CN108624658A - 快速检测金黄色葡萄球菌MRSA的qPCR方法及试剂 - Google Patents

快速检测金黄色葡萄球菌MRSA的qPCR方法及试剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种快速检测金黄色葡萄球菌MRSA的qPCR方法及试剂，包括如下步骤：(1)前期准备程序；(2)核酸提取与纯化；(3)引物/探针设计、合成、标记；(4)qPCR扩增及结果判断；(5)检测下限及扩增线性范围试验；(6)基因片段灵敏度、特异性计算；(7)诊断灵敏度、特异性计算；(8)统计方法；本发明的有益效果在于：检测下限低至4cfu/反应，扩增线性范围均达到：2.0×102～8Copies/ml；对金黄色葡萄球菌鉴定的灵敏度和特异性分别为100％(352/352)、100％(77/77)，对MRSA检测的灵敏度和特异性分别为100％(94/94)、95.4％(94/98)；简便、快速、灵敏度高、特异性好，不仅可提高金黄色葡萄球菌感染的诊断能力，还可实现快速检测，为尽早精准治疗赢得时间。

Description

快速检测金黄色葡萄球菌MRSA的qPCR方法及试剂
【技术领域】
本发明涉及一种金黄色葡萄球菌MRSA的qPCR方法，尤其涉及一种快速检测金黄色葡萄球菌MRSA的qPCR方法及试剂。
【背景技术】
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)是人类的一种重要病原菌，既可引起严重的社区获得性感染，也可引起严重的医源性感染[2]。由于其症状与其他细菌感染无异，临床难以针对该菌感染进行早期精准诊断，特别是1961年首次发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin resistant staphylococcus aureus，MRSA)以来，其耐药问题日益突出，严重影响了治疗效果。培养法是目前常用的检测方法，也是金标准，但需要2～3天，甚至更久，其时效性、简便性、灵敏度等均无法满足临床快速精准诊断的需求。毕艳妮等通过多重降落PCR方法检测血流MRSA感染，结果具有高灵敏度与特异性，有利于指导临床使用抗菌药物；但通过电泳来分析PCR产物，易造成实验室污染而出现严重的假阳性。沈蕾等比较了上海之江的MRSA-PCR快速检测方法，发现除阴性预测值较好外，灵敏度、特异性及阳性预测值均较低。
【发明内容】
本发明目的在于解决金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，由于其症状与其他细菌感染无异，临床难以针对该菌感染进行早期精准诊断，特别是首次发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌以来，其耐药问题日益突出，严重影响了治疗效果，在精准医学日益发展的当下，现有方法或试剂已无法满足需求而提供的一种能实现精准诊断并适合我国人群的快速检测金黄色葡萄球菌MRSA的qPCR方法及试剂。
本发明是通过以下技术方案来实现的：一种快速检测金黄色葡萄球菌MRSA的qPCR研究方法，包括如下步骤：
(1)前期准备程序：
研究样本：①随机复苏冻存的经生化反应或质谱鉴定为金黄色葡萄球菌若干株、凝固酶阴性葡萄球菌若干株及ATCC 25923和ATCC43300用于引物、探针筛选；
②留取金黄色葡萄球菌感染患者样本若干份及培养阴性的脓性样本若干份。
仪器与试剂：
①细菌分离培养类型：哥伦比亚血琼脂、普通营养琼脂；血培养仪(BacT/ALERT 3D120)、细菌鉴定药敏分析仪(VITEK II Compact)、质谱鉴定仪(VITEK MS)、染色仪(PREVITMColor Gram)及其配套试剂；
②核酸提取仪(ExPure20)及其配套磁珠法提取纯化试剂；
③荧光定量PCR仪(LightCycler480)；多重荧光定量PCR体系(PlatinumTMMultiplex PCR Master Mix)；
④PCR产物测序；
细菌培养鉴定与MRSA检测：
增菌、分离及纯化培养、革兰氏染色、生化鉴定、质谱鉴定、MRSA检测等，均严格按仪器及其配套试剂SOP文件操作；
(2)核酸提取与纯化：
①纯培养物核酸提取：挑取复苏后的对数生长期纯培养菌落用生理盐水调成0.5～1.0McF菌悬液，在8小时内完成菌悬液核酸提取；
②原始样本核酸提取：各类原始样本接种完毕后，选用对应的核酸提取试剂盒，严格按仪器及配套试剂SOP进行操作；
③提取纯化后的核酸模板吸入无DNA酶EP管，冻存-86℃备用；
(3)引物/探针设计、合成、标记：从NCBI数据库，分别下载金黄色葡萄球菌nuc、atl、icaB、fnbA、hla、srap、mecA基因序列各100条，用DNAMAN进行序列比对，用Primer 5软件，避开变异区或突变点后，分别设计各基因的引物和探针；每个基因设计1～2套；金黄色葡萄球菌各基因引物/探针设计与标记表：
(4)qPCR扩增及结果判断：
①qPCR体系：Multiplex PCR Mix 25.0μl、10μM正反引物各1.0μl、10μM探针各0.3μl、模板20.0μl，补超纯水至终体积50.0μl；
②扩增参数：95℃2min+(95℃10s+60℃30s)×40，选择510、580、610、670nm通道于60℃探测荧光；
③鉴定结果判断：鉴定标志物扩增曲线呈“S”形、CT值≤36判为阳性；否则判为阴性；
④MRSA结果判断：MRSA及鉴定标志物扩增曲线均呈“S”形、CT值≤36判为阳性；否则判为阴性；
(5)检测下限及扩增线性范围试验：
①挑取对数生长期的两个标株纯培养菌落分别用生理盐水调成约3.0×108cfu/ml，经3次平板倾注法菌落计数均值确定菌悬液浓度，用生理盐水稀释菌悬液至2.0×108cfu/ml后提取核酸，以1个细菌对应1Copy模板确定模板浓度；
②用超纯水，10倍梯度稀释核酸模板，制成8个梯度浓度模板，用于PCR扩增，以能判阳的最低加入模板数作为检测下限；以线性关系良好的最低和最大浓度作为扩增线性范围；
(6)基因片段灵敏度、特异性计算：
①鉴定标志物灵敏度＝鉴定基因片段qPCR阳性数÷金黄色葡萄球菌株数×100％；MRSA标志物灵敏度＝MRSA基因片段qPCR阳性数÷MRSA株数×100％；
②鉴定标志物特异性＝鉴定基因片段qPCR阴性数÷凝固酶阴性葡萄球菌株数×100％；MRSA标志物特异性＝MRSA基因片段qPCR阴性数÷非MRSA株数×100％；
(7)诊断灵敏度、特异性计算：
①原始样本鉴定结果判断：qPCR法与培养法均阳性，或培养法阴性，qPCR法阳性，经扩增产物一代测序，与标株同源性≥90％，判为真阳性；否则，判为真阴性；
②原始样本MRSA结果判断：培养法阳性判为真阳性；否则，判为真阴性；
③诊断灵敏度＝真阳性数÷(真阳性数+假阴性数)×100％；诊断特异性＝真阴性数÷(真阴性数+假阳性数)×100％；
(8)统计方法：采用SPSS进行结果的统计学分析，计数资料两样本率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
进一步地，金黄色葡萄球菌atl和mecA基因检测引物、探针的序列与标记表为：
进一步地，同时检测金黄色葡萄球菌自溶素(Autolysin，atl)基因片段(CP009361.1：1010217～1010341)和青霉素结合蛋白2a(penicillin binding protein2a,mecA)基因片段(KF058908.1：1715～1843)，所用引物和探针是经过我国流行分布株筛选后确定，避开变异区或突变点设计而成。
进一步地，快速检测金黄色葡萄球菌及MRSA的qPCR试剂：
(1)qPCR体系：Multiplex PCR Mix 25.0μl、10μM正反引物各1.0μl、10μM探针各0.3μl、模板20.0μl，补超纯水至终体积50.0μl；
(2)扩增参数：95℃2min+(95℃10s+60℃30s)×40，选择510、580nm通道于60℃探测荧光；
进一步地，快速检测金黄色葡萄球菌及MRSA的qPCR研究方法，鉴定结果判断为：
(1)鉴定标志物扩增曲线呈“S”形、CT值≤36判为阳性；否则判为阴性；
(2)MRSA结果判断：MRSA及鉴定标志物扩增曲线均呈“S”形、CT值≤36判为阳性；否则判为阴性。
进一步地，所述研究样本：①随机复苏冻存的经生化反应或质谱鉴定为金黄色葡萄球菌93株(含32株MRSA)、凝固酶阴性葡萄球菌93株(含26株MRCNS)及ATCC 25923和ATCC43300用于引物、探针筛选；②留取金黄色葡萄球菌感染患者样本335份(含94例MRSA)及培养阴性的脓性样本95份。
进一步地，所述ATCC 25923用于引物、探针筛选其他基因实验，ATCC 43300用于引物、探针筛选mecA实验。
本发明的有益效果在于：
(1)检测下限低至4cfu/反应，扩增线性范围均达到：2.0×102～8Copies/ml；对金黄色葡萄球菌鉴定的灵敏度和特异性分别为100％(352/352)、100％(77/77)，对MRSA检测的灵敏度和特异性分别为100％(94/94)、95.4％(94/98)；
(2)对金黄色葡萄球菌的诊断灵敏度明显高于培养法高，P<0.01,差异有统计学意义；从样品处理到报告结果≤2.0小时；
(3)本方法专利简便、快速、灵敏度高、特异性好，不仅可提高金黄色葡萄球菌感染的诊断能力，还可实现快速检测，为尽早精准治疗赢得时间。
【附图说明】
图1为本发明检测金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 25923梯度模板扩增曲线图；
图2为本发明检测金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 43300梯度模板扩增曲线图；
图3为本发明金黄色葡萄球菌各基因引物、探针筛选结果，其中atl片段1和mecA片段1的检测性能最优结果图；
图4为本发明qPCR方法检测培养阳性原始样本及空白对照扩增效果图；
图5为本发明qPCR方法检测原始样本结果比较表；
【具体实施方式】
下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步描述：
如图1、图2、图3、图4、图5所示，一种快速检测金黄色葡萄球菌MRSA的qPCR研究方法，包括如下步骤：
(1)前期准备程序：
研究样本：①随机复苏冻存的经生化反应或质谱鉴定为金黄色葡萄球菌若干株、凝固酶阴性葡萄球菌若干株及ATCC 25923和ATCC43300用于引物、探针筛选；
②留取金黄色葡萄球菌感染患者样本若干份及培养阴性的脓性样本若干份。
仪器与试剂：
①细菌分离培养类型：哥伦比亚血琼脂、普通营养琼脂；血培养仪(BacT/ALERT 3D120)、细菌鉴定药敏分析仪(VITEK II Compact)、质谱鉴定仪(VITEK MS)、染色仪(PREVITMColor Gram)及其配套试剂；
②核酸提取仪(ExPure20)及其配套磁珠法提取纯化试剂；
③荧光定量PCR仪(LightCycler480)；多重荧光定量PCR体系(PlatinumTMMultiplex PCR Master Mix)；
④PCR产物测序；
细菌培养鉴定与MRSA检测：
增菌、分离及纯化培养、革兰氏染色、生化鉴定、质谱鉴定、MRSA检测等，均严格按仪器及其配套试剂SOP文件操作；
(2)核酸提取与纯化：
①纯培养物核酸提取：挑取复苏后的对数生长期纯培养菌落用生理盐水调成0.5～1.0McF菌悬液，在8小时内完成菌悬液核酸提取；
②原始样本核酸提取：各类原始样本接种完毕后，选用对应的核酸提取试剂盒，严格按仪器及配套试剂SOP进行操作；
③提取纯化后的核酸模板吸入无DNA酶EP管，冻存-86℃备用；
(3)引物/探针设计、合成、标记：从NCBI数据库，分别下载金黄色葡萄球菌nuc、atl、icaB、fnbA、hla、srap、mecA基因序列各100条，用DNAMAN进行序列比对，用Primer 5软件，避开变异区或突变点后，分别设计各基因的引物和探针；每个基因设计1～2套；金黄色葡萄球菌各基因引物/探针设计与标记表：
(4)qPCR扩增及结果判断：
①qPCR体系：Multiplex PCR Mix 25.0μl、10μM正反引物各1.0μl、10μM探针各0.3μl、模板20.0μl，补超纯水至终体积50.0μl；
②扩增参数：95℃2min+(95℃10s+60℃30s)×40，选择510、580、610、670nm通道于60℃探测荧光；
③鉴定结果判断：鉴定标志物扩增曲线呈“S”形、CT值≤36判为阳性；否则判为阴性；
④MRSA结果判断：MRSA及鉴定标志物扩增曲线均呈“S”形、CT值≤36判为阳性；否则判为阴性；
(5)检测下限及扩增线性范围试验：
①挑取对数生长期的两个标株纯培养菌落分别用生理盐水调成约3.0×108cfu/ml，经3次平板倾注法菌落计数均值确定菌悬液浓度，用生理盐水稀释菌悬液至2.0×108cfu/ml后提取核酸，以1个细菌对应1Copy模板确定模板浓度；
②用超纯水，10倍梯度稀释核酸模板，制成8个梯度浓度模板，用于PCR扩增，以能判阳的最低加入模板数作为检测下限；以线性关系良好的最低和最大浓度作为扩增线性范围；
(6)基因片段灵敏度、特异性计算：
①鉴定标志物灵敏度＝鉴定基因片段qPCR阳性数÷金黄色葡萄球菌株数×100％；MRSA标志物灵敏度＝MRSA基因片段qPCR阳性数÷MRSA株数×100％；
②鉴定标志物特异性＝鉴定基因片段qPCR阴性数÷凝固酶阴性葡萄球菌株数×100％；MRSA标志物特异性＝MRSA基因片段qPCR阴性数÷非MRSA株数×100％；
(7)诊断灵敏度、特异性计算：
①原始样本鉴定结果判断：qPCR法与培养法均阳性，或培养法阴性，qPCR法阳性，经扩增产物一代测序，与标株同源性≥90％，判为真阳性；否则，判为真阴性；
②原始样本MRSA结果判断：培养法阳性判为真阳性；否则，判为真阴性；
③诊断灵敏度＝真阳性数÷(真阳性数+假阴性数)×100％；诊断特异性＝真阴性数÷(真阴性数+假阳性数)×100％；
(8)统计方法：采用SPSS进行结果的统计学分析，计数资料两样本率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
进一步地，金黄色葡萄球菌atl和mecA基因检测引物、探针的序列与标记表为：
进一步地，同时检测金黄色葡萄球菌自溶素(Autolysin，atl)基因片段(CP009361.1：1010217～1010341)和青霉素结合蛋白2a(penicillin binding protein2a,mecA)基因片段(KF058908.1：1715～1843)，所用引物和探针是经过我国流行分布株筛选后确定，避开变异区或突变点设计而成。
进一步地，快速检测金黄色葡萄球菌及MRSA的qPCR试剂，
(1)qPCR体系：Multiplex PCR Mix 25.0μl、10μM正反引物各1.0μl、10μM探针各0.3μl、模板20.0μl，补超纯水至终体积50.0μl；
(2)扩增参数：95℃2min+(95℃10s+60℃30s)×40，选择510、580nm通道于60℃探测荧光；
进一步地，快速检测金黄色葡萄球菌及MRSA的qPCR研究方法，鉴定结果判断为：
(1)鉴定标志物扩增曲线呈“S”形、CT值≤36判为阳性；否则判为阴性；
(2)MRSA结果判断：MRSA及鉴定标志物扩增曲线均呈“S”形、CT值≤36判为阳性；否则判为阴性。
进一步地，所述研究样本：①随机复苏冻存的经生化反应或质谱鉴定为金黄色葡萄球菌93株(含32株MRSA)、凝固酶阴性葡萄球菌93株(含26株MRCNS)及ATCC 25923和ATCC43300用于引物、探针筛选；②留取金黄色葡萄球菌感染患者样本335份(含94例MRSA)及培养阴性的脓性样本95份。
进一步地，所述ATCC 25923用于引物、探针筛选其他基因实验，ATCC 43300用于引物、探针筛选mecA实验。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (4)

1.一种快速检测金黄色葡萄球菌MRSA的qPCR方法，采用实时荧光定量PCR技术(Quantitative Real-time PCR，qPCR)，其特征在于：金黄色葡萄球菌atl和mecA基因检测引物、探针的序列与标记表为：
2.根据权利要求1所述的快速检测金黄色葡萄球菌MRSA的qPCR方法，其特征在于：同时检测金黄色葡萄球菌自溶素(Autolysin，atl)基因片段(CP009361.1：1010217～1010341)和青霉素结合蛋白2a(penicillin binding protein 2a,mecA)基因片段(KF058908.1：1715～1843)，所用引物和探针是经过我国流行分布株筛选后确定，避开变异区或突变点设计而成。
3.根据权利要求1所述的快速检测金黄色葡萄球菌MRSA的qPCR试剂，其特征在于：
(1)qPCR体系：Multiplex PCR Mix 25.0μl、10μM正反引物各1.0μl、10μM探针各0.3μl、模板20.0μl，补超纯水至终体积50.0μl；
(2)扩增参数：95℃2min+(95℃10s+60℃30s)×40，选择510、580nm通道于60℃探测荧光。
4.根据权利要求1所述的快速检测金黄色葡萄球菌MRSA的qPCR方法，其特征在于，鉴定结果判断为：
(1)鉴定标志物扩增曲线呈“S”形、CT值≤36判为阳性；否则判为阴性；
(2)MRSA结果判断：MRSA及鉴定标志物扩增曲线均呈“S”形、CT值≤36判为阳性；否则判为阴性。
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