CN1261590C - 菌血症检验用基因芯片的检验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及菌血症检验用基因芯片的检验方法，特别是对血液中病原菌DNA的分离、靶基因DNA顺序扩增和鉴定的技术。以基因芯片为基础，建立一种简便快捷、准确的方法，对血液中的病原菌DNA进行有效的分离，PCR(多聚酶链式反应)扩增和标记靶DNA顺序，通过与基因芯片上的探针阵列的杂交、酶联免疫吸附检测，实现对病原菌的分类、鉴定，从而彻底的摒弃冗长、繁杂的血液中病原菌的检验方法。本发明简便快捷、准确，并且由此可延伸到以基因芯片为基础的人体、牲畜其它器官感染病菌检测、环境、卫生检测及海关检疫技术。
Description
技术领域
本发明涉及菌血症检验用基因芯片的检验方法，特别是对血液中病原菌DNA的分离、靶基因DNA顺序扩增和鉴定的技术，由此可延伸到以基因芯片为基础的人体、牲畜其它器官感染病菌检测、环境、卫生检测及海关检疫技术。
背景技术
正常人的血液是无菌的，当细菌侵入血液时，可引起人类的菌血症乃至败血症。此种病症是一种严重而危急的全身性感染，细菌学检验对疾病的防治具有极为重要的意义。对血液中病原菌的传统鉴定方法主要有两种，一种是最为传统的培养、分离、鉴定系统，以无菌的方法采集静脉血，立即注入适当的液体增菌培养基内，作需氧或厌氧培养等。另一种是自动血液分析、鉴定系统，以阿克苏公司生产的BacT/Alert为例，BacT/Alert血培养系统是一种全自动封闭式微生物监测系统，能自动培育、振荡、连续监测来自菌血症或真菌血症可疑患者的厌氧及需氧血标本。根据病菌生长过程发生的生理、生化变化来判定有无菌感染以及菌的种类。要涉及多种培养介质和多种检测指标。
目前的细菌学检验在血液中病原菌的分离及鉴定方面的现状是工序烦杂、耗时长，且有些病原菌不能被体外培养，因此现有的检验方法阳性检出率低。
Anthony.R.M.et al.(Rapid diagnosis of bacteremia by universal amplification of 23sribosomal DNA followed by hybridization to an oligonucleotide array，J.Clinicalmicrobiology，Feb.2000.p781-788)，报道了对菌血症迅速诊断方面的研究结果，设计出了探针阵列应用于菌血症的诊断。但是，其中包括的探针较少，覆盖病原菌种类只有22个，会漏掉许多病原菌，而且准确性差。
发明内容
本发明目的是提供一种菌血症检验用基因芯片的检验方法，可以克服已有技术的缺点，实现简便快捷、准确的病原菌检出。本发明以菌血症检验用基因芯片为基础，对血液中的病原菌DNA进行有效的分离、PCR(多聚酶链式反应)扩增和标记靶DNA顺序，通过标记靶DNA顺序与基因芯片上的探针阵列的杂交、酶联免疫吸附检测，实现对病原菌的分类检出和鉴定，从而彻底摒弃现有的冗长、繁杂的血液中病原菌的检验方法。
本发明包括下述步骤：
1)、采集血液标本，采血一次，采血量在0.1-0.5ml的范围之内。
2)、血样中病原菌DNA的抽提：
取全血置于eppendorf离心管中，补加无菌水1ml在室温下静置5分钟，然后于室温下离心：14000×g，5分钟，弃去900μl上清液，加入400μl裂解缓冲液(lysis buffer，10mMTris.HCL pH8.0，10mM EDTA，0.5％SDS)混匀后加6μl 20mg/ml的蛋白酶K(Sigma或上海生工公司产品)，混匀，置56℃水浴中保温30分，之后加等体积TE溶液饱和酚试剂，强烈震荡后，于8000r/min室温离心3分钟，吸取上清液，重复酚抽提一次，吸取上清液，加1/10体积的甲醇纳(3mol/l)，混匀，再加等体积冰冷异丙醇，混匀后再12,000rpm，室温，离心5分钟，倾去上清，加70％冰冷乙醇振荡洗涤一次，室温下12,000rpm，离心5分钟，倾去上清，沉淀加50μlTE溶液溶解，置-20℃储存。
3)、病原菌DNA靶顺序的PCR扩增和地高辛或荧光素标记：
1.靶顺序扩增的PCR体系：
| 成分 | 浓度 | 加样量 | 反应终浓度 |
| PCR bufferMgcl2Taq DNAPolymerase引物I引物II引物III引物IVdNTPDigoxigenin-11-dUTPDNA样品重蒸蒸馏水总反应体积 | 10X25mM5U/μl10μM10μM10μM10μM10mM/each25nmol | 5μl5μl0.3μl2μl2μl2μl2μl0.3μl0.3μl15μl16μl50μl | 1X2.5mM0.03/μl100nM100nM100nM100nM60μM/each60pmol/μl |
引物I的序列组成为(引用)：5’-CCGATTTCAGATAGGTGCAATCT-3’
引物II的序列组成为(引用)：5’-TACGCCATTCGCTCCCTGTAAT-3’
引物III的序列组成为(引用)：5’-GTATCGACGATGAACGGAGC-3’
引物IV的序列组成为(引用)：5’-TTCTCGGCATAATGATGTGA-3’
2.PCR扩增：
首先在94℃，变性10min然后94℃，30sec(30sec-1min)；57℃，15sec；72℃，40sec。这样进行5个循环。而后，94℃，30sec，64℃，40sec，这样进行25个循环的反应。最后在72℃，延伸5min。所扩增的PCR产物带有地高辛标记，在4℃保存，留待以后进行杂交。
4)、病原菌的鉴定：按如上所述的方法，扩增出被测DNA样品的靶DNA顺序，与事先制作好的鉴定病原菌用基因芯片杂交，杂交后的芯片经抗地高辛(美国Roche公司的产品)的酶联免疫吸附检测(ELISA)会显示出因不同病原菌而不同的杂交点显色图形与标准菌模式图数据库中的点阵图形相比对，即可确定病原菌的类型。
5)、菌血症检验基因芯片的组成：
本芯片以尼龙膜为基因探针阵列的基质，其探针设计见另一申请“用于鉴定血液中病原菌的基因芯片及其制造方法”。芯片的构成如附图1。所说的基因芯片是以尼龙膜为基质构建的基因探针阵列构成。
本发明与另一申请：用于鉴定血液中病原菌的基因芯片及其制造方法结合，可构成临床菌血症检验用基因芯片检验技术。本发明由于是采用多种微生物基因探针组成的基因芯片，对人血液中侵染的病原菌进行检测，具有现有微生物检验不可取代的优点：
第一：由于只需0.1ml的血样进行DNA抽提，不但减少了用血量(现有自动微生物检验系统需要20ml)，而且能对儿童实施与成人一样的检验。
第二：由于本发明的基因芯片病原菌检验技术不需要增菌培养，这样整整节约了12-24小时的增菌培养时间，可以及时挽救如败血症等这类危急病人的生命，及时作出正确的施治。本发明把现有至少24小时才能给出检验结果的时间缩短到6-8小时。
第三：现有的临床微生物检验系统(自动血培养检测和分析系统和微生物数码分类鉴别系统)由于都需要增菌培养，存在着致命弱点，就是有些病原菌在体外不能生长。因此，导致现有检验技术阳性率很低。准确率低使临床医生不相信检验结果。本发明因为不需增菌培养，只需对血样进行病原菌DNA抽提，然后进行靶DNA顺序的PCR扩增，和分子杂交鉴定，大大提高了阳性率，使临床菌血症检验的准确性有了保证。
本发明可延伸到以基因芯片为基础的人体、牲畜其它器官感染病菌检测、环境、卫生检测及海关检疫技术。
附图说明
图1：本发明尼龙膜质基因芯片示意图。
图2：本发明应用实施例1杂交点阵图谱。
图3：本发明应用实施例2杂交点阵图谱。
图4：本发明应用实施例3杂交点阵图谱。
具体实施方式
实施例
采集血液标本，0.1-0.5ml。取全血0.1ml置eppendorf离心管中，补加无菌水1ml在室温下静置5分钟，然后于室温下离心：12000rpm，5分钟，弃去900μl上清液，加入400μl裂解缓冲液(lysis buffer：10mM Tris.HCL pH8.0，10mM EDTA，0.5％SDS)混匀后加6μl20mg/ml的蛋白酶K(Sigma或上海生工公司产品)，混匀，置56℃水浴中保温30分，之后加等体积TE溶液饱和酚试剂，强烈震荡后，于8000r/min室温离心3分钟，吸取上清液，重复酚抽提一次，吸取上清液，加1/10体积的甲醇纳(3mol/l)，混匀，再加等体积冰冷异丙醇，混匀后，离心：12,000rpm，室温，5分钟，倾去上清，加70％冷乙醇振荡洗涤一次，离心：12,000rpm，室温，5分钟，倾去上清，沉淀加50μlTE溶解。吸出15μl作为模板加入到PCR反应薄壁管中，再加入PCR反应体系，即相继分别加入μl PCRbuffer，5μl MgCL2，2μl引物I，2μl引物II，2μl引物III，2μl引物IV，0.3μl dNTP，0.3μlDigoxigenin-11-dUTP，0.3μlTaq DNAPolymerase和16μl蒸蒸馏水，使总反应体积为50μl。把混合好的PCR待反应物，放入PCR仪中进行PCR扩增。扩增条件为：
首先在94℃，变性10min然后94℃，30sec(30sec-1min)；57℃，15sec；72℃，40sec。这样进行5个循环。而后，94℃，30sec，64℃，40sec，这样进行25个循环的反应。最后在72℃，延伸5min。扩增好的PCR产物与以制备好的芯片进行杂交反应。显色得出杂交点阵图与数据库中的杂交点阵图相比对，确定对应图形，从而完成对此种未知样品的菌种鉴定。
上述的芯片是尼龙膜质基因芯片尺寸为2.0cm×2.0cm。56个基因探针形成横8行，竖7行的基因探针阵列(DNA-microarray)，上端和左侧辅以判读坐标点。第一行的八个圆点，和第一纵列的九个圆点是本芯片的坐标点，以溴芬兰为主的兰色标记液点在尼龙膜上，在芯片的判读过程中，作为判读芯片的横纵坐标，对于56个探针点阵进行定位。图中56个星号点代表56种基因探针，不同的细菌或是真菌DNA的PCR产物会与鉴定此种细菌或是真菌的探针进行杂交，经过显色处理，就会表现为在不同的星号位点上的有色斑点。根据坐标点确定其位置后，就可以读出不同细菌或是真菌的杂交点阵图谱。首先要用标准菌的PCR扩增产物与此种芯片进行杂交，得出的结果汇集成为一个标准杂交图谱数据库。当用未知菌的PCR扩增产物与此种芯片杂交时，把得出的结果——杂交图与标准图谱数据库中的杂交点图谱相比对，确定对应图形，从而完成对此种未知样品的菌种鉴定。
应用实施例1：
患者：刘贾，男，18岁。8月2日高烧入院，体温38.9℃，医生给予丁胺卡那治疗，效果不佳，病人仍发热。用菌血症基因芯片进行诊断。诊断过程如下：
取刘贾血液0.1ml置eppendorf离心管中，补加无菌水1ml在室温下静置5分钟，然后于室温下离心：12,000rpm，5分钟，弃去900μl上清液，加入400μl裂解缓冲液(lysisbuffer：10mM Tris.HCLpH8.0，10mMEDTA，0.5％SDS)混匀后加6μl，20mg/ml的蛋白酶K(Sigma或上海生工公司产品)，混匀，置56℃水浴中保温30分，之后加等体积TE溶液饱和酚试剂，强烈震荡后，于8000r/min室温离心3分钟，吸取上清液，重复酚抽提一次，吸取上清液，加1/10体积的甲醇纳(3mol/l)，混匀，再加等体积冰冷异丙醇，混匀后，离心：12,000rpm，室温，5分钟，倾去上清，加70％冷乙醇振荡洗涤一次，离心：12,000rpm，室温，5分钟，倾去上清，沉淀加50μlTE溶解。吸出15μl作为模板加入到PCR反应薄壁管中，再加入PCR反应体系，即相继分别加入5μl PCR buffer，5μlMgcl2，2μl引物I，2μl引物II，2μl引物III，2μl引物IV，0.3μl dNTP，0.3μlDigoxigenin-11-dUTP，0.3μlTaq DNAPolymerase和16μl无菌水，使总反应体积为50μl。把混合好的PCR待反应物，放入PCR仪中进行PCR扩增。扩增条件为：94℃，变性10min；然后94℃，30sec；57℃，15sec；72℃，40sec。这样进行5个循环。而后，94℃，30sec，64℃，40sec，这样进行25个循环的反应。最后在72℃，延伸5min。扩增好的PCR产物与以制备好的芯片进行杂交反应。显色得出杂交点阵图见图2。与数据库中的杂交点阵图相比对，确定结果为金黄色葡萄球菌感染。
换以头孢他定治疗，两天后，患者退烧。继续治疗三天后，传统的血培养也完成鉴定，鉴定结果为金黄色葡萄球菌感染。患者继续治疗一天后，出院。
用基因芯片的方法鉴定的菌种的结果与医院采用BacT/Alert全自动血培养仪方法鉴定的菌种的结果相一致，都是金黄色葡萄球菌感染。
应用实施例2：
患者，罗建华，男，43岁。7月15日因颈骨髓损伤，发热两天后入院，医师对其实行对症治疗及消炎抗菌治疗。入院第三天，进行了菌血症基因芯片诊断：
取罗建华血液0.1ml置eppendorf离心管中，补加无菌水1ml在室温下静置5分钟，然后于室温下离心：12,000rpm，5分钟，弃去900μl上清液，加入400μl裂解缓冲液(lysisbuffer：10mM Tris.HCLpH8.0，10mMEDTA，0.5％SDS)混匀后加6μl，20mg/ml的蛋白酶K(Sigma或上海生工公司产品)，混匀，置56℃水浴中保温30分，之后加等体积TE溶液饱和酚试剂，强烈震荡后，于8000r/min室温离心3分钟，吸取上清液，重复酚抽提一次，吸取上清液，加1/10体积的甲醇纳(3mol/l)，混匀，再加等体积冰冷异丙醇，混匀后，离心：12,000rpm，室温，5分钟，倾去上清，加70％冷乙醇振荡洗涤一次，离心：12,000rpm，室温，5分钟，倾去上清，沉淀加50μlTE溶解。吸出15μl作为模板加入到PCR反应薄壁管中，再加入PCR反应体系，即相继分别加入5ul PCR buffer，5μlMgcl2，2μl引物I，2μl引物II，2μl引物III，2μl引物IV，0.3μl dNTP，0.3μl
Digoxigenin-11-dUTP，0.3μlTaq DNA Polymerase和16μl无菌水，使总反应体积为50μl。把混合好的PCR待反应物，放入PCR仪中进行PCR扩增。扩增条件为：94℃，变性10min；然后94℃，30sec；57℃，15sec；72℃，40sec。这样进行5个循环。而后，94℃，30sec，64℃，40sec，这样进行25个循环的反应。最后在72℃，延伸5min。扩增好的PCR产物与以制备好的芯片进行杂交反应。显色得出杂交点阵图见图3。与数据库中的杂交点阵图相比对，确定结果为铜绿假单胞菌。
随后，医师对罗建华的治疗进行了调整，除对症治疗外，以头孢他定进行抗菌消炎治疗。一周后，患者病情稳定，无发热现象，停用抗菌素继续针对颈髓损伤进行对症治疗。
传统血培养诊断结果为阴性。
用基因芯片方法鉴定菌种的结果为铜绿假单胞菌，而医院采用BacT/Alert全自动血培养仪方法进行鉴定，结果显示为阴性，即无菌生长。
此例说明，基因芯片的鉴定方法比全自动血培养仪的鉴定方法要灵敏。因为传统的方法要求的是活菌，并且要可以在适宜的条件下生长和繁殖。因此，很有可能，被检测的血液中的细菌进行鉴定的时候已经死亡，或是所用培养瓶的条件并不能使其继续生长繁殖。然而，基因芯片的鉴定方法，并不需要是活菌，当然也不需要菌的繁殖和生长。无论是死亡的细菌还是存活的细菌，只要有DNA存在，就可以被鉴定出来。因而，基因芯片的鉴定方法比全自动血培养仪的鉴定方法要灵敏。对152病例的鉴定就是可靠的证据。
应用实施例3
患者，刘连弟，男，73岁。7月10日入院，临床诊断为肺炎，有轻微发热情况。进行菌血症基因芯片诊断，诊断过程如下：
7月10日取刘连弟血样0.1ml置eppendorf离心管中，补加无菌水1ml在室温下静置5分钟，然后于室温下离心：12,000rpm，5分钟，弃去900μl上清液，加入400μl裂解缓冲液(lysis buffer：10mM Tris.HCL pH8.0，10mM EDTA，0.5％SDS)混匀后加6μl，20mg/ml的蛋白酶K(Sigma或上海生工公司产品)，混匀，置56℃水浴中保温30分，之后加等体积TE溶液饱和酚试剂，强烈震荡后，于8000r/min室温离心3分钟，吸取上清液，重复酚抽提一次，吸取上清液，加1/10体积的甲醇纳(3mol/l)，混匀，再加等体积冰冷异丙醇，混匀后，离心：12,000rpm，室温，5分钟，倾去上清，加70％冷乙醇振荡洗涤一次，离心：12,000rpm，室温，5分钟，倾去上清，沉淀加50μlTE溶解。吸出15μl作为模板加入到PCR反应薄壁管中，再加入PCR反应体系，即相继分别加入5μl PCRbuffer，5μl Mgcl2，2μl引物I，2μl引物II，2μl引物III，2μl引物IV，0.3μl dNTP，0.3μlDigoxigenin-11-dUTP，0.3μlTaq DNAPolymerase和16μl无菌水，使总反应体积为50μl。把混合好的PCR待反应物，放入PCR仪中进行PCR扩增。扩增条件为：94℃，变性10min；然后94℃，30sec；57℃，15sec；72℃，40sec。这样进行5个循环。而后，94℃，30sec，64℃，40sec，这样进行25个循环的反应。最后在72℃，延伸5min。扩增好的PCR产物与以制备好的芯片进行杂交反应。显色得出杂交点阵图见图4。只有质控点显色，诊断结果为没有细菌或真菌感染。
医师给予患者抗病毒等治疗，情况有所缓解，患者病情稳定。七天后，传统血培养方法鉴定结果为阴性。
用基因芯片的方法鉴定的结果与医院采用全自动血培养仪方法鉴定的结果相一致，都是没有细菌或真菌感染。
Claims (4)
1、一种菌血症病原菌检验用基因芯片的检验方法，其特征在于：
所说的菌血症病原菌检验用基因芯片为：尼龙膜基质构建的基因芯片尺寸为2.0cm×2.0cm，56个基因探针形成横8行，竖7行的基因探针阵列，上端和左侧辅以判读坐标点；第一行的八个圆点，和第一纵列的九个圆点是本芯片的坐标点，以溴芬兰为主的兰色标记液点在尼龙膜上，在芯片的判读过程中，作为判读芯片的横纵坐标，对于56个探针点阵进行定位；
具体检验方法包括如下步骤：
1)、血样中病原菌DNA的抽提：
取全血血液样品置eppendorf离心管中，加入无菌水1ml在室温下静置5分钟，离心：14000×g，5分钟，弃去900μl上清液，加入400μl含有Tris、HCL、EDTA和SDS的pH8.0的裂解缓冲液，混匀后加6μl 20mg/ml的蛋白酶K，混匀，置56℃水浴中保温30分钟，之后加等体积TE溶液饱和酚试剂，强烈震荡后，于8000r/min室温离心3分钟，吸取上清液，重复酚抽提一次，吸取上清液，加1/10体积的甲醇纳，3mol/l，混匀，再加等体积冰冷异丙醇，混匀后再12,000rpm，室温，离心5分钟，倾去上清液，加70％冰冷乙醇振荡洗涤一次，室温下12,000rpm，离心5分钟，倾去上清液，沉淀加50μlTE溶液溶解，置-20℃储存；
2)、取第一步抽提样品，加入PCR反应体系：5μl PCR buffer，5μl MgCL2，2μl引物I，2μl引物II，2μl引物III，2μl引物IV，0.3μl dNTP，0.3μl
Digoxigenin-11-dUTP，0.3μlTaq DNA Polymerase和16μl重蒸蒸馏水，使总反应体积为50μl；把混合好的PCR待反应物，放入PCR仪中进行PCR扩增；
引物I：5’-CCGATTTCAGATAGGTGCAATCT-3’
引物II：5’-TACGCCATTCGCTCCCTGTAAT-3’
引物III：5’-GTATCGACGATGAACGGAGC-3’
引物IV：5’-TTCTCGGCATAATGATGTGA-3’
PCR扩增条件：
首先在94℃，变性10min；然后94℃，30sec；57℃，15sec；72℃，40sec，这样进行5个循环；而后，94℃，30sec，64℃，40sec，这样进行25个循环的反应；最后在72℃，延伸5min；所扩增的PCR产物带有地高辛标记，在4℃保存，留待以后进行杂交；
3)、病原菌的鉴定：按上述扩增出被测DNA样品的靶DNA顺序，与菌血症病原菌检验用基因芯片杂交，杂交后的芯片经抗地高辛的酶联免疫吸附检测，出杂交点显色图形，然后与标准菌模式图数据库中的点阵图形相比对，即可确定病原菌的类型。
2、按照权利要求1所说的菌血症病原菌检验用基因芯片的检验方法，其特征在于所说的裂解缓冲液是10mM Tris.HCL pH8.0，10mM EDTA，0.5％SDS的溶液。
3、按照权利要求1所说的菌血症病原菌检验用基因芯片的检验方法，其特征在于所说的全血血液样品为0.1-0.5ml。
4、按照权利要求1所说的菌血症病原菌检验用基因芯片的检验方法，其特征在于所说的菌血症病原菌为金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌。
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Legal Events
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20060628 Termination date: 20090930 |