CN114867871A - 用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开描述了用于快速检测生物样品或非生物样品中存在或不存在含有mecA和/或mecC的金黄色葡萄球菌(mecA/mecC‑MRSA)的方法。所述方法可包括执行扩增步骤、杂交步骤和检测步骤。此外，本公开提供了引物、靶向mecA‑MRSA和mecC‑MRSA的基因的探针以及设计用于检测mecA/mecC‑MRSA的试剂盒。

Description

用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的组合物和方法
技术领域
本公开涉及细菌诊断领域，且更特别地涉及检测含有mecA和mecC的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)核酸序列。
背景技术
金黄色葡萄球菌(“S.aureus”或“SA”)是一种兼性厌氧革兰氏阳性细菌，其天然宿主包括人体皮肤和鼻子，也可以寄生于伤口。大多数携带金黄色葡萄球菌的人没有感染迹象；但是，如果正常屏障被破坏，金黄色葡萄球菌可能会侵入并导致体内感染。金黄色葡萄球菌可引起许多疾病，从轻微的皮肤感染(诸如丘疹、疖子和脓肿)到重大疾病(诸如肺炎、脑膜炎和败血症)。当屏障被破坏时，皮肤和鼻子以外的组织可能会受到感染，例如皮肤或粘膜内层，这会导致疖和痈。金黄色葡萄球菌感染可通过与感染者的皮肤接触或接触感染者使用的物品在人与人之间传播。
金黄色葡萄球菌具有对主要抗生素(包括青霉素(甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林和氟氯西林))产生耐药性的显著能力，这使其获得了“超级细菌”的标签。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是一种对青霉素产生耐药性的细菌，它导致了几种难以治疗的人类感染。MRSA也可称为耐苯唑西林金黄色葡萄球菌(ORSA)和多重耐药性金黄色葡萄球菌，而金黄色葡萄球菌的非甲氧西林耐药菌株有时被称为对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)。
葡萄球菌中甲氧西林耐药性所需的基因，mecA，编码低亲和力青霉素结合蛋白2a(PBP2a)(Niemeyer et a1.，J.Bacteriol.，(1996)，178(18)：5464-5471)。mecA(mecALGA251)的新变体，已重命名为mecC，最近在金黄色葡萄球菌分离株中发现来自人和动物两者(Harrison等人，Antimicrob.Agents Chemother.，(2013)，57(3)：1524-1528)。该同源物与mecA基因有70％的核苷酸同一性，并且它的存在带来了诊断问题，可能被误诊为对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(Paterson等人，Trends Microbiol.，(2014)，22(1)：42-47)。因此，本领域需要一种快速且可靠的方法以灵敏的方式特异性地检测含有mecA-和mecC两者的MRSA。
发明内容
本公开中的某些实施例涉及用于例如通过单个试管中的实时聚合酶链反应进行mecA/mecC-MRSA的多重检测用于快速检测生物样品或非生物样品中存在或不存在含有mecA-或mecC金黄色葡萄球菌(mecA/mecC-MRSA)的方法。实施例包括检测mecA/mecC-MRSA的方法，这些方法包括执行至少一个循环步骤，该循环步骤可包括扩增步骤和杂交步骤。进一步，实施例包括被设计用于在单管中检测mecA/mecC-MRSA的引物、探针和试剂盒。检测方法被设计用于靶向mecA基因或mecC基因，从而在单次测试中使得一者检测mecA/mecC-MRSA。
在一个方面，提供了一种用于检测样品中含有mecA和/或mecC的金黄色葡萄球菌的方法，该方法包括执行扩增步骤，该扩增步骤包括使样品与一对mecA-MRSA引物和/或一对mecC-MRSA引物接触，如果样品中存在mecA和/或mecC-MRSA，则产生扩增产物；执行杂交步骤，该杂交步骤包括使扩增产物与一种或多种可检测的mecA-MRSA探针和/或一个或多个可检测的mecC-MRSA探针接触；以及检测存在或不存在的扩增产物，其中扩增产物的存在指示样品中的mecA和/或mecC-MRSA的存在，且其中扩增产物的不存在指示样品中mecA和/或mecC-MRSA的不存在。在本文中，mecA-MRSA引物对可以包含正向引物或者由该正向引物组成，该正向引物包含SEQ ID NO：1的核酸序列或其互补序列或者由该核酸序列或其互补序列组成，以及反向引物包含SEQ ID NO：2的核酸序列或其互补序列或者由该核酸序列或其互补序列组成；和/或mecC-MRSA引物对可以包含正向引物或者由该正向引物组成，该正向引物包含选自由SEQ ID NO：3或4组成的组的核酸序列或其互补序列或者由该核酸序列或其互补序列组成，以及反向引物，该反向引物包含SEQ ID NO：5的核酸序列或其互补序列或者由该核酸序列或其互补序列组成。进一步，一个或多个可检测的mecA-MRSA探针可以包含SEQ ID NO：6的核酸序列或其互补序列或者由该核酸序列或其互补序列组成，和/或一个或多个可检测的mecC-MRSA探针可以包含SEQ ID NO：7的序列或其互补序列或者由该序列或其互补序列组成。
在一个方面，用于扩增mecA/mecC-MRSA基因靶标的引物组包括SEQ ID NO：1、2、3、4和5或其互补组；以及用于检测mecA/mecC-MRSA扩增产物的可检测探针包括SEQ ID NO：6和7的核酸序列或其互补序列。
其他方面提供了包含或由选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7的核酸序列或其互补序列组成的寡核苷酸，该寡核苷酸具有100个或更少的核苷酸。在另一方面，本公开提供了一种寡核苷酸，该寡核苷酸包括与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7中的一个或其互补序列具有至少70％序列同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％或95％等)的核酸，该寡核苷酸具有100个或更少的核苷酸。一般来讲，在这些实施方案中，这些寡核苷酸可以是引物核酸、探针核酸等。在某些这些实施例中，寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸(例如35个或更少的核苷酸、30个或更少的核苷酸等)。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸，例如以相对于未经修饰的核苷酸改变核酸杂交稳定性。任选地，寡核苷酸包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包括至少一种保守修饰的变异。特定核酸序列的“保守修饰的变异”或简称为“保守变异”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者在核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本上相同的序列。本领域技术人员将认识到，在编码的序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小部分的氨基酸(通常小于5％，更通常小于4％、2％或1％)的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的变异”，其中这些改变导致缺失氨基酸、添加氨基酸或用化学上类似的氨基酸取代氨基酸。
在一方面，扩增可以采用具有5′至3′核酸酶活性的聚合酶。因此，第一荧光部分和第二荧光部分可以在沿着探针长度彼此相距不超过8个核苷酸。另一方面，mecA-MRSA和mecC-MRSA探针包括允许二级结构形成的核酸序列。这种二级结构形成通常会导致第一荧光部分与第二荧光部分之间的空间接近。根据该方法，探针上的第二荧光部分可以是猝灭剂。
本公开提供了用于检测来自个体的生物样品中的mecA/mecC-MRSA的存在或不存在的方法。此类方法通常包括进行至少一个循环步骤，该循环步骤包括扩增步骤和染料结合步骤。通常，如果mecA/mecC-MRSA核酸分子存在于样品中，扩增步骤包括使样品与多对mecA-MRSA引物和mecC-MRSA引物接触以产生一个或多个mecA/mecC-MRSA扩增产物，且染料结合步骤包括使mecA/mecC-MRSA扩增产物与双链DNA结合染料接触。此类方法还包括检测双链DNA结合染料与扩增产物结合的存在或不存在，其中结合的存在指示样品中存在mecA/mecC-MRSA，并且其中结合的不存在指示样品中不存在mecC-MRSA。代表性双链DNA结合染料是溴化乙锭。另外，此类方法还可包括确定mecA/mecC-MRSA扩增产物与双链DNA结合染料之间的解链温度，其中解链温度证实mecC-MRSA的存在或不存在。
在进一步方面，提供了用于检测mecA和/或mecC-MRSA的一个或多个核酸的试剂盒。试剂盒可以包括多组mecA-MRSA和/或mecC-MRSA引物，该引物对扩增mecA基因靶标和/或mecC基因靶标特异；和一个或多个可检测的mecA-MRSA和/或mecC-MRSA探针，该探针对检测mecA/mecC-MRSA扩增产物特异。在一个方面，试剂盒可包括已经用供体和相应的受体荧光部分标记，或者可包括用于标记探针的荧光部分。该试剂盒还可包括核苷三磷酸、核酸聚合酶、和核酸聚合酶功能所需的缓冲剂。试剂盒还可包括使用引物、探针和荧光部分来检测样品中mecA/mecC-MRSA的存在或不存在的包装说明书和说明。在本文中，mecA-MRSA引物对可以包含正向引物或者由该正向引物组成，该正向引物包含SEQ ID NO：1的核酸序列或其互补序列或者由该核酸序列或其互补序列组成，以及反向引物包含SEQ ID NO：2的核酸序列或其互补序列或者由该核酸序列或其互补序列组成；和/或mecC-MRSA引物对可以包含正向引物或者由该正向引物组成，该正向引物包含选自由SEQ ID NO：3或4组成的组的核酸序列或其互补序列或者由该核酸序列或其互补序列组成，以及反向引物，该反向引物包含SEQID NO：5的核酸序列或其互补序列或者由该核酸序列或其互补序列组成。进一步，一个或多个可检测的mecA-MRSA探针可以包含SEQ ID NO：6的核酸序列或其互补序列或者由该核酸序列或其互补序列组成，和/或一个或多个可检测的mecC-MRSA探针可以包含SEQ ID NO：7的序列或其互补序列或者由该序列或其互补序列组成。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语所具有的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。尽管可在本主题的实践或测试中使用与本文所述的方法和材料类似或等效的方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，而不旨在限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其全文合并于本文。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。
本发明的一个或多个实施方案的细节在附图和以下描述中阐述。本发明的其他特征、目的和优点将从附图和具体实施方式以及从权利要求中显而易见。
附图说明
图1示出了用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的几个靶基因的相对位置。本公开的引物和探针靶向mecA/mecC基因。
图2示出了使用对mecA MRSA(MRSA菌株12770)特异性的mecA引物和探针在每个反应100和10个拷贝处的实验的PCR生长曲线。生长曲线不是S形。
图3示出了使用引物/探针的实验的PCR生长曲线，该引物/探针对MRSA菌株上的含有mecA(菌株10714、10817、12270)、mecC(菌株12756)的mecA MRSA具有特异性，或对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA，菌株10853)具有特异性。
图4示出了使用对携带mecC的菌株12756和12765上的mecC MRSA特异性的引物/探针的实验的PCR生长曲线。
具体实施方式
通过核酸扩增的MRSA感染的诊断提供了一种快速且准确地检测细菌感染的方法。本文描述了一种用于检测样品中mecA/mecC-MRSA的实时测定。提供了用于检测mecA/mecC-MRSA的引物和探针，以及含有此类引物和探针的制品或试剂盒。与其他方法相比，用于检测mecA/mecC-MRSA的实时PCR灵敏度高，以及包括样品容纳和扩增产物的实时检测的实时PCR特征改进，使该技术在临床实验室中实施用于mecA/mecC-MRSA感染的常规诊断变得可行。
耐甲氧西林基因mecA及其同源物mecC两者均编码改变的耐甲氧西林青霉素结合蛋白(PBP2a或PBP2′)，这是一种青霉素结合蛋白，具有对β-内酰胺环(β-内酰胺抗生素诸如青霉素、头孢菌素和碳青霉烯类的主要活性位点)降低的亲和力(Guignard等人，2005，CurrOpin Pharmacol 5(5)：479-89)，即不存在于易感菌株中，并且被认为是从远缘相关物种中获得的。mecA和mecC两者都携带移动遗传元件，即MRSA菌株的葡萄球菌染色体盒mec(SCCmec)。SCC元件也存在于敏感的金黄色葡萄球菌但不携带mecA基因或mecC基因或携带非功能性mecA或mecC基因。这种菌株可能是假阳性结果的来源，因为它们可能具有相同的右端连接处。
通过检测mecA基因或mecC基因和金黄色葡萄球菌特异性基因从鼻标本中检测MRSA有时会导致低阳性预测值(PPV)，因为存在不同数量的非耐药性金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCoNS)两者。由于两个靶标的存在，它们的组合与MRSA无法区分。根据MRSA的流行情况，这种情况会导致高达30％的假阳性结果。为了获得更好的PPV，选择的靶标需要对MRSA是特有的。目前已知的唯一靶标是葡萄球菌染色体盒(SCCmec)，它扩增了携带mecC基因的遗传元件的转座子整合位点。
SCCmec是MRSA的SCC元件(具有功能性mecA基因或mecC基因)，是高度可变长度(16kb-67 kb)的转座子，该转座子集成到含有mecC基因的金黄色葡萄球菌(orfX)的开放阅读框X的3′部分。OrfX在金黄色葡萄球菌中没有定义的功能，并且是金黄色葡萄球菌特有的。SCCmec的集成创建了MRSA特有的特征。
SCCmec元件有两个基本组分；ccr基因复合体(ccr)和mec基因复合体(mec)。ccr基因复合体由ccr基因和周围的开放阅读框(ORF)组成，且mec基因复合体由mecC基因、调控基因和插入mecC上游或下游序列组成。
MRSA的分类可以基于MRSA的不同基因型。基于基因型的MRSA检测和分类的一个靶标可能是SCCmec的右端连接处(RE)。因此，这种MRSA分型相关的方法称为RE(SCCmec右端)分型。这种分型方法利用了SCCmec不同类型中与整合位点邻近的SCCmec DNA右端的多态性。
含有mecA/mecC的金黄色葡萄球菌(mecC-MRSA)的检测利用在金黄色葡萄球菌orfX基因和携带mecA基因或mecC基因的SCCmec之间的RE连接处以产生扩增子的策略，赋予甲氧西林耐药性。为此，将一个引物锚定在金黄色葡萄球菌的orfX基因的高度保守区域(orfX引物)，且第二引物位于SCCmec(RE引物)的非保守RE连接处内。从两个引物得到的扩增子跨越orfX基因的一部分和SCCmec的一部分。由于RE连接处SCCmec的非同源性质，需要几种不同的RE引物以便实现特有MRSA菌株的最大覆盖。mecA/mecC-MRSA的这种类型的鉴定和检测已被几个小组描述，例如在Huletsky等人的美国专利7,449,289和美国专利7,838,221中；在Aichinger等人的美国专利8,535,888中；以及在Johnson等人的美国专利9,920,381和美国专利10,190,178中，这些专利中的每一个通过引用整体并入本文。然而，如前所述，如果mecA基因或mecC基因缺失(全部或部分)或为非功能性，则此策略可能是假阳性结果的来源。
所公开的方法可包括执行至少一个循环步骤，该循环步骤包括使用一对或多对mecA-MRSA和/或mecC-MRSA引物从样品扩增mecA/mecC-MRSA核酸分子基因靶标的一个或多个部分。如本文所用，“mecA-MRSA引物”或“mecC-MRSA引物”是指与SCCmec盒内MRSA中的编码mecA或mecC的核酸序列特异性退火的寡核苷酸引物，并由此在适当条件下启动DNA合成。所讨论的mecA-MRSA引物或mecC-MRSA引物中的每一种与相应mecA/mecC-MRSA靶核酸分子内或邻近的靶标退火，使得每种扩增产物的至少一部分含有对应于靶标的核酸序列。如果样品中存在mecA/mecC核酸中的一个或多个，则产生mecA/mecC-MRSA扩增产物中的一个或多个，因此mecA/mecC-MRSA扩增产物中的一个或多个的存在指示样品中存在mecA/mecC-MRSA。扩增产物应含有与用于mecA-MRSA或用于mecC-MRSA的一种或多种可检测探针互补的核酸序列。每个循环步骤包括扩增步骤、杂交步骤和检测步骤，其中使样品与用于mecA-MRSA或用于mecC-MRSA的一个或多个可检测探针接触以检测样品中存在或不存在mecA/mecC-MRSA。
如本文所用，术语“扩增”是指合成与模板核酸分子(例如，mecA或mecC)的一条或两条链互补的核酸分子的过程。扩增核酸分子通常包括使模板核酸变性，在低于引物解链温度的温度下使引物与模板核酸退火，以及从引物酶促延伸以生成扩增产物。扩增通常需要存在三磷酸脱氧核糖核苷、DNA聚合酶(例如
Figure BDA0003715891730000081
Taq)以及用于优化聚合酶活性的适当缓冲剂和/或辅因子(例如MgCl2和/或KCl)。
如本文所用的术语“引物”是本领域技术人员已知的，并且指能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成的寡聚化合物，主要是指寡核苷酸，但也指经修饰的寡核苷酸，即例如寡核苷酸的3′-端提供游离3′-OH基团，另外的“核苷酸”可通过模板依赖性DNA聚合酶附接到该基团，从而建立3’至5’磷酸二酯键，其中使用三磷酸脱氧核苷并由此释放焦磷酸盐。因此，除了可能的预期功能之外，“引物”、“寡核苷酸”或“探针”之间没有根本区别。
术语“杂交”是指一种或多种探针与扩增产物的退火。杂交条件通常包括低于探针解链温度但避免探针非特异性杂交的温度。
术语“5′至3′核酸酶活性”是指核酸聚合酶的通常与核酸链合成相关的活性，由此从核酸链的5′端去除核苷酸。
术语“热稳定聚合酶”是指热稳定的聚合酶，即该酶催化与模板互补的引物延伸产物的形成，并且在经受升高的温度持续实现双链模板核酸变性所需的时间时不会不可逆地变性。一般来讲，合成在每个引物的3′端起始，并且沿着模板链在5′至3′方向上进行。已经从黄栖热菌(Thermus flavus)、红栖热菌(Truber)、嗜热栖热菌(Tthermophilus)、水生栖热菌(T.aquaticus)、乳栖热菌(Tlacteus)、红色栖热菌(Trubens)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)分离热稳定聚合酶。然而，非热稳定的聚合酶也可用于PCR测定中，条件是补充该酶。
术语“其互补序列”是指与给定核酸长度相同并且完全互补的核酸。
当关于核酸使用时，术语“延伸”或“延长”是指将另外的核苷酸(或其他类似分子)掺入核酸中。例如，核酸任选地通过核苷酸掺入生物催化剂(诸如通常在核酸的3′末端添加核苷酸的聚合酶)延伸。
在两个或更多个核酸序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指当进行比较和比对以获得最大对应性(例如，如使用技术人员可用的序列比较算法中的一种或通过视觉检查所测量的)时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同核苷酸。适于测定序列同一性百分比和序列相似性的示例性算法是在例如以下文献中描述的BLAST程序：Altschul等人(1990)“Basic local alignment search tool”J.Mol.Biol.215：403-410；Gish等人(1993)“Identification 0f protein codingregions by database similarity search”Nature Genet.3：266-272；Madden等人(1996)“Applications of network BLAST server”Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul等人(1997)“Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database searchprograms”Nucleic Acids Res.25：3389-3402；以及Zhang等人(1997)“PowerBLAST：A newnetwork BLAST application for interactive or automated sequence analysis andannotation”Genome Res.7：649-656，这些文献各自以引用方式并入本文。
在寡核苷酸的上下文中，“经修饰的核苷酸”是指其中寡核苷酸序列的至少一个核苷酸被为寡核苷酸提供所需性质的不同核苷酸替换的改变。在本文所述的寡核苷酸中，可被取代的示例性修饰的核苷酸包括例如C5-甲基-dC、C5-乙基-dC、C5-甲基-dU、C5-乙基-dU、2，6-二氨基嘌呤、C5-丙炔基-dC、C5-丙炔基-dU、C7-丙炔基-dA、C7-丙炔基-dG、C5-炔丙基氨基-dC、C5-炔丙基氨基-dU、C7-炔丙基氨基-dA、C7-炔丙基氨基-dG、7-脱氮-2-脱氧黄嘌呤核苷、吡唑并嘧啶、假-dU、硝基吡咯、硝基吲哚、2′-O-甲基核糖-U、2′-O-甲基核糖-C、N4-乙基-dC、N6-甲基-dA等。可在寡核苷酸中被取代的许多其他经修饰的核苷酸在本文中提及或在本领域中另外已知。在某些实施方案中，经修饰的核苷酸取代相对于相应的未经修饰的寡核苷酸的解链温度修饰寡核苷酸的解链温度(Tm)。为了进一步说明，在一些实施方案中，某些经修饰的核苷酸取代可减少非特异性核酸扩增(例如，最小化引物二聚体形成等)，增加预期的靶扩增子的产量等。这些类型的核酸修饰的示例在例如美国专利号6,001,611(通过引用并入本文)中描述。
含有mecA或mecC的金黄色葡萄球菌(mecA/mecC-MRSA)
本公开提供了通过扩增，例如mecA或mecC核酸序列的一部分来检测mecA/mecC-MRSA的方法。mecA/mecC-MRSA的各种亚型的SCCmec的核酸序列是可用的(例如，用于mecA的GenBank登录号AY786579和用于mecC的FR823292)。具体地，通过本公开的实施例提供了扩增和检测mecA/mecC-MRSA核酸分子靶标的引物和探针。
为了检测mecC-MRSA，提供了扩增mecA-MRSA基因和/或mecC-MRSA基因的引物和探针。mecA/mecC-MRSA核酸除本文示例的那些之外，也可用于检测样品中的mecA/mecC-MRSA。例如，本领域技术人员可使用常规方法来评价功能性变体的特异性和/或灵敏度。代表性功能变体可包括例如本文所公开的mecA/mecC-MRSA核酸中的一个或多个缺失、插入和/或取代。
更具体地，寡核苷酸的实施例各自包括具有选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7，其基本上相同的变体的序列的核酸，其中该变体与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7中的一者或SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7和变体的互补序列具有至少例如80％、90％或95％的序列同一性。
表I：mecA/mecC-MRSA引物和探针
Figure BDA0003715891730000101
LCR640＝LightCycler Red 640；IB RQ＝Iowa Black RQ
在一个实施例中，使用上述mecA-MRSA和mecC-MRSA引物和探针组以提供怀疑含有mecA/mecC-MRSA的生物样品中的mecA/mecC-MRSA的检测。引物和探针组可包含对mecA-MRSA基因具有特异性或对mecC-MRSA基因核酸序列具有特异性的引物和探针或者由该引物和探针组成，该引物和探针包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7的核酸序列或者由该核酸序列组成。在另一实施例中，mecA/mecC-MRSA靶标的引物和探针包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7中的任何引物和探针的功能活性变体或者由该功能活性变体组成。
可通过在所公开的方法中使用引物和/或探针来鉴定SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7中的任何引物和/或探针的功能活性变体。与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7的相应序列相比，SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7中的任一者的引物和/或探针的功能活性变体涉及在所描述的方法或试剂盒中提供相似或更高特异性和灵敏度的引物和/或探针。
变体可例如通过一个或多个核苷酸添加、缺失或取代(诸如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7的相应序列的5’端和/或3’端处的一个或多个核苷酸添加、缺失或取代)而与SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6和7的序列不同。如上所述，引物(和/或探针)可以是经化学修饰的，即引物和/或探针可包含经修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。探针(或引物)则是经修饰的寡核苷酸。“经修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)与天然“核苷酸”的不同之处在于一些修饰，但仍由碱基或碱基样化合物、戊呋喃糖基糖或戊呋喃糖基糖样化合物、磷酸部分或磷酸样部分或它们的组合组成。例如，可将“标记”附接到“核苷酸”的碱基部分，由此获得“经修饰的核苷酸”。“核苷酸”中的天然碱基也可被例如7-去氮杂嘌呤替换，其中也获得“经修饰的核苷酸”。术语“经修饰的核苷酸”或“核苷酸类似物”在本申请中可互换使用。“经修饰的核苷”(或“核苷类似物”)与天然核苷的不同之处在于以如上文针对“经修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)概述的方式进行的一些修饰。
可使用例如计算机程序诸如OLIGO(Molecular Biology Insights Inc.，Cascade，Colo.)来设计扩增编码mecA-MRSA基因或mecC-MRSA基因核酸序列的核酸分子的寡核苷酸，包括经修饰的寡核苷酸和寡核苷酸类似物。当设计用作扩增引物的寡核苷酸时，重要特征包括但不限于适当大小的扩增产物以便于检测(例如，通过电泳)、一对引物的成员的相似解链温度以及每个引物的长度(即，引物需要足够长以与序列特异性退火并启动合成，但不能太长以至于在寡核苷酸合成过程中保真度降低)。通常，寡核苷酸引物的长度为8至50个核苷酸(例如，长度为8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48个或50个核苷酸)。
除了一组引物之外，这些方法还可使用一个或多个探针以便检测存在或不存在mecA/mecC-MRSA。术语“探针”是指通过设计或选择含有特异核苷酸序列的合成或生物产生的核酸(DNA或RNA)，该特异核苷酸序列允许它们在限定的预定严格性下与“靶核酸”(在本发明的情况下与mecA-MRSA(靶标)核酸和/或mecC-MRSA(靶标)核酸)特异性(即，优先)杂交。“探针”可被称为“检测探针”，意指其检测靶核酸。
在一些实施例中，所述mecA-MRSA探针和mecC-MRSA探针可用至少一种荧光标记物标记。在一个实施例中，mecA-MRSA探针和mecC-MRSA探针可用供体荧光部分(例如荧光染料)和相应的受体荧光部分(例如猝灭剂)标记。
在一个实施例中，探针包含荧光部分或者由该荧光部分组成，并且核酸序列包含SEQ ID NO：3或7或者由该核酸序列组成(无标记示出)。
设计用作探针的寡核苷酸可以类似于引物设计的方式进行。实施方案可使用单个探针或一对探针来检测扩增产物。根据实施方案，所用的探针可包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂部分。与引物一样，探针通常具有相似的解链温度，并且每个探针的长度必须足以发生序列特异性杂交，但不能太长以至于在合成过程中保真度降低。寡核苷酸探针的长度通常为15至30(例如，16、18、20、21、22、23、24或25)个核苷酸。
构建体可包括载体，每个载体含有mecA-MRSA或mecC-MRSA引物和探针核酸分子中(例如，SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7)的一者。构建体可用作例如对照模板核酸分子。适用的载体是市售的和/或通过本领域常规的重组核酸技术方法产生的。mecA-MRSA和mecC-MRSA核酸分子可通过例如化学合成、从mecA/mecC-MRSA直接克隆、或通过PCR扩增获得。
除了mecA/mecC-MRSA核酸分子(例如，含有一个或多个SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7序列的核酸分子)外，适用于所述方法的构建体通常还包括编码用于选择所需的构建体和/或转化体的可选择标志物(例如，抗生素耐药性基因)的序列以及复制起点。载体系统的选择通常取决于若干因素，包括但不限于宿主细胞的选择、复制效率、选择性、诱导性和回收的容易性。
含有mecA/mecC-MRSA核酸分子的构建体可以在宿主细胞中繁殖。如本文所用，术语宿主细胞意在包括原核生物和真核生物，诸如酵母、植物和动物细胞。原核宿主可包括大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。真核宿主包括酵母(诸如酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、毕赤酵母(Pichia pastoris))、哺乳动物细胞(诸如COS细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)、昆虫细胞和植物细胞(诸如拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Nicotiana tabacum))。可使用本领域普通技术人员公知的任何技术将构建体引入宿主细胞中。例如，磷酸钙沉淀、电穿孔、热激、脂质转染、显微注射和病毒介导的核酸转移是将核酸引入宿主细胞中的常用方法。另外，可将裸DNA直接递送到细胞(参见例如美国专利号5,580,859和5,589,466)。
聚合酶链反应(PCR)
美国美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188公开了常规的PCR技术。PCR通常采用与所选核酸模板(例如DNA或RNA)结合的两种寡核苷酸引物。在一些实施例中有用的引物包括能够充当所述mecA/mecC-MRSA核酸序列(例如，SEQ ID NO：1、2、4、5和6)内的核酸合成起始点的寡核苷酸。引物可通过常规方法从限制性消化物中纯化，或其可合成产生。引物优选地是单链的，以获得最大的扩增效率，但引物可以是双链的。首先使双链引物变性(即对其进行处理)以分离链。一种使双链核酸变性的方法是通过加热。
如果模板核酸是双链的，则必须在其可用作PCR中的模板前分离两条链。链分离可通过任何合适的变性方法完成，包括物理、化学或酶促方式。一种分离核酸链的方法涉及加热核酸直到其大部分变性(例如，大于50％、60％、70％、80％、90％或95％变性)。使模板核酸变性所需的加热条件将取决于例如缓冲盐浓度以及被变性的核酸的长度和核苷酸组成，但通常在约90℃至约105℃的范围内持续一段时间，这取决于反应的特征诸如温度和核酸长度。变性通常进行约30秒至4分钟(例如，1分钟至2分钟30秒，或1.5分钟)。
如果通过加热使双链模板核酸变性，则使反应混合物冷却至促进每个引物与所描述的mecA/mecC-MRSA核酸分子上的靶序列退火的温度。用于退火的温度通常为约35℃至约65℃(例如，约40℃至约60℃；约45℃至约50℃)。退火时间可为约10秒至约1分钟(例如，约20秒至约50秒；约30秒至约40秒)。然后将反应混合物调节至促进或优化聚合酶活性的温度，即足以从退火的引物发生延伸以生成与模板核酸互补的产物的温度。温度应足以从与核酸模板退火的每个引物合成延伸产物，但不应高到使延伸产物从其互补模板变性(例如，用于延伸的温度通常在约40℃至约80℃的范围内(例如，约50℃至约70℃；约60℃))。延伸时间可为约10秒至约5分钟(例如，约30秒至约4分钟；约1分钟至约3分钟；约1分钟30秒至约2分钟)。
PCR测定可采用mecA/mecC-MRSA核酸诸如RNA或DNA(cDNA)。模板核酸不需要纯化；其可以是复杂混合物的一小部分，诸如人类细胞中含有的mecA/mecC-MRSA核酸。mecA/mecC-MRSA核酸分子可通过常规技术从生物学样品中提取，诸如描述于DiagnosticMolecular Microbiology：Principles and Applications(Persing等人(编)，1993，American Society for Microbiology，Washington D.C.)中所描述的那些技术。核酸可以从许多来源获得，例如质粒，或天然来源，包括细菌、酵母、病毒、细胞器或高等生物，例如植物或动物。
寡核苷酸引物(例如，SEQ ID NO：1、2、4、5和6)在诱导引物延伸的反应条件下与PCR试剂组合。例如，链延伸反应通常包括50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.3)、15mM MgCl2、0.001％(w/v)明胶、0.5-1.0μg变性模板DNA、每个寡核苷酸引物50pmol、2.5U Taq聚合酶和10％DMSO)。反应通常包含150至320μM dATP、dCTP、dTTP、dGTP中的每一种或者其一种或多种类似物。
新合成的链形成可用于后续反应步骤的双链分子。链分离、退火和伸长步骤可根据需要重复多次，以产生所需数量的与靶标mecA-MRSA和/或mecC-MRSA核酸分子相应的扩增产物。反应中的限制因素是反应中存在的引物、热稳定酶和三磷酸核苷的量。优选地重复至少一次循环步骤(即变性、退火和延伸)。为了用于检测，循环步骤的次数将取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，则将需要更多的循环步骤来扩增足以进行检测的靶序列。通常，重复循环步骤至少约20次，但可重复多达40、60次或甚至100次。
荧光共振能量转移(FRET)
FRET技术(参见例如美国专利号4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603)基于这样的概念：当供体荧光部分和相应的受体荧光部分位于彼此相距一定距离内时，两个荧光部分之间会发生能量转移，该能量转移可被可视化或以其他方式检测和/或定量。当供体被合适波长的光辐射激发时，供体通常将能量转移到受体。受体通常以不同波长的光辐射形式重新发射转移的能量。在某些系统中，非荧光能量可通过包括基本上非荧光供体部分的生物分子在供体与受体部分之间转移(参见例如美国专利号7,741,467)。
在一个实例中，寡核苷酸探针可含有供体荧光部分和相应的猝灭剂，该猝灭剂可以是或不是荧光的，并且以不同于光的形式耗散转移的能量。当探针完整时，能量转移通常发生在两种荧光部分之间，使得来自供体荧光部分的荧光发射被猝灭。在聚合酶链反应的延伸步骤期间，与扩增产物结合的探针被例如Taq聚合酶的5′至3′核酸酶活性裂解，使得供体荧光部分的荧光发射不再被猝灭。用于此目的的示例性探针在例如美国专利号5,210,015、5,994,056和6,171,785中描述。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的黑暗猝灭剂包括BlackHole QuenchersTM(BHQ)(BiosearchTechnologies，Inc.，Novato，Cal.)、Iowa BlackTM(Integrated DNA Tech.，Inc.，Coralville，Iowa)、BlackBerryTM Quencher 650(BBQ-650)(Berry&Assoc.，Dexter，Mich.)。
在另一个实例中，两个寡核苷酸探针(各自含有荧光部分)可在由寡核苷酸探针与mecA/mecC-MRSA靶核酸序列的互补性决定的特定位置与扩增产物杂交。当寡核苷酸探针与扩增产物核酸在适当位置杂交时，生成FRET信号。杂交温度可在约35℃至约65℃的范围内，持续约10秒至约1分钟。
可使用例如光子计数落射荧光显微镜系统(包含适当的分色镜和用于监测特定范围的荧光发射的滤光器)、光子计数光电倍增器系统或荧光计来进行荧光分析。可利用氩离子激光器、高强度汞(Hg)弧光灯、光纤光源或其他经适当过滤以在所需范围内激发的高强度光源来进行激发以启动能量转移或允许直接检测荧光团。
如本文关于供体和相应的受体荧光部分所用，“相应的”是指具有与供体荧光部分的发射光谱重叠的吸收光谱的受体荧光部分或黑暗猝灭剂。受体荧光部分的发射光谱的最大波长应比供体荧光部分的激发光谱的最大波长大至少100nm。因此，可以在它们之间产生有效的非辐射能量传递。
通常针对以下项选择荧光供体和相应的受体部分：(a)高效率的Forster能量转移；(b)较大的最终Stokes位移(＞100nm)；(c)尽可能将发射偏移到可见光谱的红色部分(＞600nm)；以及(d)将发射偏移到比在供体激发波长下激发所产生的Raman水荧光发射高的波长。例如，可选择以下供体荧光部分：其在激光线附近具有其激发最大值(例如，氦-镉442nm或氩488nm)，具有高消光系数、高量子产率，并且其荧光发射与相应的受体荧光部分的激发光谱良好重叠。可选择以下相应的受体荧光部分：其具有高消光系数、高量子产率，其发射与供体荧光部分的发射良好重叠，并且在可见光谱的红色部分(＞600nm)中发射。
在FRET技术中可与各种受体荧光部分一起使用的代表性供体荧光部分包括荧光素、Lucifer Yellow、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、Lucifer Yellow VS、4-乙酰氨基-4′-异硫基-氰酰二苯乙烯基-2，2′-二磺酸、7-二乙基氨基-3-(4′-异硫基氰酰苯基)-4-甲基香豆素、1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯和4-乙酰氨基-4′-异硫基氰酰二苯乙烯基-2，2′-二磺酸衍生物。取决于所使用的供体荧光部分，代表性受体荧光部分包括LC Red 640、LC Red705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺若丹明B磺酰氯、四甲基若丹明异硫氰酸盐、若丹明x异硫氰酸盐、赤藓红异硫氰酸盐、荧光素、二亚乙基三胺五乙酸盐或镧系元素离子(例如铕或铽)的其他螯合物。供体和受体荧光部分可例如从Molecular Probes(Junction City，Oreg.)或SigmaChemical Co.(St.Louis，Mo.)获得。
供体和受体荧光部分可经由接头臂附接到合适的探针寡核苷酸。每个接头臂的长度很重要，因为接头臂将影响供体与受体荧光部分之间的距离。接头臂的长度可为从核苷酸碱基到荧光部分的距离(以埃
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表示)。一般来讲，接头臂为约
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至约
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接头臂可以是WO 84/03285中所述的种类。WO 84/03285还公开用于将接头臂附接到特定核苷酸碱基以及用于将荧光部分附接到接头臂的方法。
受体荧光部分(诸如LC Red 640)可与含有氨基接头的寡核苷酸(例如，可从ABI(Foster City，Calif.)或Glen Research(Sterling，VA)获得的C6-氨基亚磷酰胺)组合，以产生例如LC Red 640标记的寡核苷酸。经常使用的将供体荧光部分(诸如荧光素)偶联到寡核苷酸的接头包括硫脲接头(FITC-衍生的，例如来自Glen Research或ChemGene(Ashland，Mass.)的荧光素-CPG′)、酰胺接头(荧光素-NHS-酯衍生的，诸如来自BioGenex(San Ramon，Calif.)的CX-荧光素-CPG)或需要在寡核苷酸合成后偶联荧光素-NHS-酯的3′-氨基-CPG。
mecA/mecC-MRSA的检测
本公开提供了用于检测生物样品或非生物样品中存在或不存在mecA/mecC-MRSA的方法。所提供的方法避免了样品污染、假阴性和假阳性的问题。该方法包括执行至少一个循环步骤，该循环步骤包括使用多对mecA-MRSA和/或mecC-MRSA引物从样品中扩增mecA-MRSA和/或mecC-MRSA靶核酸分子的一部分，以及FRET检测步骤。优选地在热循环仪中进行多个循环步骤。可以进行使用mecA-MRSA和mecC-MRSA引物和探针来检测mecA/mecC-MRSA的存在的方法，且mecA/mecC-MRSA的检测指示样品中mecA-MRSA和/或mecC-MRSA的存在。
如本文所述，可使用利用FRET技术的标记的杂交探针来检测扩增产物。一种FRET形式利用
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技术检测扩增产物的存在或不存在，并且因此检测mecA/mecC-MRSA的存在或不存在。
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技术利用一种单链杂交探针，该探针用例如一种荧光染料和一种猝灭剂标记，该猝灭剂可以是或不是荧光的。当第一荧光部分用合适波长的光激发时，吸收的能量根据FRET原理转移至第二荧光部分。第二荧光部分通常是猝灭剂分子。在PCR反应的退火步骤期间，标记的杂交探针与靶DNA(即，扩增产物)结合并在随后的延伸阶段期间被例如Taq聚合酶的5′至3′核酸酶活性降解。因此，荧光部分和猝灭剂部分变得彼此空间上分离。因此，在不存在猝灭剂的情况下激发第一荧光部分后，可检测到来自第一荧光部分的荧光发射。举例来说，ABI
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7700Sequence Detection System(Applied Biosystems)使用
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技术，并且适用于进行本文所述的用于检测样品中mecA/mecC-MRSA的存在或不存在的方法。
也可使用与FRET结合的分子信标来使用实时PCR方法检测扩增产物的存在。分子信标技术使用用第一荧光部分和第二荧光部分标记的杂交探针。第二荧光部分一般是猝灭剂，并且荧光标记通常位于探针的每个端部。分子信标技术使用具有允许形成二级结构(例如发夹)的序列的探针寡核苷酸。作为在探针内形成二级结构的结果，当探针在溶液中时，两个荧光部分空间接近。在与靶核酸(即，扩增产物)杂交后，探针的二级结构被破坏并且荧光部分变得彼此分离，使得在用合适波长的光激发后，可检测到第一荧光部分的发射。
另一种常见形式的FRET技术利用两种杂交探针。每种探针可用不同的荧光部分标记，并且通常被设计成在靶DNA分子(例如，扩增产物)中彼此非常接近地杂交。供体荧光部分，例如荧光素，在470nm处被
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仪器的光源激发。在FRET期间，荧光素将其能量转移到受体荧光部分，诸如
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640(LC Red 640)或
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705(LC Red 705)。然后受体荧光部分发出更长波长的光，由
Figure BDA0003715891730000187
仪器的光学检测系统检测。只有当荧光部分直接局部接近，并且当供体荧光部分的发射光谱与受体荧光部分的吸收光谱重叠时，有效的FRET才发生。发射信号的强度可与原始靶DNA分子的数量(例如，mecA-MRSA或mecC-MRSA基因组的数目)相关。如果mecA/mecC-MRSA靶核酸发生扩增并产生扩增产物，则杂交步骤产生基于探针对成员之间的FRET的可检测信号。
通常，FRET的存在指示样品中mecA/mecC-MRSA的存在，并且FRET的不存在指示样品中mecA/mecC-MRSA的不存在。然而，标本采集不足、运输延迟、运输条件不当或使用某些采集拭子(藻酸钙或铝杆)都是会影响测试结果的成功和/或准确性的条件。使用本文所公开的方法，在例如45个循环步骤内检测FRET指示mecA-MRSA或mecC-MRSA感染。
可用于实践所述方法的代表性生物样品包括但不限于皮肤拭子、鼻拭子、伤口拭子、血培养物、皮肤和软组织感染物。生物样品的收集和储存方法是本领域技术人员已知的。可对生物样品进行处理(例如，通过本领域已知的核酸提取方法和/或试剂盒)以释放mecA/mecC-MRSA核酸，或者在一些情况下，可使生物样品直接与PCR反应组分和合适的寡核苷酸接触。
解链曲线分析是可包括在循环曲线中的附加步骤。解链曲线分析基于DNA在称为解链温度(Tm)的特征温度下解链的事实，该解链温度被定义为一半DNA双链体分离成单链时的温度。DNA的解链温度主要取决于其核苷酸组成。因此，富含G和C核苷酸的DNA分子具有丰富的A和T核苷酸的DNA分子具有更高的Tm。通过检测信号丢失时的温度，可确定探针的解链温度。类似地，通过检测生成信号时的温度，可确定探针的退火温度。来自mecA/mecC-MRSA扩增产物的mecA-MRSA和mecC-MRSA探针的解链温度可以确认样品中mecA/mecC-MRSA的存在或不存在。
在每个热循环仪运行中，也可循环对照样品。阳性对照样品可使用例如对照引物和对照探针扩增靶核酸对照模板(除了所描述的靶基因扩增产物之外)。阳性对照样品也可扩增例如含有靶核酸分子的质粒构建体。这种质粒对照可在内部扩增(例如，在样品内)或在与患者样品并行的单独样品运行中使用与用于检测预期靶标相同的引物和探针扩增。此类对照是扩增、杂交和/或FRET反应的成功或失败的指标。每个热循环仪运行还可包括例如缺乏靶模板DNA的阴性对照。阴性对照可测量污染。这确保了系统和试剂不会产生假阳性信号。因此，对照反应可以容易地确定例如引物以序列特异性退火并启动延伸的能力，以及探针以序列特异性杂交并发生FRET的能力。
在一个实施方案中，所述方法包括避免污染的步骤。例如，在美国专利号5,035,996、5,683,896和5,945,313中描述了利用尿嘧啶-DNA糖基化酶的酶促方法，以减少或消除一个热循环仪运行与下一个之间的污染。
可使用与FRET技术结合的常规PCR方法来实践所述方法。在一个实施方案中，使用
Figure BDA0003715891730000201
仪器。以下专利申请描述了如
Figure BDA0003715891730000202
技术中使用的实时PCR：WO 97/46707、WO 97/46714和WO 97/46712。
Figure BDA0003715891730000203
可使用PC工作站操作，并且可利用Windows NT操作系统。当机器将毛细管按顺序定位在光学单元上时，获得来自样品的信号。软件可在每次测量后立即实时显示荧光信号。荧光采集时间为10-100毫秒(msec)。在每个循环步骤之后，可连续更新所有样品的荧光与循环数的定量显示。可存储所生成的数据以进行进一步分析。
作为FRET的替代，使用双链DNA结合染料诸如荧光DNA结合染料(例如，
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Green或
Figure BDA0003715891730000205
(Molecular Probes))，可以检测扩增产物。在与双链核酸相互作用时，此类荧光DNA结合染料在用合适波长的光激发后发射荧光信号。还可使用双链DNA结合染料，诸如核酸嵌入染料。当使用双链DNA结合染料时，通常进行解链曲线分析以证实扩增产物的存在。
应当理解，本公开的实施方案不受一种或多种市售仪器的配置的限制。
制品/试剂盒
本公开的实施例进一步提供了用于检测mecA/mecC-MRSA的制品或试剂盒。制品可包括用于检测mecA/mecC-MRSA的引物和探针，以及合适的包装材料。用于检测mecA/mecC-MRSA的代表性引物和探针能够与mecA/mecC-MRSA靶核酸分子杂交。另外，试剂盒还可包括DNA固定、杂交和检测所需的适当包装的试剂和材料，诸如固体支持物、缓冲剂、酶和DNA标准品。本文公开了设计引物和探针的方法，并且提供了扩增mecA/mecC-MRSA靶核酸分子并与之杂交的引物和探针的代表性实例。
制品还可包括用于标记探针的一个或多个荧光部分，或者，另选地，与试剂盒一起提供的探针可被标记。例如，制品可以包括用于标记mecA-MRSA和mecC-MRSA探针的供体和/或受体荧光部分。上文提供了合适的FRET供体荧光部分和相应的受体荧光部分的示例。
制品还可含有包装说明书或包装标记，其上具有使用mecA-MRSA和mecC-MRSA引物和探针来检测样品中的mecA/mecC-MRSA的说明。制品可另外包括用于实施本文公开的方法的试剂(例如，缓冲剂、聚合酶、辅因子、或防止污染的药剂)。此类试剂可专用于本文所述的市售仪器中的一种。
本公开的实施方案将在以下实施例中进一步描述，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实例
提供以下实例和附图以帮助理解本发明，本主题的真正范围在所附权利要求书中阐明。应当理解，在不脱离本发明的精神的情况下，可对所阐述的程序进行修改。
实例1
MecA/mecC-MRSA基因靶标
图1示出了用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的几个靶基因的相对位置。本公开的引物和探针靶向mecA/mecC基因。
实例2
PCR实验条件
使用
Figure BDA0003715891730000211
4800系统或
Figure BDA0003715891730000212
6800/8800系统平台(Roche MolecularSystems，Inc.，Pleasanton，CA)进行mecA-MRSA靶基因或mecC-MRSA靶基因的实时PCR检测。扩增试剂的最终浓度如下所示：
表II PCR扩增试剂
Figure BDA0003715891730000213
Figure BDA0003715891730000221
下表示出了用于PCR扩增反应的典型温度曲线：
表III PCR温度曲线
Figure BDA0003715891730000231
Pre-PCR程序包括初始变性以及在55℃、60℃和65℃下温育，以对RNA模板进行逆转录。在三种温度下温育同时具有以下有利效果：在较低温度下，轻微错配的靶序列(诸如生物体的遗传变体)也被转录，而在较高温度下，RNA二级结构的形成受到抑制，从而使转录更有效。将PCR循环分成两次测量，其中两次测量应用一步设置(结合退火和延伸)。55℃下的前5个循环允许通过预扩增轻微错配的靶序列来增加包容性，而第二次测量的45个循环通过使用58℃的退火/延伸温度提供了增加的特异性。
实例3
实验结果
图2示出了实验的PCR生长曲线，该实验使用来自标准寡核苷酸供应商对已知含有mecA基因的MRSA菌株12770的mecA引物和探针。虽然检测到mecA基因，但生长曲线不是S形，使得无法确定Ct值(阈值循环)，并且也无法定量靶基因浓度。相反，在PCR实验，使用SEQ IDNO：1mecA正向引物和SEQ ID NO：2mecA反向引物和SEQ ID NO：3mecA探针，仅对含有mecA基因的MRSA菌株(菌株10714、10817和12270)观察到扩增产物的检测，但对于含有mecC基因的MRSA菌株(菌株12756)或对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)菌株10853未观察到扩增产物的检测。图3示出了该PCR实验的生长曲线和如表IV所示的确定的Ct值。
表IV
Figure BDA0003715891730000241
在单独的PCR实验中，使用SEQ ID NO：4的mecC正向引物或SEQ ID NO：5的mecC正向引物与SEQ ID NO：6的mecC反向引物扩增和检测含有mecC的MRSA菌株12756和12765，并使用SEQ ID NO：7的mecC探针检测。结果如表V和图4所示。
表V
Figure BDA0003715891730000242
虽然为了清楚和理解的目的已经相当详细地描述了上述发，但是本领域技术人员通过阅读本公开将清楚，在不脱离本发明的真实范围的情况下，可在形式和细节上进行各种改变。例如，可以各种组合使用上述所有技术和装置。本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其他文档全文以引用方式并入以用于所有目的，其程度如同每项单独的出版物、专利、专利申请和/或其他文档被单独地指示通过引用并入以用于所有目的。
非正式的序列表
Figure BDA0003715891730000243
Figure BDA0003715891730000251
Figure IDA0003715891780000011
Figure IDA0003715891780000021
Figure IDA0003715891780000031

Claims (25)

1.一种检测样品中的含有mecA的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mecA-MRSA)的方法，所述方法包括：
-执行扩增步骤，所述扩增步骤包括使所述样品与包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其互补序列的正向引物和包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列或其互补序列的反向引物接触，如果所述样品中存在mecA-MRSA，则产生扩增产物；
-执行杂交步骤，所述杂交步骤包括使所述扩增产物与一种或多种可检测的mecA-MRSA探针接触，其中所述一种或多种可检测的mecA-MRSA探针中的一者包含SEQ ID NO：3的序列或其互补序列；以及
-检测存在或不存在扩增的扩增产物，其中存在所述扩增的扩增产物指示所述样品中存在mecA-MRSA，并且其中不存在所述扩增的扩增产物指示所述样品中不存在mecA-MRSA。
2.根据权利要求1所述的方法，其中：
-所述杂交步骤包括使所述扩增产物与用供体荧光部分和相应的受体荧光部分标记的探针接触；并且
-所述检测步骤包括检测存在或不存在所述探针的所述供体荧光部分与所述受体荧光部分之间的荧光共振能量转移(FRET)，其中存在或不存在荧光FRET指示所述样品中存在或不存在mecA-MRSA。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述供体荧光部分与所述相应的受体荧光部分在所述探针上彼此相距不超过8个核苷酸。
4.根据权利要求2和3中任一项所述的方法，其中所述受体荧光部分是猝灭剂。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述扩增步骤采用具有5′至3′核酸酶活性的聚合酶。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其进一步包括通过以下步骤在相同反应中检测所述样品中的含有mecC的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mecC-MRSA)：
-在所述扩增步骤中进一步使所述样品与包含SEQ ID NO：4或5的核苷酸序列或其互补序列的正向引物和包含SEQ ID NO：6的核苷酸序列或其互补序列的反向引物接触，如果所述样品中存在mecC-MRSA，则产生扩增产物；
-在所述杂交步骤中进一步使所述扩增产物与一种或多种可检测的mecC-MRSA探针接触，其中所述一种或多种可检测的mecC-MRSA探针中的一者包含SEQ ID NO：7的序列或其互补序列；以及
-检测存在或不存在所述扩增的扩增产物，其中存在所述扩增的扩增产物指示所述样品中存在mecC-MRSA，并且其中不存在所述扩增的扩增产物指示所述样品中不存在mecC-MRSA。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述mecC-MRSA探针用供体荧光部分和相应的受体荧光部分标记，所述供体荧光部分和相应的受体荧光部分与标记的mecA-MRSA探针的所述供体荧光部分和所述相应的受体荧光部分不同。
8.一种检测样品中的含有mecC的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mecC-MRSA)的方法，所述方法包括：
-执行扩增步骤，所述扩增步骤包括使所述样品与包含SEQ ID NO：4或5的核苷酸序列或其互补序列的正向引物和包含SEQ ID NO：6的核苷酸序列的反向引物接触，如果所述样品中存在mecC-MRSA，则产生扩增产物；
-执行杂交步骤，所述杂交步骤包括使所述扩增产物与一种或多种可检测的mecC-MRSA探针接触，其中所述一种或多种可检测的mecC-MRSA探针中的一者包含SEQ ID NO：7的序列或其互补序列；以及
-检测存在或不存在所述扩增的扩增产物，其中存在所述扩增的扩增产物指示所述样品中存在mecC-MRSA，并且其中不存在所述扩增的扩增产物指示所述样品中不存在mecC-MRSA。
9.根据权利要求8所述的方法，其中：
-所述杂交步骤包括使所述扩增产物与用供体荧光部分和相应的受体荧光部分标记的探针接触；并且
-所述检测步骤包括检测存在或不存在所述探针的所述供体荧光部分与所述受体荧光部分之间的荧光共振能量转移(FRET)，其中存在或不存在荧光FRET指示所述样品中存在或不存在mecC-MRSA。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述供体荧光部分与所述相应的受体荧光部分在所述探针上彼此相距不超过8个核苷酸。
11.根据权利要求9和10中任一项所述的方法，其中所述受体荧光部分是猝灭剂。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述扩增步骤采用具有5′至3′核酸酶活性的聚合酶。
13.一种用于检测含有mecA的金黄色葡萄球菌(mecA-MRSA)的核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：
-第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含SEQ ID NO：1的序列或其互补序列；
-第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含SEQ ID NO：2的序列或其互补序列；和
-第三可检测地标记的寡核苷酸，其构造成杂交至由所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸生成的扩增子，所述第三可检测地标记的寡核苷酸包含SEQ ID NO：3或其互补序列。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述第三可检测地标记的寡核苷酸包含供体荧光部分和相应的受体荧光部分。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述受体荧光部分是猝灭剂。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的试剂盒，其进一步包含三磷酸核苷、核酸聚合酶和所述核酸聚合酶的功能所需的缓冲剂。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的试剂盒，其用于进一步检测含有mecC的金黄色葡萄球菌(mecC-MRSA)的核酸，所述试剂盒进一步包括：
-第四寡核苷酸，所述第四寡核苷酸包含选自由SEQ ID NO：4和5组成的组的序列或其互补序列；
-第五寡核苷酸，所述第五寡核苷酸包含SEQ ID NO：6的序列或其互补序列；和
-第六可检测地标记的寡核苷酸，其构造成杂交至由所述第四寡核苷酸和所述第五寡核苷酸生成的扩增子，所述第六可检测地标记的寡核苷酸包含SEQ ID NO：7或其互补序列。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述第六可检测地标记的寡核苷酸探针用供体荧光部分和相应的受体荧光部分标记，所述供体荧光部分和相应的受体荧光部分与所述第三可检测地标记的寡核苷酸的所述供体荧光部分和所述相应的受体荧光部分不同。
19.一种用于检测含有mecC的金黄色葡萄球菌(mecC-MRSA)的核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：
-第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含选自由SEQ ID NO：4和5组成的组的序列或其互补序列；
-第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含SEQ ID NO：6的序列或其互补序列；和
-第三可检测地标记的寡核苷酸，其构造成杂交至由所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸生成的扩增子，所述第三可检测地标记的寡核苷酸包含SEQ ID NO：7或其互补序列。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述第三可检测地标记的寡核苷酸包含供体荧光部分和相应的受体荧光部分。
21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述受体荧光部分是猝灭剂。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的试剂盒，其进一步包含三磷酸核苷、核酸聚合酶和所述核酸聚合酶的功能所需的缓冲剂。
23.一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含选自由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7组成的组的寡核苷酸的序列或其互补序列。
24.根据权利要求23所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸。
25.根据权利要求23或24中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸。
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