CN117706088B - 甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法 - Google Patents
甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117706088B CN117706088B CN202410161636.8A CN202410161636A CN117706088B CN 117706088 B CN117706088 B CN 117706088B CN 202410161636 A CN202410161636 A CN 202410161636A CN 117706088 B CN117706088 B CN 117706088B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- solution
- staphylococcus aureus
- concentration
- dumbbell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 title claims abstract description 51
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 title claims abstract description 51
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 143
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 108091008104 nucleic acid aptamers Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 69
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 21
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 21
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 20
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 20
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 18
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims description 18
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims description 13
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 7
- KKKDGYXNGYJJRX-UHFFFAOYSA-M silver nitrite Chemical compound [Ag+].[O-]N=O KKKDGYXNGYJJRX-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N Silver ion Chemical compound [Ag+] FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 4
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 3
- 101000804877 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) 5'-3' exoribonuclease 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 32
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 abstract description 2
- 206010041925 Staphylococcal infections Diseases 0.000 abstract 2
- 208000015688 methicillin-resistant staphylococcus aureus infectious disease Diseases 0.000 abstract 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 22
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 21
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 4
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 229940054340 bacillus coagulans Drugs 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 241000607534 Aeromonas Species 0.000 description 1
- 241000195576 Bacillus subtilis group Species 0.000 description 1
- 101100268670 Caenorhabditis elegans acc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000008745 Healthcare-Associated Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 101710202686 Penicillin-sensitive transpeptidase Proteins 0.000 description 1
- 206010035734 Pneumonia staphylococcal Diseases 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 208000037919 acquired disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009635 antibiotic susceptibility testing Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- -1 silver ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法，其步骤包括：采用生物传感器对待测样品进行检测，所述生物传感器包括环状哑铃探针和辅助探针，所述哑铃探针的两端环部通过中间的颈部连接在一起，颈部是由反向互补配对的碱基对组成的互补链，分别为上链和下链；所述上链和/或下链含有与识别甲氧西林金黄色葡萄球菌的核酸适配体部分和一个或两个酶识别位点，当检测到MRSA时，环状哑铃探针中发生构象转移，从而引发一系列信号和Exo‑III增强的颜色反应。该方法具有超灵敏、超低检测线、特异性、无需提取DNA的MRSA检测技术。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法。
背景技术
甲氧西林金黄色葡萄球菌也称耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是引起医院获得性肺炎感染的感染菌，所致感染率逐渐上升，死亡率也高于其它获得性疾病，因此需要广泛地使用抗生素如青霉素、头孢菌素等β引内酰胺类药物治疗肺炎。但MRSA对大多数正在使用的抗生素具有耐药性，导致死亡率高以及各种医疗问题。因此，准确和快速地检测MRSA菌株是指导患者在感染早期进行适当治疗和防止MRSA传播的基础。
传统的抗微生物药敏试验被认为是MRSA鉴定的金标准，因为它易于使用；然而，其漫长的延迟和潜在的假阴性结果限制了其实用性。虽然它具有很高的特异性，但这种抗体的高成本阻碍了它在免疫学研究中的广泛检测方法。由于相关的抗生素耐药基因可以使用核酸的新兴方法直接鉴定，所以它们似乎优于其他方法。已建立和正在发展的等温扩增技术，如环介导的等温扩增和基于核酸序列的扩增，其灵敏度与一般的聚合酶链反应(PCR)相当。例如，Luyu Wei等人提出了一种具有重组酶聚合酶扩增(RPA)的CRISPR (Clusteredregularly interspaced palindromic repeats)/Cas12a系统，用于MRSA的比色法检测。利用RPA的三倍扩增和Cas12a的多翻核酸酶活性，在低至8 cfu/mL的浓度下检测MRSA。Kyeonghye Guk等人利用CRISPR相关蛋白9/单导RNA (dCas9/sgRNA)组合作为靶向材料，SYBR Green I作为荧光探针，提出了一种CRISPR介导的DNA-FISH方法，可简便、快速、高灵敏度地检测MRSA。但是，上述技术需要高科技的工具和严格的温度循环。此外，由于上述这些技术需要从MRSA细胞中提取遗传物质，检测结果可能会受到影响。因此，开发一种敏感、特异强和无需提取DNA的快速检测MRSA的方法至关重要。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法。该方法由于具有环状哑铃探针的靶标鉴定和核酸外切酶- III(Exo-III)增强显色反应，能够快速检测出MRSA，具有超敏感，特异性强，无繁琐的操作步骤，在临床肺炎MRSA感染的诊断中具有非常强的实用性。当检测到MRSA时，环状哑铃探针中发生构象转移，从而引发一系列信号与Exo-III发生增强的颜色反应。其中银离子(银)适配体不仅可以作为Exo-III基信号循环的底物，还可以与TMB显色反应。当银适配体被切割时，Exo-III辅助回收极大地放大了颜色反应。
本发明是通过下述技术方案实现的：
在本申请的一些实施例中，本发明提供一种甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法，其步骤包括：采用生物传感器对待测样品进行检测，所述生物传感器包括环状哑铃探针和辅助探针，所述哑铃探针的两端环部通过中间的颈部连接在一起，颈部是由反向互补配对的碱基对组成的互补链，分别为上链和下链；所述上链和/或下链含有与识别甲氧西林金黄色葡萄球菌的核酸适配体部分和一个或两个酶识别位点。
在本申请的一些实施例中，所述颈部的碱基序列上分别标记有报告荧光基团、淬灭荧光基团。所述荧光基团具体不做限定，只要能够保证荧光基团能够区分目标检测物即可。
优选，所述颈部的碱基序列上5 '端用FAM荧光基团标记，3 '端用DABCYL猝灭基团标记。
在本申请的一些实施例中，当含有甲氧西林金黄色葡萄球菌时，甲氧西林金葡萄球菌序列将与探针的核酸适配体互补配对，哑铃探针颈部被打开，发生链杂交反应后发出荧光信号；当样品中不含有甲氧西林金黄色葡萄球菌时，探针保持环状哑铃型状态。
在本申请的一些实施例中，当含有甲氧西林金黄色葡萄球菌时，甲氧西林金葡萄球菌序列将与探针的核酸适配体互补配对，哑铃探针颈部被打开，环状探针从而分解成线性状态，填加辅助探针，在DNA聚合酶的辅助下，链从5′末端延伸到3′末端。
在本申请的一些实施例中，所述环状哑铃探针的序列如SEQ ID NO:1所示：
5'-CCC ACC TTT TTT AAT ATT ATT TTT TAA TAT TCC TCA GCA AGG TGG TTACAT ATA TTG ATA AGC TAA TGT TGA TTG CAC CCC ACC TCG CTC CCG TGA CAC TAA TGC TAT GCT TAT CAG ACT GAT GTT GA -3'。其中，黑加粗字体表示核酸内切酶的识别位点，下划线表示甲氧西林金黄色葡萄球菌的核酸适配体序列。
在本申请的一些实施例中，其中所述辅助探针的序列如SEQ ID NO:2所示5'-TTTTTA GAT AA-3'。
在本申请的一些实施例中，其中所述的甲氧西林金黄色葡萄球菌的核酸适配体是PBP2a适配体。
在本申请的一些实施例中，一种甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法，所述的生物传感器中还包括DAN聚合酶、核酸内切酶、核酸外切酶、磁珠和荧光染料中的一种或以上。
进一步优选，一种甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法，包括如下步骤：将环状哑铃探针溶和辅助探针分别制成探针溶液，与PBS缓冲液、待测样品、dNTPs、DNA聚合酶、核酸内切酶、磁珠溶液、亚硝酸银溶液、核酸外切酶、荧光染料中任意一种或以上混合孵育培养，得到产物溶液，根据显色判断待测样品中是否含有甲氧西林金黄色葡萄球菌。
进一步优选，本申请所述的检测方法，包括如下步骤：将环状哑铃探针溶液、辅助探针溶液与PBS缓冲液和待测样品混合，第一次孵育培养；向其加入dNTPs、DNA聚合酶、核酸内切酶、磁珠溶液和亚硝酸银溶液，磁分离，第二次孵育培养；最后向其中加入核酸外切酶和与荧光染料溶液，第三次孵育培养，得到产物溶液，根据显色判断待测样品中是否含有甲氧西林金黄色葡萄球菌。
进一步优选，所述检测方法中还包括采用荧光分光光度计在652nm波长下测定待测样品中甲氧西林金黄色葡萄球菌含量。
在本申请的一些实施例中，所述环状哑铃探针溶液的制备：取环状哑铃探针用DEPC水配制，再加热到85-100℃，并孵化3-10分钟，然后冷却至40℃以下；所述辅助探针溶液的制备：取辅助探针用DEPC水配制，再加热到85-100℃，并孵化3-10分钟，然后冷却至40℃以下。
在本申请的一些实施例中，所述磁珠是固定有银离子Ag+适配体的磁珠；优选，所述Ag+适配体的序列如SEQ ID NO:3所示5'-CCT CCC TCC CTC CCT TTT TCC CAC CCA CCCACC-3'。
优选，所述固定有Ag+适配体磁珠的粒径600-1000nm。所述固定有Ag+适配体磁珠的粒径可以选自600nm、700nm、800nm、900nm或1000nm；进一步优选800nm。
在本申请的一些实施例中，其中所述的核酸内切酶为Nb.BbvCI和/或Nb.Bpu101。
在本申请的一些实施例中，其中所述核酸外切酶选自Exo-I、Exo-II、Exo-III中任一种或几种；优选，核酸外切酶选自Exo-III。
在本申请的一些实施例中，其中所述环状哑铃探针溶液的浓度分别为0.2-1.0mM。所述浓度可以选自0.2mM、0.3mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM或1.0mM。
在本申请的一些实施例中，其中所述辅助探针溶液的浓度分别为0.2-1.0mM。所述浓度可以选自0.2mM、0.3mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM或1.0mM。
在本申请的一些实施例中，所述核酸外切酶的酶浓度为2.0-3.0U/L。所述核酸外切酶的酶浓度可以选自2.0U/L、2.1U/L、2.2U/L、2.3U/L、2.4U/L、2.5U/L、2.6U/L、2.7U/L、2.8U/L、2.9U/L或3.0U/L。更优选，所述核酸外切酶的酶浓度为2.0U/L。
在本申请的一些实施例中，其中所述 dNTPs溶液浓度为220-270mM。所述的dNTPs溶液浓度可以选自220mM、230mM、240mM、250mM、260mM或270mM。
在本申请的一些实施例中，其中所述DNA聚合酶的酶浓度0.10-0.20U/ml。所述DNA聚合酶的酶浓度可以选自0.10U/ml、0.11U/ml、0.12U/ml、0.13U/ml、0.14U/ml、0.15U/ml、0.16U/ml、0.17U/ml、0.18U/ml、0.19U/ml或0.20U/ml。优选，所述DNA聚合酶的酶浓度0.15U/ml。
在本申请的一些实施例中，其中所述核酸内切酶的酶浓度0.10-0.30U/ml。所述的核酸内切酶的酶浓度可以选自0.10U/ml、0.11U/ml、0.12U/ml、0.13U/ml、0.14U/ml、0.15U/ml、0.16U/ml、0.17U/ml、0.18U/ml、0.19U/ml、0.20U/ml、0.21U/ml、0.22U/ml、0.23U/ml、0.24U/ml、0.25U/ml、0.26U/ml、0.27U/ml、0.28U/ml、0.29U/ml或0.30U/ml。
在本申请的一些实施例中，其中磁珠溶液浓度为8-12mM。所述磁珠溶液浓度可以选自8mM、9mM、10mM、11mM或12mM。优选，磁珠溶液浓度10mM。
在本申请的一些实施例中，其中亚硝酸银溶液浓度3-7mM。所述亚硝酸银溶液浓度可以选3mM、4mM、5mM、6mM或7mM。优选，亚硝酸银溶液浓度5mM。
在本申请的一些实施例中，其中TMB底物溶液浓度为3-7mM。所述TMB底物溶液浓度可以选自3mM、4mM、5mM、6mM或7mM。优选TMB底物溶液浓度5mM。
在本申请的一些实施例中，其中所述孵育培养温度25-50℃，共培养80-140min。
在本申请的一些实施例中，本发明的检测方法，所述孵育培养温度可以选自25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃。
在本申请的一些实施例中，本发明的检测方法，所述第一次孵育培养温度30-50℃，培养15-45min。
在本申请的一些实施例中，本发明的检测方法，所述第二次孵育培养温度30-50℃，培养10-30min。
在本申请的一些实施例中，本发明的检测方法，所述第三次孵育培养温度25-35℃，培养10-30min。
有益效果
1、本申请的检测方法表现出很好的精确性，重复性、稳定性和准确性，具有高选择性和高灵敏度。
2、本申请的检测方法无需严格控温循环，检测方法操作性强。
3、本申请的检测方法可检测到最低检测线35 cfu/mL的浓度,同时检测方法还具有较宽的线性检测范围，覆盖5个数量级（102cfu/mL、103cfu/mL、104cfu/mL、105cfu/mL、106 cfu/mL）。此外，该检测方法显示出高度特异性，使其能够在100分钟内准确区分目标 MRSA和其他微生物。
4、使用该检测方法成功检测了假临床样品中的 MRSA，表明其在肺炎和其他严重感染的诊断中具有潜在用途。
附图说明
图1本申请生物传感器工作原理图。
图2实施例2方法检测出的MRSA浓度与传统菌落计数方法获得的MRSA浓度相关性图。
具体实施方式
下文中将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。以下实施例中使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法,使用的试剂和材料如无特殊说明,均为市售商品。
其中，绿假单胞菌(P aeruginosa)、大肠杆菌(E. coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、凝结芽孢杆菌(B. coagulans)和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MRSA）的菌株参考美国型培养收集(ATCC)。
核酸外切酶Exo-III、Bsm DNA聚合酶和Nb. Bpul0l核酸内切酶由美国thermoScientific公司提供。
脱氧核糖核苷三磷酸酯(dNTPs)购自TaKaRa Bio Inc.(中国)。
表1、2所列DNA序列由中国三工生物科技有限公司合成并进行HPLC纯化。
所有试剂均分析级。
实施例1：
一种生物传感器，其结构如图1中环状哑铃探针所示，所述生物传感器包括环状哑铃探针和辅助探针，所述哑铃探针的两端环部通过中间的颈部连接在一起，颈部是由反向互补配对的碱基对组成的互补链，分别为上链和下链；所述上链和/或下链含有与识别甲氧西林金黄色葡萄球菌的核酸适配体部分和一个或两个酶识别位点。
当含有甲氧西林金黄色葡萄球菌时，甲氧西林金葡萄球菌序列将与探针的核酸适配体互补配对，哑铃探针颈部被打开，发生链杂交反应后发出荧光信号。
当样品中不含有甲氧西林金黄色葡萄球菌时，探针保持环状哑铃型。
所述的环状哑铃探针含有荧光标记，使环状哑铃探针发生链杂交反应后发出荧光信号。所述环状哑铃探针的颈部5 '端用FAM荧光基团标记，3 '端用DABCYL猝灭基团标记，当有MRSA序列存在时，发生链杂交反应，探针颈部被打开，报告荧光基团、淬灭荧光基团分离，发出荧光信号。
当传感系统中存在MRSA，其中一个环状哑铃探针上的核酸适配体序列与甲氧西林金黄色葡萄球菌蛋白结合，哑铃探针颈部被打开，从而分解成线性状态，形成环状哑铃探针-病原菌复合物，填加辅助探针，在DNA聚合酶的辅助下，链从5′末端延伸到3′末端。在此过程中适配体序列被占据，MRSA从适配体中释放出来。释放的MRSA与另一个环状哑铃探针中适配体结合，哑铃探针颈部被打开，形成信号循环。颈部互补链上所述上链或下链含被核酸内切酶识别而产生的切口位点。通过与DNA聚合酶的合作，DNA扩增反应产生了大量富含d'链序列产物（序列如SEQ ID NO.4所示）。富含d '链产物可以与Ag+适配体结合形成一个可以被核酸外切酶Exo-III识别的平的3 '末端。此时原来固定在磁珠(MB)表面的Ag+适配体已被消化，通过磁分离，只有磁珠MB会留在沉积物中，Ag+不能附着在适配体上。此时，有机染料3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(TMB)被银离子氧化，产生显色反应。在这种情况下，含有氧化TMB (TMBox)的溶液显示蓝色，并在652nm处有紫外-可见吸收峰。
表1
其中，黑加粗字体表示核酸内切酶的识别位点，下划线表示甲氧西林金黄色葡萄球菌的核酸适配体序列。
实施例2 ：检测MRSA的方法
PBS缓冲液的配制：NaCI 8.0g、KCI 0.2g、KH2PO40.24g、Na2HPO4.12H2O 3.63g，加蒸馏水至800ml，用HCI调PH至7.4，用蒸馏水定容至1000ml，高压蒸气灭菌20min，40贮存至使用。
环状哑铃探针溶液的制备：将实施例1提供的环状哑铃探针用DEPC水配制成浓度为10 μM的探针溶液，再经过预热至95℃，5 min，然后冷却至37℃。
辅助探针溶液的制备：将实施例1提供的辅助探针用DEPC水配制成浓度为10 μM的辅助探针溶液，再经过预热至95℃，5 min，然后冷却至37℃。
将0.3mM的环状哑铃探针(10 μL)、0.3mM的辅助探针(10 μL)、10 mM PBS缓冲液（80 μL）加入到100 μL MRSA样品中 ( MRSA浓度103cfu/mL)。将混合物加热至37℃，以220rpm搅拌15 min。37 ℃孵育25min后，加入250mM dNTPs (2 μL)、0.2 U/ml Nb. Bpul0l核酸内切酶 (2 μL)、0.15U/ml Bsm DNA聚合酶(2μL) 、10mM 固定有 Ag+ 适配体的磁珠(10μL)、加入25ml的 5mM AgNO3溶液，经磁分离、超纯水洗涤2次，37℃孵育10min。然后加入5mMTMB（35 ml），2.0U/L核酸外切酶Exo-III (2 μL)，室温下黑暗反应25min。判断颜色，最后测量652nm处的吸光度。
实施例3：用荧光分光光度计法对实施例1环状哑铃探针及其检测MRSA方法的可行性进行评估。
环状哑铃探针溶液的制备：将实施例1提供的环状哑铃探针用DEPC水配制成浓度为10 μM的探针溶液，再经过预热至95℃，5 min，然后冷却至37℃。
辅助探针溶液的制备：将实施例1提供的辅助探针用DEPC水配制成浓度为10 μM的辅助探针溶液，再经过预热至95℃，5 min，然后冷却至37℃。
在实施例1提供的环状哑铃探针的两端用荧光染料标记，5 '端用FAM荧光团标记，3 '端用DABCYL猝灭基团标记，通过检测环状哑铃探针变性的荧光变化评估其是否由线性（环状哑铃探针在变性前是线性状态）组装成茎环结构。如果FAM荧光信号降低，则提示环状哑铃探针成功组装。
（1）a(线性)组：取10 μM环状哑铃探针溶液2μL，即为含有线性状态的环状哑铃探针的待测检测溶液。
（2）c(开口的环状哑铃探针)组：取10 μM环状哑铃探针溶液2μL，加热至95℃并孵育5min，而后将该溶液降温37℃后，得到开口的环状哑铃探针的待检测溶液。
（3）b(线性+MRSA)组：将的环状哑铃探针2μL与10μL浓度为103cfu/mL的MRSA菌37℃混合培养27分钟，即得到b待检测组。
结果：利用荧光分光光度计检测三组样品中荧光信号强度，a线性状态下的荧光强度比c的荧光强度高出近8.48倍，由此可见，结构中FAM和DABCYL的距离很近，环状哑铃探针的荧光信号被抑制，荧光信号降低。添加MRSA后荧光强度恢复，表明环状哑铃探针的环状结构被成功解离。辅助探针的两个末端用FAM荧光团和DABCYL淬灭基团标记，以便测试靶循环。检测到显著增强的荧光信号，表明探针展开未折叠。
实施例4：DNA复合酶对检测MRSA的影响
辅助探针溶液的配制：用DEPC水配制成浓度为10 μM的辅助探针溶液。
辅助探针组：10 μM的辅助探针溶液(2μL)，即待测辅助探针组；
辅助探针+MRSA组：10 μM的辅助探针溶液(2μL)+ 103cfu/mL的MRSA菌(10μL) ，37℃混合培养27分钟，即待测辅助探针MRSA组；
辅助探针+MRSA+DNA聚合酶组：10 μM的辅助探针溶液(2μL)+ 103cfu/mL的MRSA(10μL) + DNA聚合酶(2μL)，37℃混合培养27分钟，即得待测辅助探针+MRSA+DNA聚合酶组。
结果：利用荧光分光光度计检测三组样品中荧光信号强度，结果辅助探针组的荧光强度小于100a.u，辅助探针+MRSA组的荧光强度约为1200a.u，辅助探针+MRSA+DNA聚合酶组的荧光强度约为3485a.u。可见，本申请的辅助探针增加DNA聚合酶后，体系荧光强度比不添加DNA聚合酶时提高了3倍，表明形成了靶周期。
实施例5：
实验目的：研究Exo-III、TMB对吸光度的影响
全成分组：将0.3mM环状哑铃探针(10 μL)和0.3mM辅助探针(10 μL)，10 mM PBS缓冲液（80 μL）加入到100 μL MRSA样品中（MRSA浓度103cfu/mL）。将混合物加热至37℃，以220 rpm搅拌15 min。37℃孵育25min后，加入250mM dNTPs (2 μL)、0.2 U/ml Nb. Bpul0l核酸内切酶 (2 μL)、0.15U/ml Bsm DNA聚合酶(2μL) 、10mM 固定有 Ag+ 适配体的磁珠(10μL)、加入25ml的5mM AgNO3溶液，经磁分离、超纯水洗涤2次，37℃孵育10min。然后加入5mM TMB（35 ml），2.0U/L核酸外切酶Exo-III (2 μL)，室温下黑暗反应25分钟。
缺少Exo-III组：全成分组中缺少Exo-III，其它同全成分组。
缺少TMB组：全成分组中组中缺少TMB，其它同全成分组。
结果：在生物感应器中当所有组分都存在时，吸光度增加至0.8-0.9。当缺少Exo-III时其吸光度较低，吸光度只有不到0.3；当缺少荧光物质TMB后吸光度0.7-0.8左右，吸光度减少不多。可见核酸外切酶是本申请检测方法中最重要的因素，荧光物质TMB可以协助核酸外切酶产生显色反应。
实施例6：考察组分浓度对检测结果的影响
实验目的：以含MRSA溶液的实验组的吸光度为A,以不含MRSA溶液对照组的吸光度为A0，含MRSA溶液与不含MRSA溶液的吸光度之比(A/A0)来反映检测实验组中的颜色变化作为评价优化的指标，考察环状哑铃探针浓度、Exo-III浓度对A/A0值的影响。
检测方法：同实施例2
实验结果：（1）考察环状哑铃探针浓度0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM的A/A0比值。随着初始环状哑铃探针浓度的提高，A/A0比值提高，使用的环状哑铃探针达到0.3 mM时，A/A0值最高为8左右，当环状哑铃探针为0.4 mM时A/A0有下降的趋势，A/A0值为7左右，0.5 mM和0.6 mM的A/A0比值一直维持在6-7之间，达到饱和，因此环状哑铃探针的最佳浓度为0.3 mM。
（2）考察Exo-III浓度在0.5U/L、1.0U/L、1.5U/L、2.0U/L、2.5U/L和3.0U/L的A/A0比值。吸光度随着Exo-III浓度的增加而增加，增加测试溶液中的Exo-III浓度可以使Exo-III增强显色反应更加明显。当Exo-III浓度为2.0 U/L时，该值对应于A/A0=8达到饱和的点，因此Exo-III最佳浓度为2.0 U/L。
实施例7：
实验目的：证明方法的灵敏度和动态范围。
实验方法：将MRSA用DEPC水稀释分别制成浓度为102cfu/mL、103cfu/mL、104cfu/mL、105cfu/mL、106cfu/mL的悬浮液。
检测方法同实施例2
实验结果：当MRSA浓度从102cfu/mL增加到106cfu/mL时，吸光度也随之增加。可见MRSA浓度与吸光度的对数成正比，呈线性关系，吸光度(Y)与MRSA浓度(C)的线性回归方程为Y = 0.2012*lgC - 0.0054 (R2, 0.9941)。预测35cfu/mL(空白信号/灵敏度的3个标准差)的浓度是最低可检测值。因此，本发明检测方法具有较高灵敏度，可用于检测超过五个数量级的宽浓度范围内的MRSA。
实施例8：
实验目的：MRSA检测方法的高度特异性验证实验
实验方法：各对照组的检测方法除了替换MRSA菌株，其它检测方法相同，同实施例2。
菌株：a空白组不含有任何菌、b绿假单胞菌(P aeruginosa)组，浓度为5 ×105cfu/mL的菌悬液、c大肠杆菌(E. coli)组，浓度为5 ×105cfu/mL的菌悬液、d枯草芽孢杆菌(B. subtilis)组浓度为5 ×105cfu/mL的菌悬液、e凝结芽孢杆菌(B. coagulans)组浓度为5 ×105cfu/mL的菌悬液、f甲氧西林金黄色葡萄球菌组浓度为5 ×105cfu/mL的菌悬液。
培养条件：上述菌株分别在LB培养基中37°C, 220 rpm搅拌24 h, 3000 rpm离心5min，然后在10 mM PBS溶液中轻洗，去除剩余培养基。通过连续稀释菌悬液来测定LB培养基中的细菌总数。琼脂37℃孵育24 h，重复稀释100 ml。根据平板生长菌落计数法计算活菌数量，并以每毫升菌落形成单位(CFU/ml)表示。
实验结果：a空白组不含有任何菌的吸光度0.15，b绿假单胞菌(P aeruginosa)组吸光度0.17，c大肠杆菌(E. coli)组吸光度0.18，d枯草芽孢杆菌(B. subtilis)组吸光度0.16、e凝结芽孢杆菌(B. coagulans)组液吸光度0.17、f甲氧西林金黄色葡萄球菌组吸光度约0.8。综上，除甲氧西林金黄色葡萄球菌组外其它菌悬液的吸光度均小于0.2，本申请的检测方法对MRSA有高度特异性。
实施例 9 本申请的检测方法与平板菌落计数法比较
样本制备：将MRSA培养混悬液100μL分别加入不同体积的PBS缓冲液，将MRSA稀释至不同浓度，制成几个不同的10倍递增稀释液为10组待测样本，样本中MRSA浓度未知。
实验方法：分别采用本发明实施例2的方法和最传统的菌落计数法检测所准备的10组样本中MRSA的浓度。
传统的菌落计数法操作如下：
1.从每个稀释液中分别取出10μL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合；
2.在30℃温度下，培养48小时，记录每个平皿中形成的菌落数量；
3.依据稀释倍数，计算出每10μL原始样品中所含活细菌的总数。最后取均值，计算标准差。
评价方法：将两种方法检测的MRSA数目进行比较，计算相关系数，以判断两种方法相关性。相关系数越高，则代表所构建的技术的与最传统、最常用的菌落计数法相关性检测结果越一致。
结果：如图2所示本发明的方法计算出的MRSA浓度与传统菌落计数方法获得的MRSA浓度具有良好的相关性，相关系数为0.9903。
实施例10 本申请检测方法回收率实验
培养条件：甲氧西林金黄色葡萄球菌在LB培养基中37°C, 220 rpm搅拌24 h,3000 rpm离心5 min，然后在10 mM PBS中轻洗，去除剩余培养基。通过连续稀释菌悬液来测定LB培养基中的细菌总数。琼脂37℃孵育24 h，重复稀释100 ml。根据平板生长菌落计数法计算活菌数量，并以每毫升菌落形成单位(CFU/ml)表示。
选择商品血清样品制备临床样品（商品血清样品中不含有甲氧西林金黄色葡萄球菌），将培养好的甲氧西林金黄色葡萄球菌加入血清样品中，制得浓度为分别50 cfu/mL、5×104cfu/mL、5 ×105cfu/mL、7.5 ×105cfu/mL、1 ×106cfu/mL的甲氧西林金黄色葡萄球菌临床样本。
实验组：将0.3mM的环状哑铃探针(10 μL)、0.3mM的辅助探针(10 μL)、10 mM PBS缓冲液（80 μL），加入100 μL 甲氧西林金黄色葡萄球菌临床样本中。将混合物加热至37℃，以220 rpm搅拌15 min。37 ℃孵育25min后，加入250mM dNTPs (2 μL)、0.2 U/ml Nb.Bpul0l核酸内切酶 (2 μL)、0.15U/ml Bsm DNA聚合酶(2μL) 、10mM 固定有 Ag+适配体的磁珠(10μL)、加入25ml的 5mM AgNO3溶液，经磁分离、超纯水洗涤2次，37℃孵育10min。然后加入5mM TMB（35 ml）和2.0U/L核酸外切酶Exo-III (2 μL)，室温下黑暗反应25min。在波长652nm处测得临床样本中甲氧西林金黄色葡萄球菌浓度。
对比例：将0.3mM的变构探针（序列如SEQ ID NO:5所示）(10 μL)、0.3mM的H探针（序列如SEQ ID NO:6所示）(10 μL)、10 mM PBS缓冲液（80 μL），加入100 μL 甲氧西林金黄色葡萄球菌临床样本中。将混合物加热至37℃，以220 rpm搅拌15 min。37 ℃孵育25min后，加入250mM dNTPs (2 μL)、0.2 U/ml Nb. Bpul0l核酸内切酶 (2 μL)、0.15U/ml Bsm DNA聚合酶(2μL) 、10mM 固定有 Ag+ 适配体的磁珠(10μL)、加入25ml的 5mM AgNO3溶液，经磁分离、超纯水洗涤2次，37℃孵育10min。然后加入5mM TMB（35 ml）和2.0U/L核酸外切酶Exo-III (2 μL)，室温下黑暗反应25min。在波长652nm处测得临床样本中甲氧西林金黄色葡萄球菌浓度。
表2对比例中探针序列
结果：见表3
表3回收率
通过表3可知，本申请甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法的回收率在98.40%-102.04%，而对比例的检测方法回收率在90.32%-97.38%，结果表明本申请使用环状哑铃探针的检测方法比使用变构探针的检测方法准确可靠，可真实反映出临床样本中的甲氧西林金黄色葡萄球菌。在甲氧西林金黄色葡萄球菌浓度在50cfu/mL是检测线时本申请的方法可以检测到甲氧西林金黄色葡萄球菌，而对比例未检出甲氧西林金黄色葡萄球菌。
Claims (5)
1.一种甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法，其步骤包括：采用生物传感器对待测样品进行检测，所述生物传感器包括环状哑铃探针以及辅助探针，所述环状哑铃探针的两端环部通过中间的颈部连接在一起，颈部是由反向互补配对的碱基对组成的互补链，分别为上链和下链；所述上链和/或下链含有识别甲氧西林金黄色葡萄球菌的核酸适配体部分和一个或两个核酸内切酶识别位点；所述环状哑铃探针的序列如SEQ ID NO:1所示；
所述颈部的碱基序列上分别标记有报告荧光基团以及淬灭荧光基团；当含有甲氧西林金黄色葡萄球菌时，甲氧西林金黄色葡萄球菌序列将与探针的核酸适配体互补配对，环状哑铃探针颈部被打开，发生链杂交反应后发出荧光信号；当样品中不含有甲氧西林金黄色葡萄球菌时，环状哑铃探针保持环状哑铃型状态；所述辅助探针的序列如SEQ ID NO:2所示；
所述生物传感器对待测样品进行检测，包括如下步骤: 将环状哑铃探针溶液、辅助探针溶液与PBS缓冲液和待测样品混合，第一次孵育培养；向其加入dNTPs溶液、DNA聚合酶、核酸内切酶、磁珠溶液和亚硝酸银溶液，磁分离，第二次孵育培养；最后向其中加入核酸外切酶和与荧光染料，第三次孵育培养，得到产物溶液，根据显色判断待测样品中是否含有甲氧西林金黄色葡萄球菌；采用荧光分光光度计在652nm波长下测定待测样品中甲氧西林金黄色葡萄球菌含量；
所述磁珠是固定有银离子Ag+适配体的磁珠；其中所述Ag+适配体的序列如SEQ ID NO:3所示；
所述的核酸内切酶为Nb.BbvCI和/或Nb.Bpu101；
所述的核酸外切酶选自Exo-I、Exo-II、Exo-III中任一种或几种。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述环状哑铃探针溶液的制备：取环状哑铃探针用DEPC水配制，再加热到85-100℃，并孵化3-10分钟，然后冷却至40℃以下；所述辅助探针溶液的制备：取辅助探针用DEPC水配制，再加热到85-100℃，并孵化3-10分钟，然后冷却至40℃以下。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述环状哑铃探针溶液浓度为0.2-1.0mM、所述辅助探针溶液浓度为0.2-1.0mM；所述核酸内切酶的酶浓度0.10-0.30U/ml；所述核酸外切酶的酶浓度为2.0-3.0U/L；所述DNA聚合酶的酶浓度0.10-0.20U/ml。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述 dNTPs溶液浓度为220-270mM；所述磁珠溶液浓度为8-12mM；所述亚硝酸银溶液浓度3-7mM；所述的荧光染料包括TMB底物溶液；所述TMB底物溶液浓度为3-7mM。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：第一次孵育培养温度30-50℃，培养15-45min；第二次孵育培养温度30-50℃，培养10-30min；第三次孵育培养温度25-35℃，培养10-30min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410161636.8A CN117706088B (zh) | 2024-02-05 | 2024-02-05 | 甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410161636.8A CN117706088B (zh) | 2024-02-05 | 2024-02-05 | 甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117706088A CN117706088A (zh) | 2024-03-15 |
| CN117706088B true CN117706088B (zh) | 2024-05-03 |
Family
ID=90161075
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410161636.8A Active CN117706088B (zh) | 2024-02-05 | 2024-02-05 | 甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117706088B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102399877A (zh) * | 2011-11-09 | 2012-04-04 | 泰普生物科学（中国）有限公司 | 一种金黄色葡萄球菌耐甲氧西林菌株pcr检测试剂盒 |
| CN109490284A (zh) * | 2018-12-03 | 2019-03-19 | 青岛大学 | 一种基于金纳米颗粒和二碳化钛MXenes的双重催化鲁米诺电化学发光生物传感器 |
| JP2022052023A (ja) * | 2020-09-23 | 2022-04-04 | 三洋化成工業株式会社 | 細胞外小胞の製造方法 |
| CN116287351A (zh) * | 2023-04-27 | 2023-06-23 | 复旦大学附属妇产科医院 | 一种探针组合和金黄色葡萄球菌的检测方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7888075B2 (en) * | 2007-07-31 | 2011-02-15 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Detection of methicillin-resistant and methicillin-sensitive Staphylococcus aureus in biological samples |
-
2024
- 2024-02-05 CN CN202410161636.8A patent/CN117706088B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102399877A (zh) * | 2011-11-09 | 2012-04-04 | 泰普生物科学（中国）有限公司 | 一种金黄色葡萄球菌耐甲氧西林菌株pcr检测试剂盒 |
| CN109490284A (zh) * | 2018-12-03 | 2019-03-19 | 青岛大学 | 一种基于金纳米颗粒和二碳化钛MXenes的双重催化鲁米诺电化学发光生物传感器 |
| JP2022052023A (ja) * | 2020-09-23 | 2022-04-04 | 三洋化成工業株式会社 | 細胞外小胞の製造方法 |
| CN116287351A (zh) * | 2023-04-27 | 2023-06-23 | 复旦大学附属妇产科医院 | 一种探针组合和金黄色葡萄球菌的检测方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Dual Fluorescent- and Isotopic-Labelled Self-Assembling Vancomycin for in vivo Imaging of Bacterial Infections;Yang, CH 等;ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION;20170220;第56卷(第9期);2356-2360 * |
| MRSA耐药机理及其检测方法的研究进展;刘思平;江凌晓;;热带医学杂志;20071028(10);1030-1032, 1022 * |
| 基于核酸等温扩增技术金黄色葡萄球菌检测的研究进展;伊廷存 等;中国酿造;20231231;第42卷(第9期);26-31 * |
| 应用DNA探针检测甲氧西林耐药葡萄球菌;樊慧珍;于化鹏;黄文杰;邓火金;;临床检验杂志;20061030(05);351-352, 254 * |
| 应用PCR方法直接检测痰中耐甲氧西林葡萄球菌;刘向群;张杰;肖白;刘敬忠;唐明忠;杜晓玲;;中国抗生素杂志;20060930(08);484-487 * |
| 核酸适配体在金黄色葡萄球菌检测中的应用进展;崔妍 等;食品工业科技;20211130;第42卷(第21期);1-7 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117706088A (zh) | 2024-03-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11505835B2 (en) | Method for determining the identity and antimicrobial susceptibility of a microorganism | |
| EP0822261B1 (en) | Methods for rapid antimicrobial susceptibility testing | |
| US20100255474A1 (en) | Method for Detecting Bacteria and Fungi | |
| US8535888B2 (en) | Compositions and methods for detecting methicillin-resistant S. aureus | |
| CN101680023B (zh) | 检测甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌的引物、探针和试剂盒 | |
| CA2925168A1 (en) | Detection of methicillin-resistant staphylococcus aureus in biological samples | |
| CN110616253A (zh) | 一种基于微滴式数字pcr技术的检测真菌的试剂盒及方法 | |
| CN101363056A (zh) | 一种高通量微生物鉴定方法 | |
| CN105349657A (zh) | 病原生物的多种分析检测 | |
| CN117706088B (zh) | 甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法 | |
| Hinata et al. | Quantitative detection of Escherichia coli from urine of patients with bacteriuria by real-time PCR | |
| RU2435853C1 (ru) | ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ Streptococcus agalactiae В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ | |
| CN116479150A (zh) | 单管一步法RPA-Cas12a/Cas13a快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 | |
| CN113265479B (zh) | 检测莫氏立克次体的引物组合物及其应用 | |
| CN111849966B (zh) | 用于鉴定短乳杆菌的恒温检测方法及其专用引物与试剂盒 | |
| CN110029179B (zh) | 一组核苷酸分子及在纹带棒状杆菌鉴定中的应用 | |
| CN113564271A (zh) | 病原菌分型定量检测引物探针组、试剂盒及样本纯化方法 | |
| CN103725761A (zh) | 一种b族链球菌(gbs)核酸检测试剂盒及检测方法 | |
| US20230374570A1 (en) | Method and system for detecting fungal genes and kit for use with same | |
| CN110669854A (zh) | 鉴定金黄色葡萄球菌及其耐药性的引物探针组合 | |
| CN1261590C (zh) | 菌血症检验用基因芯片的检验方法 | |
| US20090253128A1 (en) | Nucleotide sequence for identifying of acinetobacter bacteria, and method and kit of identification of acinetobacter bacteria | |
| KR102301392B1 (ko) | 바실러스 터린지엔시스 및 바실러스 세레우스 구별용 프라이머 세트 및 이를 이용하는 방법 | |
| CN117126920B (zh) | 基于纳米孔测序平台的中枢神经感染病原体建库和检测方法 | |
| JP3607327B2 (ja) | 単一微生物細胞の迅速検出法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |