DE69022291T2 - Verfahren zur Beherrschung von Kontamination der Nukleinsäure-Amplifikation. - Google Patents

Verfahren zur Beherrschung von Kontamination der Nukleinsäure-Amplifikation.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren, die Nucleinsäuresequenzen amplifizieren. Insbesondere offenbart die vorliegende Erfindung ein Mittel zur Entfernung der Produkte aus einer Ausführung eines Nucleinsäure-Amplifikationsverfahrens, die nach folgende Ausführungen des Amplifikationsverfahrens kontaminieren.
  • Das Polymerase-Kettenreaktions- (PCR-) Verfahren amplifiziert spezifische Nucleinsäuresequenzen durch eine Reihe von Manipulationen, welche die Denaturierung, das Annealing von Primern und die Verlängerung der Primer mit DNA-Polymerase umfassen (Mullis KB et al., US 4.683.202, US 4.683.195; Mullis KB, EP 201.184; Erlich H., BP 50.424, EP 84.796, EP 258.017, EP 237.362; Erlich H., US 4.582.788; Saiki R. et al., US 4.683.202; Mullis KB et al. (1986) in Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; Saiki R. et al. (1985) Science 230:1350; Saiki R. et al. (1988) Science 231:487; Loh EY et al. (1988) Science 243:217).
  • Diese Schritte können mehrere Male wiederholt werden, wodurch große Amplifikationen der Kopienzahl der ursprünglichen spezifischen Sequenz möglich sind. Es wurde gezeigt, daß selbst einzelne DNA-Moleküle amplifiziert werden können, um hunderte Nanogramm des Produktes herzustellen (Li H. et al. (1988) Nature 335:414).
  • Zu weiteren bekannten Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren zählen das auf Transkription basierende Amplifikationssystem von Kwoh D. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173.
  • "Uracil-DNA-Glycosylase" (UDG), ein Fachbegriff, bezeichnet ein Enzym, das, nur wenn das monomere Nucleotid dUTP in ein DNA-Molekül eingebaut ist, die Glycosidbindung zwischen der Base Uracil und dem Zucker Desoxyribose spaltet, wodurch ein Desoxyuridinteil eingebaut wird (Duncan B. (1981) in The Enzymes 14:565, Hrsg.: Boyer P.). Das Enzym wirkt nicht auf freies dUTP, freies Desoxyuridin oder RNA (Duncan, supra).
  • Eine Folge der Amplifikationsverfahren wie PCR ist, daß die Amplifikationsprodukte selbst Substrate für folgende PCR-Verfahren sein können. Da die Mengen der Amplifikationsprodukte sehr groß sein können, kann ferner die Ausbreitung sogar einer äußerst kleinen Fraktion einer Reaktion wie einer PCR-Reaktion in den Laborbereich potentiell zu einer Kontamination weiterer Versuche einer Amplifikation anderer Proben führen.
  • Die vorliegende Erfindung versucht, eine Verbesserung bei in vitro Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren im allgemeinen zu erzielen, indem Amplifikationsprodukte erzeugt werden, die von natürlich vorkommender Nucleinsäure wie DNA unterscheidbar sind. Daher können solche Produkte als Matrizen zur weiteren Amplifikation inaktiviert werden, bevor mit der folgenden Amplifikationsreaktion begonnen wird.
  • Daher wird in einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäure geschaffen, umfassend:
  • (a) die Hybridisierung eines Oligonucleotidprimers an die Nucleinsäure;
  • (b) die Synthese von Desoxyuridin enthaltender Nucleinsäure von dem Primer, die im wesentlichen komplementär zu der Nucleinsäure ist;
  • (c) die Trennung der Nucleinsäure und der synthetisierten Nucleinsäure;
  • (d) gegebenenfalls, falls erforderlich, die Wiederholung von (a), wobei die Nucleinsäure und die synthetisierte Nucleinsäure als Matrizen für den Primer verwendet werden; und
  • (e) die Behandlung der synthetisierten Nucleinsäure mit Uracil-DNA-Glycosylase, um sie als Matrize für die Synthese weiterer Nucleinsäure unbrauchbar zu machen.
  • Die ursprüngliche Nucleinsäure bleibt vorzugsweise unbeeinflußt, d.h., sie kann weiterhin als Matrize in einer weiteren Amplifikation dienen. Die Nucleinsäure ist vorzugsweise DNA.
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Amplifikation einer oder mehrerer Nucleinsäuren, umfassend:
  • (a) den Einbau von Desoxyuridin in die Nucleinsäure einer ersten Probe während der Amplifikation der Nucleinsäuresequenzen; und
  • (b) die Behandlung der Nucleinsäure einer zweiten Probe mit Uracil-DNA-Glycosylase, welche die Nucleinsäure, die Desoxyuridin enthält, im wesentlichen nicht amplifizierbar macht und welche die Amplifikation von Nucleinsäure, die Desoxyuridin nicht enthält, nicht wesentlich beeinträchtigt;
  • wodurch die von der ersten Probe abstammenden, amplifizierten Nucleinsäuresequenzen, welche die zweite Probe kontaminieren, während der Amplifikation der Nucleinsäuresequenzen der zweiten Probe im wesentlichen nicht weiter amplifiziert werden.
  • Das Verfahren kann ferner folgendes umfassen:
  • (c) die Amplifikation von Nucleinsäuresequenzen der zweiten Probe.
  • Als Alternative oder zusätzlich kann das Verfahren ferner folgendes umfassen:
  • (d) die Beendigung der Behandlung von Schritt (b), zum Beispiel durch Erhitzen.
  • In dieser Beschreibung ist "Amplifizieren" oder "Amplifikation" vorteilhaft ein Verfahren zur Amplifikation von mindestens einer spezifischen Nucleinsäuresequenz, die in einer Nucleinsäure oder einem Gemisch von Nucleinsäuren enthalten ist, worin jede Nucleinsäure aus zwei getrennten komplementären Strängen von gleicher oder ungleicher Länge besteht, umfassend:
  • (1) für jede unterschiedliche spezifische Sequenz, die amplifiziert wird, die Behandlung der Stränge mit zwei Oligonucleotidprimern unter solchen Bedingungen, daß für jede unterschiedliche Sequenz, die amplifiziert wird, ein Verlängerungsprodukt jedes Primers synthetisiert wird, das zu jedem Nucleinsäurestrang komplementär ist, wobei die Primer so ausgewählt werden, daß sie mit unterschiedlichen Strängen jeder spezifischen Sequenz ausreichend komplementär sind, um mit diesen zu hybridisieren, so daß das ausgehend von einem Primer synthetisierte Verlängerungsprodukt, wenn es von seinem komplementären Teil getrennt wird, als Matrize für die Synthese des Verlängerungsprodukts des anderen Primers dienen kann;
  • (2) die Trennung der Primerverlängerungsprodukte von den Matrizen, auf denen sie synthetisiert wurden, um einzelsträngige Moleküle herzustellen; und
  • (3) die Behandlung der in (2) erzeugten einzelsträngigen Moleküle mit den Primern von (1) unter solchen Bedingungen, daß ein Primerverlängerungsprodukt mit jedem der in (2) hergestellten Einzelstränge als Matrize synthetisiert wird.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt daher ein Verfahren zur Amplifikation einer oder mehrerer Nucleinsäuresequenzen, welches folgende Schritte umfaßt:
  • (A) mit einer ersten, eine Nucleinsäuresequenz oder ein Gemisch von Nucleinsäuresequenzen enthaltenden Probe, in der jede Nucleinsäuresequenz zwei getrennte komplementäre Stränge von gleicher oder ungleicher Länge aufweist:
  • (a) für jede unterschiedliche spezifische Sequenz, die amplifiziert wird, die Behandlung der Stränge mit zwei Oligonucleotidprimern unter solchen Bedingungen, daß für jede unterschiedliche Sequenz, die amplifiziert wird, ein Verlängerungsprodukt jedes Primers synthetisiert wird, das zu jedem Nucleinsäurestrang komplementär ist und das Desoxyuridin eingebaut hat, wobei die Primer so ausgewählt werden, daß sie mit unterschiedlichen Strängen jeder spezifischen Sequenz ausreichend komplementär sind, um mit diesen zu hybridisieren, so daß das ausgehend von einem Primer synthetisierte Verlängerungsprodukt, wenn es von seinem komplementären Teil getrennt wird, als Matrize für die Synthese des Verlängerungsprodukts des anderen Primers dienen kann;
  • (b) die Trennung der Primerverlängerungsprodukte von den Matrizen, auf denen sie synthetisiert wurden, um einzelsträngige Moleküle herzustellen; und
  • (c) die Behandlung der in (b) erzeugten einzelsträngigen Moleküle mit den Primern von (a) unter solchen Bedingungen, daß ein Primerverlängerungsprodukt mit jedem der in (b) hergestellten Einzelstränge als Matrize synthetisiert wird;
  • (d) die mindestens einmalige Wiederholung von (a) bis (c), wobei die in der ersten Probe enthaltene spezifische Nucleinsäuresequenz amplifiziert wird;
  • und
  • (B) mit einer zweiten, eine Nucleinsäuresequenz oder ein Gemisch von Nucleinsäuresequenzen enthaltenden Probe, in der jede Nucleinsäuresequenz zwei getrennte komplementäre Stränge von gleicher oder ungleicher Länge aufweist, wobei amplifizierte Nucleinsäuresequenzen von (A) in der zweiten Probe vorhanden sein können:
  • (e) die Behandlung der Nucleinsäure der zweiten Probe mit Uracil-DNA-Glycosylase, welche die Nucleinsäure, die Desoxyuridin enthält, im wesentlichen nicht amplifizierbar macht und welche die Amplifikation von Nucleinsäure, die Desoxyuridin nicht enthält, nicht beeinträchtigt; wodurch jegliche Primerverlängerungsprodukte der ersten Probe, die in (A) amplifiziert worden sind und in der zweiten Probe vorhanden sind, im wesentlichen nicht weiter in (B) amplifiziert werden.
  • Das Verfahren kann ferner in (B) folgendes umfassen:
  • (f) das mindestens einmalige Wiederholen von (a) bis (c), wodurch jede in der zweiten Probe enthaltene spezifische Nucleinsäuresequenz amplifiziert wird.
  • Das Verfahren kann ferner in (B) folgendes umfassen:
  • (g) das Beenden der Uracil-DNA-Glycosylase-Behandlung.
  • Die Beendigung der Uracil-DNA-Glycosylase-Behandlung erfolgt vorzugsweise durch Erhitzen.
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt ein Verfahren zum Einbau von Desoxyuridin in DNA oder RNA während der Amplifikationsverfahren. Die Erfindung eliminiert die Produkte vorangehender Amplifikation(en) aus einer weiteren Amplifikation durch eine Uracil-DNA-Glycosylase- Behandlung, welche die (ursprüngliche) Nucleinsäure der Probe in ihrer Fähigkeit zur Amplifikation nicht beeinflußt. Diese Behandlung kann ein schwerwiegendes Problem deutlich verringern, das mit der Amplifikation von Nucleinsäuren verbunden ist, nämlich die Kontamination von Ausgangsmaterialien mit Endprodukten vorangehender Amplifikationsverfahren. Mit anderen Worten, die vorliegende Erfindung schafft ein Verfahren zur Vernachlässigung von Amplifikationsprodukten und Begünstigung von Nucleinsäuren, die normalerweise von Natur aus auftreten, vor dem Beginn folgender Amplifikationsreaktionen.
  • Insbesondere umfaßt die Erfindung in vitro Verfahren, in welchen Enzyme zur Amplifikation spezifischer Nucleinsäuresequenzen verwendet werden. Ein Beispiel eines solchen Verfahrens ist als Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bekannt. Eine ernsthafte Einschränkung des PCR-Verfahrens und anderer ähnlicher Verfahren ist die Kontamination der Laborumgebung mit den amplifizierten Nucleinsäure-Endprodukten einzelner Reaktionen. Eine solche Kontamination führt allgemein zu einer Amplifikation nicht nur der authentischen Nucleinsäure, die in der Probe von Interesse vorhanden sein kann, sondern auch der kontaminierenden Endprodukte vorangehender Reaktionen. Die vorliegende Erfindung kann ein Verfahren zur Entfernung einer möglichen Kontamination dieser Art schaffen, ohne die gewünschte Amplifikation authentischer Nucleinsäuren zu beeinträchtigen.
  • Die vorliegende Erfindung kann zunächst die Durchführung der Amplifikationsverfahren umfassen, in welchen eine oder mehr der vier normalen Ribonucleosidtriphosphate (rNTP) oder Desoxyribonucleosidtriphosphate (dNTP) durch dUTP ersetzt werden, das normalerweise in Nucleinsäuren, die in den zu amplifizierenden Proben vorhanden sind, fehlt oder sehr selten vorhanden ist. Die während solcher Amplifikationsverfahren hergestellte RNA oder DNA kann von den Probennucleinsäuren unterschieden werden. Daher ist es möglich, jene Nucleinsäuren, die während der Amplifikationsverfahren hergestellt wurden, zugunsten von Proben-DNA oder -RNA vor oder während folgender Amplifikationsverfahren zu vernachlässigen, so daß zuvor amplifizierte Nucleinsäure nicht mehr amplifiziert werden kann, während die Proben-DNA oder -RNA amplifizierbar bleibt.
  • Es wird angenommen, daß seit der Erfindung der verschiedenen Nucleinsäure-Amplifikationsmethoden kein Mittel zur Beseitigung von Kontamination hinzugefügter Nucleinsäure durch die Produkte vorangehender Amplifikationszyklen offenbart wurde.
  • Der Begriff "amplifizieren", wie hierin verwendet, bezeichnet jedes in vitro Verfahren zur Erhöhung der Kopienzahl einer Nucleinsäure oder einer oder mehrerer Nucleinsäuresequenzen. Die Nucleinsäureamplifikation führt zu dem Einbau von Nucleotiden in DNA oder RNA. Die Begriffe "amplifizieren" und "Amplifikation" sind daher entsprechend auszulegen. Wenn eine Nucleinsäure als nicht amplifizierbar bezeichnet wird, kann sie als die Nucleinsäure angesehen werden, die keine Synthese von im wesentlichen komplementärer Nucleinsäure zuläßt und daher nicht imstande ist, als Matrize zu dienen.
  • "Nucleotid" ist ein Fachbegriff, der eine Base-Zucker-Phosphat-Kombination bezeichnet. Nucleotide sind die monomeren Einheiten von Nucleinsäurepolymeren, d.h. von DNA und RNA. Der Begriff umfaßt Ribonucleosidtriphosphate wie rATP, rCTP, rGTP oder rUTP und Desoxyribonucleosidtriphosphate wie dATP, dCTP, dGTP oder dTTP.
  • "Nucleosid" ist ein Fachbegriff, der eine Base-Zucker-Kombination bezeichnet, d.h. ein Nucleotid, dem ein Phosphatteil fehlt. In der Wissenschaft ist anerkannt, daß es eine gewisse Austauschbarkeit in der Verwendung der Begriffe Nucleosid und Nucleotid gibt. Zum Beispiel ist das Nucleosid Desoxyuridintriphosphat, dUTP, das Desoxyribonucleosidtriphosphat. Nach dem Einbau in DNA dient es als DNA-Monomer, wobei es formal Desoxyuridylat ist, d.h. dUMP oder Desoxyuridinmonophosphat. Es kann behauptet werden, daß dUTP in DNA eingebaut wird, obwohl in der erhaltenen DNA kein dUTP-Teil vorhanden ist. Ebenso kann behauptet werden, daß Desoxyuridin in DNA eingebaut wird, obwohl dies nur ein Teil des Substratmoleküls ist.
  • Desoxyuridin kann in die Nucleinsäure eingebaut werden, die während der Amplifikation synthetisiert wird, wie durch Ausführung des Amplifikationsverfahrens in einem Medium, das dUTP enthält. Obwohl die Triphosphatform von Desoxyuridin, dUTP, in lebenden Organismen als metabolisches Zwischenprodukt vorhanden ist, wird es selten in die DNA eingebaut. Wenn dUTP zufällig in DNA eingebaut wird, wird das erhaltene Desoxyuridin sofort in vivo durch normale Prozesse entfernt, z.B. durch Prozesse, die das Enzym UDG beinhalten. Daher tritt Desoxyuridin selten oder niemals in natürlicher DNA auf. Es ist bekannt, daß einige Organismen auf natürliche Weise Desoxyuridin in DNA einbauen. Desoxyuridin wäre bei Nucleinsäureproben dieser Organismen nicht als geeignetes Nucleotid anzusehen. Die Gegenwart von Desoxyuridin kann einfach unter Verwendung von Methoden, die in der Wissenschaft bekannt sind, bestimmt werden.
  • Der Begriff "einbauen" bedeutet, ein Bestandteil eines Nucleinsäurepolymers oder einer Nucleinsäuresequenz zu werden.
  • Der Begriff "Beenden" bezeichnet hierin das Stoppen der Uracil-DNA-Glycosylase-Behandlung. Der Begriff umfaßt Mittel sowohl für das permanente als auch bedingte Stoppen. Sowohl die permanente Wärmedenaturierung als auch der Mangel an enzymatischer Aktivität aufgrund einer Temperatur außerhalb des aktiven Bereichs des Enzyms wären in diesem Begriff enthalten.
  • In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Amplifikationsverfahren an einer ersten Probe durchgeführt, in welcher eines oder mehr der vier normalen Ribonucleosidtriphosphate (rNTP) oder Desoxyribonucleosidtriphosphate (dNTP) durch dUTP ersetzt werden. Nach der Amplifikation wird jedes möglicherweise verbleibende, kontaminierende, amplifizierte Produkt einer Uracil-DNA-Glycosylase-Behandlung unterzogen, welche die Nucleinsäure, die Desoxyuridin enthält, im wesentlichen nicht amplifizierbar macht. Die Behandlung kann als gesonderter Schritt durchgeführt werden oder kann vorzugsweise in Gegenwart einer zweiten Probe durchgeführt werden, welche zu amplifizierende Nucleinsäuresequenzen enthält. Die amplifizierten Nucleinsäuresequenzen, die von der ersten Probe stammen und die zweite Probe kontaminieren, werden während der Amplifikation von Nucleinsäuresequenzen der zweiten Probe im wesentlichen nicht weiter amplifiziert.
  • Das Desoxyribonucleosidtriphosphat dUTP kann einfach in einem enzymatischen DNA-Amplifikationsverfahren eingebaut werden, das in dem hierin angeführten Beispiel PCR ist, wodurch Desoxyuridin enthaltende DNA entsteht. Die DNA-Produkte einer solchen Reaktion enthalten normalerweise viele Uracil-Basen. Die Unterscheidung zwischen natürlicher DNA und den entstandenen, Desoxyuridin enthaltenden Produkten der Amplifikationsverfahren kann mit dem Enzym Uracil-DNA-Glycosylase (UDG) getroffen werden. Die Behandlung von Uracilbasen enthaltender DNA mit Uracil-DNA-Glycosylase führt zu der Spaltung der Glycosidbindung zwischen der Desoxyribose der DNA Zucker-Phosphat-Hauptkette und der Uracilbase. Der Uracil-Verlust erzeugt eine Apyrimidinstelle in der DNA, welche die DNA-Polymerase an der Verwendung des DNA-Stranges als Matrize für die Synthese eines komplementären DNA-Stranges hindert (Schaaper R. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:487). Das Vorhandensein zahlreicher Apyrimidinstellen in jedem DNA-Zielmolekül behindert Amplifikationsverfahren, in welchen DNA-Polymerase zur Synthese von Kopien der Ziel-DNA verwendet wird.
  • Wie hierin als Beispiel dargestellt, ist das grundlegende Amplifikationsprotokoll die allgemein bekannt PCR-Methode. PCR kann auf drei Weisen modifiziert werden.
  • (1) dUTP wurde anstelle von dTTP eingesetzt; (2) UDG wurde dem anfänglichen PCR-Reaktionsgemisch zugegeben; und (3) eine anfängliche Inkubationsperiode wurde hinzugefügt, um UDG die Zerstörung kontaminierender Produkte vorangehen der PCR-Reaktionen zu ermöglichen. UDG selbst wurde entweder durch hohe Temperaturen im ersten PCR-Zyklus permanent inaktiviert oder war bei den hohen Temperaturen, die bei Tag-Polymerase in dem gegenwärtig bevorzugten PCR-Protokoll verwendet werden, nicht aktiv. Diese Inaktivierung verhindert, daß UDG neu synthetisierte PCR-Produkte zerstört. Bei Nucleinsäure-Amplifikationsprotokollen, welche die UDG-Aktivität nicht aufheben, ist normalerweise ein zusätzlicher UDG-Inaktivierungsschritt erforderlich.
  • Es wird zwar bevorzugt, die Uracil-DNA-Glycosylase-Behandlung zu beenden, welche die Desoxyuridin enthaltende Nucleinsäure dem Amplifikationsverfahren gegenüber widerstandsfähig macht (wie beispielsweise hierin durch Wärmeinaktivierung von UDG), aber die Erfindung umfaßt auch Ausführungsbeispiele, in welchen der Beendigungsschritt fehlt. Zum Beispiel können Enzymmengen und Behandlungsperioden verwendet werden, die ausreichend hoch und lang sind, um eine erwartete Kontamination von Ausgangsmaterialien zu beseitigen, aber auch ausreichend gering und kurz, um die Amplifikationsrate aufrechtzuerhalten. Mit anderen Worten, durch die Behandlung kann kontaminierende Nucleinsäure zerstört werden, aber ein Amplifikationsverfahren kann nach wie vor neue Nucleinsäure rascher erzeugen als die Behandlung die neu synthetisierte Nucleinsäure zerstören könnte.
  • Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verhinderung oder Verringerung einer Kontamination einer zweiten, Nucleinsäure umfassenden Probe durch eine erste Probe, die Nucleinsäure umfaßt, umfassend:
  • (a) den Einbau von Desoxyuridin in eine Nucleinsäure während der Amplifikation von Nucleinsäure, um eine erste Probe herzustellen;
  • (b) wenn die zweite Probe vermutlich durch die erste Probe kontaminiert ist, die Behandlung der zweiten Probe mit Uracil-DNA-Glycosylase, um die Nucleinsäure, die Desoxyuridin enthält, im wesentlichen nicht amplifizierbar zu machen.
  • Bevorzugte Merkmale und Eigenschaften des ersten Aspekts gelten mutatis mutandis auch für den zweiten Aspekt.
  • Die Erfindung wird nun anhand eines Beispiels beschrieben, das nur als Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung dienen und nicht als Einschränkung ausgelegt werden soll.
    • VERGLEICHSBEISPIEL
  • Eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde zur Amplifikation einer Region der DNA des menschlichen Papillomavirus Typ 16 (HPV 16) durchgeführt (Durst M. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3812). Die Sequenzen der verwendeten Primer waren 5'GGTCGATGTATGTCTTGTTG3' und 5'GTCTACGTGTGTGCTTTGTAC3'.
  • HPV 16 DNA wurde aus einem Plasmidklon voller Länge, pT7HPV16 (für den Zweck dieser Erfindung entsprechend den pUC8 Plasmiden, die von Seedoff K. et al. (1985) Virol. 145:181 beschrieben wurden), mit dem Restriktionsenzym BamHI geschnitten. Die lineare DNA (10 Picogramm) wurde PCR-Reaktionen zugeführt, die 50 Mikroliter 25 mM Tris HCl, pH 8,3, 5 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 0,01% Gelatine, jeweils 0,2 mM dATP, dGTP, dCTP, 0,2 mM entweder dUTP oder dTTP, 1 Mikromol jedes Primers und 12,5 Einheiten thermostabile DNA-Polymerase von Thermus aquaticus (Cetus/Perkin-Elmer) enthielten. Die Reaktionen wurden in einem Thermal-Cycler (Cetus/Perkin-Elmer) unter Verwendung des folgenden Temperaturprofils amplifiziert: 5 Minuten bei 94ºC, dann 30 Zyklen mit 1 Minute bei 94ºC (Denaturierung), zwei Minuten bei 55ºC (Annealing) und 3 Minuten bei 72ºC (Primerverlängerung). Nach Beendigung der Temperaturzyklen wurde eine abschließende Verlängerung von 10 Minuten bei 72ºC durchgeführt. Die Amplifikation des HPV 16 DNA-Fragments mit 284 Basenpaaren wurde durch Agarose/Ethidiumbromid-Gelelektrophorese (Maniatis T. et al. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory) der PCR-Reaktionsprodukte bestätigt (5 Mikroliter jeder Reaktion pro Bahn). Alle Reaktionen zeigten eine deutliche Amplifikation. Negative Kontrollreaktionen, welchen keine HPV 16 DNA zugefügt wurde, erzeugten keine DNA-Produkte.
  • Die Konzentration der PCR-Amplifikationsprodukte wurde aus dem Agarosegel geschätzt. Neue PCR-Reaktionen wurden mit Mengen von zehn Femtogramm der Amplifikationsprodukte kontaminiert, die entweder Desoxythymidin, das durch den Einbau von dTTP erhalten wurde, oder Desoxyuridin aus dUTP-haltigen Reaktionen enthielten. Positive Kontrollreaktionen enthielten 10 Picogramm lineare HPV 16 DNA. Negative Kontrollreaktionen erhielten keine Ziel-DNA. Die neuen PCR Reaktionen enthielten dUTP anstelle von dTTP und entweder 5 Nanogramm UDG (Van de Sande J. University of Calgary; auch von Duncan Laboratories, 19 E. Central Ave., Paoli, PA 19301, USA, erhältlich) oder kein UDG. Alle Reaktionen wurden 15 Minuten bei 37 ºC inkubiert, so daß UDG auf Desoxyundin enthaltende DNA wirken konnte, und wurden dann durch dasselbe Wärmezyklusprotokoll wie oben geführt. Teilmengen jeder Reaktion wurden durch Agarose/Ethidiumbromid-Gelelektrophorese analysiert.
  • Die Agarosegelanalyse zeigte, daß die Desoxyuridin enthaltenden PCR-Produkte ohne UDG-Behandlung reamplifiziert werden konnten, um ein DNA-Produkt zu erhalten, das, wie durch Gelelektrophorese bestätigt wurde, in der Größe nicht von den Produkten zu unterscheiden ist, die durch Amplifikation der normalen HPV 16 DNA erhalten werden. Reaktionen, in welchen die Desoxyuridin enthaltende DNA vor der PCR mit UDG inkubiert wurde, ergab keine sichtbaren Produkte auf dem Agarosegel. PCR-Amplifikationsprodukte, die Desoxythymidin enthielten, wurden erfolgreich amplifiziert, ob sie nun mit UDG inkubiert waren oder nicht. Dieses Experiment zeigte, daß UDG im wesentlichen die Aniplifikation von PCR-Produkten, die Desoxyuridin enthielten, verhinderte, aber keine wesentliche Auswirkung auf die Amplifikation der Desoxythymidin enthaltenden DNA hatte.

Claims (7)

1. Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäure, umfassend:
(a) die Hybridisierung eines Oligonucleotidprimers an die Nucleinsäure;
(b) die Synthese von Desoxyuridin enthaltender Nucleinsäure von dem Primer, die im wesentlichen komplementär zu der Nucleinsäure ist;
(c) die Trennung der Nucleinsäure und der synthetisierten Nucleinsäure;
(d) gegebenenfalls, falls erforderlich, die Wiederholung von (a), wobei die Nucleinsäure und die synthetisierte Nucleinsäure als Matrizen für den Primer verwendet werden; und
(e) die Behandlung der synthetisierten Nucleinsäure mit Uracil-DNA-Glycosylase, so daß sie nicht mehr als Matrize für die Synthese weiterer Nucleinsäure dienen kann.
2. Verfahren zur Verhinderung oder Verringerung einer Kontamination einer zweiten, Nucleinsäure umfassenden Probe durch eine erste Probe, die Nucleinsäure umfaßt, welche durch ein Verfahren nach Anspruch 1 amplifiziert wurde, wobei das Verfahren die Behandlung der zweiten Probe mit Uracil-DNA-Glycosylase umfaßt, um die Desoxyuridin enthaltende Nucleinsäure im wesentlichen nicht amplifizierbar zu machen, wenn bei der zweiten Probe der Verdacht einer Kontamination durch die erste Probe besteht.
3. Verfahren zur Amplifikation einer oder mehrerer Nucleinsäuresequenzen, umfassend:
(a) den Einbau von Desoxyuridin in eine Nucleinsäure während der Amplifikation einer ersten Probe der durch ein Verfahren nach Anspruch 1 amplifizierten Nucleinsäuresequenz(en); und
(b) die Behandlung von Nucleinsäure einer zweiten Probe mit Uracil-DNA-Glycosylase, welche die Nucleinsäure, die Desoxyuridin enthält, im wesentlichen nicht amplifizierbar macht und welche die Amplifikation von Nucleinsäure, die Desoxyuridin nicht enthält, nicht wesentlich beeinträchtigt;
wobei die von der ersten Probe abstammenden, amplifizierten Nucleinsäuresequenzen, welche die zweite Probe kontaminieren, während der Amplifikation der Nucleinsäuresequenzen der zweiten Probe im wesentlichen nicht weiter amplifiziert werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, weiter umfassend:
(c) die Amplifikation von Nucleinsäure in der zweiten Probe.
5. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, weiters umfassend:
(d) die Beendigung der Behandlung in (b) zum Beispiel durch Erhitzen.
6. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Amplifikation ein Verfahren zur Amplifikation von mindestens einer spezifischen Nucleinsäuresequenz ist, die in einer Nucleinsäure oder einem Gemisch von Nucleinsäuren enthalten ist, worin jede Nucleinsäure aus zwei getrennten komplementären Strängen von gleicher oder ungleicher Länge besteht, umfassend:
(e) für jede unterschiedliche spezifische Sequenz, die amplifiziert wird, die Behandlung der Stränge mit zwei Oligonucleotidprimern unter solchen Bedingungen, daß für jede unterschiedliche Sequenz, die amplifiziert wird, ein Verlängerungsprodukt jedes Primers synthetisiert wird, das zu jedem Nucleinsäurestrang komplementär ist, wobei die Primer so ausgewählt werden, daß sie mit unterschiedlichen Strängen jeder spezifischen Sequenz ausreichend komplementär sind, um mit diesen zu hybridisieren, so daß das ausgehend von einem Primer synthetisierte Verlängerungsprodukt, wenn es von seinem komplementären Teil getrennt wird, als Matrize für die Synthese des Verlängerungsprodukts des anderen Primers dienen kann;
(f) die Trennung der Primerverlängerungsprodukte von den Matrizen, auf denen sie synthetisiert wurden, um einzelsträngige Moleküle herzustellen; und
(g) die Behandlung der in (f) erzeugten einzelsträngigen Moleküle mit den Primern von (e) unter solchen Bedingungen, daß ein Primerverlängerungsprodukt mit jedem der in (f) hergestellten Einzelstränge als Matrize synthetisiert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend:
(A) mit einer ersten, eine Nucleinsäuresequenz oder ein Gemisch von Nucleinsäuresequenzen enthaltenden Probe, in der jede Nucleinsäuresequenz zwei getrennte komplementäre Stränge von gleicher Länge aufweist:
(a) für jede unterschiedliche spezifische Sequenz, die amplifiziert wird, die Behandlung der Stränge mit zwei Oligonucleotidprimern unter solchen Bedingungen, daß für jede unterschiedliche Sequenz, die amplifiziert wird, ein Verlängerungsprodukt jedes Primers synthetisiert wird, das zu jedem Nucleinsäurestrang komplementär ist und das Desoxyuridin eingebaut hat, wobei die Primer so ausgewählt werden, daß sie mit unterschiedlichen Strängen jeder spezifischen Sequenz ausreichend komplementär sind, um mit diesen zu hybridisieren, so daß das ausgehend von einem Primer synthetisierte Verlängerungsprodukt, wenn es von seinem komplementären Teil getrennt wird, als Matrize für die Synthese des Verlängerungsprcidukts des anderen Primers dienen kann;
(b) die Trennung der Primerverlängerungsprodukte von den Matrizen, auf denen sie synthetisiert wurden, um einzelsträngige Moleküle herzustellen; und
(c) die Behandlung der in (b) erzeugten einzelsträngigen Moleküle mit den Primern von (a) unter solchen Bedingungen, daß ein Primerverlängerungsprodukt mit jedem der in (b) hergestellten Einzelstränge als Matrize synthetisiert wird;
(d) die mindestens einmalige Wiederholung von (a) bis (c), wobei die in der ersten Probe enthaltene spezifische Nucleinsäureseqtienz amplifiziert wird; und
(B) mit einer zweiten, eine Nucleinsäuresequenz oder ein Gemisch von Nucleinsäuresequenzen enthaltenden Probe, in der jede Nucleinsäuresequenz zwei getrennte komplementäre Stränge von gleicher oder ungleicher Länge aufweist, wobei amplifizierte Nucleinsäuresequenzen von (A) in der zweiten Probe vorhanden sein können:
(e) die Behandlung der Nucleinsäure der zweiten Probe mit Uracil-DNA-Glycosylase, welche die Nucleinsäure, die Desoxyuridin enthält, im wesentlichen nicht amplifizierbar macht und welche die Amplifikation von Nucleinsäure, die Desoxyuridin nicht enthält, nicht wesentlich beeinträchtigt; wobei jegliche Primerverlängerungsprodukte der ersten Probe, die in (A) amplifiziert worden sind und in der zweiten Probe vorhanden sind, im wesentlichen nicht weiter in (B) amplifiziert werden.
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