indeholder en promotor og en selekterbar markør.

I en sidste udførelsesform angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til i en kloningsvektor at klone én eller flere specifikke nukleinsyresekvenser, som findes i en nukleinsyre eller i en blanding af nukleinsyrer, hvorhos nukleinsyren (nukieinsyrerne), t . - 20 når den (de) er dobbeltstrenget (dobbeltstrengede), består af to separerede, komplementære strenge af ens eller uens længde, og nukleinsyren (nukieinsyrerne) amplificeres i mængde før kloning, hvilken fremgangsmåde omfatter, at de ovennævnte trin (a)-(f) udføres, idet trinnene (d), (e) og (f) gentages et tilstrækkeligt 25 antal gange til at resultere i en effektiv amplifikation af den nukleinsyre (de nukleinsyrer), som indeholder sekvensen (sekvenserne) til stumpendeligering i én eller flere kloningsvektorer, og (g) at dein amplificerede specifikke sekvens (de amplificerede specifikke sekvenser), som skal klones, og som er opnået i trin (f), 30 ligeres ind i én eller flere af kloningsvektorerne i nærværelse af en Ugase, hvilken amplificeret sekvens (hvilke amplificerede sekvenser) og vektor(er) er til stede i en tilstrækkelig mængde til effektuering af ligeringen.

I en produktudførelsesform tilvejebringes med opfindelsen en 35 sammensætning, som er brugbar til amplifikation af mindst én specifik nuklelnsyresekvens, som findes i en nukleinsyre eller en blanding af nukleinsyrer, hvilken sammensætning omfatter fire forskellige nukleotidtriphosphater og én oligonukleotidprimer for hver forskellig specifik sekvens, som amplificeres, hvorhos hver primer er udvalgt til at være i det væsentlige komplementær til forskellige strenge af

I DK 175806 B1 I

I I

hver specifik sekvens, således at det forlængelsesprodukt, som syn- I

I tetiseres fra én primer, kan, når det er separeret fra dens komple- I

I ment, tjene som en template for syntese af forlængelsesproduktet af I

I den anden primer. I

5 I en anden produktudførelsesform angår opfindelsen en prøve af il

I én eller flere nukleinsyrer, hvilken prøve omfatter multiple strenge I

af en specifik nukleinsyresekvens, som findes i nukleinsyren (nu- j I

kleinsyrerne). Prøven kan omfatte ca. 10-100 af strengene, ca. j . I

100-1000 af strengene eller over ca. 1000 af strengene. I

10 I en sidste produktudførelsesform angår opfindelsen en amplifi- ' I

ceret nukleinsyresekvens fra en nukleinsyre eller en blanding af I

H nukleinsyrer, som omfatter multiple kopier af den sekvens, som I

frembringes ved de foreliggende amplifikationsmetoder. I

H Figur 1 viser et kort over restriktionssteder i plasmid pFC83, I

15 hvilket kort indeholder den ca. 4,5 kb lange Hindi 11 T. aquaticus I

DNA-indføjelse subklonet i plasmid BSM13+. I

H Figur 2 viser et kort over restriktionssteder i plasmid pFC85, I

som indeholder den ca. 2,8 kb lange aquaticus DNA-indføjelse fra I

Hindll I til Asp718 subklonet i plasmid BSM13+. I

20 De her anvendte udtryk "celle", "cellelinie" og "cellekultur" kan I

H anvendes ensbetydende, og alle sådanne betegnelser inkluderer I

H afkom. Således omfatter udtrykkene "transformanter" eller "trans- I

H formerede celler" den primære celle og kulturer hidrørende herfra I

H uden hensyntagen til antallet af overføringer. Det skal også forstås, I

H 25 at alt afkom ikke nødvendigvis har præcis identisk DNA-indhold på I

H grund af bevidste eller utilsigtede mutationer. Mutantafkom, som har I

den samme funktionalitet, som der er screenet for i den oprindelige I

transformerede celle, er inkluderet. I

Udtrykket "styringssekvenser" refererer til DNA-sekvenser, I

30 som er nødvendige for ekspressionen af en på funktionsdygtig måde I

koblet kodende sekvens i en bestemt værtsorganisme. De styrings- I

sekvenser, som er egnede for prokaryoter, inkluderer f.eks. en I

promotor, eventuelt en operatorsekvens, et ribosombindingssted og I

muligvis andre endnu dårligt forståede sekvenser. Eukaryote celler I

35 vides at udnytte promotorer, polyadenyleringssignaler og enhancere. I

Udtrykket "ekspressionssystem" refererer til DNA-sekvenser, I

H som indeholder en ønsket kodende sekvens og styringssekvenser i I

funktionsdygtig kobling, således at de værter, som er transformeret I

med disse sekvenser, er i stand til at frembringe de kodede pro- I

I DK 175806 B1 teiner. For at effektuere transformering kan ekspressionssystemet være indsat i en vektor, men det relevante DNA kan imidlertid også derefter integreres i værts kromosomet.

I Det her anvendte udtryk “gen" refererer til en DNA-sekvens, 5 som koder for et bioaktivt polypeptid eller en precursor, som kan indvindes. Polypeptidet kan være kodet af en gensekvens i fuld længde eller af en hvilken som helst del af den kodende sekvens, silænge den enzymatiske aktivitet er bevaret.

"Pi funktionsdygtig måde koblet til" refererer til en sidan 10 sammenstilling, at komponenternes normale funktion kan udføres. En kodende sekvens, som er "funktionsdygtig koblet" til styringssekvenser, refererer således til en konfiguration, hvor de kodende sekvenser kan udtrykkes under styring af sekvenserne.

"i kke-ioniske, polymere detergenter" refererer til overflade-15 aktive midler, som ikke har nogen ionisk ladning, og som til brug ved den foreliggende opfindelse er karakteriseret ved deres evne til at stabilisere det foreliggende enzym i et pH-område pi fra ca. 3,5 til ca. 9,5, fortrinsvis fra 4 til 8,5.

Det her anvendte udtryk "oligonukleotid" defineres som et f 20 molekyle, der omfatter to eller flere deoxyribonukleotider eller ribo-nukleotider, fortrinsvis flere end tre. Dets nøjagtige størrelsé vil afhænge af mange faktorer, hvilket igen afhænger af den endelige funktion eller anvendelse af oligonukleotidet. Oligonukleotidet kan være syntetisk afledt eller opnået ved kloning.

25 Som udtrykket "primer" er anvendt her, refererer det til et oligonukleotid, hvad enten det er naturligt forekommende som i en oprenset restriktionsfordøjelse, eller er frembragt syntetisk, og som er i stand til at fungere som et synteseinitieringspunkt, når det anbringes under betingelser, under hvilke syntese af et primer-30 forlængelsesprodukt, som er komplementært til en nukleinsyrestreng, induceres, det vil sige i nærværelse af fire forskellige nukleotid-triphosphater og et termostabilt enzym i en egnet puffer ("puffer" inkluderer pH, ionstyrke, cofaktorer osv.) samt ved en egnet temperatur. For Taq-polymerase indeholder pufferen her fortrinsvis 35 1,5-2 mM af et magnesiumsalt, fortrinsvis MgC^, 150-200 μΜ af hvert nukleotid og 1 μΜ af hver primer sammen med fortrinsvis 50 mM KCI, 10 mM Tris-puffer, pH 8-8,4 og 100 pg/ml gelatine.

For maximal effektivitet ved amplifikation er primeren fortrinsvis enkeltstrenget, men kan alternativt være dobbeltstrenget. Hvis den

I - DK 175806 B1 I

I I

er dobbeltstrenget, behandles primeren først for at separere dens I

I strenge, før den anvendes til frembringelse af forlængelsesproduk- I

I ter. Primeren er fortrinsvis et oligodeoxyrlbonukleotid. Primeren må I

I være tilstrækkelig lang til at prime syntesen af forlængelsesproduk- I

I 5 ter i nærværelse af det termostabile enzym. De nøjagtige længder af I

primerne vil afhænge af mange faktorer, herunder temperatur, I

H primerkilde og den anvendte metode. Afhængig af målsekvensens I

kompleksitet indeholder oligonukleotidprimeren f.eks. 15-25 nukleo- |c I

H tider, skønt den kan indeholde flere eller færre nukleotider. Korte I

H 10 primermolekyler kræver almindeligvis koldere temperaturer til dan- 1 I

nelse af tilstrækkelig stabile hybridkomplekser med template. I

De foreliggende primere er udvalgt til at være "i det væsent- I

lige" komplementære til de forskellige strenge i hver specifik se- I

kvens, som skal amplificeres. Dette betyder, at primeren skal være I

H 15 tilstrækkelig komplementære til at hybridisere med deres respektive I

strenge. Primersekvensen behøver derfor ikke at reflektere den I

H nøjagtige sekvens af templaten. Der kan f.eks. være knyttet et I

H ikke-komplementært nukleotidfragment til 5'-enden af primeren, hvor I

H resten af primersekvensen er komplementær til strengen. Alternativt I

H 20 kan ikke-komplementære baser eller længere sekvenser være fordelt i I

primeren, forudsat at primersekvensen har tilstrækkelig komplemen- I

H taritet med sekvensen af den streng, som skal amplificeres, til at I

hybridisere hermed og derved danne en template for syntese af I

H forlængelsesproduktet af den anden primer. Til påvisningsformål, I

H 25 navnlig under anvendelse af mærkede sekvensspecifikke prober, har I

H primerne imidlertid typisk nøjagtig komplementaritet til opnåelse af de I

bedste resultater. I

Som anvendt her refererer udtrykkene "restriktionsendonukle- I

aser" og "restriktionsenzymer" til bakterielle enzymer, som hver især I

30 skærer dobbeltstrenget DNA ved eller nær en specifik nukleotid- I

sekvens. I

Som anvendt her refererer udtrykket "DNA-polymorfisme" til I

den tilstand, i hvilken to eller flere forskellige nukleotidsekvenser I

kan eksistere på et bestemt sted i DNA. I

35 Som anvendt her refererer udtrykket "hukleotidvariation i I

sekvens" til hvilke som helst enkelte eller multiple nukleotidsub- I

stitutioner, -deletioner og -indføjelser. Disse nukleotidvariationer I

kan være mutantvariationer eller polymorfe allelvariationer. Den I

foreliggende fremgangsmåde kan derfor påvise epkeltnukleotidændrin- I

ger i nukleinsyre, sådan som det forekommer ved genetiske β-globin- I

i DK 175806 B1 sygdomme fremkaldt af enkeltbasemutationer, tilføjelser eller deletioner (såsom β-thalassæmi, seglcel leanæmi, hæmoglobin C sygdom etc.)/ såvel som multlole basevariati«r,or< s? s cm dz vcriatior.er, der I er involveret i or-thalassæmi eller nogle β-thalassæmisygdomme. Yder- 5 mere kan den foreliggende fremgangsmåde påvise polymorfismer, som ikke nødvendigvis er forbundet med en sygdom, men som blot er en tilstand, i hvilken to eller flere forskellige nukleotidsekvenser (hvad enten de indeholder substituerede, deleterede eller indføjede nukleo-tidbasepar) kan eksistere på et bestemt sted i nukleinsyren i popu-10 lationen, såsom med HLA-områder i det humane genom og tilfældigt fordelte polymorfismer, såsom mitochondrial ON A. Oe polymorfe, sekvensspecifikke oligonukleotidprober, som omtales i detaljer herefter, kan anvendes til at påvise genetiske markører koblet til en sygdom, såsom insulinafhaengig diabetes mellitus eller til retsviden-15 skabelige anvendelser. Hvis nukleinsyren er dobbeltstrenget, bliver nukleotidvariation i sekvensen en baseparvariation i sekvens.

Udtrykket "sekvensspecifikke oligonukleotidér" refererer til oligonukleotider, som vil hybridisere til specifikke sekvenser, hvad enten de findes på alleler eller ej, hvilke sekvenser strækker sig 20 over den baseparvariation, som skal påvises, og er specifikke for den sekvensvariation, som skal påvises. Afhængig af de sekvenser, som analyseres, kan der anvendes en eller flere sekvensspecifikke nukleotider for hver sekvens, hvilket , vil blive beskrevet yderligere nedenfor.

25 Som anvendt her refererer udtrykket "restriktionsfragment- længdepolymorfi" ("RFLP") til forskelle mellem individer med hensyn til længderne af de restriktionsfragmenter, som dannes ved fordøjelse med en bestemt restriktionsendonuklease.

Som anvendt her refererer udtrykket "termostabilt enzym" til et 30 enzym, som er stabilt over for varme, og som er varmeresistent og katalyserer (letter) sammenslutningen af nukleotiderne på en korrekt mide til dannelse af de primerforlængelsesprodukter, som er komplementære til hver nukleinsyrestreng.. Generelt vil syntesen blive initieret ved 3'-enden af hver primer og vil forløbe i 5'-retningen 35 langs templatestrengen, indtil syntesen slutter under frembringelse af molekyler med forskellige længder. Der kan imidlertid findes et termostabilt enzym, som initierer syntese ved 5'-enden og fortsætter i den anden retning under anvendelse af den samme proces som ovenfor beskrevet.

I · DK 175806 B1 I

I 12 I

I Det foreliggende termostabile enzym må opfylde et enkelt kri- I

I terium for at være effektiv ved amplifikationsreaktionen, det vil I

I sige, at enzymet ml ikke blive irreversibelt denatureret (inakti- I

veret), når det udsættes for de forhøjede temperaturer i den tids- I

5 periode, som er nødvendig for at effektuere denaturering af dob- I

beltstrengede nukleinsyrer. Irreversibel denaturering i det fore- I

liggende tilfælde refererer til permanent eller fuldstændig tab af I

enzymaktivitet. De opvarmningsbetingelser, som er nødvendige for I

denaturering, vil f.eks. afhænge af koncentrationen af puffersalt og I

10 længden samt nukleotidsammensætningen af de nukleinsyrer, som I

denatureres, men temperaturen ligger typisk i området fra ca. 90 til I

I 105°C i en tidsperiode, som hovedsagelig afhænger af temperaturen I

og nukleinsyrelængden, typisk fra ca. 0,5 til fire minutter. Højere I

temperaturer kan tolereres, når puffersal tkoncentrationen og/eller I

15 nukleinsyrens GC-indhold stiger. Enzymet vil fortrinsvis ikke blive I

irreversibelt denatureret ved ca. 90-100°C. I

Det foreliggende termostabile enzym har fortrinsvis en optimal I

temperatur, ved hvilken det fungerer, hvilken temperatur er højere I

end ca. 40°C, som er den temperatur, under hvilken hybridisering I

20 af primer til template fremmes, skønt hybridisering, afhængig af (1) I

H magnesium- og saltkoncentrationer og (2) sammensætning og længde I

af primeren, kan finde sted ved højere temperatur (f.eks. 45-70°C). I

H Jo højere temperaturoptimum'et for enzymet er, des større er speci- I

H ficiteten og/eller selektiviteten af den primérstyrede forlængelsespro- I

25 ces. Enzymer, som er aktive under 40°C, f.eks. ved 37°C, ligger I

H imidlertid også inden for opfindelsens rækkevidde, forudsat at de er I

H varmestabile. Det optimale temperaturområde ligger fortrinsvis fra I

ca. 50 til 90°C, mere fortrinsvis fra 60 til 80°C. I

H Det foreliggende termostabile enzym kan opnås fra en hvilken I

30 som helst kilde og være et nativt eller rekombineret protein. Eksem- I

pier på enzymer, som er blevet omtalt i litteraturen som værende I

bestandige over for varme, inkluderer varmestabile polymeraser, I

såsom f.eks. polymerase ekstraheret fra de termofile bakterier I

Thermus flavus. Thermus ruber. Thermus termoohilus. Thermus aauaticus. Thermus lacteus I

og Thermus rubens. I

Η I

Det her foretrukne termostabile enzym er en DNA-polymerase I

isoleret fra Thermus aquaticus. Forskellige stammer heraf kan fås fra I

13 DK 175806 B1

American Type Culture Collection, Rockville, Maryland og omtales af T.D. Brock, J. Bact. (1969) 98:289-297, og af T. Oshima, Arch.

Microbiol. (1978) 117: 189-196. Én af disse foretrukne stammer er stamme YT-1.

5 Til udvinding af det native protein dyrkes cellerne under an vendelse af en egnet teknik. Én sådan teknik er omtalt af Kaledin et al., Biokhimiya (1980), se ovenfor. I korthed dyrkes cellerne på.et medium af nitrilotrieddikesyre (100 mg), tryptone (3 g), gærekstrakt (3 g), ravsyre (5 g), natriumsulfit (50 mg), riboflavin (1 mg), 10 K2HP04 <522 m9)r MgS04 (480 mg), CaCI2 (222 mg), NaCI (20 mg) og sporstoffer (mængderne er angivet pr. liter medium). Mediets pH-værdi indstilles til 8,0 ± 0,2 med KOH. Udbyttet forøges, hvis cellerne dyrkes med kraftig beluftning indtil 20 g/liter celler ved en temperatur på 70°C. Celler i sen logaritmisk fase (bestemt ved 15 absorbans ved 550 nm) opsamles ved centrifugering, vaskes med en puffer og opbevares frossen ved -20°C.

Ved en anden fremgangsmåde til dyrkning af cellerne, hvilket er beskrevet i Chien et al., J. Bacteriol. (1976), se ovenfor, anvendes et defineret mineralsaltmedium, som indeholder 0,3% glutamin-20 syre suppleret med 0,1 mg/l biotin, 0,1 mg/l thiamin og 0,05 mg/l nikotinsyre. Saltene inkluderer nitrilotrieddikesyre, CaSO^, MgSC>4,

NaCI, KN03, NaNOg, ZnSO^, H3BC>3, CuSC>4, NaMoC>4, CoCI2, FeCI3,

MnS04 og Na2HP04· Mediets pH-værdi indstilles til 8,0 med NaOH.

Ved metoden ifølge Chien et al. dyrkes cellerne i .begyndelsen 25 ved 75°C i et vandbadrysteapparat. Når der opnås en bestemt densitet overføres 1 liter af cellerne til 16 liter glasballoner, som anbringes i varmluftsinkubatorer. Steril luft blæses gennem kulturerne, og temperaturen holdes ved 75°C. Cellerne får lov til at vokse i 20 timer, før de opsamles ved centrifugering.

30 Efter cellevækst finder Isolering og oprensning af enzymet sted i 6 trin, som hver udføres ved en temperatur under stuetemperatur, fortrinsvis ved 4°C.

I den første fase eller det første trin bliver cellerne, hvis de er frosne, optøet, desintegreret med ultralyd, suspenderet i en 35 puffer ved en pH-værdi på ca. 7,5 og centrifugeret.

I den anden fase opsamles supernatanten, og den fraktioneres derefter ved tilsætning af et salt, såsom tør ammoniumsulfat. Den hensigtsmæssige fraktion (typisk 45-75% mætning) opsamles, opløses i en 0,2 kaliumphosphatpuffer fortrinsvis ved pH 6,5 og dialyseres mod den samme puffer.

DK 175806 B1 : I

Det tredie trin fjerner nukleinsyrer og noget protein. Frak- I

tionen fra den anden fase påsættes en DEAE-cellulosesøjle ækvili- I

breret med den samme puffer som ovenfor anvendt. Derefter vaskes H

søjlen med den samme puffer, og de gennemløbne proteinholdige I

5 fraktioner, bestemt ved absorbans ved 280 nm, opsamles og dialyse- I

res mod en 10 mM kaliumphosphatpuffer, fortrinsvis med de samme I

bestanddele som den første puffer, men ved en pH-værdi på 7,5. H

I det fjerde trin påsættes den således opsamlede fraktion en I

hydroxyapatltsøjle ækvilibreret med den samme puffer, som er an- H

H

10 vendt til dialyse i det tredie trin. Søjlen vaskes derefter, og enzy-

met elueres med en lineær gradient af en puffer, såsom fra 0,01 Μ H

til 0,5 M kaliumphosphatpuffer ved pH 7,5, som indeholder 10 mM H

2-mercaptoethanol og 5% glycerol. De sammenhældte fraktioner, som I

indeholder den termostabile enzymaktivitet (f.eks. DNA-polymerase- I

15 aktivitet), dialyseres mod den samme puffer, som anvendt I dialysen | H

i det tredie trin. H

I det femte trin påsættes den dialyserede fraktion en DEAE- H

cellulosesøjle, som er ækvilibreret med den puffer, som er anvendt H

til dialyse i det tredie trin. Søjlen vaskes derefter, og enzymet

20 elueres med en lineær gradient af en puffer, såsom fra 0,01 til 0,6 Μ I

KCI i den puffer, som er anvendt til dialyse i det tredie trin. Frak- H

tioner med termostabil enzymaktivitet undersøges derefter for kon- H

taminerende deoxyribonukleaser (endo- og exonukleaser) under

anvendelse af en hvilken som helst egnet procedure. Endonuklease- H

25 aktiviteten kan f.eks. bestemmes elektroforetisk ud fra ændringen i H

molekylvægt af fag λ-DNA eller superspiralsnoet plasmid DNA efter H

inkubering med et overskud af DNA-polymerase. På lignende måde H

kan exonukleaseaktivitet bestemmes elektroforetisk ud fra ændringen H

i molekylvægt af DNA efter behandling med et restriktionsenzym, som H

30 spalter adskillige steder. H

De fraktioner, som viser sig ikke at indeholde deoxyribonu- H

kleaseaktivitet, hældes sammen og dialyseres mod den samme puffer, H

som anvendt i det tredie trin. H

I det sjette trin anbringes de sammenhældte fraktioner på en H

35 phosphorceliulosesøjle med et fast lejevolumen. Søjlen vaskes og H

enzymet elueres med en lineær gradient af en puffer, såsom fra 0,01 H

til 0,4 M KCI I en kaliumphosphatpuffer ved pH 7,5. De sammen- H

hældte fraktioner, som indeholder termostabil polymeraseaktivitet og H

ingen deoxyribonukleaseaktivitet, dialyseres mod en puffer ved pH H

8,0.

15 DK 175806 B1

Molekylvægten af det dialyserede produkt kan bestemmes ved en hvilken som helst teknik, f.eks. ved SDS PAGE under anvendelse af oroteinmolekvlvægtsmarkdrer. Molekvivæaten er én af de her fore- ' ' ‘ ] trukne enzymer, DNA-polymerasen oprenset fra Thermus aquaticus, j 5 bestemmes ved ovennævnte metode til at være ca. 86.000-90.000 dalton.

Det termostabile enzym ifølge den foreliggende opfindelse kan også fremstilles ved rekombinant DNA-teknikker, eftersom det gen, som koder for dette enzym, er blevet klonet fra Thermus aquaticus's 10 genomiske DNA. Den fuldstændige kodesekvens for Thermus aquaticus (Taq)-polymerasen kan afledes fra bakteriofag CH35:Taq nr.4-2 på et ca. 3,5 kilobase (kb) langt Bglll-Asp718 (delvis) restriktions-fragment indeholdt i et ca. 18 kb langt genomisk DNA-indføJelses-fragment. Denne bakteriofag blev deponeret hos American Type 15 Culture Collection (ATCC) den 29. maj, 1987 og har deponerings-nummer 40.336. Alternativt kan genet konstrueres ved ligering af et ca. 750 basepar (bp) langt Bqll l-Hindl 11 restriktionsfragment isoleret fra plasmid pFC83 (ATCC 67.422, deponeret 29. maj, 1987) til et ca.

2,8 kb langt Hindlll-Asp7l8 restriktionsfragment isoleret fra plasmid 20 pFC85 (ATCC 67.421, deponeret 29. maj, 1987). pFC83-restriktions-

fragmentet omfatter den aminoterminale ende af Taq-polymerasegenet, I

medens restriktionsfragmentet fra pFC85 omfatter carboxylenden.

Ligeringen af disse to fragmenter i en tilsvarende fordøjet vektor med passende styringssekvenser vil derfor resultere i translation af 25 en Taq-polymerase i fuld længde.

Det har også vist sig, at det ikke er nødvendigt med hele den kodende sekvens af Taq-polymerasegenet for at genfinde et biologisk aktivt genprodukt med den ønskede enzymatiske aktivitet. Aminoterminale deletioner, hvor ca. en trediedel af den kodende sekvens 30 mangler, har resulteret i frembringelse af et genprodukt, som er ganske aktivt i polymeraseanalyser.

Ud over N-terminale deletioner kan individuelle aminosyrerester i den peptidkæde, som omfatter Taq-polymerasen, modificeres ved oxidation, reduktion eller anden derivatisering, og proteinet kan 35 spaltes til opnåelse af fragmenter, som bevarer aktiviteten. Sådanne ændringer, som ikke ødelægger aktivitet, fjerner ikke den DNA-sekvens, som koder for et sådant protein, fra definitionen på et gen.

I DK 175806 B1 I

I I

Modifikationer af selve den primære struktur ved deletion, I

tilføjelse eller ændring af de aminosyrer, som inkorporeres i se- I

kvensen under translation, kan således foretages uden at ødelægge I

proteinets aktivitet. Sådanne substitutioner eller andre ændringer I

5 resulterer i proteiner, som har en aminosyresekvens, der er kodet af H

H DNA, som ligger inden for den påtænkte rækkevidde for den fore- ; I

liggende opfindelse. H

B Polyklonalt antiserum fra kaniner, som var immuniseret med den H

oprensede, 86.000-90.000 dalton store polymerase ifølge den forelig- H

10 gende opfindelse, blev anvendt til at undersøge et partielt Thermus I

aquaticus genomisk expressionsbibliotek til opnåelse af den passende I

kodende sekvens, som ovenfor beskrevet. Den klonede, genomiske I

sekvens kan udtrykkes som et fusionspolypeptld, udtrykt direkte I

under anvendelse af dens egen styringssekvenser, eller udtrykt ved I

B 15 konstruktioner, som udnytter styringssekvenser, som er passende I

for den bestemte vært, der anvendes til expression af enzymet. I

B Tilgængeligheden af DNA, som koder for disse sekvenser, til- I

vejebringer selvfølgelig mulighed for at modificere den kodende se- I

B kvens til frembringelse af muteinformer, som også har DNA-poly- I

B 20 meraseaktivitet. I

B ' Disse værktøjer kan således tilvejebringe den fuldstændigt I

B kodende sekvens for Taq-DNA-polymerase, hvorfra expressions- I

B vektorer, som kan anvendes i en række værtssystemer, kan kon- H

B strueres, og den kodende sekvens udtrykkes. Det fremgår også af I

B 25 ovennævnte, at dele af den Taq-polymerasekodende sekvens er I

fl nyttig som prober til at genfinde andre termostabile polymerase- I

fl kodende sekvenser i en række arter. Følgelig kan dele af det geno- I

fl miske DNA, som koder for mindst seks aminosyrer, replikeres i L . I

fl coli, eller der kan syntetiseres oligodeoxyribonukleotidprober, som I

fl 30 koder for mindst seks aminosyrer, og som anvendes til at genfinde I

I yderligere DNA'er, der koder for en termostabil polymerase. Fordi I

H der måske ikke er en nøjagtig baseparring mellem nukleotidsekvensen I

fl i Thermus aquaticus formen og sekvensen i den tilsvarende del af I

I andre arter, er oligomerer, som indeholder ca. 18 nukleotider (der I

I 1 35 koder for den seks aminosyrer lange streng) sandsynligvis nødven- I

I dig for at opnå hybridisering under betingelser med tilstrækkelig I

I stringenthed til at eliminere falske positiver. De sekvenser, som I

I koder for seks aminosyrer, vil tilvejebringe tilstrækkelig information I

I til sådanne prober. I

I ! I

17 DK 175806 B1

Egnede værter, styringssystemer og metoder

Udtrykt generelt involverer frembringelsen af en rekombinant form af Taq-polymerase typisk følgende: Først opnås et DNA, som koder for det modne (her anvendt til 5 at omfatte alle muteiner) enzym eller en fusion af Taq-polymerasen og en yderligere sekvens, som ikke ødelægger dens aktivitet, eller en yderligere sekvens, som kan spaltes fra under kontrollerede betingelser (såsom behandling med peptidase) til frembringelse af et aktivt protein. Hvis sekvensen ikke indeholder introns, er den egnet 10 til expression i en hvilken som helst vært. Denne sekvens skal foreligge i en form, der kan udskæres og genvindes.

Den udskårne eller genindvundne, kodende sekvens anbringes derefter fortrinsvis i funktionsdygtig kobling med egnede styrings-► sekvenser i en expressionsvektor, som kan replikeres. Vektoren 15 anvendes til at transformere en egnet vært, og den transformerede vært dyrkes under gunstige betingelser til frembringelse af produktion af den rekombinerede Taq-polymerase. Taq-polymerasen isoleres eventuelt fra mediet eller fra cellerne; genvinding og oprensning af proteinet er måske ikke nødvendig I nogle tilfælde, 20 hvor nogle urenheder kan tolereres.

Hvert af de foregående trin kan udføres på en række måder.

De ønskede kodende sekvenser kan f.eks. opnås fra genomiske fragmenter og anvendes direkte i egnede værter. Konstruktionerne af expressionsvektorer, som kan fungere i eri række værter, fremstilles 25 under anvendelse af egnede replikoner og styringssekvenser som ' anført nedenfor. Egnede restriktionssteder kan, hvis de ikke normalt er tilgængelige tilføjes til enderne af den kodende sekvens, således at der tilvejebringes et gen, som kan udskæres til indsættelse i disse vektorer.

30 Styringssekvenserne, expressionsvektorerne og transformations metoderne afhænger af den type værtscelle, der anvendes til at udtrykke genet. Almindeligvis er prokaryote celler, gær, insekter eller pattedyrceller for tiden brugbare som værter. Prokaryote værter er i almindelighed de mest effektive og hensigtsmæssige til 35 frembringelsen af rekombinerede proteiner og foretrækkes derfor til expressionen af Taq-polymerasen.

I det specielle tilfælde med Taq-polymerasen indikerer evidenser, at en betragtelig deletion ved den N-terminale ende af proteinet kan forekomme under både rekombinerende betingelser og

DK 175806 B1 I

native betingelser, og at proteinets aktivitet stadig bevares. Det ser I

ud til, at de isolerede, native proteiner kan være resultatet af H

proteolytisk nedbrydning og ikke translation af et trunkeret gen. H

Det mutein, som frembringes fra det trun kerede gen i plasmid I

5 pFC85, er imidlertid fuldt aktivt i analyser for DNA-polymerase Uge I

så vel som det, der frembringes fra DNA, som koder for fuldlængde- I

sekvensen. Eftersom det er klart, at visse N-terminalforkortede H

former er aktive, kan de anvendte genkonstruktioner eller expres- H

sion af polymerasen også inkludere de tilsvarende forkortede former H

10 af den kodende sekvens. H

Styrinqssekvenser og tilsvarende værter H

Prokaryoter repræsenteres hyppigst med forskellige stammer af H

E. coli. Der kan imidlertid også anvendes andre mikrobielle stammer, H

15 såsom bacilli, f.eks. Bacillus subtilis, forskellige arter af Pseudo- fl

monas eller andre bakterielle stammer. I sådanne prokaryotiske H

systemer anvendes plasmidvektorer, som indeholder replikationssteder I

og styringssekvenser hidrørende fra en art, som er kompatibel med H

værten. E^ coli transformeres f.eks. typisk under anvendelse af H

20 derivater af pBR322, et plasmid, som Bolivar et al. har afledt fra en H

E. coli art (Bolivar et al., Gene (1977) 2:95). pBR322 indeholder I

gener for ampicillin- og tetracyclinresistens, og tilvejebringer således H

yderligere markører, som enten kan . blive bevaret eller ødelagt ved H

konstruktion af den ønskede vektor. Almindeligt anvendte prokaryo- I

25 tiske styringssekvenser, som her defineres til at inkludere promo- H

torer for transcriptionsinitiering, eventuelt med en operator, sammen H

med ribosombindingsstedsekvenser, herunder sådanne almindeligt H

anvendte promotorer som β-lactamase (penicillinase) og lactose pro- H

motorsystemet (lac) (Chang et al., Nature (1977) 198:1056), tryp- H

30 tophanpromotorsystemet (trp-promotorsystemet)(Goeddel et al., H

Nucleic Acids Res. (1980) 8:4057) og den lambda-afledte P^-promotor H

(Shimatake et al., Nature (1981) 292:128) samt N-genribosombin-

dingsstedet, som er blevet gjort brugbar som en flytbar styrings- I

kassette, der omfatter en første DNA-sekvens, hvilket er P^-pro- I

35 motoren funktionsdygtigt koblet til en anden DNA-sekvens svarende I

til N __ opstrøms en tredie DNA-sekvens, som indeholder mindst ét H

restriktionssted, der tillader spaltning inden for seks basepar 3' for

NDD_-sekvensen. Ligeledes brugbar er phosphatase A systemet H

KB5 H

(phoA), som er beskrevet af Chang et al. i Europæisk patent pu- H

19 DK 175806 B1 blikation nr. 196.864, publiceret 8. oktober, 1986, overdraget til samme ansøger. Der kan imidlertid anvendes et hvilket som helst promotorsystem, som er kompatibel med prokaryoter.

Udover bakterier kan eukaryotiske mikrober, såsom gær, også 5 anvendes som værter. Laboratoriestammer af Saccharomyces cere-visiae, bagegær, anvendes mest, skønt en række andre stammer er almindelig tilgængelige. Skønt vektorer, som udnytter to micron replikationsorigin er illustreret (Broach, J. R., Meth. Enz. (1983) 101:307) kendes andre plasmidvektorer, der er egnet til gærexpres-10 sion (se f.eks. Stinchcomb et al., Nature (1979) 282:39, Tschempe et al., Gene (1980) 10:157 og Clarke, L. et al., Meth. Enz. (1983) 101:300). Styringssekvenser for gærvektorer inkluderer promotorer til syntesen af glycolytiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. (1968) 7:149; Holland et al., Biotechnology (1978) 17:4900).

15 Yderligere promotorer, som kendes inden for fagområdet, inklu derer promotoren for 3-phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. (1980) 255:2073), og promotorerne for andre glyeo-lytiske enzymer, såsom glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, hexokinase, pyruvatdecarboxylase, phosphofructokinase, glucose- i / i 20 6-phosphatisomerase, 3-phosphoglyceratmutase, pyruvatkinase, triosephosphatisomerase, phosphoglucoseisomerase og glukokinase.

Andre promotorer, som har den yderligere fordel, at transkriptionen er styret af vækstbetingelser, er promotorområderne for alkohol-dehydrogenase 2, isocytochrom C, sur phosphatase, nedbrydende 25 enzymer forbundet med nitrogenmetabolisme og enzymer, som er ansvarlige for udnyttelse af maltose og galactose (Holland, se ovenfor).

Det formodes også, at terminatorsekvenser er ønskelige i 3‘- i enden af de kodende sekvenser. Sidanne terminatorer findes i det 30 3'-ikke-translaterede omrade efter de kodende sekvenser i gærafledte j

gener. Mange af de illustrerede vektorer indeholder styringssekvenser afledt fra enolasegenet, som indeholder plasmid peno46 (Holland, I

. M. J. et al., J. Biol. Chem. (1981) 256:1385) eller LEU2-genet | hidrørende fra YEp13 (Broach, J. et al., Gene (1978) 8:121); en ! 35 hvilken som helst vektor, som indeholder en gærkompatibel promotor, | replikationsstart og andre styringssekvenser, er imidlertid egnet. j

Det er selfølgelig også muligt at udtrykke gener, som koder for ! polypeptider, i eukaryotiske værtscellekulturer hidrørende fra multi-celluiaere organismer. Se f.eks. Tissue Culture, Academic Press, ___ _M_;_______

I DK 175806 B1 I

I 20 i

B Cruz and Patterson, redaktører (1973). Brugbare værtscellelinier I

B inkluderer murine myelomaer N51-, VERO- og HeLa-celler samt kine- I

B siske hamsterovarleceller (CHO)-celler. Expressionsvektorer for I

B sidanne celler inkluderer almindeligvis promotorer og styringsse- I

B 5 kvenser, som er kompatible med pattedyrceller, sisom f.eks. de I

B almindeligt anvendte tidlige og sene promotorer fra Simian Virus 40 I

B (SV 40) (Fiers et al., Nature (1978) 273:113) eller andre virale I

B promotorer, såsom de, der hidrører fra polyoma, Adenovirus 2, I

B bovin papiioma virus eller aviære sarcoma virus eller immunoglobu- I

B 10 linpromotorer og varmechokpromotorer. Et system til expression af I

B DNA i pattedyrsystemer under anvendelse af BPV som en vektor I

B omtales i US patent nr. 4.419.446. En modifikation af dette system I

B omtales i US patent nr. 4.601.978. Generelle, aspekter vedrørende I

B pattedyrcelleværtssystemtransformationer er blevet beskrevet af I

B 15 Axel, US patent nr. 4.399.216. Det viser sig nu ogsl, at "enhan- I

B cer"-omrader er vigtige til optimering af expression; disse er al- I

H mindeligvis sekvenser, der findes opstrøms promotorområdet. Repli- I

kationsorigin kan, hvis det er nødvendigt, opnås fra virale kilder. I

H Imidlertid er integration i kromosomet en almindelig mekanisme for I

H 20 DNA-replikatipn i eukaryoter. I

Planteceller er nu også tilgængelige som værter, og der kan fis I

H styringssekvenser, som er forenelige med planteceller, såsom no- I

H palinsyntethasepromotoren og polyadenyleringsignalsekvenserne I

I (Depicker, A. et al., J. Mol. Appl. Gen. (1982) 2:361). I

25 Por nylig er der ydermere blevet beskrevet expressions- I

systemer, som udnytter insektceller, der anvender de styrings- I

H systemer, som er tilvejebragt med baculovirusvektorer (Miller, D. W. I

et al., i Genetic Engineering (1986) Setlow, J. K. et al., redak- I

tører, Plenum Publishing, bind 8, siderne 277-297). Disse systemer I

H 30 er også nyttige ved frembringelse af Taq-polymerase. I

T ransformationer I

Afhængig af den anvendte værtscelle udføres transformation med I

standardmetoder, som er egnede for sådanne celler. Calciumbehand- I

H 35 lingen, som udnytter calciumchlorid, hvilket er beskrevet af Cohen, I

H S. N., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1972 ) 69:2110, anvendes til I

H prokaryoter eller andre celler, som indeholder væsentlige cellevæg- I

H barrierer. Infektion med Agrobacterium tumefaciens (Shaw, C. H. et I

H al., Gene (1983) 23:315) anvendes på visse planteceller. For patte- I

21 DK 175806 B1 dyrceller uden sådanne cellevægge foretrækkes cafciumphosphatud-fældningsmetoden af Graham og van der Eb, Virology (1978) 52:546. Transformationer i gær udføres i overensstemmelse med den metode, der er beskrevet af Van Solingen, P. et al., J. Bact. (1977) 130:946 5 og Hsiao, C. L. et al., Proc. Natl. Afcad. Sci. (USA) (1979) 76:3829.

Konstruktion af et Xqtll-expressionsblbliotek

Strategien til isolering af DNA, som koder for de ønskede proteiner, såsom det DNA, der koder for Taq-polymerasen, under 10 anvendelse af bakteriof ag vektoren lambda gt11, er som følger. Et bibliotek kan konstrueres ud fra EcoR I -flankerede A[u I -fragmenter, som er frembragt ved fuldstændig fordøjelse af Thermus aqaticus DNA og indsættelse i EcoR I-stedet i lambda gt11 (Young and Davis,

Proc. Natl. Aca. Sci. USA (1983) 80:1194-1198). Fordi det unikke 15 EcoR I-sted i denne bakteriofag er lokaliseret i den carboxylterminale ende af β-galactosidasegenet udtrykkes indsat DNA (i den hensigtsmæssige rammeorientering) som protein fusioneret med β-galactosidase under styring af lactoseoperonpromotor/operatoren.

, Genomiske expressionsbtblioteker screenes derefter under an- ; 20 vendelse af antistofplaquehybridiseringsproceduren. En modifikation af denne procedure, omtalt som "epitopselektion", udnytter antiserum mod fusionsproteinsekvensen, der er kodes af fagen, til bekræftelse af identifikationen af hybridiseret plaques. Dette bibliotek af rekom-binerede fager kan således screenes med antistoffer, som genkender 25 den 86.000-90.000 dalton lange Taq-polymerase for at identificere den fag, som bærer DNA-segmenter, der koder for de antigene determinanter i dette protein.

5

Ca. 2 x 10 rekombinerede fager screenes under anvendelse af kanin Taq-polymerase totalantiserum. Ved denne primære screening 30 påvises positive signaler, og én eller flere af disse plaques oprenses fra kandidatplaques, som ikke reagerede med preimmunserum, men reagerede med immunserum, og de blev analyseret i nogle detaljer.

Til undersøgelse af de fusionsproteiner, som frembringes af den rekombinerede fag, blev der fremstillet lysogener af fagen i værten 35 Y1089. Ved induktion af lysogenerne og’ gelelektroforese af de frem komne proteiner, kan det iagttages, at hver lysogen kan producere et nyt protein, som ikke findes i andre lysogener, eller der kan være duplikatsekvenser. Fager, som indeholder positive signaler, opsamles; i dette tilfælde blev én positiv plaque opsamlet til yder-

I DK 175806 B1 I

I 22 I

I I

I ligere identifikation, og den blev udpladet igen ved lavere tætheder I

I til oprensning af rekombinenter, og de oprensede kloner blev analy- I

I seret ved hjælp af størrelsesklasse ved fordøjelse med EcoR I-restrik- I

I tionsenzym. Der kan derefter fremstilles prober af de isolerede, I

I 5 indføjede DNA-sekvenser, og de kan mærkes hensigtsmæssigt, og I

I disse prober kan anvendes i traditionelle koloni- eller plaquehybri- I

I diseringsanalyser, som er beskrevet i Maniatis et al., Molecular I

I Cloning: A Laboratory Manual (1982). I

I Den mærkede probe blev anvendt til at undersøge et andet I

I 10 genomisk bibliotek konstrueret i en Charon 35 bakteriofag (Wilhel- I

I mine, A. M. et al, Gene (1983) 26:171-179). Dette bibliotek blev I

fremstillet ud fra partielle fordøjelser af genomisk Thermus aquaticus I

DNA med Sau3A, og størrelsesfraktionerede fragmenter (15-20 kb) I

I blev klonet i BamHI-stedet i Charon 35-fagen. Proben blev anvendt I

H 15 til at isolere fager, som indeholder DNA, der koder for Taq-polyme- I

rasen. Én af de fremkomne fager, betegnet CH35:Taq nr.4-2, fand- I

H tes at indeholde hele gensekvensen. Delsekvenser, som koder for I

dele af genet, blev også isoleret. I

Μ H

20 Vektor konstruktion I

Konstruktion af egnede vektorer, som indeholder de ønskede I

kodende sekvenser og styringssekvenser, udnytter, standardmetoder I

til Tigering og restriktion, hvilke metoder er velkendte inden for I

fagområdet. Isolerede plasmider, DNA-sekvenser eller syntetiserede I

25 oligonukleotider spaltes, forsynes med hale og genligeres i den I

ønskede form. I

Stedspecifik DNA-spaltning udførtes ved behandling med det I

hensigtsmæssige restriktionsenzym (eller enzymer) under betingelser, I

som er generelt forstået inden for fagområdet, og under anvendelse I

30 af de oplysninger, som er angivet af producenterne af disse restrik- I

tionsenzymer, som kan fås kommercielt. Se f.eks. New England Bio- I

labs. Produktkatalog. Generet spaltes ca. 1 pg plasmid eller DNA- I

sekvens med én enzymenhed i ca. 20 μ! pufferopløsning; ved de I

H foreliggende eksempler anvendes typisk et overskud af restrik- I

35 tionsenzym for at sikre fuldstændig fordøjelse af DNA-substratet. I

Inkuberingstider på fra ca. en time til ca. to timer ved 37°C kan I

H anvendes, skønt variationer kan tolereres. Efter hver inkubering I

fjernes protein ved ekstraktion med phenol/chloroform, og behandling I

H kan efterfølges med etherekstraktion, og nukleinsyren udvindes fra I

DK 175806 B1 i 23 ; de vandige fraktioner ved udfældning med ethanol. Om ønsket kan j størrelsesseparation af de spaltede fragmenter udføres ved poly-acrylamidgelelektroforese eller agarosegelelektroforese under anvendelse af standardmetoder. En almen beskrivelse af størrelsessepara-5 tioner findes i Methods in Enzymoloqy (1980) 65:499-560.

Restriktionspaltede fragmenter kan forsynes med stumpe ender ved behandling med det store fragment af coli DNA-polymerase I (Klenow) i nærværelse af de fire deoxynukleotidtrlphosphater (dNTP'er) under anvendelse af inkuberingstider på fra ca. 15 til 25 10 minutter ved fra 20 til 25°C i 50 m(YI Tris pH 7,6, 50 mM NaCI, 10 mM MgCI^, 10 mM DTT og 50-100 μΜ dNTP'er. Klenow-fragmentet fylder ud ved de klæbrige S'-ender, men fordøjer fremstikkende 3‘-enkeltstrenge, selv om de fire dNTP'er er til stede. Om ønsket kan en selektiv reparation udføres ved kun at tilføre den ene eller 15 udvalgte dNTP'er inden for de begrænsninger, som dikteres af naturen af de klæbrige ender. Efter behandling med Klenow-fragmentet ekstraheres blandingen med phenol/chloroform og ethanol-præcipiteres. Behandling under passende betingelser med S1-nuklease resulterer i hydrolyse af enhver enkeltstrenget del.

/ 20 Syntetiske oligonukleotider kan fremstilles under anvendelse af triestermetoden ifølge Matteucci et al., (J. Am. Chem. Soc. (1981) 103:3185-3191) eller under anvendelse af automatiserede syntesemetoder. Kinasebehandling af enkeltstrenge forud for annelering (eng.: annealing) eller til mærkning opnås under anvendelse af et over^ 25 skud, f.eks. ca. 10 enheder poiynukleotidkinase til 1 nM substrat i nærværelse af 50 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCI.,, 5 mM dithio- threitol, 1-2 mM ATP. Hvis kinasebehandling er til mærkning af 32 ; proben, indeholder ATP en høj specifik aktivitet af γ- P.

Ligeringer udføres i voluminer på 15-30 μΙ under følgende 30 standardbetingelser og temperaturer: 20 mM Tris-CI, pH 7,5, 10 mM MgClg, 10 mM DTT, 33 pg/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCI og enten 40 μΜ ATP, 0,01-0,02 (Weiss) enheder T4-DNA-ligase ved 0°C (for ligering af “klæbrige ender") eller 1 mM ATP, 0,3-0,6 (Weiss) enheder T4-DNA-ligase ved 14°C (for ligering af “stumpe ender").

35 Ligering af Intermolekylære “klæbrige ender" udføres sædvanligvis ved total DNA-koncentrationer på fra 33 til 100 pg/ml (en total slutkoncentratlon på 5-100 nM). Ligeringer af intermolekylære stumpe ender (sædvanligvis under anvendelse af et 10 til 30 ganges mol-overskud af linkere) udføres ved en total slutkoncentration pi 1 μΜ.

I DK 175806 B1 I

I 24 I

I Ved vektorkonstruktion, hvortil anvendes "vektorfragmenter", I

I behandles vektorfragmentet sædvanligvis med bakteriel alkalisk ι I

phosphatase (BAP) for at fjerne 5‘-phosphatet og forhindre gen- I

I ligering af vektoren. BAP-fordøjelser udføres ved pH 8 i ca. 150 mM I

I + +2 I

5 Tris, i nærværelse af Na og Mg under anvendelse af ca. 1 enhed

I BAP pr. mg vektor ved 60°C i ca. en time. For at genvinde nu- I

I kleinsyrefragmenterne ekstraheres udfældningen med phenol/chloro- I

I form, og der udføres ethanolpræcipitering. Alternativt kan gen- I

ligering forhindres i vektorer, som er blevet dobbelt fordøjet ved I

10 yderligere restriktionsenzymfordøjelse af de uønskede fragmenter. I

I Modifikation af DNA-sekvenser I

For dele af vektorer, som hidrører fra cDNA eller genomisk I

I DNA, som kræver sekvensmodifikationer, anvendes stedspecifik, I

15 primerstyret mutagenisering. Denne metode er nu en standardmetode ! I

inden for fagområdet og udføres under anvendelse af en syntetisk I

I oligonukleotidprimer, som er komplementær med et enkeltstrenget fag I

DNA-stykke, som skal mutageniseres, med undtagelse af begrænset I

fejlparring, der repræsenterer den ønskede mutation. I korthed I

Η H

I 20 anvendes det syntetiske oligonukleotid som en primer til at styre I

I syntese af en streng, som er komplementær med fagen, og det frem- I

I komne, dobbeitstrengede DNA transformeres ind i en fagnærende I

I værtsbakterium. Kulturer af den transformerede bakterium udplades i I

I topagar, hvilket tillader pjaquedannelse fra enkeltceller, som rummer I

I 25 fagen. I

Teoretisk vil 50% af de nye plaques indeholde fagen, der som en I

enkeltstreng har den muterede form; 50% vil have den oprindelige i I

sekvens. Plaquene overføres til nitrocellulosefiltre, og "aftrykkene" I

hybridiseres med kinasebehandlet, syntetisk primer ved en tempera- I

H 30 tur, som tillader hybridisering med en nøjagtig baseparring, men ved I

hvilken fejlparringerne med den oprindelige streng er tilstrækkelige I

til at forhindre hybridisering. Plaques, som hybridiserer med pro- I

ben, opsamles derefter og dyrkes, og DNA'et udvindes. I

i

35 Verifikation af konstruktionen I

I de neden for viste konstruktioner blev korrekt ligering for I

plasmidkonstruktion bekræftet ved først at transformere coli j I

stamme MM294 eller en anden egnet vært med ligeringsblandingen. I

I Vellykkede transformanter udvælges ved ampicillin- eller tetra- j I

2S : DK 175806 B1 j j cyclin-resistens eller en anden antibiotisk resistens eller under anvendelse af andre markører afhængig af plasmidkonstruktions-måden, hvilket en fagmand vil forstå. Der fremstilles derefter plas-mider ud fra transformanterne ifølge metoden beskrevet af Clewell, 5 D. B. et al., Proc, Natl. Aca. Sci. (USA) (1969) 62:1159, eventuelt efterfulgt af chloramphenicolamplifikation (Clewell, D. B., J. Bacte-riol. (1972) 110:667). Det isolerede DNA analyseres ved restriktionsanalyser og/eller sekventeres ved dideoxymetoden ifølge Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1977) 74:5463, som yderligere 10 er beskrevet af Messing et al.. Nucleic Acids Res. (1981) 9:309 eller ved metoden ifølge Maxam et al., Methods in Enzymology (1980) 65:499.

Eksempler på værter 15 Værtsstammer anvendt ved kloning og expression her er føl gende :

Til kloning og sekventering og til expression af konstruktioner under styring af de fleste bakterielle promotorer blev der som vært anvendt E^ coli stamme MM294 opnået fra E^ coli Genetic Stock Cen- / 20 ter GCSC nr.6135. Til expression under styring af P^N^g^-promo- toren kan coli stamme Kl2 MC1000 lambda lysogen, N^N£gCl857 SusPqq, ATCC 39351 anvendes. Her blev der anvendt coli DG116, som blev deponeret hos ATCC (ATCC 53606) 7. april 1987.

Til M13-fagrekombinanter blev der anvendt E^ coli stammer, som 25 er følsomme over for faginfektion, såsom E_^ coli K12, stamme DG98.

DG98-stammen er blevet deponeret hos ATCC, 13. juli, 1984 og har deponeringsnummer 39768.

Pattedyrexpression kan udføres i COS-7, COS-A2, CV-1 og murine celler samt ved insektcellebaseret expression i Spodoptera 30 fruqipeida.

Stabilisering af enzymaktivitet

For at opnå langtidsstabilitet ml nærværende enzym opbevares i en puffer, som indeholder én eller flere ikke-ioniske, polymere 35 detergenter. Sådanne detergenter er almindeligvis de detergenter, som har en molekylvægt i området fra ca. 100 til 250.000, fortrinsvis fra ca. 4.000 til 200.000 dalton, og som stabiliserer enzymet ved en pH-værdi fra ca. 3,5 til ca. 9,5, fortrinsvis fra ca. 4 til 8,5. Eksempler på sådanne detergenter inkluderer de forbindelser, som er spe-

I DK 175806 B1 I

I I

cificeret på siderne 295-298 i McCutcheon's Emulsifiers & Detergents, H

I Nordamerikansk udgave (1983), publiceret af McCuthcheon Division H

I fra NIC Publishing Co., 175 Rock Road, Glen Rock, NJ (USA), som i H

I sin helhed er medtaget her ved denne henvisning. Detergenterne

I 5 udvælges fortrinsvis fra gruppen, som omfatter ethoxylerede fedt- H

I alkoholethere og laurylethere, ethoxylerede alkylphenoler, octyl- H

I phenoxypolyethoxyethanolforbindelser, modificerede, oxyethylerede H

I og/eller oxypropylerede, uforgrenede alkoholer, polyethylenglycol- H

monooleatforbindelser, polysorbatforbindelser og phenoliske fedt- H

I 10 alkoholethere. Nærmere bestemt foretrækkes Tween 20 fra ICI Arne- H

I ricas Inc. Wilmington, DE, hvilket er et polyoxyethyleret (20) sor- H

I bitanmonolaurat, samt Iconol NP-40, fra BASF Wyandotte Corp. H

Parsippany, NJ, hvilket er en ethoxyleret alkylphenol (nonyl). H

I Det termostablie enzym ifølge den foreliggende opfindelse kan H

I 15 anvendes til et hvilket som helst formål, ved hvilket et sådant enzym H

I er nødvendig eller ønskelig. I en speciel foretrukken udførelsesform H

I anvendes det foreliggende enzym i den amplifikationsprotokol, der H

I beskrives herefter. H

I 20 Amplifikationsprotokol H

I Den amplifikationsprotokol, som udnytter enzymet ifølge den H

I foreliggende opfindelse, kan være fremgangsmåden til amplifikation af

I eksisterende nukleinsyresekvenser, hvilket er emnet for europæisk H

I patent publikation nr. 200.362, se ovenfor. Det foreliggende enzym H

I 25 anvendes imidlertid fortrinsvis i den nedenfor beskrevne amplifika- H

I tionsproces. H

I Generelt omfatter amplif i kationsprocessen en kædereaktion for i H

I eksponentielle mængder i forhold til antallet af de involverede reak- H

I tionstrin at producere mindst én specifik nukleinsyresekvens under H

I 30 forsætning af, at (a) enderne af den ønskede sekvens er kendte i H

tilstrækkelige detaljer til, at oligonukleotider, som vil hybridisere H

med dem, kan syntetiseres, og (b) at en lille mængde af sekvensen H

I er tilgængelig til initiering af kædereaktionen. Produktet fra kæde- H

I reaktionen vil være en særskilt nukleinsyreduplex med ender, der H

I 35 svarer til enderne af de anvendte, specifikke primere. H

I Enhver nukleinsyrekilde kan i oprenset eller ikke-oprenset form H

I anvendes som udgangsnukleinsyren (-syrerne), forudsat at den

I indeholder eller formodes at indeholde den ønskede, specifikke nu- H

kleinsyresekvens. Ved fremgangsmåden kan f.eks. således anvendes H

27 DK 175806 B1 DNA eller RNA, inklusiv mRNA, hvilket DNA eller RNA kan være enkeltstrenget eller dobbeltstrenget. Desuden kan en DNA-RNA-hybrid, som indeholder én streng af hver, anvendes. En blanding af ! enhver af disse nukleinsyrer kan også anvendes, eller nuklein-5 syrerne, der er produceret ud fra en heri tidligere anvendt am-plifikationsreaktion, under anvendelse af den samme eller forskellige primere, kan anvendes således. Den specifikke nukleinsyresekvens, der skal amplificeres, kan være blot en fraktion af et større molekyle eller kan i begyndelsen være til stede som et særskilt molekyle, 10 således at den specifikke sekvens udgør hele nukleinsyren.

Det er ikke nødvendigt, at sekvensen, der skal amplificeres, i begyndelsen er til stede i ren form; den kan være en mindre fraktion af en kompleks blanding, såsom en del af det β-globingen, der findes i hel human DNA (som eksemplificeret i Saiki et al., Science, 15 230, 1530-1534 (1985)), eller en del af en nukleinsyresekvens fra en speciel mikroorganisme, hvilken organisme kan udgøre blot en meget lille del af en speciel biologisk prøve. Udgangsnukleinsyresekvensen kan indeholde mere end én ønsket specifik nukleinsyresekvens, som kan være ens eller forskellig. Amplifikationsprocessen er derfor ikke / 20 blot anvendelig til produktion af store mængder af én specifik nukleinsyresekvens, men også til samtidig amplifikation af mere end én forskellig, specifik nukleinsyresekvens, der er lokaliseret på samme eller forskellige nukleinsyremolekyler.

Nukleinsyren (nukleinsyrerne) kan opnås fra en hvilken som

25 helst kilde, f.eks. fra plasmider, såsom pBR322, fra klonet DNA

eller RNA, eller fra naturligt DNA eller RNA fra en hvilken som helst kilde, herunder bakterier, gær, virus, organeller, samt højere organismer, såsom planter eller dyr. DNA eller RNA kan ekstraheres fra blod, vævsmateriale, såsom chorion villi, eller amnionceller ved 30 hjælp af en række metoder, såsom de metoder, der er beskrevet af Maniatis et al., se ovenfor, side 280-281.

Hvis der anvendes prober, som er specifikke for en sekvens, som skal amplificeres og derefter påvises, kan cellerne anvendes direkte uden ekstraktion af nukleinsyren, hvis cellerne suspenderes 35 i hypotonisk puffer og opvarmes til ca. 90-100°C, indtil der sker cellelyse og dispersion af intracellulære komponenter, almindeligvis fra 1 til 15 minutter. Efter opvarmningstrinnet kan amplifikatlons-reagenserne tilsættes direkte til de lyserede celler.

I DK 175806 B1 I

I I

En hvilket som helst specifik nukleinsyresekvens kan produ- I

ceres ved amplifikationsprocessen. Det er kun nødvendigt, at et I

H tilstrækkeligt antal baser ved begge ender af sekvensen er kendt i I

H tilstrækkelige detaljer, således at der kan fremstilles to oligo- I

5 nukleotidprimere, som vil hybridisere til forskellige strenge af den

ønskede sekvens og ved relative positioner langs sekvensen, således I

H at et forlængelsesprodukt, der er syntetiseret fra én primer, kan, I

når den er separeret fra dens template (komplement), tjene som I

template for forlængelse af den anden primer til en nukleinsyre- I

10 sekvens med begrænset længde. Jo større viden man har om baserne I

ved begge ender af sekvensen, jo mere specifik kan primeren for I

målnukleinsyresekvensen gøres og jo mere effektiv kan fremgangs- I

måden derfor være. I

Det vil forstås, at betegnelsen "primer", som anvendt her, I

IS henviser til mere end én primer, navnlig i det tilfælde, hvor der er H

H nogen tvetydighed i informationen vedrørende den terminale sekvens I

(de terminale sekvenser) af det fragment, der skal amplificeres. I I

det tilfælde, hvor en nukleinsyresekvens f.eks. er udledt fra pro- I

teinsekvensinformation, vil der for hver streng blive anvendt en I

20 samling af primere, der indeholder sekvenser, som repræsenterer alle I

H mulige codonvariationer baseret pi degenereringen af den genetiske I

kode. έη primer fra denne samling vil være homolog med enden af I

H den ønskede sekvens, der skal amplificeres. I

H Oligonukleotidprimerne kan fremstilles under anvendelse af en I

25 hvilken som helst egnet fremgangsmåde, såsom f.eks. de ovenfor I

H beskrevne phosphotriester- og phosphodiestermetoder, samt automa- I

tiserede udførelsesformer deraf. I én sådan automatiseret udførelses- I

H form er diethylphosphoramiditer anvendt som udgangsmateriale, og de I

H kan syntetiseres som beskrevet af Beaucage et al., Tetrahedron Let- I

I 30 ters (1981), 22:1859-1862. én fremgangsmåde til syntetisering af I

oligonukleotider på et modificeret, fast bæremateriale er beskrevet i I

US patent nr. 4.458.066. Det er også muligt at anvende en primer, I

som er blevet isoleret fra en biologisk kilde (såsom ved en restrik- I

tionsendonukleasefordøjelse). I

H 35 Den specifikke nukleinsyresekvens produceres ved at anvende I

den nukleinsyre, der indeholder denne sekvens, som en template. I

H Det første trin involverer, at hver nukleinsyrestreng kontaktes med I

H fire forskellige nukleotidtriphosphater og én oligonukleotidprimer for I

H hver forskellig nukleinsyresekvens, som skal amplificeres eller på- I

29 DK 175806 B1 vises. Hvis de nukleinsyrer, som skal amplificeres eller påvises, er ONA, er nukleotidtriphosphaterne dATP, dCTP, dGTP og TTP. !

Nukleinsyrestrengene anvendes som en template til syntese af ! yderligere nukleinsyrestrenge. Denne syntese kan udføres under ! 5 anvendelse af en hvilken som helst egnet metode. Alment finder den sted i en pufret, vandig opløsning, fortrinsvis ved en pH-værdi på fra 7 til 9, mest fortrinsvis ca. 8. Der tilsættes fortrinsvis et molært overskud (for klonet nukleinsyre, sædvanligvis ca. 1.000:1 primer: template, og for genomisk nukleinsyre, sædvandligvis ca. 10 .1 10 primer: template) af de to oligonukleotidprimere ti! den puffer, som indeholder de adskilte templatestrenge. Det skal imidlertid forstås, at mængden af komplementær streng måske ikke er kendt, hvis den foreliggende fremgangsmåde anvendes til diagnostisk brug, således at mængden af primer i forhold til mængden af komplementær streng 15 ikke kan bestemmes med sikkerhed. Som en praktisk foranstaltning vil den tilsatte mængde primer almindeligvis være i et molært overskud i forhold til mængden af komplementær streng (template) når den sekvens, som skal amplificeres, findes i en blanding af komplicerede, langkædede nukleinsyrestrenge. Der foretrækkes et stort / 20 molært overskud for at forbedre processens virkningsf uldhed. ’

Koncentrationen af nukleotidtriphosphat er fortrinsvis 150-200 ! μΜ af hver i amplifikationspufferen, og MgC^ er tilstede i pufferen i i en mængde på fra 1,5 til 2 inM for at forøge reaktionens virknings- j fuldhed og specificitet. · 25 Den fremkomne opløsning behandles derefter på en måde, der

afhænger af om de nukleinsyrer, som skal amplificeres eller påvises, er dobbelt- eller enkeltstrengede. Hvis nukleinsyren er enkeltstren-get er det ikke nødvendigt at anvende noget denatureringstrin, og I

reaktionsblandingen holdes ved en temperatur, som fremmer hybridi-30 sering af primeren til dens komplementære målsekvens (template).

Sådanne temperaturer ligger almindeligvis fra ca. 35° C tii 65°C eller højere, fortrinsvis fra ca. 37 til 60°C, i en effektiv tidsperiode, almindeligvis fra et halvt minut til fem minutter, fortrinsvis fra et til tre minutter. Der anvendes fortrinsvis fra 45 til 58°C for Taq-poly-35 merase og primere, der er større end 15-merer, for at forøge specificiteten af primerhybridiseringen. Kortere primere kræver lavere temperaturer.

Den komplementære sekvens til den oprindelige enkelt-strengede nukleinsyre kan syntetiseres ved at tilsætte én eller to oligonukleo-

I DK 175806 B1 I

I I

tidprimere hertil. Hvis der tilsættes en hensigtsmæssig enkelt pri- I

mer, syntetiseres et primerforlængelsesprodukt i nærværelse af I

I primeren, det termostabile enzym og nukleotidtriphosphaterne. Pro- I

I duktet vil være delvis komplementært til den enkeltstrengede nu- I

5 kleinsyre og vil hybridisere med nukleinsyrestrengen til frembrin- I

H gelse af en duplex af strenge med uens længde, som derefter kan I

H separeres til enkeltstrenge som ovenfor beskrevet til frembringelse af I

H to enkelte, separerede, komplementære strenge. Alternativt kan der I

I tilsættes to egnede primere til den enkeltstrengede nukleinsyre og I

I 10 reaktionen kan udføres. I

Hvis nukleinsyren indeholder to strenge, er det nødvendigt at I

I separere strengene af nukleinsyren, før den kan anvendes som I

I template. Denne strengseparation kan udføres ved en hvilken som I

I helst egnet denatureringsmetode, inklusiv fysiske, kemiske eller I

15 enzymatiske metoder. Én foretrukken fysisk metode til separering af I

strengene af nukleinsyren involverer opvarmning af nukleinsyren til I

I den er fuldstændig (>99%) denatureret. Typisk varmedenaturering I

H involverer temperaturer i området på fra 90 til 105°C i tidsperioder I

H der almindeligvis ligger fra ca. 0,5 til 5 minutter. Den effektive I

I 20 denatureringstemperatur er fortrinsvis fra 90 til 100°C i fra 0,5 til 3 I

minutter. Streng-separation kan også induceres med et enzym fra I

den klasse af enzymer, der kendes som helicaser, eller enzymet I

RecA, som har helicaseaktivitet, og som ved tilstedeværelse af I

riboATP vides at denaturere DNA. De egnede omsætningsbetingelser I

25 for separering af nukleinsyrestrengene ved hjælp af helicaser er I

beskrevet af Kuhn Hoffmann-Berling, CSH-Quantitative Biology, I

43:63 (1978), og der gives en oversigt over metoderne ved anven- I

delse af RecA i C.Radding, Ann,Rev.Genetics., 16:405-37 (1982). I

Ved denatureringen frembringes to separerede, komplementære stren- I

30 ge med ens eller uens længde. I

Hvis den dobbeltstrengede nukleinsyre denatureres med varme, I

får reaktionsblandingen lov til at afkøle til en temperatur, som frem- I

H mer hybridiseringen af hver tilstedeværende primer til dens komple- I

mentære målsekvens (template). Den temperatur ligger sædvanligvis I

35 fra ca. 35°C til 65°C eller højere, afhængig af reagenserne, fortrins- I

vis fra 37 til 60°C, opretholdt i en effektiv tidsperiode, almindeligvis I

fra 0,5 til 5 minutter og fortrinsvis fra 1 til 3 minutter. Rent prak- I

tisk sænkes temperaturen simpelthen fra ca. 95° C til så lavt som I

H 37°C, fortrinsvis fra ca. 45 til 58°C for Taq-pol ymerase, og hybri- I

disering finder sted ved en temperatur inden for dette område. I

I DK 175806 B1

Hvad enten nukleinsyren er enkelt- eller dobbeltstrenget kan det termostabile enzym tilsættes ved denatureringstrinnet, eller når temperaturen nedsættes til eller ligger i det område, som fremmer hybridisering. Reaktionsblandingen opvarmes derefter til en tempe-5 ratur< ved hvilken aktiviteten af enzymet fremmes eller optimeres, |. det vil sige en temperatur, som er tilstrækkelig til at forøge en- J zymets aktivitet til at lette syntesen af primerforlængelsesprodukter fra den hybridiserede primer og template. Temperaturen skal faktisk være tilstrækkelig til at syntetisere et forlængelsesprodukt af hver TO primer, hvilket forlængelsesprodukt er komplementær til hver nu-kleinsyretemplate, men temperaturen må ikke være så høj, at den denaturerer hvert forlængelsesprodukt fra dens komplementære template (det vil sige at temperaturen almindeligvis er mindre end ca. 80°C til 90°C).

15 Hovedsagelig afhængig af den anvendte enzymtype og de an vendte nukleinsyretyper ligger den typiske temperatur, som er effektiv for denne syntese, almindeligvis fra ca. 40 til 80°C, fortrinsvis fra 50 til 75°C. Temperaturen ligger mere fortrinsvis fra ca.

65 til 75°C, når der anvendes en DNA-polymerase fra Thermus t 20 aquaticus. Den tidsperiode, som kræves til denne syntese, kan ligge fra ca. 0,5 til 40 minutter eller højere, hvilket hovedsageligt afhænger af temperaturen, længden af nukleinsyren, enzymet og kompleksiteten af nukleinsyreblandingen, fortrinsvis fra et til tre minutter. Hvis nukleinsyren er længere kræves almindeligvis en 25 længere tidsperiode. Tilstedeværelse af dimethylsulfoxid (DMSO) er ikke nødvendig eller anbefalelsesværdig, fordi det har vist sig, at DMSO hæmmer Taq-polymeraseenzymaktivitet.

Den nyligt syntetiserede streng og dens komplementære nukle-insyrestreng danner et dobbeltstrenget molekyle, som anvendes i de 30 efterfølgende trin i processen. I de næste trin adskilles strengene i det dobbeltstrengede molekyle ved varmedenaturering ved en temperatur, som er effektiv til at denaturere molekylet, men en temperatur, som ikke er så høj, at det termostabile enzym denatureres fuldstændigt og irreversibelt eller inaktiveres. Hovedsagelig afhængig 35 af enzymtypen og længden af nukleinsyren ligger denne temperatur almindeligvis fra ca. 90 til 105°C, mere fortrinsvis fra 90 til 100°C, og denatureringstiden ligger typisk fra 0,5 til fire minutter, hovedsagelig afhængig af temperaturen og nukleinsyrelængden.

--

SDK 175806 B1 I

til et niveau, som I

»lementære, enkelt- I

tidligere trin. En I

for (eller samtidig I

til en temperatur, I

termostabile enzym I

dukt, idet der som I

ig fra det tidligere I

orfængelsesproduk- I

m tidligere beskre- I

inutter, fortrinsvis I

idisering kan finde I

i afkøling efter de- I

e, hvor der anven- I

r fra 50 til 70°C. I

rengseparering og I

m gentages si ofte I

æde mængde af den I

af slutanvendelsen. I

e, det termostabile I

ter. Trinnene gen- I

brug vil antallet af I

eks. er. færre cyk- I

•es, er ren. Hvis I

er flere cyklusser I

eligt til pivisning I

ling gentages pro- I

mærkede, sekvens- I

lindst 5 gange. Når I

ant genomisk DNA, I

for at amplificere I

t tydeligt påviseligt I

iterfererer med på- I

vil mængden af den I

lere pi eksponentiel I

I DK 175806 B1 i

Det er ikke nødvendigt at tilsætte yderligere nukleotider, primere eller termostabilt enzym efter den initielle tilsætning, forudsat at enzymet ikke irreversibelt denatureres eller inaktiveres. i hvilket tilfælde det er nødvendigt at erstatte enzymet efter hvert 5 denatureringstrin. Tilsætning af sidanne materialer ved hvert trin vil imidlertid ikke på ugunstig mide påvirke reaktionen.

Når det er ønsket at frembringe mere end én specifik nuklein-syresekvens fra den første nukleinsyre eller blandinger af nukleinsyrer, anvendes det hensigtsmæssige antal af oligonukleotidprimere.

10 Hvis der f.eks. skal frembringes to forskellige specifikke nuklein-syresekvenser anvendes der fire primere. To af primerne er specifikke for den ene specifikke nukleinsyresekvens, og de to andre primere er specifikke for den anden specifikke nukleinsyresekvens.

Pi denne måde kan enhver af de to forskellige specifikke sekvenser 15 frembringes eksponentielt ved den foreliggende fremgangsmåde.

Efter den passende tid er gået til frembringelse af den ønskede ! mængde af den specifikke nukleinsyresekvens, kan reaktionen standses ved at inaktivere enzymet på kendt måde (f.eks. ved tilsætning af EDTA, phenol, SOS eller CHC1-) eller ved at separere komponen- i 3 20 terne i reaktionsblandingen.

Ampiifikationsprocessen kan udføres kontinuerligt. I én udførelsesform for en automatiseret proces kan reaktionsblandingen underkastes en temperaturcyklus, således at temperaturen er programmeret til at blive styret på et bestemt niveau i en bestemt tidsperiode.

25 Et sådant instrument til dette formål er en automatiseret ma skine til håndtering af amplifikationsreaktionen ifølge den foreliggende opfindelse. Dette instrument udnytter et væskehåndteringssystem under computerstyring til væskeoverføringer af enzym opbevaret ved en styret temperatur i en første beholder til en anden 30 beholder, hvis temperatur er styret af computeren for at tilpasses en bestemt inkuberingsprofil. Den anden beholder rummer nukleinsyre-sekvensen (-sekvenserne), som skal amplificeres, plus nukleotidtri-phosphaterne og primerne. Computeren omfatter en brugerinterface, gennem hvilken en bruger kan indføre procesparametre, som styrer 35 kendetegnene for de forskellige trin i amplifikationssekvensen, såsom inkuberingstiderne og -temperaturerne, mængden af enzym, som skal overføres, etc.

' En foretrukken maskine, som kan anvendes, udnytter temperaturcyklusser uden et væskehåndteringssystem, fordi enzymet ikke η

I DK 175806 B1 I

I I

I behøver at blive overført ved hver cyklus. En sidan maskine består H

I af følgende systemer: H

I 1. En varmeledende beholder til opbevaring af et givent antal H

I reagensglas, fortrinsvis 500 μΙ reagensglas, som indeholder reak- H

I 5 tionsblandingen af nukleotidtriphosphater, primere, nukleinsyre- H

H sekvenser og enzymer. H

I 2. En anordning til at opvarme, afkøle og holde den varme- H

I ledende beholder over eller under stuetemperatur, hvilken anordning . H

har en indgang til at modtage et styringssignal til styring af ved ' H

10 hvilken temperatur eller til hvilken temperatur beholderen opvarmes, H

afkøles eller holdes. (Disse kan være Peltier varmepumper, som kan H

fås fra Materials Electronics Product Corporation i Trenton, NJ eller

en vandvarmeudveksler.) H

3. En computer (f.eks. en mikroprocessor controller), koblet til H

H 15 indgangen for ovennævnte anordning, til frembringelse af signaler, H

som automatisk styrer amplifikationssekvensen, temperaturniveauerne H

H og temperaturprofilhældningerne og tidsforløbet. I

I en anden udførelsesform kan enzymet, der anvendes til syn- I

tese af primerforlængelsesprodukterne, immobiliseres i en søjle. De i I

H 1 I

20 andre omsætningskomponenter kan ved hjælp af en pumpe cirkuleres

kontinuerligt gennem søjlen og en varmespiral i serie. De producere- j I

H de nukleinsyrer kan således blive denatureret gentagne gange uden ! I

H inaktivering af enzymet. I

Amplifikationsprotokolien demonstreres skematisk nedenfor, hvor I

H 25 dobbeltstrenget DNA, der indeholder den ønskede sekvens [S], som I

består af komplementære strenge [S+] og (S ], anvendes som nu- I

H kleinsyren. Under den første og hver efterfølgende omsætningscyklus I

H vil forlængelse af hver oligonukleotidprimer på den oprindelige tem- I

plate producere ét nyt ssDNA-molekyleprodukt af ikke nærmere j I

H 30 bestemt længde, som slutter med kun en af primerne. Disse produk- I

H ter, der herefter henvises til som "lange produkter", vil akkumulere I

H på liniær måde; dvs. at mængden, der er til stede efter et vilkårligt I

antal cyklusser, vil være proportional med antallet af cyklusser. I

De lange produkter, der således er produceret, vil virke som I

35 templater for den ene eller den anden af oligonukleotidprimerne i I

efterfølgende cyklusser og vil producere molekyler med den ønskede I

sekvens [S+] eller [S ]. Disse molekyler vil også fungere som tem- I

plater for den ene eller den anden af oligonukleotidprimerne, hvilket I

frembringer yderligere [S+j og [S }, og en kædereaktion, som vil I

I DK 175806 B1 resultere i akkumuleringen af [S] med en eksponentiel hastighed i forhold til antallet af cyklusser, som kan vedligeholdes.

Biprodukter, som er dannet ved andre oligonukleotidhybridi-seringer end de tilsigtede er ikke selv-katalytiske (undtagen i sjæld-5 ne tilfælde) og akkumulerer således med liniær hastighed.

Den specifikke sekvens, der skal amplificeres, [S], kan angives skematisk som: [S + ] 5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC 3' 10 [S"] 3' TTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5'

De passende oligonukleotidprimere ville være:

Primer 1: GGGGGGGGGG

Primer 2: AAAAAAAAAA

15 således at hvis DNA, der indeholder (S} . . .zzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzz... i .. .ZZZZZZZZZZTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGZZZZZZZZZZ... 1 1 i 20 separeres i enkeltstrenge, og dets enkeltstrenge hybridiseres til primere 1 og 2, kan de efterfølgende forlaengelsesreaktioner katalyseres af en termostabil polymerase under tilstedeværelse af de fire nukleosidtriphosphater: 25 3' 5' i forlængelse <- GGGGGGGGGG primer 1 .. . .zzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXX CCCCCCCCCCzzzzzzzzz____ oprindelig template-streng* 30 oprindelig template-streng ____zzzzzzzz TTTTTTTTTTYYYYYYYYYY GGGGGGGGGGzzzzzzzzz____ primer 2 AAAAAAAAAA----> forlængelse 5' 3'

Ved denaturering af de to dannede duplexer er produkterne: i i 35

I DK 175806 B1 ; I

I 36 I

I 3' 51 I

I ____ZZZZZ2Z2ZZ2ZZZ2ZZZTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG I

I nyligt syntetiseret langt produkt 1 I

I 55' 31 I

I ____222222zzzAAAAAAA AAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzz I

I oprindelig templatestreng+ I

I 3' 5' I

I 10 ____zzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzz____ I

I oprindelig templatestreng I

I 5' I

I AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC2Z22222222 I

15 nyligt syntetiseret langt produkt 2 I

I Hvis disse 4 strenge fir lov at rehybridisere med primere 1 og 2 i I

den næste cyklus, vil den termostabile polymerase katalysere de I

følgende reaktioner: I

I 20 forlæn- I

Primer 2 5' AAAAAAAAAA -> ges her I

I 3'____zzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5' I

nyligt syntetiseret langt produkt 1 I

25 forlængelse <--GGGGGGGGGG 5' primer 1 I

I 5'____zzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzz____3' I

oprindelig templatestreng I

H Primer 2 5' AAAAAAAAAA -> forlænges I

30 3*.. . zzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzz____5‘ I

oprindelig templatestreng I

forlæn- I

GGGGGGGGGG 51 primer 1 I

M gelse her <- r I

35 5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXX CCCCCCCCCCzzzzzzz____3' I

H nyligt syntetiseret langt produkt 2 I

37 DK 175806 B1

Hvis strengene af de fire duplexer ovenfor separeres, findes følgende strenge: 5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC 3' nyligt syntetiseret [S+] 5 3' ----zzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5' langt produkt 1 syntetiseret i første cyklus 3‘ ____zzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5' 10 nyligt syntetiseret langt produkt 1 5' ----zzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzz____3' oprindelig templatestreng 15 i 5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzz____3' | nyligt syntetiseret langt produkt 2 3'____zzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzz____5' 20 oprindelig templatestreng 3' TTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5’ nyligt syntetiseret [S ] 25 5’ AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzz____3' langt produkt 2 syntetiseret i første cyklus

Det ses, at hver streng, som ender med oligonukleotidsekvensen af én primer og den komplementære sekvens af den anden, er den 30 specifikke nukleinsyresekvens [S], som det ønskes at producere.

Mængden af oprindelig nukleinsyre forbliver konstant i hele fremgangsmåden, fordi den ikke replikeres. Mængden af de lange produkter forøges llniært, fordi de kun produceres ud fra den oprindelige nukleinsyre. Maengden af den specifikke sekvens forøges 35 eksponentielt. Den specifikke sekvens vil således blive den dominerende form. Dette vises i den følgende tabel, som indicerer de relative mængder af de teoretiske typer, der er til stede efter n cyklusser, idet der for hver cyklus antages 100% effektivitet:

I DK 175806 B1 I

38 I Antal af dobbeltstrenge

I efter 0 til n cykler I

I Specifik I

I Cyklus antal Template Lange produkter sekvens [5} I

I S 0 I

I I

I 2 2 I

I 3 13 4 I

I 5 1 5 26 I

10 10 1 10 1013 I

I 15 1 15 32.752 I

20 1 20 1.048.555 I

I η 1 η (2Π-η-1) I

15 Når en enkeltstrenget nukleinsyre anvendes som templaten I

dannes kun 1 langt produkt pr. cyklus. I

En sekvens i en given sekvens kan blive amplificeret efter et I

givent antal amptifikationer til opnåelse af større specificitet for I

reaktionen ved, at der efter mindst én amptifikationscyklus tilsættes I

20 et sæt primere, som er komplementære til interne sekvenser (som I

ikke er ved enderne) af den sekvens, som skal amplificeres. Sådanne I

primere kan tilsættes på et hvilket som helst trin og vil tilvejebringe I

et kortere, amplificeret fragment. Alternativt kan der fremstilles et I

længere fragment ved at anvende primere med ikke-komplementære I

25 ender, men som har overlappende sekvens med de primere, der I

tidligere blev anvendt i amplifikationen. I

Den heri beskrevne fremgangsmåde kan anvendes til kloning af

en speciel nukleinsyresekvens for indføjelse i en egnet ekspressions- I

vektor. Vektoren kan derefter anvendes til transformering af en I

30 passende værtsorganisme til dannelse af genproduktet af sekvensen I

ved standardmetoder af rekombinant DNA-teknologi. I

Den heri beskrevne multiplikationsproces kan give en blanding I

af nukleinsyrer, som hidrører fra den oprindelige template-nuklein- I

syre, de forventede, amplificerede målprodukter og forskellige bag- I

35 grundsprodukter, som ikke er målprodukter. Det amplificerede pro- I

H dukt kan også være en blanding, hvis det oprindelige template-DNA I

indeholder multiple målsekvenser, såsom i et heterozygotisk, diploid I

H genom, eller når der er en familie af beslægtede gener. I

39 DK 175806 B1

De heri beskrevne primere kan være modificeret til at hjælpe til hurtig og specifik kloning af blandingen af DNA'er, der produceres ved amplifikationsreaktion. I en sidan modifikation findes der et restriktionssted i hver af primerne eller i den sekvens, som skal 5 amplificeres og klones. Fortrinsvis inkorporeres det samme eller forskellige restriktionssteder ved 5*-enderne af primerne, hvilket resulterer i restriktionssteder ved de to ender af det amplificerede produkt. Når det amplificerede produkt udskæres med de passende enzymer kan det amplificerede produkt derefter let indsættes i 10 plasmid- eller virusvektorer og klones. Denne kloning tillader analyse eller ekspression af individuelle amplificerede produkter, ikke en blanding.

Hvis der inkorporeres restriktionssteder i primerne, kan det samme restriktionssted anvendes for begge primere. Anvendelse af 15 forskellige steder muliggør imidlertid indsættelse af produktet i vektoren med en specifik orientering og undertrykker multiple indsætninger såvel som indsætninger, der stammer fra amplifikationer, der kun er baseret på én af de to primere. Den specifikke orientering er nyttig, når der klones i sekventerende, enkeltstrengede i 20 vektorer, nlr enkeltstrenghybridiseringsprober anvendes, eller når det klonede produkt udtrykkes.

Én metode til fremstilling af primerne er at vælge en primer-sekvens, som adskiller sig minimalt fra målsekvensen. Områder, i hvilke hver af primerne skal lokaliseres, bliver screenet for homologi 25 med restriktionssteder, der er passende for den ønskede vektor. Målsekvensen "CAGTATCCGA.. adskiller sig f.eks. med kun en base fra en, der indeholder et genkendelsessted for BamHI. En primersekvens udvælges, så den passer præcist med målet i dets 3‘-ende således, at den indeholder den ændrede sekvens og et re-30 striktionssted nær dets 5‘-ende (f.eks. "CAGgATCCGA. .hvor det lille bogstav symboliserer en fejiparring, i forhold til målsekvensen).

Denne minimalt ændrede sekvens vil ikke interferere med primerens evne til at hybridisere med den originale målsekvens og til initiering af polymeriseringen. Efter den første amplifikationscyklus kopieres 35 primeren, den bliver målsekvensen og parrer eksakt med nye primere.

Efter amplifikationsprocessen spaltes produkterne med passende restriktionsenzymer, restriktionsfordøjelsen separeres eventuelt fra ligationsinhibitorer, såsom nukleotidtriphosphaterne og saltene ved

I ΛΛ DK 175806 B1 I

H 40

H f.eks. at føre blandingen gennem en afsaltende søjle eller en molekyl- I

H væg tkromatografi søjle eller gennem en membran, og fordøjelsespro- I

H duktet (-produkterne), som indeholder den amplificerede sekvens, I

H som skat klones, indsættes ved ligering i en kloningsvektor, sSsom I

H 5 bakteriofag M13. Kloningsvektoren indeholder almindeligvis en selek- I

H terbar markør og kan eventuelt også indeholde en promotor. Genet I

H kan derefter sekventeres og/eller udtrykkes, hvis det koder for et I

H protein, under anvendelse af velkendte metoder. Genet kan også I

H sekventeres ved at tilsætte en hensigtsmæssig primer under ampli- I

H 10 fikationsprocessen, hvilken primer er komplementær med den ønskede I

del, som skal sekventeres. Primeren vil danne et forlængelsespro- I

dukt, og amplifikationsgraden med et sådant forlængelsesprodukt vil I

tilvejebringe sekvensinformation. j I

H En anden metode til fremstilling af primerne involverer at tage j I

15 3'-enden af primerne fra målsekvensen og tilføje det ønskede re- ' M

H

striktionssted (-steder) ved 5'-enden af primeren. For det ovenfor ! I

anførte eksempel kunne et genkendelsessted for Hindi 11 tilføjes til I

dannelse af sekvensen "cgaagcttCAGTATCCGA..hvor små bog- I

staver har samme betydning som beskrevet ovenfor. De tilføjede H

20 baser ville ikke bidrage til hybrtdiseringen i den første amplifika- I

H tionscyklus, men ville passe i efterfølgende cyklusser. De endelige I

H amplificerede produkter udskæres derefter med restriktionsenzym I

(-enzymer), klones og udtrykkes som beskrevet ovenfor. Genet, der I

amplificeres, kan f.eks. være human β-hæmoglobin eller humane HLA I

I 25 DQ-, DR- eller DP-or- og -β-gener. I

I 1 en alternativ, men mindre foretrukken og mindre effektiv I

kloningsfremgangsmåde, hvor der anvendes stump-ende-ligering i I

stedet for ligering med klæbrige ender (under anvendelse af restrik- I

I 30 tionsenzymer), anvendes den basale amplifi kationsprocedure uden H

hensyntagen tit restriktionsenzymer i de primere eller den sekvens I

I (de sekvenser), som skal klones. Trinnene skal imidlertid gentages I

I tilstrækkelig mange gange til at frembringe tilstrækkelig amplificeret I

I sekvens (amplificerede sekvenser) til effektuering af ligering. Stump- I

35 ende-Iigering kræver imidlertid, at der er større koncentrationer af I

I sekvens(er) og kloningsvektor(er) til stede end ved ligering med H

I klæbrige ender. Ydermere skal ligeringen finde sted i nærværelse af I

I en ligase, såsom T4-ligase, coli-ligase og ligase. Nlr det ampli- H

ficerede produkt er opnået, er ligeringsproceduren en standard- j H

DK 175806 B1 | 41 ' procedure under anvendelse af betingelser, som er velkendte for en fagmand.

Den kloningsmetode, som Ikke involverer stump-ende-ligering,

ArifAr·· r» r» aIIa·* rv\i · I f i A I f Vkt frtl ·» f f>lå — --, - - - — · •••O''·* »·”- . .. ----* ·“ · — — 5 ficerede produkt i kloningsvektoren.

Den foreliggende fremgangsmåde kan desuden anvendes til in vitro mutagenisering. Oligonukleotidprimerne behøver ikke at være præcis komplementære til nukieinsyresekvensen, som skal amplifice-res. Det er blot nødvendigt, at den er i stand til at hybridlsere 10 tilstrækkeligt godt til sekvensen til at blive forlænget af det termo-stabile enzym. Produktet fra en amplifikationsreaktion, hvor de anvendte primere ikke er præcis komplementære til den oprindelige template, vil indeholde sekvensen af primeren snarere end sekvensen af templaten, og derved indføre en in vitro mutation.. I yderligere 15 cyklusser vil denne mutation blive amplificeres med en uformindsket effektivitet, fordi ingen yderligere fejlparrede primerreaktioner kræves. Den således fremstillede mutant kan indsættes i en passende vektor ved molekylærbiologiske standardteknikker og kan overføre mutantegenskaber til denne vektor, såsom potentialet for at frem- i 20 bringe et ændret protein.

Fremgangsmåden til fremstilling af en ændret DNA-sekvens, som beskrevet ovenfor, kan gentages på det ændrede DNA under anvendelse af forskellige primere for således at Inducere yderligere sekvensændringer. På denne måde kan en serie af muterede sekvenser 25 gradvis produceres, hvori hver ny tilføjelse til serierne kan adskille sig fra den forrige i ringe grad, men fra den oprindelige DNA-sekvens i stadig større grad. På denne måde kan der i sidste ende laves ændringer, som ikke var mulige i et enkelt trin på grund af den manglende funktionsevne hos en meget fejlparrende primer.

30 Primeren kan desuden som én del af dens sekvens indeholde en ikke-komplementær sekvens, forudsat at en tilstrækkelig mængde af primeren indeholder en sekvens, som er komplementær til den streng, som skal amplificeres. En nukleotidsekvens, som ikke er komplementær til templatesekvensen (såsom f.eks. en promotor, en 35 linker, en kodende sekvens osv) kan f.eks. blive tilføjet til 5'-enden af en eller begge primere og derved tilhæftet til produktet fra ampli-f i kationsprocessen. Efter at forlængel sesprimeren er tilsat, gennem- ! 5 føres tilstrækkeligt mange cyklusser til opnåelse af den ønskede mængde af ny template, der indeholder den ikke-komplementære

I DK 175806 B1 I

42 B

B nukleotidindføjelse. Dette tillader produktion af store mængder af de I

B kombinerede fragmenter pS relativ kort tid (f.eks. to timer eller I

mindre) under anvendelse af en simpel teknik. H

B Den foreliggende fremgangsmåde kan også anvendes til at mu- I

5 liggøre påvisning og/eller karakterisering af specifikke nukleinsyre- I

B sekvenser, som er knyttet til infektiøse sygdomme, genetiske syg- I

domme eller cellulære sygdomme, såsom cancer, f.eks. oncogener. I

Amplifikation er nyttig, når mængden af nukleinsyre, som er til- I

gængelig for analyse er meget lille, som f.eks. ved prenatal diagnose I

10 for seglcelleanæmi under anvendelse af DNA opnået fra føtale celler. I

Amplifikation er navnlig brugbar, hvis en sådan analyse skal udføres fl på en lille prøve under anvendelse af påvisningsmetoder, hvortil der fl ikke anvendes radioaktivitet, hvilke metoder kan være iboende u- fl følsomme, eller hvor der anvendes metoder med radioaktivitet, men fl B 15 hvor man ønsker en hurtig påvisning. fl

fl For formålet med den foreliggende opfindelse kan genetiske H

fl sygdomme inkludere specifikke deletioner og/eller mutationer i geno- H

misk DNA fra en hvilken som helst organisme, såsom f.eks. segl- H

celleanæmi, or-thalassæmi, β-thalassæmi og lignende. Seglcelleanæmi H

20 kan let påvises ved oligomer-restriktionsanalyse som beskrevet i EP fl

patent publikation 164.054, publiceret 11. december, 1985, eller ved H

hjælp af en RFLP-lignende analyse efterfulgt af amplifikation af den H

hensigtsmæssige DNA-sekvens ved den foreliggende fremgangsmåde. I

or-thalassæmi kan påvises ved fraværet af en sekvens og .β-thalassæm.i I

25 kan påvises ved tilstedeværelsen af et polymorft restriktionssted tæt H

koblet til en mutation, som fremkalder sygdommen. fl

Alle disse genetiske sygdomme kan påvises ved at amplificere fl

den hensigtsmæssige sekvens og analysere sekvensen ved hjælp af H

Southern blot uden anvendelse af radioaktive prober. Ved en sådan H

fl 30 fremgangsmåde amplificeres f.eks. en lille prøve af DNA fra f.eks. I

fl amnionvæske, som indeholder et meget lavt niveau af den ønskede fl

sekvens, DNA'et skæres med et restriktionsenzym og analyseres med I

en Southern blotting metode. Anvendelsen af ikke-radioaktive prober fl

fl gøres lettere på grund af det høje niveau af det amplificerede signal. I

35 I en anden udførelsesform kan en lille prøve af DNA amplifi- fl

I ceres til et bekvemt niveau, og derefter udføres en yderligere cyk- H

fl lus med forlængelsesreaktioner, hvorved nukleotidderivater, som let B

B kan påvises (såsom P-mærkede eller biotinmærkede nukleotidtri- B

B phosphater) inkorporeres direkte i det endelige DNA-produkt, som B

43 DK 175806 B1 kan analyseres ved restriktionsanalyse og elektroforetisk separation eller en hvilken som helst anden egnet metode.

I en anden udførelsesform kan nukleinsyren udsættes for en bestemt restriktionsendonuklep«:*» forur! fnr ampllfikafior« Pfl-orcom on 5 sekvens, som er blevet skåret, ikke kan blive amplificeret, betyder tilstedeværelsen af et amplificeret fragment på trods af restriktion af DNA-prøven fraværet af et angrebssted for endonukleasen i den amplificerede sekvens. Tilstedeværelsen eller fraværet af en amplificeret sekvens kan påvises ved hjælp af en passende metode.

10 Praktisk anvendelse af denne metode kan illustreres ved dens anvendelse til at lette påvisningen af segl cel leanæmi ved hjælp af .

oligomerrestriktionsmetoden, som omtales her og i EP 164.054, se ovenfor, samt af Saiki et al., Bio/Technology, 3, siderne 1008-1012 (1985). Segicelleanæmi er en hæmoglobinsygdom, som fremkaldes af 15 en enkel baseparændring i den sjette codon for β-globingenet.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan også anvendes til direkte påvisning af enkeltbaseparvariationer i nuklein- i syresekvensen (såsom genomisk DNA) under anvendelse af sekvensspecifikke oligonukleotider. Ved denne fremgangsmåde påvises 20 sekvensvariationen, hvad enten den hidrører fra cancer, en infektiøs sygdom eller en genetisk sygdom, f.eks. en genetisk skade, direkte og eliminerer behovet for restriktionsfordøjelse, elektroforese og andre gelmanipulationer, som ellers er nødvendige. Anvendelsen af sekvensspecifikke oligonukleotider i et dot blot format efter am-25 plifikation, som her beskrevet, tilvejebringer forbedret probespe-cificitet og følsomhed; der kan opnås et fortolkbart signal med en 0,04 pg prøve på 6 timer. Hvis mængden af prøve, som afsættes på en membran, forøges til 0,1-0,5 pg kan der også anvendes ikke-isotopisk mærkede oligonukleotider i stedet for de radioaktive pro-30 ber, som anvendes ved de kendte metoder. Ydermere kan den foreliggende fremgangsmåde anvendes med sekvensspecifikke oligonukleotider, der har en størrelse på mindre end 19-merer, hvilket således gør det muligt at anvende mere diskriminatoriske sekvensspecifikke oligonukleotider.

35 Hvad angår genetiske sygdomme, kræver RFLP, at et polymorft restriktionssted er associeret med sygdommen, medens sekvensspecifikke oligonukleotider direkte påviser den genetiske skade og generelt er mere brugbare til analyse af sådanne sygdomme som hæmoglobin C sygdom, cr-1 -antitrypsin og β-thalassæmi, som skyldes en-

I DK 175806 B1 I

I I

keltbasemutationer. Ydermere kan oligonukleotider anvendes til at

skelne mellem genetiske varianter, som repræsenterer forskellige I

I alleiler (f.eks. HLA-typebestemmelse), hvilket indikerer anvendelig- I

H heden af et sekvensspecifikt, oligonukleotidbaseret HLA-typebestem- I

H 5 melseskit, som inkluderer et termostabilt enzym. I

Ved én udførelsesform for den foreliggende opfindelse, hvor en I

nukleotidsekvensvariation skal påvises, afsættes den prøve, som er I

amplificeret som ovenfor beskrevet under, anvendelse af én primer for I

hver streng af hver nukleinsyre, og som formodes at indeholde

10 nukleotidvariationen, direkte på en serie af membraner, og hver I

membran hybridiseres med en forskelligt mærket, sekvensspecifik I

oligonukleotidprobe. En fremgangsmåde til afsætning af prøven på I

membran er beskrevet af Kafotos et al., Nucleic Acids Research, I

7:1541-1552 (1979). I

15 I korthed kan den DNA-prøve, som fæstnes til membranen, I

forbehandles med en præhybridiseringsopløsning, som indeholder I

natriumdodecylsulfat, Ficoll, serumalbumin og forskellige salte, forud I

for at proben tilsættes. Derefter tilsættes en mærket oligonukleo- I

tidprobe, som er specifik for hver sekvensvariation, der skal på- I

20 vises, til en hybridiseringsopløsning i lighed med præhybridise- I

ringsopløsningen. Hybridiseringsopløsningen påføres membranen, og I

membranen udsættes for hybridiseringsbetingelser, som vil afhænge I

af probetypen og -længden, typen og koncentrationen af bestand- I

delene osv. Almindeligvis udføres hybridisering ved fra ca. 25 til I

25 75°C, fortrinsvis fra 35 til 65°C, i fra 0,25 til 50 timer, fortrinsvis I

H mindre end tre timer. Jo større stringentheden for betingelserne er, I

des større er den krævede komplementaritet for hybridisering mellem I

H proben og prøven. Hvis baggrundsniveauet er højt, kan stringent- I

heden forøges i overen stemmel se hermed. De stringente betingelser I

30 kan også inkorporeres under vask. I

Efter hybridlseringen vaskes prøven for uhybridiseret probe I

H under anvendelse af egnede metoder, såsom én eller flere vask med I

forskellige koncentrationer af standardsalinphosphat EDTA (SSPE- I

opløsninger) (180 mM NaCI, 10 mM NaHPC>4 og 1 M EDTA, pH 7,4) I

H 35 ved fra 25 til 75°C i fra ca. 10 min. til en time, afhængig af tem- I

^B peraturen. Mærkningen påvises derefter ved at anvende en hen- I

H sigtsmæssig påvisningsmetode. I

^B Det her anvendte sekvensspecifikke oligonukleotid er et oligo- I

nukleotid, som generelt fremstilles og udvælges som ovenfor be- j I

I

45 DK 175806 B1 skrevet for fremstilling og udvælgelse af primere. Som ovenfor beskrevet skal det sekvensspecifikke oli gonu kleotid omfatte området ! med sekvensen, som strækker sig over den nukleotidvariation, der

n£\/i CAQ r\ri rlon cl, al \/aaispscifik fCT den njklcjtidvcricticr.r wCT

5 påvises. Hvis det f.eks. er ønsket at påvise, om en prøve indeholder mutationen for seglcelleanæmi, vil der blive fremstillet et oligonukleotid, som indeholder det nukleotidsekvenssted, der er karakteristisk for normal β-globingen, og der vil blive fremstillet et oligonukleotid, som indeholder den nukleotidsekvens, der er karak-10 teristisk for seglcelleallelet. Hvert oligonukleotid vil blive hybridi-seret til duplikater af den samme prøve for at bestemme, om prøven indeholder mutationen. !

De polymorfe områder af HLA klasse 11-gener er lokaliseret til j

specifikke områder i den første exon og er flankeret med konser- I

i 15 verede sekvenser, således at der kan fremstilles oligonukleotidpri- j mere, som er komplementære til modstående strenge af de konser- | verede 5‘- og 3'-ender af den første exon.

Det antal oligonukleotider, som anvendes til påvisning af de polymorfe områder af HLA klasse 11-generne, vil afhænge af den 20 gentype, som har områder med baseparvariation, som kan være sammenklumpet eller spredt. Hvis områderne er sammenklumpede, sådan som det er tilfældet med HLADQ-α, anvendes ét oligonukleotid for hvert allel. Hvis områderne er spredte, sådan som det er tilfældet med HLA-DQ-β og HLA-DR-β, vil der blive anvendt flere end 25 én probe, som hver omfatter en allelvariant for hvert allel. I tilfælde med HLA-DQ-β og HLA-DR-β anvendes tre prober for de tre områder af locuset, hvor der kan forekomme allelvariationer. Til påvisning af insulinafhængig diabetes mellitus (IDDM) anvendes fire prober for j det andet exon i HLA-DR-β.

30 Haplotyper kan udledes ved segretionsanalyse i familier eller i nogle tilfælde ved direkte analyse af den individuelle DNA-prøve.

Specifikke allelkombinationer (haplotyper) af sekvensspecifikke oligo-nukleotidreaktiviteter kan identificeres i heterozygote celler under anvendelse af restriktionsenzymfordøjelse af det genomiske DNA 35 forud for amplifikation .

Hvis man f.eks. i ΟΡβ finder tre meget variable underområder ! A, S og C inden for et enkelt amplificeret område, og hvis der er 6 j forskellige sekvenser i hvert område (A1-6, Bl-6, Cl-6), så kan et ; s individ ved sekvensspecifik oligonukleotidprobeanalyse typebestemmes | I DK 175806 B1 I 46 I i DQp-locuset til at indeholde A1, A2; B2, B3; Cl, C4, med mulige

haplotypekombinationer på A1, B2, Cl; Al, B2, C4; A2, 82, Cl; I

I A2, B2, C4; A1, B3, C1; Al, B3, C4; Al, B2, Cl og Al, B2, C4.

Hvis det genomiske DNA fordøjes med et polymorft restriktions- I

5 enzym forud for amplifikation, og hvis enzymet skærer begge alleler I

mellem primerne, er der ingen reaktivitet med de sekvensspecifikke I

H prober på grund af manglende amplifikation, og resultatet er ikke I

H informativt. Hvis enzymet ikke skærer nogen af allelerne, er probe- I

resultaterne med fordøjet og ikke-fordøjet genomisk DNA de samme, I

10 og resultatet er ikke informativt. Hvis enzymet kun skærer det ene I

H al I el r kan man imidlertid udlede begge haplotyper ved at sammenligne j I

probereaktivitetsmønstrene på fordøjet og ikke-fordøjet DNA. I

Haplotyperne kan udledes ved at sammenligne sekvensspecifikke I

oligonukleotidreativiteter med ikke-skåret genomisk DNA og genomisk I

H 15 DNA, som er skåret med ét eller adskillige enzymer, som vides at I

være polymorfe eller at genkende steder mellem primerne. I

H Længden af det sekvensspecifikke oligonukleotid vil afhænge af I

H mange faktorer, herunder det specielle målmolekyle, som skal på- I

vises, oligonukteotidkilden og oligonukleotidsammensætningen. For det I

20 foreliggende formål indeholder det sekvensspecifikke oligonukleotid I

typisk fra 15 til 25 nukleotider, skønt det kan indeholde flere eller I

færre nukleotider. Skønt oligonukleotider, som er mindst 19 merer I

H lange, kan forøge specificitet og/eller følsomhed, kan prober, som er I

mindre end 19 merer, f.eks. 16 merer, vise større sekvensdiskrimi: I

25 nering, hvilket sandsynligvis skyldes, at en enkelt fejlparring her I

H er mere destabiliserende. Fordi amplifikation forøger specificitet, I

H således at en længere længde er mindre kritisk, og hybridiserings- I

H og vasketemperaturer kan være lavere ved den samme saltkoncen- I

H tration, foretrækkes det at anvende oligonukleotider, som er mindre I

30 end 19 merer lange. I

Når prøven først anbringes på membranen og derefter påvises I

H med oiigonukleotidet, skal oligonukleotidet være mærket med en egnet j I

H mærkningsenhed, som kan påvises spektroskopisk, fotokemisk, bio- I

kemisk, immunokemisk eller kemisk. Immunokemiske midler inkluderer I

35 antistoffer, som er i stand til at danne et kompleks med oligonukleo- I

H tidet under egnede betingelser, og biokemiske midler Inkluderer I

polypeptider eller lectiner, som er i stand til at danne et kompleks I

H med oligonukleotidet under passende betingelser. Eksempler inklu- I

derer fluoriserende farvestoffer, elektrontætte reagenser, enzymer, I

47 DK 175806 B1 som er i stand til aflejre uopløselige reaktionsprodukter eller blive pivist kromogenisk, sisom peberrodperoxidase, alkalisk phosphatase, 32 en radioaktiv mærkning, såsom P, eller biotin. Hvis der anvendes biotin, kan aer anvenaes en arstandsarm til at fæstne biotinen til 5 oligonukleotidet. Mærkningsenheden er fortrinsvis peberrodperoxidase.

Alternativt mærkes i et "omvendt" dot blot format mindst én af primerne og/eller mindst én af de fire nukleotidtriphosphater med en påviselig mærkning, således at den fremkomne, amplificerede sekvens 10 mærkes. Disse mærkede enheder kan være til stede i reaktionsblandingen i begyndelsen eller kan tilsættes under en senere cyklus i i amplifikationen til indføring af mærkningen i det amplificerede produkt. Derefter afsættes et umærket sekvensspecifikt oligonukleotid, som er i stand til at hybridisere med den amplificerede nuklein-15 syresekvens, hvis sekvensvariationen (-variationerne) (hvad enten normal eller mutant) er til stede, i pletter på (fæstnes til) membranen under præhybrisdiseringsbetingelser som ovenfor beskrevet.

Den amplificerede prøve tilsættes derefter til den forbehandlede membran under hybridiseringsbetingelser som ovenfor beskrevet.

/ 20 Endelig anvendes påvisningsmidler til at bestemme, om en amplificeret sekvens i nukleinsyreprøven er blevet hybridiseret til oligonukleotidet, som er fæstnet til membranen. Hybridisering vil kun finde sted, hvis den membranbundne sekvens, som indeholder variationen, er til stede i det amplificerede produkt, dvs. kun hvis en sekvens 25 er komplementær til et område i den amplificerede sekvens.

I en anden version af det "omvendte" dot blot format udføres amplifikationen uden at anvende en mærkning, som i det "fremadgående" dot blot format, som ovenfor beskrevet, og en mærket, sekvensspecifik oligonukleotidprobe, som er i stand til at hybridisere 30 med den amplificerede nukleinsyresekvens, der indeholder varia tionen, hvis den er til stede, afsættes i pletter på (fæstnes til) membranen under præhybridiseringsbetingelser som ovenfor beskrevet. Derefter tilsættes den amplificerede prøve til den forbe-. handlede membran under hybridiseringsbetingelser, som ovenfor 35 beskrevet. Derefter frigøres det mærkede oligonukleotid eller et fragment heraf fra membranén pi en sidan mide, at et påvisningsmiddel kan anvendes til at bestemme om en amplificeret sekvens i prøven hybridiserede til det mærkede oligonukleotid. Frigørelsen kan f.eks. finde sted ved en tilsætte et restriktionsenzym til membranen, r *

I DK 175806 B1 I

I 48

I hvilket enzym genkender et restriktionssted i proben. Denne frem- H

I gangsmåde, som kaldes oligomer restriktion, omtales i større detalje i I

I EP patent publikation nr. 164.054, publiceret 11. december, 1985. I

I både den "fremadgående" og "omvendte" dot blot metode ! I

I 5 inkluderer de genetiske sygdomme, . som kan påvises, specifikke I

deletioner, indsættelser og/eller substitutioner ved en hviken som I

i helst baseparmutation eller polymorfisme i nukleinsyrer, f.eks.

I genomisk DNA, for en hvilken som helst organisme. Eksempler på I

I sygdomme, i hvilken baseparvariation kendes, inkluderer segl- I

I 10 celleanæmi, hæmoglobin C sygdom, α-thalassæmi, β-thalassæmi og j I

I j lignende. Andre sygdomme, som kan påvises, inkluderer kræft- j I

I ! sygdomme, såsom de sygdomme, der involverer RAS-oncogener, j I

I f.eks. n-RAS-oncogenet, samt infektiøse sygdomme. I

En dot blot procedure kan også anvendes til HLA-typebestem- I

I 15 melse inden for vævstransplantation, til bestemmelse af sygdoms- I

I modtagelighed og til faderskabsbestemmelse. HLA klasse Il-generne, I

I som omfatter a- og β-generne fra HLA-DR-, HLA-DQ- og HLA-DP- I

I ! områderne, er meget polymorfe; deres genetiske kompleksitet på I

I | DNA-niveauet er væsentlig større end den polymorfisme, som for I

20 øjeblikket defineres ved serologiske typebestemmelser. Ydermere kan

H den foreliggende fremgangsmåde anvendes til at påvise fire DNA- I

j sekvenser, som koder for HLA klasse ΙΙ-β-proteiner (f.eks. DR8) I

| forbundet med insulinafhængig diabetes mellitus (IDDM). I korthed I

udvælges de fire DNA-sekvenser, som er forbundet med IDDM,

H 25 blandt gruppen bestående af: H

I 1) 5'-GAGCTGCGTAAGTCTGAG-3', I

I 2) 5'-GAGGAGTTCCTGCGCTTC-3' I

I 3) 5'-CCTGTCGCCGAGTCCTGG-3\ og I

I 4) 5'-GACATCCTGGAAGACGAGAGA-3' I

30 eller de DNA-strenge, som er komplementære hermed. Der kan frem- I

stilles sekvensspecifikke prober, som vil hybridlsere til én eller flere H

af disse sekvenser. H

H Forskellige infektiøse sygdomme kan diagnosticeres ved tilstede- I

H værelse af specifikke DNA-sekvenser, som er karakteristiske for den I

35 sygdomsfremkaldende mikroorganisme i kliniske prøver. Disse inklu- H

derer bakterier, såsom Salmonella, Chlamydia, Neisseria; vira, såsom I

hepatitis vira, og parasitter, såsom Plasmodium, som er anvarlig for I

malaria. I US patent genundersøgt certifikat 814.358.535, udstedt I

13. maj, 1986, til Falkow et al., omtales anvendelsen af specifikke M

49 DK 175806 B1 : DNA-hybridiserlngsprober til diagnosticering af infektiøse sygdomme.

Et relativt lille antal patogene organismer kan være til stede i en klinisk prøve fra en inficeret patient, og DNA'et ekstraheret fra disse patienter udgør masKe Kun en meget iiiie dei af del lulaie DiNA 5 i prøven. Specifik amplifikation af de mistænkte sekvenser forud for immobilisering og hybridiseringspåvisning af DNA-prøverne kan i høj grad forbedre følsomheden og specificiteten af traditionelle procedurer.

Rutinemæssig klinisk anvendelse af DNA-prober til diagnosti-10 cering af infektiøse sygdomme vil i høj grad blive simplificeret, hvis | der kunne anvendes ikke-radioaktivt mærkede probér som beskrevet j i EP nr. 63.879 til Ward. Ved denne fremgangsmåde påvises biotin- holdige DNA-prober ved hjælp af kromogene enzymer bundet til i avidinantistoffer eller biotinspecifikke antistoffer. Denne påvisnings- j 15 type er hensigtsmæssig, men forholdsvis ufølsom. Kombinationen af specifik DNA-amplifikation ifølge den foreliggende fremgangsmåde og anvendelsen af stabilt mærkede prober tilvejebringer den bekvemhed og følsomhed, der er nødvendig for at gøre fremgangsmåden ifølge Falkow og Ward anvendelig i en klinisk rutineopsætning.

20 En specifik anvendelse af amplifikationsteknologien til påvisning eller overvågning af AlDS-virus beskrives på følgende måde. Ampli-fikations- og påvisningsprocessen anvendes med primere og prober, som er udformet til at amplificere henholdsvis påvise nukleinsyre-sekvenser, som i det væsentlige er konserverede blandt.nukleinsyrer 25 i AlDS-vira og specifikke for nukleinsyrerne i AJDS-vira. Den sekvens, som skal påvises, skal således være tilstrækkelig komplementær til nukleinsyrerne i AlDS-vira til at initiere polymerisering, fortrinsvis ved stuetemperatur, i nærværelse af enzymet og nu-kleotidtriphosphater.

30 Ydermere kan proben være en biotinyleret probe, i hvilken biotinet er fæstnet til en afstandsarm med formlen: -Y-(CH2)2-0-l(CH2)x0]y-CH2CH2-HN-hvor Y er O, NH eller N-CHO, x er et tal på fra 1 til 4, og y er et tal på fra 2 til 4. Afstandsarmen er igen fæstnet til et psoralen 35 enhed med formlen: ch3 ch,- jttrx 0A0/yN0ACH3 ch3

I DK 175806 B1 I

I 50 I

Psoralenenheden interkalerer i og tværbinder en "hullet cirkel "-probe I

som beskrevet af Courage-Tebbe et al., Biochem. Biophys. Acta, 697 I

(1982) 1-5, I hvilket det enkeltstrengede hybridiseringsområde i den I

"gennemhullede" cirkel strækker sig over det område, som findes i I

H 5 primerne. Detaljerne for denne biotinyleringsprocedure og dot blot H

H procedure er beskrevet mere fuldt ud i til offentligheden overdraget i I

US patent nr. 4.582.789, udstedt 15. april, 1986, og US patent nr. I

I 4.617.261, udstedt 14. oktober, 1986. I

H Amplifikationsprocessen kan også anvendes til at frembringe I

10 tilstrækkelige mængder af DNA fra et enkelt kopi humant gen, så- I

ledes at påvisning med en enkel, ikke-speclfik DNA-farve, såsom I

H ethidiumbromid, kan anvendes til at diagnosticere DNA direkte. I

Ud over at påvise infektiøse sygdomme og patologiske abnor- I

H maliteter i organismernes genom, kan amplifikationsprocessen også I

15 anvendes til at påvise DNA-polymorfismer, som ikke er forbundet I

med nogen patologisk tilstand. I

Sammenfattende ses det, at amplifikationsprocessen tilvejebrin- ! I

ger en fremgangsmåde til at amplificere én eller flere specifikke I

nukleinsyresekvenser under anvendelse af en kædereaktion og et I

20 termostabilt enzym, i hvilken reaktion der frembringes primerforlæn- I

gelsesprodukter, som derefter kan fungere som templater for yder- I

ligere primerforlængelsesreaktioner. Fremgangsmåden er speciel H

brugbar til påvisning af nukleinsyresekvenser, som i begyndelsen I

kun er til stede i meget små mængder. I

25 De efterfølgende eksempler angives alene til illustrering og har I

' ikke til hensigt på nogen måde at begrænse opfindelsens rækkevidde. I

I disse eksempler er alle procentdele angivet i vægtprocent, hvis det

H er faste stoffer, og i volumenprocent, hvis det er væsker, med H

I mindre andet er angivet, og alle temperaturer er angivet i °C. I

I 30 I

I Eksempel 1 H

I I. Syntese af primerne H

I Følgende to oligonukleotidprimere blev fremstillet ved den neden- H

for beskrevne metode: H

I 35 5'-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3' (PC03)

I 5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-3* (PC04) I

I Disse primere, begge 20-merer, annelerer til modstående strenge af H

I det genomiske DNA, idet deres 5'-ender er separeret med en afstand H

på 110 basepar. H

DK 175806 B1 51 A. Automatiserede synteseprocedurer: Diethylphosphoramiditer, som er syntetiseret ifølge Beaucage og Caruthers (Tetrahedron Letters (1981) 22:1859-1862) blev sekventielt kondenseret til et nukleo-sidderivatiseret glasbæremateriale med styret porestørrelse. Frem- 5 gangsmSden omfattede af detritylering med trichloreddikesyre i ! dichlormethan, kondensering under anvendelse af benzotriazol som aktiverende protondonor og endeafslutning med aceteddikesyre-anhydrid og dimethylaminopyridin i tetrahydrofuran og pyridin. Cyklustiden var ca. 30 minutter. Udbytterne på hvert trin var i det 10 væsentlige kvantitative og blev bestemt ved opsamling og spektro-skopisk undersøgelse af den dimethoxytritylalkohol, som blev frigjort under detrityleringen.

B. Fjernelse af beskyttelsen fra oligodeoxyribonukleotider og oprensningsprocedurer: det faste bæremateriale blev fjernet fra søj- 15 len og udsat for 1 ml koncentreret ammoniumhydroxid ved stuetemperatur i 4 timer i et lukket reagensglas. Bærematerialet blev derefter fjernet ved filtrering, og den opløsning, som indeholdt det delvis beskyttede oligodeoxynukleotid, blev bragt til 55°C i 5 timer. Ammoniak blev fjernet, og resten blev påsat en præparativ polyacrylamid- t 20 gel. Der blev udført elektroforese ved 30 volt/cm i 90 min, hvorefter det bånd, som indeholdt produktet, blev identificeret ved UV-skyg-ning af en fluorescerende plade. Båndet blev udskåret og elueret med 1 ml destilleret vand natten over ved 4°C. Denne opløsning blev påsat en RP-HPLC-søjle og elueret med en 7-13% gradient af aceto- 25 nitril i 1% ammoniumacetatpuffer ved pH 6,0. Elueringen blev overvåget ved UV-absorbans ved 260 nm, og den hensigtsmæssige fraktion blev opsamlet, kvantificeret ved UV-absorbans i et fixeret volumen og inddampet til tørhed ved stuetemperatur i en vacuum-centrifuge.

30 C. Karakterisering af ollgodeoxyribonukleotlder: testdelmængder 32 af de oprensede oligonukleotider blev P-mærkede med polynukleo-tidkinase og γ- CP-ATP. De mærkede forbindelser blev undersøgt ved autoradiografi af 14-20% polyacrylamidgeler efter elektroforese i 45 min ved 50 volt/cm. Denne procedure bekræftede molekylvægten.

35 Basesammensætningen blev bestemt ved fordøjelse af oligodeoxyribo-nukieotidet til nukleosider under anvendelse af giftdiesterase og bakteriel alkalisk phosphatase og efterfølgende separation og kvantificering af de afledte nukleosider under anvendelse af en HPLC-søjle med omvendt fase og en mobil fase af 10% acetonitril og 1% ammoniumacetat.

r

I DK 175806 B1 I

I 52 I

H. Isolering af humant genomisk DNA fra en cellelinie H

I Højmolekylært, genomisk DNA blev isoleret fra en T-cellelinie, I

I Molt 4, som er homozygot for normal β-globin, og som kan fås fra H

I Human Genetic Mutant Cell Depository, Camden, NJ, som GM2219C, I

5 idet der stort set blev anvendt den metode, der er beskrevet af H

I Maniatis et al., se ovenfor, side 280-281. I

I III. Oprensning af en polymerase fra Thermus aquaticus H

I Thermus aquaticus, stamme YT1, som kan fås uden restriktion H

I 10 fra American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, I

I Rockville, MD, som ATCC nr. 25.104, blev dyrket i flasker i føl- I

I gende medium: H

I Natriumcitrat 1 mM I

I Kaliumphosphat, pH 7,9 5 mM

I 15 Ammoniumchlorid 10 mM H

Magnesiumsulfat 0,2 mM I

Calciumchlorid 0,1 mM I

Natriumchlorid 1 g/l H

I Gærekstrakt 1 g/l I

I 20 Tryptone 1 g/l I

I Glucose 2 g/l

I Ferrosulfat 0,01 mM I

I (pH-værdien blev indstillet til 8,0 forud for autoklavering.) I

I En 10 liter gæringstank blev inokuleret med kultur fra en I

25 podefiaske, som var dyrket natten over i ovennævnte medium ved I

I 70°C. I alt 600 ml fra podeflasken blev anvendt til at inokulere 10 I

M liter af det samme medium. pH-værdien blev styret ved 8,0 med I

ammoniumhydroxid med opløst oxygen ved 40%, der blev anvendt en I

I temperatur pi 70°C og en omrøringshastighed p§ 400 omdrejninger I

I 30 pr. minut. I

Efter vækst af cellerne blev de oprenset under anvendelse af I

protokollen (med små modifikationer) ifølge Kaledin et al., se oven- I

I for, i de første fem trin og under anvendelse af en anden protokol I

I ved det sjette trin. Alle seks trin blev udført ved 4°C. Fraktione- I

I 35 ringshastigheden på søjler var 0,5 søjler/time, og voluminerne af M

M gradienterne under elueringen var 10 søjlevoluminer. En alternativ I

og foretrukken oprensningsprotokol er angivet nedenfor i eksempel I

I I

53 DK 175806 B1 I korthed blev ovennævnte kultur af 7\_ aquaticus celler høstet ved centrifugering efter 9 timers dyrkning i sen logfase ved en celledensitet på 1,4 g tørvægt/l. Tyve gram af cellerne blev resus- nonHorflf i ΠΠ ml af nr. ----'---*-.j - c rn _>< ιιλι -h

------ · . » - .... — · nr. . I r VI f UVI11 UUJ IVU α « <^v «««(«· l|·^ ti *w « I pi I

5 7,5, 0,1 mM EDTA. Cellerne blev lyseret, og lysatet blev centri fugeret i to timer ved 35.000 omdrejninger pr. minut i en rotor ved 4°C. Supernatanten blev opsamlet (fraktion A), og den proteinfrak-j tion, som udfældede mellem 45 cig 75% mætning med ammoniumsulfat, blev opsamlet, opløst i en puffer, som bestod af 0,2 M kaliumphos-10 phatpuffer, pH 6,5, 10 mM 2-mercaptoethanol, og 5% glycerol, og blev endelig dialyseret mod den samme puffer til frembringelse af fraktion B.

Fraktion B blev påsat en 2,2 x 30 cm søjle med DEAE-cellulose, som var ækvilibreret med den ovenfor beskrevne puffer. Søjlen blev 15 derefter vasket med den samme puffer, og de fraktioner, som indeholdt protein (bestemt ved absorbans ved 280 nm) blev opsamlet.

Den kombinerede proteinfraktion blev dialyseret mod en anden puffer, som indeholdt 0,01 M kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, 10 mM

2-mercaptoethanol og 5% glycerol, til frembringelse af fraktion C.

/ 20 Fraktion C blev påsat en 2,6 x 21 cm søjle af hydroxyapatit, som var ækvilibreret med en anden puffer. Søjlen blev derefter vasket, og enzymet blev elueret med en lineær gradient af 0,01-0,5 M kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, som indeholdt 10 mM 2-mercaptoethanol og 5% glycerol. Fraktioner, som indeholdt DNA-polymeraseakti-25 vitet (90-180 mM kaliumphosphat) blev kombineret, koncentreret 4 gange under anvendelse af en Amiconcelle med omrøring og en YM10-membran, og blev dialyseret mod den anden puffer til frembringelse af fraktion D.

Fraktion D blev påsat en 1,6 x 28 cm søjle af DEAE-cellulose,

30 som var ækvilibreret med den anden puffer. Søjlen blev derefter vasket, og polymerasen blev elueret med en lineær gradient af 0,01-0,5 M kaliumphosphat i den anden puffer. Fraktionerne blev analyseret for kontaminerende endonukiease(r) og exonuklease(r) ved elektroforetisk påvisning af ændring i molekylevægt af fag λϋΝΑ 35 ell er superspiralsnoet plasmid-DNA efter inkubering med et overskud I

af DNA-polymerase (for endonuklease) og efter behandling med et restriktionsenzym, som spalter DNA'et i adskillige fraktioner (for exonuklease). Kun de DNA-polymerasefraktioner (65-95 mM kaliumphosphat), som havde minimal nukleasekontaminering, blev hældt

I DK 175806 B1 I

54 * sammen. Til denne pulje blev der tilsat autoklaveret gelatine i en

mængde på 250 pg/ml, og der blev udført dialyse mod den anden j I

puffer til frembringelse af fraktion E. ' I

I Fraktion E blev påsat et phosphocellulosesøjle og elueret med en I

I 5 100 ml gradient (0,01-0,4 M KCI gradient i 20 mM kaliumphosphat- I

puffer pH 7,5). Fraktionerne blev analyseret for kontaminerende I

endo/exonuklease(r), som ovenfor beskrevet såvel som for polyme- I

raseaktivitet (ved fremgangsmåden ifølge Kaledin et al.) og blev I

derefter hældt sammen. De sammenhældte fraktioner blev dialyseret I

10 mod den anden puffer, blev derefter koncentreret ved dialyse mod I

50% glycerol og den anden puffer. I

Molekylvægten af polymerasen blev bestemt ved SDS PAGE. I

Markerproteiner var phophorylase B (92-500), bovinserumalbumin I

(66.200), ovalbumin (45.000), kulsyreanhydrase (31.000), soja- I

15 bønnetrypsininhibitor (21.500) og lysozym (14.400). I

Foreløbige resultater antyder, at polymerasen har en molekyl- I

I vægt på ca. 86.00090.000 dalton, ikke 62.000-63.000 dalton, som I

H angivet i litteraturen (f.eks. af Kaledin et al.). I

Polymerasen blev inkuberet i 50 pi af en blanding, som inde- I

I 20 holdt 25 mM Tris-HCI pH 6,4 og pH 8,0, 0,1 M KCI, 10 mM MgCI2, 1 I

mM 2-mercaptoethanol, 10 nmol af hver af dGTP, dATP og TTP samt I

0,5 pCi (^H) dCTP, 8 pg "aktiveret” kalvethymus DNA og 0,5-5 I

H enheder polymerase. "Aktiveret" DNA er en nativ præparation af I

DNA efter delvis hydrolyse med DNase I indtil 5% af DNA'et var I

25 blevet overført til den syreopløselige fraktion. Reaktionen blev I

udført ved 70°C i 30 min og standset ved at tilsætte 50 μ| af en I

mættet, vandig opløsning af natriumpyrophosphat, som indeholdt I

H 0,125 M EDTA-Na2- Prøver blev behandlet og aktiviteten blev be- I

stemt som beskrevet af Kaledin et al., se ovenfor. I

30 Resultaterne viste, at ved pH 6,4 var polymerasen mere end I

halv så aktiv som ved pH 8,0. I modsætning hertil fandt Kaledin et I

H al., at ved pH ca. 7,0 havde det foreliggende enzym 8% af akti- I

H viteten ved pH 8,3. pH-profilen for det foreliggende termostabile I

enzym er derfor bredere end pH-profilen for enzymet, som blev I

H 35 isoleret af Kaledin et al. I

H Når én eller flere nukleotidtriphosphater blev elimineret fra en I

DNA-polymeraseanalysereaktionsblanding blev der observeret meget I

lidt, om nogen, aktivitet under anvendelse af det foreliggende en- I

zym, og aktiviteten stemte overens med den forventede værdi og med I

55 DK 175806 B1 et enzym, som udviste høj nøjagtighed. I modsætning hertil er den aktivitet, som observeres med enzymet ifølge Kaledin et al. (se ovenfor), ikke i overensstemmelse med den forventede værdi og lader formode, at der sker en feilinkoroorerinq af nukleotidtriphosphatfer).

5 IV. Amplifikationsreaktion

Ét mikrogram af det ovenfor beskrevne genomiske DNA blev fortyndet i en vandig reaktionsblanding med et begyndelsesvolumen på 100 μΙ og som indeholdt 25 mM Tris*HCI puffer (pH 8,0), 50 mM

10 KCI, 10 mM MgClg, 5 mM dithiothreitol, 200 pg/ml gelatine, 1 μΜ primer PC03, 1 μΜ primer PC04, 1,5 mM dATP, 1,5 mM dCTP, 1,5 mM dGTP og 1,5 mM TTP. Prøven blev opvarmet i 10 min ved 98°C for at denaturere det genomiske DNA, og blev derefter afkølet til stuetemperatur. Der blev tilsat 4 mikroliter af polymerasen fra 15 Thermus aquaticus til reaktionsblandingen, og ovenpå blev der lagt et lag af 100 μΙ mineralolie. Prøven blev derefter anbragt i aluminiumopvarmningsblokken i den oven for beskrevne maskine til væskehåndtering og -opvarmning under anvendelse af pipetter, som var programmeret til at levere væske, samt en temperaturstyringsanordning i 20 til effektuering af temperaturændringer.

DNA-prøven gennemgik 20 amplifikationscyklusser i maskinen, under gentagelse af den følgende programcyklus: 1) opvarmning fra 37°C til 98°C i opvarmningsblokken over en periode af 2,5 min, 25 2) afkøling fra 98°C til 37°C over en periode på tre minutter for at tillade, at primerne og DNA'et annelerede.

Efter den sidste cyklus blev prøven inkuberet i. yderligere 10 minutter ved 55°C for at afslutte den sidste forlængelsesreaktion.

30 V. Syntese og phophorylering af oligodeoxyribonukleotidprober

Der blev fremstillet en mærket DNA-probe, kaldt RS24, med følgende sekvens: 5' -*CCC ACAGGGC AGT AACGGC AGACTT CTCCTCAGGAGT C AG-3' (RS24) 35 hvor * indikerer mærkningen. Denne probe er 40 baser lang, strækker sig over fjerde til syttende codon i genet og er komplementær

A

med det normale β-globinalle! (β ). Det skematiske diagram af primer og probér angives nedenfor:

I DK 175806 B1 I

56

I y_110 bp _ y I

I n 8-globin ' I

PC03 RS24“ PC04 I

Denne probe blev syntetiseret ifølge de i afsnit I I eksempel I I

5 beskrevne fremgangsmåder. Proben blev mærket ved at kontakte 20 I

I pmol heraf med fire enheder T4-polynukleotidkinase og ca. 40 pmol I

I 32

γ- P-ATP (ca. 7.000 Ci/mmol) i et 40 μΙ reaktionsvolumen, som H

indeholdt 70 mM Tris-puffer (pH 7,6), 10 mM MgCI,,, 1,5 mM spermin I

og 10 mM dithiothreitol i 60 min. ved 37°C. Det totale volumen blev I

10 derefter indstillet til 100 μΙ med 25 mM EDTA og oprenset ifølge I

fremgangsmåden beskrevet af Maniatis et al., se ovenfor, side 466- H

467 over en 1 ml spindialysesøjle, som var ækvilibreret med Tris- I

I EDTA-puffer (TE-puffer) (10 mM Tris-puffer, 0,1 mM EDTA, pH I

8,0). TCA-præcipitering af reaktionsproduktet indikerede, at den H

15 specifikke aktivitet for RS24 var 4,3 pCi/pmol, og slutkoncentra- H

tionen var 0,118 pmol/μΙ. H

Η VI. Dot blot hybridiseringer I

Fire mikroliter af den amplificerede prøve fra afsnit IV og 5,6

20 μ| af passende fortyndinger af β-globin-plasmid-DNA beregnet til at I

repræsentere amplifikationseffektiviteter pi 70, 75, 80, 85, 90, 95 og I

I 100% blev fortyndet med 200 μΙ 0,4 N NaOH, 25 mM EDTA og blev I

H påsat i pletter på et nylonfilter ved først at befugte filteret med H

vand, anbringe det i et apparat til fremstilling af dot .blot, hvilket I

25 apparat holder filtrene på plads, påsætte prøverne og skylle hver I

I brønd med 0,1 ml 20 x SSPE (3,6 M NaCI, 200 mM NaH^PO^, 20 mM I

EDTA), som omtalt af Reed og Mann, Nucleic Acids Research, 13, I

I 7202-7221 (1985). Filtrene blev derefter fjernet, skyllet i 20 x SSPE I

I og varmebehandlet i 30 min ved 80°C i en vacuumovn. I

30 Efter varmebehandlingen blev hvert filter derefter kontaktet I

med 16 ml af en hybridiseringsopløsning, som bestod af 3 x SSPE, 5 I

x Denhardt's opløsning (1 x = 0,02% polyvinylpyrrolidon, 0,02% I

Ficoll, 0,02% bovinserumalbumin, 0,2 mM Tris, 0,2 mM EDTA, pH H

8,0), 0,5% SDS og 30% formamid, og blev inkuberet i 2 timer ved H

35 42°C. Derefter blev der tilsat 2 pmol probe RS24 til hybridiserings- I

opløsningen, og filteret blev inkuberet i 2 min ved 42°C. I

Endelig blev hvert hybridiseret filter vasket to gange med 100 I

ml 2 x SSPE og 0,1% SDS i 10 min ved stuetemperatur. Derefter blev I

filtrene behandlet én gang med 100 ml 2 x SSPE, 0,1% SDS ved 60°C I

i 10 min. I

H

57 DK 175806 B1

Hvert filter blev derefter autoradiograferet, og signalet var med lethed synligt efter 2 timer.

VII. Diskussion af autoradiogrammet 5 Autoradiogrammet af dot blot'ene blev analyseret efter to timer og sammenlignet med hensyn til intensitet med standardseriefortyn-

ding af β-globin-rekonstruktioner fremstillet ved Hael 11/MaeI-fordøjet A A

pBR:p , hvor β er vildtypeallelet, som beskrevet i Saiki et al.,

Science, se ovenfor. Analyse af reaktionsproduktet indikerede, at 10 den samlede amplifikationseffektivitet var ca. 95%, hvilket svarer til j en 630.000 ganges forøgelse i β-globinmålsekvensen.

Eksempel II

I. Amplifikationsreaktion 15 To 1 pg prøver af genomisk DNA ekstraheret fra Molt 4-celle- linien, som beskrevet i eksempel I, blev hver fortyndet i 100 pi reaktionsvolumen, som indeholdt 50 mM KCI, 25 mM Tris-HCl-puffer pH 8,0, 10 mM MgCI^, 1 μΜ primer PC03, 1 μΜ primer PC04, 200 pg/ml gelatine, 10% dimethylsulfoxid (volumenprocent), og 1,5 mM af 20 hver af dATP, dCTP, dGTP og TTP. Derefter . blev blandingen opvarmet i 10 min. ved 98°C for at denaturere det genomiske DNA, prøverne blev afkølet til stuetemperatur, og der blev til hver prøve tilsat 4 μΙ af polymerasen fra Thermus aquaticus, som er beskrevet i eksempel I. Over prøverne blev der lagt mineralolie for at forhindre 25 kondensation og fordampningstab.

Én af prøverne blev anbragt i opvarmningsblokken i den maskine, som er beskrevet i eksempel I, og blev udsat for 25 amplifika-tionscyklusser, idet følgende programcyklus blev gentaget: (1) opvarmning fra 37 til 93°C over en periode på 2,5 minutter, 30 (2) afkøling fra 93°C til 37°C over en periode på 3 minutter for at tillade primerne og DNA'et at annellere, og (3) opretholdelse af 37°C i to minutter.

Efter den sidste cyklus blev prøven inkuberet i yderligere 10 min ved 60°C for at afslutte den sidste forlængelsesreaktion.

35 Den anden prøve blev anbragt i den varmeledende beholder i en temperaturcyklusmaskine (opvarmning og afkøling). I denne maskine ! er den varmeledende beholder forbundet til en Peltier-varmepumpe, som justerer temperaturen opad eller nedad, og en mikroprocessorcontroller til automatisk styring af amplifikationssekvensen, tempe-

I DK 175806 B1 I

I 58 I

raturniveauerne, temperaturprofilhaeldningerne og tidsstyringen af H

temperaturen. H

Den anden prøve blev udsat for 25 amplifikationscyklusser, idet I

følgende programcyklus blev gentaget: H

I 5 (1) opvarmning fra 37 til 95°C over en periode på 3 minutter, H

(2) opretholdelse af 95°C i 0,5 minutter for at tillade, at dena- I

H turering finder sted, H

I (3) afkøling fra 95°C til 37°C over en periode på et minut, H

I (4) opretholdelse af 37°C i et minut. H

I 10 I

I II. Analyse H

I Der blev udført to forsøg for at analysere reaktionen, en dot H

I blot analyse og en agarosegelanalyse. H

Til dot blot analysen blev der fremstillet en mærket DNA-probe, H

I 15 kaldt RS18, med følgende sekvens: I

I S'-*CTCCTGAGGAGAAGTCTGC-31 (RS18) I

hvor * indikerer mærkningen. Denne probe er 19 baser lang, stræk- ! H

ker sig fra den fjerde til den syttende codon i genet og er komple- H

H

mentært til det normale β-globin-allel (β ). Det skematiske diagram

20 over primere og prober er angivet nedenfor: H

I J__110 bo v I

I n β-globin 7 I

I 25 PC03 RS18 f>C04 I

Denne probe blev syntetiseret" ifølge de i afsnit I i eksempel I I

beskrevne fremgangsmåder. Proben blev mærket ved at kontakte 10 I

pmol heraf med 4 enheder T4-polynukleotidkinase og ca. 40 pmol H

I 32 I

30 γ P-ATP (ca. 7.000 Ci/mmol) i en 40 μΙ reaktionsvolumen, som

I indeholdt 70 mM Tris-HCI-puffer (pH 7,6), 10 mM MgCI^, 1,5 mM I

spermin og 10 mM dithiothreitol i 60 min ved 37°C. Det totale volu- I

men blev derefter justeret til 100 μΙ med 25 mM EDTA, og prøven I

blev derefter oprenset efter fremgangsmåden ifølge Maniatis et al., H

35 se ovenfor, side 466-467, over en 1 ml spindialysesøjle, som var H

ækvilibreret med Tris-EDTA-puffer (TE-puffer) (10 mM Tris*HCI- I

puffer, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). TCA-præcipitering af reaktions- I

produktet indikerede, at den specifikke aktivitet for RS18 var 4,6 H

pCi/pmol, og slutkoncentration var 0,114 pmol/μΙ. H

59 DK 175806 B1

Fem mi kroliter af den amplificerede prøve fra afsnit I og en prøve amplificeret som ovenfor beskrevet med undtagelse af, at der blev anvendt Klenow-fragment.er af rnli DNA-polymerase I i stedet for det termostabile enzym, blev fortyndet med 195 μΙ 0,4 N NaOH, 5 25 mM EDTA og blev anbragt i pletter på to replika nylonfilter ved først at befugte filtrene med vand, anbringe dem i et apparat til fremstilling af dot blot, som holder filtrene på plads, påsætte prøverne, skylle hver brønd med 0,4 ml 20 x SSPE (3,6 M NaCI, 200 mM NaH^PO^, 20 mM EDTA), som omtalt af Reed og Mann, se oven-10 for. Filtrene blev derefter fjernet, skyllet i 20 x SSPE og varmebehandlet i 30 min. ved 80°C i en vacuumovn.

Efter varmebehandlingen blev hvert filter kontaktet med 6 ml af en hybridiseringsopløsning, som bestod af 5 x SSPE, 5 x Denhardt's opløsning (1 x = 0,02% polyvinylpyrrolidon, 0,02% Ficoll, 0,02% bo-15 vinserumalbumin, 0,2 mM Tris, 0,2 mM EDTA, pH 8,0) og 0,5% SDS og blev inkuberet i 60 min. ved 55°C. Derefter blev 5 μΙ probe RS18 tilsat til hybridiseringsopløsningen, og filteret blev inkuberet i 60 min ved 55°C.

Endelig blev hvert hybridiseret filter vasket to gange med 100 ; 20 ml 2 x SSPE og 0,1% SDS i 10 min ved stuetemperatur. Derefter blev filtrene behandlet endnu to gange med 100 ml 5 x SSPE, 0,1% SDS ved 60°C i 1) ét minut henholdsvis 2) tre minutter.

Hvert filter blev derefter autoradiograferet, hvorved signalet med lethed var synligt efter 90 minutter.

25 Ved agarosegelanalysen blev 5 μ! af hver amplifikationsreaktion sat på en 4% NuSieve/0,5% agarosegel i 1 x TBE-puffer (0,089 M Tris, 0,089 M borsyre og 2 mM EDTA) og blev underkastet elek-troforese i 60 min ved 100 volt. Efter farvning med ethidiumbromid blev DNA visualiseret ved UV-fluorescens.

30 Resultaterne viser, at de maskiner, som blev anvendt i eksem pel I og i dette eksempel, var lige effektive til at amplificere DNA'et, idet de viste særskilte højintense, 110-basepar lange bånd med lignende intensitet, hvilket svarede til den ønskede sekvens, såvel som nogle få andre særskilte bånd med en meget lavere inten-35 sitet. I modsætning hertil gav den amplifikationsmetode, som involverer reagensoverførsel efter hver cyklus under anvendelse af Klenowfragmentet fra E^ coli polymerase I, et DNA-smear, hvilket hidrørte fra den ikke-specifikke amplifikation af mange lkke-beslæg-tede DNA-sekvenser.

DK 175806 B1 I

Det forventes, at lignende forbedringer i amplifikation og påvis-. H

ning vil blive opnået ved at vurdere HLA-DQ-, DR- og DP-områder. H

Hvis amplifikationsreaktionspufferen i ovennævnte forsøg inde- H

holdt 2 mM MgC^ i stedet for 10 mM MgC^ og 150-200 μΜ af hver I

5 nukleotid i stedet for 1,5 mM af hver, og hvis den lavere temperatur H

p§ 37°C blev hævet tiJ 45-58°C under amplifikation, opnås en bedre H

specificitet og virkningsfuldhed for amplifikation. Ligeledes blev det H

fundet, at DMSO ikke var nødvendig eller foretrukken til ampiifika- H

tion. H

Eksempel 111 H

Amplifikation og kloning H

Til amplifikation af et 119 basepar langt fragment på det humane H

β-globin gen blev i alt 1 pg af hver af humangenomisk DNA, som er H

15 isoleret fra Molt 4-cellelinien eller fra GM206.4 cellelinien (som repræ- H

senterer en homozygot deletion af β- og δ-hæmoglobinområdet og som H

kan fås fra Human Genetic Mutant Cell Depository, Camden, NJ) som H

ovenfor beskrevet amplificeret i et 100 μΙ reaktion s vol umen, som H

indeholdt 50 mM KCl, 25 mM Tris*HCI pH 8, 10 mM MgCI_, 200 pg/ml I

j C' £

20 gelatine, 5 mM 2-mercaptoethanol, 1,5 mM af hver af dATP, dCTP, H

TTP og dGTP, samt 1 μΜ af hver af følgende primere: H

5'-CTTCTGcagCAACT GTGTTCACT AGC-3* (GH18) I

5'-CACaAgCTT CAT CCACGTTC ACC-31 (GH19) I

hvor små bogstaver betegner fejlparringer i forhold .til vildtype.- H

25 sekvensen til frembringelse af restriktionsenzymsteder. GH18 er et H

26 basepar langt oligonukleotid, som er komplementært til den nega- H

tive streng, og som indeholder et internt Pstl-sted. GH19 er et 29 I

basepar langt oligonukleotid, som er komplementært til plus-stren- H

gen, og som indeholder en intern Hmdl 11-genkendelsessekvens. Disse H

30 primere blev udvalgt ved først at screene områderne i genet for H

homologi med Pstl og Hindi! I-restriktionsstederne. Primerne blev H

derefter fremstillet som beskrevet i eksempel 1. H

Ovennævnte reaktionsblandinger blev opvarmet i 10 min ved H

95°C og derefter afkølet til stuetemperatur. I alt 4 μΙ af den i ek- I

35 sempel I beskrevne polymerase blev tilsat til hver reaktionsblanding, H

og derefter blev der over hver blanding lagt mineralolie. Reak- H

tionsblandingerne blev udsat for 30 amplifikationscyklusser med H

følgende program: H

I DK 175806 B1

2,5 min temper aturændring, 37 til 98°C 3 min temperaturændring, 98 til 37°C 2 min gennemvædning, 37°C

Cfter der· aicisLe vykius biev reaKtionsDlandingerne inkuberet i 5 20 min ved 65°C for at afslutte den sidste forlængelse. Mineralolien blev ekstraheret med chloroform, og blandingerne blev opbevaret ved -20°C.

I alt 10 μΐ af det amplificerede produkt blev fordøjet med 0,5 pg M13mp10-kloningsvektor, som kan fås offentligt, i et 50 μΙ volumen, 10 der indeholdt 50 mM NaCI, 10 mM Tris*HCI, pH 7,8, 10 mM MgC^, 20 enheder Pst! og 26 enheder Hindi 11 i 90 min ved 37°C. Reaktionen blev standset ved frysning ved -20°C. Voluminet blev indstillet til 110 μ| med TE-puffer, og 100 μΙ blev sat på en 1 ml BioGel P-4 spindialysesøjle. Der blev opsamlet en 0,1 ml fraktion og den blev 15 ethanolpræcipiteret.

(På dette tidspunkt blev det opdaget, at der var et β-globin-amplifikationsprodukt i GM2064-prøven. Efterfølgende forsøg sporede kontamineringskilden til primerne, enten GH18 eller GH19. Fordi der ikke var nogen anden primerkilde til rådighed, blev forsøget fortsat / 20 med den forståelse, at nogle klonede sekvenser ville hidrøre fra det kontaminerende DNA i primerne.)

Ethanol pel leten blev resuspenderet i 15 μΙ vand, derefter indstillet til 20 μΐ volumen, som indeholdt 50 mM Tris*HCI, pH 7,8, 10 mM MgClg, 0,5 mM ATP, 10 mM dithiothreitol og 400 enheder ligase.

25 [Én enhed af den mængde enzym, som er nødvendig for at give 50% ligering af Hindi 11-fordøjet lambda-DNA på 30 min ved 16°C i 20 μΙ ved en 5'-terminikoncentration på 0,12 mM (ca. 330 μΙ/ml)]. Denne blanding blev inkuberet i 3 timer ved 16°C.

Ti mikroliter af ligeringsreaktionsblandingen, som indeholdt Molt 30 4-DNA, blev transformeret kompetente celler af i E^ coli, stamme JM103, som kan fås offentligt. Den procedure, som blev fulgt til fremstilling af den transformerede stamme, er beskrevet i Messing, J. (1981) Third Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombi nant DMA, redaktør A. Walton, Elsevier, Amsterdam, 143-163. I alt 35 651 farveløse plaques (og 0 blå plaques) blev opnået. Blandt disse havde 119 en (+)-strengindføjelse (18%) og 19 havde en (-^streng-indføjelse (3%). Dette er en forøgelse på næsten 20 gange i forhold til procentdelen af β-globinposltive plaques blandt de primerpositive plaques fra den amplifikationsmetode, som anvender Klenow-frag- I DK 175806 B1

I 62 I

mentet af colj-polymerase I, hvor reaktionen forløber i 2 min ved I

I 25°C, hvorefter trinnene med opvarmning til 100°C i 2 min, afkøling, I

I tilsætning af Klenow-fragment og reaktion blev gentaget 9 gange. I

I Disse resultater bekræfter den forbedrede specificitet af amplifika- I

I 5 tionsreaktionen, som udnytter det foreliggende termostabile enzym. I

l et senere kloningsforsøg med GM2064 og de kontaminerede I

primere havde 43 ud af 510 farveløse plaques (8%) (+)-strengind- I

føjeisen. Dette antyder, at ca. halvdelen af de 119 kloner fra Molt 4 I

indeholdt den kontaminerende sekvens. I

10 10 af (+)~strengklonerne fra Molt 4 blev sekventeret. Fem I

havde normale vildtypesekvenser og fem havde en enkelt C til T-mu- I

H tation i den tredie position af den anden codon i genet (CAC til I

CAT). Fire af de kontaminerende kloner fra GM2064 blev sekvente- I

ret, og alle fire var normale. I

15 Restriktionsstedmodificerede primere blev også anvendt til at I

amplificere og klone og delvis sekventere det humane N-ras-oncogen I

og til at klone baseparsekvenser i HLA DQ-a-, DQ-β- og DR-p-ge- I

H nerne under anvendelse af ovennævnte metode. I

H Hvis koncentrationerne af MgClg og nukleotiderne igen nedsæt- I

20 tes til 2 mM henholdsvis 150-200 μΜ og den minimale cyklustempera- I

tur forøges fra 37°C til 45-58°C kan specificiteten og effektiviteten I

H af amplifikationsreaktlonen forøges. I

H Eksempel IV I

^B Gen-aenerhvervelse I

Η A. Identifikation af en DNA-sekvensprobe for Taq-polymerasegenet I

^B En specifik DNA-sekvensprobe for Taq pol-genet blev opnået I

efter immunologisk screening af et Agt11 ekspressionsbibliotek. 72 ! I

aquaticus DNA blev fordøjet fuldstændigt med Alul, ligeret med I

30 EcoRI 12-merer linkere (CCGGAATTCCGG, New England Biolabs), I

^B fordøjet med EcoRI og ligeret med dephosphoryleret, EcoRI-fordøjet I

Xgt11 DNA (Promega Biotech). Det ligerede DNA blev indesluttet I

(Gigapack Plus, Strategene) og transficeret i E^ coli K-12, stamme I

Y1090 (tilvejebragt af R. Young). I

35 Det initielle bibliotek med 2 x 10^ . plaques blev screenet I

(Young, R.A. og R.W. Davis (1983) Science, 222:778-782) med en I

1:2000 fortynding af kaninpolyklonalt antiserum rejst mod oprenset I

Taq-polymerase (se eksemplerne I og VI). Mulige ønskede plaques I

blev udpladet ved begrænset fortynding og screenet igen, indtil de I

63 DK 175806 B1 var homogene (ca. tre cyklusser). Fager blev oprenset fra mulige ønskede plaques, som ikke reagerede med præimmunserum, og som reagerede med immunserum.

Muligvis ønskede plaques blev anvendt til at lysogenisere E_^ 5 coli K-12, stamme Y1089 (R. Young). Lysogener blev screenet for frembringelse af et IPTG-inducerbart fusionsprotein (større end β-galactosidase), som reagerede med Taq-polymeraseantlserummet.

Fast fase, størrelsesfraktionerede fusionsproteiner blev anvendt til affinitetsoprensning af epitopspecifikke antistoffer fra det totale 10 polyklonale antiserum (Goldstein, L.S.B. et al. (1986) Cell Biol. 102:2076-2087).

De "fiskede", epitopselekterede antistoffer blev derefter anvendt i en Western analyse til at identificere, hvilke Agtll-fagkan-didater, som koder for DNA-sekvenser, der er unikt specifikke for 15 Taq-polymerase. Én Agtll-fagkandidat, betegnet Agt:1, selekterede specifikt antistoffer fra det totale kanin polylonale Taq-polymerase-antiserum, som reagerede unikt med både oprenset Taq-polymerase og råekstraktfraktioner, som indeholdt Taq-polymerase. Denne fag,

Agt:1 blev anvendt til yderligere undersøgelser.

j 20 Det ca. 115 bp lange EcoR I -adapterede Alu I-fragment af Ther- mus aquaticus-DNA blev mærket (Mamatis et al., se ovenfor) til frembringelse af en Taq-polymerasespecifik probe. Proben blev anvendt i Southern analyser og til at screene et randomiseret T. aquatlcus genomisk DNA-bibliotek.

25 B. Konstruktion og screening af et randomiseret Thermus aquaticus genomisk bibliotek

Lambda fag Charon 35 (Wilhelmine, A. M. et al., se ovenfor) blev anneleret og ligeret via dens kohæsive ender, blev fordøjet 30 fuldstændig med BamHI, og de annelerede arme blev oprenset fra "stuffer"-fragmenterne ved kaliumacetatdensitetgradientultracentri-fugering (Maniatis et al., se ovenfor). T\_ aquaticus DNA blev delvis fordøjet med - Sau3A, og størrelsesfraktionen på 15-20 kb blev oprenset ved succrosedehsitetgradientultracentrifugering. Det ran-35 domiserede genomiske bibliotek blev konstrueret ved at ligere målfragmentet og vektor-DNA-fragmentet i et molforhold på 1:1. DNA’et blev indesluttet og transficeret i coll K-12 stammerne LE392 eller K802. Et bibliotek med over 20.000 med over 99% rekombinanter, som i begyndelsen indeholdt fag, blev amplificeret på E_^ coli K-12, stamme LE392.

I DK 175806 B1 I

64

I Det genomiske CH35-Taq-fag bibliotek blev screenet (Maniatis et H

I al., se ovenfor) med den radioaktivt mærkede EcoRI-indføjelse fra H

I \gt11:1. Specifikt hybridiserende fagkandidatplaques blev oprenset

I og yderligere analyseret. En fag, betegnet CH35::4-2, frigjorde έ I

I 5 fire T\ aquaticus DNA-fragmenter ved fordøjelse med Hindil I (ca. H

8,0, 4,5, 0,8, 0,58 kb). I

I De fire Hindi 11 T. aquaticus DNA-fragmenter blev ligeret med I

I Hindi I l-fordøjet plasmid BSM13+ (3,2 kb, Vector Cloning Systems, I

San Diego) og blev individuelt klonet efter transformation af coli I

I 10 K-12, stamme DG98. I

I Det ca. 8,0 kb lange Hindlll DNA-fragment fra CH35::4-2 blev I

I isoleret i plasmid pFC82 (11,2 kb), medens det 4,5 kb lange Hindi 11 I

I DNA-fragment fra CH35::4-2 blev isoleret i plasmid pFC83 (7,7 kb). I

I Det blev vist, at coli, stamme DG98, som indeholdt pFC82, I

I 15 indeholdt en termostabil, højtemperatur-DNA-polymeraseaktivitet I

I (tabel 1). Ydermere syntetiserede disse celler et nyt polypeptid, som I

havde en molekylevægt pi ca. 60 kd, og som var immunologisk I

beslægtet med Taq-DNA-polymerase. I

I ' Det Taq-polymerasekodende området af det 8,0 kb lange I

I 20 Hindi 11-DNA-fragment blev yderligere lokaliseret til lac-promotoren I

I proximalt den 2,8 kb lange del fra Hindi 11 til Asp7l8 i det 8,0 kb I

I lange Hindi 11 -fragment. Dette område blev subklonet til frembringelse I

I af plasmid pFC85 (6,0 kb). Ved induktion med IPTG, syntetiserede I

E_^ coli DG98-celler, som indeholdt plasmid pFC85, op fil 100 gange I

I 25 mere termostabil, Taq-polymerase-beslægtet aktivitet (tabel 1) end I

I den oprindelige moderklon (pFC82/DG98). Skønt celler, som inde- I

I holder pFC85, syntetiserede en væsentlig mængde af en termostabil I

DNA-polymeraseaktivitet blev kun en del af Taq-pol-DNA-sekvensen I

I translateret, hvilket resulterede i akkumuleringen af et Taq-poly- I

30 merasebeslægtet polypeptid med en molekylvægt på ca. 60 kd. I

B 35 I

65 DK 175806 B1

Tabel 1 5|ς

Expression af en termostabll DNA-polymeraseaktivitet i coli

Prøve enheder ’/ml

5 -IPTG +IPTG

BSM13/DG98- - 0,02 PFC82/DG98 2,2 2,7 PFC85/DG98 11,9 643,8 Ϊ - 10 Cellerne blev dyrket til sen logfase (+/- IPTG, 10 mM), blev høstet, blev ultralydsbehandlet, blev opvarmet ved 75°C i 20 min, blev centrifugeret, og den klarede supernatant blev analyseret ved 70°C for DNA-polymeraseaktivitet.

En enhed = i nM dCTP inkorporeret pi 30 min.

15

Eksempel V

Ekspression af Taq-polymerase

Det termostabile gen ifølge den foreliggende opfindelse kan • udtrykkes i en hvilken som helst af en række bakterielle ekspres- 20 sionsvektorer, herunder DG141 (ATCC 39588) og pP, N__,_ATG.

Begge disse værtsvektorer er pBR322-derivater, som enten har en sekvens, der indeholder en tryptophan promotor-operator og et ribosombindingssted med en funktionsdygtig tilkoblet ATG startcodon (DG141), eller en sekvens, som indeholder λΡ^-promo toren og gen 25 N-ribosombindingsstedet, som er funktionsdygtigt koblet til en ATG- startcodon (pP NDDCATG). Begge de to værtsvektorer kan restrik- L Kd5 j tionsbehandles med Sacl, og forsynes med stumpe ender med Klenow-fragment eller S1-nuklease til konstruktion af et bekvemt restriktionssted for efterfølgende indsættelse af Taq-polymerasegenet.

30 Taq-polymerasegenet i fuld længde blev konstrueret ud fra DNA-indføjelsesfragmenterne subklonet i plasmiderne pFC83 og pFC85 på følgende måde. Vektor BSM13+ (som kan fås kommercielt fra j l

Vector Cloning Systems, San Diego, CA) blev fordøjet ved det | unikke Hindlll-sted, blev repareret med Klenow-fragment og dNTP'er j 35 og blev ligeret med T4-DNA-ligase til en Bqlll-octanukleotidlinker, 5'-CAGATCTG-3', og blev transformeret i coli, stamme DG98.

R +

Plasmider blev isoleret fra Amp lacZo -transformanter. En af klonerne blev fordøjet med Bqlll- og Asp7l8-restriktionsenzymer, og det store vektorfragment blev oprenset ved gelelektroforese.

DK 175806 B1 I

66

Dernæst blev plasmid pFC83 fordøjet med Bgll I og Hindi 11, og H

det ca. 750 basepar lange fragment blev isoleret. Plasmid pFC85 blev H

fordøjet med Hindi 11 og Asp7l8, og det ca. 2,8 kb lange fragment I

blev isoleret og forbundet ved en trevejsligering til det ca. 750 I

5 basepar lange Bql II - Hindi 11-fragment fra pFC83 og Bglll- Asp718- I

vektorfragmentet fra BSM13+. Denne ligeringsblanding blev anvendt I

til at transformere coli, stamme DG98 (ATCC 39.768, deponeret I

R I

13. juli, 1984), hvorfra Amp -kolonier blev selekteret, og der blev

isoleret et ca. 6,75 kilobase langt plasmid (pLSGl). lsopropyl-β-Ο- I

10 thiogalactosidinducerede (I PTG-inducerede) DG98-cellerf som inde- H

holder pLSGl, syntetiserede Taq-DNA-polymerase, som ikke kunne H

skelnes i størrelse fra det native enzym, der er isoleret fra H

aquaticus. Plasmid pLSGl kan derefter anvendes til at udvikle en H

enkeltstrenget DNA-template ifølge den fremgangsmåde, der anbefales H

15 af Vector Cloning Systems. H

Oligonukleotidstyret mutagenisering (se Zofler og Smith, Nuc. H

Acids Res. (1982) 10;6487-6500) kan derefter anvendes til at indføre I

et Sjahl-restriktionssted som en del af ATG-startcodonen (opstrøms H

det interne Hindi 11-sted i den kodende sekvens for Taq-polymerase- I

20 genet). På lignende måde kan et Bgl 11 -genkendelsessted indføres H

efter carboxylenden af genet (ca. 0,7 kb opstrøms Asp7l8-stedet) H

for at lette subkloning af Taq-polymerasegenet i en ekspressions- H

vektor. Efter at stedstyret mutagenisering er udført, kan genet iso- I

leres fra BSM13+-vektoren på et ca. 3,2 kb langt Sphl-BstEIl-re- I

- 25 striktionsfragment, behandles med Klenow-fragment og alle fire H

dNTP'er, og indsættes med T4-DNA-ligase (stump-ende-betingelser) i H

enten én af de tidligere nævnte eksp.ressionsvektorer, som er blevet

fordøjet med Sacl, repareret med Klenow-fragment og dNTP'er, og H

behandles med kalvetarmphosphatase for at udvikle dephosphory- I

30 lerede, stumpe ender. Denne ligeringsblanding anvendes til at trans- H

formere coli DG116, og de fremkomne transformanter blev screenet H

for frembringelse af Taq-polymerase. Ekspression af enzymet kan H

bekræftes ved Western-immunoblotanalyse og aktivitetsanalyse. H

En større del af Taq-polymerasegenet indeholdt i det ca. 2,8 kb H

35 lange Hindi 11- As£71 8-fragment af plasmid pFC85 kan udtrykkes H

under anvendelse af f.eks. plasmid vec* funktions- H

dygtig måde at koble det aminoterminale Hindi 11-restriktionssted, som H

koder for Tag- pol-genet, til en ATG-initieringscodon. Produktet af H

denne fusion vil ved expression give en trunkeret polymerase med en I

molekylvægt på ca. 66.000-68.000 dalton. I

67 DK 175806 B1

Denne specifikke konstruktion kan fremstilles ved at fordøje plasmid pFC85 med Hindi 11 og behandle med Klenow-fragment i nærværelse af dATP, dGTP og dCTP. Det fremkomne fragment behandledes yderligere med S1-nuklease for at fjerne hvilke som helst 5 enkeltstrengede forlængelser, og det fremkomne DNA blev fordøjet med Asp718 og behandlet med Klenow-fragment i nærværelse af alle fire dNTP'er. Det genvundne fragment kan ligeres under anvendelse af T4-DNA-ligase til dephosphoryleret plasmid pP^^^ATG, SOm var blevet fordøjet med Sacl og behandlet med Klenow-fragment I 10 nærværelse af dGTP til konstruktion af en ATG-stump ende. Denne ligeringsblanding kan derefter anvendes til at transformere E_^ coli DG116, og transformanterne blev screenet for frembringelse af Taq-polymerase. Igen kan ekspression bekræftes ved en Western immuno-blotanalyse og aktivitetsanalyse.

15

Eksempel VI Oprensning

Den termostabile polymerase kan oprenses direkte fra en kultur af Thermus aguaticus efter fremgangsmåden beskrevet ovenfor i / 20 eksemplet eller alternativt fra en bakteriekultur, som indeholder det med rekombinante metoder frembragte enzym med blot mindre nødvendige modifikationer ved præparationen af råekstraktet.

Efter høst ved centrifugering blev 60 g af cellerne resuspen-deret i 75 ml af en puffer, som bestod af 50 mM Tris-Cl pH 8, 1 mM 25 EDTA. Cellerne blev lyseret i en fransk presse ved (14.000-16.000 PSI), hvorefter der yderligere blev tilsat fire voluminer (300 ml) Tris-EDTA. Puffer A (β-mercaptoethanol til 5 mM og NP-40 og Tween 20 til 0,5% af hver (volumen/volumen) blev tilsat, og opløsningen blev indgående behandlet med ultralyd under afkøling. Den frem-30 komne, homogene suspension blev fortyndet yderligere med puffer A, således at slutvoluminet var 7,5-8 gange celleudgangsvægten; dette blev betegnet fraktion I.

Polymeraseaktiviteten i fraktion I og efterfølgende fraktioner v blev bestemt i en 50 pi blanding, som indeholdt 0,025 M TAPS HCI

35 pH 9,4 (20°C), 0,002 M MgClg, 0,05 M KCI, 1 mM 2-mercaptoethanol, 0,2 mM af hver af dGTP, dATP, TTP, og 0,1 mM dCTP (a-32P, 0,05

Cl/mM], 12,5 pg "aktiveret" laksesperm-DNA og 0,01-0,2 enheder af polymerasen (fortyndet i 10 mM Tris-HCI, pH 8, 50 mM KCI, 1 mg/ml autoklaveret gelatine, 0,5% NP-40, 0,5% Tween 20 og 1 mM 2-mer-

I DK 175806 B1 I

68

I captoethanol). Én enhed svarer til 10 nM produkt i 30 min. "Aktive- I

I ret" DNA er en nativ præparation af DNA efter delvis hydrolyse med I

I DNase I, indtil 5% af DNA'et var overført til den syreopløselige I

I fraktion. Reaktionen blev udført ved 74°C i 10 min, og derefter blev I

I 5 · 40 μΐ overført til 1,0 ml 50 pg/ml bærer-DNA i 2 mM EDTA ved 0°C. I

Et lige så stort volumen (1,0 ml) 20% TCA, 2% natriumpyrophosphat I

I blev tilsat. Efter 15 til 20 min ved 0°C blev prøverne filtreret gen- I

nem Whatman GF/C-skiver og blev vasket grundigt med koldt 5% I

I TCA-1% pyrophosphat, efterfulgt af koldt 95% ethanol, blev tørret og I

I 10 I

H Fraktion I blev centrifugeret i 2 timer ved 35.000 omdrejninger I

I pr. min. i en Beckmån TI 45 rotor ved 2°C, og den opsamlede I

H supernatant blev betegnet fraktion II. I

H Taq-polymeraseaktiviteten blev præcipiteret med Polymin P I

I 15 (BRL, Gaithersburg, MD) (10%, vægt/volumen, indstillet til pH 7,5 I

og autoklaveret) efter at den minimale mængde af Polymin P, som var I

nødvendig til at udfælde 90-95% af aktiviteten, var blevet bestemt,

hvilken mængde almindeligvis fandtes at ligge mellem 0,25% og 0,3% af I

slutvoluminet. I

20 Et passende niveau af Polymin P blev langsomt tilsat til fraktion I

II under omrøring i 15 min ved 0°C. Denne opløsning blev centrifu- I

I geret ved 13.000 rpm i 20 min i en Beckman JA 14 rotor ved 2°C. I

Supernatanten blev analyseret for aktivitet, og pelleten blev resus- I

penderet i 1/5 volumen 0,5 gange puffer A (fortyndet 1:2 med I

25 vand). Denne suspension blev recentrifugeret, og pelleten blev I

resuspenderet i 1/4 volumen puffer A, som indeholdt 0,4 M KCI. I

Denne suspension blev grundigt homogeniseret og henstod natten I

I over ved 4°C. Homogenatet blev centrifugeret som ovenfor, og den I

opsamlede supernatant blev. betegnet fraktion III. I

H 30 Proteinfraktionen blev opsamlet ved og blev "præcipitering" ved I

I 75% mætning med ammoniumsulfat, centrifugeret (ved 27.000 omdrej- I

I ninger pr. min., SW27-rotor, 30 min), og den hinde, som flød oven- I

I på, blev resuspenderet i 50 mM Tris-CI pH 8, 1 mM EDTA. Disse I

trin blev gentaget, og proteinsuspensionen blev dialyseret grundigt I

I 35 med P-cellepuffer (20 mM KPO^ pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 5 mM β-mer- I

captoethanol, 5% (vægt/volumen) glycerol og 0,5% (volumen/volumen) I

Η NP-40 og Tween 20), som indeholdt 80 mM KCI. I

Dialysatet blev overført til en centrifugeflaske, til hvilken der

H blev tilsat ethvert genvundet protein fra dialysesækkene skyllet med I

69 DK 175806 B1 P-cellepufferen, som indeholdt 80 mM KCI. Centrifugering blev udført ved 20.000 gange g, og tiden blev reduceret til 15 min. Su-pernatanten blev bevaret, og enhver resterende pellet blev vasket, ekstraheret med P-cellepuffer og 80 mM KCI og blev centrifugeret 5 igen. Supernatanterne blev derefter kombineret til frembringelse af fraktion IV.

Fraktion IV blev sat på en 2,2 gange 22 cm søjle af phospho-cellulose, som var ækvilibreret med P-cellepufferen, der indeholdt 80 mM KCI. Søjlen blev vasket (2,5-3 søjlevoluminer) med den samme 10 puffer, og proteinet blev elueret under anvendelse af en lineær gradient af fra 80 til 400 mM KCI i P-cellepuffer. De fraktioner, som indeholdt DNA-polymeraseaktivitet (ca. 0,18-0,20 M KCI) blev hældt sammen og koncentreret 3 til 4 gange på en Amiconcelle med omrøring og en YM30-membran. Cellen blev skyllet med P-cellepufferen 15 uden KCI og . tilsat til fraktionskoncentratet (0,15 M KCI indstillet slutvolumen) til frembringelse af fraktion V. 1

Fraktion V blev sat på en 5 ml Heparin Sepharose CL-6B-søjle (Pharmacia), som var ækvilibreret med P-cellepufferen og 0,15 M KCI. Søjlen blev vasket med 0,15 M KCI-puffer (3-4 søjlevoluminer), 20 og proteinet blev elueret med en lineær gradient fra 0,15 til 0,65 M KCI i P-cellepuffer. En 1:10 fortynding i fortyndingsmiddel uden gelatine blev fremstillet til SDS-PAGE-analyse, og en efterfølgende 1:20 fortynding i fortyndingsmiddel med 1 mg/ml gelatine blev fremstillet til brug ved enzymanalyser. Aktivitetsfraktionerne (elueret 25 ved ca. 0,3 M KCI) blev analyseret på superspiralsnoet DNA-tem-plate, for specifikke og ikke-specifikke endonukleaser/topoisomerase ved elektroforetisk påvisning af ændring af molekylevægt af superspiralsnoet plasmid-DNA efter inkubering med et overskud af DNA-polymerase. Exonukleasekontaminering blev påvist efter inkubering af 30 små lineære DNA-fragmenter. 1 topfraktioner blev et protein med en molekylvægt på ca. 88 kd fundet at være hovedbåndet. Hovedpuljen, betegnet fraktion VI, havde den højeste polymeraseaktivitet med minimal påviselig endonukleaseaktivitet, når denne pulje blev analyseret i 30 min ved 55°C med ca. 3 til 5 polymeraseenheder/600 ng 35 DNA.

Fraktion VI blev dialyseret mod 10 mM KPO^ pH 7,5, 5 mM p-mercaptoethanol, 5% glycerol, 0,2% NP-40 og 0,2% Tween 20 (HA-puffer). Den dialyserede prøve blev sat på en 3 ml søjle af hydroxy-apatit, og enzymet blev elueret med en lineær gradient af fra 10 til

I DK 175806 B1 I

I I

I 250 mM KPO^ pH 7,5, HA-puffer. DNA-polymeraseaktiviteten be- I

I gyndte at eluere ved 75 mM KPO^ med en top ved 100 mM ΚΡΟ^. I

I Aktive topfraktioner blev analyseret ved 1:100-1:300 fortynding. Som H

ved det tidligere kromatografitrin blev der fremstillet en 1:10 for- H

5 tynding i fortyndingsmiddel uden gelatine til SDS-PAGE-analyse. H

Fraktioner, som Ikke udviste signifikant endonuklease eller dobbelt- H

I strenget exonuklease, når de blev analyseret ved 55°C med 5 poly- I

I meraseenheder, blev hældt sammen og betegnet fraktion Vil, H

I Fraktion VII blev dialyseret mod en opløsning af 25 mM natri- I

10 umacetat pH 5,2, 5% glycerol, 5 mM β-mercaptoethanol, 0,1 mM ! I

i

I EDTA, 0,1% NP-40 og 0,1% Tween 20, indstillet til pH 5 ved stue- H

I temperatur. Den dialyserede prøve blev sat på en 2 ml OEAE-Tris- I

Acryl-M (LKB)-søjle, som var præækvilibreret og blev efterfølgende H

vasket med den samme puffer. Den fraktion, som indeholdt poly- I

15 meraseaktivitet, som ikke hæftede sig til søjlen, blev hældt sammen I

I og indstillet til 50 mM NaCI i den samme puffer til frembringelse af I

I fraktion VIII. I

I Fraktion VIII blev sat på en 2 ml CM-Tris-Acryl M (LKB)-søjle, I

I som var ækvilibreret med den samme puffer (25 mM natriumacetat, 50 H

20 mM NaCI, 5% glycerol, 0,1 mM EDTA, 0,1% NP-40 og 0,1% Tween 20). I

Søjlen blev vasket med 4 til 5 søjlevoluminer af den samme puffer, og H

enzymet elueredes med en lineær gradient fra 50 til 400 mM NaCI i I

natriumacetatpuffer. Polymeraseaktivitettoppen eluerede ud fra ca. I

0,15 til 0,20 M NaCI. Polymeraseaktiviteten blev analyseret ved 1:300 I

25 tiJ 1:500 fortynding med den første fortynding på 1:10 i fortyndings- I

middel uden gelatine til SDS-PAGE-analyse. En analyse på tværs af H

aktivitetstoppen på superspiralsnoet DNA-templater for specifik og H

H ikke-specifik endonuklease/topoisomerase under anvendelse af DNA- I

I polymeraseanalysesalte (25 mM TAPS-HCI pH 9,4, 2,0 mM MgCI^ og I

I 30 50 mM KCI) ved 74°C blev udført såvel som analyser for nukleaser I

på M13 ss DNA og pBR322-fragmenter. Aktive fraktioner, som ikke I

indeholdt påviselig nuklease (påviselige nukleaser) blev hældt sam- I

men og blev løbet på en sølvfarvet SDS-PAGE-minigel. Resultaterne I

viste et enkelt bånd med en molekylvægt på ca. 88 kd med en spe- I

I 35 cifik aktivitet på ca. 250.000 enheder/mg. I

H Denne specifikke aktivitet er mere end en størrelsesorden større I

end den, der er nævnt for den tidligere isolerede Taq-polymerase og I

er mindst en størrelsesorden større end aktiviteten for E_;_ coli poly- I

H merase I. I

71 DK 175806 B1

Eksempel VII

Taq-polymerasen, som var oprenset som beskrevet ovenfor i eksempel VI, fandtes at være fri for enhver kontaminerede Taq-endonuklease- og -exonukleaseaktivitet. Ydermere opbevares Taq-5 polymerasen fortrinsvis i en opbevaringspuffer, som indeholdt fra ca. 0,1 til ca. 0,5% volumen/volumen af hver af de anvendte ikke-ioniske, polymere detergenter. Mere fortrinsvis består opbevaringspufferen af 50% (volumen/volumen) glycerol, 100 mM KCI, 20 mM Tris-HCI pH 8,0, 0,1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 1 mM 10 dithiothreitol, 0,5% volumen/volumen NP-40, 0,5% volumen/ volumen Tween 20 og 200 pg/ml gelatine og opbevares fortrinsvis ved -20°C.

Den opbevarede Taq-polymerase blev fortyndet i en puffer, som bestod af 25 mM Tris Cl pH 8,0, 20 mM KCI, 1 mM β-mercapto-ethanol, 0,5% NP-40, 0,5% Tween-20 og 500 pg/ml gelatine. Der blev 15 derefter fremstillet en reaktionspuffer, som indeholdt 50 mM KCI, 10 mM Tris-CI, pH 8,3, 1,5 mM MgCI0, 0,01% (vægt/volumen) gelatine, | j

^ I I

200 μΜ af hver af dNTP, 1 μΜ af hver af primerne, som afgrænser j j

en 500 basepar lang m&lsekvens på en kontroltemplate fra bakteriofag j I

i K og 2,0-2,5 enheder Taq-polymerase/analyse i et slutvolumen på 100 i 20 μΙ. Template blev tilsat til reaktionspufferen, prøven blev anbragt i i et 0,5 ml polypropylenreagensglas, og oven på prøven blev der lagt 100 μΐ tung paraffinolie for at forhindre fordampning.

Der blev opnået mindst en 10^ ganges amplifikation, når de nedenstående betingelser blev anvendt under anvendelse af 1 ng 25 kontroltemplate (bakteriofag λ DNA), når målsekvensen repræsenterede ca. 1% af udgangsmassen af DNA.

Først blev templateblandingen denatureret i 1 min, 30 sekunder ved 94°C ved at anbringe reagensglasset i et varmebad. Derefter blev reagensglasset anbragt i et varmebad ved 37°C i to min. Der-30 efter blev reagensglasset anbragt i et varmebad ved 72°C i tre min og dernæst i varmebadet ved 94°C i et min. Denne cyklus blev gentaget for i alt 25 cyklusser. Ved afslutningen af den 25'ende cyklus blev varmedenatureringstrinnet ved 94°C udeladt og erstattet med en forlængelse af inkuberingstrinnet ved 72°C i yderligere tre min.

35 Efter afslutning af analysen fik prøverne lov til at afkøle til stuetemperatur og blev analyseret som beskrevet i de tidligere eksempler.

Templaten kan amplificeres optimalt med en forskellig koncentration af dNTP'er og en forskellig mængde Taq-polymerase. Størrelsen

I 72 DK 175806 B1 I

H af målsekvensen i DNA-prøven vil også direkte virke ind pi den I

minimale tid, som er nødvendig for passende forlængelse (72°C I

inkuberingstrin). Der skal udføres en optimering af temperatur- I

cyklusprofilen for hver individuel template, som skal amplificeres, I

5 for at opnå den maximale virkning. I

I Eksempel VIII I

Taq-polymerase, der var oprenset som beskrevet ovenfor i I

H eksempel I, blev formuleret ti i opbevaring som beskrevet i det tid- I

H 10 ligere eksempel, men uden de ikke-ioniske, polymere detergenter. Da I

enzymopbevaringsblandingen blev analyseret for aktivitet som be- I

skrevet i dette eksempel, fandtes blandingen at være inaktiv. Når I

NP-40 og Tween 20 blev tilsat til opbevaringspufferen blev den fulde I

enzymaktivitet genetableret, hvilket indikerede, at tilstedeværelsen I

15 af ikke-ioniske detergenter er nødvendige for at stabilisere enzym- I

formulationen. I

Eksempel IX I

Adskillige 1 pg prøver af humant genomisk DNA blev udsat for I

20 20 til 35 amplifikationscyklusser som beskrevet i eksempel V med I

ækvivalente enheder af enten Klenow-fragment eller Taq-polymerase I

og blev analyseret ved agarosegelelektroforese og Southern Blot. De I

primere, som blev anvendt i disse reaktioner, PC03 og PCQ4, dirige- I

rer syntesen af et 110 bp langt segment af det humane β-globingen. I

25 Klenow-polymeraseamplifikationerne udviste det smear af DNA, som I

typisk observeres med dette enzym, hvilket tilsyneladende skyldes I

den ikke-specifikke annelering og forlængelse af primerne på ikke- I

beslægtede genomiske sekvenser under hvad der i det væsentlige I

svarer til ikke-stringente hybridiseringsbetingelser (1 gange I

30 Klenow-salte ved 37°C). Ikke desto mindre blev der ved Southern I

blot påvist et specifik 110 bp langt β-globinmålfragment i alle ba- I

nerne. Et væsentligt anderledes elektroforetisk mønster blev set i de I

amplifikationer, der blev udført med Taq-polymerase, hvor det I

enkelte hovedbind var den 110 bp lange målsekvens. Denne be-

35 mærkelsesværdige specificitet skyldtes uden tvivl den temperatur, I

H ved hvilken primerne blev forlænget. I

Skønt anneleringstrinnet ligesom Klenow-fragmentamplifikatio- I

nerne blev udført ved 37°C, skulle temperaturen for de Taq-kataly- I

I serede reaktioner hæves til ca. 70°C, før enzymet udviste signifikant I

DK 175806 B1 ; 73 aktivitet. Under denne overføring fra 37 til 70°C diassocierede dårligt parrede primer-templatehybrider (som blev dannet ved 37°C), således at når reaktionen havde nået en enzymaktiverende tempe- ΓονϋΓ f ν'αΓ uci rvLii i et iiic^ci rumpiciiici iidtu i, ^uubu οι uS^dcii^cuC| Tur 5 forlængelse. Denne specificitet resulterede også i et større udbytte af målsekvensen end lignende amplifikationer gør med Klenow-frag-ment, fordi de ikke-specifikke forlængelsesprodukter konkurrerer effektivt om polymerasen, hvorved den mængde af 110-merer, som kan frembringes af Klenow-fragmentet, nedsættes.

10

Eksempel X

Der blev udført amplifikation på en prøve, som indeholdt 1 pg Molt 4-DNA, 50 mM KCI, 10 mM Tris pH 8,3, 10 mM MgCI2, 0,01% gelatine, 1 μΜ af hver af følgende primere (til amplifikation af et 150 15 bp langt område): 5'-CATGCCTCTTTGCACCATTC-3' (RS79) og j 5'-TGGTAGCTGGATTGTAGCTG-3‘ (RS80) 1,5 mM af hver af dNTP og 5,0 enheder Taq-polymerase pr. 100 · μΙ reaktionsvolumen. Der blev fremstillet 3 yderligere prøver, som ! > [ 20 indeholdt 2,5, 1,3 eller 0,6 enheder Taq-polymerase. Amplifikationen blev udført i den ovenfor beskrevne temperaturcyklusmaskine under 1 anvendelse af følgende cyklus for 30 cykluser: fra 70 til 98°C i et minut opbevaring ved 98°C i et minut 25 fra 98°C til 35, 45 eller 55°C i et minut opbevaring ved 35, 45 eller 55°C i et minut fra 35, 45 eller 55°C til 70°C i et minut opbevaring ved 70°C i 30 sekunder

Ved en anneleringstemperatur på 35°C gav 2,5 enheder/100 μΙ 30 Taq-enzymfortynding det bedste forhold mellem signal og baggrund ved agarosegelelektroforese i forhold til alle andre Taq-polymerase- koncentrationer. Ved 45°C gav 5 enheder/100 μΐ Taq-enzym det bedste forhold mellem signal og baggrund i forhold til de andre koncentrationer. Ved 55°C gav 5 enheder/100 μΙ Taq-enzym det 35 bedste forhold mellem signal og baggrund i forhold til de andre koncentrationer og i forhold til annelering ved 45°C samt forbedret udbytte. Taq-polymerasen har større specificitet og giver et bedre udbytte ved 55°C.

DK 175806 B1 I

74 I

I et separat forsøg blev Molt 4-DNA fortyndet i serie 10 gange i

DNA fra cellelinien GM2064, som ikke indeholdt β- eller δ-globin- I

sekvenser, hvilken cellelinie kan fås fra Human Genetic Mutant Cell H

Depository, Camden, New Jersey, ved forskellige koncentrationer, H

5 som repræsenterede varierende kopier pr. celle, og amplifikation blev

udført på disse prøver som beskrevet i dette eksempel ved annele- I

ringstemperaturer på 35°C og 55°C. Ved 35°C er det bedste, som I

kan ses ved agaroseelektroforese, 1 kopi i 50 celler. Ved 55°C er I

det bedste, som kan ses, 1/5.000 celler (en 100 ganges forbedring i I

10 forhold til den lavere temperatur), hvilket illustrerer det vigtige i at I

forøge anneleringstemperaturen for Taq-polymerasespecificitet under

disse betingelser. I

I et tredie forsøg blev DNA fra en cellelinie 368H, som inde- I

holdt HIV-positivt DNA, hvilken cellelinie kan fås fra B. Poiesz, H

15 State University of New York, Syracuse, NY, på lignende måde

fortyndet i DNA fra en SCI-cellelinie (deponeret hos ATCC, 19. H

marts, 1985; en EBV-transformeret β-cellelinie, der er homozygot for H

seglcelleallellet, og som mangler hvilke som helst HIV-sekvenser) ved I

forskellige koncentrationer, som repræsenterer varierende kopier pr. H

20 celle, og amplifikationen blev udført som beskrevet i dette eksempel H

ved anneleringstemperaturer på 35°C og 55°C og under anvendelse af I

primerne SK38 og SK39, som amplificerer et 115 bp langt område af H

HIV-sekvensen: H

5'-ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT-3' (SK38) og I

25 5'-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC-3‘ (SK39) I I

Resultaterne ved agarosegelelektroforese viste, at kun den H

ufortyndede 368H-prøve kunne påvises ved anneleringstemperaturen j

på 35°C, hvorimod mindst en 10 2 fortynding kan påvises med anne- I

leringstemperaturen ved 55°C, hvilket gav en 100 ganges forbedring H

30 med hensyn til påvisning. H

Eksempel XI H

Der blev fremstillet cDNA ud fra 1 pg kaninreticulocyt mRNA j

(Bethesda Research Laboratories) i et 100 μΙ reaktionsvolumen, som S I

35 indeholdt 150 mM KCI, 50 mM Tris-HCI (pH 8,3), 10 mM MgCI2, 5 mM j I

DTT, 0,5 mM dATP, 0,5 mM dCTP, 0,5 mM TTP, 0,5 mM dGTP, 0,2 I

pg oligo(dT)12-18 (Pharmacia), 40 enheder RNasin (Promega Biotec) H

og 5 enheder AMV revers transcriptase (BRL) og blev inkuberet i 30 H

min ved 42°C. Reaktionen blev standset ved opvarmning i 10 min ved I I

75 DK 175806 B1 95°C. Der blev tilsat to pg RNase A til prøven (2 μΙ af en 2 mg/ml opløsning i vand) og blandingen blev inkuberet i 10 min ved 37°C.

Der blev udført tre ampiifikationsreaktioner med Klenow-frag-mentet under anvendelse ar rorsKeiiige par af primere. rriinerp«u«cl 5 PC03/PC04 afgrænser et 110-bp langt produkt. Primerparret RS4S/ oligo(dT)25-30 afgrænser et 370 bp langt produkt, og primerparret PC03/oligo(dT)25-30 afgrænser et ca. 600 bp langt produkt. PC03, PC04 og RS45 er komplementære til det humane β-globingen og hver har to fejlparringer i forhold til kaningenet. PC03 og PC04 er be-10 skrevet i eksempel I. RS45 har sekvensen: 5'-CAAGAAGGTGCTA-GGTGCC-31.

Der blev udført ampiifikationsreaktioner med 1/20 (5 μΙ) af det ovenfor beskrevne cDNA i en 100 μ! reaktion s vol umen, som indeholdt 50 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI (pH 7,6), 10 mM MgCI2, 200 pg/ml 15 gelatine, 10% DMSO, 1 μΜ PC03 eller RS4S, 1 μΜ PC04 eller oligo-

(dT)25-30, 1,5 mM dATP, 1,5 mM dCTP, 1,5 mM TTP og 1,5 mM

dGTP). Prøverne blev opvarmet i 5 min ved 98°C, derefter afkølet til stuetemperatur og ovenpå blev der lagt 100 μΙ paraffinolie.

Prøverne blev udsat for 10 cyklusser af den automatiserede 20 amplifikation under anvendelse af den i eksempel ! beskrevne ma skine og følgende program: 1) opvarmning fra 37°C til 98°C. i en opvarmningsblok i løbet af 2,5 min (denaturering), 2) afkøling fra 98°C til 37°C i løbet af 3,0 min (annelering), 25 3) tilsætning af 1 enhed Klenow-fragment, og 4) opretholdelse af 37°C i 20 min (forlængelse).

Slutvoluminet af hver prøve var ca. 140 μΙ.

En tyvendedel (7 μΙ) af hver prøve blev analyseret ved etek-troforese på en 2% agarosegel. Efter farvning med ethidiumbromid 30 kunne der ses adskilte bånd i PC03/PC04- og RS45/oligo(dT)-prø- verne. Størrelserne af båndene stemte overens med de forventede længder: 110 bp for førstnævnte, ca. 370 bp for sidstnævnte. Der blev ikke set nogen tegn på amplifikation af et ca. 600 bp langt fragment med PC04/oligo(dT)-primerparret.

35 Indholdet af gelen blev ved Southern blot teknik overført på en

Genatran nylonmembran og hybridiseret med en nicktranslateret human β-globinprobe, pBR328:betaA, beskrevet i Saiki et al.,

Science, se ovenfor, under anvendelse af standardmetoder. Det fremkomne autoradiogram udvidede de tidligere nåede konklusioner -

I DK 175806 B1 I

76

H de 110 og ca. 370 bp lange fragmenter var β-globinspecifikke am- I

H plifikationsprodukter, og der blev ikke påvist væsentlig amplifikation I

H af det ca. 600 bp lange bånd. I

H Tre yderligere prøver blev amplificeret med Taq-polymerasen, I

H 5 der var opnået som ovenfor beskrevet, under anvendelse af de I

samme primerpar, som tidligere beskrevet. Portioner på fem mikro- I

liter cDNA blev amplificeret i 100 pi reaktionsvoluminer, som inde- I

holdt 50 mM KCI, 25 mM Tris-HCI (pH 8,0), 10 mM MgCI2, 200 pg/ml I

I gelatine, 10% DMSO, 1 pM PC03 eller RS45, 1 pM PC04 eller oligo- I

I 10 (dT)25-30, 1,5 mM dATP, 1,5 mM dCTP, 1,5 mM TTP og 1,5 mM I

dGTP. Prøverne blev opvarmet i 5 min ved 98°C, derefter afkølet til I

stuetemperatur. Der blev tilsat et mikroliter Taq-polymerase (1/8 I

fortynding af nr. 2) til hver prøve, og ovenpå blandingerne blev I

der lagt ca. 100 pi paraffinolie. I

15 Prøverne blev udsat for 9 amplifikationscyklusser i den Peltier- I

anordning, som er beskrevet i det tidligere eksempel, under anven- I

del se af følgende program: I

I 1)1 min, temperaturændring fra 35 til 60°C, I

2) 12 min, temperaturændring fra 60 til 70°C (forlængelse), I

20 3) 1 min, temperaturændring fra 70 til 95°C (denaturering), I

4) 30 sekunder, henstand ved 95°C, I

5) 1 min, temperaturændring fra 95 til 35°C (annelering), og I

6) 30 sekunder, henstand ved 35°C. I

Efter den sidste cyklus blev prøven inkuberet i yderligere 10 I

I 25 min ved 70°C for at afslutte den sidste forlængelse (10'ende cyklus). I

Slutvoluminet af hver prøve var ca. 100 pi. I

Som tidligere blev 1/20 (10 pi) af hver prøve analyseret på en I

2% agarosegel. I denne gel var amplifikationsprodukter tilstede i alle I

I tre prøver: 110 bp for PC03/PC04, ca. 370 bp for RS45/oligo (dT) I

I 30 og ca. 600 bp for PC03/oligo(dT). Disse resultater blev bekræftet I

ved Southern overføring og hybridisering med pBR328: betaA-pro- I

ben. I

Frembringelsen af det 600 bp lange produkt med Taq-poly- I

H merase, men ikke med Klenow-fragmentet, er signifikant, og anty- I

35 der, at Taq-polymerasen er i stand til producere længere DNA end I

Klenow-fragmentet. I

Følgende bakteriofager og bakteriestammer blev deponeret hos I

H Cetus Master Culture Collection, 1400 Fifty-Third Street, Emeryville, I

H California, USA (CMCC) og hos American Type Culture Collection, I

DK 175806 B1 77 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA (ATCC). Disse deponeringer blev foretaget under reglerne ifølge Budapesttraktaten vedrørende international anerkendelse af deponeringen af mikroorga-nicmAr mprl hpn^vn fil patentprocedurer og reauleringer herunder 5 (Budapest-traktaten). Dette sikrer bevarelsen af en levende kultur i 30 Sr efter deponeringsdatoen. Organismerne vil være tilgængelige hos ATCC under betingelserne ifølge Budapesttraktaten og i overensstemmelse med en aftale mellem ansøger og ATCC, som sikrer ube- « grænset tilgængelighed ved udstedelse af det relevante US patent.

10 At de deponerede stammer er tilgængelige skal ikke tages som en licens til at udøve opfindelsen i modstrid med de rettigheder, som udstedes af enhver myndighed i overensstemmelse med landets patentlove.

15 Deponerings- betegnelser CMCC nr. ATCC nr Deponeret CH35:Taq nr.4-2 3125 40.336 29.maj 1987 colji DG98/pFC83 3128 67.421 29.maj 1987 coH DG98/pFC85 3127 67.422 29.maj 1987 20

Sammenfattende ses det, at den foreliggende opfindelse tilvejebringer en fremgangsmåde til amplifikation af én eller flere specifikke nukleinsyresekvenser under anvendelse af en temperaturcyklus-reguleret kædereaktion og et termostabilt enzym, ved hvilken reak-25 tion der frembringes primerforlængelsesprodukter, som efterfølgende kan fungere som templater for yderligere primerforlængelsesprodukter. Fremgangsmåden er navnlig brugbar til påvisning af nukleinsyresekvenser, som i begyndelsen kun er til stede i meget små mængder, og til påvisning af nukleotidvariationer under anvendelse 30 af sekvensspecifikke oligonukleotider. Den foreliggende amplifika-tionsproces kan også anvendes til molekylær kloning.

Den foreliggende fremgangsmåde resulterer i forøget udbytte af amplificeret produkt, større specificitet og færre nødvendige trin for at udføre amplifikationsproceduren i forhold til kendte processer.

35

Claims (35)

1. Thermostabilt enzym med DNA-polymeraseaktivitet, kendetegnet ved, at det I katalyserer sammenslutningen af nukleosidtriphosphater til dannelse af en nuklein- I 5 syrestreng, der er komplementær til en nukleinsyretemplatestreng; hvilket enzym har I en molekylvægt pi fra 86.000 til 90.000 bestemt ud fra dets vandring i SDS-PAGE, I når markørproteinerne er phosphorylase B (92.500), bovint serumalbumin (66.200), I H ovalbumin (45.000), carbonanhydrase (33.000), trypsininhibitor fra soyabønne I B (21.500) og lysozym (14.400). » I I 10 I

2. Thermostabilt enzym ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det ikke denatureres I H irreversibeit, når det udsættes for øgede temperaturer i et tidsrum, der er nødvendigt I H for at bevirke denaturering af dobbeltstrengede nukleinsyrer. I

3. Thermostabilt enzym ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det er en DNA- I polymerase. I

4. Thermostabilt enzym ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3, kendetegnet I ved, at det er et enzym, der er afledt fra Thermus aquaticus. I B 20 I

5. Thermostabilt enzym ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det er et enzym, der er H B afledt fra Thermus aquaticus YT1 (ATCC 25.104). I

6. Thermostabilt enzym ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 5, kendetegnet I B 25 ved, at det ved pH 6,4 har mindst 50% af aktiviteten ved pH 8,0. I

7. Thermostabilt enzym ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 6, kendetegnet I ved, at det kan opnås fra Thermus aquaticus ved en fremgangsmåde, der omfatter de I B følgende trin: I 30 (a) cellerne genindvindes fra et medium og lyseres; I H (b) proteinfraktionen opsamles ved ammoniumsulphatpræcipitation ved mellem 45 I I og 75% mætning med ammuniumsulphat; I (c) de indvundne fraktioner underkastes kromatografi ved anvendelse af en DEAE- I cellulosekolonne, og de proteinholdige fraktioner opsamles; I 35 (d) de opsamlede fraktioner sættes på en hydroxyapatitkolonne, og de eluerede I fraktioner, der indeholder nukleinsyrepolymeraseaktivitet, kombineres; I (e) de kombinerede fraktioner underkastes kromatografi ved anvendelse af en I anden DEAE-cellulosekolonne, der er bragt i ligevægt med en anden puffer, og I nukleinsyrefraktionerne med minimal nukleasekontaminering kombineres; I H 40 (f) de kombinerede fraktioner underkastes kromatografi ved anvendelse af en I I phosphocellulosekolonne, og der foretages eluering med KCL-gradient, og I fraktionerne anlyseres for kontaminerende endo/exonukleaser og for , I polymeraseaktivitet, og fraktionerne med polymeraseaktivitet kombineres. I DK 175806 B1 79

8. Thermostabilt enzym ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 6, kendetegnet ved, at det er opnået fra en kultur af Thermus aquaticus eller fra en bakteriel kultur, der indeholder det rekombinant producerede enzym, ved en fremgangsmåde, der omratter de følgende trin: 5 (a) cellerne genindvindes fra et medium og lyseres; (b) nukleinsyrepolymerasen præcipiteres med Polyamin P, og den præcipiterede nukleinsyrepolymeraseaktivitet genopslemmes i tilstedeværelse af non-ionisk detergent; i (c) proteinfraktionen opsamles ved ammoniumsulfatpræcipitation; 10 (d) den genindvundne proteinfraktion underkastes kromatografi ved anvendelse af en phosphoceliulosekolonne, og der elueres med en KCI-gradient, og fraktionerne, der indeholder nukleinsyrepolymeraseaktivitet, kombineres; (e) de kombinerede fraktioner sættes på en Heparin-Sepharose CI-6B-kolonne, der elueres med en KCI-gradient, og fraktionerne, der indeholder den højeste 15 nukleinsyrepolymeraseaktivitet, kombineres; (f) de kombinerede fraktioner sættes på en hydroxyapatit kolonne og de eluerede fraktioner med nukleisyrepolymeraseaktivitet, og som er uden signifikant kontaminering med endonuklease eller dobbeltstrenget exonuklease, kombineres; : 20 (g) de kombinerede fraktioner underkastes kromatografi ved anvendelse af en DEAE-Tris-Acryl-M-kolonne, og fraktionerne, der indeholder nukleinsyrepolyme-rase, kombineres; (h) de kombinerede fraktioner underkastes kromatografi ved anvendelse af en CM-Tris-Acryl-M-kolonne, der elueres med en NaCI-gradient, og nukleinsyrepolyme- 25 rasefraktionerne, der ikke indeholder målbare nukleaser, kombineres.

9. DNA-sekvens, der koder for en thermostabil enzym med DNA-polymeraseaktivitet, hvilket enzym katalyserer sammenslutningen af nukleosidtriphosphater til dannelse af en nukleinsyrestreng, der er komplementær til en nukleinsyretemplatestreng, ifølge et 30 hvilket som helst af kravene 1 til 8, eller et fragment af denne DNA-sekvens, der koder for et enzymatisk aktivt, trunkeret thermostabilt enzym med DNA- polymeraseaktivitet. I i

10. DNA-sekvens ifølge krav 9, kendetegnet ved, at enzymet ikke denatureres 35 irreversibelt, når det udsættes for de øgede temperaturer i et tidsrum, der er nødvendigt for at bevirke denaturering af dobbeltstrengede nukleinsyrer.

11. DNA-sekvens ifølge krav 9 eller 10, kendetegnet ved, at den kan opnås fra en thermofil bakterie ved en fremgangsmåde, der omfatter de følgende trin: 40 (a) en DNA-sekvensprobe for det thermostabile enzym identificeres ved immunologisk screening af et ekspressionsbibliotek med antistoffer mod Taq thermostabil polymerase; i (b) der konstrueres et genomisk bibliotek af mål-DNA'et; I DK 175806 B1 I I 80 I I (c) det genomiske bibliotek screenes med den radioaktivt mærkede probe som I opnås i trin (a); og I (d) fager, som indeholder DNA, der koder for det thermostabile enzym, eller et I fragment af denne DNA-sekvens, der koder for et enzymatisk aktivt, trunkeret I 5 thermostabilt enzym, der har DNA-polymeraseaktivitet, isoleres. H

12. DNA-sekvens ifølge krav 9 eller 10, kendetegnet ved, at den kan opnås fra en H H j thermofil bakterie ved en fremgangsmåde, der omfatter anvendelse af en del af det H · genomiske DNA fra Thermus aquaticus, som koder for mindst seks aminosyrer af Taq- I H 10 polymerase, som en probe. H

13. DNA-sekvens ifølge krav 12, kendetegnet ved, at proben er valgt blandt de I følgende prober: H (a) det ~115 pb lange EcoRl-adapterede Alul Thermus aquaticus DNA-fragment fra I I 15 pFC85 (ATCC 67.421), I I (b) det ~750 pb lange Bqlll-hindlH Thermus aquaticus DNA-fragment fra pFC83 I {ATCC 67.422), ! I (c) HindHI-BamHI DNA-fragmentet fra Thermus aquaticus DNA-fragment fra i I I insertet af pFC85 (ATCC 67.421), I I 20 (d) det 2,8 kb lange HindIII-Asp718 Thermus aquaticus DNA-fragment fra PFC85 I I (ATCC 67.421), I (e) BamHl-Nhel Thermus aquaticus DNA-fragmentet fra insertet af pFC85 (ATCC I I I 67.421). I

14. DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 9 til 13, kendetegnet ved at H · være fra Thermus aquaticus. H

15. Thermus aquaticus DNA-sekvens ifølge krav 14, kendetegnet ved at være I indeholdt i et ca. 3,5 kb BqII1-Asp718 (partielt) restriktionsfragment enten fra I

30 Thermus aquaticus' genom eller fra DNA'et fra bakteriofagen CH35:Taq#4-2 (ATCC I I 40.336). I

16. Thermus aquaticus DNA-sekvens ifølge krav 14, kendetegnet ved at være I indeholdt i et ca. 2,8 kb HindIII-Asp718 restriktionsfragment enten fra Thermus I 35 aquaticus' genom eller fra plasmidet pFC85 (ATCC 67.421) I

17. DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 13 til 16, kendetegnet ved desuden at have et ATG-startkodon.

18. DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 13 til 17, kendetegnet ved, I at det koder for et fusionsprotein, der indeholder det thermostabile enzym. I

19. Rekombinant vektor, der omfatter DNA-sekvensen eller -fragmentet ifølge et hvilket I som helst af kravene 9 til 18 81 DK 175806 B1

20. Rekombinant vektor ifølge krav 19, kendetegnet ved at være CH35:Taq#4-2 (ATCC 40.336), pFC83 (ATCC 67.422), pFC85 (ATCC 67.421) eller en vektor, hvis insert er sammensat af det ca. 750 bp lange BolII/HindUl-fragment af pFC83 og det 5 ca. 2,8 kbp HindIII/AsD7l8-fraoment af pFC85. * 21. Rekombinant vektor ifølge krav 19, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen eller -fragmentet er operativt forbundet med en ekspressionskontrolsekvens.

22. Rekombinant værtscelle, der indeholder en vektor ifølge et hvilket som helst af kravene 19 til 21.

23. Rekombinant værtscelle ifølge krav 22, kendetegnet ved at være E. coli.

24. Fremgangsmåde til fremstilling af et rekombinant thermostabilt enzym med DNA- polymeraseaktivitet eller fragment heraf, hvilket enzym katalyserer sammenslutningen af nukleosidtriphosphater til dannelse af en nukleinsyrestreng, der er komplementær til en nukleinsyretemplatestreng, kendetegnet ved at omfatte dyrkningen af en værtscelle ifølge krav 22 eller 23. 20

25. Fremgangsmåde ifølge krav 24,kendetegnet ved, at enzymet eller fragmentet deraf ikke denatureres irreversibelt, når det udsættes for de øgede temperaturer i den tid, der er nødvendig, for at bevirke denaturering af dobbeltstrengede nukleinsyrer.

26. Rekombinant thermostabilt enzym med DNA-polymeraseaktivitet eller en modifikation heraf med DNA-polymeraseaktivitet, kendetegnet ved, at det katalyserer sammenslutningen af nukleosidtriphosphater til dannelse af en nukleinsyrestreng, der er komplementær til en nukleinsyretemplatestreng; hvilket enzym eller modifikation heraf har en molekylvægt på fra 86.000 til 90.000 bestemt ud fra disses vandring i

30 SDS-PAGE, når markørproteinerne er phosphorylase B (92.500), bovint serumalbumin (66.200), ovalbumin (45.000), carbonanhydrase (31.000), trypsininhibitor fra soyabønne (21.500) og lysozym (14.400).

27. Rekombinant enzym eller en modifikation heraf ifølge krav 26, kendetegnet 35 ved, at det ikke indeholder kontaminerende thermostabil deoxyribonukleaseaktivitet.

28. Rekombinant enzym eller en modifikation heraf ifølge krav 26 eller 27, kendetegnet ved, at det ikke denatureres irreversiblet, når det udsættes for de øgede temperaturer i den tid, der er nødvendig, for at bevirke denaturering af 40 dobbeltstrengede nukleinsyrer.

29. Rekombinant enzym eller en modifikation heraf ifølge et hvilket som helst af kravene 26 til 28, kendetegnet ved, at det ved pH 6,4 har mindst 50% af aktiviteten ved pH 8,0. I DK 175806 B1 I I 82 I

30. Stabilt enzympræparat, kendetegnet ved, at det omfatter et thermostabilt H enzym med DNA-polymeraseaktivitet ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 8, et H I rekombinant thermostabilt enzym eller fragment deraf med DNA-polymeraseaktivitet H I 5 opnået ved fremgangsmaden ifølge krav 24 eller 25, eller et rekombinant enzym eller H modifikation deraf med DNA-polymeraseaktivitet ifølge et hvilket som helst af kravene H 26 til 29 i en puffer, der omfatter én eller flere ikke-ioniske polymere detergenter. H

31. Præparat ifølge krav 30, kendetegnet ved, at detergenterne er til stede i en L H I 10 koncentration på ca. 0,1 til ca. 0,5 volumenprocent af det samlede præparat. H

32. Præparat ifølge krav 30 eller 31, kendetegnet ved, at detergenterne er et H I polyoxyethyleret sorbitanmonolaurat og en ethoxyleret nonylphenyl. I I 15 33. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 30 til 32, kendetegnet ved, at I I pufferen omfatter glycerol, Tris-CI, pH 8.0, ethyendiamintetraeddikesyre, H dithiothreitol, et polyoxyethyleret sorbitanmonolaurat, en ethoxyleret nonoylphenyl og H gelatine. H

34. Anvendelse af et thermostabilt enzym med DNA-polymeraseaktivitet ifølge et hvilket H som helst af kravene 1 til 8, et rekombinant thermostabilt enzym med DNA- I polymeraseaktivitet opnået ved fremgangsmåden ifølge krav 24 eller 25, et I rekombinant thermostabilt enzym eller en modifikation deraf med DNA- I polymeraseaktivitet ifølge et hvilket som helst af kravene 26 til 29, eller anvendelse af I 25 et stabilt enzympræparat ifølge et hvilket som helst af kravene 30 til 33 til I polymerasekædereaktioner. H

35. Fremgangsmåde til amplifikation af nukleinsyresekvenser, hvilken fremgangsmåde I omfatter anvendelsen af et thermostabilt enzym med DNA-polymeraseaktivitet ifølge I 30 et hvilket som helst af kravene 1 eller 8, et rekombinant thermostabilt enzym med I DNA-polymeraseaktivitet opnået ved fremgangsmåden ifølge krav 24 eller 25, et I rekombinant thermostabilt enzym eller en modifikation deraf med DNA- I H polymeraseaktivitet ifølge et hvilket som helst af kravene 26 til 29, eller anvendelse af I et stabilt enzympræparat ifølge et hvilket som helst af kravene 30 til 33. I