JP5498954B2 - 抗生剤耐性微生物の検出 - Google Patents
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Description
本願は、2007年12月21日に出願された米国仮特許出願第61/015,954号;および2008年3月31に出願された米国仮特許出願第61/041,146号の利益を主張する。これらの、より早い出願の全体の開示は、参照により本明細書により援用される
本発明は、核酸診断に関連するバイオテクノロジーの亜分野に関する。より具体的に述べると、本発明は、メチシリン耐性Staphylococcus aureus(MRSA)などの抗生剤耐性菌の検出に関する。
メチシリン耐性Staphylococcus aureus(MRSA)は、それ以外のメチシリン感受性S.aureus(MSSA)に対しては有効な特定の抗生剤に対して耐性な細菌性病原体である。より具体的に述べると、オキサシリンおよびメチシリンに対して耐性な、従来MRSAと呼ばれてきたS.aureus菌株は、セファロスポリンおよびカルバペネムを含むすべてのβ−ラクタム剤に対して耐性である。病院関連のMRSA分離株が、エリトロマイシン、クリンダマイシン、およびテトラサイクリンを含む他の一般に用いられる抗微生物剤に対して多剤耐性であることが多いのに対し、地域関連のMRSA分離株は、β−ラクタム剤およびエリトロマイシンのみに対して耐性であることが多い(非特許文献1を参照されたい)。2005年において重度のMRSA感染(すなわち、侵襲性の感染)を発生させた人々の推定人数は、約94,360人であった(非特許文献2)。
(1) S.aureus特異的標的配列をコードする核酸配列を増幅するための組成物であって、
配列番号1からなる標的相補的塩基配列を有する第1のオリゴヌクレオチドと、
前記S.aureus特異的標的配列に対して相補的でない5’配列を場合によって含む、配列番号4からなる標的相補的塩基配列を有する最長60塩基までの長さの第2のオリゴヌクレオチドと
を含む組成物。
(2) 前記第1および第2のオリゴヌクレオチドのうちの一方のみが、鋳型依存性DNAポリメラーゼにより伸長しうる3’端を有する、項目1に記載の組成物。
(3) 検出可能に標識されているハイブリダイゼーションプローブをさらに含む、項目2に記載の組成物。
(4) メチシリン耐性をコードする核酸配列を増幅するための組成物であって、
配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、および配列番号9からなる群から選択される標的相補的塩基配列を有する第1のオリゴヌクレオチドと、
メチシリン耐性をコードする前記核酸配列に対して相補的でない5’配列を場合によって含む、配列番号13からなる標的相補的塩基配列を有する第2のオリゴヌクレオチドと
を含む組成物。
(5) 前記第1および第2のオリゴヌクレオチドのうちの一方のみが、鋳型依存性DNAポリメラーゼにより伸長しうる3’端を有する、項目4に記載の組成物。
(6) 検出可能に標識されているハイブリダイゼーションプローブをさらに含む、項目5に記載の組成物。
(7) 2つの増幅配列の存在によりMRSAを同定する核酸共増幅アッセイにおける偽陽性MRSA判定の発生率を低減する方法であって、
(a)MRSAの存在について試験される臨床試料からゲノムDNAを取得するステップであり、この結果、S.aureus核酸およびメチシリン耐性をコードする核酸の混合物がもたらされるステップと、
(b)ステップ(a)で取得された前記ゲノムDNAを鋳型として用いて実施されるin vitroの核酸増幅反応で、S.aureus特異的標的配列およびメチシリン耐性マーカーを共増幅するステップと、
(c)ステップ(b)で共増幅された前記S.aureus特異的標的配列および前記メチシリン耐性マーカーに対して、時間依存的な増幅指標を決定するステップと、
(d)ステップ(c)で決定された前記時間依存的な増幅指標両方の関数である数値を計算するステップと、
(e)ステップ(d)で計算された前記数値を、MRSAを同定する閾値基準と比較するステップであり、MSSA菌およびMR−CoNS細菌の混合物は含むがMRSA細菌は含まない臨床試料を示す数値の部分集合を、前記閾値基準により除外するステップと、
(f)前記閾値基準が満たされる場合に限り前記臨床試料中にMRSAが存在することを判定するステップであり、これにより、偽陽性MRSA判定の発生率が低下するステップと
を含む方法。
(8) ステップ(d)で計算される前記数値が、上限閾値カットオフ値から下限閾値カットオフ値にわたる範囲内にあることを、ステップ(e)の前記閾値基準が必要とする、項目7に記載の方法。
(9) ステップ(d)で計算される前記数値が、ステップ(c)で決定された前記時間依存的な増幅指標の間の差として計算されるΔCtの数値である、項目7に記載の方法。
(10) 前記ΔCtの数値が、経験的に決定される上限閾値カットオフ値から経験的に決定される下限閾値カットオフ値にわたるΔCt範囲内にあることを、ステップ(e)の前記閾値基準が必要とする、項目9に記載の方法。
(11) 前記メチシリン耐性マーカーがmecA標的配列を含み、
ステップ(d)の前記ΔCtの数値が、S.aureus特異的標的配列に対して決定された時間依存的な増幅指標から、mecA標的配列に対して決定された時間依存的な増幅指標を減じることにより計算され、
前記ΔCtの数値が、経験的に決定された閾値カットオフ値よりも大きいことを、ステップ(e)の前記閾値基準が必要とする、
項目9に記載の方法。
(12) 前記臨床試料が鼻腔スワブ試料を含む、項目7に記載の方法。
(13) 前記メチシリン耐性マーカーがmecA標的配列を含む、項目7に記載の方法。
(14) 前記メチシリン耐性マーカーがmecA標的配列を含む、項目12に記載の方法。
(15) 前記S.aureus特異的標的配列が、S.aureus特異的リボソーム核酸配列を含む、項目14に記載の方法。
(16) 臨床試料がメチシリン感受性S.aureus細菌を含有することを確立する方法であって、
(a)前記臨床試料から核酸を取得するステップと、
(b)ステップ(a)で取得された核酸を鋳型として用いて実施される、in vitroの核酸増幅反応で、S.aureus特異的標的配列およびメチシリン耐性特異的標的配列を共増幅するステップであり、
前記標的配列の各々がステップ(a)で取得された核酸の中に含まれ、
前記標的配列の両方についての増幅産物が、前記in vitroの核酸増幅反応で生成および検出されるステップと、
(c)ステップ(b)で共増幅された前記S.aureus特異的標的配列および前記メチシリン耐性特異的標的配列についての時間依存的な増幅指標を決定するステップと、
(d)ステップ(c)で決定された、前記時間依存的な増幅指標両方の関数である数値を計算するステップと、
(e)ステップ(d)で計算された前記数値が、
(i)メチシリン耐性S.aureus細菌から取得される核酸の共増幅反応速度と、
(ii)メチシリン感受性S.aureus細菌およびメチシリン耐性コアグラーゼ陰性細菌の混合物から取得される核酸の共増幅反応速度と
を区別する閾値基準を満たす場合に、前記生物学的試料がメチシリン感受性S.aureus細菌を含有することを確立するステップと
を含む方法。
(17) 前記臨床試料が鼻腔スワブ試料を含む、項目16に記載の方法。
(18) 前記メチシリン耐性特異的標的配列がmecA標的配列を含む、項目16に記載の方法。
(19) ステップ(e)の前記閾値基準が、ステップ(d)で計算された前記数値の、経験的に決定された下限閾値カットオフ値との比較、および経験的に決定された上限閾値カットオフ値との比較を含む、項目16に記載の方法。
(20) ステップ(d)で計算される前記数値が、ステップ(c)で決定された前記時間依存的な増幅指標の間の差として計算されるΔCtの数値である、項目16に記載の方法。
(21) メチシリン感受性S.aureus細菌の存在を確立するために、前記ΔCtの数値が経験的に決定された下限閾値カットオフ値よりも小さいこと、または前記ΔCtの数値が経験的に決定された上限閾値カットオフ値よりも大きいことを、ステップ(e)の前記閾値基準が必要とする、項目20に記載の方法。
(22) 前記S.aureus特異的標的配列に対して決定された前記時間依存的な増幅指標から、前記mecA標的配列に対して決定された前記時間依存的な増幅指標を減じることによりステップ(d)の前記ΔCtの数値が計算され、
メチシリン感受性S.aureus細菌の存在を確立するために、前記ΔCtの数値が経験的に決定された閾値カットオフ値よりも小さいことを、ステップ(e)の前記閾値基準が必要とする、
項目20に記載の方法。
(23) 前記S.aureus特異的標的配列に対して決定された前記時間依存的な増幅指標から、前記mecA標的配列に対して決定された前記時間依存的な増幅指標を減じることによりステップ(d)の前記ΔCtの数値が計算され、
メチシリン感受性S.aureus細菌の存在を確立するために、前記ΔCtの数値が経験的に決定された閾値カットオフ値よりも大きいことを、ステップ(e)の前記閾値基準が必要とする、
項目20に記載の方法。
(24) 前記取得するステップが、ゲノムDNAを取得することを含む、項目16に記載の方法。
(25) ステップ(b)における前記in vitroの核酸増幅反応が逆転写酵素を含む、項目16に記載の方法。
(26) 前記S.aureus特異的標的配列が、S.aureusリボソーム核酸配列である、項目16に記載の方法。
(27) 前記決定するステップが、単位複製配列の生成を示す検出可能なシグナルの所定レベルに到達する時間を決定することを含む、項目16に記載の方法。
(28) 前記メチシリン耐性特異的標的配列が、mecA標的配列を含む、項目17に記載の方法。
(29) ステップ(d)で計算される前記数値が、ステップ(c)で決定された前記時間依存的な増幅指標の間の差として計算されるΔCtの数値である、項目28に記載の方法。
(30) ステップ(e)の前記閾値基準が、ステップ(d)の前記ΔCtの数値の、経験的に決定された下限閾値カットオフ値との比較、および経験的に決定された上限閾値カットオフ値との比較を含む、項目29に記載の方法。
(31) メチシリン感受性S.aureus細菌の存在を確立するために、前記ΔCtの数値が経験的に決定された下限閾値カットオフ値よりも小さいこと、または前記ΔCtの数値が経験的に決定された上限閾値カットオフ値よりも大きいことを、ステップ(e)の前記閾値基準が必要とする、項目29に記載の方法。
(32) 前記S.aureus特異的標的配列に対して決定された前記時間依存的な増幅指標から、前記mecA標的配列に対して決定された前記時間依存的な増幅指標を減じることによりステップ(d)の前記ΔCtの数値が計算され、
メチシリン感受性S.aureus細菌の存在を確立するために、前記ΔCtの数値が経験的に決定された閾値カットオフ値よりも小さいことを、ステップ(e)の前記閾値基準が必要とする、
項目29に記載の方法。
(33) 前記S.aureus特異的標的配列に対して決定された前記時間依存的な増幅指標から、前記mecA標的配列に対して決定された前記時間依存的な増幅指標を減じることによりステップ(d)の前記ΔCtの数値が計算され、
メチシリン感受性S.aureus細菌の存在を確立するために、前記ΔCtの数値が、経験的に決定された閾値カットオフ値よりも大きいことを、ステップ(e)の前記閾値基準が必要とする、
項目29に記載の方法。
(34) 臨床試料がメチシリン耐性S.aureus(MRSA)細菌を含有することを、制御可能な偽陽性判定発生率で示す方法であって、
(a)前記臨床試料からゲノムDNAを取得するステップであり、この結果、S.aureus核酸およびメチシリン耐性をコードする核酸の混合物がもたらされるステップと、
(b)ステップ(a)で取得された前記ゲノムDNAを鋳型として用いて実施されるin vitroの核酸増幅反応で、S.aureus特異的標的配列およびメチシリン耐性マーカーを共増幅するステップと、
(c)ステップ(b)で共増幅された前記S.aureus特異的標的配列および前記メチシリン耐性マーカーに対して、時間依存的な増幅指標を決定するステップと、
(d)ステップ(c)で決定された、前記時間依存的な増幅指標両方の関数である数値を計算するステップと、
(e)MRSAから取得された核酸の増幅を、MSSA細菌およびMR−CoNS細菌の混合物から取得された核酸の増幅から区別する閾値基準を、ステップ(d)で計算された前記数値が満たす場合に、前記臨床試料がMRSAを含有することを示すステップであり、これにより、前記S.aureus特異的標的配列および前記メチシリン耐性マーカーの両方の存在を定性的に検出することによりMRSAの存在を判定する方法と比較して、臨床試料中におけるMSSAおよびMR−CoNSの混合物からもたらされる偽陽性MRSA判定が低減されるステップと
を含む方法。
(35) ステップ(d)で計算される前記数値が、経験的に決定される上限閾値カットオフ値から、経験的に決定される下限閾値カットオフ値にわたる範囲内にあることを、ステップ(e)の前記閾値基準が必要とする、項目34に記載の方法。
(36) ステップ(d)で計算される前記数値が、ステップ(c)で決定された前記時間依存的な増幅指標の間の差として計算されるΔCtの数値である、項目34に記載の方法。
(37) 前記前記ΔCtの数値が、経験的に決定される上限閾値カットオフ値から、経験的に決定される下限閾値カットオフ値にわたるΔCt範囲内にあることを、ステップ(e)の前記閾値基準が必要とする、項目36に記載の方法。
(38) 前記臨床試料が鼻腔スワブ試料を含む、項目34に記載の方法。
(39) 前記メチシリン耐性マーカーがmecA標的配列を含む、項目34に記載の方法。
(40) 前記メチシリン耐性マーカーがmecA標的配列を含む、項目38に記載の方法。
(41) 前記S.aureus特異的標的配列が、リボソーム核酸配列を含む、項目40に記載の方法。
(42) 臨床試料が、メチシリン耐性S.aureus(MRSA)細菌を含有するか、メチシリン感受性S.aureus(MSSA)細菌およびメチシリン耐性コアグラーゼ陰性Staphylococcus(MR−CoNS)細菌の混合物を含有するか確立する方法であって、
(a)前記臨床試料からゲノムDNAを取得するステップであり、この結果、S.aureus核酸およびメチシリン耐性をコードする核酸の混合物がもたらされるステップと、
(b)ステップ(a)で取得された前記ゲノムDNAを鋳型として用いて実施されるin vitroの核酸増幅反応で、S.aureus特異的標的配列およびメチシリン耐性マーカーを共増幅するステップと、
(c)ステップ(b)で共増幅された前記S.aureus特異的標的配列および前記メチシリン耐性マーカーに対して、時間依存的な増幅指標を決定するステップと、
(d)ステップ(c)で決定された前記時間依存的な増幅指標両方の関数である数値を計算するステップと、
(e)以下の相互に排他的な条件、
(i)MRSA細菌から取得される核酸の共増幅反応速度と、MSSA細菌およびMR−CoNS細菌の混合物から取得される核酸の共増幅反応速度とを区別する閾値基準を、ステップ(d)で計算された前記数値が満たす場合に、前記臨床試料はMRSAを含有すること、または
(ii)ステップ(d)で計算された前記数値が前記閾値基準を満たさない場合、前記臨床試料は、MR−CoNSと混合されたMSSAを含有し、MRSAを含有しないこと
のいずれが存在するかを確立するステップと
を含む方法。
(43) 前記数値が、経験的に決定される上限閾値カットオフ値から、経験的に決定される下限閾値カットオフ値にわたる範囲内にあることを、ステップ(e)の前記閾値基準が必要とする、項目42に記載の方法。
(44) ステップ(d)で計算される前記数値が、ステップ(c)で決定された前記時間依存的な増幅指標の間の差として計算されるΔCtの数値である、項目42に記載の方法。
(45) 前記ΔCtの数値が、経験的に決定される上限閾値カットオフ値から、経験的に決定される下限閾値カットオフ値にわたるΔCt範囲内にあることを、ステップ(e)の前記閾値基準が必要とする、項目44に記載の方法。
(46) ステップ(d)で計算される前記ΔCtの数値が前記経験的に決定された下限閾値カットオフ値よりも小さく、これにより、MR−CoNS細菌を超える量でMSSA細菌が存在するMSSA細菌およびMR−CoNS細菌の混合物を前記臨床試料が含有することを示す、項目45に記載の方法。
(47) 前記臨床試料が鼻腔スワブ試料を含む、項目42に記載の方法。
(48) 前記メチシリン耐性マーカーがmecA標的配列を含む、項目42に記載の方法。
(49) 前記メチシリン耐性マーカーがmecA標的配列を含む、項目47に記載の方法。
(50) 前記S.aureus特異的標的配列が、リボソーム核酸配列を含む、項目49に記載の方法。
(51) 臨床検査試料中におけるMRSA細菌の存在と符合する反応速度プロファイルを同定するリアルタイム核酸共増幅アッセイで、感度および特異性のパラメータを設定する方法であって、
(a)MRSA細菌を含むことが既知である臨床試料コレクションと、MSSA細菌およびMR−CoNS細菌は含むがMRSA細菌は含まないことが既知である臨床試料コレクションとを取得するステップと、
(b)ステップ(a)における前記臨床試料コレクションの中における各試料からゲノムDNAを単離するステップであり、この結果、MRSAを含む細菌から単離されたゲノムDNA試料のコレクションと、MSSAおよびMR−CoNSは含むがMRSAは含まない細菌から単離されたゲノムDNA試料のコレクションとがもたらされるステップと、
(c)ステップ(b)からの前記単離されたゲノムDNA試料の各々についての個別の核酸増幅反応で、S.aureus特異的標的配列およびメチシリン耐性マーカーを共増幅するステップと、
(d)ステップ(c)の前記核酸増幅反応で共増幅されたS.aureus特異的標的配列およびメチシリン耐性マーカーに対して、時間依存的な増幅指標を決定するステップと、
(e)ステップ(c)の前記核酸増幅反応の各々について、ステップ(d)で決定された前記時間依存的な増幅指標両方の関数である数値を計算するステップであり、この結果、MRSAを含む試料についての数値コレクションと、MSSAおよびMR−CoNSは含むがMRSAは含まない試料についての数値コレクションとがもたらされるステップと、
(f)前記臨床検査試料中におけるMRSA細菌の存在と符合する反応速度プロファイルを同定するのに必要とされる、ステップ(e)で計算された前記数値に対する閾値基準を選択するステップであり、MSSAおよびMR−CoNSは含むがMRSAは含まない試料についての前記数値コレクションの中における値の部分集合を前記閾値基準により除外し、これにより、前記リアルタイム核酸共増幅アッセイで、感度および特異性のパラメータを設定するステップと
を含む方法。
(52) 前記閾値基準により除外される前記値の部分集合が、MSSAおよびMR−CoNSは含むがMRSAは含まない試料についての前記数値コレクションの中における最高値および最低値を含む、項目51に記載の方法。
(53) ステップ(f)で選択された前記閾値基準を変更し、これにより、前記リアルタイム核酸共増幅アッセイの感度および特異性のパラメータを改変するステップ(g)をさらに含む、項目51に記載の方法。
以下の用語は、異なる意味を有することが明示的に示されない限り、本明細書において示される意味を有する。
以下では、MRSA細菌およびMSSA菌の核酸を調製、増幅、および検出する方法の例が説明される。より具体的に述べると、mecA核酸配列およびS.aureusリボソーム核酸配列の組合せを検出することにより、環境試料または生物学的試料中におけるMRSA細菌の存在を判定する方法が開示される。該技法は、メチシリン感受性CoNS細菌(すなわち、Staphylococcus epidermidisおよびStaphylococcus haemolyticus)の高バックグラウンド中、およびMSSAの高バックグラウンド中においてMRSAを検出する点で有利であった。加えて、該技法は、メチシリン感受性CoNS細菌(すなわち、表皮ブドウ球菌およびS.haemolyticus)の高バックグラウンド中においてMSSAを検出する点でも有利であった。mecA核酸配列およびS.aureusリボソーム核酸配列に対する個別の増幅反応が意図され、これらは本発明の範囲内にあるが、単一の多重核酸増幅反応(すなわち、単一の反応試験管または反応容器内における)においてこの核酸配列の組合せを増幅および検出することが好ましい。リアルタイムの増幅結果に対する反応速度解析を用いて、MRSA感染を、MSSA(すなわち、S.aureus配列の供給源をもたらす)およびMR−CoNS(すなわち、mecA配列の供給源をもたらす)の重感染から区別し、臨床試料を用いて、MSSAを、MR−CoNSまたはMRSAから区別することが可能であった。
一般的に述べると、開示される増幅手順で用いるのに好ましい試料の調製法は、細菌試料を回収するステップと、次いで、これを溶解させてゲノムDNAを放出させるステップと、次いで、少なくとも部分的にゲノムDNAを変性させるステップとを含む。該方法は、該溶解ステップの前に、試料中に含有される生物を他の試料成分から分離および/または濃縮する手順(例えば、試料からの粒子物質の濾過)を含みうる。試料調製は、化学的、機械的、および/または酵素的な細胞の破壊による、23S rRNAをコードするDNAおよびmecA遺伝子を含む細胞内内容物の放出を含みうる。細菌を溶解させ、ゲノムDNAを放出させ、放出されたゲノムDNA固体支持体上に捕捉するのに好ましい特定の方法は、任意選択の加熱するステップを含む。任意選択の加熱するステップを省き、細菌溶解、ゲノムDNAの放出、および固体支持体上へのゲノムDNAの捕捉を含む全試料調製手順を室温において実行することがより好ましい。試料調製にリソスタフィンなどの酵素を用いることもできるが、極めて好ましい手順では酵素を用いない。核酸増幅前の標的捕捉ステップでは、標的の核酸配列に基づいて他の試料成分から標的核酸を特異的または非特異的に分離することができる。非特異的な標的調製法では、実質的に水性の混合物から核酸を選択的に沈殿させるか、核酸を支持体に結合させ、これを洗浄して他の試料成分を除去するか、または他の手段を用いて、他の成分を含有する混合物から核酸を物理的に分離することができる。ある実施形態において、捕捉された核酸は、増幅前に固体支持体から放出される。他の実施形態において、捕捉された核酸は、最初に固体支持体から放出されることなく増幅される。
本発明との関連で有用な増幅法は、転写媒介増幅(TMA)、核酸配列ベースの増幅(NASBA)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、鎖置換増幅(SDA)、ならびに自己複製ポリヌクレオチド分子と、MDV−1 RNA酵素およびQ−ベータ酵素などの複製酵素とを用いる増幅法を含む。これらの各種増幅法を実施する方法は、それぞれ、米国特許第5,399,491号、米国特許第5,554,517号、米国特許第4,965,188号、米国特許第5,455,166号、米国特許第5,472,840 号、およびLizardiら、BioTechnology、第6巻、1197頁(1988年)において見出すことができる。増幅される配列を含有する標的核酸は、一本鎖核酸、または少なくとも部分的な一本鎖核酸として増幅反応混合物に供給されることが好ましい。
プロモーターオリゴヌクレオチド
当技術分野で周知の通り、プロモーターとは、核酸に結合し、特異的な部位におけるRNA転写を開始するためのシグナルとしてDNA依存性RNAポリメラーゼにより認識される、特異的な核酸配列である。鋳型核酸(転写される配列)は、二本鎖である必要はない。個々のDNA依存性RNAポリメラーゼは、転写の促進におけるそれらの有効性において顕著に異なりうる各種の異なるプロモーター配列を認識する。RNAポリメラーゼがプロモーター配列に結合して転写を開始する場合、そのプロモーター配列は、転写される配列の一部ではない。したがって、これにより生成されるRNA転写物は、その配列を含まない。
プライミングオリゴヌクレオチドは、その少なくとも3’端が核酸鋳型に相補的であり、該鋳型にハイブリダイズして、DNAポリメラーゼによる合成の開始に適するプライマー:鋳型複合体を与えるオリゴヌクレオチドである。プライミングオリゴヌクレオチドは、鋳型依存的な形における、その3’末端に対するヌクレオチドの付加により伸長する。結果は、プライマー伸長産物である。本発明のプライミングオリゴヌクレオチドは、少なくとも10ヌクレオチドの長さであることが典型的であり、15、20、25、30、35、40、50ヌクレオチド以上の長さまで伸長しうる。本明細書では、適切で好ましいプライミングオリゴヌクレオチドが説明される。公知のほとんどすべてのDNAポリメラーゼ(逆転写酵素を含む)は、一本鎖鋳型に対するオリゴヌクレオチドの複合体化(「プライミング」)によるDNA合成の開始を必要とすることが知られるが、RNAの転写(DNAからのRNAのコピー生成)は一般に、プライマーを必要としない。DNAポリメラーゼにより伸長するまさにその性質により、プライミングオリゴヌクレオチドは、3’遮断部分を含まない。
「ディスプレイサーオリゴヌクレオチド」とは、標的配列の3’端にハイブリダイズした近接するプライミングオリゴヌクレオチド(本明細書では、「順方向プライミングオリゴヌクレオチド」とも称する)よりも上流の鋳型核酸にハイブリダイズするプライミングオリゴヌクレオチドである。「上流」とは、ディスプレイサーオリゴヌクレオチドの3’端が、順方向プライミングオリゴヌクレオチドの3’端に対して5’側の鋳型核酸と複合体化することを意味する。鋳型核酸にハイブリダイズすると、ディスプレイサーオリゴヌクレオチドの3’末端塩基は、順方向プライミングオリゴヌクレオチドの5末端塩基に隣接するかまたはこれとは隔てられることが好ましい。ディスプレイサーオリゴヌクレオチドの3’末端塩基は、順方向プライミングオリゴヌクレオチドの5’末端塩基から5〜35塩基隔てられていることがより好ましい。ディスプレイサーオリゴヌクレオチドは、順方向プライミングオリゴヌクレオチドと同時であるか、または順方向プライミングオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とハイブリダイズするのに十分な時間を経た後に、反応混合物に供給することができる。順方向プライミングオリゴヌクレオチドの伸長は、ディスプレイサーオリゴヌクレオチドが反応混合物に供給される前に開始させることもでき、該供給の後に開始させることもできる。増幅条件下において、ディスプレイサーオリゴヌクレオチドは、鋳型依存的な形で伸長し、これにより、鋳型核酸と複合体化した順方向プライミングオリゴヌクレオチドを含むプライマー伸長産物を置換する。鋳型核酸から置換されると、順方向プライミングオリゴヌクレオチドを含むプライマー伸長産物は、プロモーターオリゴヌクレオチドとの複合体化に用いられる。順方向プライミングオリゴヌクレオチドおよびディスプレイサーオリゴヌクレオチドは共に、標的核酸に対して優先的にハイブリダイズする。ディスプレイサーオリゴヌクレオチドおよびそれらの使用の例は、Beckerら、米国特許出願第11/681,104号により開示されている。
核酸ポリメラーゼにより伸長しないオリゴマーは、増幅反応におけるオリゴマーの酵素を介する伸長を阻止するように3’OHを置換する「遮断部分」を含むことが好ましい。本明細書で用いられる遮断部分は、核酸ポリメラーゼによる効果的な伸長が不可能であるように、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸の3’末端を「遮断する」のに用いられる物質である。遮断部分は、小型分子(例えば、リン酸基またはアンモニウム基)の場合もあり、改変ヌクレオチド(例えば、3’2’−ジデオキシヌクレオチドまたは3’デオキシアデノシン5’−三リン酸(コルジセピン))または他の改変ヌクレオチドの場合もある。さらなる遮断部分は、例えば、3’末端における遊離ヒドロキシル基、3’側アルキル基、3’側非ヌクレオチド部分(Arnoldら、「Non−Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes」、米国特許第6,031,091号を参照されたい)、ホスホロチオエート、アルカンジオール残基、ペプチド核酸(PNA)、3’末端において3’側ヒドロキシル基を欠くヌクレオチド残基、または核酸結合タンパク質を存在させないような、3’から5’への方向性を有するヌクレオチドまたは短いヌクレオチド配列を含む。3’遮断部分は、3’から5’への方向性を有するヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列または3’側非ヌクレオチド部分を含むが、3’2’−ジデオキシヌクレオチドまたは遊離ヒドロキシル基を有する3’末端は含まないことが好ましい。3’遮断オリゴヌクレオチドを調製するさらなる方法は、当業者に周知である。
「ターミネーティングオリゴヌクレオチド」とは、プライミングオリゴヌクレオチドを含む新生核酸のプライマー伸長を「終結させ」、これにより、新生核酸鎖に指摘の3’端をもたらすように、標的配列の5’端の近傍における標的核酸の領域に対して相補的である塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである。ターミネーティングオリゴヌクレオチドは、新生核酸鎖に望ましい3’端を達成するのに十分な位置において標的酢酸にハイブリダイズするように設計される。ターミネーティングオリゴヌクレオチドの位置取りは、その設計に応じて柔軟である。ターミネーティングオリゴヌクレオチドは、改変の場合もあり、非改変の場合もある。ある実施形態において、ターミネーティングオリゴヌクレオチドは、少なくとも1種または複数種のLNAヌクレオチド類似体により合成される。これらの改変ヌクレオチドは、DNAを含む相補的二重鎖のより高度な熱安定性を示している。2’−O−MEリボヌクレオチドなど、他の改変もまた、一部の実施形態において用いることができる。本発明のターミネーティングオリゴヌクレオチドは、その3’末端において伸長を阻止する遮断部分を含むことが典型的である。本発明のターミネーティングオリゴヌクレオチドは、少なくとも10塩基の長さであることが典型的であり、15、20、25、30、35、40、50ヌクレオチド以上の長さまで伸長させることができる。本明細書では、適切で好ましいターミネーティングオリゴヌクレオチドが説明されている。ターミネーティングオリゴヌクレオチドが3’遮断部分を含むことは典型的であるかまたは必要であるが、「3’遮断された」オリゴヌクレオチドは、必ずしもターミネーティングオリゴヌクレオチドではない。
本明細書で開示される種類の核酸増幅産物は、従来の任意の手段により検出することができる。例えば、増幅産物は、検出可能な標識プローブとのハイブリダイゼーションおよび結果としてもたらされるハイブリッド体の測定により検出することができる。具体的な標的配列を検出するプローブの選択における設計基準は当技術分野において周知であり、例えば、Hoganら、「Methods for Making Oligonucleotide Probes for the Detection and/or Quantitation of Non−Viral Organisms」、米国特許第6,150,517号において説明されている。Hoganは、(1つまたは複数の)標的配列に対する相同性を最大化し、可能な非標的配列に対する相同性を最小化するようにプローブを設計すべきであることを教示している。非標的配列との安定性を最小化するため、Hoganは、グアニンおよびシトシンに富む領域を回避し、プローブとの不安定化ミスマッチが可能な限り多数にわたり、非標的配列に対する完全な相補性の長さを最小化するべきであることを示唆している。(1つまたは複数の)標的配列とのプローブの安定性を最大化すべきであり、アデニンおよびチミンに富む領域を回避すべきであり、プローブ:標的ハイブリッド体がグアニンおよびシトシンの塩基対により終結することが好ましく、広範にわたる自己相補性は一般に回避すべきであり、プローブ:標的ハイブリッド体の融解温度をアッセイ温度よりも2〜10℃高温とすべきである。
分子トーチおよび分子ビーコンは、検出可能標識の相互作用対により標識することが好ましい。標識の相互作用対のメンバーとして好ましい検出可能標識の例は、FRETまたは非FRETによるエネルギー移動機構により互いに相互作用する。蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)は、熱エネルギーへの転換がなく、またドナーおよびアクセプターが運動論的衝突を来すこともない、原子間距離よりもはるかに大きな距離にわたる発色団間の共鳴相互作用を介する、分子または分子システム内における吸収部位からその使用部位へのエネルギー量子の非放射性移動を伴う。「ドナー」とは、エネルギーを最初に吸収する部分であり、「アクセプター」とは、エネルギーがその後そこへ移動する部分である。FRETに加え、励起エネルギーをドナー分子からアクセプター分子へと移動させうる、少なくとも3つの他の「非FRET」エネルギー移動過程が存在する。
本明細書で開示される方法により、核酸増幅反応における所定レベルの進行を示す数値(本明細書では、「増幅指標」と称する)を比較することで、試料中におけるMRSA細菌の存在についての情報を得た。この目的では多くの異なる増幅指標を用いうるが、閾値ベースの増幅指標(「Ct」値の決定を結果としてもたらす)を用いて本発明を例示した。等温条件下において実行された多重核酸増幅反応を用いて本発明をさらに例示した。増幅サイクルの関数としての反応進行をモニタリングするのではなく、反応時間の関数としての反応進行をモニタリングした。したがって、本明細書で報告されるCt値は、閾値の値に達した蛍光シグナルを結果としてもたらすのに十分な量の単位複製配列を生成する特定の増幅反応に必要とされる時間を表わした。当然ながら、多数の変化形は同等であることが示唆されるであろう。例えば、満たされるかまたは超えられる閾値の値が生の蛍光リーディング以外のものでありうるような標準化ステップおよび/またはバックグラウンド減算ステップが存在しうる。多重増幅反応における2つの核酸標的に対する増幅指標を比較するのに好ましい方法は、減算、加算、除算、および乗算を含む。比較は、増幅指標間の差に基づくことが好ましい。
本発明によれば、共増幅されたS.aureus特異的標的核酸およびmecA標的核酸について決定される増幅指標の関数である数値が計算される。簡単に述べると、2つの共増幅された核酸標的の増幅反応速度から標的のレベル差を推定することができる。単一の共増幅反応に由来する2つの増幅指標(すなわち、S.aureus特異的標的核酸およびmecA標的核酸の各々に対する指標)を変数として用いて、ある種の方程式を解くことが好ましい。この目的で用いられて有用であることが意図される数学的関係の例は、乗算、除算、加算、および減算である。減算による2つの増幅指標の数学的な関連付け(すなわち、該指標間の差の確立)が極めて好ましく、これにより閾値カットオフ値の確立が簡略化される。2つの増幅指標間の差は、項「ΔCt」により表わすことができる。これらのΔCt値を閾値ベースの基準と比較して、診断法の出力結果についての判定を行うことができる。
本発明によれば、閾値カットオフ値は、検査試料がMRSAまたはMSSAおよびMR−CoNSの混合物のいずれを含むのかを判定するのに用いられる。例えば、MRSA陽性試料に対して、S.aureus特異的標的核酸およびmecA標的核酸について決定される増幅指標(例えば、ΔCt値)を変数として用いる数学的方程式の解として計算された数値が−1であり、MSSAおよびMR−CoNSの混合物を含むがMRSAは含まない試料に対する増幅指標を用いて同様に計算された値が−3である場合、閾値カットオフ値を−2に設定すれば、1つの試料が他の試料から区別される。別の形で述べれば、この場合、MRSA試料に対するΔCt値(すなわち、−1)は、−2に設定された閾値カットオフ値により、MSSA試料に対するΔCt値(すなわち、−3)から「分離」される。特に、閾値カットオフ値の調整または変更により、アッセイの感度および特異性が改変される。これは、図7Bにおける水平線として示される閾値カットオフ値を−2から−4へと変化させると、さらに1〜2例のMRSA陽性試料を正当に含むことにはなるが、また、さらなるMRSA陰性試料を含むことにもなる(すなわち、偽陰性判定を増大させる)ことを理解することにより認めうる。したがって、互いに排除的なMRSA判定またはMSSA判定を行うのに用いられる閾値カットオフ値を調整するのみで、アッセイの感度および特異性が改変される。
本明細書で開示される方法は、コンピュータまたは類似の処理デバイス(以下では「コンピュータ」)を用いて部分的に実装することができる点で簡便である。異なる好ましい実施形態では、フリースタンディングコンピュータのメモリー構成要素内、または解析を受ける産物の量を、好ましくは時間の関数としてモニタリングするのに用いられるデバイスに連結されたコンピュータのメモリー構成要素内に、アルゴリズムを実行するソフトウェアまたはマシンで実行可能な命令をロードするかまたは他の形で保持することができる。極めて好ましい実施形態において、アルゴリズムを実行するソフトウェアは、反応混合物中に存在する単位複製配列の量を時間の関数としてモニタリングすることが可能なデバイスに連結されるか、またはこの統合部分であるコンピュータのメモリー構成要素内に保持される。
増幅反応を実施するのに有用な増幅オリゴヌクレオチドは、標的結合に関与せず、増幅手順または検出手順に実質的に影響を及ぼさないこともある外来配列の存在を受け入れる、異なる長さを有しうる。例えば、本発明による増幅反応を実施するのに有用なプロモーターオリゴヌクレオチドは、標的核酸にハイブリダイズする少なくとも最小限の配列と、その最小限の配列の上流に位置するプロモーター配列とを有する。しかし、標的結合配列とプロモーター配列との間における配列の挿入により、増幅反応におけるその有用性を損なわずにプライマーの長さを変化させることができる。加えて、増幅プライマーおよび検出プローブの長さは、これらのオリゴヌクレオチドの配列が、所望の相補的配列にハイブリダイズする最小限の不可欠な要件を満たす限りにおいて、選択の問題である。
解析対象の核酸配列を検出するのに有用なハイブリダイゼーションプローブは、S.aureusrDNA標的核酸配列、mecA標的核酸配列、または内部対照標的核酸に対して実質的に相補的な塩基配列を含む。したがって、本発明のプローブは、増幅された標的核酸配列の1本の鎖またはその相補体にハイブリダイズすることが好ましい。これらのプローブは、場合によって、検出される標的核酸に対して相補的な場合もありそうでない場合もある標的核酸領域の外側において、さらなる塩基を有することがある。
簡単に述べると、好ましい標的捕捉法では、標的核酸に非特異的にハイブリダイズし、次いで、それを試料調製物の他の成分から分離するのに、1種または複数種の核酸オリゴマーを用いる。増幅前に核酸を精製するのに極めて好ましい非特異的な標的捕捉法に関する詳細は、第11/832,367号の番号により同定される米国特許出願において、Beckerらにより与えられる。
増幅核酸を検出するアッセイは、場合によって、同じ増幅反応混合物中において増幅および検出される内部対照(IC)核酸を含む。ICは、IC配列に特異的な増幅オリゴヌクレオチドおよび検出プローブを用いることにより増幅することができる。意図される解析対象の核酸に対するシグナルが得られない場合(例えば、S.aureusおよびmecAによる解析対象の核酸に対して陰性結果をもたらす試料の場合)、増幅されたIC配列からのシグナルの検出により、アッセイ試薬、アッセイ条件、およびアッセイ手順のステップがアッセイにおいて適正に用いられて実施されたことが示される。ICの好ましい実施形態は、天然の供給源に由来している無作為的配列(無作為的な形で再配列されたHIV配列)である。好ましいICは、天然の供給源から単離されるか、または化学合成されるか、またはin vitroの技法によるRNA転写物またはDNA分子でありうる。プライマーおよびプローブが、解析対象の標的配列を増幅および検出するのに用いられるのと実質的に同じアッセイ条件を用いるIC配列の増幅および検出に機能する場合、IC標的配列のプライマーおよびプローブは、任意の周知の方法を用いて設計および合成される。標的捕捉ベースの精製ステップを含む好ましい実施形態において、IC標的に特異的な標的捕捉プローブは、該ICが、すべてのアッセイステップにおいて意図される解析対象に用いられるのと同じ条件において処理されるように、標的捕捉ステップ内に組み入れられる。
S.aureusに特異的なリボソーム核酸配列に加えて、他のS.aureus特異的核酸配列も、本明細書で開示される該リボソーム核酸配列に代用することができる。例えば、上記で言及されたorfX遺伝子配列はS.aureus内で高度に保存されることが公知であり、SCCmecの組込み部位であることが公知である。したがって、本発明は、S.aureus特異的核酸配列の代わりにS.aureus特異的なorfX核酸配列を増幅および検出するステップを含む方法を包含することを意図する。当然ながら、これらの手順は、メチシリンに対して耐性を付与する組込み配列に近接するかまたはこれを含むorfXの一部の増幅など、orfX配列の一部のみの増幅を伴いうる。組込み接合部を超えた増幅に依拠する本発明の実施形態は、mecA配列との共増幅反応において特に好ましい。このような増幅反応において得られる反応速度結果に対する閾値基準の適用により、MRSAの同定に関する特異性を増強することができる。より具体的に述べれば、このような適用により、それがなければ(1)臨床試料中におけるMRSAの存在についての直接の指標としての挿入接合部の検出、または(2)臨床試料(例えば、鼻腔スワブ試料)中におけるMRSAの存在についての直接の指標としての挿入接合部およびmecA核酸配列の定性的検出から生じる偽陽性MRSA同定の発生率を低下させることができる。MRSA細菌内に含有されるorfX配列の一部に対する増幅、またはorfX接合部を超える増幅のための組成物および方法は、当業者に容易に使用可能である(例えば、米国特許第6,156,507号および同第7,449,289号を参照されたい)。
本明細書で説明されるリアルタイムの増幅システムを用いて得られる結果から進んで、本発明者らは、ゴールドスタンダードの微生物学法を用いてMRSA陽性またはMRSA陰性として類別された臨床検体(すなわち、鼻腔スワブ)を検討した。
本明細書で説明される方法に加えて、本発明は、本明細書で説明される方法を実施するのに必要とされる1種または複数種の試薬を含むキットにも関する。本発明を実施するのに用いられる各種の成分を含むキットは、核酸標的分子の増幅を必要とする任意の手順において用いられるように構成することができ、このようなキットは、各種の異なる末端使用者向けにカスタマイズすることができる。本発明のキットは、本発明による核酸増幅を実行するのに必要な1つまたは複数の成分を提供する。キットは、1つの特定の標的から核酸を増幅するのに適する試薬を含む場合もあり、複数の標的を増幅するのに適する試薬を含む場合もある。本発明のキットは、単一の試料中における1つまたは複数の核酸標的のリアルタイムでの検出のための試薬、例えば、上記で説明したステムループ構造を有する1種または複数種の自己ハイブリダイジングプローブをさらに提供しうる。キットは、バイアル、試験管、ウェルなど、1つまたは複数の容器を厳重な密封下で封入するように区分されうる携帯袋を含みうる。少なくとも1つのこのような容器は、本発明の増幅法を実施するのに必要な1種もしくは複数種の成分または成分の混合物を含有する。
密接な類縁生物の存在下におけるMRSAおよびMSSAの検出
検査に用いられる細菌標的を含有する試料は、以下の通りに調製した。Stuart培地を含有する付属の試験管内に無菌のBBL CULTURE SWABS(Becton,Dickinson および Company社製)を挿入し、室温で少なくとも6時間にわたり静置し、バッチ回収条件をシミュレートした。10mMトリス(pH8.0)および1mM EDTAからなる250μlの試料緩衝液を含有する1.7ml Eppendorf社製反応試験管内に、個々のスワブを移した。スワブアプリケーターハンドルの過剰長部分を除去して、反応試験管内にスワブを収めた。その後、試験管に施栓し、30秒間にわたりボルテックスした。ボルテックスの直後にスワブを取り出した。次に、2本の1.7ml Eppendorf社製反応試験管各々に残りの試料緩衝液80μlを移した。次に、3つの異なる負荷条件の1つに応じて、公知量の細菌を含有する20μlのアリコートを多連試験管に受け入れた。これらの条件は、(a)160コロニー形成単位(CFU)のMRSA細菌、ならびに各々100,000CFUずつの表皮ブドウ球菌およびS.haemolyticus、(b)160CFUのMRSA細菌および100,000CFUのS.aureus(MSSA菌)、ならびに(c)160CFUのMSSA菌、ならびに各々100,000CFUずつの表皮ブドウ球菌およびS.haemolyticusであった。次いで、5,000コピーの内部対照DNAを含有する100μlの溶解緩衝液アリコートを各試験管に受け入れた。試験管を1〜2秒間にわたりボルテックスし、10分間にわたり室温で静置した。次いで、1M HEPES(pH6.5)により作製された40μlの標的捕捉試薬(TCR)アリコートと、500μg/mlのオリゴ(dT)磁気ビーズ(インディアナ州、インディアナポリス、Seradyn社製)と、配列番号21の3’遮断非特異的標的捕捉オリゴヌクレオチド200pmol/mlとを各試験管に受け入れた。短時間にわたるボルテキシングの後、200μlの混合物アリコートを96ウェルKF200プレート(マサチューセッツ州、ウォルサム、Thermo Fisher Scientific社製)のウェル内に移し、その後の処理を行った。これをプレート1と名付けた。
MRSA陰性臨床試料に対するリアルタイム解析
基本的に実施例1の下で説明した通りに、MRSAに対して陰性の鼻腔スワブ試料55例を多重リアルタイム増幅システムにおいて検査し、S.aureus標的核酸およびmecA標的核酸の存在または不在について判定を行った。MXPRO QPCRリアルタイム解析ソフトウェア(カリフォルニア州、ラホーヤ、Stratagene社製)を用いて、リアルタイムの反応曲線を解析し、閾値蛍光値の達成に基づき増幅指標を決定した。Ct値を決定したら、該値を平均し、ΔCt値の計算に用いた。
MRSA陽性臨床試料に対するリアルタイム解析
基本的に実施例1の下で説明した通りに、MRSAに対して陽性の鼻腔スワブ試料50例を多重リアルタイム増幅システムにおいて検査し、S.aureus標的核酸およびmecA標的核酸の存在または不在について判定を行った。反応は、2連または3連で実施した。前出の実施例下で説明した通りに、増幅指標(すなわち、Ct値)を決定した。Ct値を決定したら、該値を平均し、ΔCt値の計算に用いた。
偽陽性結果を最小化する任意閾値の選択
実施例2〜3から集めた結果を図7にプロットして、S.aureus標的核酸とmecA標的核酸とを含有する臨床試料を用いて得られる結果の分布に対するΔCt値を視覚化した。一般的に述べると、プロットされたデータには、微生物学的検査によりMRSA陽性と確認された複数例の臨床試料に由来する結果のほか、複数の偽陽性結果も含まれた。偽陽性結果は、MSSAとMR−CoNSとの重感染を表わす臨床試料に起因する可能性が高かった。図7中の2枚のパネルにより示される場合、プロットには実施例3において解析された47例の陽性試料に由来するΔCt値が含まれた。特に、該実施例において検査された50例の鼻腔スワブ試料のうち、3例は真の陰性であることが分かり、このため図7から除外された。また、プロットには、表10にまとめた、実施例2に由来する7例の偽陽性結果も含まれる。これらの結果は、55例のMRSA陰性臨床試料の解析後に得られた。図7Aは、MRSA陽性試料を100%適正な形で検出した結果のプロットコレクションを示す。当然ながら、この結果のコレクションには、S.aureus以外のメチシリン耐性菌と組み合わせたMSSAを含む重感染から生じる7例の偽陽性結果が含まれたであろう。図7Bは同一の結果についてのプロットを示すが、試料をMRSA陽性として指摘する任意閾値を表わす水平線をさらに含む。この場合、該閾値の上方にあるデータ点は、MRSA陽性として分類することができる。当然ながら、該閾値の値は、閾値ベースの判定により組み入れられる真のMRSA陽性数と偽陽性数との間の望ましい均衡を達成するように選択することができる。図7Bに示される通り、−2分間に任意閾値を確立し、この値を超えるΔCt値がMRSA陽性試料と関連することを指摘することにより、7例の偽陽性から4例が除外される一方で、47例の真の陽性のうち44例が捕捉された。
単回の多重増幅反応に由来する結果を用いるMRSAおよびMSSAの存在についての評価
閾値ベースの基準を用いると偽陽性MRSA判定の数をどの程度減少させうるかについて示したので、本発明者らは、検査試料がMSSA核酸を含有するかどうかを決定する方法を包含するように、該手法を拡張した。表12には、S.aureus特異的標的核酸配列(例えば、23S rDNA配列)およびメチシリン耐性マーカー(例えば、mecA配列)を増幅および検出するリアルタイムのプロトコールを用いて検査しうる各種の個別の細菌標的核酸(第1〜4行)および2種の細菌核酸の組合せ(第5〜10行)が記載される。該表の第2列および第3列は、任意の許容基準を用いて決定されるS.aureus標的およびmecA標的の存在(すなわち、「(+)」)または不在(すなわち「(−)」)を示す予測の定性的結果を示す。この目的に有用な例示的許容基準は、実施例1の下に上記で与えられている。第4列は、S.aureus標的配列およびmecA標的配列に対する増幅指標を用いてΔCt値を計算する任意閾値ベースの基準に対する結果を示す。この列において、「NA」は、ΔCt関係を計算するのに用いられる必要な2つの増幅指標を欠いているために該基準が適用できないことを示す。「<」および「≧」の符号はそれぞれ、ΔCt値が任意の閾値カットオフ「未満」およびこれ「以上」であることを示す。この例示において、任意の閾値カットオフは、図7Bに示される通り、−2分間に設定された。第5列および第6列はそれぞれ、先行する3列において見られる情報に基づくMSSA判定およびMRSA判定を示す。これらのカラムにおいて、「陽性」とは生物が存在すると判定されることを示し、「陰性」とは生物が不在であると判定されることを示す。表12中の項目についての詳細な説明を以下で行う。特に、表12はまた、リアルタイムの結果を解読または解釈するための「参照表」としても用いることができる。
臨床試料の広範な検査によりΔCt範囲の有用性が裏付けられる
387例の臨床鼻腔スワブ試料を処理して、核酸検査および標準的な微生物学的検査のためのアリコートを供給した。より具体的に述べると、まず試料スワブを10mMトリス(pH8.0)および1mM EDTAからなる試料緩衝液のアリコートと組み合わせ、次いで、ボルテックスして付着物質を放出させた。後続の核酸検査のために液相を単離した後、スワブにより寒天プレートのコレクション上に画線を引いて、これにより、S.aureus、MRSA、およびコアグラーゼ陰性Staphylococcusを同定した。この微生物学的検査に由来する結果を用いて、該臨床試料を、(1)MR−CoNSのみ、(2)MRSAおよびMR−CoNSの混合物、(3)MRSAのみ、(4)MSSA、(5)MSSAおよびMR−CoNSによる重感染、ならびに(6)陰性試料の6つの類型の1つであると判定した。
Claims (4)
- 2つの増幅配列の存在によりMRSAを同定する核酸共増幅アッセイにおける偽陽性MRSA判定の発生率を低減する方法であって、
(a)MRSAの存在について試験される臨床試料からゲノムDNAを取得するステップであり、この結果、S.aureus核酸およびメチシリン耐性をコードする核酸の混合物がもたらされるステップであって、該臨床試料は鼻腔のスワブ試料を含む、ステップと、
(b)ステップ(a)で取得された前記ゲノムDNAを鋳型として用いて実施されるin vitroの核酸増幅反応で、S.aureus特異的標的配列およびメチシリン耐性マーカーを共増幅するステップであって、該S.aureus特異的標的配列は、S.aureus特異的リボソーム核酸配列を含み、そして該メチシリン耐性マーカーはmecA標的配列を含む、ステップと、
(c)ステップ(b)で共増幅された前記S.aureus特異的標的配列および前記メチシリン耐性マーカーに対して、核酸増幅反応における所定レベルの進行を示すリアルタイムの反応曲線のCt値を決定するステップと、
(d)ステップ(c)で決定された前記リアルタイムの反応曲線のCt値の両方の関数であるΔCtの数値を計算するステップであって、該ΔCtの数値は、ステップ(c)で決定されたリアルタイムの反応曲線のCt値の間の差として計算される、ステップと、
(e)ステップ(d)で計算された前記ΔCtの数値を、MRSAを同定する閾値基準と比較するステップであり、MSSA菌およびMR−CoNS細菌の混合物は含むがMRSA細菌は含まない臨床試料を示すΔCtの数値の部分集合を、前記閾値基準により除外するステップと、
(f)前記閾値基準が満たされる場合に限り前記臨床試料中にMRSAが存在することを判定するステップであり、これにより、偽陽性MRSA判定の発生率が低下するステップと
を含む方法。 - ステップ(d)で計算される前記ΔCtの数値が、上限閾値カットオフ値から下限閾値カットオフ値にわたる範囲内にあることを、ステップ(e)の前記閾値基準が必要とする、請求項1に記載の方法。
- 前記ΔCtの数値が、経験的に決定される上限閾値カットオフ値から経験的に決定される下限閾値カットオフ値にわたるΔCt範囲内にあることを、ステップ(e)の前記閾値基準が必要とする、請求項1に記載の方法。
- 前記メチシリン耐性マーカーがmecA標的配列を含み、
ステップ(d)の前記ΔCtの数値が、S.aureus特異的標的配列に対して決定されたリアルタイムの反応曲線のCt値から、mecA標的配列に対して決定されたリアルタイムの反応曲線のCt値を減じることにより計算され、
前記ΔCtの数値が、経験的に決定された閾値カットオフ値よりも大きいことを、ステップ(e)の前記閾値基準が必要とする、
請求項1に記載の方法。
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