CN101680023B - 检测甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌的引物、探针和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测样品中甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)的存在或不存在的方法，所述方法包括进行扩增步骤、杂交步骤和检测步骤。此外，本发明涉及用于MRSA的检测的引物、探针和试剂盒。

Description

检测甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌的引物、探针和试剂盒

本发明涉及检测样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的存在或不存在的方法，所述方法包括进行扩增步骤、杂交步骤和检测步骤。此外，本发明涉及用于MRSA的检测的引物、探针和试剂盒。 

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus；SA)是一种细菌，其天然的储存器是粘性的或湿润/含盐的皮肤区域，如腹股沟、肛门或鼻部。此外它存在于创伤处。总的说来，鼻部是金黄色葡萄球菌的主要环境。然而，金黄色葡萄球菌可以引起疾病，从较小的皮肤感染(例如，丘疹、疖和蜂窝组织炎(cellulites))和脓肿，到严重的疾病如肺炎、脑膜炎、心内膜炎、中毒性休克综合征(TSS)、败血症和多器官功能障碍综合征(MODS)。每年，在美国医院中大约500,000名患者遭遇葡萄球菌感染。 

当今，金黄色葡萄球菌对许多常用的抗生素变得有抗性。在英国，所有金黄色葡萄球菌分离株的仅2％对青霉素敏感，在世界其他地方也有类似情况。开发了β-内酰胺酶抗性-青霉素(甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林和氟氯西林)来治疗青霉素抗性金黄色葡萄球菌，并仍然用作第一线的治疗。甲氧西林是这个类别中使用的第一种抗生素(它在1959年引入)，但仅两年后，在英国报道了第一例甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)。MRSA还被称为苯唑西林抗性金黄葡萄球菌(ORSA)以及多抗性金黄色葡萄球菌，而如果必需进行明确的区别，金黄色葡萄球菌的非甲氧西林抗性菌株有时称为甲氧西林敏感性金黄葡萄球菌(MSSA)。 

尽管有它的抗性，直到1990年代甚至在医院环境中MRSA一般仍是罕有的发现，在这时MRSA发病率在医院中显著地提高，现在它是在医院里域内流行的。此外，在美国，存在着通过衣帽间和体育馆中的皮肤接触暴发MRSA定居现象和感染的越来越多的报告，甚至是在健康群体之中。MRSA在儿科学中也成为难题(Johnson AP等，2005，J Antimicrob Chemother 56(3)：455-62)。自2005年早期起，在英国归因于MRSA的死亡数目通过各种来源的估计在3000人每年 的范围内(Johnson，上文) 

由MRSA引起的感染显示了更高的致死率和更严重的症状，因为由于对仅仅少数抗生素的抗性治疗受到限制。MRSA的第一线的治疗当前是糖肽抗生素(万古霉素和替考拉宁(teicoplanin))。然而，这些抗生素存在许多难题，主要在于静脉内施用(没有可用的口服制品)的要求、毒性和定期通过血液测试的手段监视药物水平的要求。还牵涉的是，糖肽抗生素类不能很好地穿透进入感染的组织(对于脑和脑膜的感染以及在心内膜炎中这是特别关注的)。然而，由于结果较差，糖肽不能用于治疗甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌。结合起来，与仅感染SA的患者相比，感染MRSA的患者在医院中留置更长的时间。 

此外，未被识别的MRSA定居(colonization)可能通过用MRSA替换MRSA-未定居患者的菌群而引起MRSA从一个患者到另一个患者的散布。定居通过某些风险因素被易化，包括，例如，早先的抗生素治疗、多病状和糖尿病以及早先在医院的留置。 

这决定了高度重要的是拥有安全和可靠的工具用于MRSA的诊断和/或检测。 

当前，大多数皮肤感染的诊断结论是通过症状和身体检查发现的模式作出的，但是通常不可能的是知道感染是由任何类型的葡萄球菌属细菌还是由其他细菌，如A组β-溶血性链球菌(化脓性链球菌，(Streptococcus pyogenes))所引起。为了得到确定的诊断结论和确认MRSA是引起感染的细菌，可以进行培养。 

然而，利用常规的培养诊断MRSA需要16-72小时，引起治疗的延迟，显著地损害患者结局，并可能促成暴发以及提高医院成本。 

表型的分析，例如凝固酶类型、肠毒素(SE)类型、中毒性休克综合征毒素-1的产生、体外抗生素易感性，已经常规地用于MRSA菌株分型。 

另外，已经建立了MRSA菌株的遗传型分析，提供了比表型分析更详细的分类法。特别是，利用MRSA的总基因组DNA的限制性片断的脉冲场凝胶电泳(PFGE)是特征化的极好的方法。 

做为选择，通过利用七种持家基因(housekeeping)的内部片段的序列，可以利用多位点序列分型(MLST)来表征细菌的分离株。 已经开发了MLST并批准用于金黄色葡萄球菌(Enright等2002，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.99：7687-7692)，提供了一种鉴别方法，其容许在不同国家回收的相关菌株被容易地鉴定。 

已经开发了测试试剂盒来检测MRSA(例如，IDI-MRSA分析，Becton Dickinson，USA)以帮助预防和控制护理环境中的MRSA感染，其是用于甲氧西林抗性金黄葡萄球菌(MRSA)鼻部定居的直接检测的体外诊断测试。 

然而，这种试剂盒具有限制其有用性的一系列缺点。首先，它不能检测V型葡萄球菌染色体盒(SCC)的MRSA，这是重要的，因为V型SCC是早先鉴定的类型，特别是在亚洲和澳大利亚存在。第二，它的适用性受到更高探针数量的限制。第三，样品的制备是十分复杂的或困难的。第四，为对照物使用的构思不是现有技术。此外，抑制率是十分高的，最后，需要使用许多引物和探针，结果形成倾向于误差的诊断工具。另外，与扩增曲线相比，可以被FRET探针分析使用的熔解曲线分析容许输出信号内的更高的特异性。 

因而，本发明的一个目的是提供用于检测MRSA的可选择的方法，优选的，避免上述缺点的可选择的方法。 

本发明的目的通过提供检测样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的存在或不存在的方法来解决了，所述方法包括： 

(a)进行扩增步骤，包括用MRSA引物组接触所述样品来产生扩增产物，如果MRSA存在于所述样品中， 

(b)进行杂交步骤，包括用MRSA探针对接触步骤(a)的所述扩增产物，其中MRSA探针对的第一MRSA探针是用供体荧光部分标记的，以及其中所述MRSA探针对的第二MRSA探针是用相应的接受体荧光部分标记的；以及 

(c)检测所述第一MRSA探针的供体荧光部分和所述第二MRSA探针的接受体荧光部分之间荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在，其中FRET的存在是样品中存在MRSA的指示，以及其中FRET的不存在是样品中不存在MRSA的指示，其中所述方法能够检测MRSA的I到V型葡萄球菌染色体盒(Staphylococcal Chromosomal Cassettes，SCCmec)的每一种。 

所述方法可以用于样品中MRSA的快速和可靠的检测。特别地， 所述方法可以用来检测样品中的MRSA，或诊断个体例如患者的MRSA感染。 

因而，MRSA的快速检测改善了患有MRSA的患者的状况，例如，通过更早的治疗，通过例如对医院中定居或感染MRSA的患者的屏蔽预防措施的快速和严格的应用，防止MRSA的爆发，并因而降低了护理成本。另外，在本发明的优选的实施方式中，可以使用有限数量的引物，例如3种或4种，来检测所有目前已知的SCCmec型，即，I、II、III、IV和V型的成员，其提供了用于检测MRSA的高度可靠的工具。 

如上文详述的，本发明的方法适合于检测所有已知的葡萄球菌染色体盒(SCCmec)型，即，I、II、III、IV和V型的MRSA。为了例如对感染MRSA的患者选择合适的治疗，这是特别重要的。 

甲氧西林抗性基因(mecA)。MecA编码改变的甲氧西林抗性青霉素结合蛋白(PBP2a或PBP2’)，一种具有对β-内酰胺环(β-内酰胺抗生素类例如青霉素、头孢菌素和碳青霉烯类的主要活性位点)的降低的亲和力的青霉素结合蛋白(Guignard B等，2005，Curr OpinPharmacol 5(5)：479-89)，其不存在于敏感菌株中，被认为是从远源相关的物种获得的。MecA被携带在可动的遗传元件，MRSA菌株的葡萄球菌染色体盒mec(SCCmec)上，已经描述了其在大小和遗传组成上不同的五种形式。SCC元件也存在于敏感金黄色葡萄球菌中，但是不带有mecA基因或带有无功能的mecA基因。这些菌株是假阳性结果的主要来源，因为它们具有相同的右侧末端接点。 

然而，通过检测mecA基因和金黄色葡萄球菌特异性基因的鼻样本的MRSA检测产生了低阳性预测值(PPV)，是由于各种数量的非抗性SA和甲氧西林抗性凝固酶阴性葡萄球菌(MRCoNS)的存在。由于两种靶的存在，它们的组合不能与MRSA区分开来。取决于MRSA的流行率，这种情况导致了最高至30％的假阳性结果。对于更好的PPV，被选的靶需要对MRSA是独特的。当前已知的的仅有的靶是葡萄球菌染色体盒(SCCmec)，其扩增带有mecA基因的遗传元件的转座子整合位点。 

SCCmec，MRSA的SCC元件(具有功能性的mec A基因)，是16kb-67kb长度的转座子，整合到来自金黄色葡萄球菌(orfX)的含 有mecA基因的开放阅读框X的3’部分中。MecA编码PBP2a，其赋予对甲氧西林和它的衍生物以及对其他抗生素的抗性。OrfX在金黄色葡萄球菌中没有确定的功能，是SA独特的。SCCmec的整合产生了对MRSA独特的标志。 

SCCmec元件具有两个关键成分，ccr基因复合体(ccr)和mec基因复合体(mec)。ccr基因复合体由ccr基因和周围的开放阅读框(ORFs)组成，mec基因复合体由mecA基因、调节基因和mecA上游或下游的插入序列组成。在SCCmec元件中已经发现了几种mec和ccr同种异型，其导致以下的分类(Ito et al，2004，Antimicrob AgentsChemother.48：2637-2651)： 

-I型SCCmec，具有B类mec和1型ccr； 

-II型SCCmec，具有A类mec和2型ccr； 

-III型SCCmec，具有A类mec和3型ccr； 

-IV型SCCmec，具有B类mec和2型ccr；和 

-V型SCCmec，具有C2类mec和5型ccr。 

然而，MRSA的分类和向I到V型SSCmec的分配是一种表型的方法。做为选择，可以使用利用MRSA的不同基因型的方法。根据基因型的MRSA检测和分类的一个靶可以是SCCmec的右侧末端接点(RE)。MRSA分型关系的这种可选择的方法因而被称为RE(SCCmec的右侧末端)分型。这种分型方法利用了在三种类型的SCCmec中邻近于整合位点的SCCmec DNA的右侧末端的多态性。在SEQ ID NO：78到85的核酸序列的基础上，MRSA可以分类为如下的： 

RE2A型(GenBank gi|73537130|gb|DQ106887.1|；SEQ ID NO：78) 

TTTGCTTCACTATAAGTATTCAGTATAAAGAATATTTCGCTATTATTTACTTGAAATGAAAGACTGCGGAGGCTAACTATGTCAAAAATCATGAACCTCATTACTTATGATAAGCTTCTTAAAAACATAACAGCAATTCACATAAACCTCATATGTTCTGATACATTCAAAATCCCTTTATGAAGCGGCTGAAAAAACCGCATCATTTGATATGCTTCTTAAAAACATAACAGCAATTCACATAAACCTCATATGTTCTGATACATTCAAAATCCCTTTATGAAGCGGCTGAAAAAACCGCATCATTTATGATATGCTTCTCCACGCATAATCTTAAATGCTCTATACACTTGCTCAATTAACACAACCCGCATCATTTGATGTGGGAATGTCATTTTGCTGAATGATAGTGCGTAGTTACTGCGTTGTAAGACGTCCTTGTGCAGGCCGTTTGATCCGCCAATGACGAATACAAAGTCGCTTTGCCCTTGGGTCATGCGTTGGTTCAATTCTTGGGCCAATCCTTCGGAAGATAGCATCTTTCCTTGTATTTCTAATGTAATGACTGTGGATTGTGGTTTAATTTTGGCTAGTATTCGTTGGCCTTCTTTTTCTTTTACTTGCTCAATTTCTTTGTCGCTCA 

RE2_B型(GenBank gi|73537130|gb|DQ106887.1|；SEQ ID NO：79) 

TTTGCTTCACTATAAGTATTCAGTATAAAGAATATTTCGCTATTATTTACTTGAAATGAAAGACTGCGGAGGCTAACTATGTCAAAAATCATGAACCTCATTACTTATGATAAGCTTCTTAAAAACATAACAGCAATTCACATAAACCTCATATGTTCTGATACATTCAAAATCCCTTTATGAAGCGGCTGAAAAAACCGCATCATTTATGATATGCTTCTCCACGCATAATCTTAAATGCTCTATACACTTGCTCAATTAACACAACCCGCATCATTTGATGTGGGAATGTCATTTTGCTGAATGATAGTGCGTAGTTACTGCGTTGTAAGACGTCCTTGTGCAGGCCGTTTGATCCGCCAATGACGAATACAAAGTCGCTTTGCCCTTGGGTCATGCGTTGGTTCAATTCTTGGGCCAATCCTTCGGAAGATAGCATCTTTCCTTGTATTTCTAATGTAATGACTGTGGATTGTGGTTTAATTTTGGCTAGTATTCGTTGGCCTTCTTTTT 

RE2_C型(GenBank gi|57284222|gb|CP000046.1|；SEQ ID NO：80) 

TTTGCTTCACTATAAGTATTCAGTATAAAGAATATTTCGCTATTATTTACTTGAAATGAAAGACTGCGGAGGCTAACTATGTCAAAAATCATGAACCTCATTACTTATGATAAGCTTCTCCACGCATAATCTTAAATGCTCTATACACTTGCTCAATTAACACAACCCGCATCATTTGATGTGGGAATGTCATTTTGCTGAATGATAGTGCGTAGTTACTGCGTTGTAAGACGTCCTTGTGCAGGCCGTTTGATCCGCCAATGACGAATACAAAGTCGCTTTGCCCTTGGGTCATGCGTTGGTTCAATTCTTGGGCCAATCCTTCGGAAGATAGCATCTTTCCTTGTATTTCTAATGTAATGACTGTGGATTGTGGTTTAATTTTGGCTAGTATTCGTTGGCCTTCTTTTT 

RE3(GenBank gi|23451317|gb|AF422696.1|；SEQ ID NO：81) 

CATTCTTTCTTGATTCCATTAGTTTAAATTTAAAATTTNTCATACAATTTCTTAATTTAATTGTAGTTCCATAATCAATATAATTTGTACAGTTATTATATATTCTAGATCATCAATAGTTGAAAAATGGTTTATTAAACACTCTATAAACATCGTATGATATTGCAAGGTATAATCCAATATTTCATATATGTAATTCCTCCACATCTCATTAAATTTTTAAATTATACACAACCTAATTTTTAGTTTTATTTATGATACGCTTCTCCACGCATAATCTTAAATGCTCTGTACACTTGTTCAATTAACACAACCCGCATCATTTGATGTGGGAATGTCATTTTGCTGAATGATAGTGCGTAGTTACTGCGTTGTAAGACGTCCTTGTGCAGGCCGTTTGATCCGCCAATGACGAATACAAAGTCGCTTTGCCCTTGGGTCATGCGTTGGTTCAATTCTTGGGCCAATCCTTCGGAAGATAGCATCTTTCCTTGTATTTCTAATGTAATGACTGTTGATTGTGGTTTGATTTTGGCTAGTATTCGTTGGCCTTCTTTTTCTTTTACTTGCTCAATTTGCTTTGTCGTCTCATATT 

RE4(GenBank AY267374_；SEQ ID NO：82) 

TCCATCTCTACTTTATTGTTTTCTTCAAATATTATCTCGTAATTTACCTTGTTCATTAAACAAAAAACTGGATAAAAAACCGCATCATTTGTGGTACGCTTCTCCACGCATAATCTTAAATGCTCTGTACACTTGTTCAATTAACACAACCCGCATCATTTGATGTGGGAATGTCATTTTGCTGAATGATAGTGCGTAGTTACTGCGTTGTAAGACGTCCTTGTGCAGGCCGTTTGATCCGCCAATGACGAATACAAAGTCGCTTTGCCCTTGGGTCATGCGTTGGTTCAATTCTTGGGCCAATCCTTCGGAAGATAGCATCTTTCCTTGTATTTCTAATGTAATGACTGTTGATTGTGGTTTGATTTTGGCTAGTATTCGTTGGCCT 

RE5(GenBank AY267381；SEQ ID NO：83) 

AGATGCCTATAAACTAACAATTACAAATTATTATTTTGTGTTTCACATTATAATATATCAACTAGAATTAATTCTTAATAAAAAGTAATCATTAAAATTTAATAAACTCTGCTTTATATTATAAAATTACGGCTGAAATAACCGCATCATTTATGATATGCTTCTCCTCGCATAATCTTAAATGCTCTATACACTTGTTCAATTAACACAACCCGCATCATTTGATGTGGGAATGTCATTTTGCTGAATGATAGTGCGTAGTTACTGCGTTGTAAGACGTCCTTGTGCAGGCCGTTTGATCCGCCAATAACGAATACAAAGTCGCTTTGCCCTTGGGTCATGCGTTGGTTCAATTCTTGGGCCAATCCTTCGGAAGATAGCATCTTTCCTTGTATTTCTAATGTAATGACTGTGGATTGTGGTTTGATTTTGGCTAGTATTCGTTGGCCTTCTTTTTCTTTTACTTGCTCGATTTCTTT 

RE6(GenBank AY267375；SEQ ID NO：84) 

AAAAAGAAGTCGATTTACACACCATGTATTAAATAATGGAAATTCTTAATCTTTACTTGTACCTAAATTATCAAACTTAATATTCACTTTTTATTCTTCAAAGATTTGAGCTAATTTAATAATTTTCTCATATTTTTTAGTTTTATTTGTGGTACGCTTCTCCTCGCATAATCTTAAATGCTCTATACACTTGTTCAATTAACACAACCCGCATCATTTGATGTGGGAATGTCATTTTGCTGAATGATAGTGCGTAGTTACTGCGTTGTAAGACGTCCTTGTGCAGGCCGTTTGATCCGCCAATAACGAATACAAAGTCGCTTTGCCCTTGGGTCATGCGTTGGTTCAATTCTTGGGCCAATCCTTCGGAAGATAGCATCTTTCCTTGTATTTCTAATGTAATGACTGTGGATTGTGGTTTGATTTTGGCTAGTATTCGTTGGCCTTCTTTTTCTTTTACTTGCTCGATTTCTTT 

RE7(GenBank gi|49257031|dbj|AB121219.1|，SEQ ID NO：85) 

CAAAAAATATATTTACTTTAGTCAAATCATCTTCACTAGTGTAATTATCGAATGATTTATAACTAACATTTTCTAATTTATTTAACATAAAATCAATCCTTTTTATATTTAAAATATATTATACACAATCCGTTTTTTAGTTTTATTTATGATACGCCTCTCCACGCATAATCTTAAATGCTCTATACACTTGTTCAATTAACACAACCCGCATCATTTGATGTGGGAATGTCATTTTGCTAAATGATAGTGCATAGTTACTGCGTTGTAAGACGTCCTTGTGCAGGCCGTTTGATCCGCCAATGACGAATACAAAGTCGCTTTGCCCTTGGGTCATGCGTTGGTTCAATTCTTGGGCCAATCCTTCGGAAGATAGCATCTTTCCTTGTATTTCTAATGTAATGACTGTGGATTGTGGTTTGATTTTGGCTAGTATTCGTTGGCCTTCTTTTTCTTTTACTTGCTCAATTTCTTTGT 

如上文详述的，RE类型描述了SCCmec转座子的右侧末端接点的序列变异。RE2构成了所有RE类型的大部分(代表I、II III(某些)和一些IV型SCCmec)。RE3和RE7分别代表了III和V型SCCmec以及V型SCCmec。 

因此，在本发明的一个优选的实施方式中，使用特定的引物组以提供所有SCCmec类型的检测。引物组可以包含 

(i)特异于RE2型MRSA的引物， 

特别是包含或由核酸序列组成的引物，所述核酸序列选自 

-5’-GCA ATT CAC ATA AAC CTC ATA TGT TC-3’(AR mec1 fwd；SEQID NO：1)， 

-5’-ACC TCA TAT GTT CTG ATA CAT TCA-3’(AR mec2 fwd；SEQ IDNO：2)， 

-5’-GCA ATT CAC ATA AAC CTC ATA T-3’(AR mec3 fwd；SEQ ID NO：3)， 

-5’-CAT AAC AGC AAT TCA CAT AAA CCT C-3’(AR mec4 fwd；SEQ IDNO：4)， 

-5’-TAA CAG CAA TTC ACA TAA ACC T-3’(AR mec5 fwd；SEQ ID NO：5)， 

-5′-CGC TAT TAT TTA CTT GAA ATG AAA GAC-3′(AR mec6 fwd；SEQID NO：6)， 

-5′-CTT GAA ATG AAA GAC TGC GGA-3′(AR mec7 fwd；SEQ ID NO：7)， 

-5′-TTG CTT CAC TAT AAG TATTCA GTA TAA AGA-3′(AR mec8 fwd；SEQ ID NO：8)， 

-5′-ATT TAC TTG AAA TGA AAG ACT GCG-3′(AR mec9 fwd；SEQ IDNO：9)， 

-5′-AAA GAA TAT TTC GCT ATT ATT TAC TTG AA-3′(AR mec10 fwd；SEQ ID NO：10)， 

-5′-TCA GTA TAA AGA ATA TTT CGC TAT TAT TT-3′(AR mec11 fwd；SEQ ID NO：11)， 

-5′-TGA AAT GAA AGA CTG CGG AG-3′(AR mec12 fwd；SEQ ID NO：12)， 

-5’-AAC CTC ATA TGT TCT GAT ACA TTC AAA-3’(JU1 fwd；SEQ IDNO：13)， 

-5′-TAT GTC AAA AAT CAT GAA CCT CAT TAC T-3′(JU2 fwd；SEQ IDNO：14)， 

-5′-CAT AAC AGC AAT TCA CAT AAA CCT C-3′(JU3 fwd；SEQ ID NO：15)， 

-5′-GAC TGC GGA GGC TAA CT-3′(JU4 fwd；SEQ ID NO：16)， 

-5′-ATC CCT TTA TGA AGC GGC-3′(JU5 fwd；SEQ ID NO：17)，和 

-5’-TGA AAT GAA AGA CTG CGG AG-3’(MRSA direct RE2 fwd；SEQ IDNO：92)， 

尤其是AR mec11 fwd或AR mec12 fwd或MRSA direct RE2 fwd，特别是MRSA direct RE2 fwd； 

和/或 

(ii)特异于RE3型MRSA的引物， 

特别是包含或由核酸序列组成的引物，所述核酸序列选自 

-5’-GCA AGG TAT AAT CCA ATA TTT CAT ATA TGT-3’(AR mecA 3/1；SEQ ID NO：18)， 

-5’-AGT TCC ATA ATC AAT ATA ATT TGT ACA GT-3’(AR mecA 3/2；SEQ ID NO：19)， 

-5’-ACA TCG TAT GAT ATT GCA AGG TA-3’(AR mecA 3/3；SEQ IDNO：20)， 

-5’-CTT TCA TTC TTT CTT GAT TCC ATT AG-3’(AR mecA 3/4；SEQ IDNO：21)， 

-5’-CAC TCT ATA AAC ATC GTA TGA TAT TGC-3’(AR mecA 3/5；SEQID NO：22)， 

-5’-TTC TTA ATT TAA TTG TAG TTC CAT AAT CAA-3’(AR mecA 3/6；SEQ ID NO：23)， 

-5′-AAT TAT ACA CAA CCT AAT TTT TAG TTT TAT-3′(AR mec A3/7；SEQ ID NO：24)， 

-5’-AAT TTT TAG TTT TAT TTA TGA TAC GCT TC-3’(AR mecA 3/8；SEQ ID NO：25)， 

-5’-ACA CAA CCT AAT TTT TAG TTT TAT TTA TGA-3’(AR mecA 3/9；SEQ ID NO：26)， 

-5′-TTT ATT AAA CAC TCT ATA AAC ATC GTA TGA-3′(AR mecA 3/10；SEQ ID NO：27)， 

-5’-CCA CAT CTC ATT AAA TTT TTA AAT TAT ACA C-3’(AR mecA3/13 SEQ ID NO：28)，和 

-5’-CCA CAT CTC ATT AAA TTT TTA AAT TAT ACA C-3’(MRSAdirect RE3 fwd；SEQ ID NO：93)， 

尤其是AR mecA 3/8或AR mecA 3/1或MRSA direct RE3 fwd，特别是MRSA direct RE3 fwd； 

和/或 

(iii)特异于RE7型MRSA的引物， 

特别是包含或由核酸序列组成的引物，所述核酸序列选自 

-5’-ATA TTA TAC ACA ATC CGT TTT TTA GTT TTA-3’(AR mec 5/1，SEQ ID NO：29)， 

-5’-ACA CAA TCC GTT TTT TAG TTT TAT TTA TG-3’(AR mec 5/2，SEQID NO：30)， 

-5’-TTC TAA TTT ATT TAA CAT AAA ATC AAT CCT-3’(AR mec 5/3，SEQ ID NO：31)， 

-5’-CAA TCC TTT TTA TAT TTA AAA TAT ATT ATA CAC-3’(AR mec5/16 SEQ ID NO：32)，和 

-5’-CAA TCC TTT TTA TAT TTA AAA TAT ATT ATA CAC-3’(MRSAdirect RE7 fwd；SEQ ID NO：94)， 

尤其是AR mec 5/2或AR mec 5/16或MRSA direct RE7 fwd，特别是MRSA direct RE7 fwd。 

术语“引物”在此按照本领域专门技术人员所知的使用，是指“寡聚化合物”，主要指“寡核苷酸”，但还指“修饰的寡核苷酸”，其能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成，即，例如寡核苷酸的3′末端提供了游离的3′-OH基团，其上可以通过模板依赖性DNA聚合酶附着上另外的“核苷酸”，建立3′到5′磷酸二酯键，由此使用脱氧核苷三磷酸并由此释放焦磷酸。因而，除了预期功能之外，在根据本发明的“引物”、“寡核苷酸”或“探针”之间没有根本的差异。 

在本发明的再更优选的实施方式中，所述引物组包含或由特异于RE2型MRSA的引物、特异于RE3型MRSA的引物和特异于RE7型MRSA的引物组成，特别地，其中RE2型MRSA、RE3型MRSA和RE7型MRSA的引物包含或由核酸序列组成，所述核酸序列分别选自SEQ ID NO：1到17和92，SEQ ID NO：18到28和93，以及SEQ IDNO：29到32和94的序列，尤其是，其中所述RE2型MRSA、RE3型MRSA和RE7型MRSA的引物分别包含或由SEQ ID NO：11、SEQID NO：25和SEQ ID NO：30的核酸序列组成，或优选的尤其是，其中RE2型MRSA、RE3型MRSA和RE7型MRSA的引物分别包含或由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：32的核酸序列组成，更优选的，其中RE2型MRSA、RE3型MRSA和RE7型MRSA的引物分别包含或由SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93和SEQ ID NO：94的核酸序列组成。 

在本发明另一个优选的实施方式中，所述引物组另外包含另外的特异于甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)以及甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)的引物(MRSA/MSSA的引物)。这些引物的实例选自引物的组，所述引物组包含或由核酸序列组成，所述核 酸序列选自： 

-5’-AGG AAA GAT GCT ATC TTC CGA-3’(AR mec1 rev，SEQ ID NO：33)， 

-5’-GAA AGA TGC TAT CTT CCG AAG-3’(AR mec2 rev，SEQ ID NO：34)， 

-5’-GAT GCT ATC TTC CGA AGG-3’(AR mec3 rev，SEQ ID NO：35)， 

-5’-GTC ATT ACA TTA GAA ATA CAA GGA AAG AT-3’(AR mec4 rev，SEQID NO：36)， 

-5’-GCC AAC GAA TAC TAG CC-3’(AR mec5 rev，SEQ ID NO：37)， 

-5′-ACG AAT ACT AGC CAA AAT TAA ACC-3′(AR mec6-2 rev，SEQ ID NO：38)， 

-5′-CAC AAT CCA CAG TCA TTA CAT TAG A-3′(AR mec7 rev，SEQ ID NO：39)， 

-5’-CAA GGA AAG ATG CTA TCT TCC G-3’(JU1 rev，SEQ ID NO：40)， 

-5′-AGT CAT TAC ATT AGA AAT ACA AGG AAA GA-3′(JU2 rev，SEQ IDNO：41)， 

-5′-AGGAAAGATGCTATCTTCCGA-3′(JU3 rev，SEQ ID NO：42)， 

-5′-AGG AAA GAT GCT ATC TTC CGA-3′(JU4 rev，SEQ ID NO：43)， 

-5′-ACA ATC CAC AGT CAT TAC ATT AGA A-3′(JU5 rev，SEQ ID NO：44)，和 

-5’-CAA GGA AAG ATG CTA TCT TCC G-3’(MRSA direct rev；SEQ ID NO：95)， 

尤其是AR mec6-2 rev或JU1 rev或MRSA direct rev，特别是MRSA direct rev。 

如上文详述的，本发明的目的是提供用于MRSA检测的高度可靠的工具。为了降低本发明的方法失败的可能性，所述方法中使用的引物的数量被限制。因而，在本发明进一步优选的实施方式中，引物组由最多5个、优选的最多3或4个引物组成。这些组的实例有： 

-特异于RE2型MRSA的引物、特异于RE3型MRSA的引物、和特异于RE7型MRSA的引物，尤其是其中所述引物的一个、两个或三个选自SEQ ID NO：1到32和92到94的核酸， 

-特异于RE2型MRSA的引物、特异于RE3型MRSA的引物、特异于RE7型MRSA的引物和特异于MRSA以及MSSA的引 物(MRSA/MSSA的引物)，尤其是其中所述引物的一个、两个、三个或四个选自SEQ ID NO：1到44和92到95的核酸， 

-AR mec11 fwd、AR mecA 3/8和AR mec5/2和任选的反向引物、 

-AR mec12 fwd、AR mecA 3/13和AR mec5/16和任选的反向引物、 

-AR mec11 fwd、AR mecA 3/8、AR mec5/2和AR mec6-2 rev、 

-AR mec12 fwd、AR mecA 3/13、AR mec5/16和JU1 rev、 

-MRSA direct RE2 fwd、MRSA direct RE3 fwd和MRSA directRE7 fwd和任选的反向引物，或 

-MRSA direct RE2 fwd、MRSA direct RE3 fwd、MRSA direct RE7fwd和MRSA direct rev。 

在本发明的另一个实施方式中，RE2、RE3、RE7和/或MRSA/MSSA的引物包含或由SEQ ID NO：1到44或92到95的任一引物的功能活性的变体组成，任选地包含在上文详述的特定引物的任何优选组合中。 

SEQ ID NO：1到44或92到95的任一引物的功能活性的变体可以利用本发明的方法中的引物来鉴定。SEQ ID NO：1到44或92到95的任一引物的功能活性的变体涉及引物，与SEQ ID NO：1到44或92到95的相应序列相比，其提供了在本发明的方法或试剂盒中类似的或更高的特异性和敏感性。 

术语“特异性”在对于给定类别的二元分类测试中是所述测试将案例正确地分类为不属于该类别的概率。也就是说，它是群体中所有阴性案例的真阴性的比例。它是测试的参数。在当前情况下，对于确定是否存在MRSA的MRSA检测，对于存在MRSA的特异性是，如果没有MRSA、测试为阴性的概率。 

因而，100％的特异性意味着所述测试将所有MRSA阳性样品识别为MRSA阳性。 

在本发明的上下文中相似的特异性是指一种特异性，其最多10％、 优选的最多5％、更优选的最多4、3、2、或1％小于相应引物的特异性，如果所述引物(变体和没有突变的相应引物)在本发明的方法中测试，优选的在实施例3中描述的方法中测试。 

术语“敏感性”在对于给定类别的二元分类测试中是所述测试将案例正确地分类为属于该类别的概率。也就是说，它是群体中所有阳性案例的真阳性的比例。它是测试的参数。在当前情况下，对于确定是否存在MRSA的MRSA检测，对于存在MRSA的敏感性是，如果存在MRSA、测试为阳性的概率。 

100％的敏感性意味着所述测试将所有病人识别为患病的。我们总是能够构建一种价值不高的测试，其通过将所有测试案例分类为阳性来实现100％的敏感性。 

在本发明的上下文中相似的敏感性是指一种敏感性，其最多10％、优选的最多5％、更优选的最多4、3、2、或1％小于相应引物的敏感性，如果所述引物(变体和没有突变的相应引物)在本发明的方法中测试，优选的在实施例3中描述的方法中测试。 

在优选的实施方式中，所述引物包含或由SEQ ID NO：1到44或92到95的任一引物的功能活性的变体组成，其中 

(a)所述功能活性的变体是SEQ ID NO：1到44或92到95的引物的功能活性部分，所述部分包含SEQ ID NO：1到44或92到95的任一序列的至少70％、优选的至少80％、更优选的至少90％、最优选的至少95％； 

(b)所述功能活性的变体是与SEQ ID NO：1到44或92到95的任一序列具有至少70％、优选的至少80％、更优选的至少90％、最优选的至少95％的序列同一性的功能活性的变体； 

(c)所述功能活性的变体是包含至少一个化学上修饰的核酸的SEQ ID NO：1到44或92到95的探针；和/或 

(d)所述功能活性的变体是与SEQ ID NO：1到44或92到 95的任一序列或(a)、(b)和/或(c)的功能活性的变体互补的功能活性的变体。 

引物的部分可以通过核苷酸的末端缺失来获得(5′末端和/或3′末端处)。序列同一性可以通过序列比对来确定。用于比较的序列的比对方法是本领域公知的。例如在Smith and Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981或Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444-2448，1988中已经描述了各种程序和比对算法。 

NCBI基本局部比对检索工具(BLAST)(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)可从几个来源获得，包括国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和互联网，与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx一起使用。SEQ ID NO：1到44或92到95的任一序列的引物的变体一般利用NCBI Blast 2.x来表征。 

例如，所述变体可以与SEQ ID NO：1到44或92到95的序列不同在于一个或更多个核苷酸添加、缺失或取代，特别是在SEQ IDNO：1到44或92到95的相应序列的5′末端和/或3′末端处的一个或更多个核苷酸添加、缺失或取代。 

如上文详述的，引物(和/或探针)可以被化学地修饰，即，引物和/或探针包含修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。探针(或引物)然后成为修饰的寡核苷酸。“修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)与天然“核苷酸”不同在于一些修饰，但仍然由碱基、五呋喃糖、磷酸部分、碱基样、五呋喃糖样和磷酸样部分或其组合构成。举例来说，“标记物”可以附着于“核苷酸”的碱基部分，从而获得“修饰的核苷酸”。“核苷酸”中的天然碱基也可以被例如7-脱氮嘌呤替代，从而也获得“修饰的核苷酸”。术语“修饰的核苷酸”或“核苷酸类似物”在本申请中可互换地使用。“修饰的核苷”(或“核苷类似物”)与天然核苷不同在于按照上文对“修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)所列方式的一些修饰。 

“修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)属于“寡聚化合物”的另一个特定亚群，其拥有一个或更多个“核苷酸”、一个或更多个“非核苷酸化合物”或“修饰的核苷酸”作为“单体单位”。因而，术语“修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)是指一些结构，其以基本上类似于“寡核苷酸”的方式起作用，并且在本申请中可互换地使用。从合成的角度来看，“修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)可以例如通过“寡 核苷酸”通过磷酸主链、核糖单元或核苷酸碱基的合适的修饰的化学修饰制成(Uhlmann and Peyman，Chemical Reviews 90(1990)543；Verma S.，and Eckstein F.，Annu.Rev.Biochem.67(1998)99-134))。代表性的修饰包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸甲酯、磷酸三酯或氨基磷酸酯核苷内键代替磷酸二酯核苷内键；脱氮或氮杂嘌呤和嘧啶代替天然的嘌呤和嘧啶碱基，在5或6位置处具有取代基团的嘧啶碱基；在2、6或8位置或7位置处具有改变的取代基团的嘌呤碱基，如7-脱氮嘌呤；在例如它们的2′位置处具有取代基团的糖类；或碳环或无环糖类似物。与本发明的精神相符的其他修饰是本领域技术人员已知的。这些“修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)被最好地描述为与天然“寡核苷酸”(或沿着天然系的合成“寡核苷酸”)功能上地可互换的，而结构上不同。更详细地，示范性的修饰在Verma S.，andEckstein F.，Annu.Rev.Biochem.67(1998)99-134或WO 02/12263中公开。此外，可以产生修饰，其中核苷单位通过基团连接，所述基团取代核苷内磷酸酯或糖磷酸酯键。这样的键包括在Verma S.，andEckstein F.，Annu.Rev.Biochem.67(1998)99-134中公开的那些。除了利用磷酸酯键来连接核苷单元之外，这样的结构也被描述为“寡核苷酸”。 

然而，可以利用例如计算机程序如OLIGO(Molecular BiologyInsights Inc.，Cascade，CO)来设计可选择的引物，所述引物扩增编码MRSA的核酸分子，例如，编码RE2、RE3或RE7的部分的可选择的部分的核酸。当设计用作扩增引物的寡核苷酸时重要的特征包括，但不限于，合适大小的扩增产物以便于检测(例如，通过电泳)，引物对的成员的相似的熔解温度，以及每个引物的长度(即，引物需要足够长以序列特异性地退火和启动合成，但不能太长使得在寡核苷酸合成期间精确度被降低)。一般地，寡核苷酸引物长度是8到50个核苷酸(例如，长度8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50个核苷酸) 

MRSA的各种亚型的SCCmec的序列是公众可获得的，例如，在NCBI(国家生物技术信息中心)的核苷酸数据库(参见，例如，I型葡萄球菌盒染色体mec：菌株NCTC10442的AB033763；II型葡萄球菌盒染色体mec：菌株N315的D86934；AB047089，III型葡萄球菌 盒染色体mec的右侧末端和它的侧翼染色体区域：菌株85/3907；IV.1型(IVa)葡萄球菌盒染色体mec：菌株CA05(JCSC1968)的AB063172；或V型葡萄球菌盒染色体mec：菌株JCSC3624(WIS)的AB121219)。 

在此使用的“特异于RE2的引物”或“特异于RE3的引物”或“特异于RE7的引物”是指分别与编码RE2或RE3或RE7的核酸序列退火、并在合适的条件下由此启动合成的寡核苷酸引物。 

除了引物组之外，本发明的方法利用探针对来检测MRSA的存在或不存在。术语“探针”是指合成地或生物学地产生的核酸(DNA或RNA)，通过设计或选择，其含有特异的核苷酸序列，所述特异的核苷酸序列容许它们在规定的预定严格度下特异性地(即，优先地)杂交“目标核酸”，在本案中是MRSA(目标)核酸。“探针”可以被确定为“检测探针”，意味着它检测目标核酸。 

在本发明的优选的实施方式中，探针对的至少一个探针包含或由荧光部分和核酸序列组成，所述核酸序列选自： 

-5′-AAG TCG CTT TGC CTT TGG GTC A-3′(AR mec Fluo 1 w/o label；SEQ IDNO：45)， 

-5’-TAC AAA GTC GCT TTG CCT TTG GGT CA-3’(AR mec Fluo 2 w/o label；SEQ ID NO：46)， 

-5’-GGC CGT TTG ATC CGC CAA T-3’(AR mec Fluo 3 w/o label；SEQ ID NO：47)， 

-5’-AAG TCG CTT TGC CCT TGG GTA-3’(AR mec Fluo 4 w/o label；SEQ IDNO：48)， 

-5’-AAG TCG CTT TGC CCT TGG GT-3’(AR mec Fluo 4-2 w/o label；SEQ IDNO：49)， 

-5’-AAG TCG CTT TGC CCT TGG GTC A-3’(AR mec Fluo 4-3 w/o label；SEQID NO：50)， 

-5’-AAG TCG CTT TGC CCT TGG G-3’(AR mec Fluo 4-GV w/o label；SEQ IDNO：51)， 

-5’-CAA GAA TTG AAC CAA CGC AT-3’(AR mec Fluo 4k w/o label；SEQ IDNO：52)， 

-5’-CAA TGA CGA ATA CAT AGT CGC TTT GCC CTT-3’(AR mec Fluo 5w/olabel；SEQ ID NO：53)， 

-5’-CGT TTG ATC CGC CAA TGA CGA-3’(AR mec Fluo 6w/o label；SEQ IDNO：54)， 

-5’-GCC AAT CCT TCG GAA GAT AGC A-3’(AR mec Fluo 7w/o label；SEQ IDNO：55)， 

-5’-ATT AAC ACA ACC CGC ATC-3’(AR mec Fluo UR w/o label；SEQ ID NO：56)， 

-5’-GTC GCT TTG CCC TTG GGT C-3’JU1 probe 1 w/o label；SEQ ID NO：57)， 

-5′-TCG CTT TGC CCT TGG GTC AT-3′JU2 probe 1 w/o label；SEQ ID NO：58)， 

-5′-GGC CGT TTG ATC CGC CAA T-3′JU3 probe 1 w/o label；SEQ ID NO：59)， 

-5′-GTC CTT GTG CAG GCC GTT TGA T-3′JU4 probe1 w/o label；SEQ ID NO：60)， 

-5′-CTT GGG TCA TGC GTT GGT TCA ATT-3′JU5probe1 w/o label；SEQ IDNO：61)， 

-5’-CGA ATA CAA AGT CGC TTT GCC CTT GGG-3’(AR mec 640 3 w/o label；SEQ ID NO：62)， 

-5’-ATG CGT TGG TTC AAT TCT TG-3’(AR mec 640 4 w/o label；SEQ ID NO：63)， 

-5’-GCG TTG GTT CAA TTC TTG GG-3’(AR mec 610 4-3 w/o label；SEQ IDNO：64)， 

-5’-ACC CAA GGG CAA AGC GAC TT-3’(AR mec 640 4k w/o label；SEQ IDNO：65)， 

-5’-GGT AAT GCG TTG GTT CAA TTC TTG-3’(AR mec 6405 w/o label；SEQID NO：66)， 

-5’-ACA AAG TCG CTA TGC CCT TGG GTC A-3’(AR mec 640 6 w/o label；SEQ ID NO：67)， 

-5’-CTT TCC TTG TAT TTC TAA TGT AAT GAC TG-3’(AR mec 640 7 w/olabel；SEQ ID NO：68)， 

-5’-TTG ATG TGG GAA TGT CAT TTT GCT GAA-3’(AR mec 640 UR w/olabel；SEQ ID NO：69)， 

-5’-GCG TTG GTF CAA TTC TTG GGC CAA T-3’JU1 probe2 w/o label；SEQID NO：70)， 

-5′-GTT GGT TCA ATT CTT GGG CCA ATC CTT CG-3′JU2 probe2 w/o label；SEQ ID NO：71)， 

-5′-CGA ATA CAA AGT CGC TTT GCC CTT GG-3′JU3 probe2 w/o label；SEQID NO：72)， 

-5′-GCC AAT GAC GAA TAC AAA GTC GCT TTG CC-3′JU4 probe2 w/o label；SEQ ID NO：73)， 

-5′-TGG GCC AAT CCT TCG GAA GAT AGC A-3′JU5 probe2 w/o label；SEQ IDNO：74)， 

-5’-ATG CGT TGG TTC GAT TCT TG-3’(AR mec 6104-MM2 w/o label；SEQ IDNO：75)， 

-5’-CAT GCG TTG GTT CGA TTC TTG-3’(AR mec 6104-MM2-GV w/o label；SEQ ID NO：76)， 

-5’-AAG TCG CTT TGC CCT TGG G-3’(MRSA direct Fluos w/o label；SEQ IDNO：96)，和 

-5’-CAT GCG TTG GTT CGA TTC TTG-3’(MRSA direct Red 610 w/o label；SEQID NO：97)， 

尤其是AR mec Fluo 4w/o label和/或AR mec 610 4-MM2 w/olabel或尤其是AR mec Fluo 4-GV w/o label和/或AR mec 6104-MM2-GV w/o label或尤其是MRSA direct Fluos w/o label和/或MRSA direct Red 610 w/o label，优选的MRSA direct Fluos w/o label和/或MRSA direct Red 610 w/o label，更优选的MRSA direct Fluos w/olabel和MRSA direct Red 610 w/o label。 

优选的，所述第一探针包含或由荧光部分和SEQ ID NO：48的核酸序列组成，所述第二探针包含或由荧光部分和SEQ ID NO：75的核酸序列组成，或反之亦然。优选的，所述第一探针包含或由荧光部分和SEQ ID NO：51的核酸序列组成，所述第二探针包含或由荧光部分和SEQ ID NO：76的核酸序列组成，或反之亦然。优选的，所述第一探针包含或由荧光部分和SEQ ID NO：96的核酸序列组成，所述第二探针包含或由荧光部分和SEQ ID NO：97的核酸序列组成，或反之亦然。根据本发明，MRSA探针对的第一MRSA探针用供体荧光部分标记，MRSA探针对的第二MRSA探针用相应的接受体荧光部分标记。适合的和优选的标记物的实例是以下列出的，其中每个探针可以用任何标记物来标记。然而，优选的探针对是一种探针对，其中包括第一标记物的第一探针是荧光素-5’-AAG TCG CTT TGC CCT TGGGTA-3’(AR mec Fluo 4)和其中包括第二标记物的第二探针是LC-Red610-5’-ATG CGT TGG TTC GAT TCT TG-3’(AR mec 6104-MM2)。可选择的优选的探针对是一种探针对，其中包括第一标记物的第一探针是荧光素-5’-AAG TCG CTT TGC CCT TGG G-3’(AR mec Fluo4-GV)和其中包括第二标记物的第二探针是LC-Red 610-5’-CAT GCG TTG GTT CGA TTC TTG-3’(AR mec 610 4-MM2 GV)。再更优选的探针对是一种探针对，其中包括第一标记物的第一探针是5’-AAGTCG CTT TGC CCT TGG G-3’-荧光素(MRSA direct Fluos)和其中包括第二标记物的第二探针是LC-Red 610-5’-CAT GCG TTG GTT CGATTC TTG-3’(MRSA direct Red 610)。 

在另一个优选的实施方式中，所述探针包含或由荧光部分和SEQID NO：45到76、96或97的任一探针的功能活性的变体组成，特别是其中 

(a)所述功能活性的变体是SEQ ID NO：45到76、96或97的任一序列的探针的功能活性部分，所述部分包含SEQ IDNO：45到76、96或97的任一序列的至少70％、优选的至少80％、更优选的至少90％、最优选的至少95％； 

(b)所述功能活性的变体是与SEQ ID NO：45到76、96或97的任一序列具有至少70％、优选的至少80％、更优选的至少90％、最优选的至少95％的序列同一性的功能活性的变体； 

(c)所述功能活性的变体是包含至少一个化学上修饰的核酸的SEQ ID NO：45到76、96或97的探针；和/或 

(d)所述功能活性的变体是与SEQ ID NO：45到76、96或97的任一序列或(a)、(b)和/或(c)的功能活性的变体互补的功能活性的变体。 

这些探针的任一的功能活性的变体可以通过利用本发明的方法中的变体和相应探针来鉴定。包含SEQ ID NO：45到76、96或97的任一的探针的功能活性的变体涉及一种探针，其具有与SEQ IDNO：45到76、96或97的相应序列相似的或更高的特异性和敏感性。术语“特异性”和“敏感性”如上文对引物所定义的，可以如对引物变体所详述的来测定。 

探针的部分可以通过核苷酸的末端缺失来获得(5′末端和/或3′末端处)。序列同一性可以通过序列比对来确定。用于比较的序列的比对的方法是本领域公知的。例如在Smith and Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981或Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444-2448，1988中已经描述了各种程序和比对算法。 

NCBI基本局部比对检索工具(BLAST)(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)可从几个来源获得，包括国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和互联网，与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx一起使用。包含SEQ ID NO：45到76、96或97的任一序列的探针的变体一般利用NCBI Blast 2.x来表征。 

例如，所述变体可以与SEQ ID NO：45到76、96或97的序列不同在于一个或更多个核苷酸添加、缺失或取代，特别是在SEQ IDNO：45到76、96或97的相应序列的5′末端和/或3′末端处的一个或更多个核苷酸添加、缺失或取代。 

另外，它涉及关于引物变体的上文的详细描述，其可以类似地应用于探针的变体。

在本发明的再更优选的实施方式中，所述引物组包含或由以下组成 

a)AR mec 11 fwd、AR mecA 3/8、AR mec 5/2和任选的AR mec6-2 rev，其中第一探针是荧光素-5’-AAG TCG CTT TGC CCTTGG GTA-3’(AR mec Fluo 4)和其中第二探针是LC-Red610-5’-ATG CGT TGG TTC GAT TCT TG-3’(AR mec 6104-MM2)，或 

b)AR mec 12 fwd、AR mecA 3/13、AR mec 5/16和任选的JU1rev，其中第一探针是荧光素-5’-AAG TCG CTT TGC CCTTGG G-3’(AR mec Fluo 4-GV)和其中第二探针是LC-Red610-5’-CAT GCG TTG GTT CGA TTC TTG-3’(AR mec 6104-MM2-GV)，或 

c)MRSA direct RE2 fwd、MRSA direct RE3 fwd、MRSA directRE7 fwd和任选的MRSA direct rev，其中第一标记物是5’-AAG TCG CTT TGC CCT TGG G-3’-荧光素(MRSA directFluos)和其中第二探针是LC-Red 610-5’-CAT GCG TTG GTTCGA TTC TTG-3’(MRSA direct Red 610)。 

设计用作(杂交)探针的寡核苷酸可以按照与设计引物类似的方式进行，而探针对的成员优选地在相同链上相互不超过5个核苷酸之内与扩增产物退火，使得可以发生荧光共振能量转移(FRET)(例如，在相互不超过1、2、3或4个核苷酸内)。这个最小程度的分离 一般将相应的荧光部分带到足够接近以发生FRET(见下文)。然而，要理解的是，其他的分离距离(例如，6个或更多个核苷酸)是可能的，只要荧光部分处于相互间合适的位置关系(例如，使用接头臂)从而可以发生FRET。此外，可以设计探针与含有突变或多态性的目标杂交，从而根据与要辨别的各个特定MRSA亚型相应的不同探针对的完全杂交、或者例如探针对的成员与MRSA产生的各个扩增产物之间的差异熔解温度，容许MRSA的差异检测。像寡核苷酸引物一样，寡核苷酸探针通常具有相似的熔解温度，每个探针的长度必需足够发生序列特异性的杂交，但又不过长而降低合成期间的精确度。寡核苷酸探针长度是8到50个核苷酸(例如，长度8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50个核苷酸)。 

本发明提供了检测样品中MRSA的存在或不存在的方法。本发明提供的方法避免了样品污染、假阴性和假阳性的难题。所述方法包括进行至少一个扩增步骤和至少一个杂交步骤。扩增步骤包括用适合的引物组接触样品来产生扩增产物，如果MRSA核酸分子存在于所述样品中。每一个引物与MRSA目标核酸分子内的靶退火，从而扩增产物的至少一部分含有与各自的MRSA核酸相应的核酸序列，其中选择引物组来允许检测I型到V型MRSA。杂交步骤包括用MRSA探针对接触样品。一般地，MRSA探针对的成员在相互不超过五个核苷酸之内与合适的扩增产物杂交。根据本发明，MRSA探针对的第一MRSA探针用供体荧光部分标记，MRSA探针对的第二MRSA探针用相应的接受体荧光部分标记。所述方法进一步包括检测第一MRSA探针的供体荧光部分与第二MRSA探针的相应接受体荧光部分之间FRET的存在或不存在。可以进行多个扩增和杂交步骤，优选的在热循环仪中进行。 

如在此使用的，“扩增”是指合成核酸分子的过程，所述核酸分子与模板核酸(例如，MRSA核酸分子)的一条或两条链互补。扩增核酸分子一般包括使模板核酸变性、在低于引物的熔解温度的温度之下引物与模板核酸退火、以及从引物的酶促延伸来产生扩增产物。变性、退火和延伸步骤可以各进行一次。然而，一般地，变性、退火和延伸步骤被进行多次，从而扩增产物的数量被提高，通常是指数地提高，虽然指数性扩增不是本方法所需的。扩增一般需要存在脱氧核糖核苷 三磷酸、DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)和合适的缓冲剂和/或为了聚合酶的最佳活性的辅助因子(例如，MgCl₂和/或KCl)。 

如果发生了MRSA核酸的扩增并产生了扩增产物，杂交的步骤产生了基于探针对的成员之间的FRET的可检测信号。如在此使用的，“杂交”是指探针与扩增产物退火。杂交条件一般包括低于探针的熔解温度、但避免探针的非特异性杂交的温度。 

在本发明的方法中，利用荧光共振能量转移(FRET)(参见，例如，美国专利NO.4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603)检测MRSA的存在或不存在。FRET是用于测量两种分子之间的相互作用的技术，在当前情况中为两种探针。在这种技术中，两种不同的荧光分子(荧光团或标记物)被遗传学地融合到适合于MRSA检测的探针对上。 

共振能量转移是一种机制，通过它，能量直接从一个分子转移到另一个分子。FRET的原理基于两种标记物的组合特性。如果标记物被特定波长的光线(吸收频率)激发，它以不同的波长(发射频率)重新发射该能量。在FRET中，第一标记物被激发，其随后发射具有发射频率的光线。如果第一标记物(供体)的发射峰与第二标记物(接受体)的激发峰重叠，可以测定两种标记物的接近，因为第一标记物将能量转移到第二标记物，第二标记物以它自身的发射频率发出光线。最后结果是，供体发射出比它通常将发射的较少的能量(因为它将作为光线发射的一些能量被转移到接受体)，而接受体在它的激发频率发射更多的光能(因为它从供体荧光团得到额外的能量输入)。 

FRET技术的优点是它具有极好的分辨率。供体和接受体之间的FRET能量转移的物理学(其是非放射性的)使得效力随着分子间距离的六次幂降低。因而，一般当两个荧光团相互间在20到 (0.002到0.01μM)之内时发生FRET，这意味着荧光团必须被十分紧密地放在一起。 

如在此使用的，各自含有荧光部分的两个寡核苷酸探针可以在特定位置杂交于扩增产物，所述特定位置由寡核苷酸探针与目标核酸序列，即，MRSA核酸的互补性决定。当寡核苷酸探针在合适的位置与扩增产物杂交时，产生FRET信号。在优选的实施方式中，MRSA探针对(检测探针)的成员在相互不超过五个、四个或三个核苷酸之内， 特别是不超过两个核苷酸之内、尤其是相互不超过一个核苷酸之内与扩增产物杂交。 

如上文详述的，探针对的每个探针用适合的标记物/荧光团/荧光部分来标记。“标记物”常常称为“报告物基团”、“荧光团”或“荧光部分”，一般是一些基团，其标记了目标核酸使它与其余部分可区分(具有附着的“标记物”的核酸也可以称为标记的核酸结合化合物、标记的探针或仅称探针)。 

如在此使用的，“荧光共振能量转移关系”和类似术语是指用“供体荧光部分”标记的“探针”和用“接受体荧光部分”标记的另一个“探针”与“目标核酸”的邻近的杂交，从而“供体荧光标记物”可以将共振能量转移到“接受体荧光标记物”，从而“接受体荧光标记物”产生可测量的荧光发射。如果“供体荧光标记物”和“接受体荧光标记物”被分隔过大的距离，“供体荧光标记物”不能将共振能量转移到“接受体荧光标记物”使得“接受体荧光标记物”发射可测量的荧光，则“供体荧光标记物”和“接受体荧光标记物”不处于共振能量转移关系中。 

适合的标记物是本领域已知的，熟练的技术人员能够为两种探针选择适合的标记物组合。如在此对于供体和相应的接受体荧光部分使用的，“相应的”是指接受体荧光部分具有的发射光谱重叠了供体荧光部分的激发光谱。然而，两种信号应当是相互可分的。因此，接受体荧光部分的发射光谱的最大波长优选的应当大于供体荧光部分的激发光谱的最大波长至少30nm，更优选的至少50nm，例如至少80nm、至少100nm或至少140nm。因此，在其间可以产生有效的非辐射能量转移。 

荧光供体和相应的接受体部分一般根据以下来选择，(a)高效的 能量转移；(b)大的最终斯托克斯频移(＞100nm)；(c)发射的频移尽可能远的进入可见光谱的红色部分(＞600nm)；和(d)发射的频移达到比供体激发波长下的激发所产生的Raman水荧光发射更高的波长。例如，可以选择供体荧光部分，其激发最大值接近激光谱线(例如，氦-镉442nm或氩气488nm)、具有高消光系数、高量子产量，它的荧光发射与相应的接受体荧光部分的激发光谱有良好的重叠。可以选择相应的接受体荧光部分，其具有高消光系数、高量子产量、它的激发与供体荧光部分的发射有良好重叠，以及在可见光 谱的红色部分的发射(＞600nm)。然而，主要的目的是获得可相互分离的信号。 

在FRET技术中可以与各种接受体荧光部分一起使用的代表性的供体荧光部分包括荧光素、萤光黄、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、萤光黄VS、4-乙酰氨基-4′-异硫氰酸芪-2，2′-二磺酸、7-二乙氨基--3-(4′-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素、琥珀酰亚胺基1-芘丁酸盐和4-乙酰氨基-4′-异硫氰酸芪-2，2′-二磺酸衍生物。取决于使用的供体荧光部分，代表性的接受体荧光部分包括LC-Red 610、LC-Red 640、LC-Red670、LC-Red 705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、四甲罗丹明异硫氰酸盐、罗丹明x异硫氰酸盐、赤藓红异硫氰酸盐、荧光素、二亚乙基三胺五乙酸盐或镧系元素离子的其他螯合物(例如，铕，或铽)。供体和接受体荧光部分可以从例如Molecular Probes(JunctionCity，OR)或Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)获得。 

根据本发明的优选的标记物是荧光标记物，其是例如，荧光染料，如荧光素染料、罗丹明染料、花青染料和香豆素染料。举例来说，供体荧光部分可以是荧光素，和/或接受体荧光部分可以选自LC-Red610、LC-Red 640、LC-Red 670、LC-Red 705、Cy5和Cy5.5，优选LC-Red610或LC-Red 640。更优选的，供体荧光部分是荧光素，接受体荧光部分是LC-Red 640或LC-Red 610。 

对于荧光素-罗丹明的供体-接受体对，人们可以使用470-490nm激发滤波器，500-520nm发射滤波器用于从荧光素供体收集光线。人们然后可以使用600-650nm发射滤波器，用于从罗丹明接受体收集光线。这些发射滤波器需要仅采集供体的较短的波长范围，以及接受体的长发射尾部，以避免两个图像通道之间的串光。也就是说，人们想避免采集罗丹明信道中的荧光素发射，反之亦然。难题是，为了使FRET工作，供体发射和接受体激发光谱必需重叠(高重叠是良好的)，但是对于良好信噪比的成像，人们必需通过滤波器避免收集“错误”的光子。 

供体和接受体荧光部分可以通过接头臂附着到合适的探针寡核苷酸上。每个接头臂的长度可能是重要的，因为接头臂将影响供体和接受体荧光部分之间的距离。对于本发明的目的来说接头臂的长度是核苷酸碱基到荧光部分按照埃( )的距离。一般地，接头臂 约10到约 接头臂可以是WO 84/03285中描述的类型。WO84/03285还公开了将接头臂附着到特定核苷酸碱基上的方法，以及将荧光部分附着到接头臂的方法。 

接受体荧光部分例如LC-Red 640(-NHS-酯)、LC-Red 610(-NHS-酯)或LC-Red 670(-NHS-酯)，可以与C6-亚磷酰胺(可从ABI(FosterCity，CA)或Glen Research(Sterling，VA)获得)来产生例如LC-Red640-亚磷酰胺。将供体荧光部分例如荧光素偶联到寡核苷酸的经常使用的接头包括硫脲接头(FITC-衍生的，例如，来自Glen Research或ChemGene(Ashland，MA)的荧光素-CPG′s)、酰胺-接头(荧光素-NHS-酯-衍生的，例如，来自BioGenex(San Ramon，CA)的荧光素-CPG)、或3′-氨基-CPG′s，其需要在寡核苷酸合成之后偶联荧光素-NHS-酯。 

在本发明的一个实施方式中，所述检测步骤包括在供体荧光部分所吸收的波长下激发样品，以及显现和/或测量接受体荧光部分发射的波长。优选的，所述检测包括定量FRET。可以利用例如光子计数落射荧光显微镜系统(含有合适的分色镜和滤波器用于监视特定范围的荧光发射)、光子计数光电倍增系统或荧光计来进行荧光分析。启动能量转移的激发可以用适当地滤波以在期望范围激发的氩离子激光、高强度汞(Hg)弧光灯、光纤光源或其他高强度光源来进行。 

本发明的另一个主题涉及检测样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的存在或不存在的可选择的方法，所述方法包括 

(a)进行扩增步骤，包括用MRSA引物组接触所述样品来产生扩增产物，如果MRSA存在于所述样品中， 

(b)进行杂交步骤，包括用MRSA探针接触步骤(a)的扩增产物，其中所述MRSA探针用供体荧光部分和用相应的接受体荧光部分标记；和 

(c)检测所述MRSA探针的供体荧光部分和接受体荧光部分之间荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在，其中FRET的不存在是样品中存在MRSA的指示，以及其中FRET的存在是样品中不存在MRSA的指示， 

其中所述方法能够检测MRSA的I到V型葡萄球菌染色体盒(SCCmec)的每一种。 

FRET技术的普通形式利用两个杂交探针，其中每个探针可以用 不同的荧光部分标记，并一般被设计为在目标DNA分子(例如，扩增产物)中相互非常靠近地杂交(参见上文首先描述的方法)。然而，可选择的FRET形式利用水解探针(本发明的第二种方法)来检测扩增产物的存在或不存在，由此检测MRSA的存在或不存在。这种技术利用了用两个荧光部分标记的一个单链的杂交探针。当第一荧光部分被适合波长的光线激发时，根据FRET的原理，吸收的能量被转移到第二荧光部分。第二荧光部分一般是淬灭剂分子。在PCR反应的退火步骤期间，标记的水解探针结合目标DNA(即，扩增产物)，在随后的延伸阶段期间被Taq聚合酶的5′到3′核酸外切酶活性降解。结果，激发的荧光部分和淬灭剂部分变得空间上相互分离。结果，不存在淬灭剂的情况下第一荧光部分的激发时，从第一荧光部分发射的荧光可以被检测。举例来说，ABI 7700序列检测系统(AppliedBiosystems，Foster City，CA)利用了水解探针技术，适合于进行在此描述的用于检测MRSA的方法。关于利用 770系统的PCR扩增和检测的信息可以在http://www.appliedbiosystems.com/products找到。 

适合的水解探针的实例是： 

TP mec 1：5’-AAG TCG CTT TGC CCT TGG GTC AT-3’(SEQ ID NO：87)和 

TP mec 2：5’-TGC TCA ATT AAC ACA ACC CGC ATC A-3’(SEQ ID NO：88). 

在本发明的优选的实施方式中，所述方法可以进一步由一种或更多种以下特征来定义： 

a)所述引物组是如上在本发明的第一方法的上下文中所定义的，包含或由特异于RE2型MRSA的引物、特异于RE3型MRSA的引物和特异于RE7型MRSA的引物组成 

b)所述探针包含或由两个荧光部分，优选的如上在本发明的第一方法的上下文中所定义的，以及SEQ ID NO：45到76、96或97的任一的核酸序列或如本发明的第一方法的上下文中所定义的其功能活性的变体组成 

c)所述扩增步骤采用具有5′到3′核酸外切酶活性的聚合酶 

d)供体和接受体荧光部分在探针上相互不超过5个核苷酸之内 

e)所述探针包含允许二级结构形成的核酸序列，其中所述二级结构形成引起供体和接受体荧光部分之间的空间接近 

f)所述接受体荧光部分是淬灭剂。 

分子信标与FRET一起也可以用于利用本发明的实时PCR方法(本发明的可选择的第二方法)检测扩增产物的存在。分子信标技术利用了用第一荧光部分和第二荧光部分标记的杂交探针。第二荧光部分一般是淬灭剂，荧光标记物一般位于探针的各个末端。分子信标技术利用了探针寡核苷酸，其具有允许二级结构形成(例如，发夹)的序列。作为探针内二级结构形成的结果，当探针处于溶液中时，两个荧光部分在空间上接近。在与目标核酸(即，扩增产物)杂交之后，探针的二级结构被破坏，荧光部分变得相互分离，从而在用适合波长的光线激发之后，可以检测第一荧光部分的发射。 

适合的分子信标的实例是： 

MB mec 1：5’-GCC GCG CTG CTC AAT TAA CAC AAC CCG CGC GGC-3’(SEQ IDNO：89)和 

MB mec 2：5’-GCC GCG CAT GCG TTG GTT CAA TTC TGC GCG GC-3’(SEQ IDNO：90). 

注意的是，上文关于本发明的第一方法的详细描述类似地适用于本发明的第二方法，例外是，在本发明的第二方法中，仅使用一种用供体荧光部分并用相应的接受体荧光部分标记的探针。 

因此，如在此使用的，″荧光共振能量转移关系″和类似术语是指用″供体荧光部分″和″接受体荧光部分″标记的″探针″，从而″供体荧光标记物″可以将共振能量转移到″接受体荧光标记物″，从而″接受体荧光标记物″产生可测量的荧光发射。如果“供体荧光标记物”和“接受体荧光标记物”被分隔过大的距离，“供体荧光标记物”不能将共振能量转移到“接受体荧光标记物”使得“接受体荧光标记物”发射可测量的荧光，由此“供体荧光标记物”和“接受体荧光标记物”不处于共振能量转移关系中。优选的，接受体荧光部分是吸收供体荧光部分发射的能量的淬灭剂。 

根据本发明的第一方法(利用杂交探针)和第二方法(利用水解探针或分子信标)可以以US 6,174,670中描述的在 仪器中使用的形式来进行。这种形式包括扩增和检测，借此后者利用荧光的检测，用于检测探针对或单个探针与目标核酸之间的结合产物。这些形式应用了FRET技术(参见，例如，美国专利NO.4,996,143、 5,565,322、5,849,489和6,162,603)。如在此使用的，各自含有荧光标记物的两种探针，或含有两种荧光标记物的单个探针，可以在由探针与目标核酸的互补性所决定的特定位置上与扩增产物杂交。荧光标记物可以是供体或接受体荧光标记物。当探针在合适的位置与扩增产物杂交时，产生FRET信号。可以使用上文详细例举的部件(例如，检测装置、光源，等等)。 

在本发明的优选的实施方式中，根据本发明的第一方法中的扩增步骤a)包括用引物组和任选的适合的聚合酶接触样品，尤其是通过PCR，来产生扩增产物，如果MRSA核酸存在于所述样品中，其中所述杂交步骤b)包括用探针对接触所述样品，其中所述探针对的成员与所述扩增产物在相互不超过五个核苷酸之内杂交，其中所述探针对的第一探针用供体荧光标记物标记，和其中所述探针对的第二探针用相应的接受体荧光标记物标记；以及在步骤c)中，通过检测所述第一探针的所述供体荧光标记物和所述第二探针的所述接受体荧光标记物之间的FRET的存在或不存在，检测MRSA核酸和所述探针对之间的结合产物，其中FRET的存在是所述样品中存在目标核酸的指示，和其中FRET的不存在是所述样品中不存在目标核酸的指示。 

在本发明的可选择的优选的实施方式中，根据本发明的第二方法中的扩增步骤a)包括用引物组和任选地适合的聚合酶接触样品，特别是通过PCR，来产生扩增产物，如果MRSA核酸存在于所述样品中，其中所述杂交步骤b)包括用探针接触所述样品，其中所述探针用供体荧光标记物和相应的接受体荧光标记物，例如淬灭剂来标记，和其中所述探针杂交于所述扩增产物；以及在步骤c)中，通过检测所述探针的所述供体荧光标记物和接受体荧光标记物之间FRET的存在或不存在，来检测MRSA核酸和所述探针之间的结合产物，其中FRET的存在或不存在是所述样品中目标核酸的存在或不存在的指示。 

美国专利NO.4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188公开了常规的PCR技术。PCR一般采用与选定的核酸模板(例如，DNA或RNA)结合的两个寡核苷酸引物。在本发明中有用的引物包括能够作为MRSA核酸序列内核酸合成的起始点的寡核苷酸。 

引物可以通过常规方法从限制性消化物中纯化，或可以合成地产生。为了扩增中的最高效率，引物优选的是单链的。引物可以通过化学合成产生。 

PCR分析可以采用核酸(DNA或RNA)模板，一般是DNA。模板核酸不必纯化；它可以是复杂混合物的较小的部分，例如人类细胞中含有的MRSA毒素核酸。DNA(或RNA)可以通过常规技术从任何样品，例如体液或拭子提取，例如在Diagnostic MolecularMicrobiology：Principles and Applications(Persing等(eds)，1993，American Society for Microbiology，Washington D.C)中描述的那些。 

寡核苷酸引物在诱导引物延伸的反应条件下与其他PCR试剂组合。举例来说，链延伸反应一般包括50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.3)、1.5mM MgCl₂、0.001％(w/v)明胶、0.5-1.0μg变性的模板DNA、50pmol各种寡核苷酸引物、2.5U Taq聚合酶和10％DMSO。反应通常含有150到320μM每种dATP、dCTP、dTTP、dGTP，或一种或更多种其类似物。在某些情况下，300到640μM dUTP可以替代反应中的dTTP。 

新合成的链形成双链分子，所述双链分子可以用于反应的后续步骤。链分离、退火和延伸的步骤可以按需要地重复来产生相应于目标MRSA核酸分子的期望数量的扩增产物。反应中的限制因素是反应中存在的引物、热稳定酶和核苷三磷酸的数量。扩增步骤和杂交步骤优选地重复至少一次。为了在检测中使用，扩增和杂交步骤的数目将取决于，例如，样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，可能需要更多的扩增和杂交步骤来扩增足够用于检测的目标序列。一般地，扩增和杂交步骤重复至少约20次，但是可以重复最多达40、60或甚至100次。在本发明的优选的实施方式中，在55、45或35次扩增和杂交的循环之内FRET的存在是样品中存在MRSA的指示。 

聚合酶链式反应可以包括步骤：向样品添加热稳定聚合酶、核苷酸和用于目标核酸的引物，其中引物优选地是根据本发明的引物，以及在至少变性温度和延伸温度之间热循环所述样品；用供体荧光标记物所吸收的波长的光线激发样品，并检测来自荧光能量转移对的荧光发射。 

术语“热稳定聚合酶”是指热稳定的聚合酶，即，所述酶催化与模板互补的引物延伸产物的形成，并且当经历引起双链模板核酸变性所需时间的高温时不会不可逆地变性。一般地，合成在每个引物的3′末端启动，沿着模板链按5′到3′方向进行。已经从黄栖热菌(Thermusflavus)、红栖热菌(T.ruber)、嗜热栖热菌(T.thermophilus)、水生栖热菌(T.aquaticus)、乳栖热菌(T.lacteus)、红色栖热菌(T.rubens)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)分离了热稳定的聚合酶。尽管如此，只要补充酶，非热稳定的聚合酶也可以在PCR中采用。 

在本发明的另一个优选的实施方式中，检测MRSA核酸的方法包括步骤：通过聚合酶链式反应、在存在与所述核酸的相邻区域杂交的两个核酸探针的情况下扩增所述核酸，所述探针的一个用接受体荧光标记物标记，另一个探针用荧光能量转移对的供体荧光标记物标记，从而在两个探针与目标核酸杂交时，所述供体和接受体荧光标记物处于相互间25个核苷酸之内，所述聚合酶链式反应包括步骤：向所述样品添加热稳定聚合酶、核苷酸和所述目标核酸的引物，其中所述引物是如上定义的，以及在至少变性温度和延伸温度之间热循环所述样品；用供体标记物所吸收的波长的光线激发所述样品，并监视来自所述荧光能量转移对的温度依赖性荧光。 

在本发明的另一个优选的可选择的实施方式中，检测MRSA核酸的方法包括步骤：通过聚合酶链式反应在存在一个核酸探针的情况下扩增所述核酸，所述核酸探针用接受体荧光标记物，例如淬灭剂和荧光能量转移对的供体荧光标记物来标记，使所述探针与目标核酸杂交，所述聚合酶链式反应包括步骤：向样品添加任选地具有5’到3’核酸外切酶活性的聚合酶、核苷酸和目标核酸的引物，其中所述引物是如上所定义的，以及在至少变性温度和延伸温度之间热循环所述样品；用所述供体标记物所吸收的波长的光线激发所述样品，并监视来自所述标记物的荧光能量转移对的荧光。 

对于上文描述的方法，所述核酸可以以双链或单链的形式存在。如果核酸模板是双链的，必需在它在PCR中用作模板之前分离两条链。链分离可以伴随着任何适合的变性方法，包括物理、化学或酶学的方法。分离核酸链的一种方法涉及加热核酸直到它大部分变性(例 如，超过50％、60％、70％、80％、90％或95％变性)。使模板核酸变性必需的加热条件将取决于，例如，缓冲盐浓度和要变性的核酸的长度及核苷酸成分，但一般从约90℃到约105℃，时间取决于反应的特征，例如温度和核酸长度。变性一般进行约0秒到4分钟。 

在本发明的一个实施方式中，在扩增和杂交的每个步骤之后、和/或实时地进行检测步骤。PCR的实时和即时监视的详细说明可以在http:/Ibiochem.roche.com/lightcycler找到。以下专利申请描述了LightCycler技术中使用的实时PCR：WO 97/46707、WO 97/46714和WO 97/46712。LightCycler仪器是利用高质量光学器件与微体积荧光计组合的快速热循环仪。这种快速热循环技术利用了薄的玻璃比色杯作为反应容器。反应室的加热和冷却通过交替的加热的和环境空气来控制。由于空气的低质量和比色杯的高的表面积比体积的比值，在LightCycler热室内可以实现非常快速的温度改变速率。向反应成分添加选定的荧光染料容许实时地和即时地监视PCR。此外，比色杯充当用于信号收集的光学元件(类似于玻璃纤维光学器件)，在比色杯的尖端浓缩信号。效果是微体积样品的有效的照明和荧光监视。示范性的PCR方案在实施例3中描述。 

容纳比色杯的 圆盘传送带可以从仪器上取下。因而，样品可以在仪器之外加载(例如，在PCR净室中)。此外，这种特征容许样品圆盘传送带容易清洁和灭菌。作为 设备的部分的荧光计容纳了光源。发射光被过滤，通过落射透镜聚焦在比色杯的顶部。样品发出的荧光然后通过同一透镜聚焦，穿过分色镜，适当地滤波，并聚焦在数据收集photohybrids上。在 仪器(RocheDiagnostics GmBH，目录No.03531414001)中当前可用的光学单元包括六个带通滤波器(530nm，Hex激发，610nm，640nm，670nm和705nm)，提供四种颜色检测和几种荧光获取选择。数据采集选择包括每个循环步骤监视一次、完全连续的单样品获取用于熔解曲线分析、连续采样(其中采样频率取决于样品数)和/或在预定的温度间隔后所有样品的逐步测量。 

可以利用PC工作站来操作，并且可利用Windows操作系统，例如Windows XP、Windows NT或Windows 2000。当机械在光学单元上连续地放置毛细管时，获得来自样品的信号。软件可 以在每次测量之后立即实时地显示荧光信号。荧光采集时间是10-100毫秒(msec)。在每个循环步骤之后，荧光对比循环数的定量显示可以对所有样品持续地更新。产生的数据可以被保存用于进一步的分析。 

在本发明的又一个实施方式中，所述方法进一步包括测定两个探针之一与步骤(a)的扩增产物之间的熔解温度，其中所述熔解温度确定了MRSA的存在或不存在。熔解曲线分析是可以包括在循环概貌(profile)内的另外的步骤。熔解曲线分析是基于以下事实，DNA在称为熔解温度(Tm)的特征性温度下熔解，其被定义为一半的DNA双链体分离成单链时的温度。DNA的熔解温度主要取决于它的核苷酸组成和它的长度。因而，富含G和C核苷酸和/或核苷酸更长的DNA分子，比具有丰量的A和T核苷酸和/或核苷酸较短的那些具有更高的Tm。通过检测信号丢失时的温度，可以测定探针的熔解温度。类似地，通过检测产生信号时的温度，可以测定探针的退火温度。来自相应扩增产物的MRSA探针的熔解温度可以确认样品中MRSA的存在。 

在本发明的又一个实施方式中，所述方法进一步包括防止杂质核酸的扩增，特别是包括在存在尿嘧啶的情况下进行扩增步骤(a)，尤其是包括在第一扩增步骤之前用尿嘧啶-DNA糖基化酶处理样品。举例来说，利用尿嘧啶-DNA糖基化酶的酶促方法在美国专利NO.5,035,996、5,683,896和5,945,313中描述了，以降低或消除一次热循环仪运行和下一次运行之间的污染。此外，当进行本发明的方法时，标准的实验室防范(laboratory containment)实践和操作是期望的。防范实践和操作包括，但不限于，方法的不同步骤的独立的工作区、防范通风橱、屏障过滤吸移管尖端和专用的空气置换吸移管。技术人员的一致的防范实践和操作对于诊断实验室处理临床样品中的精确性是期望的。 

在样品的核酸在上述分析之一中进行分析之前，它们可以从含有不同成分的复杂混合物的(生物学)样品中分离或纯化。通常，对于第一步骤，利用容许核酸富集的过程。 

在本发明的方法的优选的实施方式中，样品可以作为粗的溶胞产物来使用，其可以如下制备： 

样品例如拭子可以转移到适合的缓冲液中，任选地被处理以灭活细菌。为释放细胞的内容物，它们可以用酶或用化学物质处理来溶解、降解或变性细胞壁。这个过程通常被称为裂解或机械裂解。含有这种裂解的材料的产生的溶液被称为溶胞产物。溶胞产物可以通过例如旋转溶胞产物、丢弃丸粒(碎屑)来纯化。上清液可以在扩增反应中作为样品直接使用。 

特别地，可以使用S.E.T.S.试剂盒(Roche Diagnostics Corporation，目录no.03753158001)来制备粗溶胞产物。所述方法可以示范性地描述如下：样品例如拭子切断把柄，拭子尖端插入内部S.E.T.S.试管(例如，在底部含有孔洞、并在闭合时装入外S.E.T.S.试管的0.5mL试管)中。试管置于含有硅质珠子和中和缓冲液(NB)的外S.E.T.S.试管中。NB中和了来自拭子设备的转移培养基。来自拭子的粘附材料从拭子尖端上除下，通过重力(离心)转移到外S.E.T.S.试管中。闭合S.E.T.S.试管，加热到95℃用于细菌的加热灭活。细胞通过摇动装置，例如 仪器中的机械力来破坏。碎屑通过短时旋转收集在试管的底部，上清液直接用作扩增反应中的样品。该方法在Uhl等，2005，J Clin Microbiol.8：4046-51中更详细地描述了。 

在裂解期间遇到的难题是，其他的酶降解了感兴趣的成分，例如，降解核酸的脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶在裂解期间接触到感兴趣的成分。在裂解之前，这些降解酶也可能存在于细胞外部，或空间上分隔在不同的细胞区室中，现在与感兴趣的成分开始接触。在这个过程期间释放的其他成分可以是，例如，属于脂多糖家族的内毒素，其对于细胞是有毒的，可能引起预期用于人类或动物治疗的产物中的问题。 

存在着各种方法来解决上文提及的这种问题。当核酸将被释放时，通常使用离液剂，例如，硫氰酸胍或阴离子的、阳离子的、两性离子的或非离子型洗涤剂。还有好处的是使用蛋白酶，其快速地降解这些酶或不需要的蛋白质。然而，这可能产生另一个问题，因为这些物质或酶可能干扰随后步骤中的试剂或成分。 

可以有益地用于上文提及的这种裂解或样品制备过程的酶有一些酶，其裂解蛋白质底物中的酰胺键并被分类为蛋白酶或(可互换地)肽酶(参见Walsh，1979，Enzymatic Reaction Mechanisms.W.H. Freeman and Company，San Francisco，Chapter 3)。在现有技术中使用的蛋白质有例如碱性蛋白酶(WO 98/04730)或酸性蛋白酶(US5,386,024)。在用于核酸分离的样品制备现有技术中广泛使用的蛋白酶是来自Tritirachium album的蛋白酶K(参见，例如，Sambrook J.等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)，其在中性pH值附近是有活性的，属于本领域的技术人员已知的枯草蛋白酶的蛋白酶家族。 

在裂解步骤之后的下个样品制备步骤中，感兴趣的成分可以被进一步富集。如果感兴趣的非蛋白质成分是例如核酸，它们通常在被用于基于探针的分析中之前从复杂的裂解混合物中提取出。 

存在着用于核酸提取的几种方法： 

-依赖序列的或生物特异性的方法，例如： 

●亲和层析 

●与固定的探针杂交 

-不依赖序列的或物理-化学的方法，例如： 

●使用例如苯酚-氯仿的液-液提取法 

●用例如纯乙醇来沉淀 

●用滤纸提取 

●用成胶粒团试剂，如十六烷基-三甲基-铵-溴化物来提取 

●与固定的、嵌入性染料结合，例如吖啶衍生物 

●吸附于硅胶或硅藻土 

●在离液条件下吸附于磁性玻璃颗粒(MGP)或有机硅烷颗粒 

对于提取目的特别感兴趣的是核酸吸附到玻璃表面上，而其他表面也是可能的。近年来通过利用它们对玻璃表面的结合特性，已经提出了从自然环境分离核酸的许多操作。如果未修饰的核酸是目标，核酸与具有硅质表面的材料的直接结合是优选的，因为核酸不必被修饰，甚至天然的核酸也可以结合等等。这些过程由各种文献详细地描述了。例如在Vogelstein等，1979，Proc.Natl.Acad.U.S.A.76：615-619中，提出了在存在碘化钠的情况下将来自琼脂糖凝胶的核酸结合到研磨燧石玻璃的操作。在Marko等，1982，Anal.Biochem.121：382-387 中描述了在存在高氯酸钠的情况下在玻璃粉上纯化来自细菌的质粒DNA。在DE-A 37 34 442中，描述了通过利用乙酸沉淀噬菌体颗粒和用高氯酸盐裂解噬菌体颗粒，在玻璃纤维过滤器上分离单链的M13噬菌体DNA。洗涤结合到玻璃纤维过滤器上的核酸，用含有甲醇的Tris/EDTA缓冲液洗脱。在Jakobi R.等，Anal.Biochem.175(1988)196-201中描述了从λ噬菌体纯化DNA的相似的操作。所述操作需要核酸在离液盐溶液中与玻璃表面的选择性结合，以及从杂质例如琼脂糖、蛋白质或细胞残余物中分离核酸。为了从杂质中分离玻璃颗粒，颗粒可以被离心，或者液体通过玻璃纤维过滤器被抽出。然而这是限制性的步骤，阻碍了所述操作用于处理大量样品。在通过添加盐和乙醇的沉淀之后利用磁性粒子来固定核酸是更有益的，例如在Alderton等，1992，Anal.Biochem.201：166-169和PCT GB 91/00212中描述了。在这个操作中，核酸沿着磁性粒子粘合。通过施加磁场和进行洗涤步骤，从原始溶剂中分离粘合物。在一个洗涤步骤之后，核酸被溶于Tris缓冲液中。然而，这个操作具有缺点，在于沉淀对于核酸不是选择性的。同时，许多固体和溶解的物质也被粘合。结果，这个操作不能用于除去可能存在的、特异性酶反应的显著数量的任何抑制物。磁性的多孔玻璃也是市场上可获得的，其在多孔的、特别的玻璃基质中含有磁性粒子，用含有链霉抗生物素蛋白的层来包被。这个产物被用于分离生物材料，例如，蛋白质或核酸，如果它们在复杂的制备步骤中被修饰从而它们共价结合于生物素。可磁化的特定吸附剂被证明是非常有效的，适合于自动化样品制备。铁氧体磁性的和强磁性的(ferromagnetic)以及超顺磁性的色素被用于这个目的。利用磁性玻璃颗粒的最优选的MGP和方法是在WO 01/37291中描述的那些。 

在包括目标核酸的核酸从它们的天然环境中纯化和分离之后，可以检测目标核酸，MRSA特异性核酸。 

在每个热循环仪运行之内，对照样品也可以被循环。因而，在本发明的进一步的实施方式中，本发明的方法包括对照样品，特别是其中对照样品包含MRSA核酸分子。利用例如对照引物和对照探针，可以从阳性对照(试剂对照)样品扩增对照核酸模板。阳性对照样品也可以用于扩增，例如，含有MRSA核酸分子的质粒构建体。这种质粒对照可以内部地扩增(例如，在每个生物样品内)(内部对照)，或 在与患者的样品并行的独立样品运行中扩增。每个热循环仪还应当包括阴性对照，例如，不存在MRSA核酸的阴性对照。这些对照物是扩增、杂交和/或FRET反应的成功或失败的指示物。因而，对照反应可以容易地测定，例如，引物序列特异性地退火和启动延伸的能力，以及探针序列特异性地杂交并发生FRET的能力。 

优选的对照构思包含阳性对照(检测已知的MRSA DNA)、试剂对照(检测包含MRSA目标序列的质粒)和内部对照(检测包含MRSA目标序列的质粒，其中探针结合位点，例如，MRSA传感探针的结合位点，已经被另一个序列替代，所述序列不结合所述MRSA传感探针，但是被内部对照传感探针结合；做为选择，可以交换两种探针的结合位点)。内部对照可以是每个反应的部分，即，阳性对照、试剂对照阴性对照和每种样品。 

内部对照(IC)的适合的探针的实例是： 

MRSA IC 4：5’-CCA GCA GAA TGC CAA CCA-3’(SEQ ID NO：91)，例如用LC-Red 6705’标记的或 

MRSA direct IC：5’-CCA GCA GAA TGC CAG CCA AT-3’(SEQID NO：98)，例如用LC-Red 6705’标记的。 

要分析的样品可以是任何样品。然而，样品一般是生物样品，优选的来自人类受试者的样品。可以用于实践本发明的方法的代表性的生物样品包括拭子或体液，例如，选自感染的创口的拭子、皮肤拭子、鼻部拭子、喉拭子、腹股沟拭子、腋窝拭子、来自侵入性设备的部位的拭子、来自可能的感染的部位的拭子、血液样品、尿液样品和会阴拭子的样品。生物样品采集和保存方法是本领域技术人员已知的。不充分的样本采集、运输延迟、不适当的运输条件、或某些采集拭子的使用(例如，海藻酸钙或铝杆)是可能影响测试结果的成功和/或准确性的所有条件。生物样品可以被加工(例如，通过标准核酸提取方法和/或利用商业的试剂盒)来释放MRSA核酸，生物样品直接与PCR反应成分和合适的寡核苷酸接触。 

本发明的进一步的主题涉及任何上文的本发明实施方式中定义的引物、引物组、探针和/或探针对。 

本发明的再进一步的主题涉及试剂盒，包含： 

(a)任何本发明的以上实施方式中定义的引物组，特别是包含或由特异于RE2型MRSA的引物、特异于RE3型MRSA的引物和特异于RE7型MRSA的引物组成的引物组； 

(b)任何本发明的以上实施方式中定义的探针对或探针；和 

(c)标记所述探针的供体荧光部分和相应的荧光部分， 

其中所述试剂盒能够检测MRSA的I到V型葡萄球菌染色体盒(SCCmec)的每一种。 

引物组、探针和/或探针对可以是如对上述(优选的)实施方式描述的，或适合于任何上文描述的本发明的方法。另外，所述试剂盒可以包含包装标签或包装说明书，其上具有使用所述MRSA引物组和MRSA探针对来检测样品中的存在或不存在的说明。本发明的试剂盒的进一步可选择的成分是至少一种适合的酶，特别是尿嘧啶-DNA-糖基化酶和/或DNA聚合酶，和/或适合的缓冲剂。所述试剂盒还可以含有具有3′到5′核酸外切活性的模板依赖性聚合酶，优选的Taq聚合酶，核苷酸和寡核苷酸。在本发明的另一个实施方式中，提供了试剂盒，其包含模板依赖性DNA聚合酶、核苷酸和寡核苷酸或根据本发明的的引物对。 

本领域已知的这种试剂盒进一步包含塑料器具，其可以在扩增操作期间使用，如，96或384孔形式的微量滴定板，或仅是普通反应管，例如由Eppendorf，Hamburg，Germany制造的那些，以及用于进行根据本发明的方法的所有其他试剂。 

在本发明的另一个实施方式中，所述试剂盒进一步含有用于分离所述核酸的试剂。因而，试剂盒可以另外含有具有对核酸的亲和力的材料，优选的，所述具有对核酸的亲和力的材料包括具有硅质表面的材料。优选的，具有硅质表面的材料是玻璃。最优选的，具有对核酸的亲和力的材料是如WO 96/41811或WO 01/37291中描述的包含磁性玻璃颗粒的组合物。所述试剂盒可以进一步或另外包含容许细胞裂解的裂解缓冲液，其含有例如离液剂、洗涤剂或醇或其混合物，以及包含单独的蛋白酶，例如蛋白酶K，用于消化不希望的蛋白质。根据本发明的的试剂盒的这些成分可以在试管或贮藏容器中单独地提供。取决于成分的性质，这些甚至可以在单个试管或贮藏容器中提供。试剂盒可以进一步或另外包含洗涤溶液，其适合于在DNA或RNA结合其 上时磁性玻璃颗粒的洗涤步骤。这种洗涤溶液可以含有缓冲溶液中的乙醇和/或离液剂，或没有如上所述的乙醇和/或离液剂的具有酸性pH值的溶液。通常，洗涤溶液或其他溶液作为贮备溶液来提供，其在使用前必须稀释。所述试剂盒可以进一步或另外包含洗脱液或洗脱缓冲液，即，溶液或缓冲液(例如，10mM Tris、1mM EDTA、pH 8.0)或纯水来洗脱结合在磁性玻璃颗粒上的DNA或RNA。进一步的，可以存在另外的试剂或缓冲溶液，其可以用于核酸，即，DNA或RNA的纯化过程。 

在本发明的优选的实施方式中，所述试剂盒含有内、外S.E.T.S.试管和/或中和缓冲液作为样品准备试剂。优选的，本发明的方法通过制备粗的溶胞产物，例如上文详述的，不经样品纯化来进行。因此，试剂盒可以适合于这种方法，从而用于核酸的进一步分离或纯化的工具不被包括在试剂盒内。 

本发明的优选的实施方式是本发明的方法或试剂盒在可自动化方法中使用，例如在WO 99/16781中描述的可自动化方法。可自动化方法是指，所述方法的步骤适合于用设备或机器来进行，所述设备或机器能够很少或没有外部控制或人为影响地运行。自动化方法是指，所述可自动化方法的步骤用设备或机器来进行，所述设备或机器能够很少或没有外部控制或人为影响地运行。仅仅所述方法的准备步骤需要手动进行，例如，贮藏容器必需装填并放置就位，样品的选择必需由人，以及本领域技术人员已知的进一步的步骤，例如控制计算机的操作进行。设备或机器可以例如，自动地添加液体、混合样品或在特定温度进行孵育步骤。一般地，这种机器或设备是由运行程序的计算机控制的机器人，所述程序中指定了单个的步骤和指令。优选的自动化方法是以高通量形式进行的那些方法，这是指所述方法和使用的机器或设备为了短时间内样品高通量优化了。在本发明的另一个实施方式中，根据本发明的方法或试剂盒被用于半自动化的过程，这是指某些反应步骤必需人工地进行。在本发明的优选的实施方式中，含有根据本发明的MGP的悬浮液从贮藏容器中取出，部分体积被添加到不同的反应容器中。反应容器可以是塑料制成的反应管，最终是含有96或384个或更多孔的微量滴定板形式，在其上可以进行反应。然而，这些容器可以由其他材料，例如由钢制成。 

在本发明的优选的实施方式中，根据本发明的试剂盒被用于研究、生物学分析或诊断。在根据本发明的优选的实施方式中，根据本发明的试剂盒或根据本发明的方法以高通量形式使用，即，在容许非常短时间内高数量的不同样品的分析的自动化方法中使用。 

要理解的是虽然已经连同其详细说明一起描述了本发明，以上的描述意图说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由附随的权利要求的范围所定义。其他方面、优点和改变在以下权利要求的范围之内。另外，要理解的是，本发明不限于一种或更多种商业上可获得的仪器、特别是在此描述的那些的结构。 

附图 

附图1显示了MRSA，特别是RE2、RE3和RE7(各自包括orfX(CC))的起始)以及orfx的扩增子序列。 

————             引物 

...................  第一探针(锚定探针) 

-----                第二探针(传感探针) 

                     表示错配 

附图2显示了来自93种不同MRSA菌株的RE2序列比对。给出了包括突变数量和改变的种类的点突变。I型SCCmec中存在的102bp副本由______标出。从SCCmec到序列的SA部分的转换由CC标出。 

附图3显示了RE2检测的扩增曲线(附图3A)和熔解曲线(附图3B)。在分析实验中，5log步骤的动态范围和10个基因组拷贝范围内的敏感性被证明满足诊断利用的要求。这个实验证明了所述分析的功能。 

附图4显示了RE3检测的扩增曲线(附图4A)和熔解曲线(附图4B)。在分析实验中，5log步骤的动态范围和10个基因组拷贝范围内的敏感性被证明满足诊断利用的要求。这个实验证明了所述分析的功能。 

附图5显示了RE7检测的扩增曲线(附图5A)和熔解曲线(附图5B)。在分析实验中，5log步骤的动态范围和10个基因组拷贝范围内的敏感性被证明满足诊断利用的要求。这个实验证明了所述分析 的功能。 

实施例 

实施例1：MRSA的体外诊断测试 

MRSA直接测试是用于甲氧西林抗性金黄葡萄球菌(MRSA)的直接检测的定性的体外诊断测试，以帮助例如护理环境中MRSA定居的预防和控制。测试在 2.0仪器上进行，使用来自怀疑定居的患者的样本，利用拭子提取和机械裂解用于样本准备，随后聚合酶链式反应(PCR)用于扩增MRSA DNA，荧光目标特异性杂交探针用于检测扩增的DNA。 

仪器要求：对于该分析，指定 2.0。 

试剂要求：该分析试剂由样品准备试剂和扩增试剂组成。样品制备通过从拭子提取细菌和随后的裂解步骤来进行。裂解可以酶促地或机械地进行。对于SA，机械裂解过去显示了良好的结果。此外，机械裂解可以不考虑样品中存在的细菌或细菌表型来进行。因而，机械裂解是偏爱的方法。对于溶胞产物的进一步的加工，两种选择是可能的。 

1.样品裂解和随后的DNA提取 

2.样品裂解和粗提取物的使用 

由于获得结果的时间是重要的，仅仅裂解是快速的，优选的不进行DNA纯化，仅产生粗的溶胞产物并直接用于PCR。 

分析利用了PCR扩增和利用FRET探针的检测。包括了用于扩增的对照和内部对照，以控制扩增和杂交。检测是通过扩增曲线或熔解曲线分析。 

软件要求：软件SW 4.05被用于MRSA直接测试的数据分析。对于数据分析，可以使用两种可能的算法。 

当使用扩增曲线时(定性检测模块)，数据输出通过LightCyclerSW实现，没有进一步的人工步骤。编程、控制概念和结果的显示通过宏来操纵。对于这种解决方案，数据输出依靠SW固有的算法。数据结果不通过专门的分析来控制。 

熔解曲线分析需要由客户进行的人工分析步骤。优点是更好的特异性。 

工作流程说明：MRSA直接测试的工作流程包括： 

1.利用中和缓冲液、内和外S.E.T.S.试管的拭子提取。 

2.通过中和缓冲液包括添加内部对照(IC)的细菌裂解(热和机械破坏)。 

3.将粗的溶胞产物(样本提取物)转移到反应混合物(RM)。RM由引物和探针、FastStart酶(Taq聚合酶)、UNG(尿嘧啶-N-糖基化酶(glycosilase))和缓冲液组成。 

4.利用特异性引物和探针(PCR)扩增和检测。 

5.两个步骤中的数据分析。通过相应的对照的第一次实验验证。目标被分析物的存在或不存在的第二次鉴定。 

实施例2：引物和探针的设计 

设计引物和探针，使得反向引物和探针对(检测探针)位于金黄色葡萄球菌目标区域的部分中。因而，这个元件对于所有RE类型是相同的。RE类型描述了SCC mec转座子的右侧末端接点的序列变异。代表所有RE类型的大部分的RE2扩增子已经通过测序93种不相关样本来评估(附图2)。对于这种主要的RE类型(代表I、II、III(某些)和一些IV型SCCmec)，已经设计了引物和探针(参见表1)。这种设置代表了核心的分析。在合适的时候，添加进一步的引物以覆盖I到V型SCC。(参见表1)。对于引物和探针设计，使用 探针设计软件2.0。设计这些引物和探针的变体以优化信号输出(参见表1)。 

表1：用于SCCmec RE2、RE3和RE7检测的引物和探针设计 

实施例3：特定引物和探针的分析 

对于RE2、RE3和RE7，建立了利用相同的探针和相同的反向引物、但不同的正向引物的单独测试(参见表1)。对于从约10⁶个基因组拷贝/PCR到10个拷贝/PCR按照10倍稀释度，分析了这些单独测试(附图3到5)。对于数据分析，采用了定性检测模块和人工Tm调用。 

试剂浓度：

正向引物：0.2-0.5μM 

反向引物：0.3-0.5μM 

探针：0.1-0.4μM     

MgCl₂：3.0-4.5mM(终浓度需要取决于每个反应混合物中存在的MgCl₂浓度来适应) 

尿嘧啶DNA糖基化酶：1单位/反应 

480Probes Master resp. FastStart DNAMaster HybProbe resp. Fast Start DNA Master ^PLUSHybProbe 

PCR方案：

              温度     保持      缓变率  获得 

变性(1循环)： 95℃     10min     20      无 

扩增(45循环)：95℃     10sec     20      无 

              52-55℃  10sec     20      单个 

              72℃     12-22sec  20      无 

熔解曲线(1循环)：95℃  0sec   20    无 

                 54℃  20sec  20    无 

                 45℃  20sec  0.2   无 

                 80℃  0sec   0.1   继续(cont.) 

冷却(1循环)：    40℃  30sec  20    无 

表2：用于SCCmec RE2、RE3和RE7检测在附图3-5中使用的引物和探针 

名称	功能	标记物	序列(SEQ ID NO：)
				AR mec 12 fwd	RE2检测		5′-TGA AAT GAA AGA CTG CGG AG   -3′(12)
AR mecA 3/13	RE3检测		5′-CCA CAT CTC ATT AAA TTT TTA AAT TAT ACA C-3′(28)
				AR mec 5/16	RE7检测		5′-CAA TCC TTT TTA TAT TTA AAA TAT ATT ATA CAC-3′(32)
JU1 rev：	特异于SA		5′-CAA GGA AAG ATG CTA TCT   TCC G-3′(40)
				AR mec Fluo 4-GV：	特异于MRSA	Flous	5′-AAG TCG CTT TGC CCT TGG G-   3′(51)
AR mec 610 4-MM2-  GV：	特异于MRSA	LC-Red  610	5′-CAT GCG TTG GTT CGA TTC  TTG-3′(76)
				MRSA IC 4	内部对照	LC-Red   670	5′-CCA GCA GAA TGC CAA CCA-3′   (91)

附图3-5中使用的试剂浓度：

AR mec 12 fwd：0.5μM 

AR mecA 3/13：0.3μM 

AR mec 5/16：0.3μM 

JU1 rev：0.5μM 

AR mec Fluo 4-GV：0.2μM 

AR mec 610 4-MM2-GV：0.2μM 

尿嘧啶DNA糖基化酶：1单位/反应 

480Probes Master(PCR反应中的终浓度是3.2mM MgCl₂) 

附图3-5中使用的PCR方案：

                 温度  保持     缓变率  获得 

变性(1循环)：    95℃  10min    20      无 

扩增(45循环)     95℃  10sec    20      无 

                 52℃  10sec    20      单个 

                 72℃  18sec    20      无 

熔解曲线(1循环)：95℃  0sec     20      无 

                 54℃  20sec    20      无 

                 45℃  20sec    0.2     无 

                 80℃  0sec     0.1     继续 

冷却(1循环)：    40℃  30sec    20      无 

如上所述进行了进一步的实施例，例外是使用以下引物和探针： 

AR mec 11 fwd：用于RE2检测 

AR mecA 3/8：用于RE3检测 

AR mec 5/2：用于RE7检测 

AR mec 6-2 rev：特异于SA 

AR mec Fluo 4：特异于MRSA 

AR mec 610 4-MM2：特异于MRSA 

在这个实施例中，获得了类似于附图3到5的曲线，对RE2、RE3和RE7分别计算出57.21℃、56.71℃和56.89℃的Tm值。 

实施例4：优选的LC MRSA分析系统的分析 

用于鼻拭子样本上存在的甲氧西林抗性金黄葡萄球菌(MRSA)的PCR分析使用扩增引物和FRET杂交探针来开展，用于利用LightCycler仪器检测扩增的目标核酸。除非另作说明，如上文实施例1到3所描述的进行分析。 

这个实施例描述了优选的引物组和探针(Roche LC MRSA分析系统(PCR))的性能评估。 

寡聚物名称	标记物	序列(5’-3’)	SEQ ID NO：
				引物，MRSA  direct RE2 fwd	无	TGA AAT GAA AGA CTG CGG AG	92
引物，MRSA  direct RE3 fwd	无	CCA CAT CTC ATT AAA TTT TTA AAT TAT ACA C	93
				引物，MRSA  direct RE7 fwd	无	CAA TCC TTT TTA TAT TTA AAA TAT ATT ATA CAC	94
引物，MRSA  direct rev	无	CAA GGA AAG ATG CTA TCT TCC G	95
				探针，MRSA  direct Fluos	3’荧光素	AAG TCG CTT TGC CCT TGG G	96
探针，MRSA  direct Red 610	5’LC Red 610，  3’Phosphat	CAT GCG TTG GTT CGA TTC TTG	97
				探针，MRSA  direct IC Red 670	5’LC Red 670，  3’Phosphat	CCA GCA GAA TGC CAG CCA AT	98

工作流程：

递送到实验室的鼻部拭子折断放入含有600μl中和缓冲液和大约50μl 0.1mm玻璃珠的旋帽裂解试管。盖上试管，在设定在95到100℃的加热块上加热2分钟，在速度设定为5000的MagNA Lyser上处理70秒。试管在20,000×g离心1分钟，拭子上的5μl液体被用于MRSA的PCR。 

PCR：

用PCR分析检测三种类型的MRSA(RE2、RE3和RE7)。640nm信号的熔解曲线分析被用于检测MRSA。所有三种MRSA提供了相同的熔解曲线熔解温度。基线上方具有阳性对照的+/-2℃内的Tm的熔解曲线被认为是阳性的。内部对照(IC)模板被包括在分析中，利用杂交探针在710nm检测。在阴性样本中阳性对照的检测是必需的，以证明没有PCR抑制。 

特异性 

凝固酶阴性葡萄球菌属可能有一部分的PCR目标。为了确认这些细菌的分离株不会在PCR中交叉反应，测试了来自29个mecA阴性和75 个mecA阳性凝固酶-阴性葡萄球菌属的裂解培养物的DNA。凝固酶阴性葡萄球菌属没有给出阳性结果。 

对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)的100个临床分离株用PCR测试，来确定它们是否给出PCR的假阳性结果。金黄色葡萄球菌分离株都没有给出阳性PCR结果。 

●包含性 

来自美国(207个)和南非(105个)的MRSA分离株的裂解菌落的DNA通过PCR来测试。四种MRSA分离株(1.3％)不能通过PCR检测。五种MRSA分离株以降低的敏感性被检出。 

●外源的干扰 

通过向拭子添加各种数量的全血并根据工作流程加工，测试了PCR抑制作用。5或10μl全血的掺加(spiking)没有显示内部对照的抑制作用。根据重复测试，添加20μl的血液得到了低于10％的抑制作用。大多数重复测试中，向拭子添加70μl的全血产生了内部对照的PCR抑制作用。 

●敏感性 

对于来自每种MRSA类型的DNA的稀释物，通过在5个副本中测试阳性PCR结果的数量，评估了PCR对于RE2、RE3和RE7MRSA目标的敏感性。 

对于所有三种MRSA类型，当10个拷贝的DNA用于PCR时，敏感性≥90％。 

●临床敏感性和特异性 

进行了165个鼻部拭子样本的临床试验。用于比较的金标是利用CHROMagar MRSA(BD，Becton，Dickinson and Company，NJ，USA)的基于培养物的检测方法。三个拭子被发现对PCR是抑制性的。用剩余的162个拭子发现以下结果。 

^*10个中的5个在测试时在抗生素治疗。 

	全部的患者	没有用抗生素的患者#
			敏感性	97.1％	98.0％
特异性	92.2％	95.2％
			PPV	76.7％	90.9％
NPV	99.2％	99.0％

^#排除了没有用抗生素的患者，其可能对基于培养物的CHROMagarMRSA给出假阴性结果。 

●拭子类型 

用MRSA PCR评估了三种拭子类型的使用。发现Copan liquidStuarts、Copan Amies Gel和具有活性炭的Copan Amies Gel拭子对于敏感性和PCR抑制作用都得到了相当的结果。 

Claims (25)

1.MRSA引物组在制备用于检测样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的存在或不存在的方法的试剂盒中的用途，所述方法包括

(a)进行扩增步骤，包括用MRSA引物组接触所述样品来产生扩增产物，如果MRSA存在于所述样品中，

(b)进行杂交步骤，包括用MRSA探针对接触步骤(a)的所述扩增产物，其中MRSA探针对的第一MRSA探针是用供体荧光部分标记的，以及其中所述MRSA探针对的第二MRSA探针是用相应的接受体荧光部分标记的；以及

(c)检测所述第一MRSA探针的供体荧光部分和所述第二MRSA探针的接受体荧光部分之间荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在，其中FRET的存在是样品中存在MRSA的指示，以及其中FRET的不存在是样品中不存在MRSA的指示，

其中所述方法能够检测MRSA的I到V型葡萄球菌染色体盒(SCCmec)的每一种，以及

其中所述引物组包括

(i)特异于RE2型MRSA的引物，即包含或由核酸序列5’-TGA AATGAA AGA CTG CGG AG-3’(MRSA direct RE2fwd；SEQ ID NO：92)组成的引物；

知

(ii)特异于RE3型MRSA的引物，即包含或由核酸序列5’-CCACAT CTC ATT AAA TTT TTA AAT TAT ACA C-3’(MRSA direct RE3fwd；SEQ ID NO：93)组成的引物；

和

(iii)特异于RE7型MRSA的引物，即包含或由核酸序列5’-CAATCC TTT TTA TAT TTA AAA TAT ATT ATA CAC-3’(MRSA direct RE7fwd；SEQ ID NO：94)组成的引物。

2.权利要求1的用途，其中所述引物组另外包含特异于甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)以及甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)的另外的引物。

3.权利要求2的用途，其中所述另外的引物包含或由核酸序列5’-CAA GGA AAG ATG CTA TCT TCC G-3’(MRSA direct rev；SEQ ID NO：95)组成。

4.权利要求1或2的用途，其中所述引物组由最多4或5个引物组成。

5.权利要求1或2的用途，其中所述引物组包含或由以下组成：MRSA direct RE2fwd、MRSA direct RE3fwd和MRSA direct RE7fwd和反向引物。

6.权利要求1或2的用途，其中所述反向引物是MRSA direct rev。

7.权利要求1或2的用途，其中所述探针对的至少一个探针包含或由荧光部分和核酸序列组成，所述核酸序列选自

5’-AAG TCG CTT TGC CCT TGG G-3’(MRSA direct Fluos w／o label；SEQ ID NO：96)，和

5’-CAT GCG TTG GTT CGA TTC TTG-3’(MRSA direct Red610w／olabel；SEQ ID NO：97)。

8.权利要求1或2的用途，其中包括第一标记物的第一探针是5’-AAG TCG CTT TGC CCT TGG G-3’-荧光素(MRSA direct Fluos)和其中包括第二标记物的第二探针是LC-Red610-5’-CAT GCG TTG GTTCGA TTC TTG-3’(MRSA direct Red610)。

9.权利要求1或2的用途，其中MRSA探针对的成员在相互不超过五个、四个或三个核苷酸之内与扩增产物杂交。

10.权利要求1或2的用途，其中

(a)所述供体荧光部分是荧光素；和／或

(b)其中所述接受体荧光部分选自LC-Red61O、LC-Red640、LC-Red670、LC-Red705、Cy5和Cy5.5。

11.MRSA引物组在制备用于检测样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的存在或不存在的方法的试剂盒中的用途，所述方法包括

(a)进行扩增步骤，包括用MRSA引物组接触所述样品来产生扩增产物，如果MRSA存在于所述样品中，

(b)进行杂交步骤，包括用MRSA探针接触步骤(a)的扩增产物，其中所述MRSA探针用供体荧光部分和用相应的接受体荧光部分标记；和

(c)检测MRSA探针的供体荧光部分和接受体荧光部分之间荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在，其中FRET的存在或不存在是样品中MRSA的存在或不存在的指示，

其中所述方法能够检测MRSA的I到V型葡萄球菌染色体盒(SCCmec)的每一种，和其中所述引物组是如权利要求1到6中所定义的。

12.权利要求11的用途，

a)其中所述探针包含或由两个荧光部分以及如权利要求7中所定义的核酸序列组成；

b)其中所述扩增步骤采用具有5′到3′核酸外切酶活性的聚合酶；

c)其中所述供体和接受体荧光部分在探针上相互不超过5个核苷酸之内；

d)其中所述探针包含允许二级结构形成的核酸序列，其中所述二级结构形成引起供体和接受体荧光部分之间的空间接近；和／或

e)其中所述接受体荧光部分是淬灭剂。

13.权利要求1、2、11和12的任一项的用途，其中所述检测步骤包括在供体荧光部分所吸收的波长下激发样品，以及显现和／或测量接受体荧光部分发射的波长。

14.权利要求1、2、11和12的任一项的用途，其中所述检测包括定量FRET。

15.权利要求1、2、11和12的任一项的用途，其中在55、45或35次循环之内FRET的存在是样品中存在MRSA的指示。

16.权利要求1、2、11和12的任一项的用途，其中所述检测步骤在扩增和杂交的每个步骤之后和／或实时地进行。

17.权利要求1、2、11和12的任一项的用途，进一步包括测定探针之一或两者与步骤(a)的扩增产物之间的熔解温度，其中所述熔解温度确认MRSA的存在或不存在。

18.权利要求1、2、11和12的任一项的用途，进一步包括：

防止杂质核酸的扩增。

19.权利要求1、2、11和12的任一项的用途，其中所述方法在对照样品上进行，其中所述对照样品包含MRSA核酸分子。

20.权利要求1、2、11和12的任一项的用途，其中所述样品是生物样品。

21.如权利要求1到6中任一项所定义的引物组和任选的如权利要求7到10中任一项所定义的探针或探针对。

22.一种试剂盒，包含：

(a)权利要求1到6的任一项中所定义的引物组；

(b)权利要求7或8中所定义的探针对或权利要求12的a)、c)或d)中所定义的探针；和

(c)标记所述探针的供体荧光部分和相应的荧光部分，

其中所述试剂盒能够检测MRSA的I到V型葡萄球菌染色体盒(SCCmec)的每一种。

23.权利要求22的试剂盒，适合于进行权利要求1到12的任一项的方法。

24.权利要求22或23的试剂盒，进一步包括包装标签或包装说明书，其上具有使用所述MRSA引物组和MRSA探针对来检测样品中的存在或不存在的说明。

25.权利要求22或23的试剂盒，进一步包括至少一种适合的酶，和／或适合的缓冲剂。