DE60212175T2

DE60212175T2 - Verfahren zur reduzierung unspezifischer amplifikation bei pcr

Info

Publication number: DE60212175T2
Application number: DE60212175T
Authority: DE
Inventors: J. Ian Moss Beach MCLAUGHLIN; Rao Sulekha Half Moon Bay COTICONE; Will White Salmon BLOCH
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 2001-10-31
Filing date: 2002-07-30
Publication date: 2006-10-12
Anticipated expiration: 2022-07-31
Also published as: ATE329061T1; CA2464885A1; US6783940B2; AU2002365068A1; EP1446508A4; WO2003054209A2; JP2005512572A; WO2003054209A3; EP1446508B1; EP1446508A2; US20030104395A1; DE60212175D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf das Reduzieren nichtspezifischer Amplifikation in Polymerasekettenreaktionen. Genau gesagt, bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung von Sorbitol und Dimethylsulfoxid (DMSO) in Polymerasekettenreaktionen in einer Menge, die effizient ist, die Ausbeute an Zielmolekülen zu erhöhen.
Hintergrund der verwandten Technik
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) hat viel zum Fortschritt in dem Gebiet der Molekularbiologie beigetragen, indem sie die Amplifikation und Analyse von spezifischen Fragmenten von DNA erlaubte. Während PCR im Prinzip einfach ist, ist sie anfällig für zahlreiche Arten von Artefakten, die die Analyse behindern. Zum Beispiel kann beobachtete nichtspezifische Amplifikation von Fragmenten daraus folgen, dass einer oder beide der Primer an eine Sequenz, die anders ist als die Zielsequenz, binden und eine oder mehrere Fragmente DNA produzieren, die nicht das gewünschte Produkt sind.
Nichtspezifische Amplifikation von DNA ist oft ein Problem bei der Amplifikation von konservierten Sequenzen, wie ribosomaler DNA. Ribosomale RNA (rRNA) ist die bei weitem häufigste RNA Art in einer Zelle, und stellt typischerweise 85%–90% der Gesamt-RNA dar. rRNA wird durch ribosomale DNA (rDNA) kodiert. Jede Untereinheit der rRNA wird durch eine separate rDNA kodiert, obwohl in den meisten Organismen zahlreiche rRNA Gene existieren. Die Mitochondrien von Eukaryoten und die Chloroplasten von Pflanzen beinhalten auch ihre eigenen rRNA Gene.
Ribosomale RNA wurde bei Hybridisierungsuntersuchungen für die genetische Analyse, für Evolutionsuntersuchungen und für die taxonomische Klassifizierung verwendet. Jedoch sind rRNA Gensequenzen bei stark unterschiedlichen Organismen mindesten in Teilbereichen ähnlich, und fast alle der rRNA Gensequenzen aus eng verwandten Organismen kreuzhybridisieren. In PCR Untersuchungen ist die spezifische Amplifikation von rDNA Sequenzen wegen des Verwandtschaftsgrades der Sequenzen schwierig. Amplifikation von rDNA durch PCR ergibt oft nichtspezifische Amplifikation, wodurch die Analyse sehr verkompliziert wird.
Dokument EP969101 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis einer einzelsträngigen RNA enthaltend eine spezifische Nukleinsäuresequenz in einer Probe bei fast konstanter Temperatur, das nicht dem wiederholten raschen Aufheizen und Abkühlen der Lösungen in Polymerasekettenreaktionen bedarf. Dieses Verfahren wird verwendet, um virale RNA und bakterielle mRNA nachzuweisen und zu quantifizieren, zur Diagnose von infektiösen Krankheiten und zur Beurteilung der Auswirkungen von therapeutischen Agentien auf infektiöse Krankheiten.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einiger Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren werden Verfahren bereitgestellt zum Reduzieren nichtspezifischer Amplifikation von DNA in einer Polymerasekettenreaktion umfassend die Schritte:

(a) Bereitstellen einer Probe umfassend eine interessierende Ziel-DNA-Sequenz;
(b) Kontaktieren besagter Probe mit wenigstem einem Enzym mit Nukleinsäure-Polymerase-Aktivität; und
(c) Inkubieren besagter Probe mit besagtem Enzym für eine Dauer und unter Bedingungen ausreichend um besagte Ziel-DNA-Sequenz zu amplifizieren, Bilden einer amplifizierten Ziel-DNA-Sequenz;
(d) wobei besagte Inkubation in der Gegenwart einer effizienten Menge an 0,05 bis 3 M Sorbitol, oder an 0,05 bis 3 M Sorbitol und DMSO durchgeführt wird, um besagte nichtspezifische Amplifikation im Vergleich zu der Menge an nichtspezifischer Amplifikation, die in der Abwesenheit von Sorbitol, oder Sorbitol und DMSO, beobachtet wird, zu reduzieren.

In einigen Ausführungsformen werden auch Verfahren zur Amplifikation ribosomaler DNA in einer Polymerasekettenreaktion bereitgestellt umfassend die Schritte:

(a) Bereitstellen einer Probe umfassend eine interessierende ribosomale Ziel-DNA-Sequenz;
(b) Amplifizieren wenigstens einer Nukleobasensequenz von besagter ribosomaler DNA, um ein amplifizierte ribosomale DNA in einer Mischung des vollständigen amplifizierten Produkts zu bilden;

In einigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren, werden Verfahren bereitgestellt um Bakterien in einer Probe nachzuweisen umfassend: Bereitstellen einer Probe umfassend Nukleinsäure, besagte Nukleinsäure umfassend wenigstens eine ribosomale DNA Sequenz, wodurch ein amplifiziertes Produkt gebildet wird; wobei besagte Amplifikation in der Gegenwart einer effizienten Menge Sorbitol durchgeführt wird, um die nichtspezifische Amplifikation im Vergleich zu der Menge an nichtspezifischer Amplifikation, die in der Abwesenheit von Sorbitol beobachtet wird, zu reduzieren. Der Amplifikationsschritt kann auch eine wirksame Menge an DMSO in Kombination mit Sorbitol beinhalten.
Sorbitol liegt in einer Menge von 0.05 M bis 3.0 M vor. Alternativ kann Sorbitol in einer Menge von 0.05 M bis 2 M vorliegen. In anderen Ausführungsformen kann Sorbitol in einer Menge von 0.05 M bis 1 M vorliegen. In anderen Ausführungsformen wird Sorbitol in einer Menge von 0.05 M bis 0.75 M hingegeben. In anderen Ausführungsformen kann Sorbitol in einer Menge von 0.1 M bis 0.45 M vorliegen. In anderen Ausführungsformen kann Sorbitol in einer Menge von 0.2 M bis 0.4 M vorliegen. In anderen Ausführungsformen kann Sorbitol in einer Menge von 0.25 M bis 0.35 M vorliegen.
In einigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren liegt DMSO in einer Menge von 0.5% bis 8.0% vor. In anderen Ausführungsformen liegt DMSO in einer Menge von 1.0% bis 6.0% vor. In anderen Ausführungsformen liegt DMSO in einer Menge von 2.0% bis 5.0% vor. In anderen Ausführungsformen liegt DMSO in einer Menge von 3.0% bis 4.0% vor.
In einigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren liegt DMSO in einer Menge von 1.25% und Sorbitol in einer Menge von 0.15 M vor.
In einigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren, wird die nichtspezifische Amplifikation auf weniger als 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50% oder 40%, 30% oder mehr der Menge an nichtspezifischer Amplifikation reduziert, die in der Abwesenheit von Sorbitol oder Sorbitol und DMSO erlangt wird.
In einigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren stellt die amplifizierte Zielsequenz wenigstens 50–70% der Gesamtmenge des amplifizierten Produkts dar. In anderen Ausführungsformen stellt die amplifizierte Zielsequenz wenigstens 70–90% der Gesamtmenge des amplifizierten Produkts dar. In anderen Ausführungsformen stellt die amplifizierte Zielsequenz wenigstens 90% der Gesamtmenge des amplifizierten Produkts dar.
In bestimmten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Verfahren zum Reduzieren geeignet die nichtspezifische Amplifikation von DNA, die ribosomale RNA kodiert, zu reduzieren. In einigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren können die amplifizierten Produkte im Anschluss über ein siebendes oder nicht-siebendes Medium getrennt werden. Die Nukleinsäuresequenz der amplifizierten Produkte kann mit oder ohne vorherige Auftrennung bestimmt werden.
Die Proben, die ribosomale DNA enthalten, können klinische Proben wie Blut, Urin, Rückenmarksflüssigkeit, Serum, Speichel, Mucus, Hautschabung, Darmabsonderungen und/oder Fäzes sein.
In einigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren, umfasst die Amplifikation das Kontaktieren besagter Nukleobasensequenz mit einem Enzym, das Polymerase Aktivität besitzt. Zum Beispiel kann das Enzym, das Polymerase Aktivität besitzt, ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, anderen Thermus Arten, Bacillus Arten, Thermococcur Arten, Thermotoga Arten, und Pyrococcus Arten. Zum Beispiel beinhalten geeignete Polymerasen AmpliTaq Gold^® DNA Polymerase; AmpliTaq DNA Polymerase; Stoffel Fragment; rTth DNA Polymerase; rTth DNA Polymerase XL; Bst DNA Polymerase großes Fragment aus Bacillus stearothermophilus; Vent und Vent Exo- aus Thermococcus litoralis, Tma aus Thermotoga maritima; Deep Vent und Deep Vent Exo- und Pfu aus Pyrococcus, und Mutanten, Varianten und Derivate davon.
In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit umfassend:

(a) ein Nukleinsäuresequenz umfassend eine ribosomale DNA;
(b) wenigstens zwei Primer, die eine Sequenz besitzen, die komplementär ist zu einem Teil besagter Nukleinsäuresequenz angrenzend an besagte ribosomale DNA;
(c) wenigstens ein Enzym, das Nukleinsäure-Polymerase-Aktivität besitzt; und
(d) Sorbitol oder Sorbitol und DMSO.

In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung Kits für die Amplifikation von ribosomaler DNA zur Verfügung umfassend in einem oder mehreren Behältern: ein Agens, das Polymerase Aktivität besitzt, eine Vielzahl an Deoxyribonukleotidtriphosphaten; und Sorbitol, und optional DMSO. Die Polymerase des Kits kann eine DNA Polymerase aus Thermur aquaticus, Thermus thermophilus, anderen Thermus Arten, Bacillus Arten, Thermococcus Arten, Thermotoga Arten, und Pyrococcus Arten sein. Zum Beispiel beinhalten geeignete Polymerasen AmpliTaq Gold^® DNA Polymerase; AmpliTaq DNA Polymerase; Stoffel Fragment; rTth DNA Polymerase; rTth DNA Polymerase XL; Bst DNA Polymerase großes Fragment aus Bacillus stearothermophilus; Vent und Vent Exo- aus Thermococcus litoralis; Tma aus Thermotoga maritima; Deep Vent und Deep Vent Exo- und Pfu aus Pyrococcus; und Mutanten, Varianten und Derivate davon.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt eine Titrierung mit Sorbitol bei PCR Amplifikationen, die auf das 16S rRNA Gen in Escherichia coli gerichtet sind, die auf einem Agarosegel aufgetrennt wurde. Das gewünschte Produkt ist bei 1500 bp.
2 zeigt eine Titrierung mit DMSO bei PCR Amplifikationen, die auf das 16S rRNA Gen in Escherichia coli gerichtet sind, die auf einem Agarosegel aufgetrennt wurde. Das gewünschte Produkt ist bei 1500 bp.
3 zeigt PCR Amplifikationen, die auf das 16S rRNA Gen in Escherichia coli gerichtet sind, in der Gegenwart von Sorbitol (0.15 M) und DMSO (1.25%), die auf einem Agarosegel aufgetrennt wurden. Das gewünschte Produkt ist bei 1500 bp.
4 zeigt PCR Amplifikationen, die auf das 16S rRNA Gen in Escherichia coli gerichtet sind, in der Gegenwart von unterschiedlichen Mengen an Sorbitol, 0.15 M Sorbitol und 1.25% DMSO, oder keinem Zusatz, die auf einem Agarosegel aufgetrennt wurden. Das gewünschte Produkt ist bei 1500 bp. Abbildungstafel 4a zeigt Sparnummern 1 bis 30, und Abbildungstafel 4b zeigt Sparnummern 31 bis 67.
Eingehende Beschreibung
Für den Fall, dass ein Konflikt zwischen irgend einer der Literaturstellen und der genauen Lehre dieser Beschreibung auftritt, soll die Beschreibung vorgehen.
Die meisten der in dieser Beschreibung verwendeten Wörter haben die Bedeutung, die diesen Wörtern von einem Fachmann zugeschrieben würden. Wörter, die in dieser Beschreibung spezifisch definiert wurden, besitzen die Bedeutung, die im Kontext der vorliegenden Erfindung als Ganzes vorliegt, und wie sie üblicherweise von den Fachleuten verstanden wird. Für den Fall, dass ein Konflikt zwischen einer Definition eines Wortes oder eines Ausdrucks, wie sie in der Technik verstanden werden, und einer Definition eines Wortes oder eines Ausdrucks, wie sie speziell in dieser Beschreibung gelehrt wird, auftritt, soll die Beschreibung vorgehen. Hier verwendete Uberschriften dienen lediglich der Bequemlichkeit, und sollten nicht als in irgend einer Weise einschränkend verstanden werden.
Standartreferenzwerke, die die allgemeinen Prinzipien der Technik der rekombinanten DNA darlegen, die dem Fachmann bekannt sind, beinhalten Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1998 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. Aus.) Sambrook, J. & D. Russel, Hrg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Kaufmann et al., Hrg., HANDBOOK OF MOLECULAR AND CELLULAR METHODS IN BIOLOGY AND MEDICINE, CRC Press, Boca Raton, 1995; McPhrson, Hrg., DIRECTED MUTAGENESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press, Oxford, 1991.
Wie hier verwendet, bezeichnet „DMSO" Dimethylsulfoxid.
Wie hier verwendet, bezeichnet „Sorbitol" das Polyol (Zuckeralkohol), das Glucose entspricht, dargestellt durch die folgende strukturelle Formel:
Wie hier verwendet, bezeichnet der Ausdruck „isoliertes Nukleinsäuremolekül" ein Nukleinsäuremolekül (DNA oder RNA), das aus seiner natürlichen Umgebung entfernt wurde. Wie hier verwendet, bezeichnet „DNA" ein Deoxyribonukleinsäure in ihren verschiedenen Formen, wie sie in der Technik bekannt sind, wie genomische DNA, cDNA, isolierte Nukleinsäuremoleküle, Vektor DNA, chromosomale DNA. „Nukleinsäure" bezeichnet DNA oder RNA in jeglicher Form. Beispiele für isolierte Nukleinsäuremoleküle beinhalten, sind aber nicht eingegrenzt auf, rekombinante DNA Moleküle, enthalten in einem Vektor, rekombinante DNA Moleküle, die in einer heterologen Wirtszelle gehalten werden, teilweise oder im Wesentlichen aufgereinigte Nukleinsäuremoleküle, und synthetische DNA Moleküle. Typischerweise ist eine „isolierte" Nukleinsäure frei von Sequenzen, die normalerweise an die Nukleinsäure (d.h. Sequenzen, die sich an den 5' und 3' Enden der Nukleinsäure befinden,) in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure abgeleitet ist, angrenzen. Darüber hinaus ist ein „isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA Molekül, im Allgemeinen im Wesentlichen frei von anderem zellulären Material und Kulturmedium, wenn sie durch Rekombinationstechniken hergestellt wird, oder von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, wenn sie chemisch synthetisiert wird.
Wie hier verwendet, bezeichnet „rDNA" DNA Sequenzen, die ribosomale RNA kodieren.
Wie hier verwendet, bezeichnet „Nukleobasensequenz" eine Sequenz von aufeinander folgenden Nukleobasen.
Wie hier verwendet, bezeichnet „nichtspezifische Amplifikation" Amplifikation eines Bereichs von DNA, der nicht Teil der DNA ist, die Ziel-DNA ist. Als solche kann nichtspezifische Amplifikation Amplifikation eines Bereichs von DNA sein, die in keiner Beziehung zur Ziel-DNA steht; Amplifikation einer verwandten DNA Sequenz, aber von einem Bereich der DNA, der verschieden ist von dem, auf den die Amplifikation abzielt; oder Amplifikation der Ziel-Sequenz, die aber wegen ungenauen „Annealings" wenigsten eines Primers an die Zielsequenz mehr oder weniger Nukleobasen umfasst als die des angestrebten amplifizierten Fragments.
Wie hier verwendet, bedeutet „Annealen" eine spezifische Wechselwirkung zwischen Strängen an Nukleotiden, wobei die Stränge im Wesentlichen aufgrund von Komplementarität zwischen den Strängen, wie sie durch Watson-Crick Basenpaarung bestimmt werden, aneinander binden. Es ist nicht notwendig, dass die Komplementarität 100% ist, damit es zum Annealing kommt.
Wie hier verwendet, bezeichnet „Amplifizieren" die enzymatische Erhöhung der Anzahl einer spezifischen Nukleotidsequenz in einer Polymerasekettenxeaktion.
Wie hier verwendet, bezeichnet „Inkubieren" die Beibehaltung eines Zustandes kontrollierter Bedingungen wie Temperatur über eine bestimmte Zeitdauer.
Wie hier verwendet, bezeichnet „Denaturierung" die Trennung von Nukleotidsträngen, die in einem annealten Zustand sind.
Wie hier verwendet, bedeutet „ausreichende Zeitdauer", wenn auf die Zeit zur Amplifikation von Nukleinsäure Bezug genommen wird, die Zeitdauer, die dem verwendeten Enzym erlaubt, die Polymerisation von Deoxynukleotidtriphosphaten zu den amplifizierten Nukleinsäuren zu vervollständigen. Die benötigte Zeitdauer schwankt in Abhängigkeit von mehreren Faktoren, die dem Fachmann wohl bekannt sind. Allgemeine Prinzipien der PCR und von Strategien zur Amplifikation können in Texten wie Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 2001 und THE POLYMERASE CHAIN REACTION, K.B., F. Ferre, und R.A. Gibbs, Hrg. Birkhauser, Boston, 1994; und MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (3. Aus.) Sambrook, J. & D. Russel, Hrg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001) gefunden werden.
Wie hier verwendet, bezeichnen "ausreichende Bedingungen, um zu amplifizieren" Reaktionsbedingungen für PCR Reaktionen. Die Reaktionsbedingungen beinhalten chemische Reaktionskomponenten, die in den Reaktionszyklen verwendeten Temperaturen, die Anzahl der Reaktionszyklen, und die Zeitdauer der Stufen der Reaktionszyklen, wie hier ausführlicher beschrieben ist.
Typischerweise wird gepuffertes Wasser als Umgebung für die Reaktion verwendet. Die anderen chemischen Komponenten von Standaxt-PCR-Reaktionen beinhalten eine DNA Polymerase, Deoxyribonucleosidtriphosphate („dNTPs"), Oligonukleotid Primer, Zweiwertige Metallionen, und eine DNA Probe, bei der erwartet wird, dass sie das PCR Zielobjekt enthält.
Die Lösung, die für PCR verwendet wird, enthält typischerweise ein Pufferagens wie Tris-HCl und nicht puffernde Salze wie KCl. Das Pufferungsagens können jede in der Technik bekannten Puffer sein, und können durch Routine Experimente verändert werden, um die PCR Ergebnisse zu optimieren. Fachleute werden problemlos in der Lage sein, die optimalen Pufferbedingungen zu bestimmen. Einige PCR Puffer können abhängig von dem verwendeten Enzym optimiert werden. Zum Beispiel besitzt, wenn auch nicht einschränkend, AmpliTaq Gold^® DNA Polymerase eine optimale KCl Konzentration von 50 mM, AmpliTaq DNA Polymerase; Stoffel Fragment eine optimale KCl Konzentration von 10 mM und rTth DNA Polymerase; rTth DNA Polymerase XL eine optimale KCl Konzentration von 75–100 mM.
Zweiwertige Metallionen sind oft von Vorteil, um der Polymerase zu erlauben effektiv zu funktionieren. Zum Beispiel erlaubt, wenn auch nicht einschränkend, das Magnesium Ion bestimmten DNA Polymerasen effektiv zu funktionieren. Typischerweise wird MgCl₂ oder MgSO₄ den Reaktionspuffern hinzu gegeben, um die optimale Magnesium Ionen Konzentrationen zur Verfügung zu stellen. Die Magnesium Ionen Konzentration, die für optimale PCR Amplifikation benötigt wird, kann von einem spezifischem Satz von verwendeten Primern und „Template" abhängen. Somit wird die Menge an Magnesiumsalz, die hinzu gegeben wird, um optimale Amplifikation zu erreichen, oft empirisch bestimmt werden, und ist in der Technik eine Routinevorgehensweise. Im Allgemeinen, kann die Konzentration von Magnesium Ionen für optimale PCR zwischen 1 und 10 mM schwanken. Eine typischer Bereich für die Magnesium Ionen Konzentration bei PCR Reaktionen ist zwischen 1.0 und 4.0 mM, wobei sie um einen Mittelwert von 2.5 mM schwanken.
Jedes der Deoxynukleotidtriphosphate („dNTPs", Deoxyadenosintriphosphat („dATP"), Deoxyguanonsintriphosphat („dGTP"), Deoxycytidintriphosphat („dCTP"), Deoxythymidintriphosphat („dTTP"), die die Bausteine der amplifizierten Nukleinsäuremoleküle sind, werden typischerweise in Standart PCR Reaktionen bei einer Konzentration von 40–200 μM zur Verfügung gestellt. Andere dNTPs, wie Deoxyuridintriphosphat („dUTP", und dNTP Analoge und konjugierte dNTPs können auch verwendet werden, und sind durch den Begriff „dNTPs", wie her verwendet, umfasst. Während die Verwendung von dNTPs bei solchen Konzentrationen mit den erfindungsgemäßen Verfahren möglich ist, können Konzentrationen von dNTPs höher als 200 μM vorteilhaft sein. Somit ist in einigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren die Konzentration der dNTPs im Allgemeinen mindestens 500 μM für jedes einzelne dNTP bis zu 2 mM für jedes einzelne dNTP. In einigen weiteren Ausführungsformen, sind die Konzentrationen von jedem einzelnen dNTP von 0.5 mM bis 1 mM.
Das Enzym, das die Nukleotidtriphosphate in die amplifizierten Fragmente der PCR polymerisiert, kann jede DNA Polymerase sein, einschließlich Hitze stabiler Polymerasen, die in der Technik bekannt sind. Polymerasen, die in der Erfindung verwendet werden können, schließen ein, sind aber nicht eingegrenzt auf, Polymerasen aus solchen Organismen wie Thermur aquaticus, Thermur thermophilus, Thermococcus litoralis, Bacillus stearotheimophilus, Thermotoga maritima und Pyrococcur ssp. Das Enzym kann aus Bakterien isoliert, durch rekombinante DNA Technologie hergestellt oder von kommerziellen Quellen bezogen werden. Zum Beispiel sind DNA Polymerasen verfügbar von Applied Biosystems und beinhalten AmpliTaq Gold^® DNA Polymerase; AmpliTaq DNA Polymerase; Stoffel Fragment; rTth DNA Polymerase; rTth DNA Polymerase XL. Andere geeignete Polymerasen beinhalten, sind aber nicht eingegrenzt auf, Tne, Bst DNA Polymerase großes Fragment aus Bacillus stearothermophilus; Vent und Vent Exo- aus Thermococcus litoralis, Tma aus Thermotoga maritima; Deep Vent und Deep Vent Exo- und Pfu aus Pyrococcus; und Mutanten, Varianten und Derivate der vorstehend genannten.
Oligonukleotid Primer werden der Reaktion hinzu gefügt und grenzen die 5' und 3' Enden des amplifizierten Fragments ab. Ein Oligonukleotid Primer anealt an den Sense (+Strang) der denaturierten Template DNA und der andere Oligonukleotidprimer annealt an den Antisense (–Strang) der denaturierten Template DNA. Typischerweise haben die Oligonukleotid Primer eine Länge von 12–25 Nukleotiden, sie können jedoch abhängig von der spezifischen zu amplifizierenden Template Sequenz kürzer oder länger sein, und die Länge der Primer ist nicht essentiell für die Ausführung der Erfindung. Oligonukleotid Primer könne so entworfen sein, dass sie an spezifische Teile der DNA, die an ein interessierendes ribosomales RNA Gen grenzen, annealen, um spezifisch den Teil der DNA zwischen den zu den Primer komplementären Stellen zu amplifizieren. Im Allgemeinen werde Oligonukleotid Primer chemisch synthetisiert. Ein Fachmann kann leicht spezifische Primer entwerfen, um ein zu interessierendes ribosomales RNA Ziel-Gen zu amplifizieren. Weiterhin gibt es viele bekannte Primer Sequenzen, um ribosomale RNA Genbereiche zu amplifizieren. Jede von diesen kann verwendet werden und sind innerhalb des Geltungsbereichs dieser Erfindung.
Die Oligonukleotid Primer können zusammengesetzt sein aus Adenosin, Thymidin, Guanosin, Urazil, Nukleosid Analogen (z.B. geschlossenen Nukleinsäuren (LNA), Peptid Nukleinsäuren (RNA), Phosphoramidite) und Nukleosiden enthaltend oder konjugiert mit chemische(n) Einheiten wie Radionukleotiden (z.B. ³²P, ³⁵S), fluoreszierenden Molekülen, Binder an die kleine Grube, oder jeglichen anderen Nukleosid Konjugaten, die in der Technik bekannt sind.
In einigen erfindungsgemäßen Ausführungsformen wird ein Fluorophor verwendet, um wenigsten einen Primer der PCR Reaktion zu markieren. In einigen Ausführungsformen können die Primer für verschiedene Ziel-Fragmente mit verschiedenen Fluorophoren markiert (,die unterschiedlich gefärbte Produkte erzeugen) und in der gleichen Multiplex PCR Reaktion verwendet und anschließend zusammen analysiert werden. Typischerweise ist der Vorwärts Primer markiert, aber der Rückwärts Primer kann auch markiert sein. Beispiele für Fluorophore beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Fluorescein (,das mit einem Maximum bei 492 nm absorbiert und mit einem Maximum bei 520 nm emittiert); TAMRA, N,N,N',N'-Tetramethyl-6-Carboxyrhodamin (,das mit einem Maximum bei 555 nm absorbiert und mit einem Maximum bei 580 nm emittiert); FAM, 5-Carboxyfluoreszein (,das mit einem Maximum bei 495 nm absorbiert und mit einem Maximum bei 525 nm emittiert); JOE, 2',7'-Dimethoxy-4',5'-Dichloro-6-Carboxyfluoreszein (,das das mit einem Maximum bei 525 nm absorbiert und mit einem Maximum bei 555 nm emittiert), ROX, 6-Carboxy-X-Rhodamin (,das mit einem Maximum bei 585 nm absorbiert und mit einem Maximum bei 605 nm emittiert); CY3 (, das mit einem Maximum bei 552 nm absorbiert und mit einem Maximum bei 570 nm emittiert); CY5 (, das mit einem Maximum bei 643 nm absorbiert und mit einem Maximum bei 667 nm emittiert); TET, Tetrachloro-Fluoreszin (,das mit einem Maximum bei 521 nm absorbiert und mit einem Maximum bei 536 nm emittiert); und HEX, Hexachloro-Fluoreszein (,das mit einem Maximum bei 535 nm absorbiert und mit einem Maximum bei 556 nm emittiert).
Andere bekannte Komponenten von PCR Reaktionen können innerhalb des Geltungsbereichs der Erfindung benutzt werden. Diese Komponenten beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf, Detergentien (z.B. Triton X-100, Nonidet P-40 (NP-40), Tween-20) und Agentien, die die Fehlpaarung von Nukleotidpaaren spalten, wie Dimethylsulfoxid (DMSO), und Tetramethylammoniumchlorid (TMAC).
Die PCR Reaktionen können auch in der Gegenwart anderer Reagenzien ausgeführt werden, um die Amplifikation zu optimieren. Zum Beispiel kann, ohne sich darauf zu beschränken, Urazil N-Glycosylase (UNG), wie enthalten in dem GeneAmp^® PCR Carry-over Prevention Kit, verwendet werden. UNG kann in der PCR Reaktion als ein erster Schritt verwendet werden, um sicherzustellen, dass PCR Produkte in nachfolgenden PCR Amplifikationen nicht reamplifiziert werden können. Das Prinzip basiert auf einer enzymatischen Reaktion analog der Restriktions-Modifikations und Auschneiden-Reperatur Systeme von Zellen. PCR Produkte aus vorherigen PCR Amplifikationen, bei denen dUTP eingebaut wurde, werden abgebaut. Natürliche Nukleinsäure Templates sind nicht betroffen. Das Verfahren beinhaltet das Ersetzten von dTTP durch dUTP in der PCR Mischung, und Vorbehandeln aller nachfolgenden PCR Mischungen mit dem Urazil N-Glycosylase Enzym vor der PCR Amplifikation. Urazil wird aus den Anfangsprodukten ausgeschnitten unter Verwendung von UNG und eliminiert, indem das sich ergebende basenlose Polynukleotid mit Hitze abgebaut wird. PCR Reaktionsdauer, Temperaturen und die Anzahl der Zyklen können mittels Routine Experimenten verändert werden, um eine spezifische Reaktion zu optimieren. Fachleute werden das Folgende als Leitfaden nehmen können, um die verschiedenen Parameter für PCR Reaktionen zu bestimmen und werden auch erkennen können, dass von einer oder mehrerer Bedingungen abzuweichen innerhalb des Geltungsbereichs der Erfindung liegt.
PCR Reaktionstemperatur und -dauer wird in drei Stufen bestimmt: Denaturierung, Annealing und Verlängerung. Eine Runde von Denaturierung, Annealing und Verlängerung wird als „Zyklus" bezeichnet. Denaturierung wird im Allgemeinen bei einer Temperatur ausgeführt, die es den DNA Strängen erlaubt sich zu trennen, aber nicht die Aktivität der Polymerase zerstört. Im Allgemeinen werden thermostabile Polymerasen verwendet. Nicht Hitze beständige Polymerasen können jedoch verwendet werden, wenn nach jedem Denaturierungsschritt der PCR wieder hinzu gefügt werden. Thermostabile Polymerasen können hohen Temperaturen widerstehen und ein gewisses Aktivitätsniveau beibehalten. Typischerweise wird Denaturierung bei über 90°C und unter 100°C durchgeführt. In einigen Ausführungsformen wird Denaturierung bei einer Temperatur von 94°C–95°C durchgeführt. Denaturierung von DNA wird im Allgemeinen für wenigstens 1 bis 30 Sekunden durchgeführt. In einigen Ausführungsformen wird Denaturierung für 1 bis 15 Sekunden ausgeführt. In anderen Ausführungsformen wird Denaturierung für bis zu 1 Minute oder mehr durchgeführt. Zusätzlich zu der Denaturierung von DNA dient bei einigen Polymerasen, wie AmpliTaq Gold^®, die Inkubation bei der Denaturierungstemperatur auch der Aktivierung des Enzyms. Daher kann es, wenn diese Enzyme verwendet werden, vorteilhaft sein zu erlauben, dass der erste Schritt der PCR (Denaturierung) länger ist als nachfolgende Denaturierungsschritte, wenn diese Enzyme verwendet werden.
Während der Annealen Phase annealen die Oligonukleotid Primer in ihren komplementären Bereichen an die Ziel-DNA und werden im Wesentlichen durch die DNA Polymerase verlängert, sobald letztgenannte an den Primer-Template Duplex gebunden hat.
In einer konventionellen PCR ist die Annealing Temperatur typischerweise bei oder unter dem Schmelzpunkt (T_m) des am wenigsten stabilen Primer-Template Duplex, wobei der T_m durch irgendeines von zahlreichen theoretischen Verfahren, die den Fachleuten wohl bekannt sind, abgeschätzt werden kann. Zum Beispiel kann der T_m bestimmt werden durch die Formel: Tm = (4°C × Anzahl der G und C Basen) + (2°C × Anzahl der A und T Basen)
Typischerweise ist in Standart PCRs die Annealing Temperatur 5°C bis 10°C unter dem geschätzten T_m der am wenigsten stabilen Primer-Template Duplex. Die Annealing Zeit beträgt zwischen ungefähr 30 Sekunden und 2 Minuten. In bestimmten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren erhöht die hohe Konzentration an Sorbitol die Viskosität und scheint bestimmte Schritte der Reaktion zu verlangsamen (z.B. Primer Annealing und Polymerase Bindung an die Primer-Template Duplex). Somit wird in bestimmten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren der Annealing Schritt für ein Zeitdauer ausgeführt, der länger ist als der in Standart PCR Reaktionen, typischerweise für wenigstens 3 Minuten und bis zu 5 bis 6 Minuten. In einigen Ausführungsformen kann die Annealing Zeit auf bis zu 10 Minuten erhöht werden.
Sorbitol erhöht nicht nur die Reaktionsviskosität, sondern ist auch ein mildes DNA Denaturierungsmittel. Somit kann es auch in bestimmten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft sein eine geringere Temperatur zum Annealen der Primer und das Template zu verwenden als sie ein Fachmann in Standart PCR Reaktionen verwenden würde. Im Allgemeinen können in bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen Temperaturen, die niedriger als 10°C unter dem T_M (abgeschätzt in der Abwesenheit eines Zusatzes) sind, angewendet werden. In anderen Ausführungsformen können Temperaturen, die 20°C unter dem T_M (abgeschätzt in der Abwesenheit eines Zusatzes) sind, angewendet werden.
Die Annealing Phase wird typischerweise von der Verlängerungsphase gefolgt. „Verlängerung" wird für eine ausreichende Zeitdauer durchgeführt, um dem Enzym zu erlauben die Primerverlängerung zu den korrekt großen Fragmenten zu vervollständigen. Wie oben diskutiert, erhöht der Zusatz einer hohen Konzentration an Sorbitol die Viskosität der Reaktion, wodurch unüblich lange Verlängerungszeiten in bestimmten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft werden; d.h. die Verwendung von Verlängerungszeiten, die länger sind als die Verlängerungszeiten, die ein Fachmann in Standart PCR Reaktionen verwenden würde. Weiterhin ist, wie oben mit Bezug auf die Annealing Phase angemerkt wurde, Sorbitol ein mildes Denaturierungsmittel. Somit kann es in bestimmten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft sein auch geringe Temperaturen zur Verlängerung zu verwenden als die, die ein Fachmann in Standart PCR Reaktionen verwenden würde. Somit sind in einigen Ausführungsformen die Temperaturen für die Verlängerung unter den Temperaturen, die für die optimale Aktivität der verwendeten Polymerasen berichtet werden.
Die Anzahl der verwendeten PCR Zyklen (Denaturierung, Annealing und Verlängerung) wird die gewünschte Amplifikationsmenge bestimmen. PCR ist eine exponentiale Amplifikation von DNA Molekülen. Somit verdoppelt sich theoretisch nach jedem PCR Zyklus die Anzahl der Fragmente, die im vorherigen Zyklus vorhanden waren. Typischerweise werden 20–30 PCR Zyklen durchgeführt. Noch typischer werden 25–30 Zyklen durchgeführt, obwohl die Zyklus Anzahl nicht besonders eingeschränkt ist.
Bei einigen Ausführungsformen kann es vorteilhaft sein, nach der letzten Phase des letzten PCR Zyklus die Reaktionen bei einer bestimmten Temperatur zu inkubieren. In einigen Ausführungsformen wird eine verlängerte Verlängerungsphase gewählt. In anderen Ausführungsformen wird eine niedrige Temperatur (z.B. 4°C) gewählt.
Bei einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird PCR in der Gegenwart von 0.05 bis 3 M Sorbitol alleine, oder 0.05 bis 3 M Sorbitol und einem Denaturierungsmittel, wie DMSO, durchgeführt, um die Ausbeute der spezifisch amplifizierten Ziel DNA Sequenzen, wie ribosomalen DNA Sequenzen, zu erhöhen. Während es nicht gewünscht ist, an eine bestimmte Theorie der Funktionsweise gebunden zu sein, wird angenommen, dass Sorbitol die spezifische Produktausbeute und die Assay Sensitivität erhöht, wenn DNA amplifiziert wird, und dass die Zugabe von DMSO die spezifische Produktausbeute weiter verbessert.
Bei einigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren können Stereoisomere der Polyole, die die Formel C_nO_nH_n+2 besitzen, wobei 2 < n < 7, in einer Menge von 0.05 M bis 3 M, 0.05 M bis 2 M, 0.05 M bis 1 M, 0.05 M bis 0.75 M, oder 0.05 M bis 0.45 M verwendet werden. Bei einigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren ist das Polyol Sorbitol. Bei einigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren wird Sorbitol in einer Menge hinzu gefügt, die wirksam ist die nichtspezifische Amplifikation im Vergleich zu der Menge an nichtspezifischer Amplifikation, die in der Abwesenheit von Sorbitol beobachtet wird, zu reduzieren. Typischerweise wird Sorbitol in einer Menge von 0.05 M bis 3 M hinzugefügt. In einigen Ausführungsformen wird Sorbitol in einer Menge von 0.05 M bis 2 M hinzugefügt. In anderen Ausführungsformen wird Sorbitol in einer Menge von 0.05 M bis 1 M hinzugefügt. In anderen Ausführungsformen wird Sorbitol in einer Menge von 0.05 M bis 0.75 M hinzugefügt. In anderen Ausführungsformen wird Sorbitol in einer Menge von 0.05 M bis 0.45 M hinzugefügt. In anderen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren wird Sorbitol in einer Menge von 0.1 M bis 0.40 M hinzugefügt. In anderen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren wird Sorbitol in einer Menge von 0.15 M bis 0.35 M hinzugefügt. In anderen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren wird Sorbitol in einer Menge von 0.25 M bis 0.3 M hinzugefügt.
Der Zusatz eines Denaturierungsmittels zu den PCRs kann auch die Ausbeute an spezifischen Ziel-DNA erhöhen. Denaturierungsmittel, die für Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, DMSO, 2-Pyrrolidinin, und 1-Methyl-2-Pyrrolidinon. Andere Denaturierungsmittel können gefunden werden in, zum Beispiel, dem SIGMA CATALOG (2000–2001) Sigma-Aldrich Fine Chemicals, P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178. Denaturierungsmittel können in einer Menge von 0.75% bis 7.0% (Vol/Vol), 1.0% bis 6.0% (Vol/Vol), 1.5% bis 5.0% (Vol/Vol), oder 2.0% bis 4.0% (Vol/Vol) hinzu gegeben werden. In einigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren beträgt die Menge an DMSO typischerweise 0.75% bis 7.0% (Vol/Vol). In einigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren wird DMSO in einer Menge von 1.0% bis 6.0% (Vol/Vol) hinzugefügt. In anderen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren wird DMSO in einer Menge von 1.5% bis 5.0% (Vol/Vol) hinzugefügt. In anderen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren wird DMSO in einer Menge von 2.0% bis 4.0% (Vol/Vol) hinzugefügt.
Das Polyol und Denaturierungsmittel, wie Sorbitol und DMSO, können in Kombination über den für jeden bereitgestellten Bereich in jeglicher Kombination hinzugefügt werden. In bestimmten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren wird Sorbitol, zum Beispiel, in einer Menge von 0.05 M bis 3 M in Kombination mit DMSO in einer Menge von 0.75% bis 7% (Vol/Vol) hinzugefügt. In anderen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren wird Sorbitol in einer Menge von 0.1 M bis 2 M und DMSO in einer Menge von 1% bis 6% (Vol/Vol) hinzugefügt. In anderen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren wird Sorbitol, zum Beispiel, in einer Menge von 0.15 M bis 1 M mit DMSO in einer Menge von 1.25% bis 5% (Vol/Vol) hinzugefügt. In anderen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren wird Sorbitol, zum Beispiel, in einer Menge von 0.2 M bis 0.75 M mit DMSO in einer Menge von 1.5% bis 3% (Vol/Vol) hinzugefügt. In einigen erfindungsgemäßen Ausführungsformen, die in den Beispielen gezeigt werden, wird Sorbitol in einer Menge von 0.15 M und DMSO in einer Menge von 1.25% (Vol/Vol) hinzugefügt.
Wenn PCR unter der Verwendung von Sorbitol bei höheren Konzentrationen (über 1 M) durchgeführt wird, kann es vorteilhaft sein die Annealing Zeit zu erhöhen und/oder die Annealing Temperatur zu erniedrigen, um die PCR Reaktion und die Produktausbeute zu optimieren. Ein Fachmann sollte fähig sein, die Reaktionsbedingungen für das Annealing in Hinblick auf Zeitdauer und Temperatur problemlos zu optimieren, um sie an die hinzugefügte Menge an Sorbitol und/oder DMSO anzupassen. Im Allgemeinen sollte die Annealingtemperatur nicht weniger als 20°C unter dem T_m sein müssen (abgeschätzt in der Abwesenheit eines Zusatzes). Ferner sollte im Allgemeinen die Annealingzeit nicht mehr als 10 Minuten sein müssen (abgeschätzt in der Abwesenheit eines Zusatzes).
In einigen Ausführungsformen können Sorbitol und DMSO den PCRs hinzugefügt werden, um rDNA aus einer großen Vielzahl an Organismen, insbesondere Bakterien, zu amplifizieren. Bakterielle rDNA ist für jede Art einzigartig. Daher umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren Amplifikation von rDNA gekoppelt mit der Sequenzierung des amplifizierten Produkts. Die in dieser Weise gewonnene Sequenz kann mit den Sequenzen, die für bakterielle rDNA bekannt sind, verglichen werden, um eine bakterielle Art in einer Probe genau zu bestimmmen.
In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Probe enthaltend genomische DNA zu einer Haupt PCR Mischung hinzugefügt, die gepuffertes Wasser, Mg²⁺ Polymerase, dNTPs, rDNA Vorwärts und Rückwärts Primer, und Sorbitol, oder Sorbitol und DMSO umfasst, und eine Amplifikation wird ausgeführt. Das amplifizierte Produkt wird zu einer Sequenzierungsreaktion hinzu gegeben, wie zum Beispiel einer Einschritt Sequenzierungsmischung (erhältlich durch Applied Biosystems), und die Sequenz wird mit einer 16s rDNA Bibliothek (wie der firmeneigenen MicroSeq^TM 16S rDNA Sequenzbibliothek von Applied Biosystems) verglichen.
In einigen Ausführungsformen wird das PCR Produkt unter Verwendung eines nicht siebenden Mediums vor dem Sequenzieren aufgetrennt. In anderen Ausführungsformen wird das PCR Produkt unter Verwendung eines siebenden Mediums vor dem Sequenzieren aufgetrennt.
Verringerung der nichtspezifischen Amplifikation kann durch jegliche in der Technik bekannten Mittel bestimmt werden. Ein nicht einschränkendes Beispiel dafür ist, dass die Beobachtung einer erhöhten Menge an Produkt mit korrekter Größe auf einem Gel sichtbar gemacht werden kann und durch Messen der Intensität quantitativ bestimmt werden kann. Ferner können andere nichtspezifische Produkte, die als Banden mit einem nicht vorhergesagten Gewicht auf einem Gel sichtbar gemacht werden, in ihrer Intensität reduziert, oder eliminiert werden. Das bedeutet, dass in der Abwesenheit von Sorbitol oder Sorbitol und DMSO in den PCR Reaktionen ein nichtspezifisch amplifiziertes Produkt als eine intensive Bande auf einem Agarose Gel erscheinen kann und auf dem Gel als Fragment mit der falschen Größe läuft, während das spezifisch amplifizierte Produkt als das Fragmente mit der richtigen Größe erscheint, aber verglichen mit den anderen Produkten weniger intensiv erscheint. Wenn Sorbitol oder Sorbitol und DMSO den PCR Reaktionen hinzu gefügt werden, wird (nichtspezifisches) Amplifikationsprodukt mit der falschen Größe weniger intensiv erscheinen (oder nicht vorhanden sein), während das spezifische Produkt mit der richtigen Größe verglichen mit jeglichen nicht spezifisch amplifizierten Produkten intensiver erscheinen wird.
Die Erfindung wird unter Verwendung folgender tatsächlicher Beispiele weiter beschrieben, die lediglich einige erfindungsgemäße Ausführungsformen bildlich darstellen. Die Beispiele sollten nicht als den Geltungsbereich der Erfindung in irgendeiner Weise einschränkend verstanden werden, der in den beigefügten Patentansprüchen definiert ist.
BEISPIELE
Beispiel 1
Eine Titrierung für geeignete Mengen an Sorbitol, um nichtspezifische Amplifikation der ribosomalen 16S DNA zu verringern, wurde für das Esrcherichia coli 16S rRNA Gen durchgeführt. 50 pg E. coli DNA wurde unter Verwendung des Amplifikationsschritts des MicroSeq^TM 16S rRNA Gene Kits, einer PCR unterzogen, bei der die PCR Reaktionen wie folgt angesetzt sind: (a) Negativkontrollen, 50 μl PCR Hauptmischung, 50 μl steriles deionisiertes Wasser; (b) Positivkontrollen, 50 μl PCR Hauptmischung, 50 μl PCR Positivkontrollen DNA; (c) Proben, 50 μl PCR Hauptmischung, 50 μl mit 50 ng verdünnter E. coli DNA. Weiterhin enthielt jede Reaktion AmpErase^® Uracil N-Glycosylase (UNG). Typischerweise kann UNG in einer Menge von 0.5 bis 2 Einheiten/Reaktion hinzu gegeben werden. Die anfänglichen Amplifikationen wurden wie folgt durchgeführt: 50°C für 10 Minuten, 95°C für 10 Minuten, gefolgt von 35 Zyklen von 95°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 45 Sekunden; gefolgt von einem letzten Verlängerungsschritt bei 72°C für 10 Minuten, und danach wurden die Reaktionen unmittelbar analysiert oder bei –20°C aufbewahrt. Die PCR Hauptmischung enthielt DNA Polymerase, dNTPs, und optimierte Pufferkomponenten.
Nach Beendigung der PCRs, wurden 5 μl jeder Reaktion auf einem 2% NuSieve, 0.5% SeaKem Agarose Gel mit (0.5 μg/ml) Ethidiumbromid im Gel und im Laufpuffer laufen gelassen und durch ultraviolettes Licht sichtbar gemacht.
Unter Bezugnahme auf 1 enthielten die Reaktionen kein Sorbitol (Spuren 2 und 3); 0.05 M Sorbitol (Spuren 4 und 5); 0.10 M Sorbitol (Spuren 6 und 7); 0.15 M Sorbitol (Spuren 8 und 9); 0.20 M Sorbitol (Spuren 10 und 11); 0.25 M Sorbitol (Spuren 12 und 13); 0.30 M Sorbitol (Spuren 14 und 15); 0.35 M Sorbitol (Spuren 16 und 17); 0.40 M Sorbitol (Spuren 18 und 19); 0.45 M Sorbitol (Spuren 20 und 21); keine Template DNA hinzu gefügt (Spuren 22, 23 und 24); 50 ng E. coli DNA Template (Spur 25); und 10ng/Bande/μl einer 50–2,000 bp Leiter (Spuren 1 und 26). Die Ergebnisse werden in 1 gezeigt. Bemerkenswerterweise zeigte Sorbitol bei einer Konzentration von 0.15 M (Spuren 8 und 9) einen wesentlichen Anstieg der spezifischen Ziel-DNA (ungefähr 1500 bp), während es auch eine Abwesenheit der nichtspezifischen Bande bei ungefähr 140 bp zeigte.
Beispiel 2
Eine Titrierung für geeignete Mengen an DMSO, um nichtspezifische Amplifikation der ribosomalen 16S DNA zu verringern, wurde für das Ercherichia coli 16S rRNA Gen durchgeführt. 50 pg E. coli DNA wurde unter Verwendung des Amplifikationsschritts des MicroSeq^TM 16S xRNA Gene Kits, einer PCR unterzogen, bei der die PCR Reaktionen wie folgt angesetzt sind: (a) Negativkontrollen, 50 μl PCR Hauptmischung, 50 μl steriles deionisiertes Wasser; (b) Positivkontrollen, 50 μl PCR Hauptmischung, 50 μl PCR Positivkontrollen DNA; (c) Proben, 50 μl PCR Hauptmischung, 50 μl mit 50 ng verdünnter E. coli DNA. Weiterhin enthielt jede Reaktion AmpErase^® Uracil N-Glycosylase (UNG). Typischerweise kann UNG in einer Menge von 0.5 bis 2 Einheiten/Reaktion hinzu gegeben werden. Die anfänglichen Amplifikationen wurden wie folgt durchgeführt: 50°C für 10 Minuten, 95°C für 10 Minuten, gefolgt von 35 Zyklen von 95°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 45 Sekunden; gefolgt von einem letzten Verlängerungsschritt bei 72°C für 10 Minuten, und danach wurden die Reaktionen unmittelbar analysiert oder bei –20°C aufbewahrt. Die PCR Hauptmischung enthielt DNA Polymerase, dNTPs, und optimierte Pufferkomponenten.
Nach Beendigung der PCRs, wurden 5 μl jeder Reaktion auf einem 2% NuSieve, 0.5% SeaKem Agarose Gel mit (0.5 μg/ml) Ethidiumbromid im Gel und im Laufpuffer laufen gelassen und durch ultraviolettes Licht sichtbar gemacht.
Unter Bezugnahme auf 2 enthielten die Reaktionen kein DMSO (Spur 2); 0.25% DMSO (Spuren 3 und 4); 0.50% DMSO (Spuren 5 und 6); 0.75% DMSO (Spuren 7 und 8); 1.00% DMSO (Spuren 9 und 10); 1.50% DMSO (Spuren 11 und 12); 2.00% DMSO (Spuren 13 und 14); 3.00% DMSO (Spuren 15 und 16); 4.00% DMSO (Spuren 17 und 18) 5.00% DMSO (Spuren 19 und 20); 6.00% DMSO (Spuren 21 und 22); 7.00% DMSO (Spuren 23 und 24); 8.00% (Spuren 25 und 26); 9.00% DMSO (Spuren 27 und 28); 10.00% DMSO (Spuren 29 und 30); keine Template DNA hinzu gefügt (Spuren 32, 33 und 34); 50 ng E. coli DNA Template (Spur 35); und 10ng/Bande/μl einer 50–2,000 bp Leiter (Spuren 1, 31 und 36). Die Ergebnisse werden in 2 gezeigt. Bemerkenswerterweise zeigte DMSO bei einer Konzentration von 1.00% und 1.5% (Spuren 9 und 11) einen wesentlichen Anstieg der spezifischen Ziel-DNA (ungefähr 1500 bp), während es auch eine Abwesenheit der nichtspezifischen Bande bei ungefähr 140 bp und anderer Banden zeigte.
Beispiel 3
Die Wirkung der Zugabe von Sorbitol und DMSO, um nichtspezifische Amplifikation der ribosomalen 16S DNA zu verringern, wurde für das Esrcherichia coli 16S rRNA Gen durchgeführt. 5, 50, oder 500 pg E. coli DNA wurde unter Verwendung des Amplifikationsschritts des MicroSeq^TM 16S rRNA Gene Kits, in der Gegenwart von 0.15 M Sorbitol, oder 0.15 M Sorbitol + 1.25% (Vol/Vol) DMSO einer PCR unterzogen. Die PCR Reaktionen wurden wie folgt angesetzt: (a) Negativkontrollen, 50 μl PCR Hauptmischung, 50 μl steriles deionisiertes Wasser; (b) Positivkontrollen, 50 μl PCR Hauptmischung, 50 μl PCR Positivkontrollen DNA; (c) Proben, 50 μl PCR Hauptmischung, 50 μl mit 50 ng verdünnter E. coli DNA. Weiterhin enthielt jede Reaktion AmpErase^® Uracil N-Glycosylase (UNG). Typischerweise kann UNG in einer Menge von 0.5 bis 2 Einheiten/Reaktion hinzu gegeben werden. Die anfänglichen Amplifikationen wurden wie folgt durchgeführt: 50°C für 10 Minuten, 95°C für 10 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen von 95°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 45 Sekunden; gefolgt von einem letzten Verlängerungsschritt bei 72°C für 10 Minuten, und danach wurden die Reaktionen unmittelbar analysiert oder bei –20°C aufbewahrt. Die PCR Hauptmischung enthielt DNA Polymerase, dNTPs, und optimierte Pufferkomponenten.
Nach Beendigung der PCRs, wurden 5 μl jeder Reaktion auf einem Standart Agarose Gel (1% Agarose in TBE Puffer (Tris-HCl, Borsäure, EDTA)) laufengelassen, mit Ethidiumbromid gefärbt und durch ultraviolettes Licht sichtbar gemacht.
Unter Bezugnahme auf 3 enthielten die Reaktionen: 500 pg DNA Template und kein DMSO oder Sorbitol (Spuren 2, 3 und 4); 500 pg DNA Template und nur 0.15 M Sorbitol (Spuren 5, 6 und 7); 500 pg DNA Template und 0.15 M Sorbitol und 1.25% DMSO (Spuren 8, 9, und 10); 50 pg DNA Template und kein DMSO oder Sorbitol (Spuren 11, 12 und 13); 50 pg DNA Template und nur 0.15 M Sorbitol (Spuren 14, 15 und 16); 50 pg DNA Template und 0.15 M Sorbitol und 1.25% DMSO (Spuren 17, 18 und 19); 5 pg DNA Template und kein DMSO oder Sorbitol (Spuren 20, 21 und 22); 5 pg DNA Template und nur 0.15 M Sorbitol (Spuren 23, 24 und 25); 5 pg DNA Template und 0.15 M Sorbitol und 1.25% DMSO (Spuren 26, 27 und 28); keine Template DNA hinzu gefügt (Spuren 31, 32 und 33); 50 ng E. coli DNA Template (Spur 34); und 10ng/Bande/μl einer 50–2,000 bp Leiter (Spuren 1, 29, 30 und 35). Die Ergebnisse werden in 3 gezeigt. Bemerkenswerterweise ist ein Anstieg der Sensitivität in diesem Experiment erkennbar, da das spezifische Amplifikationsprodukt aus 5 pg des Positivkontrollen DNA Templates durch die Zugabe von Sorbitol und DMSO nachweisbar ist (Spuren 23 bis 28).
Beispiel 4
Die Wirkung der Zugabe von verschiedenen Mengen an Sorbitol oder Sorbitol und DMSO, um nichtspezifische Amplifikation der ribosomalen 16S DNA zu verringern, wurde für das Esrcherichia coli 16S rRNA Gen durchgeführt. 5 pg, 50 pg, oder 66 fg E. coli DNA wurde unter Verwendung des Amplifikationsschritts des MicroSeq^TM 16S rRNA Gene Kits, in der Gegenwart von 0.05 M, 0.15 M, 0.25 M, 0.35 M, 0.45 M, 0.55 M, 0.65 M, 0.75 M, 1.0 M, oder 2.0 M Sorbitol; 0.15 M Sorbitol und 1.25% (Vol/Vol) DMSO, oder keinem Zusatz, einer PCR unterzogen. Die PCR Reaktionen wurden wie folgt angesetzt: (a) Negativkontrollen, 50 μl PCR Hauptmischung, 50 μl steriles deionisiertes Wasser; (b) Positivkontrollen, 50 μl PCR Hauptmischung, 50 μl PCR Positivkontrollen DNA; (c) Proben, 50 μl PCR Hauptmischung, 50 μl mit 50 ng verdünnter E. coli DNA. Weiterhin enthielt jede Reaktion AmpErase^® Uracil N-Glycosylase (UNG). Typischerweise kann UNG in einer Menge von 0.5 bis 2 Einheiten/Reaktion hinzu gegeben werden. Die anfänglichen Amplifikationen wurden wie folgt durchgeführt: 50°C für 10 Minuten, 95°C für 10 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen von 95°C für 30 Sekunden, 50°C (oder 56°C) für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten; gefolgt von einem letzten Verlängerungsschritt bei 72°C für 10 Minuten, und danach wurden die Reaktionen unmittelbar analysiert oder bei –20°C aufbewahrt. Die PCR Hauptmischung enthielt DNA Polymerase, dNTPs, und optimierte Pufferkomponenten.
Die Reaktionen wurden gemäß Tabelle 1 angesetzt und wie in 4a und 4b geladen. In diesem Experiment wurde, verglichen mit dem Experiment in 1, das mit Standart Thermozyklierungsbedingungen durchgeführt wurde, die effektive obere Grenze für den Konzentrationsbereich von Sorbitol von ungefähr 0.45 M auf 0.75 M bei einer Annealing Temperatur von 56°C erhöht. Die Produktausbeute ist durchgehend geringer als bei der Verwendung einer Annealingtemperatur von 50°C, und die effiziente obere Grenze für den Konzentrationsbereich von Sorbitol wird auf 0.65 M erhöht.
Tabelle 1

Claims

Verfahren zum Reduzieren nichtspezifischer Amplifikation von DNA in einer Polymerasekettenreaktion umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer Probe umfassend eine interessierende Ziel-DNA-Sequenz; (b) Kontaktieren besagter Probe mit wenigstem einem Enzym mit Nukleinsäure-Polymerase-Aktivität; und (c) Inkubieren besagter Probe mit besagtem Enzym für eine Dauer und unter Bedingungen ausreichend um besagte Ziel-DNA-Sequenz zu amplifizieren, Bildung einer amplifizierten Ziel-DNA-Sequenz; wobei besagte Inkubation in der Gegenwart einer effizienten Menge an Sorbitol durchgeführt wird, um besagte nichtspezifische Amplifikation im Vergleich zu der Menge an nichtspezifischer Amplifikation, die in der Abwesenheit von Sorbitol beobachtet wird, zu reduzieren, wobei das Sorbitol in einer Menge von 0.05 M bis 3 M vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 ferner umfassend eine effiziente Menge an DMSO, um die Ausbeute an besagter amplifizierter Ziel-DNA-Sequenz im Vergleich zu der Menge an amplifizierter Ziel-DNA-Sequenz, die in der Abwesenheit von DMSO beobachtet wird, zu erhöhen, wobei besagtes DMSO in einer Menge von 0.5% bis 8.0% vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Sorbitol in einer Menge von 0.1 M bis 2 M vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Sorbitol in einer Menge von 0.2 M bis 1 M vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Sorbitol in einer Menge von 0.25 M bis 0.5 M vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei besagtes DMSO in einer Menge von 1.0% bis 6.0% vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei besagtes DMSO in einer Menge von 2.0% bis 5.0% vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei besagtes DMSO in einer Menge von 3.0% bis 4.0% vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei besagtes DMSO in einer Menge von 1.25% bis 0.15% vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei besagte nichtspezifische Amplifikation auf weniger als 99% oder mehr der Menge an nichtspezifischer Amplifikation reduziert ist, die in der Abwesenheit von besagtem Sorbitol und DMSO beobachtet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei besagte nichtspezifische Amplifikation auf weniger als 90% der Menge an nichtspezifischer Amplifikation reduziert ist, die in der Abwesenheit von besagtem Sorbitol und DMSO beobachtet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei besagte nichtspezifische Amplifikation auf weniger als 80% der Menge an nichtspezifischer Amplifikation reduziert ist, die in der Abwesenheit von besagtem Sorbitol und DMSO beobachtet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei besagte nichtspezifische Amplifikation auf weniger als 70% der Menge an nichtspezifischer Amplifikation reduziert ist, die in der Abwesenheit von besagtem Sorbitol und DMSO beobachtet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei besagte nichtspezifische Amplifikation auf weniger als 60% der Menge an nichtspezifischer Amplifikation reduziert ist, die in der Abwesenheit von besagtem Sorbitol und DMSO beobachtet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei besagte nichtspezifische Amplifikation auf weniger als 50% der Menge an nichtspezifischer Amplifikation reduziert ist, die in der Abwesenheit von besagtem Sorbitol und DMSO beobachtet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei besagte nichtspezifische Amplifikation auf weniger als 40% der Menge an nichtspezifischer Amplifikation reduziert ist, die in der Abwesenheit von besagtem Sorbitol und DMSO beobachtet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei besagte nichtspezifische Amplifikation auf weniger als 30% der Menge an nichtspezifischer Amplifikation reduziert ist, die in der Abwesenheit von besagtem Sorbitol und DMSO beobachtet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei besagte DNA ribosomale RNA kodiert.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei besagte DNA ribosomale RNA kodiert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Enzym, das die Polymerase-Aktivität besitzt, ausgewählt ist aus einer DNA-Polymerase der Art Thermus, Bacillus, Thermococcus, Thermotoga, und Pyrococcus.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Enzym, das die Polymerase-Aktivität besitzt, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Stoffel Fragment; rTth DNA Polymerase; Tne, Bst DNA Polymerase großes Fragment aus Bacillus stearothermophilus, Tma aus Thermotoga maritima; und Pfu aus Pyrococcus; und Mutanten, Varianten und Derivate davon.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Enzym, das die Polymerase-Aktivität besitzt, ausgewählt ist aus einer DNA-Polymerase der Art Thermus, Bacillus, Thermococcus, Thermotoga, und Pyrococcur.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Enzym, das die Polymerase-Aktivität besitzt, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Stoffel Fragment; rTth DNA Polymerase; Tne, Bst DNA Polymerase großes Fragment aus Bacillus stearothermophilus; Tma aus Thermotoga maritima; und Pfu aus Pyrococcur, und Mutanten, Varianten und Derivate davon.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Ziel-DNA-Sequenz ribosomale DNA ist und wobei die amplifizierte Ziel-DNA-Sequenz wenigstens eine Nukleobasensequenz besagter ribosomalen DNA in einer Mischung des vollständigen amplifizierten Produkts ist, wobei Nukleobasensequenz eine Sequenz aufeinander folgender Nukleobasen bezeichnet.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Sorbitol in einer Menge von 0.05 M bis 3 M vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Sorbitol in einer Menge von 0.1 M bis 2 M vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Sorbitol in einer Menge von 0.2 M bis 1 M vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Sorbitol in einer Menge von 0.25 M bis 0.5 M vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei besagtes DMSO in einer Menge von 0.5% bis 8.0% vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei besagtes DMSO in einer Menge von 1.0% bis 6.0% vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei besagtes DMSO in einer Menge von 2.0% bis 5.0% vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei besagtes DMSO in einer Menge von 3.0% bis 4.0% vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei besagtes DMSO in einer Menge von 1.25% und Sorbitol in einer Menge von 0.15% vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei besagte Amplifikation das Kontaktieren besagter Nukleobasensequenz mit einem Enzym, das Polymerase Aktivität besitzt, umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Enzym, das die Polymerase-Aktivität besitzt, ausgewählt ist aus einer DNA-Polymerase der Axt Thermus, Bacillus, Thermococcus, Thermotoga, und Pyrococcus.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Enzym, das die Polymerase-Aktivität besitzt, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Stoffel Fragment; rTth DNA Polymesse; Tne, Bst DNA Polymerase großes Fragment aus Bacillus stearothermophilus; Tma aus Thermotoga maritima; und Pfu aus Pyrococcus, und Mutanten, Varianten und Derivate davon.
Zusammensetzung geeignet für Polymerasekettenreaktion umfassend: (a) ein Nukleinsäuremolekül umfasend eine Sequenz, die für eine ribosomale DNA kodiert; (b) wenigstens zwei Primer, die ein Sequenz besitzen, die komplementär ist zu einem Teil besagter Nukleinsäuresequenz angrenzend an besagte ribosomale DNA; (c) wenigstens ein Enzym, das Nukleinsäure-Polymerase-Aktivität besitzt; und (d) Sorbitol, wobei das Sorbitol in einer Menge von 0.15 bis 0.35 M vorhanden ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 37 ferner umfassend DMSO.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren verwendet wird um Bakterien in einer Probe nachzuweisen, und wobei die Probe Nukleinsäure umfasst, besagte Nukleinsäure umfassend wenigstens eine ribosomale DNA Sequenz, und wobei wenigstens eine Nukleobasensequenz von besagter Nukleinsäure amplifiziert wird, wobei Nukleobasensequenz eine Sequenz aufeinander folgender Nukleobasen bezeichnet.
Verfahren gemäß Anspruch 39, wobei besagter Amplifikationsschritt ferner umfasst eine effiziente Menge an DMSO, um die nichtspezifische Amplifikation im Vergleich zu der Menge an nichtspezifischer Amplifikation zu reduzieren, die in der Abwesenheit von DMSO beobachtet wird, wobei besagtes DMSO in einer Menge von 0.5% bis 8.0% vorhanden ist
Verfahren gemäß Anspruch 39, wobei besagter Amplifikationschritt das Kontaktieren besagter Nukleobasensequenz mit einem Enzym, das Polymerase Aktivität besitzt, umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 41, wobei das Enzym, das die Polymerase-Aktivität besitzt, ausgewählt ist aus einer DNA-Polymerase der Art Thermus, Bacillus, Thermococcus, Thermotoga, und Pyrococcus.
Verfahren gemäß Anspruch 41, wobei das Enzym, das die Polymerase-Aktivität besitzt, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Stoffel Fragment; rTth DNA Polymerase; Tne, Bst DNA Polymerase großes Fragment aus Bacillus stearothermophilus; Tma aus Thermotoga maritima; und Pfu aus Pyrococcus, und Mutanten, Varianten und Derivate davon.
Verfahren gemäß Anspruch 40, wobei besagter Amplifikationsschritt das Kontaktieren besagter Nukleobasensequenz mit einem Enzym, das Polymerase Aktivität besitzt, umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 44, wobei das Enzym, das die Polymerase-Aktivität besitzt, ausgewählt ist aus einer DNA-Polymerase der Art Thermus, Bacillus, Thermococcur, Thermotoga, und Pyrococcus.
Verfahren gemäß Anspruch 44, wobei das Enzym, das die Polymerase-Aktivität besitzt, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Stoffel Fragment; rTth DNA Polymerase; Tne, Bst DNA Polymerase großes Fragment aus Bacillus srtearothermophilus; Tma aus Thermotoga maritima; und Pfu aus Pyrococcus; und Mutanten, Varianten und Derivate davon.
Verfahren gemäß Anspruch 39 ferner umfassend Bestimmen der Nukleinsäuresequenz von besagtem amplifizierten Produkt und Vergleichen besagter Nukleinsequenz von besagtem amplifizierten Produkt mit bekannten bakteriellen ribosomalen DNA Sequenzen.
Verfahren gemäß Anspruch 40 feiner umfassend Bestimmen der Nukleinsäuresequenz von besagtem amplifizierten Produkt und Vergleichen besagter Nukleinsequenz von besagtem amplifizierten Produkt mit bekannten bakteriellen ribosomalen DNA Sequenzen.
Verfahren gemäß Anspruch 47, wobei besagtes amplifiziertes Produkt vor Bestimmung besagter Nukleinsäuresequenz von besagtem amplifiziertem Produkt aufgereinigt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 48, wobei besagtes amplifiziertes Produkt vor Bestimmung besagter Nukleinsäuresequenz von besagtem amplifiziertem Produkt aufgereinigt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 42, wobei besagte Probe eine klinische Probe ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Blut, Urin, Rückenmarksflüssigkeit, Serum, Speichel, Mucus, Hautschabung, Darmabsonderungen und Fäzes.
Verfahren gemäß Anspruch 40, wobei besagte Probe eine klinische Probe ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Blut, Urin, Rückenmarksflüssigkeit, Serum, Speichel, Mucus, Hautschabung, Darmabsonderungen und Fäzes.