JP2997043B2 - 改良されたプライマー伸長反応 - Google Patents
改良されたプライマー伸長反応Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 この発明は、エネルギー部門からの認可（認可番号DE
−SG02−88ER60688）及び公衆衛生局の認可第A1−06045
号を含む政府の援助によりなされた。米国政府は、この
発明に一定の権利を有する。
−SG02−88ER60688）及び公衆衛生局の認可第A1−06045
号を含む政府の援助によりなされた。米国政府は、この
発明に一定の権利を有する。
この出願は、Taborらの米国通し番号218,103（1988年
７月12日出願、表題はDNA配列決定）の部分継続であ
り、それをこの明細書において参考として援用する。
７月12日出願、表題はDNA配列決定）の部分継続であ
り、それをこの明細書において参考として援用する。
この発明は、DNA配列決定又はポリメラーゼ鎖反応等
のプライマー伸長反応を達成するための方法に関係す
る。
のプライマー伸長反応を達成するための方法に関係す
る。
プライマー伸長反応において、一本鎖テンプレートDN
A（例えば、ゲノムDNA）に相同性を有するオリゴヌクレ
オチドプライマーは、テンプレートDNAへのアニーリン
グを生じる。アニールした混合物に、次いで、DNAポリ
メラーゼがプライマーを伸長してテンプレートDNAに相
補的なDNA鎖を形成する条件において、ヌクレオシド三
リン酸の存在下で、DNAポリメラーゼを与える。DNA配列
決定反応において、このプライマーは、塩基特異的なプ
ライマー伸長の停止を引き起こす鎖終結因子（chain−t
erminating agent）（例えは、ジデオキシヌクレオシド
三リン酸）の存在下において伸長する。Sangerら、Pro
c.Nat′1.Acad.Sci.、74、5463、1977年。ポリメラーゼ
鎖反応においては、２つのプライマーを提供するが、そ
のそれぞれは、２本鎖DNA分子の反対側の鎖に相補性を
有する。プライマーが伸長した後、それらはそれらのテ
ンプレートから分離され、追加のプライマーがテンプレ
ート及び伸長したプライマーにアニールされる。追加の
プライマーが、次いで、伸長する。分離、アニーリング
及び伸長のステップを、テンプレートDNAのコピー数を
増幅するために繰り返す。Saikiら、Science239、487、
1988年。
A（例えば、ゲノムDNA）に相同性を有するオリゴヌクレ
オチドプライマーは、テンプレートDNAへのアニーリン
グを生じる。アニールした混合物に、次いで、DNAポリ
メラーゼがプライマーを伸長してテンプレートDNAに相
補的なDNA鎖を形成する条件において、ヌクレオシド三
リン酸の存在下で、DNAポリメラーゼを与える。DNA配列
決定反応において、このプライマーは、塩基特異的なプ
ライマー伸長の停止を引き起こす鎖終結因子（chain−t
erminating agent）（例えは、ジデオキシヌクレオシド
三リン酸）の存在下において伸長する。Sangerら、Pro
c.Nat′1.Acad.Sci.、74、5463、1977年。ポリメラーゼ
鎖反応においては、２つのプライマーを提供するが、そ
のそれぞれは、２本鎖DNA分子の反対側の鎖に相補性を
有する。プライマーが伸長した後、それらはそれらのテ
ンプレートから分離され、追加のプライマーがテンプレ
ート及び伸長したプライマーにアニールされる。追加の
プライマーが、次いで、伸長する。分離、アニーリング
及び伸長のステップを、テンプレートDNAのコピー数を
増幅するために繰り返す。Saikiら、Science239、487、
1988年。
発明の要約 第一の面において、この発明は、第二の一本鎖領域を
有するテンプレート分子上の第一の一本鎖領域を有する
オリゴヌクレオチドプライマーの伸長において利用する
ための溶液又はキットを叙述するが、この第一及び第二
領域は相同である。この溶液又はキットは、反応混合物
においてこのテンプレートの第二の一本鎖領域上のプラ
イマーの第一の一本鎖領域の伸長を引き起こし得る第一
の因子、及び反応混合物中のピロリン酸のレベルを、第
二の因子の存在しないときの伸長において生じるレベル
より下げることが出来る第二の因子を含む。
有するテンプレート分子上の第一の一本鎖領域を有する
オリゴヌクレオチドプライマーの伸長において利用する
ための溶液又はキットを叙述するが、この第一及び第二
領域は相同である。この溶液又はキットは、反応混合物
においてこのテンプレートの第二の一本鎖領域上のプラ
イマーの第一の一本鎖領域の伸長を引き起こし得る第一
の因子、及び反応混合物中のピロリン酸のレベルを、第
二の因子の存在しないときの伸長において生じるレベル
より下げることが出来る第二の因子を含む。
溶液とは、任意の水性及び／又は緩衝された、上記の
成分を含む液体を意味する。これらの成分は、それらの
所望の機能を達成するのに十分な濃度で溶液中に存在す
る。例えば、第一の因子は、溶液中のピロリン酸のレベ
ルを下げるのに十分な濃度で存在する。キットとは、こ
の溶液の１つ以上の成分を別々に保持する容器を意味す
る。例えば、第一及び第二の因子はべつべつの容器中
に、混合するのに適した溶液中に保持される。
成分を含む液体を意味する。これらの成分は、それらの
所望の機能を達成するのに十分な濃度で溶液中に存在す
る。例えば、第一の因子は、溶液中のピロリン酸のレベ
ルを下げるのに十分な濃度で存在する。キットとは、こ
の溶液の１つ以上の成分を別々に保持する容器を意味す
る。例えば、第一及び第二の因子はべつべつの容器中
に、混合するのに適した溶液中に保持される。
オリゴヌクレオチドプライマーの伸長を引き起こすと
は、一本鎖領域を有するオリゴヌクレオチドプライマー
が、テンプレートとして作用し、ヌクレオシド三リン酸
の添加によりその上でオリゴヌクレオチドプライマーが
伸長してテンプレート核酸と相同な核酸を形成し得る他
の核酸分子とアニールするか、又は自然にアニールした
状態が生じる反応を達成することを意味する。一般に、
伸長は、DNAポリメラーゼ又はRNAポリメラーゼを与え
て、共有結合的に、ヌクレオチドをプライマーに加える
ことを含意する。
は、一本鎖領域を有するオリゴヌクレオチドプライマー
が、テンプレートとして作用し、ヌクレオシド三リン酸
の添加によりその上でオリゴヌクレオチドプライマーが
伸長してテンプレート核酸と相同な核酸を形成し得る他
の核酸分子とアニールするか、又は自然にアニールした
状態が生じる反応を達成することを意味する。一般に、
伸長は、DNAポリメラーゼ又はRNAポリメラーゼを与え
て、共有結合的に、ヌクレオチドをプライマーに加える
ことを含意する。
反応混合物は、伸長反応を達成するのに適した任意の
溶液又は固相である。一般に、それは、伸長反応に必要
なヌクレオシド又はデオキシヌクレオシド三リン酸、及
び金属イオンを含む液体緩衝液である。この混合物は、
DNA配列決定反応に対する任意の標準緩衝因子又は等量
の鎖終結因子をも含み得る。
溶液又は固相である。一般に、それは、伸長反応に必要
なヌクレオシド又はデオキシヌクレオシド三リン酸、及
び金属イオンを含む液体緩衝液である。この混合物は、
DNA配列決定反応に対する任意の標準緩衝因子又は等量
の鎖終結因子をも含み得る。
ピロリン酸のレベルを下げるとは、反応混合物中のピ
ロリン酸の量を、テンプレート上でのプライマーの伸長
に殆ど又は有意の影響を与えない量に減らすことを意味
する。即ち、ピロリン酸のレベルはピロホスホロリシス
を微々たるレベルに下げるのに十分なだけ低い（300μ
Ｍピロリン酸の存在において10％より少ないピロホスホ
ロリシスのレベル）。好ましくは、ピロリン酸のレベル
は、25μＭ（より好ましくは、５μＭ）を下回るまで減
じる。この段階は、ピロリン酸の形成を阻害し、並びに
それを溶液から除去するように作用するピロホスファタ
ーゼ等の因子の利用を含むことを意味する。
ロリン酸の量を、テンプレート上でのプライマーの伸長
に殆ど又は有意の影響を与えない量に減らすことを意味
する。即ち、ピロリン酸のレベルはピロホスホロリシス
を微々たるレベルに下げるのに十分なだけ低い（300μ
Ｍピロリン酸の存在において10％より少ないピロホスホ
ロリシスのレベル）。好ましくは、ピロリン酸のレベル
は、25μＭ（より好ましくは、５μＭ）を下回るまで減
じる。この段階は、ピロリン酸の形成を阻害し、並びに
それを溶液から除去するように作用するピロホスファタ
ーゼ等の因子の利用を含むことを意味する。
相同とは、２つの一本鎖領域が、それぞれのヌクレオ
チド間で十分な非共有結合を形成して安定な２本鎖構造
を、核酸のアニーリングに対して及びプライマー伸長反
応を達成するために通常用いられる条件下で形成し得る
ことを意味する。
チド間で十分な非共有結合を形成して安定な２本鎖構造
を、核酸のアニーリングに対して及びプライマー伸長反
応を達成するために通常用いられる条件下で形成し得る
ことを意味する。
好ましい実施態様において、第一の因子はDNAポリメ
ラーゼ’（最も好ましくはクレノウから選択する）、Ta
qポリメラーゼ、T7型DNAポリメラーゼ（即ち、ファージ
内におけるものと同様に、DNAポリメラーゼが宿主のチ
オレドキシンをサブユニットとして必要とするポリメラ
ーゼ、例えば、T7DNAポリメラーゼ又はT3、ΦＩ、ΦI
I、Ｈ、W31、gh−１、Ｙ、AA1122又はSp6のDNAポリメラ
ーゼ）、T4DNAポリメラーゼ、T5DNAポリメラーゼ、Φ29
DNAポリメラーゼ及び逆転写酵素であり；第二の因子
は、酵素（最も好ましくは、ピロホスファターゼ、例え
ば、60〜95℃での加熱に耐性のピロホスファターゼ）で
ある。
ラーゼ’（最も好ましくはクレノウから選択する）、Ta
qポリメラーゼ、T7型DNAポリメラーゼ（即ち、ファージ
内におけるものと同様に、DNAポリメラーゼが宿主のチ
オレドキシンをサブユニットとして必要とするポリメラ
ーゼ、例えば、T7DNAポリメラーゼ又はT3、ΦＩ、ΦI
I、Ｈ、W31、gh−１、Ｙ、AA1122又はSp6のDNAポリメラ
ーゼ）、T4DNAポリメラーゼ、T5DNAポリメラーゼ、Φ29
DNAポリメラーゼ及び逆転写酵素であり；第二の因子
は、酵素（最も好ましくは、ピロホスファターゼ、例え
ば、60〜95℃での加熱に耐性のピロホスファターゼ）で
ある。
第二の面において、この発明は、第二の一本鎖領域を
有するテンプレート分子上の第一の一本鎖領域を有する
オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させるための改良
された方法（テンプレート上のプライマーの伸長を引き
起こし得る第一の因子を供給することを含む）を叙述す
る。この改良は、第二の因子のないときの伸長に際して
生じる量を下回るまでピロリン酸の量を減じることの出
来る第二の因子により与えられる。
有するテンプレート分子上の第一の一本鎖領域を有する
オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させるための改良
された方法（テンプレート上のプライマーの伸長を引き
起こし得る第一の因子を供給することを含む）を叙述す
る。この改良は、第二の因子のないときの伸長に際して
生じる量を下回るまでピロリン酸の量を減じることの出
来る第二の因子により与えられる。
好ましい実施態様において、この方法は、少なくとも
１つ又は２つの一本鎖領域を有するオリゴヌクレオチド
プライマー及び少なくとも１つ又は２つの一本鎖領域を
有するテンプレート分子を供給するステップ、及びプラ
イマーとテンプレートの一本鎖領域をアニールしてアニ
ールした混合物を形成するステップを含む。生成したア
ニールした混合物に第一及び第二の因子を供給してプラ
イマーの伸長を引き起こす。アニールした混合物に、ジ
デオキシヌクレオシド三リン酸をも与えて良い。この方
法は、更に、伸長の後で、テンプレートからプライマー
を分離するステップを含み、このプライマーの供給、伸
長及び分離のステップを繰り返す。
１つ又は２つの一本鎖領域を有するオリゴヌクレオチド
プライマー及び少なくとも１つ又は２つの一本鎖領域を
有するテンプレート分子を供給するステップ、及びプラ
イマーとテンプレートの一本鎖領域をアニールしてアニ
ールした混合物を形成するステップを含む。生成したア
ニールした混合物に第一及び第二の因子を供給してプラ
イマーの伸長を引き起こす。アニールした混合物に、ジ
デオキシヌクレオシド三リン酸をも与えて良い。この方
法は、更に、伸長の後で、テンプレートからプライマー
を分離するステップを含み、このプライマーの供給、伸
長及び分離のステップを繰り返す。
関連する面において、この発明は、反応においてピロ
リン酸塩の量を、因子が存在しない場合のポリメラーゼ
鎖反応に際して生じる量を下回るように減じることの出
来る因子の存在下においてのポリメラーゼ鎖反応を達成
することを含むDNAの増幅方法を叙述する。好ましく
は、その因子はピロホスファターゼである。
リン酸塩の量を、因子が存在しない場合のポリメラーゼ
鎖反応に際して生じる量を下回るように減じることの出
来る因子の存在下においてのポリメラーゼ鎖反応を達成
することを含むDNAの増幅方法を叙述する。好ましく
は、その因子はピロホスファターゼである。
他の関連する面において、この発明は、Φ29DNAポリ
メラーゼ、増幅すべきDNA、及びピロリン酸の量を因子
が存在しない場合に生じる量を下回るように減じること
の出来る因子を供給することを含むDNAを増幅する方法
を叙述する。
メラーゼ、増幅すべきDNA、及びピロリン酸の量を因子
が存在しない場合に生じる量を下回るように減じること
の出来る因子を供給することを含むDNAを増幅する方法
を叙述する。
出願人は、ピロホスホロリシス（オリゴヌクレオチド
鎖の長さを減じる）はプライマー伸長反応に有害である
ということを測定した。ピロホスホロリシスは、ピロリ
ン酸塩の有効性により引き起こされる。例えば、ポリメ
ラーゼ鎖反応は、Cetus（欧州特許出願0,258,017）及び
Saikiら、Science 239,487,1988により記載されたよう
に、非常に低い濃度であっても、ピロリン酸塩の添加に
より阻害される。このピロホスホロリシスは、ピロリン
酸塩を除去することの出来る因子（例えば、ピロホスフ
ァターゼ）を供給することにより阻止することが出来
る。ポリメラーゼ鎖反応へのピロホスファターゼの添加
は、その反応の進行を大いに増大させ、ピロホスファタ
ーゼを伴わない方法を用いた場合と比較してより優れた
結果を与える。同様に、ピロホスファターゼのDNA配列
決定反応への添加は、配列決定反応の生成物を同定する
ために用いるポリアクリルアミドゲルにおいて形成され
るバンドの強度においてより一層の一様さを与える。こ
の一様さは、ピロホスホロリシスによる特定のDNA生成
物の分解の阻止によるものである。
鎖の長さを減じる）はプライマー伸長反応に有害である
ということを測定した。ピロホスホロリシスは、ピロリ
ン酸塩の有効性により引き起こされる。例えば、ポリメ
ラーゼ鎖反応は、Cetus（欧州特許出願0,258,017）及び
Saikiら、Science 239,487,1988により記載されたよう
に、非常に低い濃度であっても、ピロリン酸塩の添加に
より阻害される。このピロホスホロリシスは、ピロリン
酸塩を除去することの出来る因子（例えば、ピロホスフ
ァターゼ）を供給することにより阻止することが出来
る。ポリメラーゼ鎖反応へのピロホスファターゼの添加
は、その反応の進行を大いに増大させ、ピロホスファタ
ーゼを伴わない方法を用いた場合と比較してより優れた
結果を与える。同様に、ピロホスファターゼのDNA配列
決定反応への添加は、配列決定反応の生成物を同定する
ために用いるポリアクリルアミドゲルにおいて形成され
るバンドの強度においてより一層の一様さを与える。こ
の一様さは、ピロホスホロリシスによる特定のDNA生成
物の分解の阻止によるものである。
この発明の他の特徴及び利点は、下記の好ましい実施
態様の説明から明らかとなるであろう。
態様の説明から明らかとなるであろう。
好ましい実施態様の説明 ピロホスホロリシス反応を阻止することの出来る任意
の因子はこの発明において有用である。ピロホスホロリ
シスを阻止する１つの方法は、ポリメラーゼ反応の間に
生成する如何なるピロリン酸塩をも、酵素のピロホスフ
ァターゼの添加により分解することである。プライマー
伸長反応への痕跡量のピロホスファターゼの添加（溶液
中のDNAポリメラーゼ分子の千分の一のモル比）でさ
え、ピロホスホロリシスを阻止することによりポリメラ
ーゼ反応において生成されるオリゴヌクレオチド断片を
完全に安定化する。この因子は、反応混合物中のピロリ
ン酸塩の加水分解を触媒し、ピロホスホロリシスへ導く
であろうレベルまでピロリン酸塩が蓄積するのを阻止す
るであろう程度に、又は任意の他の方法におけるピロリ
ン酸塩の蓄積を阻止するのに十分な濃度で添加されるべ
きである。この必要とされる因子の量は、標準技術によ
り容易に決定することが出来る。
の因子はこの発明において有用である。ピロホスホロリ
シスを阻止する１つの方法は、ポリメラーゼ反応の間に
生成する如何なるピロリン酸塩をも、酵素のピロホスフ
ァターゼの添加により分解することである。プライマー
伸長反応への痕跡量のピロホスファターゼの添加（溶液
中のDNAポリメラーゼ分子の千分の一のモル比）でさ
え、ピロホスホロリシスを阻止することによりポリメラ
ーゼ反応において生成されるオリゴヌクレオチド断片を
完全に安定化する。この因子は、反応混合物中のピロリ
ン酸塩の加水分解を触媒し、ピロホスホロリシスへ導く
であろうレベルまでピロリン酸塩が蓄積するのを阻止す
るであろう程度に、又は任意の他の方法におけるピロリ
ン酸塩の蓄積を阻止するのに十分な濃度で添加されるべ
きである。この必要とされる因子の量は、標準技術によ
り容易に決定することが出来る。
下記は、ポリメラーゼ鎖反応におけるピロホスファタ
ーゼの利用の実施例である。この実施例は、この発明を
制限しない；当業者は、任意のプライマー伸長反応が上
述の因子の添加により恩恵を受けるであろうことを認め
るであろう。同様に、下記の実施例におけるピロホスフ
ァターゼの利用は、この発明を制限せず、プライマー伸
長反応における過剰のピロリン酸塩の効果を減じるのに
適した他の因子は、当業者により容易に同定される。こ
の発明に適したプライマー、DNAポリメラーゼ及びピロ
ホスファターゼの相対的濃度は、常例的実験により容易
に決定することが出来、当業者には良く知られている。
ーゼの利用の実施例である。この実施例は、この発明を
制限しない；当業者は、任意のプライマー伸長反応が上
述の因子の添加により恩恵を受けるであろうことを認め
るであろう。同様に、下記の実施例におけるピロホスフ
ァターゼの利用は、この発明を制限せず、プライマー伸
長反応における過剰のピロリン酸塩の効果を減じるのに
適した他の因子は、当業者により容易に同定される。こ
の発明に適したプライマー、DNAポリメラーゼ及びピロ
ホスファターゼの相対的濃度は、常例的実験により容易
に決定することが出来、当業者には良く知られている。
ポリメラーゼ鎖反応においては高温（例えば、（65〜
95℃の温度も普通に用いられるが）95〜100℃の温度）
が用いられるので、この発明において用いられるピロホ
スファターゼは高温での加熱に耐性であることが好まし
い。従って、65〜95℃での加熱に耐性のピロリン酸塩を
供給することは有利である。そのようなピロホスファタ
ーゼは、天然に、高温で生長し繁茂することの出来る任
意の細菌（例えば、Thermus aquaticus）から容易に得
ることが出来る。殆どの細菌は自然に生じるピロホスフ
ァターゼを有し、それ故、自然環境において高温で存在
するそれらはこの酵素の適当な源である。
95℃の温度も普通に用いられるが）95〜100℃の温度）
が用いられるので、この発明において用いられるピロホ
スファターゼは高温での加熱に耐性であることが好まし
い。従って、65〜95℃での加熱に耐性のピロリン酸塩を
供給することは有利である。そのようなピロホスファタ
ーゼは、天然に、高温で生長し繁茂することの出来る任
意の細菌（例えば、Thermus aquaticus）から容易に得
ることが出来る。殆どの細菌は自然に生じるピロホスフ
ァターゼを有し、それ故、自然環境において高温で存在
するそれらはこの酵素の適当な源である。
下記のようにTaqポリメラーゼを用いるポリメラーゼ
鎖反応におけるピロホスファターゼの利用は、反応を完
全に行なう（即ち、供給したデオキシヌクレオシド三リ
ン酸すべての消耗を引き起こす）ことを可能にする。こ
れは、ポリメラーゼ鎖反応を利用する診断技術を自動化
することを可能にする。反応の進行のアッセイは、デオ
キシヌクレオシド三リン酸からのリン酸塩の生成又はDN
Aの生成の測定（例えば、酸沈殿による）を含意し得
る。その両者とも簡単且つ迅速なアッセイであり、ポリ
メラーゼ鎖反応の生成物を検出するためのゲルを行なう
ことの必要性の代わりである。
鎖反応におけるピロホスファターゼの利用は、反応を完
全に行なう（即ち、供給したデオキシヌクレオシド三リ
ン酸すべての消耗を引き起こす）ことを可能にする。こ
れは、ポリメラーゼ鎖反応を利用する診断技術を自動化
することを可能にする。反応の進行のアッセイは、デオ
キシヌクレオシド三リン酸からのリン酸塩の生成又はDN
Aの生成の測定（例えば、酸沈殿による）を含意し得
る。その両者とも簡単且つ迅速なアッセイであり、ポリ
メラーゼ鎖反応の生成物を検出するためのゲルを行なう
ことの必要性の代わりである。
実施例1:ピロホスファターゼを伴うPCR反応 この実施例においては、M13Trx−Ｆと呼ばれるDNA
（実際の用いられるDNAはこの発明においては重要でな
い）を順方向及び逆方向プライマーを与えることによ
り、下記のポリメラーゼ鎖反応を用いて増幅した。この
方法は、一般に、Saikiら（前掲）により記載されてい
る。0.4ピコモルの濃度におけるTrx−FDNAを、１μ１ト
リス（1M、pH8.5）、10μ１塩化マグネシウム（15m
M）、6.7μ１の４種のデオキシヌクレオシド三リン酸
（3mM）、10μ１の順方向プライマー（10ピコモル;ALN
より）、20μ逆方向プライマー（10ピコモル;New Engla
nd BioLabs）、２μ１ゼラチン（0.5％）及び55μ１蒸
留水と混合した。0.5μ１のTaqポリメラーゼ（12ユニッ
ト、U.S.Biochemicals,Cleveland、オハイオ）を、次い
で、加え、溶液を94℃に１分間、50℃に１分間そして72
℃に２分間加熱し、この加熱のサイクルを40回繰り返し
た。同一の反応を、様々な濃度（12μ１、37μ１、333
μ１、及び1mM）のピロリン酸塩の存在下で又は非存在
下で、そしてピロホスファターゼ（Sigma社製酵母無機
プロホスファターゼ、カタログ番号Ｉ−4503を精製しな
いで又はFPLCモノＱカラム上で精製してから用いた）の
存在下で行なった。他のピロホスファターゼの由来は、
Worthington酵母無機ピロホスファターゼ（更なる精製
はしない）である。一般に、0.001ユニットの酵母無機
ピロリン酸塩（4ng）が、上記の反応において適してい
る。この量は、当然、かなり多くても良いし少なくても
良い。その濃度の範囲は、常例的実験により容易に決定
される。必要な濃度は、ピロリン酸塩のレベルを約５−
50μＭより低くまで下げるのに十分でありさえすれば良
い。
（実際の用いられるDNAはこの発明においては重要でな
い）を順方向及び逆方向プライマーを与えることによ
り、下記のポリメラーゼ鎖反応を用いて増幅した。この
方法は、一般に、Saikiら（前掲）により記載されてい
る。0.4ピコモルの濃度におけるTrx−FDNAを、１μ１ト
リス（1M、pH8.5）、10μ１塩化マグネシウム（15m
M）、6.7μ１の４種のデオキシヌクレオシド三リン酸
（3mM）、10μ１の順方向プライマー（10ピコモル;ALN
より）、20μ逆方向プライマー（10ピコモル;New Engla
nd BioLabs）、２μ１ゼラチン（0.5％）及び55μ１蒸
留水と混合した。0.5μ１のTaqポリメラーゼ（12ユニッ
ト、U.S.Biochemicals,Cleveland、オハイオ）を、次い
で、加え、溶液を94℃に１分間、50℃に１分間そして72
℃に２分間加熱し、この加熱のサイクルを40回繰り返し
た。同一の反応を、様々な濃度（12μ１、37μ１、333
μ１、及び1mM）のピロリン酸塩の存在下で又は非存在
下で、そしてピロホスファターゼ（Sigma社製酵母無機
プロホスファターゼ、カタログ番号Ｉ−4503を精製しな
いで又はFPLCモノＱカラム上で精製してから用いた）の
存在下で行なった。他のピロホスファターゼの由来は、
Worthington酵母無機ピロホスファターゼ（更なる精製
はしない）である。一般に、0.001ユニットの酵母無機
ピロリン酸塩（4ng）が、上記の反応において適してい
る。この量は、当然、かなり多くても良いし少なくても
良い。その濃度の範囲は、常例的実験により容易に決定
される。必要な濃度は、ピロリン酸塩のレベルを約５−
50μＭより低くまで下げるのに十分でありさえすれば良
い。
上記の反応において、ピロリン酸塩は、25μＭ以上の
レベルにおいてポリメラーゼ鎖反応を阻害した。ピロホ
スファターゼは、この阻害を逆転させ、ポリメラーゼ鎖
反応生成物の生産を約２倍に刺激した。
レベルにおいてポリメラーゼ鎖反応を阻害した。ピロホ
スファターゼは、この阻害を逆転させ、ポリメラーゼ鎖
反応生成物の生産を約２倍に刺激した。
実施例2:熱耐性ピロホスファターゼの調製 これは、Thermus aquaticusの細胞からの無機ピロホ
スファターゼの精製の実施例である。T.aquaticsの細胞
はAmerican Type Culture Collectionから入手した。10
リットルの細胞を、Chienら、J.Bacteriol.127、1550、
（1976）の生長培地を用いて70℃で生長させた。細胞を
採集（〜20gm）し、40mlの10％シュークロース、50mMト
リスHC1、pH7.5、5mMEDTA中に再懸濁（３回フレンチプ
レスを通して溶かす）し、そして細胞片を、Beckman50T
iローターにおいての60分間30,000rpmの遠心分離により
除去した。上清をストレプトマイシン硫酸塩で処理して
DNAを除去した。4mlの40％ストレプトマイシン溶液を40
mlの上清に加え、30分間混合し、そして30分間8,000rpm
で遠心分離した。その結果の上清を、次いで、硫酸アン
モニウムで処理した。60％硫酸アンモニウムではピロホ
スファターゼ活性は沈殿しなかったが、70％硫酸アンモ
ニウムによりすべて沈殿した:19mlの上清に7.2gmの硫酸
アンモニウムを加え（60％）、30分間混合し、8,000rpm
で30分間回転させた。その上清に、3gm硫酸アンモニウ
ムを加え（70％）、30分間混合し、そして8,000rpmで30
分間回転させた。ペレットを20mlの20mMトリス−HC1pH
7.5、1mMEDTA、10％グリセロール、10mM2−メルカプト
エタノール（緩衝液Ａ）に再懸濁し、次いで、２リット
ルの緩衝液Ａに対して一晩透析した。透析物を、緩衝液
Ａ中で平衡化したDEAEDE52カラムを通し、300mlの緩衝
液Ａ＋50mMNaClで洗い、次いで、50〜500mMNaClを含む
緩衝液Ａの１リットル勾配において流した。ピロホスフ
ァターゼを125mMNaClを含む緩衝液Ａにて溶出した。溶
出物（60mL）を２リットルの20mMKPO4pH7.4、1mMEDTA、
10mM2−メルカプトエタノール、10％グリセロール（緩
衝液Ｂ）に対して透析し、緩衝液Ｂで平衡化したホスホ
セルロースカラム（100ml）に載せた。すべてのピロホ
スファターゼ活性をカラムを通して流出させた。この流
出物を、次いで、20mMトリスHClpH7.0、1mMEDTA、10％
グリセロール（緩衝液Ｃ）に対して透析し、緩衝液Ｃに
おけるFPLCモノＱカラムにかけた。緩衝液Ｃにおいて、
100〜250mMNaClを含む勾配で分画し、ピロホスファター
ゼ活性を180mMNaClにおいて溶出した。ピロホスファタ
ーゼ活性を有する画分を20mMKPO4pH7.4、0.1mMEDTA、50
％グリセロールに対して透析し、−20℃において貯蔵し
た。
スファターゼの精製の実施例である。T.aquaticsの細胞
はAmerican Type Culture Collectionから入手した。10
リットルの細胞を、Chienら、J.Bacteriol.127、1550、
（1976）の生長培地を用いて70℃で生長させた。細胞を
採集（〜20gm）し、40mlの10％シュークロース、50mMト
リスHC1、pH7.5、5mMEDTA中に再懸濁（３回フレンチプ
レスを通して溶かす）し、そして細胞片を、Beckman50T
iローターにおいての60分間30,000rpmの遠心分離により
除去した。上清をストレプトマイシン硫酸塩で処理して
DNAを除去した。4mlの40％ストレプトマイシン溶液を40
mlの上清に加え、30分間混合し、そして30分間8,000rpm
で遠心分離した。その結果の上清を、次いで、硫酸アン
モニウムで処理した。60％硫酸アンモニウムではピロホ
スファターゼ活性は沈殿しなかったが、70％硫酸アンモ
ニウムによりすべて沈殿した:19mlの上清に7.2gmの硫酸
アンモニウムを加え（60％）、30分間混合し、8,000rpm
で30分間回転させた。その上清に、3gm硫酸アンモニウ
ムを加え（70％）、30分間混合し、そして8,000rpmで30
分間回転させた。ペレットを20mlの20mMトリス−HC1pH
7.5、1mMEDTA、10％グリセロール、10mM2−メルカプト
エタノール（緩衝液Ａ）に再懸濁し、次いで、２リット
ルの緩衝液Ａに対して一晩透析した。透析物を、緩衝液
Ａ中で平衡化したDEAEDE52カラムを通し、300mlの緩衝
液Ａ＋50mMNaClで洗い、次いで、50〜500mMNaClを含む
緩衝液Ａの１リットル勾配において流した。ピロホスフ
ァターゼを125mMNaClを含む緩衝液Ａにて溶出した。溶
出物（60mL）を２リットルの20mMKPO4pH7.4、1mMEDTA、
10mM2−メルカプトエタノール、10％グリセロール（緩
衝液Ｂ）に対して透析し、緩衝液Ｂで平衡化したホスホ
セルロースカラム（100ml）に載せた。すべてのピロホ
スファターゼ活性をカラムを通して流出させた。この流
出物を、次いで、20mMトリスHClpH7.0、1mMEDTA、10％
グリセロール（緩衝液Ｃ）に対して透析し、緩衝液Ｃに
おけるFPLCモノＱカラムにかけた。緩衝液Ｃにおいて、
100〜250mMNaClを含む勾配で分画し、ピロホスファター
ゼ活性を180mMNaClにおいて溶出した。ピロホスファタ
ーゼ活性を有する画分を20mMKPO4pH7.4、0.1mMEDTA、50
％グリセロールに対して透析し、−20℃において貯蔵し
た。
このピロホスファターゼ活性は、40サイクルのポリメ
ラーゼ鎖反応（各サイクルは95℃、１分間の加熱ステッ
プを含む）によって影響を受けなかった。更に、このピ
ロホスファターゼは、dNTPを加水分解せず、又、反応混
合物中において、dNTPによって阻害されなかった。ピロ
ホスファターゼ活性は、一般的に、Chenら、Anal.Chem.
28、1756（1956）及びJosse、J.Biol.Chem.、241、1938
（1966）に記載されたようにしてアッセイした。
ラーゼ鎖反応（各サイクルは95℃、１分間の加熱ステッ
プを含む）によって影響を受けなかった。更に、このピ
ロホスファターゼは、dNTPを加水分解せず、又、反応混
合物中において、dNTPによって阻害されなかった。ピロ
ホスファターゼ活性は、一般的に、Chenら、Anal.Chem.
28、1756（1956）及びJosse、J.Biol.Chem.、241、1938
（1966）に記載されたようにしてアッセイした。
他の実施態様 他の実施態様は下記の請求の範囲内にある。例えば、
DNAプライマーよりも蛋白質プライマーを利用する酵
素、例えば、Φ29DNAポリメラーゼ（２本鎖DNAを重合さ
せる）を用いて、変性加熱ステップ又は再アニーリング
ステップを必要とせずにDNAを増幅することが出来る。B
lancoら、DNA複製と突然変異誘発、A.S.M.12章、1988。
そのような増幅反応にピロホスファターゼ（又はそれと
同等の物）を含めることは、その系における増幅された
DNAの収率を増大させるであろう。
DNAプライマーよりも蛋白質プライマーを利用する酵
素、例えば、Φ29DNAポリメラーゼ（２本鎖DNAを重合さ
せる）を用いて、変性加熱ステップ又は再アニーリング
ステップを必要とせずにDNAを増幅することが出来る。B
lancoら、DNA複製と突然変異誘発、A.S.M.12章、1988。
そのような増幅反応にピロホスファターゼ（又はそれと
同等の物）を含めることは、その系における増幅された
DNAの収率を増大させるであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リチャードソン，チャールズ シー. アメリカ合衆国 02167 マサチューセ ッツ，チェスナット ヒル，チェスナッ ト ヒル ロード 78 (56)参考文献 特開 昭62−281（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−102677（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，168 （1986）ｐ．318−321
Claims (3)
- 【請求項１】DNA配列決定反応で用いるための溶液であ
って、DNAポリメラーゼ、鎖終結因子、及びDNA重合反応
混合物中のピロリン酸塩の量を減じることの出来る因子
を含む、当該溶液。 - 【請求項２】前期のピロリン酸塩の量を減じることの出
来る因子がピロホスファターゼである、請求項１に記載
の溶液。 - 【請求項３】前期の鎖終結因子がジデオキシヌクレオシ
ド三リン酸である、請求項１に記載の溶液。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US33675189A | 1989-04-12 | 1989-04-12 | |
| US336,751 | 1989-04-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04506002A JPH04506002A (ja) | 1992-10-22 |
| JP2997043B2 true JP2997043B2 (ja) | 2000-01-11 |
Family
ID=23317491
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2506210A Expired - Lifetime JP2997043B2 (ja) | 1989-04-12 | 1990-04-10 | 改良されたプライマー伸長反応 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP2997043B2 (ja) |
| KR (1) | KR920700294A (ja) |
| AU (1) | AU638246B2 (ja) |
| CA (1) | CA2050276C (ja) |
| HU (1) | HUT61054A (ja) |
| LT (1) | LTIP1519A (ja) |
| WO (1) | WO1990012111A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5198543A (en) * | 1989-03-24 | 1993-03-30 | Consejo Superior Investigaciones Cientificas | PHI29 DNA polymerase |
| US5001050A (en) * | 1989-03-24 | 1991-03-19 | Consejo Superior Investigaciones Cientificas | PHφ29 DNA polymerase |
| FR2674254B1 (fr) * | 1991-03-20 | 1995-10-06 | Univ Reims Champagne Ardenne | Detection non radioactive de la presence d'un acide nucleique determine dans un echantillon biologique. |
| US5256555A (en) | 1991-12-20 | 1993-10-26 | Ambion, Inc. | Compositions and methods for increasing the yields of in vitro RNA transcription and other polynucleotide synthetic reactions |
| FI923911A (fi) * | 1992-09-01 | 1994-03-02 | Vsevolod Kiselev | DNA-molekylers in vitro-syntes |
| DE4336266A1 (de) * | 1993-10-23 | 1995-04-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Stabilisierte flüssige Mischungen für die Markierung von Nukleinsäuren |
| US5885813A (en) * | 1995-05-31 | 1999-03-23 | Amersham Life Science, Inc. | Thermostable DNA polymerases |
| US5665551A (en) * | 1995-09-13 | 1997-09-09 | Roche Molecular Systems, Inc. | Purified nucleic acid encoding a thermostable pyrophosphatase |
| DE19612779A1 (de) * | 1996-03-29 | 1997-10-02 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur spezifischen Vervielfältigung von langen Nukleinsäuren durch PCR |
| WO1998015655A1 (en) * | 1996-10-07 | 1998-04-16 | The Perkin-Elmer Corporation | Primer extension reaction utilizing a cosubstrate-enzyme pair for consuming pyrophosphate |
| US6291164B1 (en) | 1996-11-22 | 2001-09-18 | Invitrogen Corporation | Methods for preventing inhibition of nucleic acid synthesis by pyrophosphate |
| GB0110501D0 (en) | 2001-04-30 | 2001-06-20 | Secr Defence Brit | Amplification process |
| AU2004277589A1 (en) * | 2003-09-30 | 2005-04-14 | Perkinelmer Las, Inc. | Compositions and processes for genotyping single nucleotide polymorphisms |
| EP3004378B1 (en) * | 2013-05-24 | 2017-12-20 | Illumina Cambridge Limited | Pyrophosphorolytic sequencing using nanopores |
| EP4278005A1 (en) * | 2021-01-14 | 2023-11-22 | Integrated DNA Technologies, Inc. | Methods for production and quantification of unique molecular identifier-labeled beads |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| CA1338457C (en) * | 1986-08-22 | 1996-07-16 | Henry A. Erlich | Purified thermostable enzyme |
| US4971903A (en) * | 1988-03-25 | 1990-11-20 | Edward Hyman | Pyrophosphate-based method and apparatus for sequencing nucleic acids |
-
1990
- 1990-04-10 WO PCT/US1990/001938 patent/WO1990012111A1/en not_active Application Discontinuation
- 1990-04-10 EP EP19900906516 patent/EP0467953A4/en not_active Withdrawn
- 1990-04-10 HU HU903562A patent/HUT61054A/hu unknown
- 1990-04-10 AU AU54382/90A patent/AU638246B2/en not_active Ceased
- 1990-04-10 JP JP2506210A patent/JP2997043B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-10 CA CA002050276A patent/CA2050276C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-10 KR KR1019900702622A patent/KR920700294A/ko not_active Application Discontinuation
-
1993
- 1993-12-03 LT LTIP1519A patent/LTIP1519A/xx unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６８（１９８６）ｐ．３１８−３２１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2050276C (en) | 2003-03-11 |
| HUT61054A (en) | 1992-11-30 |
| EP0467953A1 (en) | 1992-01-29 |
| KR920700294A (ko) | 1992-02-19 |
| WO1990012111A1 (en) | 1990-10-18 |
| JPH04506002A (ja) | 1992-10-22 |
| LTIP1519A (en) | 1995-06-26 |
| HU903562D0 (en) | 1992-03-30 |
| AU638246B2 (en) | 1993-06-24 |
| AU5438290A (en) | 1990-11-05 |
| CA2050276A1 (en) | 1990-10-13 |
| EP0467953A4 (en) | 1992-06-17 |
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