DE19612779A1

DE19612779A1 - Verfahren zur spezifischen Vervielfältigung von langen Nukleinsäuren durch PCR

Info

Publication number: DE19612779A1
Application number: DE19612779A
Authority: DE
Inventors: Bruno Dipl Biol Dr Frey; Hildegund Kuebler
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1996-03-29
Publication date: 1997-10-02
Also published as: WO1997037038A1

Description

Die Erfindung betrifft eine Enzymmischung bzw. deren Verwendung zur spezifischen Vervielfältigung von besonders langen Nukleinsäuresequenzen durch die Polymerase Ketten Reaktion (PCR) bzw. ein Verfahren zum spezifischen Nachweis solcher Nu kleinsäuresequenzen in Gegenwart einer Probe, insbesondere in biologischen Flüssig keiten.

Die Vermehrung von einzel- bzw. doppelsträngigen Nukleinsäuresequenzen in Gegen wart bestimmter Primer und eines die Polymerisation induzierenden Agenzes, wie z. B. hitzestabile DNA-Polymerasen oder reverse Transkriptasen, finden heutzutage eine breite Anwendung in der Molekularbiologie, molekularen Evolution, genetischen Unter suchungen, Forensik, Genom Analyse und Sequenzierung und insbesondere in der kli nischen Diagnostik. Das mehrere Cyclen durchlaufende Verfahren ist hinlänglich als Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) bekannt (EP 0 200 362, EP 0 258 017, Saiki et al., 1985, Science 230: 1350-1354). Die PCR-Reaktion wird üblicherweise mit Hilfe der thermophilen DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus, sogenannter Taq-Polymerase durchgeführt. Dieses sogenannte klassische PCR-Verfahren zeigt jedoch eine Limitation wenn PCR Fragmente größer als 3 kb vervielfältigt werden sollen. Diese Limitation ist wahrscheinlich durch die die fehlerhafte Ablesung des Enzyms bei dem Polymerisa tionsprozeß zurückzuführen.

Daher werden heute häufig DNA-Polymerasen wie z. B. aus Pyrococcus furiosus, soge nannte Pfu-Polymerasen verwendet (Lundberg, K.S. et al., Gene 108 (1991) 1-6). Die Pfu-Polymerase zeichnet sich durch eine zusätzliche Aktivität und zwar eine intrinsische 3′-(editing)-exonuclease-Aktivität (proofreading activity) aus und ist so imstande, die Mutationsrate pro Cyclus beträchtlich, und zwar um den Faktor von ungefähr 10, zu vermindern. Es hat sich jedoch gezeigt, daß die proofreading-Polymerasen bei der Ver vielfältigung von kurzen Sequenzen, d. h. bis ca. 3 kb, an ihre Grenzen stoßen. Eine Ver besserung in dieser Hinsicht ist von W. Barnes. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 2216-2220 bzw. WO 94/26766 beschrieben. Die Verbesserung nach Barnes be steht in dem Einsatz einer Mischung, bestehend aus zwei verschiedenen DNA-Poly merasen, wobei die eine sogenannte proofreading-Aktivität (wie z. B. Pfu) und die an dere, im Überschuß vorliegende DNA-Polymerase keine proofreading-Aktivität (wie z. B. Taq) aufweist. Dadurch wird die Amplifikation von längeren DNA-Sequenzen, d. h. von bis zu 35 kb an Lambda DNA und 29,9 kb an humaner DNA (Cheng et al. (1995) PCR Methods and Applications 4: 294-298), jeweils abhängig von den verwendeten Primern, den Cyclenbedingungen bzw. Cyclenanzahl oder sonstigen Bedingungen, eine höhere Effizienz als auch Ausbeute erzielt. Obwohl nun Nukleinsäuresequenzen bis zu 29 kb an human genomischer DNA und 42 kb an Lambda DNA amplifiziert werden können, sind die Ausbeuten dennoch relativ niedrig.

Eine Optimierung der PCR kann darüber hinaus nach dem Stand der Technik durch die Reduzierung der Menge an Pyrophosphat in der Reaktionsmischung erreicht werden. Als Pyrophosphat-reduzierendes Agenz wurde insbesondere eine Pyrophosphatase ver wendet (WO 90/12111, WO 94/05797). Der Zusatz einer thermostabilen Pyrophospos phatase aus Thermus aquaticus zur PCR führte danach zu einer Verdopplung der Pro duktion der PCR-Produkte im Vergleich zur PCR ohne Pyrophosphatase (WO 90/12111). Kiselev et al. (WO 94/05797) verwendeten für den selben Zweck eine thermostabile Pyrophosphatase aus E. coli oder aus Thermus thermophilus. Während sich jedoch die Pyrophosphatase aus E. coli als nicht ausreichend thermostabil unter PCR-Bedingungen erwies, konnte gezeigt werden, daß bei Verwendung einer thermo stabilen Pyrophosphatase aus Thermus thermophilus die effektive Amplifizierung von 10 kb langen Lambda DNA-Fragmenten möglich war.

Trotz der oben beschriebenen Optimierungen der PCR besteht nach wie vor ein Bedürf nis, längere PCR-Fragmente spezifisch und in zufriedenstellenden Ausbeuten zu ampli fizieren.

Insbesondere lag der Erfindung die Aufgabe zugrunde, für die spezifische Vervielfälti gung von Nukleinsäuresequenzen, die größer als 20 kb sind, Maßnahmen zur Verfügung zu stellen, durch die die im Stand der Technik beschriebenen Nachteile überwunden werden.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß eine Mischung bestehend aus einer thermosta bilen DNA-Polymerase mit proofreading-Aktivität, einer thermophilen DNA-Polyme rase ohne proofreading-Aktivität sowie einer thermostabilen Pyrophosphatase zur Ver vielfältigung von größeren Nukleinsäuresequenzen mittels PCR-Reaktion verwendet wird. Als vorteilhaft hat sich erwiesen, wenn die DNA-Polymerase ohne proofreading-Aktivität dabei im Überschuß vorliegt, vorzugsweise in einer mindestens 8-fach höheren Konzentration als das Enzym mit proofreading-Aktivität. Die Pyrophosphatase liegt in einem Verhältnis von 0,5-0,1 Units zu ca. einer Unit gesamten Polymerasen-Konzen tration vor.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist, wenn ein oder zwei Enzyme verwen det werden, die die drei für die Enzymmischung erforderlichen Enzymaktivitäten auf weisen.

Für die proofreading-Aktivität aufweisende Polymerase kommen beispielsweise DNA-Polymerasen aus Pyrococcus furiosus (Pfu), aus Pyrococcus spezies GB-D, Thermotoga maritima (Tma), aus Pyrococcus woesii (Pwo, DSM 3773), aus Thermococcus litoralis (Tli) oder Sulfolobus solfataricus (Sso) in Betracht. Für das Enzym ohne proofreading-Aktivität haben sich Taq DNA-Polymerase oder entsprechende Analoge wie Klentaq I (N-terminal verkürztes Enzym), das Klenowfragment der DNA-Polymerase I aus T, aquaticus (DSM 625) oder andere Polymerasen aus Thermus species (Tth, Tfl, Tfi, Tbr) als geeignet erwiesen. Für die Pyrophosphatase (PPase) kommen beispielsweise Enzyme aus Thermus thermophilus (TAh, DSM 579), oder anderen Thermus-Arten wie T. aquati cus, sowie Enzyme aus thermophilen Archaebacterien wie Sulfolobus acidocaltarius oder Thermoplasma acidophilum in Betracht. Erfindungsgemäß bevorzugt ist eine Mischung von Pwo und Taq im Verhältnis von ca. 1 : 10 und ein Verhältnis dieser Mischung zu PPase (Thermus thermophilus) von ca. 3,5 : 1.

Die Enzymmischung der Erfindung kann neben der Vervielfältigung langer Fragmente auch vorteilhaft zur Markierung von langen DNA-Fragmenten mit modifizierten Nu kleotiden eingesetzt werden. Lange Fragmente bedeuten insbesondere Nukleinsäurese quenzen, die 20 kb oder mehr aufweisen. In bestimmten Fällen konnte mit der erfin dungsgemäßen Mischung eine spezifische Amplifikation mit guter Ausbeute für DNA-Fragmente bis zu ca. 50 kb erzielt werden.

PCR Methoden die erlauben würden längere PCR Produkte mit größerer Effizienz zu amplifizieren, würden Genom Mapping und Sequenzierung, sowie die Klonierung und Mutagenese von großen Sequenzbereichen sowie die Diagnostik von Deletionen er leichtern.

Darüber hinaus hängen die optimalen Reaktionsbedingungen, wie Inkubationszeit, Tem peratur, Pufferbedingungen, die Magnesium (Mg²⁺)-Konzentration bzw. die Konzentra tion der Enzymmischung vom jeweils verwendeten Template/Primer-Paar ab und sollte jeweils individuell bestimmt werden. Entsprechende Vorversuche gehören zu den für den Fachmann üblichen Maßnahmen.

Darauf aufbauend hat sich nun überraschenderweise ergeben, daß eine Mischung, die eine Gesamt-Enzymkonzentration im Bereich von 0,5-5 U/Testansatz aufweist, vor zugsweise haben sich ungefähr 2,5 U/Testansatz als optimal erwiesen. Für den Test ansatz werden üblicherweise 50 µl verwendet.

Als optimale Mg²⁺-Konzentration hat sich in den meisten Fällen ein Bereich von 0,5-5 mM, vorzugsweise ca. 1,5-3,0 mM, erwiesen. In der Regel wird MgCl₂ verwendet; die übliche Konzentration beträgt ca. 2,35 mM.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist eine Enzymmischung, bestehend aus einer thermostabilen DNA-Polymerase mit proofreading-Aktivität, einer thermophilen DNA-Polymerase ohne proofreading-Aktivität sowie einer thermostabilen Pyrophos phatase und Zusatz einer speziellen Reaktionspuffer-Salz-Mischung.

Als Reaktionspuffer-Salz-Mischung erwies sich eine Pufferlösung auf Basis von Tri cine-Ammoniak und weiterer Salze als vorteilhaft. Erfindungsgemäß hat sich insbe sondere eine Konzentration der Pufferkomponente im Bereich von ca. 5-100 mM, vorzugsweise von ca. 50 mM, sowie die Anwesenheit bestimmter Salze als vorteilhaft erwiesen. Als Salz hat sich Ammoniumsulfat und zwar in einer Konzentration von ca. 5-25 mM, bevorzugt von 7,5-10 mM als besonders vorteilhaft erwiesen. Der pH-Wert für die Amplifikation liegt erfindungsgemäß bei ca. 8,8-9.2, bevorzugt bei ca. 9,0.

Die Verwendung von DMSO als weiteres Additiv in einem Konzentrationsbereich bis zu ca. 10%, bevorzugt 2-4% hat sich als weiterer Vorteil erwiesen. Darüber hinaus kann die PCR-Reaktion erfindungsgemäß durch den Zusatz weiterer Substanzen wie beispielsweise Rinderserumalbumin in einer Konzentration von bis zu ca. 100 µg/ml, SH-Reagenzien wie Dithiothreitol oder beta-Mercaptoethanol üblicherweise in einem Konzentrationsbereich von 1,0 bis 80 mM, vorzugsweise 50 mM, oder ein Detergenz wie beispielsweise Tween 20 oder Nonidet NP40 in einem Konzentrationsbereich von 0,01 bis 5,0%, vorzugsweise ca. 0,05-0,5%, Spermidin oder Glycerin in üblichen Konzentrationen weiter verbessert werden.

Es hat sich darüber hinaus gezeigt, daß die oben beschriebene Reaktionspuffer-Salz-Mi schung, die einen Tricine-Ammoniak-Puffer mit einer Konzentration von ca. 50 mM, Ammoniumsulfat mit einer Konzentration von 7,5-25 mM, 2-4% DMSO, 0,1% TWEEN 20 und Mercaptoethanol mit einer Konzentration von ca. 10 mM aufweist, sich nicht nur für solche PCR-Reaktionen als Reaktionsgemisch eignet, die mit der erfin dungsgemäßen Enzymmischung, sondern mit anderen bekannten Maßnahmen durchge führt werden. Dies ist den Abb. 2 und 5 zu entnehmen.

Für die erfindungsgemäße Amplifikation von langen Fragmenten, hat sich insbesondere eine Temperatur für den Verlängerungsschritt von ca. 66-70°C, vorzugsweise von 68°C als vorteilhaft erwiesen. Die Elongationszeit beträgt zwischen ca. 10 und 35 Minuten, und hängt stark von der Länge des zu amplifizierenden Fragments ab. Für DNA-Fragmente von 30 kb haben sich hier insbesondere 20 Minuten, für Fragmente von ca. 40 kb ca. 27 Minuten und für DNA-Fragmente in der Größenordnung von 50 kb ca. 35 Minuten, als vorteilhaft erwiesen. Die Elongationszeit sollte nach dem 10. Zyklus um jeweils 5-20 Sekunden pro Zyklus verlängert werden.

Für die Denaturierung während der Zyklen hat sich insbesondere eine Temperatur von ca. 92-94°C bewährt, vorzugsweise 92°C; die Denaturierungszeit sollte ca. 10 Se kunden betragen. Darüber hinaus hat sich die Verwendung von ultradünnen Reagier gefäßen mit einem Volumen von ca. 0,2 ml als besonders vorteilhaft erwiesen.

Ein für die Nukleinsäure-Amplifikation verwendetes Reagenz besteht im wesentlichen aus zwei Einzelmischungen. Die erste Mischung enthält die jeweilige Template-DNA, wie z. B. genomische DNA oder rekombinante DNA (z. B. Cosmide) in einem Konzen trationsbereich von ca. 1 bis 500 ng/Ansatz mit sogenannten upstream- und down-stream-Primern (vorzugsweise je ca. 300 nM) und sämtliche für die DNA-Kettenver längerung erforderlichen Nukleotide (Nukleotidtriphosphate), wie dATP, dCTP, dGTP und dTTP. Für die einzelnen Nukleotide hat sich in der Regel eine Konzentration von jeweils 200-600 µM; bevorzugt 500 µM, als besonders geeignet erwiesen.

Die zweite Mischung enthält im wesentlichen den für die PCR-Reaktion erforderlichen Puffer und die erfindungsgemäße Enzymmischung in einer entsprechend höher konzen trierten Form, so daß sich nach Vermischung mit der ersten Mischung die erfindungsge mäßen Konzentrationen ergeben. Für die Amplifikation von langen Fragmenten haben sich Reaktionsansätze von 10 bis 100 ml, vorzugsweise 50 µl als vorteilhaft erwiesen. Nach Zusammenmischung der Einzelmischungen wird die Probe in ein entsprechendes Thermocycler-Gerät eingebracht und zunächst zur Trennung des Doppelstranges des jeweiligen DNA-Fragments denaturiert (bei 92°C, 2 Minuten). Daran schließen sich die einzelnen Cyclen der PCR.

Abkürzungsverzeichnis
AS
Ammoniumsulfat
bp	Basenpaare
C	Celsius
dATP	2′-Desoxy-adenln-5′-triphosphat
dCTP	2′-Desoxy-cytidin-5′-triphosphat
dGTP	2′-Desocy-guanin-5′-triphosphat
dNTP	2′-Desoxy-nukleosid-5-triphosphat
DTT	1,4-Dithiothreit
dTTP	2′-Desoxy-thymidin-5′-triphosphat
DMSO	Dimethylsulfoxid
EDTA	(Ethylendinitrilo)tetraessigsäure
HCl	Salzsäure
kb	Kilobasen
KCl	Kaliumchlorid
Min.	Minute
mM	milimolar
µM	mykromolar
ng	Nanogramm
(NH₄)₂SO₄	Ammoniumsulfat
NH₃	Ammoniak
PCR	Polymerase Ketten Reaktion
Pwo	DNA Polymerase aus Pyrococcus woesii
Sek.	Sekunde
Taq	DNA Polymerase aus Thermus aquaticus
Tth	DNA Polymerase aus Thermus thermophilus
tPA	tissue Plasminogen Activator
Tricine	N-[Tris-(hydroxymethyl)-methyl]-glycin
Tris	2-Amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propandiol
U	Unit (Enzymeinheit)

Primerverzeichnis

Legenden zu den Abbildungen Abb. 1

Amplifikation von 23 kb (Spur 2), 24 kb (Spur 3), 27 kb (Spur 4), 28.3 kb (Spur 5), 29.9 kb (Spur 6), 31 kb (Spur 7) und 35 kb (Spur 8) Fragmenten aus humaner, genomischer DNA mit Taq/Pwo/PPase-Enzymmischung (erfindungsgemäß).

Abb. 2

Amplifikation eines 28,3 kb Fragments aus dem humanen beta-Globin Gen mit Taq/Pwo-Mischung ohne PPase (Stand der Technik, Spur 3) und Taq/Pwo/PPase-Mischung (erfindungsgemäß, Spur 4) mit Tris Puffer (Stand der Technik, Spur 5) und Tricine-NH₃-Puffer (erfindungsgemäß, Spur 6).

Die Enzymmischung mit PPase zeigt bei jeder Pufferbedingung deutlich mehr PCR-Prodakt als die Enzymmischung ohne PPase. Eine weiter verbesserte Produktausbeute wird in Kombination der Enzymmischung mit PPase mit einem Tricine-NH₃-Puffer er zielt.

Abb. 3

Amplifikation von 20 kb, 25 kb, 30 kb, 35 kb, 40 kb und 47 kb aus Lambda DNA mit Taq/Pwo/PPase-Enzymmischung (erfindungsgemäß).

Abb. 4

Amplifikation von 20 kb, 25 kb, 30 kb, 35, kb und 40 kb Fragmenten aus Lambda DNA mit Taq/Pwo-Mischung ohne PPase und Tris-HCl-Puffer (Stand der Technik) und Taq/ Pwo/PPase-Mischung und Tricine-NH₃-Puffer (erfindungsgemäß) unter Verwendung von limitierender Menge an Lambda DNA. Dabei bedeuten:
Spur 3: 20 kb Fragment mit Taq/Pwo-Mischung ohne PPase- und Tris-HCl-Puffer
Spur 5: 25 kb Fragment mit Taq/Pwo-Mischung ohne PPase- und Tris-HCl-Puffer
Spur 7: 30 kb Fragment mit Taq/Pwo-Mischung ohne PPase- und Tris-HCl-Puffer
Spur 9: 35 kb Fragment mit Taq/Pwo-Mischung ohne PPase- und Tris-HCl-Puffer
Spur 11: 40 kb Fragment mit Taq/Pwo-Mischung ohne PPase- und Tris-HCl-Puffer
Spur 4: 20 kb Fragment mit Taq/Pwo-PPase-Mischung und Tricine-Ammoniak-Puffer
Spur 6: 25 kb Fragment mit Taq/Pwo-PPase-Mischung und Tricine-Ammoniak-Puffer
Spur 8: 30 kb Fragment mit Taq/Pwo-PPase-Mischung und Tricine-Ammoniak-Puffer
Spur 10: 35 kb Fragment mit Taq/Pwo-PPase-Mischung und Tricine-Ammoniak-Puffer
Spur 12: 40 kb Fragment mit Taq/Pwo-PPase-Mischung und Tricine-Ammoniak-Puffer.

Die Enzymmischung mit PPase zeigt bei allen Längen deutlich mehr PCR Produkt als die Enzymmischung ohne PPase.

Abb. 5

Amplifikation eines 15 kb Fragmentes aus dem tPA-Gen aus humaner genomischer DNA mit Taq/Pwo-Enzymmischung (Stand der Technik) und Tris-HCl-Puffer (Stand der Technik) sowie Taq/Pwo-Enzymmischung (Stand der Technik) und Tricine-NH₃-Puffer (erfindungsgemäß).

Die Verwendung des Tricine-NH₃-Puffer zeigt deutlich mehr PCR-Produkt in Kom bination mit Taq/Pwo-Enzymmischung als die Verwendung von Tris-HCl-Puffer.
Spur 1 und 2: 15 kb Fragment aus tPA-Gen mit Taq/Pwo-Enzymmischung und Tris-HCl-Puffer
Spur 2 und 3: 15 kb Fragment aus tPA-Gen mit Taq/Pwo-Enzymmischung und Tricine-NH₃-Puffer.

Die folgenden Beispiele verdeutlichen die Erfindung weiter:

Beispiel 1

In den gezeigten Beispielen wurde als Taq/Pwo/PPase Enzymmischung (erfindungsge mäß) die thermostabilen Polymerasen von Thermus aquaticus (Taq) und Pyrococcus woesii (Pwo) sowie die thermostabile PPase von Thermus thermophilus verwendet. Das Mischungsverhältnis der beiden Polymerasen war 10 : 1 (Taq:Pwo) nach Aktivität (Units). Das Mischungsverhältnis Polymerasen zu PPase war 3,6 : 1 nach Aktivität (Units). Eine typische Enzymmischung war 3,5 U Taq Polymerase + 0,3 U Pwo Poly merase + 1 U PPase pro µl. Die Enzymmischung wurde in Lagerpuffer (20 mM Tris/HCl, pH 7,5 (20°C), 100 mM KCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,5% Tween 20, 0,5% Nonidet P40, 50% Glycerin) bei -20°C gelagert.

Die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) wurde im 50 µl Volumen durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen für die Enzymmischung war wie folgt:

PCR-Puffer: 7,5 mM (NH₄)₂SO₄; 50 mM Tricine/NH₃ (20°C) DMSO 2%, 0,5% Tween 20; 50 mM Mercapto ethanol pH 9,0
MgCl₂: 2,35 mM
Enzymmischung: 2,6 U (0,75 µl)
dNTP: 500 µM (jeweils)
Primer forward: 300 nM
Primer reverse 300 nM.

Als Template wurde 250 ng genomische DNA (human) verwendet. Folgende Primerpaare und Bedingungen wurden verwendet:

1) Beta-Globin Primer 1 + 2 (23 kb)
2) tPA-Primer 1 + 2 (24 kb)
3) tPA Primer 1 + 3 (27 kb)
4) Beta-Globin Primer 3 + 2 (28,3 kb)
5) Beta-Globin Primer 1 + 4 (29,9 kb)
6) Beta-Globin Primer 1 + 5 (31 kb)
7) Beta-Globin Primer 6 + 2 (35 kb).

Der PCR Ansatz wurde über zwei Mastermixe hergestellt:

Kurz vor Zyklusbeginn auf Eis Mastermix 1 (25 µl) und Mastermix 2 (25 µl) zusammen pipettieren. Gut mischen (es muß gewährleistet sein, daß die Komponenten gut durch mischt sind) und Reaktionsansatz mit 30 µl Mineralöl bedecken.

Die Amplifikationen wurden in einem Perkin Elmer GenAmp 9600 Thermocycler mit folgendem Cycleprogramm durchgeführt:

20 µl des erhaltenen PCR Produktes wurde auf einem 0,5%igen Agarose-Gel analysiert.

Abb. 1 zeigt die Amplifikation von 23 kb, 24 kb, 27 kb, 28,3 kb, 29,9 kb, 31 kb und 35 kb Fragmenten aus humaner, genomischer DNA mit Taq/Pwo/PPase-Enzym mischung (erfindungsgemäß).

Beispiel 2

Die Amplifikationsbedingungen waren identisch wie im Beispiel 1. Neben der Taq/Pwo/PPase Enzymmischung und des Tricine-NH₃-Puffers wurde noch eine Taq/Pwo Enzymmischung mit dem Verhältnis 10 : 1 nach Units und ein Tris-HCl-Puffer (50 mM Tris-HCl pH 9,2, 16 mM (NH₄)₂SO₄, DMSO 2%, Tween 20, 1%, 2,25 mM MgCl₂) ver wendet.

Template DNA (human-genomische DNA) war 250 ng. Als Primer wurde Beta-Globin Primer 3 als forward Primer und Beta-Globin Primer 2 als reverse Primer verwendet.

Abb. 2 zeigt die Amplifikation eines 28,3 kb Fragments aus dem humanen beta-Globin Gen mit Taq/Pwo-Mischung ohne PPase (Stand der Technik) und Taq/Pwo/PPase Mischung (erfindungsgemäß) mit Tris Puffer (Stand der Technik) und Tricine-NH₃ Puffer (erfindungsgemäß).

Die Enzymmischung mit PPase zeigt bei jeder Pufferbedingung deutlich mehr PCR Produkt als die Enzymmischung ohne PPase. Die größte Produktausbeute wird aber nur in der Kombination von Enzymmischung mit PPase und dem Tricine-NH₃ Puffer erzielt.

Beispiel 3

Eine Reihe von verschiedenen PCR Fragmenten wurden aus 10 ng Lambda DNA ampli fiziert. Die Bedingungen für die PCR Reaktion sowie das Cycle Programm waren wie in Beispiel 1 beschrieben mit folgenden Änderungen.

Es wurden 25 Zyklen mit folgende Primerpaare und Bedingungen verwendet:

1) Lambda Primer 1 und 2 (20 kb)
2) Lambda Primer 1 und 3 (25 kb)
3) Lambda Primer 1 und 4 (30 kb)
4) Lambda Primer 1 und 5 (35 kb)
5) Lambda Primer 1 und 6 (40 kb)
6) Lambda Primer 7 und 6 (47 kb).

Abb. 3 zeigt die Amplifikation von 20 kb, 25 kb, 30 kb, 35 kb, 40 kb und 47 kb aus Lambda DNA mit Taq/Pwo/PPase-Enzymmischung (erfindungsgemäß).

Beispiel 4

Die Amplifikationbedingungen als auch die Zyklenbedingungen waren wie im Beispiel 3 aufgeführt, mit folgenden Änderungen:
Die Menge an Lambda DNA war 10 pg für das 20 kb und 25 kb Fragment und 1 ng für die anderen Beispiele.

Die Taq/Pwo Enzymmischung sowie der dazu verwendete Tris-HCl-Puffer ist wie unter Beispiel 3 beschrieben.

Abb. 4 zeigt die Amplifikation von 20 kb, 25 kb, 30 kb, 35, kb und 40 kb Frag menten aus Lambda DNA mit Taq/Pwo-Mischung ohne PPase und Tris-HCl-Puffer (Stand der Technik) und Taq/Pwo/PPase Mischung und Tricine-NH₃ Puffer (erfindungs gemäß) unter Verwendung von limitierender Menge an Lambda DNA.

Beispiel 5

Die Amplifikationsbedingungen entsprechen den in Beispiel 1 (Tricine-Puffer) und Beispiel 2 (Taq/Pwo-Enzymmischung und Tris-Puffer) beschriebenen. Als Template-DNA (human genomische DNA) wurden 50 ng eingesetzt. Als Primer wurden TPA-Primer 4 (forward) und tPA Primer 5 (reverse) eingesetzt; die Annealing-Temperatur betrug 63°C; die Elongationszeit war 10 Minuten. Es wurden 30 Zyklen durchgeführt.

Abb. 5 zeigt, daß die Verwendung des Tricine-NH₃-Puffer deutlich mehr PCR-Produkt in Kombination mit Taq/Pwo-Enzymmischung als die Verwendung von Tris-HCl-Puffer ergibt.

Sequenzprotokoll

Claims

1. Verfahren zur spezifischen Vervielfältigung von ein- oder doppelsträngigen DNA-Fragmenten in Gegenwart mindestens eines geeigneten Primer-Paares, einer zwi schen pH 8,8 und 9,2 puffernden Substanz, sämtlicher für die DNA-Kettenver längerung erforderlichen Nukleotide (dNTPs) und einer Enzymmischung, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymmischung aus einer thermophilen DNA-Poly merase mit proofreading-Aktivität, einer thermophilen DNA-Polymerase ohne proofreading-Aktivität und einer thermostabilen Pyrophosphatase besteht und nach gegebenenfalls stattgefundenem Denaturierungsschritt, der Elongations schritt zwischen 10 und 35 Minuten bei 66-70°C durchgeführt wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein- oder doppel strängige DNA-Fragmente, die länger als 20 kb sind, amplifiziert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als puffernde Substanz Tricine-Ammoniak verwendet wird und Ammoniumsulfat verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Tricine-Ammoniak-Puffer in einer Konzentration von 5-100 mM und Ammoniumsulfat in einer Konzentration von 5-20 mM vorliegt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzym mischung eine DNA-Polymerase ohne proofreading-Aktivität im Überschuß auf weist.

6. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die thermostabile Pyrophosphatase in einem Verhältnis von ca. 0,5-0,1 Ein heiten zu ca. 1 Einheit der gesamten Polymeraseaktivität vorliegt.

7. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymmischung eine DNA-Polymerase erhältlich aus Pyrococcus woesii, eine DNA-Polymerase erhältlich aus Thermus aquaticus und eine Pyrophospha tase erhältlich aus Thermus thermophilus aufweist, wobei die Gesamtenzymakti vität ca. 0,5 U bis 5,0 U in der Reaktionsmischung beträgt.

8. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Magnesiumionen in einem Konzentrationsbereich von 0,5 bis 5,0 mM zu gegen sind.

9. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Magnesiumionen in einem Konzentrationsbereich von ca. 1,5 bis 3,0 mM zugegen sind und/oder die Konzentration der einzelnen dNTPs jeweils über 200 µM beträgt.

10. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ungefähr 5 bis 10 mM Ammoniumsulfat in der Reaktionsmischung, die einen Ausgangs-pH-Wert von ca. 9,0 aufweist, vorhanden sind.

11. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Elongationstemperatur ca. 68°C beträgt.

12. Enzymmischung bestehend aus einer thermophilen DNA-Polymerase mit proof reading-Aktivität und einer thermophilen DNA-Polymerase ohne proofreading-Aktivität im Verhältnis 1 : 10 sowie einer Mischung dieser Polymerasen zur Pyrophosphatase erhältlich aus Thermus thermophilus im Verhältnis 3,5 : 1 wobei die Konzentration der Enzyme so angelegt ist, daß sie 0,5 bis 5,0 Einheiten/Volu men Reaktionsmischung beträgt und die Reaktionsmischung einen Tricine-Am moniak-Puffer sowie ein Ammoniumsalz enthält.

13. Enzymmischung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine DNA-Polymerase aus erhältlich Pyrococcus woesii, eine DNA-Polymerase erhältlich aus Thermus aquaticus und eine Pyrophosphatase erhältlich aus Thermus thermo philus sowie Magnesiumionen in einer Konzentration von 0,5 bis 5,0 mM enthal ten sind.

14. Verwendung der Enzymmischung gemäß Anspruch 12 oder 13 zur Vervielfälti gung langer DNA-Fragmente und/oder Markierung von DNA-Fragmenten mit modifizierten Nukleotiden.

15. Verwendung gemäß Anspruch 12 oder 13 dadurch gekennzeichnet, daß DNA-Fragmente länger als 20 kb erzielbar sind.

16. Verwendung einer Mischung, die einen Tricine-Ammoniak-Puffer in einer Kon zentration von ca. 5-100 mM, Ammoniumsulfat in einer Konzentration von ca. 5,0-25 mM, von ca. 2-4% DMSO, ca. 0,05-0,5% TWEEN 20 und Mercapto ethanol in einer Konzentration von ca. 10 mM aufweist, zur Amplifizierung von DNA-Fragmenten.