BR112014024888B1

BR112014024888B1 - Composição e método para detectar staphylococcus aureus resistente à meticilina (sarm)

Info

Publication number: BR112014024888B1
Application number: BR112014024888-5A
Authority: BR
Inventors: Christian Menard; Celine Roger-Dalbert
Original assignee: Geneohm Sciences Canada, Inc
Priority date: 2012-04-06
Filing date: 2013-03-14
Publication date: 2023-05-16
Also published as: CA2869362A1; JP2021090445A; IN2014DN09199A; CN104364395B; EP3936620A1; JP2015513907A; JP2023154068A; WO2013150376A1; JP2018068315A; BR112014024888A2; ES2869285T3; RU2716210C2; CN104364395A; JP7334199B2; EP2834375A4; US20150232919A1; AU2019200071A1; CN108424972B; JP7272744B2; US20220170079A1

Abstract

COMPOSIÇÃO E MÉTODO PARA DETECTAR STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTE A METICILINA (SARM). São fornecidos neste documento composições e métodos para a detecção e identificação de cepas de Staphylococcus aureus abrigando sequências de extremidade direita SCCmec polimófica (MREP) de tipo xxi.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO REFERÊNCIA A LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS, TABELA OU LISTAGEM DE PROGRAMA DE COMPUTADOR

[0001] O presente Pedido está sendo depositado juntamente com uma Listagem de Sequência em formato eletrônico. A Listagem de Sequência é fornecida como um arquivo intitulado GENOM.114A.txt, salvo pela última vez em 14 de março de 2013, que tem 85,6 kb de tamanho. A informação é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo

[0002] As realizações reveladas neste documento referem-se a ferramentas de diagnóstico molecular para a detecção de Staphylococcus aureus resistente à meticilina.

Técnica Relacionada

[0003] A espécie coagulase positiva de Staphylococcus aureus (S. aureus) é bem documentada como um patógeno oportunista humano (Murray et al. Eds, 1999, Manual of Clinical Microbiology, 7a ed., ASM Press, Washington, D.C.). Infecções nosocomiais causadas por S. aureus são a principal causa de morbidade e mortalidade. Algumas das mais comuns infecções causadas por S. aureus envolvem a pele e elas incluem furúnculos ou erupções, celulite, impetigo e infecções em feridas pós-operatórias em vários locais. Algumas das mais sérias infecções produzidas por S. aureus são bacteremia, pneumonia, osteomielite, endocardite aguda, miocardite, pericardite, cerebrite, meningite, síndrome da pele escaldada e vários abscessos. Intoxicação alimentar mediada por enterotoxinas estafilocócicas é outra síndrome importante associada com S. aureus. Síndrome de choque tóxico, uma doença adquirida na comunidade, também foi atribuída a infecção ou colonização com S. aureus toxigênica.

[0004] O S. aureus resistente a meticilina (SARM) emergiu nos anos 1980 como um principal problema clínico e epidemiológico em hospitais (Oliveira et al., (2002) Lancet Infect Dis. 2:180-9). SARM são resistentes a todos os β-lactamos incluindo penicilinas, cefalosporinas, carbapenemas e monobactamos, que são os antibióticos mais comumente usados para curar infecções S. aureus.

[0005] As infecções de SARM podem apenas ser tratadas com antibióticos tóxicos e mais caros, que são normalmente usados com a última linha de defesa. Uma vez que SARM pode se espalhar facilmente de paciente para paciente por meio pessoal, os hospitais pelo mundo são confrontados com o problema de controle de SARM.

[0006] Há não muito tempo, o único modo de saber a resistência de uma cepa era realizar um teste de suscetibilidade antimicrobiana. O teste de suscetibilidade antimicrobiana sofre de muitas desvantagens, incluindo o tempo extensivo (pelo menos 48 horas) antes dos resultados estarem disponíveis, uma falta de reprodutibilidade, uma falta de padronização do processo e erros do usuário. Consequentemente, há uma necessidade de se desenvolver testes de triagem ou diagnósticos rápidos e simples para detecção e/ou identificação de SARM para reduzir sua disseminação e melhorar o diagnóstico e tratamento de pacientes infectados.

[0007] Há uma necessidade de composições e métodos para detecção rápida e sensível de SARM.

SUMÁRIO

[0008] As realizações reveladas neste documento são baseadas, em parte, na constatação de que certas cepas do Staphylococcus aureus, incluindo aquelas que abrigam um gene homólogo mecA, mecALGA251, compartilham a mesma sequência localizada na extremidade direita da região SCCmec dos ácidos nucleicos do SARM, isto é, a junção da extremidade direita polimórfica. São fornecidos neste documento métodos e composições que podem ser usados para detectar aquelas cepas de SARM, que eram até então indetectáveis através de ensaios baseados moleculares comerciais convencionais. Também são fornecidos neste documento composições e métodos que permitem detecção adicional (por exemplo, ou simultânea ou sequencial) de Staphylococcus aureus geralmente, e/ou detecção adicional de mecA e/ou mecALGA251, além de cepas de SARM.

[0009] Consequentemente, são fornecidos neste documento métodos e composições para a detecção de SARM que abrigam uma sequência MREJ do tipo xxi. Algumas realizações fornecem uma composição para a detecção de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (SARM) tendo ácidos nucleicos de MREJ do tipo xxi. O SARM pode incluir um elemento de cromossomo cassete estafilocócico mec (SCCmec) incluindo um homólogo a mecA (mecALGA251, ou mecC), em que o cassete SCCmec é inserido no DNA cromossômico do S. aureus, gerando, assim, uma sequência de junção da extremidade direita polimórfica (MREJ) do tipo xxi, que compreende sequências polimórficas da extremidade direita e DNA cromossômico contíguo à extremidade direita polimórfica. A composição pode incluir um primeiro iniciador de amplificação que tem entre 10 e 45 nucleotídeos de comprimento e que hibridiza especificamente sob condições de PCR padrões às sequências da extremidade direita polimórfica dos ácidos nucleicos de MREJ do tipo xxi. Em algumas realizações, o primeiro iniciador de amplificação hibridiza especificamente para a sequência de ácido nucleico de SEQ ID N°: 1 ou o complemento da mesma sob ditas condições de PCR padrões.

[0010] As composições reveladas neste documento podem ainda incluir um segundo iniciador de amplificação de entre 10 e 45 nucleotídeos de comprimento, que hibridiza especificamente sob condições de PCR padrões para sequências cromossômicas de S. aureus localizadas dentro de 1 quilobase do ponto de inserção do elemento SCCmec para dentro do DNA cromossômico. Preferencialmente, os primeiro e segundo iniciadores de amplificação juntos geram um amplicon da junção de extremidade direita dos ácidos nucleicos MREJ do tipo xxi. Consequentemente, em algumas realizações, o segundo iniciador de amplificação especificamente hibridiza sob condições de PCR padrões para orfX. As composições reveladas neste documento podem ainda incluir uma sonda, por exemplo, uma sonda de oligonucleotídeo compreende um segmento emissor de fluorescência e um segmento silenciador de fluorescência, que hibridiza especificamente para o amplicon dos ácidos nucleicos MREJ do tipo xxi sob as condições de PCR padrões.

[0011] As composições reveladas neste documento podem incluir um ou mais iniciadores de amplificação adicionais com entre 10 e 45 nucleotídeos de comprimento, que hibridizam especificamente para uma ou mais sequências de extremidade direita SCCmec de um SARM com MREJ do tipo i a xx, isto é, para uma ou mais sequências de extremidade direita SCCmec polimórficas selecionadas do grupo consistindo das SEQ ID Nos: 5 a 29.

[0012] Os métodos e composições podem também incluir oligonucleotídeos adicionais, isto é, que são configurados para amplificar especificamente sequências mecA e/ou mecALGA251/mecC, e/ou que são configuradas para amplificar especificamente sequências específicas do Staphylococcus aureus.

[0013] Consequentemente, algumas realizações fornecem composições em que o primeiro iniciador de amplificação é pelo menos 80% idêntico à SEQ ID N°: 2. Em algumas realizações, as composições, as composições podem incluir um segundo iniciador de amplificação que é pelo menos 80% idêntico à SEQ ID N°: 3. Em algumas realizações, a composição pode incluir uma sonda, em que a sonda é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID N°: 4 ou 82.

[0014] Em algumas modalidades, as composições reveladas neste documento são fornecidas em forma seca, por exemplo, liofilizadas ou semelhante.

[0015] São também fornecidos neste documento métodos para a detecção de Staphylococcus aureus (SARM) compreendendo ácidos nucleicos de MREJ do tipo xxi e para a detecção de ácidos nucleicos de MREJ do tipo xxi, em que o S. aureus inclui um elemento de cromossomo cassete estafilocócico mec (SCCmec) incluindo um homólogo a mecA (mecALGA251 ou mecC). O cassete SCCmec pode ser inserido no DNA cromossômico de S. aureus, gerando, assim, uma sequência de junção de extremidade direita polimórfica (MREJ) do tipo xxi, que compreende sequências polimórficas da extremidade direita (sequências de MREP) e DNA cromossômico contíguo à extremidade direita polimórfica. Consequente, em algumas realizações, os métodos podem incluir as etapas de fornecimento de uma amostra de teste; o contato da amostra com um primeiro iniciador de amplificação com entre 10 e 45 nucleotídeos de comprimento, que hibridiza especificamente sob condições de PCR padrões para as sequências de extremidade direita polimórficas da sequência de MREJ do tipo xxi; em que o contato é realizado sob condições em que um amplicon da junção de extremidade direita mec dos ácidos nucleicos de MREJ do tipo xxi é gerado se S. aureus compreendendo ácidos nucleicos de MREJ do tipo xxi estão presentes na amostra. O método pode também incluir a etapa de determinação de se um amplicon dos ácidos nucleicos de MREJ do tipo xxi é gerado seguindo à etapa de contato. Em algumas realizações, o primeiro iniciador de amplificação especificamente hibridiza para a sequência de ácido nucleico de SEQ ID N°: 1, sob ditas condições de PCR padrões.

[0016] Em algumas realizações, o método pode incluir o contato da amostra com um segundo iniciador de amplificação com entre 10 e 45 nucleotídeos de comprimento, que hibridiza sob condições de PCR padrões para o gene orfX de S. aureus, em que ditos primeiro e segundo iniciadores de amplificação juntos geram um amplicon da sequência da região de junção da extremidade direita (MREJ) SCCmec da junção de extremidade direita SCCmec do SARM sobre as condições de PCR padrões na presença de ácidos nucleicos de MREJ do tipo xxi.

[0017] O método da Reivindicação 15 compreende ainda o contato da amostra com uma sonda, em que dita sonda especificamente hibridiza para o amplicon da sequência da região de junção da extremidade direita (MREJ) SCCmec dos ácidos nucleicos de MREJ do tipo xxi, sob condições de PCR padrões. Em algumas realizações, a sonda inclui um segmento emissor de fluorescência e um segmento silenciador de fluorescência.

[0018] Em algumas realizações, a etapa de contato também inclui o contato da amostra com um ou mais iniciadores de amplificação adicionais, em que ditos um ou mais iniciadores de amplificação adicionais tem entre 10 e 45 nucleotídeos de comprimento que especificamente hibridizam para uma ou sequência de extremidade direita SCCmec polimórfica de um SARM de MREJ do tipo i a xx. Em algumas realizações, a etapa de contato também inclui o contato da amostra com um ou mais iniciadores de amplificação adicionais com entre 10 e 45 nucleotídeos de comprimento, que hibridizam especificamente para e são configurados para gerar um amplicon de sequências mecA, sequências mecC e/ou sequências específicas de Staphylococcus aureus. Exemplos não limitadores de sequências específicas de S. aureus incluem, mas sem limitação, sequências nuc, sequências de rRNA, sequências femB, sequências Sa442 e semelhantes. O técnico com conhecimento considerará facilmente, porém, que qualquer sequência que seja única para o Staphylococcus aureus pode ser usada nas realizações descritas neste documento.

[0019] Consequentemente, a etapa de contato dos métodos descritos neste documento pode incluir a realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico, tal como PCR, amplificação de deslocamento de filamento (SDA), por exemplo, amplificação de deslocamento múltiplo (MDA), amplificação isotérmica mediada por circuito (LAMP), reação em cadeia de ligase (LCR), imunoamplificação, amplificação baseada em sequência de ácido nucleico (NASBA), replicação de sequência autossustentável (3SR) ou amplificação por círculo rolante. Em algumas realizações preferidas, o método inclui a realização de PCR multiplex. Em algumas realizações preferidas, o método inclui a realização de PCR em tempo real.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0020] A FIG. 1 mostra a sequência de uma região de MREJ do tipo xxi. São também mostradas as localizações dos vários iniciadores e sondas revelados na realização descrita neste documento.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0021] Deve ser entendido que tanto a descrição geral acima, quanto a descrição detalhada a seguir são exemplificativas e explicativas apenas e não se destinam a limitar o escopo dos ensinamentos correntes. Neste pedido, o uso do singular inclui o plural, a menos que especificamente determinado de outro modo. Além disso, o uso de “compreende”, “contém” e “inclui” ou modificações destas palavras raízes, por exemplo, mas, sem limitação “compreendem”, “contido” e “incluindo” não se destinam a serem limitadoras. O uso de “ou” significa “e/ou”, a menos que de outra forma determinado. O termo “e/ou” significa que os termos antes e depois podem ser tomados juntos ou separadamente. Para fins ilustrativos, mas não como uma limitação, “X e/ou Y” pode significar “X” ou “Y” ou “X e Y”.

[0022] Sempre que uma faixa de valores for fornecida neste documento, a faixa se destina a incluir o valor inicial e o valor final e qualquer valor ou faixa de valores entre os mesmos a menos que de outro modo especificamente determinado. Por exemplo, “de 0,2 a 0,5” significa 0,2, 0,3, 0,4, 0,5; faixas entre os mesmos, tais como 0,2-0,3, 0,3-0,4, 0,2-0,4; incrementos entre os mesmos, tais como 0,25, 0,35, 0,225, 0,335, 0,49; faixas de incremento entre os mesmos, tais como 0,26-0,39; e semelhantes.

[0023] Os títulos de seções usados neste documento são para fins organizacionais apenas e devem ser interpretados como limitadores da matéria descrita de qualquer forma. Toda a literatura e materiais similares citados neste pedido incluindo, mas, sem limitação, patentes, pedidos de patente, artigos, livros, tratados e páginas da internet, independentemente do formado de tal literatura e materiais similares, são expressamente incorporados por referência em sua totalidade para qualquer fim. No caso de um ou mais da literatura e materiais similares incorporados definir ou usar um termo de tal forma que contradiga a definição do termo neste pedido, esse pedido controla. Enquanto os presentes ensinamentos são descritos em conjunção com várias realizações, não se pretende que os presentes ensinamentos sejam limitados a tais realizações. Pelo contrário, os presentes ensinamentos englobam várias alternativas, modificações e equivalentes, como era tido em consideração por aqueles de conhecimento na técnica.

[0024] São fornecidas neste documento composições e métodos para a detecção melhorada de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (SARM), e, em particular, métodos de detecção de S. aureus abrigando gene homólogo mecA, tal como uma cepa de S. aureus CC130 ou cc130. A resistência à meticilina em Staphylococcus aureus é devido ao produto genético do gene mecA, codificando a proteína ligadora de penincilina 2a (PBP-2a), uma transpeptidase resistente a β-lactamo. mecA está ausente de S. aureus sensível à meticilina, mas é amplamente distribuída entre outras espécies de estafilococos, incluindo estafilococos coagulase negativa (CoNS), tais como Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus capitis, S. saprophyticus S.lentus, S. hominus, S. cohnii, S. delphini, S. xylosus, S. muscae, S. schleiferi, S. coagulans e outros. O gene mecA é altamente conservado (Ubukata et al., 1990, Antimicrob. Agents Chemother. 34:170-172). Em estafilococos resistentes à meticilina, mecA está presente em um elemento genético chamado cromossomo cassete estafilocócico mec (SCCmec), que é inserido no cromossomo de estafilococos.

[0025] Os cassetes SCCmec variam de 20kb a mais de 60kb de comprimento e incluem genes para recombinase sítio-específica e elementos transponíveis, além do gene mecA. Cassetes SCCmec são inseridos em uma localização fixa, chamada “attBscc” dentro do DNA cromossômico de Staphylococcus aureus e que está localizada na extremidade 3’ de um quadro de leitura aberta chamado “orfX”. Huletsky et al. (2004) J. Clin. Microbiol. 42(5):1875:1884. As cepas de SARM foram classificadas com base na organização dos cassetes SCCmec (chamados “tipagem SCCmec”). SCCmecs diferentes foram classificados de acordo com seus genes de recombinase e a organização genética de genes mecI e mecR, que são reguladores de mecA.

[0026] Muitos ensaios moleculares para a detecção e identificação de SARM envolvem a detecção do gene mecA. Uma vez que mecA é também encontrado em CoNS, porém, a detecção apenas de mecA não é suficiente para determinar a presença de SARM, uma vez que CoNS resistente à meticilina também testará positivo. A fim de abordar esse problema, os ensaios foram desenvolvidos, em que genes específicos para S. aureus são detectados, além de mecA. Ver Schuenck et al., Res. Microbiol, (2006), in press, Shittu et al., (2006), Diagn Microbiol Infect Dis. 17 de julho, Grisold et al., (2006), Methods Mol. Biol. 345:79-89, Costa et al., (2005), Diag. Microbiol, and Infect. Dis, 51:13-17, Mc Donald et al., (2005), J. Clin. Microbiol, 43:6147-6149, Zhang et al., (2005), J. Clin. Microbiol. 43:5026-5033, Hagen et al., (2005), Int J Med Microbiol. 29577-86, Maes, et al., (2002) J. Clin. Microbiol. 40:1514 1517, Saito et al., (1995) J. Clin. Microbiol. 33:2498-2500; Ubukata et al., (1992) J. Clin. Microbiol. 30:1728-1733; Murakami et al., (1991) J. Clin. Microbiol. 29:2240-2244; Hiramatsu et al., (1992) Microbiol. Immunol. 36:445-453). Ademais, Levi e Towner (2003), J. Clin. Microbiol, 41:3890-3892 e Poulsen et al. (2003), J Antimicrob Chemother., 51:419421 descrevem a detecção de resistência à meticilina em Staphylococci coagulase negativos e em S. aureus usando o kit para detecção de SARM EVIGENE™.

[0027] Entretanto, porque o gene mecA é amplamente distribuído tanto em S. aureus quanto em estafilococos coagulase negativos, cada um dos métodos descritos acima é incapaz de discriminar entre as amostras contendo tanto S. aureus sensível à meticilina (“MSSA”), quanto estafilococos coagulase negativos resistentes à meticilina e amostras que contenham apenas SARM ou que tenham tanto S. aureus sensível à meticilina quanto SARM.

[0028] Para abordar esse problema, Hiramatsu et al. desenvolveram um ensaio baseado em PCR específico para SARM, que utiliza iniciadores que hibridizam para as extremidades direitas de DNA de SCCmec dos tipos I-III em combinação com iniciadores específicos para o cromossomo de S. aureus, que correspondem à sequência de nucleotídeo no lado direito do sítio de integração de SCCmec. (Patente US 6.156.507, doravante a “patente 507”). Mais recentemente, Zhang et al. (2005), J. Clin. Microbiol. 43:5026-5033, descreve um ensaio multiplex para subtipagem de SARM de SCCmec dos tipos I a V. As sequências de nucleotídeos envolvendo o sítio de integração de SCCmec em outras espécies estafilocócicas (por exemplo, S. epidermidis e S. haemolyticus) são diferentes daquelas encontradas em S. aureus, portanto, ensaios PCR multiplex que utilizam oligonucleotídeos que hibridizam para as extremidades direitas do SCCmec e o cromossomo S. aureus têm a vantagem de serem específicos para a detecção de SARM.

[0029] O ensaio de PCR descrito na patente ‘507 também levou ao desenvolvimento da “tipagem MREP” (mec right extremity polimorphism) de DNA SCCmec (Ito et al., (2001) Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-1336; Hitamatsu et al., (1996) J. Infect. Chemother. 2:117- 129). O método de tipagem MREP leva vantagem no fato de que as sequências de nucleotídeos dos três tipos de MREP diferem na extremidade direita dos DNAs SCCmec adjacentes ao sítio de integração dentre os três tipos de SCCmec.

[0030] O termo “MREJ” se refere à junção de extremidade direita mec <<mec right extremity junction>>. As sequências de ácido nucleico da região de MREJ tem aproximadamente 1 quilobase (kb) de comprimento e incluem sequências da extremidade direita do SCCmec, bem como DNA cromossômico bacteriano à direita do sítio de integração de SCCmec. As cepas que foram classificdas como MREP dos tipos i-iii correspondem a MREJ dos tipos i-iii. MREJ dos tipos iv a xx foram anteriormente caracterizadas Huletsky et al. (2004), J. Clin. Microbiol. 42:1875-1884; Pedido de Patente Internacional PCT/CA02/00824, Pedido de Patente Estados Unidos 2008/0227087.

[0031] Recentemente, Garcia-Alvarez et al. relatou cepas bacterianas que foram confirmadas por análise de RNA ribossômico como sendo S. aureus e que apresentaram resistência à meticilina, usando teste de suscetibilidade a antibiótico de rotina. Garcia-Alvarez et al. (2011) Lancet 11:595-603. Surpreendentemente, contudo, estas cepas testaram negativo como SARM usando os ensaios descritos acima, que confiam na detecção de mecA ou na detecção de regiões de MREJ conhecidas. A especificidade de ensaio é limitada para identificar as regiões de MREJ. Garcia-Alvarez et al. demonstraram que as cepas abrigavam um homólogo de mecA inovador, que compartilhava homologia limitada com genes mecA conhecidos, isto é, 63% de identidade no nível de aminoácido e 70% de identidade no nível de DNA, explicando a incapacidade dos ensaios confiarem na detecção do gene mecA para detectar estes SARM. O homólogo a mecA foi chamado mecALGA251, também conhecido aqui como mecC. Como os ensaios utilizando amplificação de MREJ foram também incapazes de detectar qualquer das cepas de SARM com mecALGA251, as cepas de SARM com mecALGA251, seriam incorretamente identificadas como falso negativo. Esse erro no diagnóstico e identificação de SARM poderia ter sério impacto no resultado de saúde do paciente.

[0032] Diversas cepas de S. aureus que testaram positivo como resistentes à meticilina usando teste de suscetibilidade a antibiótico padrão, ainda que não tenham sido detectadas como SARM usando ensaios moleculares comerciais convencionais, foram adicionalmente analisadas. As cepas estão listadas na Tabela 1, abaixo. TABELA 1

[0033] Como descrito neste documento, a presente revelação é baseada, em parte, na descoberta surpreendente de que a grande maioria de cepas de SARM analisadas que abrigam o gene homólogo a mecA, mecALGA251/mecC, compartilham a mesma sequência de MREJ. Com base nesta descoberta surpreendente, composições e métodos para a detecção melhorada de SARM são fornecidos neste documento. As composições e métodos revelados neste documento permitem vantajosamente detecção e identificação confiável e rápida de cepas de SARM mecALGA251.

Oligonucleotídeos

[0034] De acordo com algumas realizações reveladas neste documento, os oligonucleotídeos são fornecidos, por exemplo, iniciadores de amplificação e/ou sondas específicas para sequência. Como usado neste documento, os termos “iniciador” e “sonda” incluem, mas, sem limitação oligonucleotídeos. Preferencialmente, os iniciadores e/ou sondas oligonucleotídeos neste documento podem ter entre 8 e 45 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, os iniciadores e/ou sondas podem ter pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, ou mais nucleotídeos de comprimento. Iniciadores e/ou sondas podem ser fornecidas em qualquer forma apropriada, incluindo ligados a um suporte sólido, líquido e liofilizado, por exemplo. As sequências de iniciador e sonda reveladas neste documento podem ser modificadas para conter nucleotídeos adicionais nas terminações 5’ ou 3’, ou em ambas. O técnico de conhecimento considerará, contudo, que bases adicionais à terminação 3’ de iniciadores de amplificação (não necessariamente sondas) são geralmente complementares à sequência modelo. O iniciador e sequências de sonda reveladas neste documento podem também ser modificadas para remover nucleotídeos nas terminações 5’ ou 3’. O técnico com conhecimento considerará que, a fim de funcionar para amplificação, os iniciadores ou sondas serão de um comprimento mínimo e temperatura de hibridação, como revelado neste documento.

[0035] Os iniciadores e sondas de oligonucleotídeos podem se ligar a seus alvos em uma temperatura de hibridação, que é uma temperatura menos do que a temperatura de fusão (Tm). Como usado neste documento, “Tm” e “temperatura de fusão” são termos intercambiáveis, que se referem à temperatura em que 50% de uma população de moléculas de polinucleotídeo de filamento duplo se tornam dissociadas em filamentos únicos. As fórmulas para o cálculo da Tm de polinucleotídeos são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, a Tm pode ser calculada pela seguinte equação: Tm=69,3+0,41x.(G+C)%- 6-50/L, em que L é o comprimento da sonda em nucleotídeos. A Tm de um polinucleotídeo híbrido pode também ser estimada usando a fórmula adotada dos ensaios de hibridização em sal 1M e comumente usada para calcular Tm para iniciadores de PCR: [(número de A+T) x 2 °C +(número de G+C) x 4 °C]. Ver, por exemplo, C. R. Newton et al. PCR, 2a ed., Springer-Verlag (New York: 1997), p. 24. Outras computações sofisticadas existem na técnica, que levam características estruturas, bem como de sequência em consideração para o cálculo de Tm. A temperatura de fusão de um oligonucleotídeo pode depender em complementaridade entre o iniciador ou sonda de oligonucleotídeo e a sequência ligadora e em condições salinas. Em algumas realizações, um iniciador ou sonda de oligonucleotídeo fornecido neste documento tem uma Tm de menos do que cerca de 90 °C em tampão KCl 50mM, Tris- HCl 10 mM, por exemplo, cerca de 89 °C, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39°C ou menos, incluindo faixas entre quaisquer dois dos valores listados.

[0036] Como discutido em maiores detalhes abaixo, em algumas realizações, os iniciadores revelados neste documento, por exemplo, iniciadores de amplificação, podem ser fornecidos como um par de iniciador de amplificação, por exemplo, compreendendo um iniciador forward e um iniciador reverse (primeiro iniciador de amplificação e segundo iniciador de amplificação). Preferencialmente, os iniciadores forward e reverse têm Tms que não diferem em mais do que 10 °C, por exemplo, que diferem em menos do que 10 °C, menos do que 9 °C, menos do que 8 °C, menos do que 7 °C, menos do que 6 °C, menos do que 5 °C, menos do que 4 °C, menos do que 3 °C, menos do que 2 °C, ou menos do que 1 °C.

[0037] As sequências do iniciador e da sonda podem ser modificadas tendo substituições de nucleotídeo (em relação à sequência-alvo) dentro da sequência de oligonucleotídeo, desde que o oligonucleotídeo contenha complementaridade suficiente para hibridizar especificamente para a sequência de ácido nucleico algo. Desta forma, pelo menos 1, 2, 3, 4, ou até cerca de 5 nucleotídeos podem ser substituídos. Como usado neste documento, o termo “complementar” se refere à sequência complementar entre regiões de dois filamentos de polinucleotídeo ou entre duas regiões do mesmo filamento de polinucleotídeo. Uma primeira região de um polinucleotídeo é complementar a uma segunda região do mesmo polinucleotídeo ou de um polinucleotídeo diferente, se, quando as duas regiões estão arranjadas de uma forma antiparalela, pelo menos um nucleotídeo da primeira região é capaz de parear a base com uma base da segunda região. Portanto, não é requerido que dois polinucleotídeos complementares partem a base em toda posição de nucleotídeo. “Totalmente complementar” se refere a um primeiro polinucleotídeo que é 100% ou “totalmente” complementar com um segundo polinucleotídeo e, assim, forma um par de base em toda posição de nucleotídeo. “Parcialmente complementar” também se refere a um primeiro polinucleotídeo que não é 100% complementar (por exemplo, 90% ou 80% ou 70% complementar) e contém nucleotídeos descasados em uma ou mais posições de nucleotídeo. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo inclui uma base universal.

[0038] Como usado neste documento, o termo “hibridização” é usado em referência ao pareamento de filamentos de polinucleotídeos complementares (incluindo parcialmente complementares). A hibridização e a força da hibridização (isto é, a força da associação entre os filamentos de polinucleotídeos) são impactadas por muitos fatores bem conhecidos na técnica, incluindo o grau de complementaridade entre os polinucleotídeos, rigor das condições envolvidas afetadas por tais condições, como a concentração de sais, a temperatura de fusão do híbrido formado, a presença de outros componentes (por exemplo, a presença ou ausência de polietileno glicol), a molaridade dos filamentos hibridizantes e o teor de G:C dos filamentos de polinucleotídeos. Em algumas realizações, por exemplo, realizações fornecendo mais do que um oligonucleotídeo, os oligonucleotídeos são projetados tal que a Tm do oligonucleotídeo está dentro de 2 °C da Tm do outro oligonucleotídeo. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); e Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley- Interscience, New York). Ver Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Como discutido adicionalmente neste documento, o termo “hibridização específica” ou “hibridiza especificamente” se refere aa hibridização de um polinucleotídeo, por exemplo, um iniciador ou sonda de oligonucleotídeo ou semelhante para uma sequência-alvo, tal como uma sequência a ser quantificada em uma amostra, uma sequência de ácido nucleico alvo de controle positivo, ou semelhante e não a sequências não relacionadas, sob condições tipicamente usadas para amplificação de ácido nucleico.

[0039] Em algumas realizações, os iniciadores e/ou sondas incluem oligonucleotídeos que hibridizam para uma sequência de ácido nucleico alvo por todo o comprimento da sequência de oligonucleotídeo. Tais sequências podem ser referidas como “totalmente complementares” com relação uma a outra. Onde um oligonucleotídeo é referido como “substancialmente complementar” em relação a uma sequência de ácido nucleico neste documento, as duas sequências podem ser totalmente complementares, ou elas podem formar incompatibilidades com a hibridização, mas reter a capacidade de hibridizar sob condições rigorosas ou condições de amplificação de ácido nucleico padrões, como discutido abaixo. Como usado neste documento, o termo “substancialmente complementar” se refere à complementaridade entre dois ácidos nucleicos, por exemplo, a região complementar do oligonucleotídeo e a sequência-alvo. A complementaridade não precisa ser perfeita; pode haver qualquer número de incompatibilidades de pares de base que entre os dois ácidos nucleicos. Entretanto, se o número de incompatibilidades é tão grande que nenhuma hibridização pode ocorrer sob mesmo a menos rigorosa das condições de hibridização, a sequência não é uma sequência substancialmente complementar. Quando duas sequências são referidas como “substancialmente complementares” neste documento, significa que as sequências são suficientemente complementares uma à outra para hibridizar sob as condições de reação selecionadas. A relação de complementaridade de ácido nucleico e rigor da hibridização suficiente para alcançar especificidade é bem conhecida na técnica e descrita abaixo em referência à identidade da sequência, temperatura de fusão e condições de hibridização. Portanto, sequências substancialmente complementares podem ser usadas em qualquer dos métodos de detecção revelados neste documento. Tais sondas podem ser, por exemplo, perfeitamente complementares ou podem conter de 1 a muitas incompatibilidades, desde que as condições de hibridização sejam suficientes para permitir, por exemplo, a discriminação entre uma sequência-alvo e uma sequência não alvo. Consequentemente, sequências substancialmente complementares podem se referir a sequências variando em identidade percentual de 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 75, 70 ou menos, ou qualquer número entre eles, comparado à sequência de referência. Por exemplo, os oligonucleotídeos revelados neste documento podem conter 1, 2, 3, 4, 5 ou mais incompatibilidades e/ou bases degeneradas, se comparado à sequência-alvo à qual o oligonucleotídeo hibridiza, com a condição de que os oligonucleotídeos são capazes de hibridizar especificamente para a sequência-alvo sob, por exemplo, condições de amplificação de ácido nucleico padrões.

[0040] Consequentemente, a título de exemplo, o termo “condições de hibridização rigorosas” pode se referir a qualquer uma ou ambas das seguintes: a) 6 x SSC a cerca de 45 °C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2 x SSC, 0,1% SDS a 65 °C e b) NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1mM, 50 °C ou 70 °C por 12-16 horas, seguido por lavagem. Em algumas realizações, o termo “condições rigorosas” pode ser referir a condições de amplificação de ácido nucleico padrão (por exemplo, PCR).

[0041] Em algumas realizações, a amostra ou espécime é colocada em contato com um conjunto de iniciadores de amplificação sob condições de amplificação de ácido nucleico padrões, que são discutidas em maiores detalhes abaixo. Para uma revisão da tecnologia de PCR, incluindo condições de amplificação de ácido nucleico padrões, tais como condições de PCR, aplicadas à microbiologia clínica, ver DNA Methods in Clinical Microbiology, Singleton P., publicado por Dordrecht; Boston: Kluwer Academic, (2000) Molecular Cloning to Genetic Engineering White, B.A. Ed. in Methods in Molecular Biology 67: Humana Press, Totowa (1997) e “PCR Methods and Applications”, de 1991 a 1995 (Cold Spring Harbor Laboratory Press). Exemplos não limitadores de “condições de amplificação de ácido nucleico” e “condições de PCR” incluem as condições reveladas nas referências citadas neste documento, tais como, por exemplo, KCL 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 0,1%, MgCl2 2,5 mM, com uma temperatura de hibridação de 72 °C; ou MgCh 4mM, Tris 100 mM, pH 8,3, KCl 10 mM, (NH4)2SO4 5mM, 0,15 mg BSA, Trehalose 4%, com uma temperatura de hibridação de 59 °C, ou KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 0,1%, MgCl2 2,5 mM, com uma temperatura de hibridação de 55 °C, ou semelhante.

[0042] Os iniciadores descritos neste documento podem ser preparados usando técnicas conhecidas na técnica, incluindo, mas, sem limitação, clonagem e digestão das sequências apropriadas e síntese química direta. Os métodos de síntese química que podem ser usados para fazer os iniciadores da descrito neste documento, incluem, mas, sem limitação, o método fosfotriéster descrito por Narang et al. (1979) Methods in Enzymology 68:90, o método fosfodiéster revelado por Brown et al. (1979) Methods in Enzymology 68:109, o método dietilfosforamidato revelado por Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters 22:1859 e o método do suporte sólido descrito na Patente US 4.458.066. O uso de um sintetizador de oligonucleotídeo automatizado para preparar iniciadores de oligonucleotídeos sintéticos descritos neste documento é também tido em consideração aqui.

[0043] Consequentemente, algumas modalidades referem-se a composições que compreendem oligonucleotídeos (por exemplo, iniciadores e sondas de amplificação) que hibridizam especificamente (por exemplo, sob condições de amplificação de ácido nucleico padrões, por exemplo, condições de PCR padrões, e/ou condições de hibridização rigorosas) para sequências de extremidade direita SCC mec polimórfico em cepas de SARM que têm sequências de MREJ do tipo xxi. Por exemplo, em algumas realizações, são fornecidas composições que compreendem oligonucleotídeos que hibridizam especificamente para as sequências de extremidade direita SCCmec polimórficas presentes na SEQ ID N°: 1, ou o complemento da mesma. Um oligonucleotídeo exemplificativo que especificamente hibridiza para as sequências de extremidade direita SCCmec polimórficas de MREJ do tipo xxi, incluindo as sequências de extremidade direita polimórficas dentro de SEQ ID N°: 1, é fornecido em SEQ ID N°: 2, ou o complemento da mesma. Assim, são fornecidos aqui oligonucleotídeos que são substancialmente complementares à SEQ ID N°: 2 ou ao complemento da mesma, bem como oligonucleotídeos contendo 1, 2, 3, 4 ou mais incompatibilidades ou nucleotídeos universais em relação à SEQ ID N°: 2 ou ao complemento da mesma, por exemplo, incluindo oligonucleotídeos que são pelo menos 80% idênticos (por exemplo, pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticos à SEQ ID N°: 2 ou ao complemento da mesma.

[0044] Em algumas realizações, as composições e métodos podem incluir oligonucleotídeos, por exemplo, iniciadores de amplificação ou sondas de sequências específicas, que hibridizam especificamente a uma ou mais sequências de extremidade direita polimórfica dentro de regiões de MREJ outras que não MREJ do tipo xxi. Consequentemente, algumas realizações fornecem oligonucleotídeos, por exemplo, iniciadores de amplificação ou sondas de sequência específica, que hibridizam especificamente (sob condições de amplificação de ácido nucleico padrões, e/ou condições de hibridização rigorosas) para sequências de extremidade direita polimórficas dentro de uma ou mais regiões de MREJ selecionadas de regiões de MREJ do tipo i, regiões de MREJ do tipo ii, regiões de MREJ do tipo iii, regiões de MREJ do tipo iv, regiões de MREJ do tipo v, regiões de MREJ do tipo vi, regiões de MREJ do tipo vii, regiões de MREJ do tipo viii, regiões de MREJ do tipo ix, regiões de MREJ do tipo x, regiões de MREJ do tipo xi, regiões de MREJ do tipo xii, regiões de MREJ do tipo xiii, regiões de MREJ do tipo xiv, regiões de MREJ do tipo xv, regiões de MREJ do tipo xvi, regiões de MREJ do tipo xvii, regiões de MREJ do tipo xviii, regiões de MREJ do tipo xix e regiões de MREJ do tipo xx.

[0045] Em algumas realizações, as composições e métodos podem incluir oligonucleotídeos, por exemplo, iniciadores de amplificação que hibridizam especificamente para e são capazes de gerar um amplicon de sequências mecA ou um fragmento das mesmas. Consequentemente, algumas realizações incluem oligonucleotídeos, por exemplo, iniciadores de amplificação que especificamente hibridizam para e são capazes de gerar um amplicon de sequências dentro de SEQ ID N°: 156. Algumas realizações incluem oligonucleotídeos, por exemplo, iniciadores de amplificação que hibridizam especificamente para e são capazes de gerar um amplicon de sequências mecC, por exemplo, sequências dentro de SEQ ID N°: 157, ou um fragmento das mesmas. Algumas realizações incluem oligonucleotídeos, por exemplo, iniciadores de amplificação que hibridizam especificamente para e são capazes de gerar um amplicon de sequências específicas de Staphylococcus aureus. Por exemplo, algumas realizações fornecem oligonucleotídeos que hibridizam especificamente para e são capazes de gerar um amplicon de sequências nuc (por exemplo, sequências derivadas de SEQ ID N°: 158), sequências femB (por exemplo, sequências derivadas de SEQ ID N°: 159), sequências Sa442 (por exemplo, de Martineau, et al., 1998, J. Clin. Microbiol. 36(3):618-623) (SEQ ID N°: 160).

[0046] Em algumas realizações, é fornecido um oligonucleotídeo que hibridiza especificamente para as sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo xxi sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e sondas específicas de sequência) revelados neste documento especificamente hibridizam para as sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo i sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e sondas específicas de sequência) revelados neste documento especificamente hibridizam para as sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo ii sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e sondas específicas de sequência) revelados neste documento especificamente hibridizam para as sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo iii sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e sondas específicas de sequência) revelados neste documento especificamente hibridizam para as sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo iv sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e sondas específicas de sequência) revelados neste documento especificamente hibridizam para as sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo v sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e sondas específicas de sequência) revelados neste documento especificamente hibridizam para as sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo vi sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e sondas específicas de sequência) revelados neste documento especificamente hibridizam para as sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo vii sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e sondas específicas de sequência) revelados neste documento especificamente hibridizam para as sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo viii sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e sondas específicas de sequência) revelados neste documento especificamente hibridizam para as sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo ix sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e sondas específicas de sequência) revelados neste documento especificamente hibridizam para as sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo x sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e sondas específicas de sequência) revelados neste documento especificamente hibridizam para as sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo xi sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e sondas específicas de sequência) revelados neste documento especificamente hibridizam para as sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo xii sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e sondas específicas de sequência) revelados neste documento especificamente hibridizam para as sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo xiii sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e sondas específicas de sequência) revelados neste documento especificamente hibridizam para as sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo xiv sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e sondas específicas de sequência) revelados neste documento especificamente hibridizam para as sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo xv sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e sondas específicas de sequência) revelados neste documento especificamente hibridizam para as sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo xvi sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e sondas específicas de sequência) revelados neste documento especificamente hibridizam para as sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo xvii sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e sondas específicas de sequência) revelados neste documento especificamente hibridizam para as sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo xviii sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e sondas específicas de sequência) revelados neste documento especificamente hibridizam para as sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo xix sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e sondas específicas de sequência) revelados neste documento especificamente hibridizam para as sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo xx sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e/ou sondas específicas de sequência) revelados neste documento hibridizam especificamente para sequências mecA. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e/ou sondas específicas de sequência) revelados neste documento hibridizam especificamente para sequências mecC. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e/ou sondas específicas de sequência) revelados neste documento hibridizam especificamente para sequências nuc. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e/ou sondas específicas de sequência) revelados neste documento hibridizam especificamente para sequências Sa442. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos específicos de sequência (por exemplo, iniciadores de amplificação e/ou sondas específicas de sequência) revelados neste documento hibridizam especificamente para sequências femB.

[0047] Sequências de região de MREJ exemplificativas relacionadas às realizações reveladas neste documento incluem, por exemplo:

[0048] Além do oligonucleotídeo de SEQ ID N°: 2, como discutido acima, que hibridiza especificamente para as sequências de extremidade direita polimórfica dentro das regiões de MREJ do tipo xxi, oligonucleotídeos que são específicos para uma ou mais sequências polimórficas dentro de sequências de região de MREJ, ou para sequências de DNA cromossômico S. aureus, úteis nas realizações reveladas neste documento incluem, mas sem limitação, o seguinte:

[0049] Além do acima mencionado, o técnico com conhecimento considerará que as composições e métodos revelados neste documento podem incluir iniciadores e/ou sondas para a detecção específica da região de extremidade direita das sequências SCCmec em várias cepas de SARM além daquelas mencionadas neste documento, acima. A título de exemplo, em algumas realizações, composições e métodos revelados neste documento incluem sequências, por exemplo, iniciadores e/ou sondas, descritas na Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 08/080620, incluindo variantes dos mesmos e complementos dos mesmos. Consequentemente, as composições e métodos revelados neste documento podem incluir iniciadores e/ou sondas listadas abaixo: TABELA 2

[0050] Consequentemente, em realizações exemplificativas, são fornecidos métodos e composições para a detecção de SARM compreendendo MREJ xxi e um ou mais tipos de MREJ selecionados do grupo consistindo de MREJ dos tipos i-xx. Por exemplo, algumas realizações fornecem detecção e/ou identificação de SARM compreendendo ácidos nucleicos de MREJ dos tipos i, ii, iii e xxi, usando os oligonucleotídeos específicos para DNA cromossômico S. aureus e específico de MREJ revelados neste documento. Algumas realizações proporcionam detecção e/ou identificação de SARM compreendendo sequências de MREJ dos tipos i, ii, iii, iv e xxi, usando uma combinação de oligonucleotídeos específicos para MREJ como descrito neste documento. Algumas realizações fornecem a detecção de SARM compreendendo ácidos nucleicos de MREJ dos tipos i, ii, iii, iv, v, vii e xxi, usando uma combinação de oligonucleotídeos específicos para MREJ revelados neste documento. Algumas realizações fornecem a identificação de SARM compreendendo ácidos nucleicos de MREJ dos tipos i, ii, iii, iv, v, vii e xxi, usando uma combinação de oligonucleotídeos específicos para MREJ revelados neste documento. Algumas realizações fornecem a detecção de SARM compreendendo ácidos nucleicos de MREJ dos tipos i, ii, iii, iv, v, vii e xxi, usando uma combinação de oligonucleotídeos específicos para MREJ revelados neste documento. Algumas realizações fornecem a identificação de SARM compreendendo ácidos nucleicos de MREJ dos tipos i, ii, iii, iv, v, vii e xxi, usando uma combinação de oligonucleotídeos específicos para MREJ revelados neste documento. Algumas realizações fornecem a detecção de SARM compreendendo ácidos nucleicos dos tipos i, ii, iii, iv, v, vi, vii, ix, xiii, xiv e xxi, usando uma combinação de oligonucleotídeos específicos para MREJ revelados neste documento. Algumas realizações fornecem a identificação de SARM compreendendo ácidos nucleicos dos tipos i, ii, iii, iv, v, vi, vii, ix, xiii, xiv e xxi, usando uma combinação de oligonucleotídeos específicos para MREJ revelados neste documento. Algumas realizações fornecem a detecção e/ou identificação de SARM compreendendo ácidos nucleicos dos tipos i, ii, iii, iv, vii, xvi e xxi, usando uma combinação de oligonucleotídeos específicos para MREJ revelados neste documento.

Sondas

[0051] Em algumas realizações, sondas específicas de sequência são fornecidas. As sondas incluem, mas sem limitação, oligonucleotídeos, como descrito neste documento. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especificamente para uma sequência-alvo, tal como uma sequência de ácido nucleico de região de MREJ do tipo xxi. Por exemplo, em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento especificamente hibridizam para SEQ ID N°: 1, ou o complemento da mesma, ou uma subsequência da mesma (por exemplo, um amplicon de uma região dentro da SEQ ID N°: 1). Em algumas realizações, a sonda específica de sequência hibridiza especialmente para e é totalmente ou substancialmente complementar à sequência de nucleotídeos flanqueada pelos sítios de ligação de um iniciador forward e iniciador reverse revelado neste documento. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência compreendem pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 nucleotídeos da SEQ ID N°: 2 ou 3, tal que a sonda específica de sequência se sobrepõe com o sítio de ligação de um iniciador de amplificação revelado neste documento.

[0052] Em algumas realizações, sondas específicas de sequência que hibridizam para orfX são fornecidas. Em algumas realizações, sondas específicas de sequência que hibridizam para mecA são fornecidas. Em algumas realizações, sondas específicas de sequência que hibridizam para mecC são fornecidas. Em algumas realizações, sondas específicas de sequência que hibridizam para nuc são fornecidas. Em algumas realizações, sondas específicas de sequência que hibridizam para femB são fornecidas. Em algumas realizações, sondas específicas de sequência que hibridizam para Sa442 são fornecidas.

[0053] O técnico com conhecimento considerará facilmente que pares cognatos de iniciadores de amplificação e sondas específicas de sequência podem ser fornecidos juntos. Isto é, em realizações, onde iniciadores de amplificação que hibridizam especialmente para e geram um amplicon para uma sequência em particular são fornecidos, realizações reveladas neste documento podem também incluir uma sonda específica de sequência, que hibridiza e é específica para o amplicon.

[0054] Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo xxi sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de MREJ do tipo i, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de MREJ do tipo ii, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de MREJ do tipo iii, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de MREJ do tipo iv, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de MREJ do tipo v, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de MREJ do tipo vi, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de MREJ do tipo vii, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de MREJ do tipo viii, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de MREJ do tipo ix, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de MREJ do tipo x, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de MREJ do tipo xi, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de MREJ do tipo xii, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de MREJ do tipo xiii, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de MREJ do tipo xiv, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de MREJ do tipo xv, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de MREJ do tipo xvi, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de MREJ do tipo xvii, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de MREJ do tipo xviii, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de MREJ do tipo xix, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de MREJ do tipo xx, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências mecA, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências mecC, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências nuc, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências femB, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especialmente para as sequências Sa442, sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico, e/ou condições de hibridização rigorosas.

[0055] Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especificamente para sequências cromossômicas de S. aureus localizadas dentro de 1 quilobase do ponto de inserção do elemento SCCmec no DNA cromossômico. Por exemplo, em algumas realizações, é fornecida uma sonda específica de sequência que hibridiza especificamente para sequências orfX de S. aureus sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico e/ou condições de hibridização rigorosas. Em algumas realizações, é fornecida uma sonda específica de sequência que hibridiza para orfSA0022 sob condições padrões para amplificação de ácido nucleico. Em algumas realizações, as sondas específicas de sequência reveladas neste documento hibridizam especificamente para as sequências de MREP, por exemplo, sequências de MREP dos tipos i, ii, iii, iv, v, vi, vii, viii, ix, x, xi, xii, xiii, xiv, xv, xvi, xvii, xviii, xix, xx ou xxi. Em algumas realizações, mais do que uma sonda específica de sequência é fornecida. Por exemplo, em algumas realizações, sondas específicas de sequência que hibridizam especificamente para sequências de MREP do tipo xxi são fornecidas em combinação com uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove ou vinte ou mais sondas específicas de sequência.

[0056] Em algumas realizações, as sondas de oligonucleotídeo podem incluir um segmento detectável. Por exemplo, em algumas realizações, as sondas de oligonucleotídeo reveladas neste documento podem compreender um rótulo radioativo. Exemplos não limitadores de rótulos radioativos incluem 3H, 14C, 32P e 35S. Em algumas realizações, as sondas de oligonucleotídeo podem incluir um ou mais marcadores ou segmentos detectáveis não radioativos, incluindo, mas sem limitação, ligantes, fluoróforos, agentes quimiluminescentes, enzimas e anticorpos. Outros marcadores detectáveis para uso com sondas, que podem permitir um aumento na sensibilidade do método da invenção, incluem biotina e radionucleotídeos. Se tornará evidente para a pessoa de conhecimento comum, que a escolha de um rótulo em particular dita a forma com que ele é ligado à sonda. Por exemplo, sondas de oligonucleotídeo rotuladas com um ou mais corantes, tal que com a hibridização para um ácido nucleico de modelo, uma mudança detectável na fluorescência é gerada. Enquanto corantes não específicos possam ser desejáveis para algumas aplicações, sondas específicas de sequência podem fornecer medições mais precisas de amplificação. Uma configuração de sonda específica de sequência pode incluir uma extremidade da sonda ligada a um fluoróforo e a outra extremidade da sonda ligada a um silenciador. Quando a sonda é desibridizada, ela pode manter uma configuração stem-loop, em que o fluoróforo é silenciado pelo silenciador, prevenindo, assim, que o fluoróforo fluoresça. Quando a sonda é hibridizada para uma sequência nucleica modelo, ela é linearizada, distanciando o fluoróforo do silenciador, e, assim, permitindo que o fluoróforo fluoresça. Outra configuração de sonda específica de sequência pode incluir uma sonda ligada a um primeiro fluoróforo de um par FRET e uma segunda sonda ligada a um segundo fluoróforo de um par FRET. A primeira sonda e a segunda sonda podem ser configuradas para hibridizar para sequências de um amplicon que estejam em proximidade suficiente para permitir transferência de energia por FRET, quando a primeira sonda e a segunda sonda são hibridizadas para o mesmo amplicon.

[0057] Em algumas realizações, a sonda específica de sequência compreende um oligonucleotídeo, como revelado neste documento, conjugado a um fluoróforo. Em algumas realizações, a sonda é conjugada a dois ou mais fluoróforos. Exemplos de fluróforos incluem: corantes de xanteno, por exemplo, corantes de fluoresceína e rodamina, tais como isotiocianato de fluoresceína (FITC), monohidrocloreto de etil éster de ácido 2-[etilamino)-3-(etilimino)-2-7-dimetil-3H-xanten-9- il]benzóico (R6G) (emite uma radiação de resposta no comprimento de onda que varia de cerca de 500 a 560 nm), iodeto de 1,1,3,3,3’,3’- Hexametilindodicarbocianina (HIDC) (emite uma radiação de resposta no comprimento de onda que varia de cerca de 600 a 660 nm), 6- carboxifluoresceína (comumente conhecida pelas abreviações FAM e F), 6-carbóxi-2’,4’,7’,4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), 6-carbóxi-4’,5’- dicloro-2’,7’-dimetoxifluoresceína (JOE ou J), N,N,N’,N’-tetrametil-6- carboxirodamina (TAMRA ou T), 6-carbóxi-X-rodamina (ROX ou R), 5- carboxirodamina-6G (R6G5 ou G5), 6-carboxirodamina-6G (R6G6 ou G6) e rodamina 110; corantes de cianina, por exemplo, corantes Cy3, Cy5 e Cy7; cumarinas, por exemplo, umbeliferona; corantes de benzimida, por exemplo, Hoechst 33258; corantes de fenantridina, por exemplo, Vermelho Texas; corantes de etídio; corantes de acridina; corantes de carbazol; corantes de fenoxazina; corantes de porfirina; corantes de polimetina, por exemplo, corantes de cianina, tais como Cy3 (emite uma radiação de resposta no comprimento de onda que varia de 540 a 580 nm), Cy5 (emite uma radiação de resposta no comprimento de onda que varia de 640 a 680 nm), etc; corantes BODIPY e corantes de quinolina. Fluoróforos específicos de interesse incluem: Pireno, Cumarina, Dietilaminocumarina, FAM, Clorotriazinil de Fluoresceína, Fluoresceína, R110, Eosina, JOE, R6G, HIDC, Tetrametilrodamina, TAMRA, Lissamina, ROX, Naptofluoresceína, Vermelho Texas, Naptofluoresceína, Cy3 e Cy5 e semelhantes.

[0058] Em algumas realizações, a sonda é conjugada a um silenciador. Um silenciador pode absorver radiação eletromagnética e dissipá-la como calor, permanecendo, assim, escuro. Silenciadores de exemplo incluem Dabcyl, NFQ's, tais como BHQ-1 ou BHQ-2 (Biosearch), IOWA BLACK FQ (IDT) e IOWA BLACK RQ (IDT). Em algumas realizações, o silenciador é selecionado para emparelhar com um fuoróforo, de modo a absorver radiação eletromagnética emitida pelo fluoróforo. Pares fluoróforo/silenciador úteis nas composições e métodos revelados neste documento são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, descritos em S. Marras, “Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes”, disponível no site molecular- sinais.org/download/marras, mmb06%28335%293.pdf.

[0059] Em algumas realizações, um fluoróforo é ligado a uma primeira extremidade da sonda e um silenciador é ligado a uma segunda extremidade da sonda. A ligação pode incluir ligação covalente e pode opcionalmente incluir pelo menos uma molécula linker posicionada entre a sonda e o fluoróforo ou silenciador. Em algumas realizações, um fluoróforo é ligado a uma extremidade 5’ de uma sonda e um silenciador é ligado a uma extremidade 3’ de uma sonda. Em algumas realizações, um fluoróforo é ligado a uma extremidade 3’ de uma sonda e um silenciador é ligado a uma extremidade 5’ de uma sonda. Exemplos de sondas que podem ser usadas em amplificação de ácido nucleico quantitativa incluem sinais moleculares, sondas SCORPION™ (Sigma), sondas TAQMAN™ (Life Technologies) e semelhantes. Outras tecnologias de detecção de ácido nucleico que são úteis nas realizações reveladas neste documento incluem, mas sem limitação, tecnologia de sonda de nanopartícula (ver, Elghanian, et al. (1997) Science 277:1078-1081) e tecnologia de sonda Amplifluor (ver, Patentes US 5.866.366; 6.090.592; 6.117.635; e 6.117.986).

[0060] Algumas realizações reveladas neste documento fornecem sondas que hibridizam especificamente para uma sequência de MREJ do tipo xxi, ou um amplicon de uma sequência de MREJ do tipo xxi, por exemplo, SEQ ID N°: 1, ou uma subsequência da mesma. Consequentemente, algumas realizações reveladas neste documento fornecem uma sonda que hibridiza para um amplicon a partir da amplificação de um modelo compreendendo SEQ ID N°: 1 usando os iniciadores de amplificação SEQ ID Nos: 2 e 3. A título de exemplo apenas, em algumas realizações, a sonda pode compreender, consistir essencialmente de, ou consistir da sequência de SEQ ID N°: 4, ou uma variante da mesma, é fornecida. Em algumas realizações, a sonda compreende um fluoróforo e/ou silenciador, como descrito neste documento. Em algumas realizações, a sonda pode compreender, consistir essencialmente de, ou consistir da sequência de SEQ ID N°: 82, ou uma variante da mesma, é fornecida. Em algumas realizações, a sonda compreende um fluoróforo e/ou silenciador, como descrito neste documento. Em realizações preferidas, as sondas podem compreender SEQ ID N°: 4 ou SEQ ID N°: 82, ou variantes das mesmas, com o fluoróforo 6-carboxifluoresceína (“FAM”) ligado à extremidade 5’ da sonda e o silenciador IOWA BLACK Black-hole Quencher® 2 (IDT) (“BHQ”) ligado à extremidade 3’ da sonda.

Kits

[0061] Também são fornecidos neste documento kits. Os kits, iniciadores e sondas revelados neste documento podem ser usados para detectar e/ou identificar SARM de MREJ do tipo xxi (e, em algumas realizações, adicionalmente para detectar e/ou identificar SARM de um ou mais de MREJ dos tipos i-xx), tanto em aplicações in vitro, quanto/ou in situ. Por exemplo, é tido em consideração que os kits podem ser usados em combinação com quaisquer iniciadores/sondas anteriormente descritos para detecção de SARM de MREJ dos tipos i a xx. É também tido em consideração que os kits de diagnóstico, iniciadores e sondas revelados neste documento podem ser usados sozinhos ou em combinação com qualquer outro ensaio apropriado para detecção e/ou identificação de micro-organismos, incluindo, mas, sem limitação: qualquer ensaio baseado em detecção de ácidos nucleicos, qualquer imunoensaio, qualquer ensaio enzimático, qualquer ensaio bioquímico, qualquer ensaio lisotípico, qualquer ensaio sorológico, qualquer meio de cultura diferencial, qualquer meio de cultura enriquecedor, qualquer meio de cultura seletivo, qualquer meio de ensaio específico, qualquer meio de cultura de identificação, qualquer meio de cultura de enumeração, qualquer cepa celular, qualquer cultura em linhagens celulares específicas e qualquer ensaio de infectividade em animais.

[0062] Consequentemente, em algumas realizações, os kits revelados neste documento incluirão um oligonucleotídeo que se liga especificamente às sequências de extremidade direita polimórficas de sequências de MREJ do tipo xxi (por exemplo, SEQ ID N°: 1 ou o complemento da mesma) sob condições de ampliação de ácido nucleico padrões, e/ou condições de hibridização rigorosas. Por exemplo, em algumas realizações, os kits revelados neste documento incluirão um oligonucleotídeo (por exemplo, um primeiro iniciador de amplificação), que compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de SEQ ID N°:2, ou uma variante da mesma. Em algumas realizações, o kit pode também incluir um ou mais oligonucleotídeos adicionais, por exemplo, um segundo iniciador de amplificação, tal como um oligonucleotídeo que compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de SEQ ID N°: 3, ou uma variante da mesma, que, juntamente com um primeiro iniciador de amplificação gerará um amplicon das sequências de junção de extremidade direita polimórfica de MREJ do tipo xxi, Em algumas realizações, o kit pode também incluir uma sonda, como descrito neste documento. Por exemplo, em algumas realizações, o kit pode incluir uma sonda de oligonucleotídeo, que compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de SEQ ID N°: 4, ou uma variante da mesma.

[0063] Em algumas realizações, os kits revelados neste documento podem incluir, além de um oligonucleotídeo que se liga especificamente às sequências de extremidade direita polimórfica de sequências de MREJ do tipo xxi, sob condições de amplificação padrões, um ou mais oligonucleotídeos que se ligam especificamente a uma ou mais das sequências de extremidade direita polimórficas SCCmec (MREP) dentro de MREJ dos tipos i, ii, iii, iv, v, vi, vii, viii, ix, x, xi, xii, xiii, xiv, xv, xvi, xvii, xviii, ixi, ou xx. Em algumas realizações, o revelado neste documento pode incluir, além de um oligonucleotídeo que se liga especificamente às sequências de extremidade direita polimórficas de sequências de MREJ do tipo xxi sob condições de amplificação padrões, um ou mais oligonucleotídeos que se ligam especificamente a sequências mecA. Em algumas realizações, os kits revelados neste documento podem incluir, além de um oligonucleotídeo que se liga especificamente às sequências de extremidade direita polimórficas de sequências de MREJ do tipo xxi sob condições de amplificação padrões, um ou mais oligonucleotídeos que se ligam especificamente a sequências mecC. Em algumas realizações, os kits revelados neste documento podem incluir, além de um oligonucleotídeo que se liga especificamente às sequências de extremidade direita polimórficas de sequências de MREJ do tipo xxi sob condições de amplificação padrões, um ou mais oligonucleotídeos que se ligam especificamente a sequências nuc. Em algumas realizações, os kits revelados neste documento podem incluir, além de um oligonucleotídeo que se liga especificamente às sequências de extremidade direita polimórficas de sequências de MREJ do tipo xxi sob condições de amplificação padrões, um ou mais oligonucleotídeos que se ligam especificamente a sequências de nucleotídeos específicos de S. aureus, por exemplo, sequências femB. Em algumas realizações, os kits revelados neste documento podem incluir, além de um oligonucleotídeo que se liga especificamente às sequências de extremidade direita polimórficas de sequências de MREJ do tipo xxi sob condições de amplificação padrões, um ou mais oligonucleotídeos que se ligam especificamente a sequências Sa442.

[0064] Em algumas realizações, são fornecidos kits contendo os reagentes e composições para conduzir os métodos descritos neste documento. Tal kit pode compreender um portador sendo compartimentalizado para receber em confinamento fechado ali um ou mais receptáculos, tais como tubos ou frascos. Um dos receptáculos pode conter pelo menos um iniciador ou sonda não rotulado ou detectavelmente rotulado revelado neste documento. O iniciador ou iniciadores podem estar presentes em forma liofilizada ou em um tampão apropriado, conforme necessário. Um ou mais receptáculos podem conter uma ou mais enzimas ou reagentes para serem utilizados em, por exemplo, reações de amplificação de ácido nucleico. Estas enzimas podem estar presentes sozinhas ou em misturas, em forma liofilizada ou em tampões apropriados. Enzimas exemplificativas úteis em reações de amplificação de ácido nucleico, conforme revelado neste documento, incluem, mas sem limitação, polimerase de DNA Taq FASTSTART™, polimerase de DNA APTATAQ™ (Roche), polimerase de DNA KLENTAQ 1™ (AB peptides Inc.), polimerase de DNA HOTGOLDSTAR™ (Eurogentec), polimerase de DNA HotStar KAPATAQ™, polimerase de DNA Fast HotStart KAPA2G™ (Kapa Biosystemss), Polimerase de DNA Hot Start PHUSION™ (Finnzymes), ou semelhantes.

[0065] Adicionalmente, os kits revelados neste documento podem incluir todos os elementos adicionais necessários para conduzir os métodos revelados neste documento, tais como tampões, reagentes de extração, enzimas, pipetas, placas, ácidos nucleicos, trifosfatos de nucleosídeo, papel de filtro, materiais em gel, materiais de transferência, suprimentos de autorradiografia e semelhantes.

[0066] Em algumas realizações, os kits incluem reagentes adicionais que são requeridos para ou convenientes e/ou desejáveis para incluir na mistura reagente preparada durante os métodos revelados neste documento, onde tais reagentes incluem: uma ou mais polimerases; um meio de tampão aquoso (ou preparado ou presente em seus componentes constituintes, onde um ou mais dos componentes podem ser pré-misturados ou todos os componentes podem ser separados) e semelhantes. Os vários componentes reagentes dos kits podem estar presentes em receptáculos separados, ou podem todos ser pré-combinados em uma mistura reagente para combinação com ácido nucleico modelo.

[0067] Além dos componentes acima, em algumas realizações, os kits podem também incluir instruções para a prática dos métodos revelados neste documento. Estas instruções podem estar presentes nos kits em uma variedade de formas, uma ou mais das quais podem estar presentes no kit. Uma forma em que estas instruções podem estar presentes é como informação impressa em um meio ou substrato apropriado, por exemplo, um pedaço ou pedaços de papel em que a informação é impressa, na embalagem do kit, em um suplemento da embalagem, etc. Ainda outros meios seriam um meio legível em computador, por exemplo, disquete, CD, etc., em que a informação foi gravada. Ainda outros meios que podem estar presentes é um endereço de website, que pode ser usado por meio da internet para acessar a informação em um sítio removido. Quaisquer meios convenientes podem estar presentes nos kits.

Métodos

[0068] São proporcionados neste documento métodos para a detecção, identificação e/ou quantificação de SARM tendo ácidos nucleicos de MREJ do tipo xxi a partir de uma amostra. Em algumas realizações, os métodos incluem a etapa de contato da amostra a ser analisada com um oligonucleotídeo que hibridiza especificamente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de SCCmec MREJ do tipo xxi, sob condições de amplificação de ácido nucleico padrões e/ou condições de hibridização rigorosas.

[0069] Em algumas realizações, uma amostra a ser testada para a presença de um SARM tendo uma região de SCCmec MREJ do tipo xxi é processada antes da realização dos métodos revelados neste documento. Por exemplo, em algumas realizações, a amostra pode ser isolada, concentrada, ou submetida a várias etapas de processamento antes da realização dos métodos revelados neste documento. Por exemplo, em algumas realizações, a amostra pode ser processada para isolar ácidos nucleicos da amostra antes do contato da amostra com os oligonucleotídeos, como revelado neste documento. Como usado neste documento, a frase “ácidos nucleicos isolados” se refere à purificação dos ácidos nucleicos de um ou mais componentes celulares. O técnico com conhecimento considerará que as amostras processadas para “ácidos nucleicos isolados” das mesmas podem incluir componentes e impurezas outras que não ácidos nucleicos. Em algumas realizações, os métodos revelados neste documento são realizados na amostra sem a cultura da amostra in vitro. Em algumas realizações, os métodos revelados neste documento são realizados na amostra sem o isolamento de ácidos nucleicos da amostra antes do contato da amostra com oligonucleotídeos, como revelado neste documento.

i. Métodos Baseados em Não Amplificação

[0070] Em algumas realizações, o oligonucleotídeo compreende um segmento detectável, como descrito em algum lugar neste documento e a hibridização específica do oligonucleotídeo para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de SCCmec MREJ do tipo xxi pode ser detectada, por exemplo, por meios diretos ou indiretos. Consequentemente, algumas realizações para a detecção e/ou identificação de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (SARM) compreendendo ácidos nucleicos de MREJ do tipo xxi, que inclui as etapas de fornecimento de uma amostra de teste; e contato da amostra com uma sonda de oligonucleotídeo que hibridiza especificamente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região de SCCmec MREJ do tipo xxi sob condições de amplificação de ácido nucleico padrões e/ou condições de hibridização rigorosas, em que a sonda de oligonucleotídeo tem entre 10 e 45 nucleotídeos de comprimento e compreende um segmento detectável, em que o contato é realizado sob condições permitindo a hibridização específica do iniciador para a junção de extremidade direita mec da sequência de MREJ do tipo xxi se S. aureus compreendendo sequências de MREJ do tipo xxi estiver presente na amostra. A presente e/ou quantidade da sonda que é especificamente ligada à junção de extremidade direita mec da sequência de MREJ do tipo xxi (se presente na amostra sendo testada) pode ser determinada, em que a sonda ligada é indicativa da presença de um SARM tendo sequências de SCCmec MREJ do tipo xxi na amostra. Em algumas realizações, a quantidade de sonda ligada é usada para determinar a quantidade de SARM tendo sequências de SCCmec MREJ do tipo xxi na amostra.

[0071] De forma similar, em algumas realizações, métodos baseados em não amplificação podem ser usados para detectar sequências de nucleotídeo adicionais. Por exemplo, em algumas realizações, os métodos revelados neste documento podem incluir o uso de métodos baseados em não amplificação para detectar a presença e/ou quantidade de outras sequências de MREJ, por exemplo, um ou mais de MREJ dos tipos i, ii, iii, iv, v, vi, vii, viii, ix, x, xi, xii, xiii, xiv, xv, xvi, xvii, xviii, xix, ou xx, ou qualquer combinação dos mesmos, além das sequências de MREJ do tipo xxi. Em algumas realizações, os métodos revelados neste documento podem incluir o uso de métodos baseados em não amplificação para detecção da presença de sequências mecA, além das sequências de MREJ (ou MREP) do tipo xxi. Em algumas realizações, os métodos revelados neste documento podem incluir o uso de métodos baseados em não amplificação para detecção da presença de sequências mecC, além das sequências de MREJ (ou MREP) do tipo xxi. Em algumas realizações, os métodos revelados neste documento podem incluir o uso de métodos baseados em não amplificação para detecção da presença de sequências específicas de S. aureus, tais como sequências nuc, sequências femB, sequências Sa442, sequências 16S rRNA, ou semelhantes, além das sequências de MREJ (ou MREP) do tipo xxi. Consequentemente, em uma realização exemplificativa, são fornecidos neste documento métodos e composições para a detecção simultânea de sequências de MREJ do tipo xxi, i, ii, iii, iv, vii, mecA, mecC e nuc.

[0072] A etapa de determinação pode ser alcançada utilizando quaisquer métodos conhecidos daqueles versados na técnica, incluindo, mas, sem limitação, hibridização in situ, seguindo a etapa de contato. A detecção de duplex híbridos (isto é, de uma sonda especificamente ligada às sequências de extremidade direita polimórfica de uma região de MREJ do tipo xxi) pode ser conduzida por um número de métodos. Tipicamente, duplex de hibridização são separados de ácidos nucleicos desibridizados e os rótulos ligados ao duplex são, então, detectados. Tais rótulos se referem a tags ou rótulos radioativos, fluorescentes, biológicos ou enzimáticos de uso padrão na técnica. Um rótulo pode ser conjugado ou para sondas de oligonucleotídeos, ou para ácidos nucleicos derivados da amostra biológica. Aqueles versados na técnica terão em consideração que as etapas de lavagem podem ser empregadas para lavar o excesso de amostra/ácidos nucleicos alvos, sonda de oligonucleotídeo (bem como conjugado desligado, onde aplicável). Além disso, os formatos de ensaio heterogêneo padrão são apropriados para a detecção dos híbridos, usando os rótulos presentes nos iniciadores e sondas de oligonucleotídeos.

[0073] Assim, de acordo com algumas realizações, os métodos revelados neste documento podem incluir, por exemplo, ELISA (por exemplo, em um formato de vareta, um formato multiwell ou semelhantes) usando métodos reconhecidos na técnica.

ii. Métodos Baseados em Amplificação

[0074] Em algumas realizações, os métodos para detecção e/ou identificação de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (SARM) compreendendo ácidos nucleicos de MREJ do tipo xxi, que inclui as etapas de fornecimento de uma amostra de teste; e o contato da amostra com uma sonda de oligonucleotídeo que hibridiza especificamente para as sequências de extremidade direita polimórficas de uma região SCCmec MREJ do tipo xxi sob condições de amplificação de ácido nucleico padrões e/ou condições de hibridização rigorosas, em que a sonda de oligonucleotídeo tem entre 10 e 45 nucleotídeos de comprimento.

[0075] Em algumas realizações, a amostra entra em contato sob condições de amplificação padrões, ou condições que permitam a hibridização específica e extensão do iniciador para a sequência polimórfica de extremidade direita mec (sequência MREP) da sequência de MREJ do tipo xxi, se S. aureus compreendendo sequências de MREJ do tipo xxi está presente na amostra. Consequentemente, os métodos incluem a etapa de amplificação específica de ácidos nucleicos de MREJ do tipo xxi de amostras, por exemplo, para gerar amplicons ou produtos de amplificação que incluam a junção de extremidade direita mec de uma sequência de MREJ do tipo xxi. Em algumas realizações, a amostra entra em contato sob condições de amplificação padrões, ou condições que permitam a hibridização específica de um par de iniciador, por exemplo, um primeiro iniciador que hibridiza para a sequência polimórfica de extremidade direita mec (sequência MREP) e um segundo iniciador que hibridiza para a sequência cromossômica de S. aureus adjacente à extremidade direita SCCmec, isto é, orfX, a fim de gerar um amplicon através da junção cromossômica-SCCmec. Algumas realizações fornecem métodos para gerar dados de sequência de junção de extremidade direita SCCmec através do contato de uma amostra sob condições de amplificação padrões ou condições que permitam a hibridização específica de um par de iniciador, por exemplo, um primeiro iniciador que hibridiza para a sequência polimórfica de extremidade direita (sequência MREP) e um segundo iniciador que hibridiza para a sequência cromossômica de S. aureus adjacente à extremidade direita SCCmec, isto é, orfX, a fim de gerar um amplicon através da junção cromossômica - SCC mec.

[0076] Em algumas realizações, a amostra entra em contato, por exemplo, simultaneamente com (como em PCR multiplex), ou sequencialmente para o contato com oligonucleotídeo(s) específico para MREJ do tipo xxi, sob as mesmas condições de amplificação padrões, com iniciadores adicionais que permitem a amplificação específica de uma ou mais sequências de tipo MREJ, por exemplo, um ou mais de sequências de MREJ do tipo i, ii, iii, iv, v, vi, vii, viii, ix, x, xi, xii, xiii, xiv, xv, xvi, xvii, xviii, xix, ou xx. Em algumas realizações, a amostra entra em contato, por exemplo, simultaneamente com (PCR multiplex), ou sequencialmente a, o contato com oligonucleotídeo(s) específico para MREJ do tipo xxi, sob as mesmas condições de amplificação padrões, com iniciadores adicionais que permitem a amplificação específica das sequências mecA e/ou mecC. Em algumas modalidades, a amostra entra em contato, por exemplo, simultaneamente com (PCR multiplex), ou sequencialmente a, o contato com oligonucleotídeo(s) específico(s) para MREJ do tipo xxi, sob as mesmas condições de amplificação padrões, com iniciadores adicionais que permite a amplificação específica de uma ou mais sequências que sejam únicas a S. aureus (sequências específicas de S. aureus), tais como nuc, femB, Sa442 e semelhantes. Consequentemente, em algumas realizações, a amostra entra em contato com iniciadores específicos para sequências de MREP do tipo xxi, i, ii, iii, iv, v, vii, ix, xiii, xiv e xxi, bem como sequências mecA, mecC e nuc.

[0077] Em algumas realizações, os métodos incluem a identificação de um tipo específico de sequência (por exemplo, uma sequência de MREJ do tipo xxi). Por exemplo, em realizações envolvendo a amplificação específica de apenas sequências MREJ do tipo xxi em simplexm a presença ou a ausência de um amplicon é indicativa da presença ou ausência de sequências MREJ do tipo xxi na amostra. Em algumas realizações, os métodos envolvem a amplificação específica de sequências adicionais, por exemplo, sequências MREJ, sequências mec, sequências específicas de S. aureus e semelhantes, em multiplex com a amplificação específica de sequências de MREJ do tipo xxi. Nas realizações que envolvem amplificação multiplex, em algumas realizações, os métodos podem incluir a identificação ou detecção de sequências específicas, por exemplo, através do uso de sondas específicas de sequência que hibridizam para apenas um amplicon. Em algumas realizações, os métodos não discriminam entre alguns ou todos os amplicons diferentes possíveis presentes na amostra após a amplificação. Por exemplo, em algumas realizações, a sonda específica de sequência que hibridiza para orfX pode ser usada para detectar a presença de amplicons de um ou mais tipos de MREJ. Em algumas realizações, os métodos incluem a detecção de um produto de amplificação, sem a detecção específica de uma sequência em particular.

[0078] Diversos métodos para a amplificação específica de ácidos nucleicos alvos são conhecidos na técnica e são úteis nas realizações reveladas neste documento. Exemplos não limitadores de métodos de amplificação incluem Reação em Cadeia da Polimerase (PCR; ver Saiki et al., 1985, Science 230:1350-1354, incorporado neste documento por referência), Reação em Cadeia da Ligase (LCR; ver Wu et al., 1989, Genomics 4:560-569; Barringer et al., 1990, Gene 89:117-122; Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193, todos os quais são incorporados neste documento por referência), Amplificação Mediada por Transcrição (TMA; ver Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177, incorporado neste documento por referência), Replicação de Sequência Autossustentável (3SR; ver Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878, incorporado neste documento por referência), Amplificação por Círculo Rolante (RCA), Amplificação Baseada em Sequência de Ácido Nucleico (NASBA), sistema de replicase Q β (Lizardi et al., 1988, BioTechnology 6:1197-1202, incorporado neste documento por referência) e Amplificação de Deslocamento de Filamento (SDA); ver Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396; Walker et al., 1992, Nuc. Acids. Res. 20:1691-1696; e EP 0 497 272, todos os quais são incorporados neste documento por referência)) incluindo SDA termofílica (tSDA).

[0079] Em várias modalidades, os métodos revelados neste documento são úteis para detecção da presença de ácidos nucleicos ou sequências SCCmec MREJ do tipo xxi em amostras clínicas. Por exemplo, em algumas realizações, os métodos revelados neste documento são úteis para detecção e identificação de S. aureus tendo amostras de regiões de MREJ do tipo xxi tendo concentração de bactéria que está dentro das faixas fisiológicas (isto é, a concentração de bactéria em uma amostra coletada de um indivíduo infectado com a bactéria). Assim, a amostra pode ser diretamente selecionada sem a necessidade de isolamento, concentração ou expansão (por exemplo, cultura) da população bacteriana a fim de detectar a presença de SARM tendo ácidos nucleicos de MREJ do tipo xxi. Em várias realizações, os métodos revelados neste documento são capazes de detectar a presença de uma SARM tendo ácidos nucleicos de MREJ do tipo xxi de uma amostra que tem uma concentração de bactéria de cerca de 1 CFU/ml, 10 CFU/ml, 100 CFU/ml, 1x103 CFU/ml, 1x103 CFU/ml, cerca de 1x104 CFU/ml, cerca de 1x105 CFU/ml, ou cerca de 1x106 CFU/ml, ou qualquer número entre os mesmos.

[0080] Em algumas modalidades, os métodos descritos neste documento, os métodos incluem o desempenho de PCR ou qPCR a fim de gerar um amplicon. Numerosos protocolos PCR e qPCR diferentes são conhecidos na técnica e exemplificados neste documento abaixo e podem ser diretamente aplicados ou adaptados para uso utilizando as composições presentemente descritas para a detecção e/ou identificação de SARM tendo ácidos nucleicos de MREJ do tipo xxi em uma amostra.

[0081] Geralmente, em PCR, uma sequência de polinucleotídeo- alvo é amplificada por reação com pelo menos um iniciador de oligonucleotídeo ou par de iniciadores de oligonucleotídeo. O(s) iniciador(s) hibridizam especificamente para uma região complementar do ácido nucleico alvo e uma polimerase de DNA extende o(s) iniciador(s) para amplificar a sequência-alvo. Sob condições suficientes para fornecer produtos de amplificação de ácido nucleico baseado em polimerase, um fragmento de ácido nucleico de um tamanho domina os produtos reagentes (a sequência de polinucleotídeo-alvo que é o produto da amplificação). O ciclo de amplificação é repetido para aumentar a concentração da única sequência de polinucleotídeo alvo. A reação pode ser realizada em qualquer termociclador comumente usados para PCR. Entretanto, são preferidos cicladores com capacidades de medição de fluorescência em tempo real, por exemplo, SMARTCYCLER® (Cepheid, Sunnyvale, CA), ABI PRISM 7700® (Applied Biosystems, Foster City, CA), ROTOR-GENE™; (Corbett Research, Sydney, Austrália), LIGHTCYCLER® (Roche Diagnostics Corp, Indianápolis, IN), ICYCLER® (Biorad Laboratories, Hercules, CA) e MX4000® (Stratagene, La Jolla, CA).

[0082] Algumas realizações fornecem métodos incluindo PCR Quantitativo (qPCR) (também referido como PCR em tempo real). qPCR pode fornecer medições quantitativas e também fornecer os benefícios de tempo e contaminação reduzidos. Como usado neste documento “PCR quantitativo” (ou “qPCR em tempo real”) se refere ao monitoramente direto do progresso de uma amplificação de PCR quando está ocorrendo sem a necessidade de amostragem repetida dos produtos reagentes. Em qPCR, os produtos reagentes podem ser monitorados por meio de um mecanismo de sinalização (por exemplo, fluorescência), à medida que eles são gerados e são rastreados após o sinal subir acima de um nível de fundo, mas antes da reação alcançar um platô. O número de ciclos requeridos para alcançar um nível detectável ou “de limiar” de fluorescência (referida neste documento como um limiar de ciclo ou “CT”) varia diretamente com a concentração de alvos amplificáveis no início do processo de PCR, permitindo uma medição de intensidade de sinal para fornecer uma medida da quantidade de ácido nucleico alvo em uma amostra em tempo real.

[0083] Os métodos para configurar PCR e qPCR são bem conhecidos daqueles versados na técnica. A mistura reagente compreende minimamente o ácido nucleico modelo (por exemplo, como presente nas amostras de teste, exceto no caso de um controle negativo, como descrito abaixo) e iniciadores e/ou sondas de oligonucleotídeo em combinação com tampões, sais e semelhantes apropriados e uma concentração apropriada de uma polimerase de ácido nucleico. Como usado neste documento, “polimerase de ácido nucleico” se refere a uma enzima que catalisa a polimerização de nucleosídeos trifosfatos. Geralmente, a enzima iniciará a síntese na extremidade 3’ do iniciador annealed à sequência-alvo e procederá na direção 5’ juntamente com o modelo até que a síntese termine. Uma concentração apropriada inclui uma que catalise essa reação nos métodos presentemente descritos. Polimerases de DNA conhecidas úteis nos métodos revelados neste documento incluem, por exemplo, Polimerase de DNA I de E. coli, Polimerase de DNA T7, Polimerase de DNA de Thermus thermophilics (Tth), Polimerase de DNA de Bacillus stearothermophilus, Polimerase de DNA de Thermococcus litoralis, Polimerase de DNA Thermus aquaticus (Taq) e Polimerase de DNA de Pyrococcus furiosus (Pfu), Polimerase de DNA Taq FASTSTART™, Polimerase de DNA APTATAQ™ (Roche), Polimerase de DNA KLENTAQ 1™ (AB peptides Inc.), Polimerase de DNA HOTGOLDSTAR™ (Eurogentec), Polimerase de DNA HotStart KAPATAQ™, Polimerase de DNA Fast HotStart KAPA2G™ (Kapa Biosystemss), Polimerase de DNA HotStart PHUSION™ (Finnzymes), ou semelhantes.

[0084] Além dos componentes acima, a mistura reagente dos presentes métodos inclui iniciadores, sondas e desoxirribonucleosídeo trifosfatos (dNTPs).

[0085] Normalmente a mistura reagente compreenderá ainda quatro tipos diferentes de dNTPs correspondendo às quatro bases nucleosídeos naturais, isto é, dATP, dTTP, dCTP e dGTP. Nos métodos da invenção, cada dNTP estará tipicamente presente em uma quantidade variando de cerca de 10 a 5000 μM, normalmente de cerca de 20 a 1000 μM, cerca de 100 a 800 μM ou cerca de 300 a 600 μM.

[0086] A mistura reagente pode ainda incluir um meio tampão aquoso que inclui uma fonte de íons monovalentes, uma fonte de cátions divalentes e um agente tamponador. Qualquer fonte conveniente de íons monovalentes, tais como cloreto de potássio, acetato de potássio, acetato de amônio, glutamato de potássio, cloreto de amônio, sulfato de amônio e semelhantes podem ser empregados. O cátion divalente pode ser magnésio, manganês, zinco e semelhantes, onde o cátion será tipicamente magnésio. Qualquer fonte conveniente de cátion de magnésio pode ser empregada, incluindo cloreto de magnésio, acetato de magnésio e semelhantes. A quantidade de magnésio presente no tampão pode variar de 0,5 a 10 mM e pode variar de cerca de 1 a cerca de 6 mM, ou cerca de 3 a cerca de 5 mM. Agentes tamponadores ou sais representativos que podem estar presentes no tampão incluem Tris, Tricina, HEPES, MOPS e semelhantes, onde a quantidade de agente tamponador variará tipicamente de cerca de 5 a 150 mM, normalmente de cerca de 10 a 100 mM e mais comumente de cerca de 20 a 50 mM, onde, em certas realizações preferidas, o agente tamponador estará presente em uma quantidade suficiente para proporcionar uma variação de pH de cerca de 6,0 a 9,5, por exemplo, cerca de pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0 ou 9,5. Outros agentes que podem estar presentes no meio de tampão incluem agentes quelantes, tais como EDTA, EGTA e semelhantes. Em algumas realizações, a mistura reagente pode incluir BSA ou semelhantes. Além disso, em algumas modalidades, as reações podem incluir um crioprotetor, tal como trehalose, particularmente, quando os reagentes são fornecidos como uma mistura mestre, que pode ser armazenada com o tempo.

[0087] No preparo de uma mistura reagente, os vários componentes constituintes podem ser combinados em qualquer ordem conveniente. Por exemplo, o tampão pode ser combinado com iniciador, polimerase e depois ácido nucleico modelo, ou todos os vários componentes constituintes podem ser combinados ao mesmo tempo, para produzir a mistura reagente.

[0088] Alternativamente, reagentes pré-misturados comercialmente disponíveis podem ser utilizados nos métodos revelados neste documento, de acordo com as instruções do fabricante, ou modificados para melhorar as condições de reação (por exemplo, modificação de concentração de tampão, concentração de cátion, ou concentração de dNTP, conforme necessário), incluindo, por exemplo, Mistura Mestre de PCR Universal TAQMAN® (Applied Biosystems), OMNIMIX® ou SMARTMIX® (Cepheid), IQ™ Supermix (Bio-Rad Laboratories), LIGHTCYCLER® FastStart (Roche Applied Science, Indianápolis, IN), ou Mistura Mestre QPCR BRILLIANT® (Stratagene, La Jolla, CA).

[0089] A mistura reagente pode ser submetida a condições reagentes de extensão de iniciador (“condições suficientes para fornecer produtos de amplificação de ácido nucleico baseado em polimerase”), isto é, condições que permitem a extensão do iniciador mediado por polimerase através da adição de nucleotídeos na extremidade da molécula de iniciador usando o filamento modelo como um modelo. Em muitas realizações, as condições reagentes de extensão de iniciador são condições de amplificação, condições as quais incluem uma pluralidade de ciclos de reação, onde cada ciclo de reação compreende: (1) uma etapa de desnaturação, (2) uma etapa de hibridação e (3) uma etapa de polimerização. Como discutido acima, em algumas realizações, o protocolo de amplificação não inclui um momento específico dedicado à hibridação, e, ao invés disso, compreende apenas momentos específicos dedicados à desnaturação e extensão. O número de ciclos de reação irá variar dependendo da aplicação sendo realizada, mas normalmente será pelo menos 15, mais normalmente, pelo menos 20 e pode ser tão alto quanto 60 ou maior, onde o número de ciclos diferentes variará tipicamente de cerca de 20 a 40. Para métodos onde mais do que cerca de 25, normalmente mais do que cerca de 30 ciclos são realizados, pode ser conveniente ou desejável introduzir polimerase adicional na mistura reagente, tal que condições apropriadas para extensão de iniciador enzimático são mantidas.

[0090] A etapa de desnaturação compreende o aquecimento da mistura reagente para uma temperatura elevada para qualquer ácido nucleico de filamento duplo ou hibridizado presente na mistura reagente para dissociar. Para desnaturação, a temperatura da mistura reagente será normalmente elevada para e mantida em, uma temperatura variando de cerca de 85 a 100 °C, normalmente de cerca de 90 a 98 °C, mais normalmente de cerca de 93 a 96 °C, por um período de tempo variando de cerca de 3 a 120 segs, normalmente de cerca de 3 seg.

[0091] Seguindo à desnaturação, a mistura reagente pode ser submetida a condições suficientes para hibridação de iniciador para ácido nucleico modelo presente na mistura (se presente) e para polimerização de nucleotídeos para as extremidades do iniciador de uma forma tal que o iniciador é estendido em uma direção 5’ a 3’, usando o ácido nucleico ao qual é hibridizado como um modelo, isto é, condições suficientes para produção enzimática de um produto de extensão de iniciador. Em algumas realizações, os processos de hibridação e extensão ocorrem na mesma etapa. A temperatura para a qual a mistura reagente é diminuída para alcançar estas condições será normalmente escolhida para fornecer eficiência e especificidade ótimas e variará geralmente de cerca de 50 a 85 °C, normalmente de cerca de 55 a 70 °C e mais normalmente de cerca de 60 a 68 °C. Em algumas realizações, as condições de hibridação podem ser mantidas por um período de tempo variando de cerca de 15 segs. a 30 minutos, normalmente 20 segundos a 5 minutos, ou cerca de 30 segundos a 1 minuto ou cerca de 30 segundos.

[0092] Essa etapa pode opcionalmente compreender uma de cada de uma etapa de hibridação e uma etapa de extensão com variação e otimização da temperatura e comprimento de tempo para cada etapa. Em uma hibridação e extensão de duas etapas, a etapa de hibridação é permitida prosseguir como acima. Segundo à hibridação do iniciador para ácido nucleico modelo, a mistura reagente será adicionalmente submetida a condições suficientes para fornecer polimerização de nucleotídeos às extremidades do iniciador, como acima. Para alcançar as condições de polimerização, a temperatura da mistura reagente será tipicamente elevada para ou mantida em uma temperatura variando de cerca de 65 a 75 °C, normalmente de cerca de 67 a 73 °C e mantida por um período de tempo variando de cerca de 15 segundos a 20 minutos, normalmente de cerca de 30 segundos a 5 minutos. Em algumas realizações, os métodos revelados neste documento não incluem uma etapa de hibridação e extensão separada. Ao invés disso, os métodos incluem as etapas de desnaturação e extensão, sem qualquer etapa dedicada especificamente à hibridação.

[0093] Os ciclos de desnaturação, hibridação e extensão acima podem ser realizados usando um dispositivo automatizado, tipicamente conhecido como um termociclador. Termocicladores que podem ser empregados são descritos em algum outro lugar neste documento, bem como nas Patentes US 5.612.473; 5.602.756; 5.538.871; e 5.475.610; as revelações das quais são incorporadas neste documento por referência.

[0094] Os métodos descritos neste documento podem também ser usados em aplicações baseadas em não PCR, para detectar uma sequência de ácido nucleico alvo, onde tal alvo pode ser imobilizado em um suporte sólido. Métodos de imobilização de uma sequência de ácido nucleico em um suporte sólido são conhecidos na técnica e são descritos em Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing e Wiley-Interscience, NY) e em protocolos fornecidos pelos fabricantes, por exemplo, para membranas: Pall Corporation, Schleicher & Schuell; para esferas magnéticas: Dynal; para placas de cultura: Costar, Nalgenunc; para plataformas de conjunto ordenado de esferas: Luminex e Becton Dickinson; e, para outros suportes úteis de acordo com as modalidadesfornecidas neste documento, CPG, Inc.

[0095] Variações nas quantidades exatas dos vários reagentes e nas condições para o PCR ou outro procedimento de amplificação apropriado (por exemplo, condições de tampão, tempos de ciclo, etc.) que levam a amplificação ou resultados de detecção/quantificação similares são conhecidas daqueles de conhecimento na técnica e são consideradas como sendo equivalentes. Em uma realização, a detecção de qPCR em questão tem uma sensibilidade de detecção menor do que 50 cópias (preferencialmente, menor do que 25 cópias, com maior preferência menor do que 15 cópias, ainda com maior preferência menor do que 10 cópias, por exemplo, 5, 4, 3, 2, ou 1 cópia) de ácido nucleico (isto é, ácidos nucleicos de MREJ do tipo xxi) em uma amostra.

Controles

[0096] Os ensaios revelados neste documento podem opcionalmente incluir controles. Reações de PCR ou qPCR reveladas neste documento podem conter vários controles. Tais controles podem incluir um controle negativo “sem modelo”, em que os iniciadores, tampão, enzima(s) e outros reagentes necessários (por exemplo, MgCl2, nucleotídeos e semelhantes) são ciclados na ausência da amostra teste adicionada. Isso garante que os reagentes não sejam contaminados com polinucleotídeos que são reativos com os iniciadores e que produzem produtos de amplificação espúrios. Além de controles “sem modelo”, controles negativos podem também incluir reações de amplificação com ácido nucleico alvo não específico incluídos na reação ou podem ser amostras preparadas usando qualquer ou todas as etapas do preparo da amostra (da extração de ácido nucleico a preparo de amplificação) sem a adição de uma amostra teste (por exemplo, cada etapa usa ou nenhuma amostra de teste ou uma amostra conhecida como sendo livre de micro-organismos resistentes a carbapenemo).

[0097] Em algumas realizações, os métodos revelados neste documento podem incluir um controle positivo, por exemplo, para garantir que os métodos e reagentes estão funcionando como esperado. O controle positivo pode incluir alvo conhecido que não seja relacionado aos ácidos nucleicos de MREJ do tipo xxi revelados neste documento. Antes da amplificação, o ácido nucleico de controle positivo (por exemplo, na forma de um plasmídeo, que ou é linearizado, ou é não linearizado) pode ser adicionado à reação de amplificação. Uma única reação pode conter ou um modelo de controle positivo, um controle negativo ou um modelo de amostra, ou uma única reação pode conter tanto um modelo de amostra, quanto um controle positivo. Preferencialmente, o controle positivo compreenderá sequências que são substancialmente complementares aos iniciadores de amplificação forward e reverse de MREJ do tipo xxi derivados das sequências de MREJ do tipo xxi reveladas neste documento, tal que um par de iniciador de amplificação usado para amplificar sequências de MREJ do tipo xxi também amplificam os ácidos nucleicos de controle sob as mesmas condições de ensaio. Em algumas realizações, o amplicon gerado dos ácidos nucleicos modelo de controle positivo é maior do que o amplicon alvo. Preferencialmente, com exceção das sequências em um ácido nucleico de controle positivo que são complementares ou substancialmente complementares aos iniciadores forward e reverse, o ácido nucleico de controle positivo não compartilhará similaridade substancial com o amplicon-alvo/sequências de MREJ do tipo xxi revelados neste documento. Em outras palavras, fora dos iniciadores forward e reverse, o amplicon de controle positivo é preferencialmente menos do que 80%, menos do que 70%, menos do que 60%, menos do que 50%, menos do que 40%, menos do que 30%, menos do que 20% e mesmo com maior preferência, menos do que 10% idêntico ao polinucleotídeo de controle positivo, por exemplo, quando a identidade de sequência é comparada usando ferramentas NCBI BLAST ALIGN.

[0098] Controles positivos e/ou negativos podem ser usados no ajuste dos parâmetros dentro dos quais uma amostra de teste será classificada como tendo ou não tendo um SARM tendo sequências de MREJ do tipo xxi. Por exemplo, em uma reação de qPCR, o limiar de ciclo em que um amplicon é detectado em uma amostra de controle positivo pode ser usado para estabelecer o limiar para classificar uma amostra como “positiva” e o limiar de ciclo em que um amplicon é detectado em uma amostra de controle negativo pode ser usado para estabelecer o limiar para classificar uma amostra como “negativa”. O CT de uma única reação pode ser usado para cada controle, ou o mediano ou meio de amostras replicadas pode ser usado. Em ainda outra realização, valores de controle histórico podem ser usados. O nível mínimo de detecção para cada um dos controles negativo e positivo é tipicamente estabelecido na extremidade mais baixa do intervalo de confiança de 95% do meio CT através de múltiplas reações. Esse valor pode ser ajustado dependendo dos requisitos do ensaio de diagnóstico.

[0099] Preferencialmente, controles de PCR devem ser realizado ao mesmo tempo que a amostra teste, usando os mesmos reagentes, na mesma reação de amplificação.

[00100] Algumas realizações fornecem a determinação da identidade e/ou quantidade de produtos de amplificação alvos durante a reação de amplificação, por exemplo, em tempo real. Por exemplo, algumas realizações se referem à tomada de medidas de, por exemplo, sonda que é especificamente ligada aos ácidos nucleicos de amplicon alvos, e/ou amplicons de controle positivo (por exemplo, como indicado por fluorescência). Em algumas realizações, ao invés de usar sondas de oligonucleotídeos específicas de sequência, os métodos podem utilizar sondas específicas não sequência, que ligam não especificamente a ácido nucleico de filamento duplo, por exemplo, agentes de intercalação ou semelhantes. Agentes de intercalação têm uma fluorescência relativamente baixa quando desligados e uma fluorescência relativamente alta com a ligação a ácidos nucleicos de filamento duplo. Como tal, agentes de intercalação podem ser usados para monitorar o acúmulo de ácidos nucleicos de filamento duplo durante uma reação de amplificação de ácido nucleico. Exemplos de tais corantes não específicos incluem agentes de intercalação, tais como Verde SYBR I™ (Sondas Moleculares), iodeto de propídio, brometo de etídio, verde LC, SYTO9, corante fluorescente EVAGREEN®, CHROMOFY®, BEBO e semelhantes, que fluorescem e produzem um sinal detectável na presença de ácidos nucleicos de filamento duplo. As medições podem ser tomadas em um ponto especificado durante cada ciclo de uma reação de amplificação, por exemplo, após cada etapa de extensão (antes de cada etapa de desnaturação). Independente de se uma sonda de oligonucleotídeo específica de sequência ou uma sonda de oligonucleotídeo específica de não sequência ser usada, as medições das quantidades de sonda que são especificamente ligadas a ácidos nucleicos de amplicon alvos, e/ou amplicons de controle positivo podem ser tomadas continuamente por cada ciclo.

[00101] Alternativamente, em algumas realizações, a identidade/quantidade dos amplicons (por exemplo, alvo e/ou controle positivo) pode ser confirmada após a reação de amplificação ser completada, usando técnicas moleculares padrões, incluindo (por exemplo, técnica de southern blot, de dot blot e semelhantes.

EXEMPLOS

[00102] Os seguintes exemplos são fornecidos para demonstrar situações e ajustes particulares, em que essa tecnologia pode ser aplicada e não se destinam a restringir o escopo da invenção e as Reivindicações incluídas nesta revelação.

EXEMPLO 1: DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE SARM DE MREJ DO TIPO XXI DE AMOSTRAS CLÍNICAS

[00103] Uma reação de qPCR para detectar e identificar SARM tendo ácidos nucleicos de MREJ do tipo xxi é realizada. Amostras clínicas são coletadas de pacientes, usando Amies liquid swabs (Copan Diagnostics, Inc.).

[00104] DNA é opcionalmente isolado das amostras clínicas usando o kit BD GeneOhm™ Lysis (Becton Dickinson) de acordo com as instruções do fabricante. Uma amostra do DNA isolado é colocada em contato com iniciadores que hibridizam especificamente sob condições de amplificação padrões para sequências orfX específicas da espécie S. aureus e para sequências de extremidade direita polimórfica de MREJ do tipo xxi, isto é, 0,2-0,7 μM cada de SEQ ID Nos: 2 e 3. dNTPs 0,3 μM (Roche), MgCl2 4mM (SIGMA), 2,8 unidades de polimerase Taq FASTSTART® (Roche), Tris 100mM, pH 8,3 (EMD), KCl 10 mM (LaboratoireMat), 5 mM (NH4)2SO4, (SIGMA), 0,15 mg/mL de BSA (SIGMA), trehalose 4% (SIGMA). A reação também inclui sondas beacon moleculares que hibridizam especificamente para produtos de amplificação da junção de extremidade direita de MREJ do tipo xxi detectáveis e que incluem segmentos detectáveis detectáveis no aparelho BD MAX™ (Becton Dickinson), SMARTCYCLER® (Cepheid), ou outro aparelho configurado para PCR em tempo real em FAM, Vermelho Texas e canais Tet são adicionados à mistura reagente.

[00105] PCR é conduzido em um BD MAX™ (Becton Dickinson) ou SMARTCYCLER® (Cepheid), usando os mesmos parâmetros de ciclo, como se segue:

[00106] O limiar de ciclo (CT) em FAM, Vermelho Texas e canais TET é determinado usando o software BD MAX™ ou SMARTCYCLER®.

EXEMPLO 2: DETECÇÃO MULTIPLEX DE SARM DE MERJ DOS TIPOS I-XXI DE AMOSTRAS CLÍNICAS

[00107] Uma reação de amplificação multiplex é realizada para detectar a presença de SARM tendo qualquer de MREJ dos tipos i-vii, ix, xiii, xiv e xxi é realizada. Amostras clínicas são coletadas de pacientes usando Amies liquid swabs (Copan Diagnostics, Inc.).

[00108] DNA é opcionalmente isolado das amostras clínicas usando o kit BD GeneOhm™ Lysis (Becton Dickinson) de acordo com as instruções do fabricante. Uma amostra do DNA isolado é colocado em contato com iniciadores que hibridizam especificamente sob condições de amplificação padrões para sequências orfX específicas para a espécie S. aureus e para sequências de extremidade direita polimórfica de MREJ de tipo i-vii, ix, xiii, xiv e xxi e isto é, 0,2-0,7 μM cada das SEQ ID Nos: 2, 3, 39, 77 e 81, dNTPs 0,3 μM (Roche), MgCl2 4 mM (SIGMA), 2,8 unidades de polimerase FASTSTART® Taq (Roche), Tris 100 mM, pH 8,3 (EMD), KCl 10 mM (LaboratoireMat), (NH4)2SO4 5 mM (SIGMA), 0,15 mg/mL BSA (SIGMA) trehalose 4% (SIGMA). A reação também inclui sondas de sinais moleculares que hibridizam especificamente a produtos de amplificação da junção de extremidade direita do MREJ do tipo xxi detectável e que incluem segmentos detectáveis detectáveis no aparelho BD MAX™ (Becton Dickinson), SMARTCYCLER® (Cepheid), ou outro aparelho configurado para PCR em tempo real em FAM, Vermelho Texas e canais Tet são adicionados à mistura reagente, isto é, SEQ ID N°: 4.

[00109] PCR é conduzido em um BD MAX™ (Becton Dickinson) ou SMARTCYCLER® (Cepheid), usando os mesmos parâmetros de ciclo, como se segue:

[00110] O limiar de ciclo (CT) em FAM, Vermelho Texas e canais TET é determinado usando o software BD MAX™ ou SMARTCYCLER®. O CT é usado para determinar se SARM de qualquer de MREJ dos tipos i-vii, xvi, ix, xiii, xiv e xxi estão presentes.

EXEMPLO 3: SEQUÊNCIAS DE MREJ DO TIPO XXI SÃO ASSOCIASDA COM O HOMÓLOGO DE MECA, MECC

[00111] Amplificação PCR da região de MREJ do tipo xxi e o gene mecC foi realizado em 51 isolados de SARM isolados tanto de hospedeiros bovinos, quanto humanos.

[00112] Uma lista dos isolados é fornecida na tabela abaixo:

[00113] DNA foi isolado a partir das amostras clínicas acima conhecidas por abrigar mecC, usando kit BD GeneOhm™ Lysis (Becton Dickinson) de acordo com as instruções do fabricante. As reações de PCR foram preparadas como se segue: 0,2-0,7 μM cada das SEQ ID Nos: 182, 183 e 187, dNTPs 0,3 μM (Roche), MgCl2 4 mM (SIGMA), 2,8 unidades de polimerase FASTSTART® Taq (Roche), Tris 100 mM, pH 8,3 (EMD), KCl 10 mM (LaboratoireMat), (NH4)2SO4 5 mM (SIGMA), 0,15 mg/mL BSA (SIGMA) trehalose 4% (SIGMA).

[00114] As reações foram realizadas no sistema BD MAX®, usando o canal FAM.

[00115] Os dados indicam que 50 de 51 cepas de SARM que abrigaram o gene mecC contiveram uma sequência de MREJ do tipo xxi, fornecendo, assim, evidência de alta ubiquidade de detecção de cepas de SARM mecC usando a sequência de MREJ do tipo xxi.

[00116] Tendo geralmente descrito esta invenção, um entendimento adicional pode ser obtido por referência a certos exemplos específicos, que são fornecidos neste documento para fins de ilustração apenas e não se destinam a serem limitadores.

Claims

1. Composição Para Detectar Staphylococcus aureus Resistente a Meticilina (SARM), de junção de extremidade direita mec (MREJ) do tipo xxi, os ditos SARM MREJ do tipo xxi compreendendo um elemento de cassete cromossomo mec Staphylococcal (SCCmec) incluindo um homólogo a mecA (mecALGA251), sendo o dito cassete SCCmec inserido no DNA cromossômico de S. aureus, gerando uma sequência de junção de extremidade direita mec (MREJ) polimórfica do tipo xxi que consiste na SEQ ID NO: 1 que compreende sequências polimórficas da extremidade direita e DNA cromossômico adjacente à extremidade direita polimórfica, caracterizada por que a referida composição compreende: i) um primeiro iniciador de amplificação e um segundo iniciador de amplificação: o dito primeiro iniciador de amplificação tem de 15 a 45 nucleotídeos de comprimento, em que o dito primeiro iniciador de amplificação é complementar para nucleotídeos 149-774 de SEQ ID NO: 1 e o referido segundo iniciador de amplificação tem de 15 a 45 nucleotídeos de comprimento, em que o referido segundo iniciador de amplificação é complementar ao gene orfX de S. aureus e em que o referido primeiro e segundo iniciadores de amplificação juntos são um par de iniciadores direto e reverso orientado para ser capaz de gerar um amplicon específico para a junção da extremidade direita de MREJ do tipo xxi compreendendo a SEQ ID NO: 1, sob condições de PCR padrões na presença de MREJ do tipo xxi compreendendo a SEQ ID NO: 1 e ii) um ou mais iniciadores de amplificação adicionais de 15 a 45 nucleotídeos de comprimento, em que referidos um ou mais iniciadores de amplificação adicionais são complementares a uma ou mais sequências de extremidade direita SCCmec polimórficas a partir de uma sequência de MREJ tipo i a xx MRSA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 5 a 29.

2. Composição Para Detectar Staphylococcus aureus Resistente a Meticilina (SARM), de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por que compreende ainda uma sonda, em que a dita sonda tem de 15 a 45 nucleotídeos de comprimento e é complementar à sequência do gene orfX de S. aureus ou a sequência de nucleotídeos 149-774 da SEQ ID NO: 1 dentro do amplicon de MREJ do tipo xxi gerado pelo primeiro e segundo iniciadores sob condições de PCR padrões.

3. Composição Para Detectar Staphylococcus aureus Resistente a Meticilina (SARM), de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 2, caracterizada por que compreende ainda um par de iniciadores que é complementar a e é capaz de amplificação de uma sequência mecA dentro de SEQ ID NO: 156.

4. Composição Para Detectar Staphylococcus aureus Resistente a Meticilina (SARM), de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 3, caracterizada por que compreende ainda um par de iniciadores que é complementar a e é capaz de amplificação de uma sequência mecC dentro de SEQ ID NO: 157.

5. Composição Para Detectar Staphylococcus aureus Resistente a Meticilina (SARM), de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 4, caracterizada por que compreende ainda um par de iniciadores que é complementar a e é capaz de amplificação de uma sequência nuc dentro de SEQ ID NO: 158.

6. Composição Para Detectar Staphylococcus aureus Resistente a Meticilina (SARM), de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 5, caracterizada por que o primeiro iniciador de amplificação é da SEQ ID NO: 2.

7. Composição Para Detectar Staphylococcus aureus Resistente a Meticilina (SARM), de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 6, caracterizada por que o segundo iniciador de amplificação é da SEQ ID NO: 3.

8. Composição Para Detectar Staphylococcus aureus Resistente a Meticilina (SARM), de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 7, caracterizada por que compreende ainda uma sonda, em que a sonda é da SEQ ID NO: 4 ou 82.

9. Composição Para Detectar Staphylococcus aureus Resistente a Meticilina (SARM), de acordo com a Reivindicação 8, caracterizada por que a dita sonda compreende um segmento emissor de fluorescência e um segmento silenciador de fluorescência.

10. Composição Para Detectar Staphylococcus aureus Resistente a Meticilina (SARM), de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 9, caracterizada por que o primeiro e o segundo iniciadores de amplificação estão na forma liofilizada.

11. Método Para Detectar Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (SARM), de junção de extremidade direita mec (MREJ) do tipo xxi, compreendendo os ditos SARM MREJ do tipo xxi um elemento de cassete cromossomo mec Staphylococcal (SCCmec) incluindo um homólogo mecA (mecALGA251), sendo o dito cassete SCCmec inserido no DNA cromossômico de S. aureus, gerando uma sequência de junção de extremidade direita mec (MREJ) polimórfica do tipo xxi, compreendendo a SEQ ID NO:1 que compreende sequências polimórficas da extremidade direita e DNA cromossômico adjacente à extremidade direita polimórfica, caracterizado por que o referido método compreende: fornecer uma amostra de teste; contatar a amostra com um primeiro iniciador de amplificação de 15 a 45 nucleotídeos de comprimento e em que o dito primeiro iniciador de amplificação é complementar para nucleotídeos 149-774 da SEQ ID NO: 1; contatar a amostra com um segundo iniciador de amplificação de 15 a 45 nucleotídeos de comprimento, em que o dito segundo iniciador de amplificação é complementar para o gene orfX de S. aureus e em que os ditos primeiro e segundo iniciador de amplificação geram juntos um amplicon específico para a junção da extremidade direita de MREJ do tipo xxi, sob condições de PCR padrões na presença de MREJ do tipo xxi; e determinar se o amplicon de MREJ do tipo xxi é gerado seguindo à etapa de contato, ou ao contrário, em que a presença ou ausência do amplicon é indicativa da presença ou ausência, respectivamente, de SARM MREJ do tipo xxi na amostra e em que a referida etapa de contato compreende ainda o contato da amostra com um ou mais iniciadores de amplificação adicionais, em que referidos um ou mais iniciadores de amplificação adicionais têm 15 a 45 nucleotídeos de comprimento e em que referidos um ou mais iniciadores de amplificação adicionais são complementares a um ou sequência de extremidade direita SCCmec polimórfica de uma sequência de MREJ tipo i a xx de MRSA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 5 a 29.

12. Método Para Detectar Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (SARM), de acordo com a Reivindicação 11, caracterizado por que a dita etapa de contato compreende ainda o contato da amostra com um ou mais pares de iniciadores de amplificação adicionais, em que ditos um ou mais pares de iniciadores de amplificação adicionais são complementar para e é capaz de gerar um amplicon de sequências nuc dentro da SEQ ID NO: 158 sob condições de PCR padrões.

13. Método Para Detectar Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (SARM), de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 11 a 12, caracterizado por que a dita etapa de contato compreende realizar PCR multiplex.

14. Método Para Detectar Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (SARM), de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 11 a 13, caracterizado por que a dita etapa de contato compreende realizar PCR em tempo real.

15. Método Para Detectar Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (SARM), de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 11 a 14, caracterizado por que a dita etapa de contato compreende ainda o contato da amostra com um ou mais pares de iniciadores de amplificação adicionais, em que ditos um ou mais pares de iniciadores de amplificação adicionais são complementares e é(são) capaz(es) de gerar um amplicon de uma sequência mecA dentro da SEQ ID NO: 156 e/ou uma sequência mecC dentro da SEQ ID NO: 157 sob condições de PCR padrões.

16. Método Para Detectar Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (SARM), de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por que ditos um ou mais pares de iniciadores de amplificação adicionais são complementares a e são capazes de amplificar uma sequência mecA dentro da SEQ ID NO: 156.

17. Método Para Detectar Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (SARM), de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por que ditos um ou mais pares de iniciadores de amplificação adicionais são complementares a e são capazes de amplificar uma sequência mecC dentro da SEQ ID NO: 157.

18. Método Para Detectar Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (SARM), de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 11 a 17, caracterizado por que o primeiro iniciador de amplificação é da SEQ ID NO: 2.

19. Método Para Detectar Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (SARM), de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 11 a 18, caracterizado por que o segundo iniciador de amplificação é da SEQ ID NO: 3.

20. Método Para Detectar Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (SARM), de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 11 a 19, caracterizado por que a determinação compreende contatar a referida amostra de teste com uma sonda de 15 a 45 nucleotídeos de comprimento que é complementar à sequência do gene orfX de S. aureus ou a sequência de nucleotídeos 149-774 da SEQ ID NO: 1 que estão presentes no amplicon de ácidos nucleicos MREJ do tipo xxi.

21. Método Para Detectar Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (SARM), de acordo com a Reivindicação 20, caracterizado por que a sonda é da SEQ ID NO: 4 ou 82.

22. Método Para Detectar Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (SARM), de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 20 a 21, caracterizado por que a referida sonda compreende um segmento emissor de fluorescência e um segmento silenciador de fluorescência.