ES2264461T3 - Deteccion del virus de la viruela. - Google Patents
Deteccion del virus de la viruela.Info
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Abstract
Un método para detectar la presencia o ausencia del virus de la viruela en una muestra biológica de un individuo, que comprende: realizar al menos una etapa de ciclación, donde una etapa de ciclación comprende una etapa de amplificación y una etapa de hibridación, donde dicha etapa de amplificación comprende poner dicha muestra en contacto con un par de cebadores de hemaglutinina (HA) para producir un producto de amplificación de HA si una molécula de ácido nucleico de HA del virus de la viruela está presente en dicha muestra, donde dicha etapa de hibridación comprende poner dicha muestra en contacto con un par de muestras de HA, donde los elementos de dicho par de muestras de HA forman híbridos con no más de cinco nucleótidos de cada uno, donde una primera muestra de HA de dicho par de muestras de HA se etiqueta con una mitad fluorescente donante y dicha segunda muestra de HA de dicho par de muestras de HA se etiqueta con una mitad fluorescente del aceptor correspondiente; y detectar la presencia o ausencia de la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre dicha mitad fluorescente del donante y dicha primera muestra de HA y dicha mitad fluorescente del aceptor y dicha segunda muestra de HA. donde la presencia de FRET es indicativa de la presencia del virus de la viruela en dicha muestra biológica, y donde la ausencia del FRET es indicativa de la ausencia del virus de la viruela en dicha muestra biológica, que además comprende las etapas de realizar al menos una etapa de ciclación, donde dicha etapa de ciclación comprende una etapa de amplificación y una etapa de hibridación, producir un producto de amplificación TK si una molécula de ácido nucleico de TK del virus de la viruela está presente en dicha muestra, donde dicha etapa de hibridación comprende poner dicha muestra en contacto con un par de muestras de TK, donde los elementos de dicho par de muestras de TK forman híbridos con no más de cinco nucleótidos de cada uno, donde una primera muestra de TK de dicho par de muestras de TK se etiqueta con una mitad fluorescente donante y dicha segunda muestra de TK de dicho par de muestras de TK se etiqueta con una mitad fluorescente aceptor correspondiente; y detectar la presencia o ausencia de FRET entre dicha mitad fluorescente donante de dicha primera muestra de TK y dicha mitad fluorescente aceptor de dicha segunda muestra de TK.
Description
Detección del virus de la viruela.
Esta invención se refiere a los diagnósticos
víricas, y más en particular a la detección del virus de la
viruela.
La inmunización rutinaria en los Estados Unidos
se interrumpió en 1971 debido a que el riesgo de una infección
diseminada en niños con un estado de inmunodeficiencia tuviera más
peso que la probabilidad de contraer una infección de viruela. El
último caso de viruela tuvo lugar en 1977 en Somalia, Africa. En
1980, la Organización Mundial de la Salud (OMS) declaró que la
viruela había sido erradicada. Como resultado de esta política, han
pasado 30 años y existe una población joven probablemente sensible a
una infección por el virus de la viruela. El uso de la viruela como
componente de una guerra biológica sigue siendo una amenaza para
producir la enfermedad epidémica en aquellos individuos que nunca
han estado inmunizados contra el virus y quizás adultos que
recibieron la vacuna en su día.
La detección de la viruela por la RCP se ha
realizado usando cebadores basados en secuencias de genomas que
codifican la proteína hemaglutinina (HA). Se ha estudiado un
conjunto de cebadores específicos del virus de la viruela (Ropp y
cols., J. Clinical Microbiology, vol. 33, páginas
2069-276).
La invención proporciona los métodos para
identificar viruela en una muestra biológica. Los cebadores y las
muestras para detectar el virus de la viruela son aportados por la
invención, así como los estuches que contienen dichos cebadores y
muestras. Pueden utilizarse métodos de la invención para identificar
rápidamente el ADN del virus de la viruela de las muestras para el
diagnóstico de la infección por virus de viruela y para diferenciar
las infecciones por el virus de la viruela de las infecciones por el
virus HSV (virus del herpes simple). Usando cebadores y muestras
específicas, los métodos incluyen la amplificación y el control del
desarrollo de productos de amplificación específicos usando
transferencia de energía por resonancia de fluorescencia
(FRET).
En un aspecto de la invención, se dispone de un
método para detectar la presencia o ausencia de virus de viruela en
una muestra biológica de un individuo. El método para detectar el
virus de viruela incluye efectuar al menos una etapa de ciclación,
que incluya una etapa de amplificación y una etapa de hibridización.
La etapa de amplificación incluye poner la muestra en contacto con
un par de cebadores de hemaglutinina (HA) para producir un producto
de amplificación de HA si una molécula de ácido nucleico de HA del
virus de la viruela está presente en la muestra. La etapa de
hibridación incluye poner la muestra en contacto con un par de
muestras de HA. En general, los miembros del par de muestras de HA
forman híbridos en no más de cinco nucleótidos de cada uno. Una
primera muestra de HA del par de muestras de HA está marcada
típicamente con una mitad fluorescente donante y una segunda
muestra de HA del par de muestras de HA está marcada con una mitad
fluorescente aceptor correspondiente. El método incluye además
detectar la presencia o ausencia de FRET entre la mitad fluorescente
donante de la primera muestra de HA y la mitad fluorescente aceptor
de la segunda muestra de HA. La presencia de FRET es indicadora en
general de la presencia del virus de la viruela en la muestra
biológica mientras que la ausencia de FRET es indicativa en general
de la ausencia del virus de la viruela en la muestra biológica.
La etapa de amplificación incluye además poner
la muestra en contacto con un par de cebadores de timidina kinasa
(TK) para producir un producto de amplificación de TK si una
molécula de ácido nucleico de TK del virus de la viruela está
presente en la muestra. La etapa de hibridación incluye poner la
muestra en contacto con un par de muestras de TK. En general, los
miembros del par de muestras de TK forman híbridos en no más de
cinco nucleótidos de cada uno. Una primera muestra de TK del par de
muestras de TK está marcada típicamente con una mitad fluorescente
donante y una segunda muestra de TK del par de muestras de TK está
marcada con una mitad fluorescente aceptor correspondiente. El
método incluye además detectar la presencia o ausencia de FRET
entre la mitad fluorescente donante de la primera muestra de TK y la
mitad fluorescente aceptor de la segunda muestra de TK. La
presencia de FRET es indicadora en general de la presencia del virus
de la viruela en la muestra biológica mientras que la ausencia de
FRET es indicativa en general de la ausencia del virus de la
viruela en la muestra biológica. Los métodos para detectar el virus
de la viruela usando HA y TK puede realizarse de forma secuencial o
concurrente.
Los cebadores y las muestras conforme a la
invención pueden ser dirigidos a una primera parte (HA1) o a una
segunda parte (HA2) del gen de HA. Un par de cebadores de HA1
incluye generalmente un primer cebador HA1 y un segundo cebador
HA1. El primer cebador HA1 puede incluir la secuencia
5'-CTA ATA TCA TTA GTA TAC GCT ACA
C-3' (SEQ ID NO:1), y el segundo cebador HA1 puede
incluir la secuencia 5'-GAG TCG TAA GAT ATT TTA
TCC-3'(SEQ ID NO:2). Una primera muestra HA1 puede
incluir la secuencia 5'-AAT GAT TAT GTT GTT ATG AGT
GCT TG-3' (SEQ ID NO:3) y la segunda muestra HA1
puede incluir la secuencia 5'-TAT AAG GAG CCC AAT
TCC ATT ATT CT-3'(SEQ ID NO:4).
Un par de cebadores HA2 incluye generalmente un
primer cebador HA2 y un segundo cebador HA2. El primer cebador HA2
puede incluir la secuencia 5'-ATA GTG AAT CGA CTA
TAG ACA TAA TA-3' (SEQ ID NO:5), y el segundo
cebador HA2 puede incluir la secuencia 5'-TTG ATT
TAG TAG TGA CAA TTC C-3'(SEQ ID NO:6). Una primera
muestra HA2 puede incluir la secuencia 5'-CTG TCA
CAT ACA CTA GTG ATA TCA TT-3' (SEQ ID NO:7) y la
segunda muestra HA2 puede incluir la secuencia
5'-ATA CAG TAA GTA CAT CAT CTG GAG
AA-3'(SEQ ID NO:8).
Un par de cebadores TK incluye generalmente un
primer cebador TK y un segundo cebador TK. El primer cebador TK
puede incluir la secuencia 5'-ATG GAC AGT TCT TTC
CAG -3' (SEQ ID NO:9), y el segundo cebador TK puede incluir la
secuencia 5'-TGA TAC ATA TCA TTA CCT CCT
A-3'(SEQ ID NO:10). Una primera muestra TK puede
incluir la secuencia 5'-CCG TTT AAT AAT ATC TTG GAT
CTT-3' (SEQ ID NO:11) y la segunda muestra TK puede
incluir la secuencia 5'-TTC CAT TAT CTG AAA TGG TGG
T-3'(SEQ ID NO:12). Alternativa o adicionalmente, un
segundo par de muestras TK que tiene las secuencias siguientes se
puede utilizar para detectar un producto de amplificación TK:
5'-GAC ATT TCA ACG TAA ACC GTT
TAA-3'(SEQ ID NO:13); y 5'-AATATC
TTG GAT CTT ATT CCA TTA TCT G-3'(SEQ ID NO:14). En
algunos aspectos, uno de los cebadores HA ó TK puede ser etiquetado
con una mitad fluorescente (sea un donante o un aceptor, según sea
apropiado) y puede ocupar el sitio de las muestras HA ó TK,
respectivamente.
Los miembros del par de muestras HA ó de las
muestras TK pueden formar híbridos en no más de dos nucleótidos de
cada uno, o bien pueden formar híbridos en no más de un nucleótido
de cada uno. Una mitad fluorescente donante representativa es la
fluoresceína, y las mitades fluorescentes de aceptor
correspondientes incluyen LC-Red 640,
LC-Red 705, Cy5 y Cy5.5. Se conocen en la tecnología
actual las mitades fluorescentes correspondientes de aceptor y
donante.
En un aspecto, la etapa de detección incluye
excitar la muestra biológica a una longitud de onda absorbida por
la mitad fluorescente donante y visualizar y/o medir la longitud de
onda emitida por la mitad fluorescente del aceptor (es decir
visualizar y/o medir FRET). En otro aspecto, la etapa de detección
incluye cuantificar la FRET. E incluso en todavía
otro aspecto, la etapa de detección puede realizarse después de cada etapa de ciclación (es decir, en tiempo real).
otro aspecto, la etapa de detección puede realizarse después de cada etapa de ciclación (es decir, en tiempo real).
En general, la presencia de FRET en 50 ciclos
(por ejemplo, 20, 25, 30, 35, 40 ó 45 ciclos) indica la presencia
de una infección por el virus de la viruela en el individuo. Además,
determinar la temperatura de fusión entre una o ambas muestras de
HA y la amplificación de HA, o de un modo similar, una o ambas
muestra(s) de TK y el producto de amplificación de TK puede
confirmar la presencia o ausencia del virus de la viruela.
Muestras biológicas representativas incluyen
extensiones dérmicas, fluido cerebroespinal, tejido gangliónico,
tejido cerebral, fluido ocular, sangre, esputo, lavado
bronco-alveolar, aspirados bronquiales, tejido
pulmonar y orina. Los métodos anteriormente descritos pueden
incluir además la prevención de la amplificación de un ácido
nucleico contaminante. Prevenir la amplificación puede incluir
realizar la etapa de amplificación en presencia de uracilo y tratar
la muestra biológica con uracilo-ADN glucosilasa
previamente a la amplificación.
Además, la etapa de ciclación puede efectuarse
en una muestra de control. Una muestra de control puede incluir la
misma parte de molécula de ácido nucleico de HA de virus de viruela.
Alternativamente, una muestra de control puede incluir una molécula
de ácido nucleico distinta de una molécula de ácido nucleico de HA
del virus de la viruela. Las etapas de ciclación pueden llevarse a
cabo en una muestra de control de ese tipo usando un par de
cebadores de control y un par de muestras de control. Los cebadores
y las muestras de control son distintos de los cebadores y las
muestras de HA. Una o más etapas de amplificación dan lugar a un
producto de amplificación de control. Cada una de las muestras de
control forma híbridos con el producto de amplificación de
control.
En otro aspecto, se dispone de artículos o
estuches de fabricación los estuches de la invención pueden incluir
un par de cebadores HA (HA1 ó HA2) y un par de muestras HA (HA1 ó
HA2, respectivamente), y las mitades fluorescentes aceptor y
donante correspondientes. Por ejemplo, un primer cebador HA1
dispuesto en un estuche de la invención puede tener la secuencia
5'-CTA ATA TCA TTA GTA TAC GCT ACA
C-3' (SEQ ID NO:1) y un segundo cebador HA1 puede
tener la secuencia 5'-GAG TCG TAA GAT ATT TTA
TCC-3' (SEQ ID NO:2). Una primera muestra de HA1
dispuesta en un estuche de la invención puede tener la secuencia
5'-AAT GAT TAT GTT GTT ATG AGT GCT
TG-3' (SEQ ID NO:3) y una segunda muestra de HA1
puede tener la secuencia 5'-TAT AAG GAG CCC AAT TCC
ATT ATT CT-3' (SEQ ID NO:4). Un primer cebador de
HA2 dispuesto en un estuche de la invención puede tener la secuencia
5'-ATA GTG AAT CGA CTA TAG ACA TAA
TA-3' (SEQ ID NO:5) y un segundo cebador HA2 puede
tener la secuencia 5'-TTG ATT TAG TAG TGA CAA TTC
C-3' (SEQ ID NO:6). Una primera muestra de HA2
dispuesta en un estuche de la invención puede tener la secuencia
5'-ATA CAG TAA GTA CAT CAT CTG GAG
AA-3'
(SEQ ID NO:8).
(SEQ ID NO:8).
Los artículos de fabricación pueden además o
alternativamente incluir un par de cebadores TK, un par de muestras
TK, y las mitades fluorescentes donante y aceptor correspondientes.
Por ejemplo, el primer cebador TK dispuesto en un estuche de la
invención puede tener la secuencia 5'-AAG GAC AGT
TCT TTC CAG-3'(SEQ ID NO:9), y el segundo cebador
de TK puede tener la secuencia 5'-TGA TAC ATA TCA
TTA CCT CCT A-3' (SEQ ID NO:10). La primera muestra
de TK dispuesta en un estuche de la invención puede tener la
secuencia 5'-CCG TTT AAT AAT ATC TTG GAT
CTT-3' (SEQ ID NO:11) y la segunda muestra de TK
puede tener la secuencia 5'-TTC CAT TAT CTG AAA TGG
TGG T-3' (SEQ ID NO:12). Alternativamente, las
muestras de TK siguientes pueden disponerse en un estuche de la
invención: 5'-GAC ATT TCA ACG TAA ACC GTT
TAA-3' (SEQ ID NO:13) y 5'-AAT ATC
TTG GAT CTT ATT CCA TTA TCT G-3' (SEQ ID
NO:14).
Los artículos de fabricación pueden incluir
mitades fluorescentes para etiquetar las muestras o bien las
muestras ya etiquetadas con las mitades fluorescentes de donante y
aceptor correspondientes. El artículo de fabricación puede incluir
también un estuche que tenga instrucciones para utilizar los
cebadores, las muestras y las mitades fluorescentes para detectar
la presencia o ausencia del virus de la viruela en una muestra
biológica.
En otro aspecto incluso, se dispone de un método
para detectar la presencia o ausencia del virus de la viruela en
una muestra biológica de un individuo. Dicho método incluye realizar
al menos una etapa de ciclación. Una etapa de ciclación puede
incluir una etapa de amplificación y una etapa de hibridación. En
general, una etapa de amplificación incluye poner la muestra en
contacto con un par de cebadores HA para producir un producto de
amplificación si una molécula de ácido nucleico de HA del virus de
la viruela está presente en la muestra. En general, una etapa de
hibridación incluye poner la muestra con una muestra de HA en
contacto con el producto de amplificación de HA. Dicha muestra de
HA habitualmente está marcada con una mitad fluorescente donante y
una mitad fluorescente aceptor correspondiente. El método incluye
además detectar la presencia o ausencia de la transferencia de
energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre la mitad
fluorescente donante y la mitad fluorescente aceptor de la muestra
HA. La presencia o ausencia de fluorescencia es indicativa de la
presencia o ausencia del virus de la viruela en dicha muestra.
Adicionalmente a los cebadores/muestra de HA aquí descritos, este
método puede llevarse a cabo también usando cebadores/muestras de
TK.
En un aspecto, la amplificación puede emplear
una enzima de polimerasa que tenga una actividad de exonucleasa de
5' a 3'. Por consiguiente, la primera y segunda mitades
fluorescentes estarían en no más de 5 nucleótidos una de otra a lo
largo de la longitud de la muestra. En otro aspecto, la muestra de
HA incluye una secuencia de ácido uncleico que permite la formación
de estructuras secundarias. Dicha formación de estructuras
secundarias da lugar generalmente a una proximidad espacial entre
la primera y la segunda mitad fluorescente. De acuerdo con este
método, la segunda mitad fluorescente en una muestra puede ser un
elemento de extinción.
En otro aspecto, se dispone de un método para
detectar la presencia o ausencia del virus de la viruela en una
muestra biológica de un individuo. Dicho método incluye realizar al
menos una etapa de ciclación. Una etapa de ciclación puede incluir
una etapa de amplificación y una etapa de fijación al colorante. Una
etapa de amplificación generalmente incluye poner la muestra en
contacto con un par de cebadores de HA para producir un producto de
amplificación si una molécula de ácido nucleico de HA del virus de
la viruela está presente en la muestra. Una etapa de fijación al
colorante incluye generalmente poner el producto de amplificación
de HA en contacto con un colorante de fijación de ADN doblemente
ramificado. El método incluye además detectar la presencia o
ausencia de la fijación del colorante al ADN doblemente ramificado,
siendo la fijación típicamente indicativa de la presencia del virus
de la viruela en la muestra, y la ausencia de la fijación
típicamente indicativa de la ausencia del virus de la viruela en la
muestra. Dicho método puede incluir además las etapas de
determinación de la temperatura de fusión entre el producto de
amplificación de HA y el colorante de fijación del ADN doblemente
ramificado. En general, la temperatura de fusión confirma la
presencia o ausencia del virus de la viruela. Los colorantes de
fijación del ADN doblemente ramificado representativos incluyen
SYBRGreen®, SYBRGold® y el bromuro de etidio.
A menos que se defina lo contrario, todos los
términos técnicos y científicos aquí utilizados tienen el mismo
significado a lo comúnmente entendido por la tecnología ordinaria a
la que pertenece esta invención. Aunque métodos y materiales
similares o equivalentes a los descritos aquí pueden ser utilizados
en la práctica o en las pruebas de la presente invención, a
continuación se describen los métodos y materiales adecuados.
Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos
únicamente y no limitativos. Todas las publicaciones, aplicaciones
de patentes, patentes y otras referencias aquí mencionadas se
incorporan por referencia a su totalidad. En caso de conflicto,
regirá la presente especificación y sus definiciones.
Los detalles de una o más configuraciones de la
invención se indican en los dibujos adjuntos y en la siguiente
descripción. Otras características, objetos y ventajas de la
invención se ponen de manifiesto a partir de los dibujos y de una
descripción detallada y de las reivindicaciones.
Se describe aquí un ensayo en tiempo real para
detectar el virus de la viruela en una muestra biológica que es más
sensible a los ensayos existentes. Los cebadores y las muestras para
detectar las infecciones por virus de la viruela y los artículos de
fabricación que contienen dichos cebadores y muestras son descritos
por la invención. La sensibilidad incrementada de la RCP a tiempo
real para la detección del virus de la viruela en comparación con
otros métodos, así como los rasgos mejorados de la RCP a tiempo real
que incluye el muestreo y la detección a tiempo real del producto
amplificado, hacen factible la implementación de esta tecnología
para el diagnóstico rutinario de las infecciones por el virus de la
viruela en el laboratorio clínico.
La viruela es un virus que contiene ADN
doblemente ramificado, lineal, de la familia Poxviridae. Los virus
de la viruela son grandes partículas en forma de ladrillo (\sim
300x250 nm). Desde el punto de vista clínico, se producen lesiones
vesiculares en los individuos sensibles después de un periodo de
incubación de 8-10 días después de una exposición
al virus de la viruela. Las lesiones vesiculares producidas por el
virus del herpes simples (HSV) y por el virus de la
varicela-zoster(VZV) se podrían considerar en
el diagnóstico clínico diferencial de la infección por el virus de
la viruela. El virus de la vacuna, íntimamente relacionado desde el
punto de vista antigénico y genómico (identidad del nucleótido
>95%) con el virus de la viruela se incorporaba a una vacuna
atenuada para la viruela.
La invención proporciona métodos para detectar
el virus de la viruela amplificando, por ejemplo, una parte de la
hemaglutinina (HA) o de la timidincinasa (TK) del virus de la
viruela. Los ácidos nucleicos del virus de la viruela diferentes de
los que aquí se mencionan (por ejemplo, distintos de HA y TK)
también se pueden utilizar para detectar el virus de la viruela en
una muestra y son conocidos por los expertos. La secuencia del
ácido nucleico del genoma del virus de la viruela, así como las
moléculas de ácido nucleico de la viruela codificadas como HA y TK,
se encuentran disponibles (ver, por ejemplo, GenBank Accesión nº
M14783 y K02031). Específicamente, los cebadores y las muestras
para amplificar y detectar las moléculas de ácido nucleico HA del
virus de la viruela son aportadas por la invención, así como los
cebadores y las muestras para amplificar y detectar las moléculas
de ácido nucleico TK del virus de la viruela.
Los cebadores que amplifican una molécula de
ácido nucleico del virus de la viruela, por ejemplo, la HA ó TK del
virus de la viruela, pueden ser diseñados utilizando, por ejemplo,
un programa de ordenador como el OLIGO (Molecular Biology Insights,
Inc., Cascade, CO). Los rasgos importantes al diseñar los
oligonucleótidos que se han de usar como cebadores de amplificación
incluyen, pero no se limitan a un producto de amplificación de
tamaño apropiado para facilitar la detección (por ejemplo, por
electroforesis), unas temperaturas de fusión similares para los
miembros de un par de cebadores, y la longitud de cada cebador (es
decir, los cebadores necesitar ser suficientemente largos para
formar híbridos con una especificidad de secuencia y para iniciar
la síntesis pero no tan largos que la fidelidad se reduzca
durante la síntesis del oligonucleótido). Típicamente, los cebadores de oligonucleótidos son de 15 a 30 nucleótidos.
durante la síntesis del oligonucleótido). Típicamente, los cebadores de oligonucleótidos son de 15 a 30 nucleótidos.
El diseño de oligonucleótidos que se utilizarán
como muestras de hibridación puede efectuarse de forma similar al
diseño de cebadores, aunque los miembros de un par de muestras
forman híbridos preferiblemente con un producto de amplificación en
no más de 5 nucleótidos de cada uno de en la misma ramificación de
manera que la FRET puede producirse (por ejemplo, en no más de 1,
2, 3 ó 4 nucleótidos de cada uno). Este grado mínimo de separación
une respectivamente las respectivas mitades fluorescentes hasta que
están suficientemente próximas para que ocurra la FRET. Sin
embargo, hay que entender que otras distancias de separación (por
ejemplo, 6 o más nucleótidos) son posibles siempre que las mitades
fluorescentes estén colocadas de forma apropiada una respecto a la
otra (por ejemplo, con un brazo de enlace) de forma que pueda
producirse la FRET. Además, las muestras pueden ser diseñadas para
formar híbridos dando lugar a puntos de referencia que contengan un
polimorfismo o una mutación, permitiendo con ello la detección
diferencial de las cepas del virus de la viruela en base a la
hibridación absoluta de los diferentes pares de muestras
correspondientes a la cepa del virus de la viruela en particular o
bien a las temperaturas de fusión diferenciales entre, por ejemplo,
miembros de un par de muestras y cada producto de amplificación que
corresponda a una cepa del virus de la viruela que se va a
distinguir. Como con los cebadores de oligonucleótidos, las
muestras de oligonucleótidos tienen temperaturas de fusión
similares, y la longitud de cada muestra debe ser suficiente para
la hibridación específica de cada secuencia pero no tan larga para
que la fidelidad se reduzca durante la síntesis. Las muestras de
oligonucleótidos son de 15 a 30 nucleótidos de longitud.
La creación incluye vectores que contienen una
molécula de ácido nucleico del virus de la viruela, por ejemplo, el
HA o el TK del virus de la viruela o fragmentos del mismo. Las
creaciones de la invención se pueden usar, por ejemplo, como
moléculas de ácido nucleico de control. Los vectores adecuados para
ser usados en la presente invención se encuentran disponibles en el
comercio y/o son fabricados por métodos de tecnología rutinarios
del ADN recombinante. Se pueden obtener, por ejemplo, moléculas de
ácido nucleico de HA o TK del virus de la viruela mediante síntesis
química, clonación directa del virus de la viruela o por
amplificación de la RCP. Una molécula de ácido nucleico del virus
de la viruela o fragmentos de la misma pueden unirse a un promotor
o bien otro elemento regulador como a una secuencia de aumento, o a
un elemento de respuesta, o a un elemento inducible que modula la
expresión de la molécula de ácido nucleico del virus de la viruela.
Tal como se ha utilizado aquí, el enlace funcional hace referencia
a la conexión de un promotor y/o otros elementos reguladores a una
molécula de ácido nucleico del virus de la viruela, de manera que
permita y/o regule la expresión de la molécula de ácido nucleico
del virus de la viruela. Un promotor que normalmente no dirige la
expresión del virus de la viruela HA ó TK puede ser usado para
dirigir la transcripción de un ácido nucleico HA ó TK usando, por
ejemplo, una polimerasa vírica, una polimerasa bacteriana, o bien
una polimerasa II de ARN eucariótica. Alternativamente, el promotor
nativo de HA o TK puede ser usado para dirigir la transcripción de
un ácido nucleico de HA ó TK, respectivamente, usando, por ejemplo,
una enzima de polimerasa de ARN del virus de la viruela. Además,
unido funcionalmente puede hacer referencia a una conexión apropiada
entre un promotor de HA ó TK del virus de la viruela o bien un
elemento regulador y una secuencia de codificación heterológica (es
decir, una secuencia de codificación no HA o TK, por ejemplo, un gen
de información) de manera que permita la expresión de la secuencia
de codificación heterológica.
Las creaciones adecuadas para ser usadas en los
métodos de la invención incluyen típicamente, además de moléculas
de HA del virus de la viruela o de moléculas de ácido nucleico de
TK, secuencias que codifican un marcador seleccionable (es decir,
un gen de resistencia antibiótico) para seleccionar las creaciones
y/o elementos transformantes deseados y un origen de la
replicación. La elección de los sistemas vectoriales depende
habitualmente de varios factores que incluyen pero no se limitan a
la elección de células anfitrionas, a la eficacia de la
replicación, a la capacidad de selección, la capacidad de inducción
y la facilidad de recuperación.
Las creaciones que contienen las moléculas de
ácido nucleico de HA o TK del virus de la viruela pueden propagarse
en una célula anfitriona. Tal como se ha utilizado aquí, el término
célula anfitriona equivale incluir procariotos y eucariotos como la
levadura, las células de plantas y animales. Los anfitriones
procarióticos pueden incluir la E. coli, Salmonella
typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus
subtilis. Las células eucarióticas incluyen levaduras como
S.cerevisiae, S. pombe, Pichia pastoris,
células mamarias como las células COS o las células (CHO) de ovario
de hámster chino, células de insectos y células de plantas como la
Arabidopsis thaliana y Nicotiana tabacum. Una
creación puede introducirse en una célula anfitriona usando
cualquiera de las técnicas frecuentemente conocidas por los
expertos en la materia. Por ejemplo, la precipitación de fosfato de
calcio, la electroporación, choque térmico, lipofección,
microinyección y transporte de ácido nucleico mediado por el virus
son métodos frecuentes para introducir ácidos nucleicos en células
anfitrionas. Además, el ADN desnudo puede ser suministrado
directamente a las células (ver, por ejemplo, patentes americanas
nrs. 5.580.859 y 5.589.466).
Las patentes americanas nr. 4.683.202,
4.683.195, 4.800.159 y 4.965.188 muestran técnicas de RCP
convencionales. La RCP emplea típicamente dos cebadores de
oligonucleótidos que se unen a un modelo de ácido nucleico
seleccionado (por ejemplo, ADN o ARN). Los cebadores útiles en la
presente invención incluyen oligonucleótidos capaces de actuar como
punto de inicio de la síntesis del ácido nucleico en el HA o TK del
virus de la viruela. Un cebador puede ser purificado a partir de un
digesto de restricción según métodos convencionales, o bien puede
ser producido sintéticamente. El cebador tiene preferiblemente una
sola ramificación para una eficacia máxima en la amplificación,
pero el cebador puede tener doble ramificación. Los cebadores
doblemente ramificados son desnaturalizados en primer lugar, es
decir tratados para separar las ramificaciones. Un método para
desnaturalizar los ácidos nucleicos doblemente ramificados es
mediante su calentamiento.
El término "polimerasa termoestable" hace
referencia a una enzima de polimerasa que es estable al calor, es
decir, la enzima cataliza la formación de productos de primera
extensión complementarios a un modelo o patrón y no se
desnaturaliza de forma irreversible cuando se someta a las
temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para realizar la
desnaturalización de los ácidos nucleicos modelo doblemente
ramificados. En general, la síntesis se inicia en el extremo 3' de
cada cebador y avanza en la dirección 5' a 3' a lo largo de la rama
modelo. Las polimerasas termoestables se han aislado a partir de
Thermus flavus, T.ruber, T. thermophilus, T. aquaticus, T.
lacteus, T. rubens, Bacillus stearothermophilus, y
Methanothermus fervidus. Sin embargo, las polimerasas que no
son termoestables también se pueden emplear en los análisis o
métodos de la RCP, siempre que se disponga de enzima.
Si el ácido nucleico modelo del virus de la
viruela presenta doble rama, es necesario separar las dos ramas
antes de que se pueda utilizar como un modelo en la RCP. La
separación de las ramas puede efectuarse mediante un método de
desnaturalización adecuado que incluya los medios físicos, químicos
o enzimáticos. Un método de separación de las ramas del ácido
nucleico implica el calentamiento del ácido nucleico hasta que se
encuentre básicamente desnaturalizado (por ejemplo, desnaturalizado
más del 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%). Las condiciones de
calentamiento necesarias para desnaturalizar el ácido nucleico
modelo dependerán, por ejemplo, de la concentración salina del
tampón y de la longitud y composición de nucleótidos de los ácidos
nucleicos que son desnaturalizados, pero oscila típicamente entre
los 90ºC y los 105ºC durante un tiempo que depende de las
características de la reacción como la temperatura y la longitud
del ácido nucleico. La desnaturalización dura típicamente entre 30
seg. y 4 min.
Si el ácido nucleico doblemente ramificado es
desnaturalizado por el calor, se permite que la mezcla de reacción
se enfríe a una temperatura que promueva la hibridación de cada
cebador en su secuencia de referencia en el ácido nucleico del
virus de la viruela. La temperatura de la hibridación oscila
frecuentemente entre 35ºC y 65ºC. La mezcla de reacción se ajusta
luego a una temperatura a la cual se promueve o bien optimiza la
actividad de la polimerasa, es decir, a una temperatura suficiente
para que se produzca la extensión del cebador hibridado con el fin
de generar productos complementarios al ácido nucleico patrón. La
temperatura debería ser suficiente para sintetizar un producto de
extensión de cada cebador que es hibridado en un modelo de ácido
nucleico, pero no debería ser tan alta que desnaturalizara un
producto de extensión de su modelo complementario (es decir, la
temperatura oscila generalmente entre 40 y 80ºC).
Los análisis o métodos de la RCP pueden emplear
ácido nucleico del virus de la viruela como el ADN o ARN,
incluyendo ARN mensajero (mARN). El ácido nucleico modelo no
necesita ser purificado; puede ser una fracción mínima de una
mezcla compleja, como el ácido nucleico del virus de la viruela
contenido en las células humanas. El ADN o el ARN pueden ser
extraídos de una muestra biológica como extensiones dérmicas, fluido
cerebroespinal, tejido gangliónico, tejido cerebral, fluido ocular,
sangre, esputo, lavado bronquio-alveolar, aspirados
bronquiales, tejido pulmonar y orina mediante técnicas rutinarias
como las descritas en Diagnostic Molecular Microbiology:
Principles and Applications (Persing y cols.(eds), 1993,
American Society for Microbiology, Washington D.C). Los ácidos
nucleicos se pueden obtener a partir de cualquier tipo de fuentes,
como los plásmidos, o fuentes naturales que incluyen las bacterias,
levaduras, virus, orgánulos o bien organismos mayores como plantas o
animales.
Los cebadores de los oligonucleótidos se
combinan con los reactivos de la RCP en unas condiciones de la
reacción que inducen a una extensión del cebador. Por ejemplo, las
reacciones de extensión en cadena incluyen generalmente KCl 50 mM,
Tris-HCl 10 mM(pH 8,3), MgCl_{2} 15 mM,
0,001% (p/v) gelatina, 0,5-1,0 cg de ADN patrón
desnaturalizado, 50 pmoles de cada cebador de oligonucleótido, 2,5
U de Taq polimerasa y un 10% de DMSO). Las reacciones generalmente
contienen 150 a 320 cM de dATP, dCTP, dTTP, dGTP o uno o más
análogos de los mismos.
Las ramas recién sintetizadas formar una
molécula de doble ramificación que se puede usar en las etapas
sucesivas de la reacción. Las etapas de separación, hibridación y
elongación de las ramas se pueden repetir tan a menudo como se
necesite para producir la cantidad deseada de productos de
amplificación que corresponda a la molécula de ácido nucleico del
virus de la viruela de referencia. Los factores limítrofes en la
reacción son las cantidades de cebadores, enzimas termoestables, y
trifosfatos de nucleósidos presentes en la reacción. Las etapas de
ciclación (es decir, desnaturalización, hibridación y extensión) se
repiten preferiblemente al menos una vez. Para usar en la
detección, el número de etapas de ciclación dependerá, por ejemplo
de la naturaleza de la muestra. Si la muestra es una mezcla
compleja de ácidos nucleicos, se requerirán más etapas de ciclación
para amplificar la secuencia de referencia suficiente para la
detección. En general, las etapas de ciclación se repiten al menos
20 veces, pero se pueden repetir 40, 60 o incluso hasta 100
veces.
La tecnología FRET (ver, por ejemplo, patente
americana nrs. 4.996.143, 5.565.322, 5.849.489 y 6.162.603) se basa
en un concepto de que cuando un donante y una mitad fluorescente
aceptor correspondiente se colocan a una cierta distancia una de
otra, tiene lugar el paso de energía entre las dos mitades
fluorescentes que puede ser visualizado o detectado de algún modo
y/o cuantificado. Dos muestras de oligonucleótidos, que contienen
una mitad fluorescente pueden formar híbridos dando lugar a un
producto de amplificación en una posición en particular determinada
por la complementariedad de las muestras de oligonucleótidos
respecto a la secuencia del ácido nucleico de referencia del virus
de la viruela. En la hibridación de las muestras de oligonucleótidos
al ácido nucleico del producto de amplificación en las posiciones
apropiadas se general una señal de FRET.
El análisis fluorescente puede llevarse a cabo
usando, por ejemplo, un sistema de microscopio epifluorescente de
recuento de fotones (que contiene el apropiado espejo dicroico y los
filtros para controlar la emisión fluorescente en la gama
correspondiente), un sistema fotomultiplicador de recuento de
fotones o bien un fluorómetro. La excitación para iniciar el
transporte de energía puede llevarse a cabo con un láser de ión
argon, una lámpara de arco de mercurio (Hg) de elevada intensidad,
una fuente luminosa de fibra óptica o bien otra fuente luminosa de
elevada intensidad filtrada de forma apropiada para la excitación en
el margen deseado.
Tal como se utiliza aquí con respecto a las
mitades fluorescentes aceptor y donante correspondientes, el término
"correspondiente" se refiere a una mitad fluorescente aceptor
que tiene un espectro de emisión que se sobrepasa el espectro de
excitación de la mitad fluorescente donante. La longitud de onda
máxima del espectro de emisión de la mitad fluorescente del aceptor
debería ser al menos 100 nm superior a la longitud de onda máxima
del espectro de excitación de la mitad fluorescente donante. De
acuerdo con ello, puede producirse un transporte eficaz de energía
no radiactiva.
Las mitades donante y aceptor fluorescentes
correspondientes se eligen generalmente para (a) transporte de
energía de Förster de elevada eficacia; (b) una gran variación final
de Stokes (>100 nm); (c) variación de la emisión siempre que sea
posible en la parte roja del espectro visible (>600 nm); y (d)
variación de la emisión a una longitud de onda superior que la
emisión fluorescente de agua de Raman producida por la excitación a
la longitud de onda de excitación del donante. Por ejemplo, se puede
elegir una mitad fluorescente donante que tenga su máximo de
excitación próximo a una línea láser (por ejemplo,
Helio-Cadmio 442 nm o Argon 488 nm), un coeficiente
de extinción elevado, un rendimiento cuántico elevado, y un buen
solapamiento de su emisión fluorescente con el espectro de
excitación de la mitad fluorescente del aceptor correspondiente. Se
puede elegir una mitad fluorescente del aceptor correspondiente que
tenga un coeficiente de extinción elevado, un rendimiento cuántico
alto, y un buen solapamiento de su excitación con la emisión de la
mitad fluorescente donante y la emisión en la parte roja del
espectro visible (>600 nm).
Las mitades fluorescentes del donante
representativas que se pueden usar con diversas mitades
fluorescentes del aceptor en la tecnología FRET incluyen
fluoresceína, Lucifer Yellow, B-ficoeritrina,
9-acridinaisotiocianato, Lucifer Yellow VS, ácido
4-acetamido-4'-isotio-canatoestilbeno-2,2'-disulfónico,
7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina,
1-pirenobutirato de succinimidilo, y derivados del
ácido
4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico.
Las mitades fluorescentes del aceptor representativas, dependiendo
de la mitad fluorescente donante utilizada, incluyen
LC^{TM}-Red 640, LC^{TM}-Red
705, Cy5, Cy5,5, cloruro de sulfonilo de Lissamina rodamina B,
isotiocianato de rodamina de tetrametilo, rodamina x isotiocianato,
isotiocianato de eritrosina, fluoresceína, pentaacetato de
dietiltriamina o bien otros quelatos de los iones de lantánidos (por
ejemplo, Europio o terbio). Pueden obtenerse, por ejemplo, mitades
fluorescentes de donante y aceptor de las muestras moleculares
(Junction City, OR) o de Sigma Chemical Co (St. Louis, MO).
Las mitades fluorescentes donante y aceptor
pueden acoplarse a la muestra de oligonucleótidos apropiada a
través de un brazo de enlace o de conexión. La longitud de dicho
brazo es importante, ya que el brazo de conexión influirá en la
distancia entre las mitades fluorescentes donante y aceptor. La
longitud del brazo de enlace para el objetivo de la presente
invención es la distancia en Angstroms (A) desde la base del
nucleótido hasta la mitad fluorescente. En general, un brazo de
conexión mide de 10 a aproximadamente 25 A. El brazo de conexión
puede ser del tipo descrito en WO 84/03285. El WO 84/03285 muestra
también unos métodos para acoplar los brazos de conexión a una base
de nucleótidos particular, y también para acoplar las mitades
fluorescentes a un brazo de conexión.
Una mitad fluorescente del aceptor tal como un
éster LC^{TM}-Red 640-NHS puede
combinarse con los C6-fosforamiditas (disponible de
ABI (Foster City, CA) o bien Glen Research (Sterling, VA) para
producir, por ejemplo, LC^{TM}-Red
640-fosforamidita. Las conexiones utilizadas
frecuentemente para acoplar una mitad fluorescente donante como la
fluoresceína a un óligonucleótido incluyen enlaces de tiourea
(derivado de FITC, por ejemplo, CPG de fluoresceína de Glen
Research o ChemGene (Ashland, MA)), enlaces de amidas (derivados del
éster de NHS de fluoresceína, como la CPG de fluoresceína de
BioGenex (San Ramon, CA)) o bien
3'-amino-CPG's que requieren el
acoplamiento de un éster de NHS de fluoresceína después de la
síntesis de oligonucleótidos.
Se han utilizado métodos convencionales de la
RCP para detectar el virus de la viruela. La amplificación
convencional basada en la RCP va seguida generalmente de un
transporte de los productos de amplificación a un soporte sólido y
de una detección que utiliza una muestra etiquetada (por ejemplo,
método de Southern o de Northern). Estos métodos son arduos y
requieren más de un día de trabajo. Además, la manipulación de los
productos de amplificación para los fines de detección (por
ejemplo, por coagulación) aumenta el riesgo de la contaminación
cruzada y los falsos positivos. Usando una instrumentación de la
CPR a tiempo real disponible en el comercio (por ejemplo,
LighCycler^{TM}, Roche molecular Biochemicals, Indianápolis, IN)
la amplificación de la RCP y la detección del producto de
amplificación se pueden combinar en una cubeta cerrada única con un
tiempo de ciclación reducido dramáticamente. Puesto que la
detección se produce al mismo tiempo que la amplificación, los
métodos de RCP a tiempo real obvian la necesidad de la manipulación
del producto de amplificación, y reducen el riesgo de la
contaminación cruzada entre los productos de amplificación. La RCP a
tiempo real reduce enormemente el tiempo de espera y es una
alternativa atractiva a las técnicas convencionales de RCP en el
laboratorio clínico.
La presente invención proporciona métodos para
detectar la presencia o ausencia del virus de la viruela en una
muestra biológica de un individuo. Los métodos aportados por la
invención evitan problemas de contaminación de muestras, falsos
negativos y falsos positivos. Los métodos incluyen la realización de
al menos una etapa de ciclación que incluya la puesta en contacto
de una muestra con un par de cebadores de HA. Si una molécula de
ácido nucleico de HA del virus de la viruela está presente en la
muestra biológica, se produce un producto de amplificación del HA.
Cada uno de los cebadores de HA se híbrida en un elemento de
referencia en o adyacente a una molécula de ácido nucleico de HA
del virus de la viruela de manera que al menos una parte del
producto de amplificación contiene una secuencia de ácido nucleico
que corresponde a HA y, lo que es más importante, dicho producto de
amplificación contiene las secuencias de ácido nucleico que son
complementarias a las muestras de HA. El producto de amplificación
de HA se crea siempre que el ácido nucleico del virus de la viruela
esté presente. Cada etapa de ciclación incluye además poner la
muestra en contacto con un par de muestras de HA. De acuerdo con la
invención, una de las muestras de HA está etiquetada con una mitad
fluorescente donante y la otra está etiquetada con una mitad
fluorescente aceptor correspondiente. Se detecta la presencia o
ausencia de FRET entre la mitad fluorescente donante de la primera
muestra de HA y la correspondiente mitad fluorescente aceptor de la
segunda muestra de HA.
Cada etapa de ciclación incluye una etapa de
amplificación y una etapa de hibridación, y cada etapa de ciclación
va seguida de una etapa de detección de la FRET. Las etapas de
ciclación múltiples se llevan a cabo preferiblemente en un
termociclador. Los métodos anteriormente descritos para detectar el
virus de la viruela en una muestra biológica usando cebadores y
muestras dirigidas hacia HA también pueden llevarse a cabo usando
otros cebadores y muestras específicos del gen del virus de la
viruela y cebadores y muestras específicos de TK.
Tal como se utiliza aquí, "amplificar" se
refiere al proceso de sintetizar moléculas de ácido nucleico que
son complementarias a una o ambas ramificaciones de una molécula de
ácido nucleico patrón (por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico
de HA o TK del virus de la viruela). Amplificar una molécula de
ácido nucleico incluye típicamente desnaturalizar el ácido nucleico
patrón, formar híbridos de los cebadores con el ácido nucleico
patrón a una temperatura que es inferior a las temperaturas de
fusión de los cebadores, y una elongación enzimática de los
cebadores para generar un producto de amplificación. La
amplificación requiere típicamente la presencia de trifosfatos de
deoxiribonucleósidos, un enzima de polimerasa de ADN (por ejemplo,
Platinum® Taq) y un tampón apropiado y/o cofactores para una
actividad óptima de la enzima polimerasa (Por ejemplo, MgCl_{2}
y/o KCl).
Si la amplificación del ácido nucleico del virus
de la viruela se produce y se crea un producto de amplificación, la
etapa de hibridación da lugar a una señal detectable basada en la
FRET entre los miembros de los pares de muestras. Tal como se
utiliza aquí, "hibridar" se refiere ala hibridación de las
muestras en un producto de amplificación. Las condiciones de
hibridación incluyen típicamente una temperatura que es inferior a
la temperatura de fusión de las muestras pero que evita la
hibridación no específica de las muestras.
En general, la presencia de FRET indica la
presencia del virus de la viruela en la muestra biológica, y la
ausencia de FRET indica la ausencia del virus de la viruela en la
muestra biológica. Sin embargo, la recogida de muestra inadecuada,
los retrasos en el transporte, las condiciones inapropiadas en el
transporte, o bien el uso de ciertas extensiones del muestreo
(alginato de calcio o vara de aluminio) son todas las condiciones
que pueden afectar al éxito y/o la exactitud de un resultado de la
prueba.
Usando los métodos que aquí se indican, la
detección de la FRET en 30 etapas de ciclación es indicativa de una
infección por el virus de la viruela. Las muestras en las cuales se
detecta la FRET después de más de 30 etapas de ciclación es también
un hecho indicativo de una infección por el virus de la viruela,
pero se puede efectuar una evaluación de la infección por el virus
utilizando un método de la invención con un objetivo de genes
distinto o bien una valoración diferente a la RCP a tiempo real aquí
descrita. El número de ciclos en el cual se detecta la FRET puede
estar correlacionado con la cantidad de virus de viruela en una
muestra biológica, es decir con el individuo (por ejemplo, carga
vírica).
También se pueden utilizar métodos de la
invención para los estudios de epidemiología o de eficacia de la
vacuna del virus de la viruela. Por ejemplo, un virus de la viruela
atenuado en una vacuna de la viruela se puede detectar usando los
métodos de la invención durante el tiempo en el que el virus todavía
está presente en un individuo. Para dichos estudios de eficacia de
la vacuna, se pueden utilizar los métodos de la invención para
determinar, por ejemplo, la capacidad o persistencia de replicación
de un virus atenuado utilizado en una vacuna, o bien se puede
llevar a cabo junto a una valoración adicional como una valoración
serológica para controlar la respuesta inmunitaria de un individuo
a dicha vacuna. Además, los métodos de la invención se pueden usar
para distinguir una cepa del virus de la viruela de otra para los
estudios epidemiológicos de, por ejemplo, el origen o la gravedad
de un ataque de viruela.
Las muestras biológicas representativas que se
pueden utilizar al utilizar los métodos de la invención incluyen
extensiones dérmicas, fluido cerebroespinal, tejido gangliónico,
tejido cerebral, fluido ocular, sangre, esputo, lavado
bronquio-alveolar, aspirados bronquiales, tejido
pulmonar y orina. Los expertos conocen las recogidas de muestras
biológicas y los métodos de almacenamiento. Las muestras biológicas
pueden ser procesadas (por ejemplo, mediante métodos y/o estuches
conocidos para la extracción de ácido nucleico) para liberar ácido
nucleico del virus de la viruela o bien en algunos casos, la muestra
biológica se pone en contacto directamente con los componentes de
la reacción de RCP y con los oligonucleótidos apropiados.
El análisis de la curva de fusión es una etapa
adicional que se puede incluir en un perfil de ciclación. El
análisis de la curva de fusión se basa en el hecho de que el ADN se
funde a una temperatura característica denominada la temperatura de
fusión (T_{m}), que se define como la temperatura a la cual la
mitad de los duplex de ADN se han separado en ramas individuales.
La temperatura de fusión de un ADN depende básicamente de su
composición de nucleótidos. Por consiguiente, las moléculas de ADN
ricas en nucleótidos G y C tienen una TM mayor que las que tienen
una abundancia de nucleótidos A y T. Detectando la temperatura a la
cual se pierde la señal se puede determinar la temperatura de
fusión de las muestras. Del mismo modo, detectando la temperatura a
la cual se genera la señal, se puede determinar la temperatura de
hibridación de las muestras. La temperatura de fusión de las
muestras de HA o TK del producto de amplificación respectivo puede
confirmar la presencia o ausencia del virus de la viruela en la
muestra.
En cada recorrido del termociclador, las
muestras de control también ciclan. Las muestras de control
positivas pueden amplificar el patrón de control del ácido nucleico
del virus de la viruela (distinto del HA o TK) utilizando, por
ejemplo, cebadores y muestras de control. Las muestras de control
positivas puede amplificar también, por ejemplo, un plásmido que
contenga moléculas de ácido nucleico de HA o TK del virus de la
viruela. Dicho plásmido se puede amplificar internamente (por
ejemplo, en la muestra biológica) o en un recorrido aparte de la
muestra junto a las muestras de los pacientes. Cada termociclador
debería incluir también un control negativo al que, por ejemplo, le
falte el ADN patrón del virus de la viruela. Dichos controles son
indicadores del éxito o fracaso de la amplificación, hibridación
y/o reacción de FRET. Por lo tanto, las reacciones de control
pueden determinar fácilmente, por ejemplo, la capacidad de los
cebadores para formar híbridos con una especificidad de la
secuencia y para iniciar la elongación, así como la capacidad de las
muestras para formar híbridos con la especificidad de la secuencia
y para que se produzca la FRET.
En una configuración, los métodos de la
invención incluyen las etapas para evitar la contaminación. Por
ejemplo, un método enzimático que utiliza glucosilasa de
ADN-uracilo se describe en las patentes americanas
nrs. 5.035.996, 5.683.896 y 5.945.313 para reducir o eliminar la
contaminación entre un recorrido del termociclador y el siguiente.
Además, se desean prácticas y procedimientos estándar en el
laboratorio para llevar a cabo los métodos de la invención. Las
prácticas y procedimientos de confinamiento constante por parte del
personal son necesarias para conseguir exactitud en el manejo de
muestras clínicas en el laboratorio.
Los métodos de RCP convencionales junto con la
tecnología de FRET se pueden utilizar para practicar los métodos de
la invención. En una configuración se utiliza un instrumento
LightCycler^{TM}.
En http://biochem.roche.com/lightcycler
se puede hallar una descripción detallada del sistema
LightCycler^{TM} y un control a tiempo real y en línea de la RCP.
Las siguientes solicitudes de patentes describen la RCP a tiempo
real tal como se utiliza en la tecnología LightCycler^{TM}: WO
97/46707, WO 97/46714 y WO 97/46712. El instrumento
LightCycler^{TM} es un ciclador térmico rápido combinado con un
fluorímetro de micro volumen que utiliza ópticas de elevada
calidad. Esta rápida técnica de termociclación emplea cubetas de
vidrio finas como recipientes de reacción. El calentamiento y el
enfriamiento de la cámara de reacción son controlados alternando
aire calentado y aire a temperatura ambiente. Debido a la escasa
masa de aire y al elevado porcentaje de área superficial frente al
volumen de las cubetas, pueden conseguirse intercambios de
temperatura muy rápidos en la cámara térmica LightCycler^{TM}. La
adición de colorantes fluorescentes seleccionados a los componentes
de reacción permite que se controle la RCP a tiempo real y de forma
directa. Además, las cubetas sirven de elemento óptico para recoger
la señal (similar a la óptica de fibra de vidrio), concentrando la
señal en la punta de la cubeta. El efecto es una iluminación eficaz
y un control fluorescente del microvolumen de las muestras.
El carrusel LightCycler^{TM} que alberga las
cubetas puede ser extraído del instrumento. Por lo tanto, las
muestras se pueden cargar fuera del instrumento (en un PCR Clean
Room, por ejemplo). Además, este rasgo permite limpiar y
esterilizar fácilmente el carrusel de muestras. El fluorómetro, como
parte del aparato LightCycler^{TM}, alberga la fuente luminosa.
La luz emitida es filtrada y centralizada por una lente de
epi-iluminación en la parte superior de la cubeta.
La luz fluorescente emitido por la muestra es luego centralizada por
la misma lente, pasa a través de un espejo dicroico, es filtrada de
forma apropiada y centralizada en fotohíbridos colectores de datos.
La unidad óptica disponible actualmente en el instrumento
LightCycler^{TM} (Roche Molecular Biochemicals, Catalog nr. 2011
468) incluye tres filtros de paso de banda (530 nm, 640 nm y 710
nm), que proporcionan una detección tricolor y varias opciones de
adquisición de fluorescencia. Las opciones de recogida de datos
incluyen un control por etapa de ciclación, la adquisición de una
sola muestra completamente continua para el análisis de la curva de
fusión, el muestreo continuo (en el cual la frecuencia de muestreo
depende del número de muestras) y/o la medición etapa a etapa de
todas las muestras después de un intervalo de temperatura
definido.
El LightCycler^{TM} puede funcionar usando un
PC y puede utilizar un sistema operativo de Windows NT. Las señales
de las muestras se obtienen a medida que la máquina coloca los
capilares de forma secuencial sobre la unidad óptica. El software
puede visualizar las señales de fluorescencia a tiempo real
inmediatamente después de cada medición. El periodo de adquisición
de fluorescencia es de 10 a 100 milisegundos (mseg). Después de
cada etapa de ciclación, una visualización cuantitativa de
fluorescencia frente al número de ciclos puede actualizarse de
forma continua para todas las muestras. Los datos generados se
pueden almacenar para un análisis posterior.
Como una alternativa al FRET, se puede detectar
un producto de amplificación usando un colorante enlazado al ADN
bicatenario como un colorante de enlace al ADN fluorescente (por
ejemplo, SYBRGreen® o bien SYBRGold® (muestras moleculares)). En la
interacción con el ácido nucleico bicatenario, dichos colorantes
enlazados al ADN fluorescente emiten una señal de fluorescencia
después de la excitación con luz a una longitud de onda adecuada.
También se puede utilizar un colorante que se enlaza al ADN
bicatenario como un colorante que intercala ácido nucleico. Cuando
se utilizan colorantes que se enlazan al ADN bicatenario, se realiza
generalmente un análisis de la curva de fusión para confirmar la
presencia del producto de amplificación.
Tal como se ha descrito aquí, los productos de
amplificación se pueden detectar utilizando muestras de hibridación
etiquetadas que se benefician de la tecnología FRET. Un formato
frecuente de la tecnología FRET utiliza dos muestras de
hibridación. Cada muestra puede ser etiquetada con una mitad
fluorescente distinta y generalmente se han diseñado para formar
híbridos muy próximos unos a otros en una molécula de ADN de
referencia (por ejemplo, un producto de amplificación). Una mitad
fluorescente donante, por ejemplo, la fluoresceína, se excita a 470
nm por la fuente luminosa del instrumento LightCycler^{TM}.
Durante la FRET, la fluoresceína transfiere su energía a una mitad
fluorescente aceptor como la LightCycler^{TM}-Red
640(LC^{TM}-Red 640) o bien
LightCycler^{TM}-Red
705(LC^{TM}-Red 705). La mitad fluorescente
del aceptor emite entonces luz de una longitud de onda mayor, que
es detectada por el sistema de detección óptico del instrumento
LightCycler^{TM}. La FRET eficiente puede tener lugar únicamente
cuando las mitades fluorescentes se encuentran localmente próximas y
cuando el espectro de emisión de la mitad fluorescente donante se
solapa con el espectro de absorción de la mitad fluorescente
aceptor. La intensidad de la señal emitida puede correlacionarse con
el número de moléculas originales de referencia de ADN (por
ejemplo, el número de partículas del virus).
Otro formato de FRET utiliza la tecnología
TaqMan® para detectar la presencia o ausencia de un producto de
amplificación, y con ello la presencia o ausencia del virus de la
viruela. La tecnología TaqMan® utiliza una muestra de hibridación
monocatenaria etiquetada con dos mitades fluorescentes. Cuando la
primera mitad fluorescente se excita con luz de una longitud de
onda adecuada, la energía absorbida es transferida a la segunda
mitad fluorescente según los principios de la FRET. La segunda
mitad fluorescentes es generalmente una molécula de extinción.
Durante la etapa de hibridación de la reacción RCP, la muestra de
hibridación etiquetada se une a un ADN de referencia (es decir, al
producto de amplificación) y es degradada por la actividad de la
5'\rightarrow3' exonucleasa de una polimerasa (por ejemplo, Taq
polimerasa®) durante la posterior fase de elongación. Como
resultado de la degradación, la mitad fluorescente excitada y la
mitad de extinción se separan una de otra. Como consecuencia de
ello, al excitar la primera mitad fluorescente en ausencia de la
molécula de extinción, se puede detectar la emisión de
fluorescencia de la primera mitad fluorescente. Como ejemplo de
ello, un Sistema de Detección de Secuencias ABI PRISM® 7700 (Applied
Biosystems, Foster City, CA) utiliza la tecnología TaqMan®, y es
adecuado para realizar los métodos aquí descritos para la detección
del virus de la viruela. Información acerca de la amplificación y
detección de la RCp usando un sistema ABI PRISM® 770 se puede
hallar en http:/www.appliedbiosystems.com/products.
También se pueden usar guías moleculares junto
al FRET para detectar la presencia de un producto de amplificación
usando los métodos de la RCP a tiempo real. La tecnología de la guía
molecular utiliza una muestra de hibridación única etiquetada con
una mitad fluorescente y una segunda mitad fluorescente. La segunda
mitad fluorescente es generalmente un elemento de extinción, y las
etiquetas fluorescentes se localizan típicamente a cada extremo de
la muestra. La tecnología de guías moleculares utiliza una muestra
de oligonucleótido que tiene secuencias que permiten la formación
de una estructura secundaria (por ejemplo, una horquilla). Como
resultado de la formación de estructura secundaria en la muestra,
ambas mitades fluorescente se encuentran próximas cuando la muestra
esta en solución. Después de la hibridación al(los)
producto(s) de amplificación deseado(s), la
estructura secundaria de la muestra se rompe y las mitades
fluorescentes se separan una de otra de manera que después de la
excitación con luz de una longitud de onda adecuada, se puede
detectar la emisión de la primera mitad fluorescente.
Se entiende que la presente invención no está
limitada por la configuración de uno o más instrumentos disponibles
en el mercado.
Un artículo de fabricación puede incluir
cebadores y muestras utilizados para detectar el virus de la
viruela, junto con materiales de embalaje adecuados. Los cebadores
y las muestras representativas para la detección del virus de la
viruela son capaces de formar híbridos con las moléculas de ácido
nucleico de HA o TK del virus de la viruela. Los métodos de diseño
de los cebadores y las muestras se revelan aquí y se aportan
ejemplos representativos de cebadores y muestras que amplifican y
forman híbridos con las moléculas de ácido nucleico de HA o TK del
virus de la viruela. Los artículos de fabricación pueden incluir
también una o más mitades fluorescentes para etiquetar las muestras
o bien, de forma alternativa, las muestras suministradas con el
estuche pueden ser marcadas. Por ejemplo, un artículo de fabricación
puede incluir una mitad fluorescente donante para etiquetar una de
las muestras de HA ó TK y una mitad fluorescente aceptor para
etiquetar la otra muestra de HA o TK. Ejemplos de las mitades
fluorescentes donantes de FREt adecuadas y de las correspondientes
mitades fluorescentes del aceptor ya se han mencionado antes.
Los artículos de fabricación pueden contener
también una etiqueta de embalaje con las instrucciones para usar
los cebadores y muestras de HA o bien los cebadores y muestras de TK
para detectar el virus de la viruela en una muestra biológica. Los
artículos de fabricación pueden incluir además reactivos para llevar
a cabo los métodos que aquí se indican (por ejemplo, tampones,
enzimas de polimerasa, co-factores, o agentes para
impedir la contaminación). Dichos reactivos pueden ser específicos
para uno de los instrumentos disponibles en el mercado que aquí se
describen.
La invención se describirá seguidamente en los
siguientes ejemplos, que no limitan el objetivo de la invención
descrito en las reivindicaciones.
Ejemplo
1
El ácido nucleico se extraía de
HSV-1; HSV-2; VZV; y vacunas
(IsoQuick, Orca Research, Inc., Bothell, WA) para su uso en
valoraciones a tiempo real de la RCP. Un plásmido intacto
(CDC-HA1) que contiene una parte del gen de HA del
virus de la viruela (aproximadamente 15.000-15.300
nucleótidos del GenBank Accesión nº.X65516 y NC 001611) también se
usaba en las valoraciones a tiempo real de la RCP.
La muestra y un volumen similar de tampón de
lisis se colocaban en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Se
añadían 700 \mul de la matriz de extracción y 400 \mul del
tampón de extracción y el tubo se centrifugaba durante 5 minutos a
13.000 rpm. La capa acuosa superior se colocaba en un tubo nuevo y
1/10 del volumen de acetato de sodio, 2 \mul de glucógeno, y un
volumen igual de alcohol de isopropilo. Entonces se centrifugaba el
tubo durante 10 minutos a 13.000 rpm. El alcohol se vertía y se
añadían 2 volúmenes de etanol del 70%; el tubo se centrifugaba
luego durante 5 minutos a 13.000 rpm. El etanol se aspiraba del tubo
y los gránulos se volvían a suspender en 100 \mul de agua libre
de ribonucleasa.
Ejemplo
2
El instrumento LightCycler^{TM} puede
amplificar ácidos nucleicos de referencia en unos
30-40 minutos y controla el desarrollo de la RCP
mediante un ensayo de fluorescencia después de cada etapa de
ciclación (amplificación e hibridación). Todas las muestras son
amplificadas por el LightCycler^{TM} PCR con cebadores dirigidos
tanto a la hemaglutinina (HA) como a la timidincinasa (TK). Un
primer conjunto de cebadores y muestras se dirige a una primera
parte del gen HA (HA1) del virus de la vacuna, mientras que un
segundo grupo de cebadores y muestras se dirige a una segunda parte
del gen HA(HA2) del virus de la vacuna. La secuencia de
nucleótidos del virus de la vacuna HA es homóloga al HA del virus
de la viruela. Un tercer grupo de cebadores y muestras se dirige al
gen TK del virus de la vacuna. La secuencia de nucleótidos del virus
de la vacuna TK es homóloga al TK del virus de la viruela a
excepción de dos pares de bases. El virus de la viruela se puede
diferenciar del virus de la vacuna en base a la curva de fusión de
las muestras del producto de amplificación respectivo.
Los cebadores de la RCP para la detección del
ADN del virus de la viruela dirigidos al HA se diseñaban usando el
programa OLIGO. Los cebadores y las muestras dirigidos a una primera
parte del HA(HA1) tenían las secuencias siguientes: sense,
5'-CTA ATA TCA TTA GTA TAC GCT ACA
C-3'(SEQ ID NO:1); antisense, 5'-GAG
TCG TAA GAT ATT TTA CC-3'(SEQ ID NO:2); y muestras
5'-AAT GAT TAT GTT GTT ATG AGT GCT
TG-fluoresceína-3' (SEQ ID NO:3) u
5'-Red 640-TAT AAG GAG
CCCAATTCCATTATTCT-fosfato-3'(SEQ ID
NO:4). La amplificación del ADN del virus de la viruela usando
cebadores de HA1 generaba un producto de amplificación de 204 bp.
Los cebadores y las muestras dirigidos a una segunda parte del
HA(HA2) tenían las secuencias siguientes: sense,
5'-ATA GTG AAT CGA CTA TAG ACA TAA
TA-3' (SEQ ID NO:5); antisense,
5'-TTG ATT TAG TAG TGA CAA TTC
C-3'
(SEQ ID NO:6); y las muestras 5'-CTG TCA CAT ACA CTA GTG ATA TCA TT-fluoresceína-3'(SEQ ID NO:7); y 5'-Red 640-ATA CAG TAA GTA CAT CAT CTG GAG AA-fosfato-3'(SEQ ID NO:8). La amplificación del virus de la viruela ADN usando cebadores de HA2 generaba un producto de amplificación de 326 bp.
(SEQ ID NO:6); y las muestras 5'-CTG TCA CAT ACA CTA GTG ATA TCA TT-fluoresceína-3'(SEQ ID NO:7); y 5'-Red 640-ATA CAG TAA GTA CAT CAT CTG GAG AA-fosfato-3'(SEQ ID NO:8). La amplificación del virus de la viruela ADN usando cebadores de HA2 generaba un producto de amplificación de 326 bp.
Los cebadores y las muestras para la detección
del ADN del virus de la viruela usando TK se diseñaban utilizando
el software OLIGO (Molecular Biology Insights, Inc.,Cascade, CO) y
tenían las secuencias siguientes: sense, 5'-AAG GAC
AGT TCT TTC CAG-3'(SEQ ID NO:9); antisense,
5'-TGA TAC ATA TCA TTA CCT CCT A-3'
(SEQ ID NO:10); y las muestras 5'-CCG TTT AAT AAT
ATC TTG GAT CTT-fluoresceína-3'(SEQ
ID NO:11); y 5'-Red 640-TTC CAT TAT
CTG AAA TGG TGG T-fosfato-3'(SEQ ID
NO:12). Alternativamente, las muestras de TK que tienen las
secuencias siguientes se utilizaban para detectar el producto de
amplificación TK: 5'-GAC ATT TCA ACG TAA ACC FTT
TAA-fluoresceína-3'(SEQ ID NO:13) y
5'-Red 640-AAT ATC TTG GAT CTT ATT
CCA TTA TCT G-fosfato-3'(SEQ ID
NO:14). La amplificación del virus de la viruela ADN usando dichos
cebadores de TK generaba un producto de amplificación de 250 bp.
Cada conjunto de muestras de hibridación (es
decir, muestras HA y TK) contenía un fluoroforo donante
(fluoresceína) en el extremo 3' de una muestra, que cuando se
excitaba mediante una fuente de luz externa emitía luz que era
absorbida por un fluoroforo aceptor correspondiente
(LC-Red 640) en el extremo 5' de la segunda muestra
de hibridación.
Para la valoración de la RCP a tiempo real se
añadían 5 \mul de cada muestra de ácido nucleico de un PCR Master
Mix a cada capilar de reacción. Un control sin patrón recibe 15
\mul de mezcla de reacción con 5 \mul de agua. El PCR Master
Mix es optimizado para el LightCycler^{TM} y contiene lo
siguiente: 0,2 mM de trifosfatos de desoxiribonucleósido (50 mM
KCl, 10 mM tris-Cl (pH 8,3)), MgCl_{2} 4mM, 0,7
\muM de cebadores, 0,025% de albúmina de suero
bovino(BSA), 0,2 \muM de muestra de fluoresceína, 0,4
\muM de CL-Red 640-muestra, 2% de
DMSO, 0,2% de uracilo-ADN glucosilasa, y 0,03
unidades/ml de platino Taq (Perkin-Elmer
Corp.,Branchburg, NJ). Los reactivos de RCP y el extracto de
muestras son centrifugados en el capilar para facilitar la mezcla.
Todos los capilares se asientan luego y se colocan en el aparato
LightCycler.
Las muestras son tratadas inicialmente a unos
37ºC durante 5 minutos en presencia de uracilo-DNA
glucosilasa. La uracilo-ADN glucosilasa es luego
inactivada calentando las muestras durante unos 3 minutos a
aproximadamente 95ºC, después de los cual las muestras se someten a
45 ciclos de: desnaturalización a aproximadamente 95ºC durante 10
segundos seguida de la hibridación del cebador con el ácido nucleico
patrón durante unos 15 segundos a aproximadamente 55ºC (durante lo
cual se recoge la señal de tiempo) y elongación de las ramas recién
sintetizadas a aproximadamente 72ºC durante unos 15 segundos. Luego
se determina la curva de fusión calentando a aproximadamente 95ºC
seguido inmediatamente de aproximadamente 1 minutos a unos 45ºC. La
temperatura se incrementa luego a unos 78ºC a una velocidad de
0,2ºC por segundo (durante dicho tiempo se recoge la señal). La
muestra se mantiene luego a 40ºC durante unos 30 segundos.
Ejemplo
3
Los ensayos habituales de la viruela (por
ejemplo, cultivos celulares o reconocimiento morfológico por
microscopía electrónica) requieren unos servicios Biosafety
Level-4(BS-4). El proceso de
autoclave de las muestras biológicas previo al análisis permitiría
que las instalaciones BS-2 realizaran unas pruebas
de la viruela. Se examinaban los ácidos nucleicos de los virus
relacionados con la viruela (por ejemplo, HSV y vacuna) para
confirmar la viabilidad del ácido nucleico vírico para la
amplificación del PCR posterior al proceso de autoclave (por
ejemplo, 121ºC; 15 minutos; 20 psi).
Las muestras se sembraban con el virus de la
vacuna (VV), HSV o VZV. Se sembraban un total de 30 extensiones
culturette con cinco diluciones de cada suspensión vírica (VV, HSV,
VZV). Los cultivos se colocaban en viales de vidrio y se sellaban
con tapones de rosca. Quince muestras se colocaban en un autoclave;
las otras 15 se llevaban a temperatura ambiente. Posteriormente,
todos los cultivos se colocaban en viales de vidrio y se sellaban
con tapones de rosca. Quince muestras se colocaban en un autoclave;
las otras 15 se llevaban a temperatura ambiente. Posteriormente,
todos los culturettes se colocaban en 2 ml de un medio sin suero.
Los extractos de ácido nucleico de todas las muestras (200 cl) se
analizaban mediante LightCyclerPCR específico para cada referencia
del virus. Del mismo modo, todas las muestras (200 cl) se inoculaban
en cultivos celulares que se incubaban a 36ºC y se examinaban
diariamente durante 5 (VV, HSV) o bien 10 (VZV) días en busca de la
presencia de efectos citopáticos característicos. Las condiciones
de la PCR para detectar VV, HSV y VZV con o sin autoclave se han
descrito en el ejemplo 2, a excepción de que la temperatura máxima
para la determinación de la curva de fusión era de 80ºC.
La esterilización en autoclave eliminaba la
infección de los tres virus tal como muestran las tablas 1 y 2. El
ADN de los tres virus se detectaba mediante LightCycler PCR en las
muestras de la autoclave (VV, 7/15; HSV, 11/15; VZV, 10/15) y en
las muestras no esterilizadas en autoclave (vv, 6/15; HSV, 9/15;
VZV, 8/15). Las muestras de HSV y VV (no esterilizadas en
autoclave) detectadas por LightCycler PCR también se detectaban en
los cultivos celulares.
| Procedimiento | Resultados del | Infección en | |||
| LightCycler PCR | cultivos celulares | ||||
| Nr. muestras | En autoclave | Ácidos nucleicos | Pos | Neg | |
| extraídos | |||||
| 15 | Si | Si | 11 | 4 | 0 |
| 15 | No | Si | 9 | 6 | 9 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Procedimiento | Resultados del | Infección en | |||
| LightCycler PCR | cultivos celulares | ||||
| Nr. muestras | En autoclave | Ácidos nucleicos | Pos | Neg | |
| extraídos | |||||
| 15 | Si | Si | 7 | 8 | 0 |
| 15 | No | Si | 6 | 9 | 6 |
Se da por entendido que mientras se describe la
invención junto con la descripción detallada de la misma, la
descripción mencionada pretende ilustrar y no limitar el objetivo de
la invención, que ha sido definido por las reivindicaciones
adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones se encuentran
dentro del objetivo de las reivindicaciones siguientes.
<110> Roche Diagnostics GMBH
\hskip1cmMayo Foundation for Medical Education and Research
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Detección del virus de la
viruela
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 21434 EP
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/338.237
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-11-02
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/341.601
\vskip0.400000\baselineskip
<151>2001-12-17
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente Ver.2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210>1
\vskip0.400000\baselineskip
<211>25
\vskip0.400000\baselineskip
<212>AND
\vskip0.400000\baselineskip
<213>Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400>1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaatatcat tagtatacgc tacac
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>2
\vskip0.400000\baselineskip
<211>21
\vskip0.400000\baselineskip
<212>ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213>Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagtcgtaag atattttatc c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>3
\vskip0.400000\baselineskip
<211>26
\vskip0.400000\baselineskip
<212>ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213>Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatgattatg ttgttatgag tgcttg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>4
\vskip0.400000\baselineskip
<211>26
\vskip0.400000\baselineskip
<212>ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213>Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptataaggagc ccaattccat tattct
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>5
\vskip0.400000\baselineskip
<211>26
\vskip0.400000\baselineskip
<212>ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213>Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatagtgaatc gactatagac ataata
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>6
\vskip0.400000\baselineskip
<211>26
\vskip0.400000\baselineskip
<212>ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213>Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgatttagt agtgacaatt cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>7
\vskip0.400000\baselineskip
<211>26
\vskip0.400000\baselineskip
<212>ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213>Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtcacata cactagtgat atcatt
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>8
\vskip0.400000\baselineskip
<211>26
\vskip0.400000\baselineskip
<212>ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213>Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatacagtaag tacatcatct ggagaa
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>9
\vskip0.400000\baselineskip
<211>18
\vskip0.400000\baselineskip
<212>ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213>Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggacagtt ctttccag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>10
\vskip0.400000\baselineskip
<211>22
\vskip0.400000\baselineskip
<212>ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213>Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgatacatat cattacctccta
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>11
\vskip0.400000\baselineskip
<211>24
\vskip0.400000\baselineskip
<212>ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213>Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgtttaata atatcttgga tctt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>12
\vskip0.400000\baselineskip
<211>22
\vskip0.400000\baselineskip
<212>ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213>Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttccattatc tgaaatggtg gt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>13
\vskip0.400000\baselineskip
<211>24
\vskip0.400000\baselineskip
<212>ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213>Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatatcttgg atcttattcc attatctg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (3)
1. Un método para detectar la presencia o
ausencia del virus de la viruela en una muestra biológica de un
individuo, que comprende:
realizar al menos una etapa de ciclación, donde
una etapa de ciclación comprende una etapa de amplificación y una
etapa de hibridación, donde dicha etapa de amplificación comprende
poner dicha muestra en contacto con un par de cebadores de
hemaglutinina (HA) para producir un producto de amplificación de HA
si una molécula de ácido nucleico de HA del virus de la viruela
está presente en dicha muestra, donde dicha etapa de hibridación
comprende poner dicha muestra en contacto con un par de muestras de
HA, donde los elementos de dicho par de muestras de HA forman
híbridos con no más de cinco nucleótidos de cada uno, donde una
primera muestra de HA de dicho par de muestras de HA se etiqueta
con una mitad fluorescente donante y dicha segunda muestra de HA de
dicho par de muestras de HA se etiqueta con una mitad fluorescente
del aceptor correspondiente; y
detectar la presencia o ausencia de la
transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET)
entre dicha mitad fluorescente del donante y dicha primera muestra
de HA y dicha mitad fluorescente del aceptor y dicha segunda
muestra de HA.
donde la presencia de FRET es indicativa de la
presencia del virus de la viruela en dicha muestra biológica, y
donde la ausencia del FRET es indicativa de la ausencia del virus de
la viruela en dicha muestra biológica,
que además comprende las etapas de
realizar al menos una etapa de ciclación, donde
dicha etapa de ciclación comprende una etapa de amplificación y una
etapa de hibridación, producir un producto de amplificación TK si
una molécula de ácido nucleico de TK del virus de la viruela está
presente en dicha muestra, donde dicha etapa de hibridación
comprende poner dicha muestra en contacto con un par de muestras de
TK, donde los elementos de dicho par de muestras de TK forman
híbridos con no más de cinco nucleótidos de cada uno, donde una
primera muestra de TK de dicho par de muestras de TK se etiqueta
con una mitad fluorescente donante y dicha segunda muestra de TK de
dicho par de muestras de TK se etiqueta con una mitad fluorescente
aceptor correspondiente; y
detectar la presencia o ausencia de FRET entre
dicha mitad fluorescente donante de dicha primera muestra de TK y
dicha mitad fluorescente aceptor de dicha segunda muestra de TK.
2. El método de la reivindicación 1, donde dicha
muestra biológica se elige del grupo formado por las extensiones
dérmicas, el fluido cerebroespinal, el tejido gangliónico, el tejido
cerebral, el fluido ocular, sangre, esputo, lavado
bronquio-alveolar, aspirados bronquiales, tejido
pulmonar y orina.
3. El método de la reivindicación 1, donde dicha
etapa de ciclación se lleva a cabo en una muestra de control.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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