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TECHNISCHES
GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die virale Diagnostik und insbesondere
den Nachweis von Variolavirus.
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STAND DER
TECHNIK
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In
den Vereinigten Staaten wurde die routinemäßige Immunisierung 1971 beendet,
da die Gefahr einer Verbreitung der Infektion in Kleinkindern mit
Immunschwächeleiden
die Wahrscheinlichkeit einer nachfolgenden Pockeninfektion überstieg.
Der letzte Fall von Pocken trat 1977 in Somalia, Afrika, auf. Im
Jahr 1980 erklärte
die Weltgesundheitsorganisation (WHO) die Pocken für ausgerottet.
Als Folge dieser Politik sind 30 Jahre vergangen, die eine junge
Bevölkerung
hervorbrachten, die wahrscheinlich einer Infektion mit dem Pockenvirus
gegenüber
anfällig
sind. Die Verwendung von Pocken als Bestandteil der biologischen
Kriegsführung stellt
weiterhin eine Bedrohung hinsichtlich der Erzeugung einer Epidemie
in solchen Individuen, die nie gegen dieses Virus immunisiert wurden,
und möglicherweise
in Erwachsenen, die den Impfstoff in der weit zurückliegenden
Vergangenheit erhielten, dar.
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Der
Nachweis von Pocken mittels PCR wurde unter Verwendung von Primern
auf der Grundlage von Genomsequenzen, die für das Protein Hämagglutinin
(HA) codieren, durchgeführt.
Ein Satz von für
das Variolavirus spezifischen Primern wurde offenbart (Ropp et al.,
J. Clinical Microbiology, Bd. 33, S. 2069-2076).
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung sieht Verfahren zur Identifizierung von Variola in einer
biologischen Probe vor. Dabei werden von der Erfindung Primer und
Sonden zum Nachweis von Variolavirus ebenso wie solche Primer und Sonden
enthaltende Kits bereitgestellt. Erfindungsgemäße Verfahren lassen sich zur
schnellen Identifizierung von Variolavirus-DNA aus Präparaten
zur Diagnose einer Variolavirusinfektion sowie zur Unterscheidung
von Variolavirusinfektionen von HSV-Infektionen verwenden. Die Verfahren
beinhalten unter Verwendung spezifischer Primer und Sonden die Amplifikation
und Überwachung
der Entwicklung spezifischer Amplifikationsprodukte mittels Fluoreszenzresonanz-Energietransfer
(FRET).
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In
einem erfindungsgemäßen Aspekt
wird ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins bzw. der Abwesenheit
von Variolavirus in einer biologischen Probe aus einem Individuum
bereitgestellt. Dabei beinhaltet das Verfahren zum Nachweis von
Variolavirus, daß man
mindestens einen Zyklusschritt, der einen Amplifikationsschritt
und einen Hybridisierungsschritt beinhaltet, durchführt. In
dem Amplifikationsschritt bringt man die Probe mit einem Paar Hämagglutinin
(HA)-Primer in Kontakt, sodaß bei
Vorhandensein eines Variolavirus-HA-Nukleinsäuremoleküls in der Probe ein HA-Amplifikationsprodukt
gebildet wird. Im Hybridisierungsschritt bringt man die Probe mit
einem Paar (HA)-Sonden in Kontakt. Dabei hybridisieren im allgemeinen
die Mitglieder des HA-Sondenpaars nicht mehr als fünf Nukleotide
voneinander entfernt. Eine erste HA-Sonde des HA-Sondenpaars ist
typischerweise mit einer Donor-Fluoreszenzgruppierung
und eine zweite HA-Sonde des HA-Sondenpaars
mit einer entsprechenden Akzeptor-Fluoreszenzgruppierung markiert.
Ferner beinhaltet das Verfahren, daß man das Vorhandensein bzw.
die Abwesenheit von FRET zwischen der Donor-Fluoreszenzgruppierung
der ersten HA-Sonde und der Akzeptor-Fluoreszenzgruppierung der
zweiten HA-Sonde nachweist. Dabei zeigt das Vorhandensein von FRET üblicherweise
das Vorhandensein von Variolavirus in der biologischen Probe an,
während
die Abwesenheit von FRET üblicherweise
die Abwesenheit von Variolavirus in der biologischen Probe anzeigt.
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Im
Amplifikationsschritt bringt man ferner die Probe mit einem Paar
Thymidinkinase (TK)-Primern in Kontakt, sodaß bei Vorhandensein eines Variolavirus-TK-Nukleinsäuremoleküls in der
Probe ein TK-Amplifikationsprodukt gebildet wird. Im Hybridisierungsschritt
bringt man die Probe mit einem Paar TK-Sonden in Kontakt. Dabei
hybridisieren die Mitglieder des TK-Sondenpaars im allgemeinen nicht
mehr als fünf
Nukleotide voneinander entfernt. Eine erste TK-Sonde des TK-Sondenpaars
ist typischerweise mit einer Donor-Fluoreszenzgruppierung und eine
zweite TK-Sonde des TK-Sondenpaars mit einer entsprechenden Akzeptor-Fluoreszenzgruppierung
markiert. Ferner beinhaltet das Verfahren, daß man das Vorhandensein bzw.
die Abwesenheit von FRET zwischen der Donor-Fluoreszenzgruppierung
der ersten TK-Sonde und der Akzeptor-Fluoreszenzgruppierung der
zweiten TK-Sonde
nachweist. Dabei zeigt das Vorhandensein von FRET üblicherweise
das Vorhandensein von Variolavirus in der biologischen Probe an,
während
die Abwesenheit von FRET üblicherweise
die Abwesenheit von Variolavirus in der biologischen Probe anzeigt.
Die Verfahren zum Nachweis von Variolavirus unter Verwendung von
HA und TK können
nacheinander oder gleichzeitig durchgeführt werden.
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Erfindungsgemäße Primer
und Sonden können
auf einen ersten Teil (HA1) oder einen zweiten Teil (HA2) des HA-Gens gerichtet werden.
Ein HA1-Primerpaar beinhaltet im allgemeinen einen ersten HA1-Primer und
einen zweiten HA1-Primer. Dabei kann der erste HA1-Primer die Sequenz
5'-CTA ATA TCA TTA
GTA TAC GCT ACA C-3' (SEQ
ID NO : 1) und der zweite HA1-Primer die Sequenz 5'-GAG TCG TAA GAT
ATT TTA TCC-3' (SEQ
ID NO: 2) beinhalten. Eine erste HA1-Sonde kann die Sequenz 5'-AAT GAT TAT GTT
GTT ATG AGT GCT TG-3' (SEQ
ID NO: 3) und eine zweite HA1-Sonde
die Sequenz 5'-TAT
AAG GAG CCC AAT TCC ATT ATT CT-3' (SEQ
ID NR: 4) beinhalten.
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Ein
HA2-Primerpaar beinhaltet im allgemeinen einen ersten HA2-Primer
und einen zweiten HA2-Primer. Dabei kann der erste HA2-Primer die
Sequenz 5'-ATA GTG
AAT CGA CTA TAG ACA TAA TA-3' (SEQ
ID NO: 5) und der zweite HA2-Primer die Sequenz 5'-TTG ATT TAG TAG
TGA CAA TTC C-3' (SEQ
ID NO: 6) beinhalten. Eine erste HA2-Sonde kann die Sequenz 5'-CTG TCA CAT ACA
CTA GTG ATA TCA TT-3' (SEQ ID NO: 7) und
eine zweite HA2-Sonde die Sequenz 5'-ATA CAG TAA GTA CAT CAT CTG GAG AA-3' (SEQ ID NO: 8) beinhalten.
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Ein
TK-Primerpaar beinhaltet im allgemeinen einen ersten TK-Primer und
einen zweiten TK-Primer. Dabei kann der erste TK-Primer die Sequenz
5'-AAG GAC AGT TCT
TTC CAG-3' (SEQ
ID NO: 9) und der zweite TK-Primer die Sequenz 5'-TGA TAC ATA TCA TTA CCT CCT A-3' (SEQ ID NO: 10)
beinhalten. Eine erste TK-Sonde kann die Sequenz 5'-CCG TTT AAT AAT
ATC TTG GAT CTT-3' (SEQ
ID NO: 11) und eine zweite TK-Sonde die Sequenz 5'-TTC CAT TAT CTG
AAA TGG TGG T-3' (SEQ
ID NO: 12) beinhalten.
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Alternativ
oder zusätzlich
läßt sich
zum Nachweis eines TK-Amplifikationsprodukts ein zweites TK-Sondenpaar
mit den folgenden Sequenzen verwenden: 5'-GAC ATT TCA ACG TAA ACC GTT TAA-3' (SEQ ID NO: 13)
und 5'-AAT ATC TTG
GAT CTT ATT CCA TTA TCT G-3' (SEQ
ID NO: 14). In einigen Aspekten kann einer der HA- bzw. TK-Primer
mit einer Fluoreszenzgruppierung (je nach Bedarf einem Donor oder
Akzeptor) markiert werden und den Platz der HA- bzw. TK-Sonden einnehmen.
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Die
Mitglieder des HA-Sondenpaars oder TK-Sondenpaars können nicht
mehr als zwei Nukleotide voneinander entfernt oder nicht mehr als
ein Nukleotid voneinander entfernt hybridisieren. Eine repräsentative Donor-Fluoreszenzgruppierung
ist Fluorescein, wobei entsprechende Akzeptor-Fluoreszenzgruppierungen LC-Red
640, LC-Red 705, Cy5, und Cy5.5 umfassen. Zusätzliche entsprechende Donor-
oder Akzeptor-Fluoreszenzgruppierungen sind im Fachgebiet bekannt.
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In
einem Aspekt wird im Nachweisschritt die biologische Probe bei einer
von der Donor-Fluoreszenzgruppierung absorbierten Wellenlänge angeregt
und die von der Akzeptor-Fluoreszenzgruppierung emittierte Wellenlänge sichtbar
gemacht und/oder gemessen (d. h. FRET sichtbar gemacht und/oder
gemessen). In einem weiteren Aspekt wird der FRET im Nachweisschritt
quantifiziert. In noch einem weiteren Aspekt läßt sich der Nachweisschritt
nach jedem Zyklusschritt (z. B. in Echtzeit) durchführen.
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Im
allgemeinen zeigt das Vorhandensein eines FRET innerhalb von 50
Zyklen (z. B. 20, 25, 30, 35, 40 oder 45 Zyklen) das Vorhandensein
einer Variolavirusinfektion in dem Individuum an. Darüber hinaus
läßt sich das
Vorhandensein bzw. die Abwesenheit des Variolavirus durch Bestimmen
der Schmelztemperatur zwischen einer oder beiden HA-Sonde(n) und
der HA-Amplifikation oder in ähnlicher
Weise zwischen einer oder beiden TK-Sonde(n) und dem TK-Amplifikationsprodukt
bestätigen.
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Zu
repräsentativen
biologischen Proben gehören
Hautabstriche, Liquor, Gangliongewebe, Hirngewebe, Augenflüssigkeit,
Blut, Speichel, bronchioalveoläre
Lavage, Bronchialaspirate, Lungengewebe und Urin. Die oben beschriebenen
Verfahren können
ferner die Verhinderung einer Amplifikation einer kontaminierenden Nukleinsäure beinhalten.
Dabei kann das Verhindern der Amplifikation beihalten, daß man den
Amplifikationsschritt in Gegenwart von Uracil durchführt und
die biologische Probe vor der Amplifikation mit Uracil-DNA-Glykosylase
behandelt.
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Darüber hinaus
läßt sich
der Zyklusschritt an einer Kontrollprobe durchführen. Dabei kann eine Kontrollprobe
den gleichen Teil des Variolavirus-HA-Nukleinsäure moleküls beinhalten. Andererseits
kann eine Kontrollprobe ein anderes Nukleinsäuremolekül als ein Variolavirus-HA-Nukleinsäuremolekül beinhalten.
An einer solchen Kontrollprobe lassen sich Zyklusschritte unter
Verwendung eines Kontrollprimerpaars und eines Kontrollsondenpaars
durchführen.
Die Kontrollprimer und -sonden sind von den HA-Primern und -Sonden
verschieden. Ein Kontrollamplifikationsprodukt wird durch einen
oder mehrere Amplifikationsschritte erzeugt. Die Kontrollsonden
hybridisieren jeweils an das Kontrollamplifikationsprodukt.
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In
einem weiteren Aspekt werden hergestellte Artikel oder Kits bereitgestellt.
Erfindungsgemäße Kits können ein
Paar HA-Primer (HA1 oder HA2) sowie ein Paar HA-Sonden (HA1 bzw. HA2) und eine Donor-
und eine entsprechende Akzeptor-Fluoreszenzgruppierung beinhalten.
So kann beispielsweise ein erster in einem erfindungsgemäßen Kit
bereitgestellter HA1-Primer die Sequenz 5'-CTA ATA TCA TTA GTA TAC GCT ACA C-3' (SEQ ID NO: 1) und
ein zweiter HA1-Primer die Sequenz 5'-GAG TCG TAA GAT ATT TTA TCC-3' (SEQ ID NO: 2) aufweisen.
Eine in einem erfindungsgemäßen Kit
bereitgestellte erste HA1-Sonde kann die Sequenz 5'-AAT GAT TAT GTT
GTT ATG AGT GCT TG-3' (SEQ
ID NO: 3) und eine zweite HA1-Sonde
die Sequenz 5'-TAT
AAG GAG CCC AAT TCC ATT ATT CT-3' (SEQ
ID NO: 4) aufweisen. Ein in einem erfindungsgemäßen Kit bereitgestellter erster
HA2-Primer kann die Sequenz 5'-ATA
GTG AAT CGA CTA TAG ACA TAA TA-3' (SEQ ID NO: 5) und
ein zweiter HA2-Primer die Sequenz 5'-TTG ATT TAG TAG TGA CAA TTC C-3' (SEQ ID NO: 6) aufweisen.
Eine in einem erfindungsgemäßen Kit
bereitgestellte erste HA2-Sonde kann die Sequenz 5'-CTG TCA CAT ACA
CTA GTG ATA TCA TT-3' (SEQ
ID NO: 7) und eine zweite HA2-Sonde die Sequenz 5'-ATA CAG TAA GTA
CAT CAT CTG GAG AA-3' (SEQ
ID NO: 8) aufweisen.
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Hergestellte
Artikel können
ferner oder als Alternative ein Paar TK-Primer, ein Paar TK-Sonden
sowie eine Donor- und eine entsprechende Akzeptor-Fluoreszenzgruppierung
beinhalten. So kann beispielsweise der in einem erfindungsgemäßen Kit
bereitgestellte erste TK-Primer die Sequenz 5'-AAG GAC AGT TCT TTC CAG-3' (SEQ ID NO: 9) und
der zweite TK-Primer die Sequenz 5'-TGA TAC ATA TCA TTA CCT CCT A-3' (SEQ ID NO : 10)
aufweisen. Die in einem erfindungsgemäßen Kit bereitgestellte erste
TK-Sonde kann die
Sequenz 5'-CCG TTT
AAT AAT ATC TTG GAT CTT-3' (SEQ
ID NO: 11) und die zweite TK-Sonde die Sequenz 5'-TTC CAT TAT CTG AAA TGG TGG T-3' (SEQ ID NO: 12)
aufweisen. Als Alternative können
in einem erfindungsgemäßen Kit
die folgenden TK-Sonden bereitgestellt sein: 5'-GAC ATT TCA ACG TAA ACC GTT TAA-3' (SEQ ID NO: 13)
und 5'-AAT ATC TTG
GAT CTT ATT CCA TTA TCT G-3' (SEQ
ID NO: 14).
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Hergestellte
Artikel können
Fluorophorgruppierungen zur Markierung der Sonden oder bereits mit
Donor- und entsprechenden Akzeptor-Fluoreszenzgruppierungen markierte
Sonden beinhalten. Die hergestellten Artikel können auch einen Beipackzettel
mit darauf angegebenen Anweisungen zur Verwendung der Primer, Sonden
und Fluorophorgruppierungen zum Nachweis des Vorhandenseins bzw.
der Abwesenheit von Variolavirus in einer biologischen Probe beinhalten.
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In
noch einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins
bzw. der Abwesenheit von Variolavirus in einer biologischen Probe
aus einem Individuum bereitgestellt. In einem solchen Verfahren
wird wenigstens ein Zyklusschritt durchgeführt. Dabei kann ein Zyklusschritt
einen Amplifikationsschritt und einen Hybridisierungsschritt beinhalten.
Im allgemeinen beinhaltet ein Amplifikationsschritt, daß man die Probe
mit einem Paar HA-Primern in Kontakt bringt, sodaß bei Vorhandensein
eines Variolavirus-HA-Nukleinsäuremoleküls in der
Probe ein HA-Amplifikationsprodukt gebildet wird. Ein Hybridisierungsschritt
beinhaltet im allgemeinen, daß man
die Probe mit einer HA-Sonde für
das HA-Amplifikationsprodukt in Kontakt bringt. Eine solche HA-Sonde
ist üblicherweise
mit einer Donor-Fluoreszenzgruppierung und einer entsprechenden Akzeptor-Fluoreszenzgruppierung
markiert. In dem Verfahren weist man ferner das Vorhandensein bzw.
die Abwesenheit von Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) zwischen
der Donor-Fluoreszenzgruppierung und der Akzeptor-Fluoreszenzgruppierung
der HA-Sonde nach. Dabei zeigt das Vorhandensein bzw. die Abwesenheit
von Fluoreszenz das Vorhandensein bzw. die Abwesenheit von Variolavirus
in der Probe an. Neben den hier beschriebenen HA-Primern/ der HA-Sonde
läßt sich
dieses Verfahren auch unter Verwendung von TK-Primern/ einer TK-Sonde
durchführen.
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In
einem Aspekt kann bei der Amplifikation ein Polymeraseenzym mit
5'-nach-3'-Exonukleaseaktivität zum Einsatz
kommen. So wären
die erste und die zweite Fluoreszenzgruppierung nicht mehr als fünf Nukleotide
voneinander entfernt entlang der Länge der Sonde. In einem weiteren
Aspekt beinhaltet die HA-Sonde eine Nukleinsäuresequenz, die die Ausbildung
einer Sekundärstruktur
gestattet. Eine derartige Ausbildung einer Sekundärstruktur
führt im
allgemeinen zur räumlichen
Nähe zwischen
der ersten und der zweiten Fluoreszenzgruppierung. Gemäß diesem
Verfahren kann es sich bei der zweiten Fluoreszenzgruppierung auf
einer Sonde um einen Quencher handeln.
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In
einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins
bzw. der Abwesenheit von Variolavirus in einer biologischen Probe
aus einem Individuum bereitgestellt. In einem solchen Verfahren
wird mindestens ein Zyklusschritt durchgeführt. Dabei kann ein Zyklusschritt
einen Amplifikationsschritt und einen Farbstoffbindungschritt beinhalten.
Ein Amplifikationsschritt beinhaltet im allgemeinen, daß man die Probe
mit einem Paar HA-Primern in Kontakt bringt, sodaß bei Vorhandensein
eines Variolavirus-HA-Nukleinsäuremoleküls in der
Probe ein HA-Amplifikationsprodukt gebildet wird. Ein Farbstoffbindungschritt
beinhaltet im allgemeinen, daß man
das HA-Amplifikationsprodukt mit einem Doppelstrang-DNA bindenden
Farbstoff in Kontakt bringt. In dem Verfahren weist man ferner das
Vorhandensein bzw. die Abwesenheit der Bindung des Doppelstrang-DNA
bindenden Farbstoffs nach. Das Vorhandensein von Bindung zeigt dabei
typischerweise das Vorhandensein von Variolavirus in der Probe an,
wobei die Abwesenheit von Bindung typischerweise die Abwesenheit
von Variolavirus in der Probe anzeigt. Ein solches Verfahren kann
ferner die Schritte beinhalten, daß man die Schmelztemperatur
zwischen dem HA-Amplifikationsprodukt und dem Doppelstrang-DNA bindenden
Farbstoff bestimmt. Dabei bestätigt
die Schmelztemperatur im allgemeinen das Vorhandensein bzw. die
Abwesenheit von Variolavirus. Zu repräsentativen Doppelstrang-DNA
bindenden Farbstoffen gehören
SYBRGreenI®,
SYBRGold® und
Ethidiumbromid.
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Falls
nicht anders angegeben, weisen alle hier verwendeten technischen
und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung auf, wie sie
allgemein vom Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden
wird. Obwohl sich zur Praktizierung oder zum Testen der vorliegenden
Erfindung zu den hier beschriebenen Verfahren ähnliche oder äquivalente
Verfahren und Materialien verwenden lassen, sind geeignete Verfahren
und Materialien unten beschrieben. Darüber hinaus dienen die Materialien,
Verfahren und Beispiele lediglich der Veranschaulichung und sollen
keine Beschränkung
darstellen. Alle hier erwähnten
Veröffentlichungen,
Patentanmeldungen, Patente und andere Literaturangaben sind hiermit
durch Bezugnahme voll inhaltlich aufgenommen. Im Falle eines Konflikts
entscheidet die vorliegende Beschreibung, einschließlich der
Definition.
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Die
Einzelheiten einer oder mehrerer erfindungsgemäßer Ausführungsformen sind in den beigefügten Zeichnungen
und der nachfolgenden Beschreibung dargelegt. Weitere Merkmale,
Gegenstände
und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den Zeichnungen und
der ausführlichen
Beschreibung sowie aus den Ansprüchen.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG
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Beschrieben
wird hier ein Echtzeittest zum Nachweis von Variolavirus in einer
biologischen Probe, der empfindlicher ist als existierende Tests.
Durch die Erfindung werden Primer und Sonden zum Nachweis von Variolavirusinfektionen
sowie hergestellte Artikel, die solche Primer und Sonden enthalten,
bereitgestellt. Die erhöhte
Empfindlichkeit der Echtzeit-PCR zum Nachweis von Variolavirus im
Vergleich mit anderen Verfahren ermöglicht ebenso wie die verbesserten
Merkmale der Echtzeit-PCR, einschließlich Proben-Containment und Echtzeitnachweis
des amplifizierten Produkts, die Realisierung dieser Technologie
für die
routinemäßige Diagnose
von Variolavirusinfektionen im klinischen Labor.
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Variolavirus
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Bei
Variola (Pocken) handelt es sich um ein lineares, Doppelstrang-DNA
enthaltendes Virus in der Familie Poxviridae. Variolavirionen sind
große
(~300 × 250
nm), backsteinförmige
Partikel. Klinisch treten vesikuläre Läsionen bei anfälligen Individuen
nach einer Inkubationszeit von 8–10 Tagen nach In-Kontakt-Kommen mit
Pockenvirus auf. Bei der differentiellen klinischen Diagnose einer
Pockenvirusinfektion würden
durch Herpes simplex-Virus (HSV) und Varicella-Zoster-Virus (VZV)
erzeugte vesikuläre
Läsionen
in Betracht gezogen. Das mit Kuhpocken- und Pockenviren antigenisch
sowie genomisch (> 95%
Nukleotididentität)
eng verwandte Vacciniavirus wurde in einen abgeschwächten Pocken-Lebendimpfstoff eingebaut.
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Variolavirus-Nukleinsäuren und
-oligonukleotide
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Durch
die Erfindung werden Verfahren zum Nachweis von Variolavirus, beispielsweise
durch Amplifizieren eines Teils der Variolavirus-Hämagglutinin
(HA)-Nukleinsäure
oder -Thymidinkinase (TK)-Nukleinsäure, bereitgestellt. Andere
als die hier beispielhaft aufgeführten
Variolavirus-Nukleinsäuren
(z. B. andere als HA und TK) können
auch zum Nachweis von Variolavirus in einer Probe verwendet werden
und sind dem Fachmann bekannt. Die Nukleinsäuresequenz des Variolavirus-Genoms
steht ebenso wie für
HA und TK codierende Variola-Nukleinsäuremoleküle zur Verfügung (siehe z. B. GenBank Accession
Nos. M14783 und K02031). Insbesondere werden durch die Erfindung
Primer und Sonden zur Amplifikation und zum Nachweis von Variolavirus-HA-Nukleinsäuremolekülen ebenso
wie Primer und Sonden zur Amplifikation und zum Nachweis von Variolavirus-TK-Nukleinsäuremolekülen bereitgestellt.
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Primer,
die ein Variolavirus-Nukleinsäuremolekül, z. B.
Variolavirus-HA oder -TK, amplifizieren, können beispielsweise unter Verwendung
eines Computerprogramms, wie z. B. OLIGO (Molecular Biology Insights,
Inc., Cascade, CO, USA) konstruiert werden. Dabei gehören zu wichtigen
Merkmalen bei der Konstruktion von als Amplifikationsprimern zu
verwendenden Oligonukleotiden, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, ein
Amplifikationsprodukt geeigneter Größe zur Erleichterung des Nachweises
(z. B. Elektrophorese, ähnliche Schmelztemperaturen
für die
Mitglieder eines Primerpaars sowie die jeweilige Länge der
Primer (d. h. die Primer müssen
lang genug sein, um eine Annealing-Reaktion mit Sequenzspezifität einzugeben
und die Synthese zu starten, doch nicht so lang sein, daß die Treue
während
der Oligonukleotidsynthese reduziert ist). Typischerweise weisen
Oligonukleotidprimer eine Länge
von 15 bis 30 Nukleotiden auf.
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Die
Konstruktion von als Hybridisierungssonden zu verwendenden Oligonukleotiden
läßt sich
auf ähnliche Weise
durchführen
wie die Konstruktion von Primern, obwohl die Mitglieder eines Sondenpaars
vorzugsweise eine Annealing-Reaktion mit einem Amplifikationsprodukt
nicht mehr als fünf
Nukleotide voneinander entfernt auf dem gleichen Strang eingehen,
sodaß ein
FRET stattfinden kann (z. B. nicht mehr als 1, 2, 3 oder 4 Nukleotide
voneinander entfernt). Durch diesen minimalen Trennungsgrad werden
die jeweiligen Fluoreszenzgruppierungen typischerweise in ausreichende
Nähe gebracht,
sodaß der
FRET stattfindet. Allerdings versteht sich, daß andere Trennungsabstände, (z.
B. sechs oder mehr Nukleotide) möglich
sind, vorausgesetzt, daß die
Fluoreszenzgruppierungen in angemessener Weise relativ zueinander
(z. B. mit einem Linker-Arm) positioniert sind, sodaß der FRET
stattfinden kann. Darüber
hinaus können
Sonden so konstruiert werden, daß sie an Ziele hybridisieren,
die einen Polymorphismus oder eine Mutation enthalten, was einen
unterschiedlichen Nachweis von Variolavirusstämmen entweder auf Grundlage
einer absoluten Hybridisierung unterschiedlicher Sondenpaare, die
dem jeweiligen zu unterscheidenden Variolavirusstamm entsprechen, oder
unterschiedlicher Schmelztemperaturen zwischen beispielsweise Mitgliedern
eines Sondenpaars und jedem Amplifikationsprodukt, das einem zu
unterscheidenden Variolavirusstamm entspricht, gestattet. Wie Oligonukleotidprimer
weisen Oligonukleotidsonden typischerweise ähnliche Schmelztemperaturen
auf, wobei die Länge
jeder Sonde jeweils dazu ausreichen muß, daß eine sequenzspezifische Hybridisierung
stattfindet, jedoch nicht so lang sein darf, daß die Treue während der
Synthese reduziert ist. Oligonukleotidsonden weisen im allgemeinen
eine Länge
von 15 bis 30 Nukleotiden auf.
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Konstruktionen
umfassen Vektoren, die ein Variolavirus-Nukleinsäuremolekül, z. B. Variolavirus-HA oder
-TK oder Fragmente davon enthalten. Erfindungsgemäße Konstrukte
lassen sich beispielsweise als Kontroll matrizen-Nukleinsäuremoleküle verwenden.
Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete Vektoren
sind kommerziell erhältlich
und/oder werden mit im Fachgebiet routinemäßigen Verfahren der rekombinanten
DNA-Technologie
hergestellt. Variolavirus-HA- oder -TK-Nukleinsäuremoleküle lassen sich beispielsweise
durch chemische Synthese, direkte Klonierung aus Variolavirus oder
durch PCR-Amplifikation erhalten. Ein Variolavirus-Nukleinsäuremolekül oder ein
Fragment davon läßt sich
dabei operativ mit einem Promotor oder einem anderen Regulationselement,
wie z. B. einer Enhancer-Sequenz,
einem Response-Element oder einem induzierbaren Element, das die
Expression des Variolavirus-Nukleinsäuremoleküls moduliert,
verknüpfen.
Operative Verknüpfung,
wie hier verwendet, bezieht sich auf die Verbindung eines Promotors
und/oder anderer Regulationselemente mit einem Variolavirus-Nukleinsäuremolekül auf solche
Weise, daß dadurch
die Expression des Variolavirus-Nukleinsäuremoleküls stattfindet und/oder reguliert
wird. Ein Promotor, der normalerweise die Expression von Variolavirus-HA-
oder -TK nicht steuert, läßt sich
zur Steuerung der Transkription einer HA- oder TK-Nukleinsäure unter Verwendung beispielsweise
einer viralen Polymerase, einer bakteriellen Polymerase oder einer
eukaryontischen RNA-Polymerase II verwenden. Als Alternative läßt sich
der native HA- oder TK-Promotor
zur Steuerung der Transkription einer HA- bzw. TK-Nukleinsäure unter
Verwendung beispielsweise eines Variolavirus-RNA-Polymeraseenzyms
verwenden. Darüber
hinaus kann sich operativ verknüpft
auf eine entsprechende Verbindung zwischen einem Variolavirus-HA- oder TK-Promotor
oder -Regulationselement und einer heterologen codierenden Sequenz
(d. h. einer nicht für
HA oder TK codierenden Sequenz, beispielsweise einem Reportergen),
sodaß dadurch
die Expression der heterologen codierenden Sequenz gestattet ist,
beziehen.
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Neben
Variolavirus-HA- oder -TK-Nukleinsäuremolekülen gehören zu zur Verwendung in den
erfindungsgemäßen Verfahren
geeigneten Konstruktionen typischerweise für einen selektionierbaren Marker
(z. B. ein Antibiotikaresistenz-Gen) zur Selektion gewünschter
Konstrukte und/oder Transformanten codierende Sequenzen sowie ein
Replikationsursprung. Die Wahl der Vektorsysteme hängt üblicherweise
von mehreren Faktoren ab, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein,
der Wahl der Wirtszellen, der Replikationseffizienz, der Selektionierbarkeit,
der Induzierbarkeit und der Einfachheit der Gewinnung.
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Variolavirus-HA-
oder -TK-Nukleinsäuremoleküle enthaltende
Konstrukte lassen sich in einer Wirtszelle vermehren. Dabei soll
der Begriff Wirtszelle, wie er hier verwendet wird, Prokaryonten
und Eukaryonten, wie z. B. Hefe-, Pflanzen- und Tierzellen, einschließen. Zu
prokaryontischen Wirten können
E. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens und Bacillus
subtilis gezählt
werden. Eukaryontische Wirte umfassen Hefen, wie z. B. S. cerevisiae,
S. pombe, Pichia pastoris, Säugerzellen,
wie z. B. COS-Zellen oder CHO (Chinese hamster ovary)-Zellen, Insektenzellen
sowie Pflanzenzellen, wie z. B. Arabidopsis thaliana und Nicotiana
tabacum. Ein Konstrukt läßt sich
in eine Wirtszelle unter Verwendung einer der dem Fachmann allgemein
bekannten Techniken einfügen.
So handelt es sich beispielsweise bei der Calciumphosphatpräzipitation,
der Elektroporation, dem Hitzeschock, der Lipofektion, der Mikroinjektion
und dem Virus-vermittelten Nukleinsäuretransfer um gängige Verfahren
zur Einführung
von Nukleinsäuren
in Wirtszellen. Darüber
hinaus läßt sich nackte
DNA direkt den Zellen zuführen
(siehe, z. B. US-Patente Nr. 5,580,859 und 5,589,466).
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Polymerasekettenreaktion
(PCR)
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Die
US-Patente Nr. 4,683,202, 4,683,195, 4,800,159 und 4,965,188 offenbaren
herkömmliche PCR-Techniken.
Bei der PCR werden typischerweise zwei Oligonukleotidprimer eingesetzt,
die an eine ausgewählte
Nukleinsäurematrize (z.
B. DNA oder RNA) binden. Zu in der vorliegenden Erfindung geeigneten
Primern gehören
Oligonukleotide, die als Startpunkt für die Nukleinsäuresynthese
in Variolavirus-HA- oder -TK wirken können. Ein Primer läßt sich
aus einem Restriktionsverdau mit herkömmlichen Verfahren auf reinigen oder
kann synthetisch hergestellt werden. Vorzugsweise ist der Primer
für die
maximale Effizienz bei der Amplifikation einzelsträngig, doch
kann der Primer auch doppelsträngig
sein. Doppelsträngige
Primer werden zunächst
denaturiert, d. h. zur Trennung der Stränge behandelt. Ein Verfahren
zur Denaturierung von Doppelstrang-Nukleinsäuren besteht im Erhitzen.
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Der
Begriff "thermostabile
Polymerase" bezieht
sich auf ein Polymeraseenzym, das hitzestabil ist, d. h. das Enzym
katalysiert die Bildung von Primerverlängerungsprodukten, die zu einer
Matrize komplementär sind,
und denaturiert nicht irreversibel, wenn es den erhöhten Temperaturen über den
Zeitraum, der zur Durchführung
der Denaturierung doppelsträngiger
Matrizennukleinsäuren
notwendig ist, ausgesetzt wird. Im allgemeinen wird die Synthese
jeweils am 3'-Ende
der Primer gestartet und verläuft
in 5'-nach-3'-Richtung entlang dem
Matrizenstrang. Thermostabile Polymerasen konnten aus Thermus flavus,
T. ruber, T. thermophilus, T. aquaticus, T. lacteus, T. rubens,
Bacillus stearothermophilus und Methanothermus fervidus isoliert
werden. Trotzdem lassen sich auch Polymerasen, die nicht thermostabil
sind, in PCR-Tests einsetzen, vorausgesetzt, daß das Enzym nachgeliefert werden
kann.
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Falls
die Variolavirus-Matrizennukleinsäure doppelsträngig ist,
ist es notwendig, die beiden Stränge vor
deren Verwendung als Matrize in der PCR zu trennen. Die Strangtrennung
läßt sich
mit einem geeigneten Denaturierungsverfahren, einschließlich physikalischen,
chemischen oder enzymatischen Mitteln, bewerkstelligen. Bei einem
Verfahren zur Trennung der Nukleinsäuresträn ge wird die Nukleinsäure erhitzt,
bis sie vorwiegend denaturiert vorliegt (z. B. mehr als 50%, 60%,
70%, 80%, 90% oder 95% denaturiert). Die zur Denaturierung von Matrizennukleinsäure notwendigen
Aufheizbedingungen hängen
beispielsweise von der Puffersalzkonzentration sowie der Länge und
Nukleotidzusammensetzung der denaturierten Nukleinsäuren ab,
befinden sich aber typischerweise in einem Bereich von etwa 90°C bis etwa
105°C über einen
Zeitraum, der von Merkmalen der Reaktion, wie z. B. der Temperatur
und der Nukleinsäurelänge, abhängt. Die
Denaturierung wird typischerweise über einen Zeitraum von etwa
30 s bis 4 min durchgeführt.
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Falls
die doppelsträngige
Nukleinsäure
durch Hitze denaturiert wird, läßt man das
Reaktionsgemisch auf eine Temperatur abkühlen, die das Annealing eines
jeden Primers an seine Zielsequenz auf der Variolavirus-Nukleinsäure fördert. Die
Annealing-Temperatur liegt üblicherweise
bei etwa 35°C
bis etwa 65°C.
Anschließend
wird das Reaktionsgemisch auf eine Temperatur gebracht, bei der
die Aktivität
der Polymerase gefördert oder
optimiert wird, d. h. einer ausreichenden Temperatur, damit die
Verlängerung
von dem in der Annealing-Reaktion
gebundenen Primer unter Erzeugung von zur Matrizennukleinsäure komplementären Produkten stattfindet.
Dabei sollte die Temperatur zur Synthese eines Verlängerungsprodukts
von einem jeden Primer, der in der Annealing-Reaktion an eine Nukleinsäurematrize
gebunden wurde, ausreichen, sollte jedoch nicht so hoch sein, daß ein Verlängerungsprodukt
von ihrer komplementären
Matrize denaturiert wird (z. B. die Temperatur liegt im allgemeinen
im Bereich von etwa 40°C
bis 80°C).
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In
PCR-Tests kann Variolavirus-Nukleinsäure, wie z. B. DNA oder RNA,
einschließlich
Messenger-RNA (mRNA), eingesetzt werden. Dabei braucht die Matrizennukleinsäure nicht
aufgereinigt zu werden; sie kann eine Nebenfraktion eines komplexen
Gemisches darstellen, wie z. B. in menschlichen Zellen enthaltene
Variolavirus-Nukleinsäure. DNA
oder RNA kann aus einer biologischen Probe, wie z. B. Hautabstriche, Liquor,
Gangliongewebe, Hirngewebe, Augenflüssigkeit, Blut, Speichel, bronchioalveoläre Lavage,
Bronchialaspirate, Lungengewebe und Urin, mit Routinetechniken,
wie beispielsweise den in Diagnostic Moleculear Microbiology: Principles
and Applications (Persing et al. (Hrsg.), 1993, American Society
for Microbiology, Washington D.C.) beschriebenen, extrahiert werden.
Nukleinsäuren
lassen sich aus einer beliebigen Anzahl von Quellen, wie z. B. Plasmiden,
oder natürlichen
Quellen, einschließlich
Bakterien, Hefe, Viren, Organellen oder höheren Organismen, wie z. B.
Pflanzen oder Tieren, erhalten.
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Die
Oligonukleotidprimer werden mit PCR-Reagentien unter Reaktionsbedingungen,
die die Primerverlängerung
induzieren, kombiniert. So beinhalten Kettenverlängerungsreaktionsansätze im allgemeinen
50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 15 mM MgCl2,
0,001% (w/v) Gelatine, 0,5–1,0 c cg denaturierte
Matrizen-DNA, jeweils 50 pmol Oligonukleotidprimer, 2,5 U Taq-Polymerase
und 10% DMSO). Die Reaktionsansätze
enthalten üblicherweise
jeweils 150 bis 320 c cM
dATP, dCTP, dTTP, dGTP oder eines oder mehrerer Analoge davon.
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Die
neu synthetisierten Stränge
bilden ein Doppelstrangmolekül,
das in den nachfolgenden Schritten der Reaktion verwendet werden
kann. Dabei können
die Schritte Strangtrennung, Annealing und Elongation so oft wie
nötig wiederholt
werden, um die gewünschte
Menge an Amplifikationsprodukten, die dem Variolavirus-Zielnukleinsäuremolekül entsprechen,
zu produzieren. Dabei stellen die im Reaktionsansatz vorhandenen Mengen
an Primern, thermostabilen Enzymen und Nukleosidtriphosphaten die
beschränkenden
Faktoren bei der Reaktion dar. Die Zyklusschritte (d. h. Denaturierung,
Annealing und Verlängerung)
werden vorzugsweise wenigstens einmal wiederholt. Zur Verwendung
im Nachweis hängt
die Anzahl der Zyklusschritte zum Beispiel von der Art der Probe
ab. Handelt es sich bei der Probe um ein komplexes Gemisch aus Nukleinsäuren, so sind
mehr Zyklusschritte erforderlich, um die Zielsequenz für den Nachweis
hinreichend zu amplifizieren. Im allgemeinen werden die Zyklusschritte
wenigstens etwa 20 mal wiederholt, können jedoch bis zu 40, 60 oder sogar
100 mal wiederholt werden.
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Fluoreszenzresonanz-Energietransfer
(FRET)
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Die
FRET-Technologie (siehe z. B. US-Patente Nr. 4,996,143, 5,565,322,
5,849,489, und 6,162,603) beruht auf einem Konzept, daß, wenn
ein Donor und eine entsprechende Akzeptor-Fluoreszenzgruppierung
in einem bestimmten Abstand zueinander positioniert werden, zwischen
den beiden Fluoreszenzgruppierungen ein Energietransfer stattfindet,
der sichtbar gemacht oder in anderer Weise nachgewiesen und/oder
quantifiziert werden kann. Zwei Oligonukleotidsonden, die jeweils
eine Fluoreszenzgruppierung enthalten, können an ein Amplifikationsprodukt
an bestimmten Positionen, die über
die Komplementarität
der Oligonukleotidsonden zur Variolavirus-Zielnukleinsäuresequenz
bestimmt wurden, hybridisieren. Bei Hybridisierung der Oligonukleotidsonden
an die Amplifikationsprodukt-Nukleinsäure an den
entsprechenden Positionen wird ein FRET-Signal erzeugt.
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Die
Fluoreszenzanalyse kann beispielsweise unter Verwendung eines photonenzählenden
Epifluoreszenzmikroskopsystems (mit dem entsprechenden Dichroitischen
Spiegel und den entsprechenden Filtern zur Verfolgung der Fluoreszenzemission über den
jeweiligen Bereich), eines photonenzählenden Photomultiplier-Systems
oder eines Fluorometers durchgeführt
werden. Die Exzitation zur Initiierung des Energietransfers läßt sich
mit einem Argonionenlaser, einer hochintensiven Quecksilber (Hg)-Bogenlampe,
einer faseroptischen Lichtquelle oder einer anderen hochintensiven
Lichtquelle mit entsprechender Filterung für die Exzitation in dem gewünschten
Bereich durchführen.
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"Entsprechend", wie es hier mit
Bezug auf Donor- und entsprechende Akzeptor-Fluoreszenzgruppierungen
verwendet wird, bezieht sich auf eine Akzeptor-Fluoreszenzgruppierung
mit einem Emissionsspektrum, das das Exzitationsspektrum der Donor-Fluoreszenzgruppierung überlappt.
Dabei sollte das Wellenlängenmaximum
des Emissionsspektrums der Akzeptor-Fluoreszenzgruppierung wenigstens
100 nm höher
sein als das Wellenlängenmaximum
des Exzitationsspektrums der Donor-Fluoreszenzgruppierung. Dementsprechend
kann dazwischen ein effizienter nichtstrahlender Energietransfer
produziert werden.
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Fluoreszenzdonor-
und entsprechende Akzeptor-Gruppierungen werden im allgemeinen auf
(a) einen hocheffizienten Förster-Energietransfer;
(b) eine große
endgültige
Stokes-Verschiebung (> 100
nm); (c) die Verschiebung der Emission so weit wie möglich in
den roten Anteil des sichtbaren Spektrums (> 600 nm) sowie (d) die Verschiebung der
Emission zu einer höheren
Wellenlänge
als die durch die Exzitation bei der Donor-Exzitationswellenlänge produzierten Raman-Wasserfluoreszenzemission
hin gewählt.
So kann beispielsweise eine Donor-Fluoreszenzgruppierung gewählt werden,
deren Exzitationsmaximum in der Nähe einer Laserlinie (z. B.
Helium-Cadmium 442 nm oder Argon 488 nm) liegt und die einen hohen
Extinktionskoeffizienten, eine hohe Quantenausbeute sowie eine gute Überlappung
ihrer Fluoreszenzemission mit dem Exzitationsspektrum der entsprechenden
Akzeptor-Fluoreszenzgruppierung aufweist. Dabei kann eine entsprechende
Akzeptor-Fluoreszenzgruppierung gewählt werden, die einen hohen
Extinktionskoeffizienten, eine hohe Quantenausbeute, eine gute Über lappung
ihrer Exzitation mit der Emission der Donor-Fluoreszenzgruppierung sowie eine Emission
im roten Teil des sichtbaren Spektrums (> 600 nm) aufweist.
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Zu
repräsentativen
Donor-Fluoreszenzgruppierungen, die sich mit verschiedenen Akzeptor-Fluoreszenzgruppierungen
bei der FRET-Technologie verwenden lassen, gehören Fluorescein, Lucifer Yellow,
B-Phycoerythrin, 9-Acridinisothiocyanat,
Lucifer Yellow VS, 4-Acetamido-4'-isothiocyanatostilben-2,2'-disulfonsäure, 7-Diethylamino-3-(4'-isothiocyanatophenyl)-4-methylcoumarin,
1-Pyrenbuttersäuresuccinimidylester
und 4-Acetamido-4'-isothiocyanatostilben-2,2'-disulfonsäurederivate.
Zu repräsentativen
Akzeptor-Fluoreszenzgruppierungen gehören je nach der verwendeten
Donor-Fluoreszenzgruppierung LCTM-Red 640,
LCTM-Red 705, Cy5, Cy5.5, Lissaminrhodamin-B-sulfonylchlorid,
Tetramethylrhodaminisothiocyanat, Rhodamin x Isothiocyanat, Erythrosinisothiocyanat,
Fluorescein, Diethylentriaminpentaacetat oder andere Chelate von
Lanthanidenionen (z. B. Europium oder Terbium). Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzgruppierungen
können
beispielsweise von den Firmen Molecular Probes (Junction City, OR,
USA) bzw. Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) bezogen werden.
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Die
Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzgruppierungen lassen sich über einen
Linker-Arm an das entsprechende Sondenoligonukleotid binden. Dabei
ist die Länge
eines jeden Linker-Arms von Bedeutung, da die Linker-Arme den Abstand
zwischen den Donor- und den Akzeptor-Fluoreszenzgruppierungen beeinflussen. Dabei
handelt es sich bei der Länge
eines Linker-Arms in Sinne der vorliegenden Erfindung um den Abstand in
Angström
(Å) von
der Nukleotidbase zur Fluoreszenzgruppierung. Im allgemeinen weist
ein Linker-Arm eine Länge
von etwa 10 bis etwa 25 Å auf.
Der Linker-Arm kann von der in der WO 84/03285 beschriebenen Art sein.
Aus der WO 84/03285 sind ebenso Verfahren zur Bindung von Linker-Armen
an eine bestimmte Nukleotidbase und ebenso zur Bindung von Fluoreszenzgruppierungen
an einen Linker-Arm bekannt.
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Eine
Akzeptor-Fluoreszenzgruppierung, wie z. B. ein LCTM-Red
640-NHS-Ester, läßt sich
mit C6-Phosphoramiditen (erhältlich
von ABI (Foster City, CA, USA) oder Glen Research (Sterling, VA,
USA)) unter Erhalt von beispielsweise LCTM-Red
640-Phosphoramidit kombinieren. Zu häufig verwendeten Linkern zur
Kupplung einer Donor-Fluoreszenzgruppierung, wie z. B. Fluorescein
an ein Oligonukleotid gehören
Thioharnstoff-Linker (FITC-derivatisiert,
z. B. Fluorescein-CPGs von Glen Research oder ChemGene (Ashland,
MA, USA)), Amid-Linker (Fluorescein-NHS-ester-derivatisiert, wie
z. B. Fluorescein-CPG von BioGenex (San Ramon, CA, USA)) oder 3'-Amino-CPGs, die Kupplung eines Fluorescein-NHS-Esters
nach der Oligonukleotidsynthese erfordern.
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Nachweis von Variolavirus
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Zum
Nachweis von Variolavirus wurden herkömmliche PCR-Verfahren verwendet. Dabei schließt sich an
die herkömmliche
Amplifikation auf PCR-Basis im allgemeinen die Übertragung der Amplifikationsprodukte auf
einen festen Träger
sowie ein Nachweis unter Verwendung einer markierten Sonde an (z.
B. ein Southern oder Northern-Blot).
Diese Verfahren sind arbeitsintensiv und benötigen zur vollständigen Durchführung häufig mehr
als einen Tag. Darüber
hinaus erhöht
die Manipulation von Amplifikationsprodukten für Nachweiszwecke (z. B. durch
Blotting) die Gefahr eines Mitschleppens von Kontamination und Falsch-Positiven.
Durch Verwendung von kommerziell erhältlichen Echtzeit-PCR-Geräten (z.
B. LightCyclerTM, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis,
IN, USA), können
die PCR-Amplifikation sowie der Nachweis des Amplifikationsprodukts
in einer einzigen geschlossenen Küvette bei einer dramatisch
reduzierten Zykluszeit kombiniert werden. Da der Nachweis gleichzeitig
mit der Amplifikation erfolgt, machen die Echtzeit-PCR-Verfahren
die Manipulation des Ampli fikationsprodukts überflüssig und vermindern damit das
Risiko einer Kreuzkontamination zwischen Amplifikationsprodukten.
Die Echtzeit-PCR verkürzt
die Bearbeitungszeit stark und stellt eine attraktive Alternative
zu herkömmlichen
PCR-Techniken im klinischen Labor dar.
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Durch
die vorliegende Erfindung werden Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins
bzw. der Abwesenheit von Variolavirus in einer biologischen Probe
aus einem Individuum bereitgestellt. Mit den durch die Erfindung
bereitgestellten Verfahren werden Probleme mit Probenkontamination,
Falsch-Negativen und Falsch-Positiven vermieden. Die Verfahren beinhalten
die Durchführung
von wenigstens einem Zyklusschritt, bei dem man eine Probe mit einem
Paar HA-Primer in Kontakt bringt. Bei Vorhandensein eines HA-Nukleinsäuremoleküls aus Variolavirus
in der biologischen Probe wird ein HA-Amplifikationsprodukt erzeugt.
Die HA-Primer binden in einer Annealing-Reaktion jeweils an ein
Ziel in oder unmittelbar neben einem Variolavirus-HA-Nukleinsäuremolekül, sodaß wenigstens
ein Anteil des Amplifikationsprodukts HA entsprechende Nukleinsäuresequenz
enthält
und, was wichtiger ist, sodaß das
Amplifikationsprodukt die Nukleinsäuresequenzen enthält, die
zu den HA-Sonden komplementär
sind. Dabei wird das HA-Amplifikationsprodukt erzeugt, vorausgesetzt,
daß die
Variolavirus-Nukleinsäure vorhanden
ist. Jeder weitere Zyklusschritt beinhaltet das In-Kontakt-Bringen
der Probe mit einem Paar HA-Sonden. Erfindungsgemäß ist dabei
eine der HA-Sonden
mit einer Donor-Fluoreszenzgruppierung und die andere mit einer
entsprechenden Akzeptor-Fluoreszenzgruppierung markiert. Das Vorhandensein
bzw. die Abwesenheit eines FRET zwischen der Donor-Fluoreszenzgruppierung
der ersten HA-Sonde und der entsprechenden Akzeptor-Fluoreszenzgruppierung
der zweiten HA-Sonde wird nachgewiesen.
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Jeder
Zyklusschritt beinhaltet einen Amplifikationsschritt und einen Hybridisierungsschritt,
und auf jeden Zyklusschritt folgt üblicherweise ein FRET-Nachweisschritt.
Es werden mehrere Zyklusschritte durchgeführt, vorzugsweise in einem
Thermocycler. Die oben beschriebenen Verfahren zum Nachweis von
Variolavirus in einer biologischen Probe unter Verwendung von auf
HA gerichteten Primern und Sonden können auch unter Verwendung
von anderen Variolavirus-genspezifischen Primern und Sonden, TK-spezifischen
Primern und TK-spezifischen Sonden, durchgeführt werden.
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"Amplifizieren", wie hier verwendet,
bezieht sich auf den Vorgang der Synthese von Nukleinsäuremolekülen, die
zu einem oder beiden Strängen
eines Matrizen-Nukleinsäuremoleküls (z. B.
Variolavirus-HA- oder -TK-Nukleinsäuremolekülen) komplementär sind.
Das Amplifizieren eines Nukleinsäuremoleküls beinhaltet dabei
typischerweise die Denaturierung der Matrizennukleinsäure, das
Annealing von Primern an die Matrizennukleinsäure bei einer Temperatur, die
unterhalb der Schmelztemperatur der Primer liegt sowie das enzymatische
Verlängern
von den Primern aus, sodaß ein
Amplifikationsprodukt erzeugt wird. Die Amplifikation erfordert
typischerweise das Vorhandensein von Desoxyribonukleosidtriphosphaten,
eines DNA-Polymeraseenzyms (z. B. PlatinumTM Taq)
sowie eines entsprechenden Puffers und/oder Cofaktors für die optimale
Aktivität des
Polymeraseenzyms (z. B. MgCl2 und/oder KCl).
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Findet
die Amplifikation von Variolavirus-Nukleinsäure statt und wird ein Amplifikationsprodukt
erzeugt, so führt
der Hybridisierungsschritt zu einem nachweisbaren Signal auf der
Grundlage eines FRET zwischen den Mitgliedern des Sondenpaars. "Hybridisierung", wie hier verwendet,
bezieht sich auf das Annealing der Sonden an ein Amplifikationsprodukt.
Zu den Hybridisierungsbedingungen zählt typischerweise eine Temperatur,
die unterhalb der Schmelztemperatur der Sonden liegt, bei der jedoch
die nichtspezifische Hybridisierung der Sonden vermieden wird.
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Im
allgemeinen zeigt das Vorhandensein eines FRET das Vorhandensein
von Variolavirus in der biologischen Probe und die Abwesenheit eines
FRET die Abwesenheit von Variolavirus in der biologischen Probe an.
Dabei handelt es sich bei einer unzureichenden Präparatensammlung,
Transportverzögerungen,
unzureichenden Transportbedingungen oder der Verwendung bestimmter
Sammelabstriche (Calciumalginat oder Aluminiumschaft) jedoch allesamt
um Bedingungen, die den Erfolg und/oder die Genauigkeit eines Testergebnisses
beeinflussen können.
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Unter
Verwendung der hier offenbarten Verfahren zeigt der Nachweis eines
FRET innerhalb von 30 Zyklusschritten eine Variolavirusinfektion
an. Proben, bei denen ein FRET nach mehr als 30 Zyklusschritten nachgewiesen
wird, zeigen ebenso eine Variolavirusinfektion an, doch können, falls
gewünscht,
hinsichtlich einer Variolavirusinfektion beurteilt werden, wobei
ein erfindungsgemäßen Verfahren
mit einem anderen Genziel oder ein anderer Test als die hier beschriebene
Echtzeit-PCR verwendet wird. Die Zyklusnummer, bei der FRET nachweisbar
ist, kann mit der Menge an Variolavirus in einer biologischen Probe
und somit in dem Individuum korreliert werden (z. B. Viruslast).
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Erfindungsgemäße Verfahren
lassen sich auch für
Variolavirus-Impfstoff-Wirksamkeitsuntersuchungen oder -Epidemiologieuntersuchungen
verwenden. So läßt sich
beispielsweise ein abgeschwächtes
Variolavirus in einem Variolaimpfstoff unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren
während
der Zeit, in der das Virus noch in einem Individuum vorliegt, nachweisen.
Für derartige
Impfstoffwirksamkeitsuntersuchungen können die erfindungsgemäßen Verfahren
dazu verwendet werden, um beispielsweise die Replikationsfähigkeit
oder das Fortbestehen eines in einem Impfstoff verwendeten abgeschwächten Virus
zu bestimmen, oder können
in Verbindung mit einem zusätzlichen
Test, wie beispielsweise einem serologischen Test, zur Überwachung
einer Immunantwort eines Individuums auf einen solchen Impfstoff
durchgeführt
werden. Darüber
hinaus können
erfindungsgemäße Verfahren
dazu verwendet werden, einen Variolavirusstamm von einem anderen
Stamm zu unterscheiden, beispielsweise für Epidemiologieuntersuchungen
des Ursprungs oder der Schwere eines Ausbruchs von Variola (Pocken).
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Zu
repräsentativen
biologischen Proben, die bei der Praktizierung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet
werden können,
gehören
Hautabstriche, Liquor, Gangliongewebe, Hirngewebe, Augenflüssigkeit, Blut,
Speichel, bronchioalveoläre
Lavage, Bronchialaspirate, Lungengewebe und Urin. Verfahren zum
Sammeln und zur Lagerung von biologischen Proben sind dem Fachmann
bekannt. Biologische Proben lassen sich bearbeiten (z. B. mit im
Fachgebiet bekannten Nukleinsäureextraktionsverfahren
und/oder -kits), um Variolavirus-Nukleinsäure freizusetzen, oder die
biologische Probe wird in einigen Fällen direkt mit den PCR-Reaktionskomponenten
und den entsprechenden Oligonukleotiden in Kontakt gebracht.
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Bei
der Schmelzkurvenanalyse handelt es sich um einen zusätzlichen
Schritt, der in einem Zyklusverlauf enthalten sein kann. Die Schmelzkurvenanalyse
beruht auf der Tatsache, daß DNA
bei einer charakteristischen Temperatur mit der Bezeichnung Schmelztemperatur
(Tm), die als diejenige Temperatur definiert ist, bei der die Hälfte der
DNA-Duplexe in Einzelstränge
getrennt worden ist, schmilzt. Die Schmelztemperatur einer DNA hängt dabei
vorwiegend von ihrer Nukleotidzusammensetzung ab. Somit weisen DNA-Moleküle, die reich
an den Nukleotiden G und C sind, eine höhere Tm als solche mit einer
großen
Anzahl an A- und T-Nukleotiden auf. Die Schmelztemperatur von Sonden
läßt sich
bestimmen, indem die Temperatur, bei der das Signal verloren geht,
nachgewiesen wird. Auf ähnliche
Weise läßt sich
die Annealing-Temperatur von Sonden bestimmen, indem die Temperatur,
bei der das Signal erzeugt wird, nachgewiesen wird. Das Vorhandensein bzw.
die Abwesenheit von Variolavirus in der Probe läßt sich über die Schmelztemperatur(en)
der HA- bzw. TK-Sonden vom jeweiligen Amplifikationsprodukt bestätigen.
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Bei
jedem Thermocycler-Lauf durchlaufen die Kontrollproben ebenfalls
Zyklen. Dabei können
positive Kontrollproben Variolavirus-Nukleinsäure-Kontrollmatrize (von HA
oder TK verschieden) beispielsweise unter Verwendung von Kontrollprimern
und Kontrollsonden amplifizieren. Positive Kontrollproben können beispielsweise
auch ein Plasmidkonstrukt, das ein Variolavirus-HA- bzw. -TK-Nukleinsäuremolekül enthält, amplifizieren.
Eine solche Plasmidkontrolle läßt sich
intern (z. B. innerhalb der biologischen Probe) oder in einer getrennten
Probe, die Seite an Seite mit den Patientenproben gefahren wird,
amplifizieren. Dabei sollte jeder Thermocycler-Lauf auch eine negative
Kontrolle enthalten, der beispielsweise Variolavirus-Matrizen-DNA fehlt.
Solche Kontrollen sind Indikatoren für den Erfolg oder den Mißerfolg
der Amplifikation, Hybridisierung und/oder FRET-Reaktion. Daher
kann über
Kontrollreaktionen leicht beispielsweise die Fähigkeit von Primern, eine Annealing-Reaktion
mit Sequenzspezifität
einzugehen und die Elongation zu starten, ebenso wie die Fähigkeit von
Sonden, mit Sequenzspezifität
zu hybridisieren und einen FRET stattfinden zu lassen, bestimmt
werden.
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In
einer Ausführungsform
beinhalten die erfindungsgemäßen Verfahren
Schritte zur Vermeidung von Kontamination. So ist beispielsweise
ein enzymatisches Verfahren unter Nutzung von Uracil-DNA-Glykosylase zur
Reduzierung oder Eliminierung der Kontamination zwischen einem Thermcycler-Lauf
und dem nächsten in
den US-Patenten Nr. 5,035,996, 5,683,896 und 5,945,313 beschrieben.
Darüber
hinaus sind bei der Durchführung von
erfindungsgemäßen Verfahren
Standard-Laborpraktiken und -maßnahmen
zum Containment wünschenswert.
Zu den Containment-Praktiken und -maßnahmen gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, getrennte
Arbeitsbereiche für
unterschiedliche Schritte eines Verfahrens, Containment-Abzüge, Schrankenfilter-Kettenspitzen
sowie spezielle Luftverdrängungspipetten.
Containment-Praktiken und -maßnahmen
des Personals auf gleichbleibendem Niveau sind für die Genauigkeit bei der Handhabung
klinischer Proben in einem diagnostischen Labor notwendig.
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Herkömmliche
PCR-Verfahren lassen sich in Verbindung mit der FRET-Technologie
zur Praktizierung der erfindungsgemäßen Verfahren verwenden. In
einer Ausführungsform
wird dabei ein LightCyclerTM-Instrument
verwendet. Eine ausführliche
Beschreibung des LightCyclerTM-Instruments
sowie der Überwachung
einer PCR in Echtzeit und on-line findet sich unter http://biochem.roche.com/lightcycler.
In den folgenden Patentanmeldungen wird die Echtzeit-PCR beschrieben,
wie sie bei der LightCyclerTM-Technologie
verwendet wird: WO 97/46707, WO 97/46714 und WO 97/46712. Bei dem
LightCyclerTM-Instrument handelt es sich
um einen schnellen thermischen Cycler, der mit einem Mikrovolumen-Fluorometer
unter Nutzung qualitativ hochwertiger Optik kombiniert ist. Bei
dieser schnellen Thermozyklus-Technik werden dünne Glasküvetten als Reaktionsgefäße verwendet.
Das Aufheizen beziehungsweise Abkühlen der Reaktionskammer wird
durch einen Wechsel zwischen aufgeheizter und Umgebungsluft gesteuert.
Aufgrund der geringen Masse von Luft und des hohen Verhältnisses
der Oberfläche
zum Volumen der Küvetten
lassen sich in der LightCyclerTM-Temperaturkammer sehr
schelle Temperaturaustauschgeschwindigkeiten erzielen. Das Hinzufügen ausgewählter Fluoreszenzfarbstoffe
zu den Reaktionskomponenten gestattet die Überwachung der PCR in Echtzeit
und on-line. Weiterhin dienen die Küvetten als opti sches Element
für die
Signalsammlung (ähnlich
der Glasfaseroptik), wobei das Signal an der Spitze der Küvette konzentriert
wird. Dies führt
zu einer effizienten Bestrahlung und Fluoreszenzüberwachung von Mikrovolumenproben.
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Das
LightCyclerTM-Karussell, in dem sich die
Küvetten
befinden, kann aus dem Instrument entfernt werden. Daher können Proben
außerhalb
des Instruments (beispielsweise in einem PCR-Cleanroom) geladen werden.
Darüber
hinaus gestattet dieses Merkmal eine leichte Reinigung und Sterilisation
des Probenkarussells. Die Lichtquelle ist im Fluorometer als Teil
des Light-CyclerTM-Geräts
untergebracht. Das emittierte Licht wird gefiltert und von einer
Epiilluminationslinse auf das obere Ende der Küvette fokussiert. Anschließend wird von
der Probe emittiertes Fluoreszenzlicht von der gleichen Linse fokussiert,
durch einen dichroitischen Spiegel geleitet, entsprechend gefiltert
und auf datensammelnde Photohybride fokussiert. Die zur Zeit im
LightCyclerTM-Instrument verfügbare optische
Einheit (Roche Molecular Biochemicals, Katalog Nr. 2 011 468) beinhaltet
drei Bandpaßfilter
(530 nm, 640 nm und 710 nm), wodurch ein dreifarbiger Nachweis und
mehrere Fluoreszenzaufnahmeoptionen bereitgestellt werden. Zu den
Datensammeloptionen gehören
das Überwachen
jeweils einmal pro Zyklusschritt, die vollkontinuierliche Einzelprobenaufnahme
zur Schmelzkurvenanalyse, kontinuierliche Probennahme (bei der die
Probennahmefrequenz von der Probennummer abhängt) und/oder stufenweise Messung
aller Proben nach einem definierten Temperaturintervall.
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Der
LightCyclerTM kann mit einer PC-Workstation
betrieben werden und kann ein Windows NT-Betriebssystem nutzen.
Signale von den Proben werden erhalten, wenn die Maschine die Kapillaren
nacheinander über
die optische Einheit positioniert. Die Software kann die Fluoreszenzsignale
unmittelbar nach jeder Messung in Echtzeit darstellen. Die Fluoreszenzaufnahmezeit
beträgt
10–100
Millisekunden (ms). Nach jedem Zyklusschritt läßt sich eine quantitative Darstellung
von Fluoreszenz gegen Zyklusnummer für alle Proben kontinuierlich
aktualisieren. Die erzeugten Daten können zur weiteren Analyse gespeichert
werden.
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Als
Alternative zum FRET kann ein Amplifikationsprodukt unter Verwendung
eines Doppelstrang-DNA-bindenden Farbstoffs, wie z. B. eines fluoreszierenden
DNA-bindenden Farbstoffs (z. B. SYBRGreenITM oder
SYBRGoldTM (Molecular Probes)) nachweisen.
Nach der Wechselwirkung mit der doppelsträngigen Nukleinsäure emittieren
derartige fluoreszierende DNA-bindende Farbstoffe ein Fluoreszenzsignal nach
der Anregung mit Licht bei einer geeigneten Wellenlänge. Ebenso
läßt sich
ein Doppelstrang-bindender Farbstoff, wie etwa ein nukleinsäureinterkalierender
Farbstoff, verwenden. Bei der Verwendung Doppelstrang-DNA-bindender
Farbstoffe wird üblicherweise
zur Bestätigung
des Vorhandenseins des Amplifikationsprodukts eine Schmelzkurvenanalyse
durchgeführt.
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Wie
hier beschrieben, lassen sich Amplifikationsprodukte unter Verwendung
markierter Hybridisierungssonden, die die FRET-Technologie ausnutzen,
nachweisen. Bei einem gängigen
Format der FRET-Technologie werden zwei Hybridisierungssonden benutzt.
Dabei kann jede Sonde mit einer unterschiedlichen Fluoreszenzgruppierung
markiert werden und wird allgemein so konstruiert, daß die Sonden
in enger Nachbarschaft zueinander in einem DNA-Zielmolekül (z. B. einem Amplifikationsprodukt)
hybridisieren. Eine Donor-Fluoreszenzgruppierung, beispielsweise
Fluorescein wird bei 470 nm von der Lichtquelle des LightCyclerTM-Instruments angeregt. Während des
FRET überträgt das Fluorescein
seine Energie auf eine Akzeptor-Fluoreszenzgruppierung, wie z. B.
LightCyclerTM-Red 640 (LCTM-Red
640) oder LightCyclerTM-Red 705 (LCTM-Red 705). Anschließend emittiert die Akzeptor-Fluoreszenz gruppierung
Licht einer längeren
Wellenlänge,
das mit dem optischen Nachweissystem des LightCyclerTM-Instruments
nachgewiesen wird. Ein effizienter FRET kann nur dann stattfinden,
wenn sich die Fluoreszenzgruppierungen in unmittelbarer lokaler
Nähe befinden
und wenn das Emissionsspektrum der Donor-Fluoreszenzgruppierung
mit dem Absorptionsspektrum der Akzeptor-Fluoreszenzgruppierung überlappt.
Die Intensität
des emittierten Signals kann mit der Anzahl der ursprünglichen
DNA-Zielmoleküle (z. B.
der Anzahl an Viruspartikeln) korreliert werden.
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Ein
weiteres FRET-Format nutzt die TaqManTM-Technologie
zum Nachweis des Vorhandenseins bzw. der Abwesenheit eines Amplifikationsprodukts
und somit des Vorhandenseins bzw. der Abwesenheit von Variolavirus.
Die TaqManTM-Technologie benutzt eine Einzelstrang-Hybridisierungssonde,
die mit zwei Fluoreszenzgruppierungen markiert ist. Wird die erste
Fluoreszenzgruppierung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge angeregt,
so wird die absorbierte Energie auf die zweite Fluoreszenzgruppierung
gemäß den FRET-Prinzipien übertragen.
Bei der zweiten Fluoreszenzgruppierung handelt es sich im allgemeinen
um ein Quencher-Molekül.
Während
des Annealing-Schritts der PCR-Reaktion bindet die markierte Hybridisierungssonde an
die Ziel-DNA (d. h. das Amplifikationsprodukt) und wird von der
5'→3'-Exonukleaseaktivität einer Polymerase (z. B. Taq-Polymerase®)
während
der nachfolgenden Elongationsphase abgebaut.
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Als
Ergebnis des Abbaus werden die angeregte Fluoreszenzgruppierung
und die Quencher-Gruppierung räumlich
voneinander getrennt. Als Folge davon läßt sich bei Anregung der ersten
Fluoreszenzgruppierung in Abwesenheit des Quenchers eine Fluoreszenzemission
von der ersten Fluoreszenzgruppierung nachweisen. Die TagMan®-Technologie
wird beispielsweise im ABI PRISM® 7700
Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA,
USA) eingesetzt, wobei sich dieses System zur Durchführung der
hier beschriebenen Verfahren zum Nachweis von Variolavirus eignet.
Informationen über
die PCR-Amplifikation und den Nachweis mit dem ABI PRISM®-System
finden sich unter http://www.appliedbiosystems.com/products.
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Ebenso
können
zum Nachweis des Vorhandenseins eines Amplifikationsprodukts unter
Verwendung der erfindungsgemäßen Echtzeit-PCR-Verfahren "molecular beacons" [etwa: molekulare
Leuchtfeuer] in Verbindung mit FRET verwendet werden. Bei der Molecular-Beacon-Technologie wird
eine mit einer ersten Fluoreszenzgruppierung und einer zweiten Fluoreszenzgruppierung
markierte einzelne Hybridisierungssonde verwendet. Bei der zweiten
Fluoreszenzgruppierung handelt es sich im allgemeinen um einen Quencher,
und die Fluoreszenzmarkierungen sind typischerweise jeweils an den
Enden der Sonde lokalisiert. Die Molecular-Beacon-Technologie verwendet
ein Sondenoligonukleotid mit Sequenzen, die die Ausbildung einer
Sekundärstruktur
(z.B. einer Haarnadel) gestatten. Als Ergebnis der Ausbildung der
Sekundärstruktur
in der Sonde sind beide Fluoreszenzgruppierungen in räumlicher
Nähe zueinander,
wenn sich die Sonde in Lösung
befindet. Nach Hybridisierung an das gewünschte Amplifikationsprodukt
bzw. die gewünschten
Amplifikationsprodukte wird die Sekundärstruktur der Sonde zerstört, und
die Fluoreszenzgruppierungen werden voneinander getrennt, so daß nach der
Anregung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge die Emission der ersten
Fluoreszenzgruppierung nachgewiesen werden kann.
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Es
versteht sich, daß die
vorliegende Erfindung nicht durch die Konfiguration eines oder mehrerer
im Handel erhältlicher
Instrumente beschränkt
ist.
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Hergestellte Artikel
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Ein
hergestellter Artikel kann zum Nachweis von Variolavirus verwendete
Primer und Sonden zusammen mit geeigneten Verpackungsmaterialien
beinhalten. Repräsentative
Primer und Sonden zum Nachweis von Variolavirus sind in der Lage,
an Variolavirus-HA- oder -TK-Nukleinsäuremoleküle zu hybridisieren.
Es werden hier Verfahren zur Konstruktion von Primern und Sonden
offenbart und repräsentative
Beispiel für
Primer und Sonden, die Variolavirus-HA- oder -TK-Nukleinsäuremoleküle amplifizieren
und daran hybridisieren, bereitgestellt.
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Hergestellte
Artikel können
auch eine oder mehrere Fluoreszenzgruppierungen zur Markierung der Sonden
beinhalten, oder als Alternative können die mit dem Kit gelieferten
Sonden markiert sein. So kann beispielsweise ein hergestellter Artikel
eine Donor-Fluoreszenzgruppierung
zur Markierung einer der HA- oder TK-Sonden
sowie eine Akzeptor-Fluoreszenzgruppierung zur Markierung der anderen
HA- bzw. TK-Sonde
beinhalten. Beispiele für
geeignete FRET-Donor-Fluoreszenzgruppierungen
und entsprechende Akzeptor-Fluoreszenzgruppierungen
sind oben angegeben.
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Hergestellte
Artikel können
auch einen Beipackzettel oder eine Verpackungsaufschrift mit darauf
befindlichen Anweisungen zur Verwendung der HA-Primer und -Sonden
bzw. TK-Primer und -Sonden zum Nachweis von Variolavirus in einer
biologischen Probe enthalten. Darüber hinaus können hergestellte
Artikel Reagentien zur Durchführung
der hier offenbarten Verfahren beinhalten (z.B. Puffer, Polymeraseenzyme,
Cofaktoren oder Agenzien zur Verhinderung von Kontamination). Dabei
können
derartige Reagenzien für
eines der hier beschriebenen im Handel erhältlichen Instrumente spezifisch
sein.
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Die
Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter beschrieben, wobei
diese keine Beschränkung des
in den Ansprüchen
beschriebenen Umfangs der Erfindung darstellen.
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BEISPIELE
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Beispiel 1 – Präparate und
Nukleinsäureextraktionen
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Zur
Verwendung in Echtzeit-PCR-Tests wurde Nukleinsäure aus HSV-1; HSV-2; VZV und
Vaccinia (IsoQuick, Orca Research, Inc., Bothell, WA, USA) extrahiert.
Ebenso wurde in Echtzeit-PCR-Tests ein intaktes Plasmid (CDC-HA1) mit einem Anteil
des HA-Gens aus Variolavirus (ungefähr Nukleotide 15.000–15.300
der GenBank Accession No. X65516 und NC 001611) verwendet.
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Die
Probe und ein gleiches Volumen an Lysepuffer wurden in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben.
Dazu wurden 700 μl
Extraktionsmatrix sowie 400 μl
Extraktionspuffer gegeben, und das Röhrchen wurde 5 min bei 13.000
UpM zentrifugiert. Die obere wäßrige Schicht
wurde in ein frisches Röhrchen
gegeben und mit 1/10 Volumen Natriumacetat, 2 μl Glykogen und einem gleichen
Volumen an Isopropylalkohol versetzt. Anschließend wurde das Röhrchen 10
min bei 13.000 UpM zentrifugiert. Der Alkohol wurde abgegossen,
und es wurde mit 2 Volumen 70% Ethanol versetzt; anschließend wurde
das Röhrchen
5 min bei 13.000 UpM zentrifugiert. Der Ethanol wurde aus dem Röhrchen abgesaugt
und das Pellet in 100 μl
RNase-freiem Wasser resuspendiert.
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Beispiel 2 – LightCyclerTM-PCR
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Mit
dem LightCyclerTM-Instrument können Zielnukleinsäuren innerhalb
von etwa 30–40
min amplifiziert und die Entwicklung von PCR-Produkt über einen
Fluoreszenztest nach jedem Cyclusschritt (Amplifikation und Hybridisierung)
verfolgt werden. Dabei werden alle Proben durch LightCyclerTM-PCR mit auf sowohl Hämagglutinin (HA) als auch Thymidinkinase
(TK) gerichteten Primern amplifiziert. Ein erster Satz von Primern
und Sonden wird auf einen ersten Anteil des HA-Gens (HA1) von Vacciniavirus gerichtet,
während
ein zweiter Satz von Primern und Sonden auf einen zweiten Anteil
des HA-Gens (HA2) von Vacciniavirus gerichtet wird. Die Nukleotidsequenz
von Vacciniavirus-HA ist homolog zu HA aus dem Pockenvirus. Ein
dritter Satz von Primern und Sonden wird auf das TK-Gen von Vacciniavirus
gerichtet. Die Nukleotidsequenzen von Vacciniavirus-TK sind homolog
zu TK aus dem Pockenvirus mit Ausnahme von zwei Basenpaaren. Pockenvirus
kann von Vacciniavirus auf der Grundlage der Schmelzkurve der Sonden
von dem jeweiligen Amplifikationsprodukt unterschieden werden.
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Auf
HA gerichtete PCR-Primer zum Nachweis von Variolavirus-DNA wurden
unter Verwendung des Programms OLIGO konstruiert. Dabei wiesen die
auf einen ersten Anteil von HA (HA1) gerichteten Primer und Sonden
die folgenden Sequenzen auf: Sense; 5'-CTA ATA TCA TTA GTA TAC GCT ACA C-3' (SEQ ID NO:1); Antisense,
5'-GAG TCG TAA GAT
ATT TTA TCC-3' (SEQ
ID NO: 2); und Sonden 5'-AAT
GAT TAT GTT GTT ATG AGT GCT TG-Fluorescein-3' (SEQ ID NO: 3) und 5'-Red 640-TAT AAG
GAG CCC AAT TCC ATT ATT CT-phosphat-3' (SEQ ID NO: 4).
Durch die Amplifikation von Variolavirus-DNA unter Verwendung von
HA1-Primern wurde ein 204 Bp großes Amplifikationsprodukt erzeugt.
Die auf einem zweiten Anteil von HA (HA2) gerichteten Primer und
Sonden wiesen die folgenden Sequenzen auf: Sense; 5'-ATA GTG AAT CGA
CTA TAG ACA TAA TA-3' (SEQ
ID NO: 5); Antisense, 5'-TTG
ATT TAG TAG TGA CAA TTC C-3' (SEQ
ID NO: 6); und Sonden 5'-CTG
TCA CAT ACA CTA GTG ATA TCA TT-Fluorescein-3'(SEQ ID NO: 7); und 5'-Red 640-ATA CAG
TAA GTA CAT CAT CTG GAG AA-phosphat-3' (SEQ ID NO: 8). Durch die Amplifikation
von Variolavirus-DNA unter Verwendung von HA2-Primern wurde ein
326 Bp großes
Amplifikationsprodukt erzeugt.
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Primer
und Sonden zum Nachweis von Variolavirus-DNA unter Verwendung von
TK wurden mit der OLIGO-Software (Molecular Biology Insights, Inc.,
Cascade, CO, USA) konstruiert und wiesen die folgenden Sequenzen
auf: Sense; 5'-AAG
GAC AGT TCT TTC CAG-3' (SEQ
ID NO: 9); Antisense, 5'-TGA
TAC ATA TCA TTA CCT CCT A-3' (SEQ
ID NO: 10); und Sonden 5'-CCG TTT AAT AAT ATC
TTG GAT CTT-Fluorescein-3'(SEQ
ID NO: 11); und 5'-Red
640-TTC CAT TAT CTG AAA TGG TGG T-phosphat-3' (SEQ ID NO: 12).
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Als
Alternative wurden TK-Sonden mit den folgenden Sequenzen zum Nachweis
des TK-Amplifikationsprodukts verwendet: 5'-GAC ATT TCA ACG TAA ACC GTT TAA-Fluorescein-3' (SEQ ID NO: 13)
und 5'-Red 640-AAT
ATC TTG GAT CTT ATT CCA TTA TCT G-phosphat-3' (SEQ ID NO: 14). Die Amplifikation
von Variolavirus-DNA unter Verwendung solcher TK-Primer ergab ein
Amplifikationsprodukt von 250 Bp.
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Jeder
Satz von Hybridisierungssonden (d.h. HA- und die TK-Sonden) enthielt
jeweils einen Donor-Fluorphor (Fluorescein) am 3'-Ende einer Sonde, der bei einer Anregung
durch eine externe Lichtquelle Licht emittierte, das von einem entsprechenden
Akzeptor-Fluorphor
(LC-Red 640) am 5'-Ende
der zweiten Hybridisierungssonde absorbiert wurde.
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Für den Echtzeit-PCR-Test
wurden jeweils 5 μl
Nukleinsäureprobe
zu jeweils 15 μl
eines PCR Master Mix in jede Reaktionskapillare gegeben. Eine Kontrolle
ohne Matrize erhält
15 μl Reaktionsgemisch
mit 5 μl Wasser.
Der PCR Master Mix ist für
den LightCyclerTM optimiert und enthält das folgende:
0,2 mM Desoxyribonukleosidtriphosphate (50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl
(pH 8,3)), 4 mM MgCl2, 0,7 μM Primer,
0,025% Rinderserumalbumin (BSA), 0,2 μM Fluorescein-Sonde, 0,4 μM LC-Red
640-Sonde, 2% DMSO, 0,2% Uracil-DNA-Glycosylase sowie 0,03 Einheiten/ml
Platin-Taq (Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ, USA). Die PCR-Reagenzien
sowie der Präparatextrakt
werden zur Erleichterung des Mischens in der Kapillare zentrifugiert.
Anschließend
werden alle Kapillaren verschlossen und in das LightCycler-Gerät gestellt.
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Die
Proben werden zunächst
etwa 5 min in Gegenwart von Uracil-DNA-Glycosylase bei etwa 37°C behandelt.
Anschließend
wird die Uracil-DNA-Glycosylase durch etwa 3 minütiges Erhitzen der Proben bei
etwa 95°C
inaktiviert, wonach die Proben 45 Cyclen aus: 10 s Denaturierung
bei 95°C
mit anschließendem
15 s dauernden Primer-Annealing an die Matrizennukleinsäure bei
etwa 55°C
(während
dieser Zeit werden Signaldaten gesammelt) und etwa 15 s Elongation
des neu synthetisierten Strangs bei etwa 72°C, durchlaufen. Anschließend wird
die Schmelzkurve durch Erhitzen auf etwa 95°C und unmittelbar danach etwa
1 min bei etwa 45°C bestimmt.
Anschließend
wird die Temperatur auf etwa 78°C
bei einer Rate von etwa 0,2°C
pro Sekunde erhöht (während dieser
Zeit werden Signaldaten gesammelt). Die Probe wird dann etwa 30
s bei etwa 40°C
gehalten.
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Beispiel 3 – Autoklavierte
Proben
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Gegenwärtige Tests
auf Variola (z.B. Zellkulturen oder morphologische Erkennung mittels
Elektronenmikroskopie) erfordern Biosafety Level-4-(BS-4)-Einrichtungen.
Eine Autoklavierung der biologischen Proben vor der Analyse würde die
Durchführung
von Variolatests mit BS-2-Einrichtungen
gestatten. Nukleinsäuren
von mit Variola verwandten Viren (z.B. HSV und Vaccinia) wurden
untersucht, um die Viabilität
der viralen Nukleinsäure
für die
PCR-Amplifikation nach dem Autoklavieren (z.B. 121°C; 15 min;
20 psi) zu bestätigen.
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Scheinpräparate wurden
mit Vacciniavirus (VV), HSV oder VZV beimpft. Insgesamt 30 Culturetten-Abstriche
wurden mit fünf
10fach-Verdünnungen
jeder Virussuspension (VV, HSV, VZV) beimpft. Die Culturetten wurden
in Glasfläschchen
gegeben und mit Schraubdeckeln verschlossen. 15 der Proben wurden
autoklaviert; die anderen 15 wurden bei Raumtemperatur gehalten.
Anschließend
wurden alle Culturetten in 2 ml serumfreies Medium gegeben. Nukleinsäureextrakte
von allen Präparaten
(200 c cl) wurden
mit einer für
jedes Virusziel spezifischen LightCycler-PCR getestet. In ähnlicher
Weise wurden MRC-5-Röhrchenzellkulturen
mit allen Präparaten
(200 c cl) beimpft,
bei 36°C
inkubiert und täglich
für 5 (W,
HSV) bzw. 10 (VZV) Tage auf das Vorhandensein charakteristischer
cytopathischer Effekte untersucht. Die PCR-Bedingungen zum Nachweis
von VV, HSV und VZV mit und ohne Autoklavieren waren wie oben in
Beispiel 2 beschrieben, außer
daß die
maximale Temperatur zur Schmelzkurvenbestimmung 80°C betrug.
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Durch
das Autoklavieren wurde die Infektiösität aller drei Viren beseitigt,
wie in Tabellen 1 und 2 gezeigt. DNA aus allen drei Viren wurde
mittels LightCycler-PCR sowohl in autoklavierten (VV, 7/15; HSV,
11/15; VZV, 10/15) und nicht autoklavierten (VV, 6/15; HSV, 9/15;
VZV, 8/15) Proben nachgewiesen. Mit LightCycler-PCR nachgewiesene
HSV- und VV-Präparate
(nicht autoklaviert) wurden ebenso in Zellkulturen nachgewiesen.
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Tabelle
1. Nachweis von HSV-DNA mit und ohne Autoklavieren
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Tabelle
1. Nachweis von Vaccinia-DNA mit und ohne Autoklavieren
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WEITERE AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Es
versteht sich, daß,
obschon die Erfindung in Verbindung mit der ausführlichen Beschreibung davon beschrieben
wurde, die vorstehende Beschreibung den Umfang der Erfindung, der
durch den Umfang der beigefügten
Ansprüche
definiert ist, veranschaulichen und nicht beschränken soll. Weitere Aspekte,
Vorteile und Modifikationen liegen im Umfang der folgenden Ansprüche.
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