ES2426289T3 - Detección de Staphylococcus aureus e identificación de Staphylococcus aureus resistente a meticilina - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de detección específica de la presencia de una cepa de Staphylococcus aureus (S.aureus) y detección e identificación específica de una cepa de S. aureus resistente a meticilina de una muestraclínica en un único ensayo, que comprende poner en contacto dicha muestra con al menos un cebador y/o sonda de nuc de al menos 13 nucleótidos que sehibrida bajo condiciones rigurosas con una secuencia específica para S. aureus dentro de SEQ ID NO: 200 o elcomplemento de la misma; poner en contacto dicha muestra con al menos un cebador y/o sonda MREJ de al menos 13 nucleótidos que sehibrida bajo condiciones rigurosas con ácidos nucleicos de MREJ polimórficos dentro de al menos una de lassiguientes SEQ ID NOs específicas para MREJ: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 u 88, o el complementode las mismas, en el que el al menos un cebador y/o sonda se hibridan conjuntamente bajo condiciones rigurosascon secuencias de orfX específicas para especies de S. aureus y secuencias polimórficas de la extremidad derechade SCCmec; y detectar la presencia y/o cantidad de sonda(s) nuc y MREJ hibridadas como indicativa de la presencia y/o cantidadde S. aureus y MRSA en la muestra, respectivamente, o detectar la cantidad de un producto de amplificaciónproducido mediante hibridación de los cebadores nuc y MREJ con los ácidos nucleicos, como indicación de lapresencia y/o cantidad de S. aureus y MRSA, respectivamente, en el que dichas condiciones rigurosas comprenden MgCl2 4 mM, Tris 100 mM (pH 8,3), KCl 10 mM, (NH4)2SO4 5mM, 0,15 mg/ml de BSA, 4% de trehalosa a 59 ºC.

Description

Detección de Staphylococcus aureus e identificación de Staphylococcus aureus resistente a meticilina

5 LISTADO DE SECUENCIAS

[0001] La presente solicitud está siendo presentada junto con un listado de secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias se proporciona como un archivo titulado GENOM.072A.TXT, creado el 29 de noviembre de 2007, que tiene 124 KB de tamaño.

10 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Los miembros del género Staphylococcus son patógenos humanos importantes, causando una amplia variedad de infecciones intrahospitalarias y extrahospitalarias en el mundo. La especie positiva para coagulasa 15 Staphylococcus aureus está bien documentada como patógeno oportunista humano (Murray y col. Eds, 2003, Manual of Clinical Microbiology, 8ª ed., ASM Press, Washington, D.C.). Las infecciones nosocomiales producidas por

S. aureus son una causa importante de morbilidad y mortalidad. Algunas de las infecciones más comunes producidas por S. aureus implican la piel, e incluyen forúnculos o diviesos, celulitis, impétigo e infecciones por heridas posoperatorias en diversos sitios. Algunas de las infecciones más graves producidas por S. aureus son

20 bacteremia, neumonía, osteomielitis, endocarditis aguda, miocarditis, pericarditis, cerebritis, meningitis, dermatitis exfoliativa y diversos abscesos. El envenenamiento de los alimentos mediado por enterotoxinas estafilocócicas es otro síndrome importante asociado a S. aureus. El síndrome del choque tóxico, una enfermedad extrahospitalaria, también se ha atribuido a infección o colonización con S. aureus toxigénico.

25 [0003] Los estafilococos negativos para coagulasa se habían considerado comensales de la piel inofensivos antes de los años 70; sin embargo, ahora se reconocen como una causa importante de infecciones humanas (Kloos y col. (2004) Clin. Microbiol. Rev. 7:117-140). Además de estar entre las bacterias más frecuentemente aisladas en laboratorios de microbiología clínica, los estafilococos negativos para coagulasa sirven de depósitos de determinantes de resistencia antimicrobiana (Bastos y col. (1999) Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 18:393-398).

30 Como tal, es importante caracterizar y distinguir cepas de S. aureus de otros estafilococos negativos para coagulasa.

[0004] Las cepas de S. aureus producen una nucleasa termoestable extracelular (TNasa termoestable) con una frecuencia similar a la que producen coagulasa. La secuencia del gen que codifica TNasa, nuc, se desveló por primera vez en 1985 (Kovacevi y col. (1985), J. Bact. 162:521-528). La TNasa es una proteína de 17 kDa que 35 degrada tanto ARN como ADN a temperaturas de hasta 100 ºC. La actividad de TNasa no es específica para S. aureus, sin embargo, existen secuencias específicas para especies de S. aureus. Véanse, por ejemplo, Brackstad y col. (1992), J. Clin. Microbiol. 30:1654-1660; Zhang y col. (2004), J. Clin. Microbiol. 42:4947-4955; Chesneau y col. (1993) Mol. Cell Probes 7:301-310, Wilson y col. (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57:1793-1798; Poulsen y col., (2003) J. Antimicrob. Chemo. 51:419-421, Costa y col., (2005), Diag. Microbiol. and Infect. Dis, 51: 13-17, Shittu y

40 col., (2006), Diagn Microbiol Infect Dis. 17 de julio de 2006. Hasta la fecha, ninguna de las secuencias de nuc específicas para S. aureus ha demostrado ser clínicamente útil a modo de un gran estudio de especificidad. Por tanto, existe una necesidad de oligonucleótidos que hayan demostrado ser tanto altamente específicos como sensibles, que sean útiles en la rápida detección e identificación de S. aureus de muestras clínicas.

45 [0005] Tanto S. aureus como los estafilococos negativos para coagulasa tienen una capacidad sorprendente para acumular determinantes resistentes a antibióticos adicionales, produciendo la formación de cepas resistentes a múltiples fármacos. Esta resistencia limita las opciones terapéuticas para el tratamiento y sustancialmente aumenta la morbilidad y mortalidad del paciente. S. aureus resistente a meticilina (MRSA) emergió en los años 80 como un problema clínico y epidemiológico importante en los hospitales (Oliveira y col., (2002) Lancet Infect Dis. 2:180-189).

50 MRSA son resistentes a todas las �-lactamas que incluyen penicilinas, cefalosporinas, carbapenémicos y monobactámicos, que son los antibióticos más comúnmente usados para curar infecciones por S. aureus. Las infecciones por MRSA solo pueden tratarse con antibióticos más tóxicos y más costosos que se usan normalmente como última línea de defensa. Como MRSA puede propagarse fácilmente de paciente a paciente mediante el personal, los hospitales en el mundo se enfrentan al problema de controlar MRSA.

55 [0006] La resistencia a meticilina en S. aureus es única porque es debida a la adquisición de ADN de otros estafilococos negativos para coagulasa (CNS), que codifican una proteína de unión a penicilina (PBP) resistente a �lactama supernumeraria que asume las funciones biosintéticas de las PBP normales cuando la célula se expone a antibióticos de �-lactama. S. aureus normalmente contiene cuatro PBP, de las que PBP 1, 2 y 3 son esenciales. La PBP de baja afinidad en MRSA, llamada PBP 2a (o PBP2'), está codificada por el gen mecA cromosómico y sirve de transpeptidasa resistente a -lactama. El gen mecA está ausente de S. aureus sensible a penicilina, pero está ampliamente distribuido entre otras especies de estafilococos y está altamente conservado (Ubukata y col., (1990) Antimicrob. Agents Chemother. 34:170-172).

5 [0007] La determinación de la secuencia de nucleótidos de la región de ADN que rodea el gen mecA de la cepa N315 de S. aureus (aislada en Japón en 1982) condujo al descubrimiento de que el gen mecA es llevado por un novedosos elemento genético, designado cromosoma en casete estafilocócico mec (SCCmec), que se inserta en el cromosoma. SCCmec es un elemento genético móvil caracterizado por la presencia de repeticiones invertidas y

10 directas terminales, un conjunto de genes recombinasa específicos para sitio (ccrA y ccrB) y el complejo del gen mecA (Ito y col., (1999) Antimicrob. Agents Chemother. 43:1449-1458; Katayama y col., (2000) Antimicrob. Agents Chemother. 44:1549-1555). SCCmec se escinde precisamente del cromosoma de la cepa N315 de S. aureus y se integra en un sitio cromosómico de S. aureus específico en la misma orientación mediante recombinasas codificadas por los genes ccrA y ccrB. La clonación y el análisis de secuencias del ADN que rodean el gen mecA de las cepas

15 de MRSA NCTC 10442 (la primera cepa de MRSA aislada en Inglaterra en 1961) y 85/2082 (una cepa de Nueva Zelanda aislada en 1985) condujo al descubrimiento de dos elementos genéticos novedosos que compartieron características estructurales similares de SCCmec. Los tres SCCmec se han designado tipo I (NCTC 10442), tipo II (N315) y tipo III (85/2082) basándose en el año de aislamiento de las cepas (Ito y col., (2001) Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-1336). Hiramatsu y col. han encontrado que los ADN de SCCmec están integrados en un sitio

20 específico en el cromosoma de S. aureus sensible a meticilina (MSSA). Se analizaron la secuencia de nucleótidos de las regiones que rodean los límites derecho e izquierdo de ADN de SCCmec (es decir, attL y attR, respectivamente), además de aquellas de las regiones alrededor del sitio de integración de ADN de SCCmec (es decir, attBscc que es el sitio de unión a cromosoma bacteriano para ADN de SCCmec). El análisis de secuencias de los sitios attL, attR y attBscc revelaron que attbscc se localiza en el extremo 3' de un marco de lectura abierto (ORF)

25 novedoso, orfX. orfX codifica un polipéptido putativo de 159 aminoácidos que presenta homología de secuencias con algunos polipéptidos previamente identificados de función desconocida (Ito y col., (1999) Antimicrob. Agents Chemother. 43:1449-1458). Dos nuevos tipos de SCCmec, designados tipo IV y tipo V, se describieron recientemente (Ma y col., (2002) Antimicrob. Agents Chemother. 46:1147-1152, Ito y col., (2004) Antimicrob Agents Chemother. 48:2637-2651, Oliveira y col., (2001) Microb. Drug Resist. 7:349-360). Oliveira y col. también informaron

30 recientemente de la existencia de tipo VI de SCCmec. Oliveira y col., (2006), Antimicrob Agents Chemother. 50:3457-3459. Se ha determinado la secuencia de la extremidad derecha de algunas cepas de Staphylococcus clasificadas como tipo IV de SCCmec. Véanse Ma y col., (2002) Antimicrob. Agents Chemother. 46:1147-1152; Ito y col., (2001) Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-1336; Oliveira y col., (2001) Microb. Drug Resist. 7:349-360. Secuencias de las cepas de S. aureus CA05 y 8/6-3P, clasificadas como tipo IV de SCCmec, fueron casi idénticas

35 en 2000 nucleótidos con la de SCCmec de tipo II de la cepa N315 de S. aureus (Ma y col., (2002) Antimicrob. Agents Chemother. 46:1147-1152; Ito y col., (2001) Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-1336).

[0008] Se han descrito procedimientos para detectar e identificar MRSA basado en la detección del gen mecA y secuencias cromosómicas específicas para S. aureus. Véanse Schuenck y col., Res. Microbiol., (2006), en prensa, 40 Shittu y col., (2006), Diagn Microbiol Infect Dis. 17 de julio, Grisold y col., (2006), Methods Mol. Biol, 345: 79-89, Costa y col., (2005), Diag. Microbiol. and Infect. Dis, 51: 13-17, Mc Donald y col., (2005), J. Clin. Microbiol., 43: 61476149, Zhang y col., (2005), J. Clin. Microbiol. 43: 5026-5033, Hagen y col. (2005), Int J Med Microbiol. 295:77-86, Maes y col. (2002) J. Clin. Microbiol. 40:1514-1517, Saito y col., (1995) J. Clin. Microbiol. 33:2498-2500; Ubukata y col., (1992) J. Clin. Microbiol. 30:1728-1733; Murakami y col., (1991) J. Clin. Microbiol. 29:2240-2244; Hiramatsu y

45 col., (1992) Microbiol. Immunol. 36:445-453). Además, Levi y Towner (2003), J. Clin. Microbiol., 41:3890-3892 y Poulsen y col. (2003), J Antimicrob Chemother., 51:419-421 describen la detección de resistencia a meticilina en estafilococos negativos para coagulasa y en S. aureus usando el kit de detección de MRSA EVIGENE™.

[0009] Sin embargo, debido a que el gen mecA está ampliamente distribuido en tanto S. aureus como

50 estafilococos negativos para coagulasa, cada uno de los procedimientos descritos anteriormente son incapaces de discriminar entre muestras que contienen tanto S. aureus sensible a meticilina (“MSSA”) como estafilococos negativos para coagulasa resistentes a meticilina, y muestras que contienen solo MRSA o que tienen tanto S. aureus como MRSA sensible a meticilina.

55 [0010] Para tratar este problema, Hiramatsu y col. desarrollaron un ensayo basado en PCR específico para MRSA que utiliza cebadores que se hibridan con las extremidades derechas de ADN de los tipos I-III de SCCmec en combinación con cebadores específicos para el cromosoma de S. aureus, que se corresponde con la secuencia de nucleótidos en el lado derecho del sitio de integración de SCCmec (patente de EE.UU. 6.156.507, en lo sucesivo la “patente '507”). Más recientemente, Zhang y col., (2005), J. Clin. Microbiol. 43: 5026-5033, describieron un ensayo de múltiplex para subtipar MRSA de tipos I a V de SCCmec. Las secuencias de nucleótidos que rodean el sitio de integración de SCCmec en otras especies estafilocócicas (por ejemplo, S. epidermidis y S. haemolyticus) son diferentes de aquellas encontradas en S. aureus; por tanto, ensayos de PCR múltiplex que utilizan oligonucleótidos que se hibridan con las extremidades derechas de SCCmec y el cromosoma de S. aureus tienen la ventaja de ser

5 específicos para la detección de MRSA.

[0011] El ensayo de PCR descrito en la patente '507 también condujo al desarrollo de “tipado de MREP” (polimorfismo de la extremidad derecha de mec, de mec right extremity polymorphism) de ADN de SCCmec (Ito y col., (2001) Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-1336; Hiramatsu y col., (1996) J. Infect. Chemother. 2:117-129). 10 El procedimiento de tipado de MREP se aprovecha del hecho de que las secuencias de nucleótidos de los tres tipos de MREP se diferencian en la extremidad derecha de ADN de SCCmec adyacente al sitio de integración entre los tres tipos de SCCmec. En comparación con el tipo I, el tipo III tiene una única secuencia de nucleótidos mientras que el tipo II tiene una inserción de 102 nucleótidos en el extremo derecho de SCCmec. El procedimiento de tipado de MREP descrito por Hiramatsu y col. usa la siguiente nomenclatura: tipo I de SCCmec es tipo i de MREP, tipo II de

15 SCCmec es tipo ii de MREP y tipo III de SCCmec es tipo iii de MREP. Hiramatsu después revisó esta nomenclatura en vista de la publicación de las secuencias de los genomas de las cepas N315 y Mu50, ya que las secuencias revelaron que los elementos de SCCmec se localizan en la dirección 3' de orfX. Por consiguiente, MREP puede ahora denominarse MLEP (polimorfismo de la extremidad izquierda de mec) (Chongtrakool y col., (2006), Antimicrob. Agents Chemother. 50:1001-1012).

20 [0012] Recientemente, Chongtrakool y col. propusieron sustituir la nomenclatura de SCCmec con nomenclatura nueva. Chongtrakool y col., (2006), Antimicrob. Agents Chemother. 50:1001-1012. La nomenclatura propuesta por Chongtrakool y col. se basa en la estructura de elementos de SCCmec y tiene tres características. La primera característica es una descripción del tipo de SCC y se define por tipo de ccr y clase de mec. La segunda

25 característica es la descripción de las regiones J (regiones junkyard), que son parte del elemento de SCCmec, localizadas entre y alrededor de los complejos de mec y ccr. La tercera característica es la enumeración que permite la numeración de tipo ccr y regiones J según su momento de identificación.

[0013] Como se ha establecido anteriormente, los tipos II y IV de SCCmec tienen la misma secuencia de

30 nucleótidos para la extremidad derecha. Por consiguiente, el procedimiento de tipado de MREP (o MLEP según la reciente revisión) descrito anteriormente no puede diferenciar el tipo IV de SCCmec descrito por Hiramatsu y col. (Ma y col., (2002) Antimicrob. Agents Chemother. 46:1147-1152) del tipo III de SCCmec.

[0014] Los presentes inventores describieron recientemente secuencias de ADN y regiones en MRSA

35 llamadas MREJ. Solicitud PCT nº PCT/CA02/00824. El término MREJ se refiere al empalme de la extremidad derecha de mec «empalme de la extremidad derecha de mec, de mec extremity right junction». MREJ tiene aproximadamente 1 kilobase (kb) de longitud e incluye secuencias de la extremidad derecha de SCCmec, además de ADN cromosómico bacteriano a la derecha del sitio de integración de SCCmec. Y, lo que es más importante, las secuencias de MREJ proporcionan ventajas con respecto a secuencias de MREP/MLEP en la clasificación de MRSA

40 en la que secuencias de MREJ/MLEJ permiten la diferenciación entre cepas clasificadas como tipo II de SCCmec y tipo IV de SCCmec. Como se ha tratado en la solicitud PCT nº PCT/CA02/00824, las cepas que Hiramatsu clasificó como tipo i-iii de MREP se encuentran bajo los tipos i-iii de MREJ según el sistema de tipado de MREJ. Los presentes inventores identificaron recientemente tipos iv-xx de MREJ novedosos, y desarrollaron ensayos de ácido nucleico con ubicuidad mejorada que pueden detectar e identificar MRSA de tipos i-xx de MREJ (Huletsky y col.,

45 2004, J Clin. Microbiol. 42:1875-1884, solicitud de patente internacional PCT/CA02/00824, solicitud de patente de EE.UU. nº 11/248.438). Basándose en la revisión de MREP para MLEP, puede entenderse que tipos de MREJ previamente nombrados podrían ahora reclasificarse como MLEJ (empalme de la extremidad izquierda de mec). El experto apreciará que cualquier sistema de clasificación de S. aureus y MRSA se contempla en los procedimientos desvelados en el presente documento, ya que las secuencias pueden detectar específicamente S. aureus e

50 identificar aquellas que son resistentes a meticilina.

[0015] Maes y col. describen un ensayo de PCR para discriminar S. aureus de estafilococos negativos para coagulasa y para determinar resistencia a meticilina en cultivos de sangre (Maes y col. (2002) J. Clin. Microbiol. 40:1514-1517). El ensayo descrito en Maes y col. no puede distinguir MRSA de estafilococos negativos para

55 coagulasa resistentes a meticilina.

[0016] Poulsen y col. describen la detección de resistencia a meticilina en estafilococos negativos para coagulasa y en S. aureus usando el kit de detección de MRSA EVIGENE™. El ensayo descrito en Poulsen y col. no puede discriminar entre una muestra que tiene tanto S. aureus sensible a meticilina como estafilococos negativos para coagulasa resistentes a meticilina, y una muestra que contiene solo MRSA o que tiene tanto S. aureus como MRSA sensible a meticilina.

[0017] Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad de un rápido ensayo para detectar e identificar tanto 5 MRSA como S. aureus sensible a meticilina en la misma reacción y que pueda distinguir S. aureus de estafilococos negativos para coagulasa en la misma reacción.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

10 [0018] En el presente documento se desvelan procedimientos y composiciones para detectar específicamente la presencia de una cepa de Staphylococcus aureus (S. aureus) y detectar la presencia de una cepa de S. aureus resistente a meticilina (MRSA) de una muestra clínica en un único ensayo. En el presente documento también se proporcionan procedimientos y composiciones para la detección específica de S. aureus de una muestra.

15 [0019] Algunas realizaciones se refieren a procedimientos de detección de S. aureus e identificación de la presencia de MRSA de una muestra que incluye ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, la muestra puede ponerse en contacto con al menos un cebador y o sonda de al menos 10 nucleótidos que se hibrida bajo condiciones rigurosas con una secuencia específica para S. aureus del gen nuc, y al menos un cebador y/o sonda específico para una cepa de MRSA. Cepas de S. aureus se convierten en resistentes a meticilina debido a la presencia de un

20 casete de SCCmec que contiene un gen mecA que se inserta en ácidos nucleicos bacterianos. La inserción del casete de SCCmec puede generar un empalme de la extremidad derecha (MREJ) polimórfico. El (Los) cebador(es) y/o sonda(s) específico(s) para MRSA pueden hibridarse bajo condiciones rigurosas con ácidos nucleicos de MREJ polimórficos que incluyen, por ejemplo, tipos i a xx de MREJ. Los cebadores específicos para S. aureus y específicos para MRSA se hibridan en condiciones de, por ejemplo, MgCl2 4 mM, Tris 100 mM (pH 8,3), KCI 10 mM y (NH4)2SO4

25 5 mM a 59 ºC. La presencia y/o cantidad de sonda(s) hibridada(s), o productos de amplificación producidos mediante hibridación de los cebadores con los ácidos nucleicos, puede usarse como indicación de la presencia y/o cantidad de S. aureus (MSSA y MRSA) y MRSA en la muestra.

[0020] El al menos un cebador específico para una cepa de S. aureus puede hibridarse bajo condiciones

30 rigurosas con SEQ ID NO: 200, el complemento de la misma o cualquier secuencia que se diferencie de SEQ ID NO: 200 por 1 a 20 nucleótidos.

[0021] En algunas realizaciones, el al menos un cebador y/o sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia de nuc específica para S. aureus se hibrida bajo condiciones rigurosas con una de las siguientes

35 SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12, o el complemento de las mismas. Preferentemente, el al menos un cebador y/o sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia de nuc específica para S. aureus comprende, consiste esencialmente en o consiste en una de las siguientes SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12.

40 [0022] En realizaciones preferidas, el (los) cebador(es) y/o sonda(s) específico(s) para S. aureus tienen al menos 10 nucleótidos de longitud, y se hibridan bajo condiciones rigurosas con el ácido nucleico de una cualquiera de SEQ ID NOs: 1 a 12, o el complemento de las mismas

[0023] En realizaciones todavía más preferidas, la muestra también se pone en contacto con una sonda que

45 se hibrida bajo condiciones rigurosas con el ácido nucleico de una cualquiera de SEQ ID NOs: 9, 10, 11 ó 12, o el complemento de las mismas. En algunas realizaciones, la sonda es una sonda fluorescible molecular. Preferentemente, la sonda comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de SEQ ID NOs: 9, 10, 11 ó 12.

50 [0024] En algunas realizaciones, el procedimiento también incluye añadir ADN de control interno a la muestra, y al menos un cebador y/o sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con el ADN de control interno. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el control interno puede ser un plásmido de 4,23 kb linealizado purificado de E. coli. El control interno puede usarse para monitorizar la presencia de sustancias inhibidoras procedentes de un espécimen.

55 [0025] El al menos un cebador específico para una cepa de MRSA puede hibridarse bajo condiciones rigurosas con las secuencias de MREJ de tipos i a xx, como se define en una cualquiera de SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78,

79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 y 88, el complemento de las mismas o cualquier secuencia que se diferencie de SEQ ID NOs 14 a 88 por 1 a 20 nucleótidos.

[0026] En realizaciones preferidas, cebadores y/o sondas específicos para S. aureus y específicos para 5 MRSA se eligen para hibridarse con los ácidos nucleicos de muestra bajo las mismas condiciones de hibridación. En realizaciones más preferidas, el (los) cebador(es) y/o sonda(s) se disponen en conjunto en el mismo recinto físico.

[0027] En realizaciones preferidas, el (los) cebador(es) y/o sonda(s) específico(s) para MRSA tienen al menos 10 nucleótidos de longitud, y se hibridan bajo condiciones rigurosas con el ácido nucleico de una cualquiera de SEQ 10 ID NOs: 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 15, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 201 (tipos i-ix), 182, 183, 184, 195, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 196, 197, 198 (tipos x-xx) o 199, o 15 el complemento de las mismas. Preferentemente, el (los) cebador(es) y/o sonda(s) específico(s) para MRSA comprenden, consisten esencialmente en o consisten en el ácido nucleico de una cualquiera de SEQ ID NOs: 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 15, 156, 157, 158, 159, 160, 20 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 201 (tipos iix), 182, 183, 184, 195, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 196, 197 (tipos xi-xx) o 199. En algunas realizaciones, cebadores específicos para MRSA también incluyen un oligonucleótido que se hibrida bajo condición rigurosa con orf22 del cromosoma de S. aureus, en el que el cebador puede usarse en una reacción de amplificación con SEQ ID NO: 197 para detectar tipo x de MREJ. En realizaciones más preferidas, el (los) cebador(es) y/o 25 sonda(s) específico(s) para MRSA se hibridan bajo condiciones rigurosas con el ácido nucleico de una cualquiera de SEQ ID NOs: 99, 199, 144, 150, 155 y 163, o el complemento de las mismas, tal como un cebador y/o sonda que comprende, consiste esencialmente en o consiste en el ácido nucleico de una cualquiera de SEQ ID NOs: 99, 199, 144, 150, 155 y 163. En realizaciones todavía más preferidas, la muestra también se pone en contacto con una sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con el ácido nucleico de una cualquiera de SEQ ID NOs: 126, 128,

30 130 y 131, o el complemento de las mismas. En algunas realizaciones, la sonda es una sonda fluorescible molecular. Preferentemente, la sonda comprende, consiste esencialmente en o consiste en el ácido nucleico de una cualquiera de SEQ ID NOs: 126, 128, 130 y 131.

[0028] En algunas realizaciones, la muestra y cebador(es) y/o sonda(s) descritos anteriormente se usan en

35 una reacción de amplificación tal como una PCR, LCR, NABSA, 3SR, SDA, ADNr, TMA, CPT, SPA, NDSA, amplificación por círculo rodante, amplificación por desplazamiento de cadenas ancladas, amplificación por círculo rodante (inmovilizada) en fase sólida, o reacción de amplificación por Q beta replicasa.

[0029] Otros aspectos se refieren a la detección específica de una cepa de S. aureus en una muestra que

40 incluye ácidos nucleicos. Al menos se proporciona un cebador y/o sonda que es específico para el gen nuc de S. aureus. Los cebadores y/o sonda(s) incluyen un ácido nucleico que pueden hibridarse con al menos 11 nucleótidos consecutivos de uno cualquiera de los ácidos nucleicos de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12, o el complemento de las mismas, bajo condiciones rigurosas tales como KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), 0,1% de Triton X-100, MgCl2 2,5 mM a 59 ºC; o MgCl2 4 mM, Tris 100 mM (pH 8,3), KCl 10 mM y (NH4)2SO4 5 mM a 59 ºC. El

45 (Los) cebador(es) y/o sonda(s) se dejan hibridar con los ácidos nucleicos de la muestra. Los cebador(es) y/o sonda(s) hibridado(s) indican la presencia de una cepa de S. aureus en la muestra. Pueden detectarse cebador(es) y/o sonda(s) hibridado(s), y la presencia y/o cantidad de sonda(s) hibridada(s), la cantidad de un producto de amplificación producido mediante hibridación de los cebadores con los ácidos nucleicos, indica la presencia y/o cantidad de S. aureus presente en la muestra.

50 [0030] En algunas realizaciones, la muestra y cebador(es) y/o sonda(s) descritos anteriormente se usan en una reacción de amplificación, tal como una PCR, LCR, NABSA, 3SR, SDA, ADNr, TMA, CPT, SPA, NDSA, amplificación por círculo rodante, amplificación por desplazamiento de cadenas ancladas, amplificación por círculo rodante (inmovilizada) en fase sólida, o reacción de amplificación por Q beta replicasa.

55 [0031] En realizaciones preferidas, un par de cebadores que incluye un primer cebador que se hibrida bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 1 o el complemento de la misma (tal como un cebador que comprende, consiste esencialmente en o consiste en SEQ ID NO: 1) y un segundo cebador que se hibrida bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 6 (tal como un cebador que comprende, consiste esencialmente en o consiste en SEQ ID NO: 6), o el complemento de las mismas, se deja hibridar con los ácidos nucleicos de la muestra. En realizaciones más preferidas también se proporciona una sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 9 ó 10 (tal como una sonda que comprende, consiste esencialmente en o consiste en SEQ ID NO: 9 ó 10), o el complemento de las mismas.

5 [0032] En otras realizaciones preferidas, un par de cebadores que incluye un primer cebador que se hibrida bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 3 (tal como un cebador que comprende, consiste esencialmente en o consiste en SEQ ID NO: 3) o el complemento de la misma, y un segundo cebador que se hibrida bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 8 (tal como un cebador que comprende, consiste esencialmente en o consiste en SEQ ID

10 NO: 8) o el complemento de la misma, se deja hibridar con los ácidos nucleicos de la muestra. En realizaciones más preferidas también se proporciona una sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 11 ó 12, (tal como un cebador que comprende, consiste esencialmente en o consiste en SEQ ID NO: 11 ó 12) o el complemento de las mismas.

15 [0033] En realizaciones todavía más preferidas, la muestra se pone en contacto con al menos un par de cebadores, que incluye un primer cebador y un segundo cebador que se hibridan bajo condiciones rigurosas con la secuencia de ácidos nucleicos de al menos uno de los siguientes pares:

[0034] SEQ ID NOs: 1 y 5; 20 [0035] SEQ ID NOs: 1 y 6;

[0036] SEQ ID. NOs: 2 y 5;

25 [0037] SEQ ID NOs: 2 y 6;

[0038] SEQ ID NOs: 3 y 7

[0039] SEQ ID NOs: 3 y 8; 30 [0040] SEQ ID NOs: 4 y 7; y

[0041] SEQ ID NOs: 4 y 8, o los complementos de las mismas.

35 [0042] Por ejemplo, en realizaciones preferidas, la muestra se pone en contacto con al menos un par de cebadores que incluye un primer cebador y un segundo cebador que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en la secuencia de ácidos nucleicos de al menos uno de los siguientes pares:

[0043] SEQ ID NOs: 1 y 5; 40 [0044] SEQ ID NOs: 1 y 6;

[0045] SEQ ID NOs: 2 y 5;

45 [0046] SEQ ID NOs: 2 y 6;

[0047] SEQ ID NOs: 3 y 7

[0048] SEQ ID NOs: 3 y 8; 50 [0049] SEQ ID NOs: 4 y 7; y

[0050] SEQ ID NOs: 4 y 8.

55 [0051] En realizaciones preferidas, la muestra también se pone en contacto con al menos un par de cebadores que incluye un primer cebador y un segundo cebador que se hibridan bajo condiciones rigurosas con la secuencia de ácidos nucleicos de al menos uno de los siguientes pares:

[0052] SEQ ID NOs: 99 y 199;

[0053]

SEQ ID NOs: 99 y 144;

[0054]

SEQ ID NOs: 99 y 150;

[0055]5

SEQ ID NOs: 99 y 155; y

[0056]

SEQ ID NOs: 99 y 163, o el complemento de las mismas.

[0057]

Por ejemplo, en algunas realizaciones, la muestra se pone en contacto con al menos un par de

10 cebadores que incluye un primer cebador y un segundo cebador que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en al menos uno de los siguientes pares: [0058] SEQ ID NOs: 99 y 199; 15 [0059] SEQ ID NOs: 99 y 144; [0060] SEQ ID NOs: 99 y 150; [0061] SEQ ID NOs: 99 y 155; y 20

[0062] SEQ ID NOs: 99 y 163. [0063] En realizaciones preferidas, la muestra se pone en contacto con una pluralidad de pares de cebadores, en las que los cebadores se hibridan bajo condiciones rigurosas con las secuencias de ácidos nucleicos de

25 [0064] SEQ ID NOs: 1 y 6 [0065] SEQ ID NOs: 99 y 199; 30 [0066] SEQ ID NOs: 99 y 144; [0067] SEQ ID NOs: 99 y 150; [0068] SEQ ID NOs: 99 y 155; y

35 [0069] SEQ ID NOs: 99 y 163, o los complementos de las mismas, tal como pares de cebadores que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en las secuencias de ácidos nucleicos de:

[0070] SEQ ID NOs: 1 y 6 40 [0071] SEQ ID NOs: 99 y 199; [0072] SEQ ID NOs: 99 y 144; 45 [0073] SEQ ID NOs: 99 y 150; [0074] SEQ ID NOs: 99 y 155; y [0075] SEQ ID NOs: 99 y 163.

50 [0076] En otras realizaciones preferidas, la muestra se pone en contacto con una pluralidad de pares de cebadores, en las que los cebadores se hibridan bajo condiciones rigurosas con las secuencias de ácidos nucleicos de

55 [0077] SEQ ID NOs: 3 y 8 [0078] SEQ ID NOs: 99 y 199; [0079] SEQ ID NOs: 99 y 144; [0080] SEQ ID NOs: 99 y 150; [0081] SEQ ID NOs: 99 y 155; y

5 [0082] SEQ ID NOs: 99 y 163, o los complementos de las mismas, tal como pares de cebadores que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en las secuencias de ácidos nucleicos de:

[0083] SEQ ID NOs: 3 y 8

10 [0084] SEQ ID NOs: 99 y 199;

[0085] SEQ ID NOs: 99 y 144;

[0086] SEQ ID NOs: 99 y 150;

15 [0087] SEQ ID NOs: 99 y 155; y [0088] SEQ ID NOs: 99 y 163.

20 [0089] Preferentemente, la muestra también se pone en contacto con al menos una sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia de ácidos nucleicos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 12, 126, 128, 130 y 131, o el complemento de las mismas, tal como una sonda que comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de ácidos nucleicos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 12, 126, 128, 130 y 131.

25 [0090] Otros aspectos se refieren a oligonucleótidos útiles para la detección específica de S. aureus. Algunas realizaciones proporcionan oligonucleótidos que se hibridan bajo condiciones rigurosas con al menos 11 nucleótidos consecutivos de la secuencia de ácidos nucleicos de una de las siguientes SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12, tal como ácidos nucleicos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en una de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12.

30 [0091] Todavía otros aspectos se refieren a kits para detectar la presencia de una cepa de S. aureus en una muestra que incluye ácidos nucleicos. El kit puede incluir al menos un oligonucleótido que se hibrida bajo condiciones rigurosas con una de las siguientes SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12, o el complemento de las mismas. Por ejemplo, el kit puede incluir al menos un oligonucleótido que comprende, consiste esencialmente

35 en o consiste en SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12. En realizaciones preferidas, el kit también incluye al menos una sonda, en las que la sonda pueden hibridarse con la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 9, 10, 11 ó 12, o el complemento de las mismas, bajo condiciones rigurosas. En realizaciones preferidas, la sonda puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en SEQ ID NO: 9, 10, 11 ó 12.

40 [0092] En realizaciones preferidas, el kit también incluye al menos un cebador específico para una cepa de MRSA. Cepas de S. aureus se convierten en resistentes a meticilina debido a la presencia de un inserto de SCCmec que contiene un gen mecA que se inserta en ácidos nucleicos bacterianos. La inserción del inserto de SCCmec puede generar un empalme de la extremidad derecha (MREJ) polimórfico. Los cebador(es) y/o sonda(s) específicos para MRSA pueden hibridarse bajo condiciones rigurosas con ácidos nucleicos de MREJ polimórficos que incluyen,

45 por ejemplo, tipos i a xx de MREJ.

[0093] En realizaciones preferidas, el kit incluye al menos un oligonucleótido específico para MRSA que se hibrida bajo condiciones rigurosas con una de las siguientes SEQ ID NOs: SEQ ID NOs:,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 50 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 y 88, o el complemento de las mismas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un kit puede contener al menos un oligonucleótido específico para MRSA que tiene al menos 10 nucleótidos de longitud, y se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia de ácidos nucleicos de una cualquiera de las siguientes SEQ ID NOs: 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 55 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 15, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 201 (tipos i-ix), 182, 183, 184, 195, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 196, 197 (tipos xi-xx) o 199, o el complemento de las mismas. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos específicos para MRSA también pueden

incluir un oligonucleótido que se hibrida bajo condiciones rigurosas con orf22 del cromosoma de S. aureus, en las que el oligonucleótido puede usarse en una reacción de amplificación con SEQ ID NO: 197 para detectar tipo x de MREJ. Preferentemente, el oligonucleótido específico para MRSA puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una cualquiera de las siguientes SEQ ID NOs: 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102,

5 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 15, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 201 (tipos i-ix), 182, 183, 184, 195, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 196, 197 (tipos xi-xx) o 199.

10 [0094] En algunas realizaciones, el kit contiene una pluralidad de oligonucleótidos que se hibridan bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NOs: 1, 6, 99, 144, 150, 155 y 163. Por ejemplo, en realizaciones preferidas, el kit puede contener una pluralidad de oligonucleótidos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en SEQ ID NOs: 1, 6, 99, 144, 150, 155 y 163. En algunas realizaciones, el kit contiene una pluralidad de

15 oligonucleótidos que se hibridan bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NOs: 3, 8, 99, 144, 150, 155 y 163, tal como una pluralidad de oligonucleótidos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en SEQ ID NOs: 3, 8, 99, 144, 150, 155 y 163. Preferentemente, el kit también incluye al menos una sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con las siguientes SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 12, 126, 128, 130 ó 131, tal como al menos una sonda que comprende, consiste esencialmente en o consiste en SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 12, 126, 128, 130 ó 131.

20 BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0095] Las Figuras 1A y 1B muestran fotografías de geles de agarosa que muestran los productos de amplificación por reacciones de PCR. Se indica el número de copias y fuente de ADN molde (15 cp = 15 copias; 185

25 cp = 185 copias) (S. aureus = cepa de MSSA ATCC 25923; MRSA = cepa de MRSA ATCC 43300). Las flechas indican los tamaños de productos de PCR y dímeros de cebadores.

[0096] Las Figuras 2A y 2B muestran una representación gráfica de curvas de amplificación por PCR medidas de reacciones que contienen sondas fluorescibles moleculares. Las reacciones contuvieron 0, 2,5, 5, 10, 15

30 ó 20 copias de ADN molde de MSSA (Figura 2A) o MRSA (Figura 2B), además de 3000 copias de ADN de control interno. Se añadieron sondan fluorescibles moleculares a cada reacción y se midió la fluorescencia de las reacciones. Sondas marcadas con FAM se hibridan con secuencias específicas para MRSA, sondas marcadas con TET se hibridan con secuencias de ADN de control interno y sondas marcadas con Texas Red se hibridan con secuencias de nuc específicas para S. aureus.

35 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

[0097] Procedimientos y composiciones desvelados en el presente documento se refieren a la detección y/o cuantificación de S. aureus en una muestra, y también se refieren a la detección y/o cuantificación de una cepa de

40 Staphylococcus aureus (S. aureus) e identificación de una cepa de S. aureus resistente a meticilina de una muestra en un único ensayo. Las realizaciones en el presente documento se desvelan útiles para la detección y/o cuantificación de S. aureus y MRSA de cualquier tipo de muestra, tal como cualquier muestra clínica, cualquier muestra medioambiental, cualquier cultivo microbiano, cualquier colonia microbiana, cualquier tejido y cualquier línea celular.

45 [0098] Los estafilococos son cocos Gram-positivos. S. aureus puede distinguirse de otras especies de estafilococos clínicamente relevantes por un resultado positivo basándose en su capacidad para coagular plasma sanguíneo (la reacción de coagulasa) y su capacidad para formar agrupaciones en presencia de fibrinógeno. S. aureus, como algunos otros estafilococos, tiene la capacidad para producir una nucleasa termoestable (TNasa),

50 Becker y col., (2005), Diagn Microbiol Infect Dis., 51:237-244, Brakstad y col., (1995), APMIS, 103:219-224, Chesneau y col. (1993) Mol. Cell Probes 7:301-310. Sin embargo, algunas secuencias de nucleótidos del gen que codifica la nucleasa son específicos de las cepas de S. aureus (Costa y col., (2005), Diag. Microbiol. and Infect. Dis,

51: 13-17, Mc Donald y col., (2005), J. Clin. Microbiol., 43: 6147-6149, Zhang y col. (2004), J. Clin. Microbiol. 42:4947-4955; Maes y col. (2002) J. Clin. Microbiol. 40:1514-1517).

55 Procedimientos de detección de S. aureus o S. aureus y MRSA

[0099] Algunas realizaciones se refieren a procedimientos de detectar específicamente S. aureus en una muestra. En el presente documento se desvelan cebadores y/o sondas novedosos (por ejemplo, SEQ ID NOs: 1, 2,

3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12) que se hibridan con la secuencias específicas para S. aureus del gen nuc, ejemplificado por SEQ ID NO: 200, que son útiles para distinguir S. aureus de otros estafilococos, además de otras especies productoras de TNasa de bacterias. En algunas realizaciones se proporciona al menos un cebador y/o sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12, o el 5 complemento de las mismas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el al menos un cebador y/o sonda puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12. El al menos un cebador se deja hibridar con los ácidos nucleicos de la muestra, por ejemplo, bajo condiciones de PCR estándar

o condiciones rigurosas. Se detecta la presencia y/o cantidad de sonda(s) hibridada(s) y/o la cantidad de un

producto de amplificación producido mediante hibridación de los cebadores con los ácidos nucleicos, indicando así 10 la presencia y/o cantidad de S. aureus presente en la muestra.

[0100] El término “que consiste esencialmente en”, cuando se usa en referencia a ácido nucleico, puede referirse a las secuencias de ácidos nucleicos especificadas, y puede incluir cualquier nucleótido adicional que no afecte materialmente las características básicas y novedosas de la secuencia especificada. El término “que consiste

15 esencialmente en” también puede referirse a variantes que son sustancialmente similares a, y se diferencian de una secuencia de referencia de una forma irrelevante como se juzga por examen de la secuencia. Por ejemplo, secuencias de ácidos nucleicos que codifican la misma secuencia de aminoácidos son sustancialmente similares a pesar de diferencias en posiciones degeneradas o diferencias modestas en la longitud o composición de cualquier región no codificante.

Cebadores y o sondas y nucleótidos

[0101] Como se usa en el presente documento, los términos “cebador” y “sonda” no se limitan a oligonucleótidos o ácidos nucleicos, sino que engloban moléculas que son análogos de nucleótidos, además de 25 nucleótidos. Los nucleótidos y polinucleótidos, como se usa en el presente documento, deben ser genéricos para polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), para polirribonucleótidos (que contiene D-ribosa), para cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un N- o C-glucósido de un base de purina o pirimidina, y para otros polímeros que contienen esqueletos no nucleotídicos, por ejemplo, poliamida (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos (PNA)) y polimorfolino (comercialmente disponible de AntiVirals, Inc., Corvallis, Oreg., como polímeros

30 NEUGENE™), y otros polímeros de ácido nucleico específicos para secuencia sintética siempre que los polímeros contengan nucleobases en una configuración que permita el apareamiento de bases y apilamiento de bases, tal como se encuentra en ADN y ARN.

[0102] Los términos nucleótido y polinucleótido incluyen, por ejemplo, 3'-desoxi-2',5'-ADN,

35 oligodesoxirribonucleótido N3'-P5' fosforamidatos, ARN sustituido con 2'-O-alquilo, ADN bi- y monocatenario, además de ARN bi- y monocatenario, híbridos de ADN:ARN e híbridos entre PNA y ADN o ARN. Los términos también incluyen tipos modificados de modificaciones, por ejemplo, marcas que se conocen en la técnica, metilación, “tapas”, sustitución de uno o más de los nucleótidos que se producen naturalmente con un análogo, modificaciones de internucleótidos tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces sin carga (por ejemplo, metilfosfonatos,

40 fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), con enlaces negativamente cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.) y con enlaces positivamente cargados (por ejemplo, aminoalquilfosforamidatos, aminoalquilfosfotriésteres), aquellos que contienen restos colgantes tales como, por ejemplo, proteínas (incluyendo nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro,

45 metales oxidantes, etc.), aquellos que contienen alquilantes, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), además de formas sin modificar del polinucleótido o oligonucleótido.

[0103] Se apreciará que, como se usa en el presente documento, los términos “nucleósido” y “nucleótido” incluirán aquellos restos que contienen no solo las bases de purina y pirimidina conocidas, sino también otras bases 50 heterocíclicas que han sido modificadas. Tales modificaciones incluyen purinas o pirimidinas metiladas, purinas o pirimidinas aciladas, u otros heterociclos. Nucleósidos o nucleótidos modificados también incluirán modificaciones en el resto de azúcar, por ejemplo, en el que uno o más de los grupos hidroxilo se sustituyen con un halógeno, un grupo alifático, o se funcionalizan como éter, aminas o similares. Otras modificaciones a nucleótidos o polinucleótidos implican reorganizar, agregar, sustituir con, o alterar de otro modo grupos funcionales en la base de purina o 55 pirimidina que forman enlaces de hidrógeno con una pirimidina o purina complementaria respectiva. El nucleótido o polinucleótido modificado resultante puede formar un par de bases con otras unidades nucleotídicas modificadas tales, pero no con A, T, C, G o U. Por ejemplo, puede modificarse guanosina (2-amino-6-oxi-9-beta-D-ribofuranosilpurina) para formar isoguanosina (2-oxi-6-amino-9-.beta.-D-ribofuranosil-purina). Tal modificación produce una base de nucleósido que ya no formará eficazmente un par de bases convencionales con citosina. Sin embargo, la modificación de citosina (1-.beta.-D-ribofuranosil-2-oxi-4-amino-pirimidina) para formar isocitosina (1-.beta.-Dribofuranosil-2-amino-4-oxi-pirimidina) produce un nucleótido modificado que no apareará eficazmente bases con guanosina, pero formará un par de bases con isoguanosina. La isocitosina está disponible de Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.); la isocitidina puede prepararse mediante el procedimiento descrito por Switzer y col. (1993) 5 Biochemistry 32:10489-10496 y referencias citadas en su interior; la 2'-desoxi-5-metil-isocitidina puede prepararse mediante el procedimiento de Tor y col. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:4461-4467 y referencias citadas en su interior; y los nucleótidos de isoguanina pueden prepararse usando el procedimiento descrito por Switzer y col. (1993), arriba, y Mantsch y col. (1993) Biochem. 14:5593-5601, o mediante el procedimiento descrito la patente de EE.UU. nº 5.780.610 a Collins y col. Los pares de bases no naturales denominados K y I puede sintetizarse

10 mediante el procedimiento descrito en Piccirilli y col. (1990) Nature 343:33-37 para la síntesis de 2,6diaminopirimidina y su complemento (1-metilpirazolo[4,3]-pirimidina-5,7-(4H,6H)-diona). Otras de tales unidades nucleotídicas modificadas que forman pares de bases únicos se han descrito en Leach y col. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:3675-3683 y Switzer y col., arriba, o serán evidentes para aquellos expertos habituales en la materia.

15 [0104] Los cebadores y/o sondas tienen preferentemente entre 10 y 45 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, los cebadores y o sondas pueden tener al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, o más nucleótidos de longitud. Los cebadores y/o sondas pueden proporcionarse en cualquier forma adecuada, incluido unidos a un soporte sólido, líquido y, por ejemplo, liofilizado.

Hibridación y unión específica

[0105] La unión o hibridación de los cebadores y/o sondas a secuencias de ácidos nucleicos diana se lleva a cabo mediante hibridación. Se apreciará por un experto en la materia que la hibridación específica se logra 25 seleccionando secuencias que son al menos sustancialmente complementarias a la secuencia de ácidos nucleicos diana o de referencia. Esto incluye apareamiento de bases de la secuencia de ácidos nucleicos diana de oligonucleótidos con respecto a la longitud entera de la secuencia de oligonucleótidos. Tales secuencias pueden denominarse “completamente complementarias” las unas con respecto a las otras. Si un oligonucleótido se denomina “sustancialmente complementario” con respecto a una secuencia de ácidos nucleicos en el presente

30 documento, las dos secuencias pueden ser completamente complementarias, o pueden formar desapareamiento tras la hibridación, pero retienen la capacidad para hibridarse bajo condiciones rigurosas o condiciones de PCR estándar como se trata más adelante.

[0106] Existe una correlación positiva entre longitud de sonda y tanto la eficiencia como la precisión con la que

35 una sonda se hibridará con una secuencia diana. En particular, secuencias más largas tienen una mayor temperatura de fusión (Tm) que las más cortas, y es menos probable que se repitan dentro de una secuencia diana, minimizando así la hibridación promiscua.

[0107] Como se usa en el presente documento, “Tm” y “temperatura de fusión” son términos intercambiables

40 que se refieren a la temperatura a la que el 50% de una población de moléculas de polinucleótido bicatenarias se disocian en hebras sencillas. Las fórmulas para calcular las Tm de los polinucleótidos son muy conocidas en la técnica. Por ejemplo, Tm puede calcularse por la siguiente ecuación: Tm =69,3+0,41 x (G+C)%-650/L en la que L es la longitud de la sonda en nucleótidos. La Tm de un polinucleótido híbrido también puede estimarse usando una fórmula adoptada de estos ensayos de hibridación en sal 1 M, y comúnmente usada para calcular Tm para

45 cebadores de PCR: [(número de A+T) x 2 ºC + (número de G+C) x 4 ºC]. Véase, por ejemplo, C. R. Newton y col. PCR, 2ª ed., Springer-Verlag (Nueva York: 1997), pág. 24. Otros cálculos más sofisticados existen en la materia, que tienen en cuenta características estructurales, además características de secuencia, para el cálculo de Tm. Una Tm calculada es simplemente un cálculo estimado; la temperatura óptima se determina comúnmente empíricamente.

50 [0108] Las secuencias de cebadores o sondas con un alto contenido de G+C o que comprenden secuencias palindrómicas tienden a auto-hibridarse, como sus sitios diana previstos, ya que la cinética de hibridación unimolecular, en vez de bimolecular, está generalmente favorecida en disolución. Sin embargo, también es importante diseñar una sonda que contenga números suficientes de apareamientos de nucleótidos G:C, ya que cada par de G:C está unido por tres enlaces de hidrógeno, en vez de los dos que se encuentran cuando el par de bases A

55 y T (o A y U) se une a la secuencia diana y, por tanto, forma un enlace más fuerte más estrecho. El contenido de G+C preferido es aproximadamente del 50%.

[0109] La temperatura de hibridación varía inversamente con la eficiencia de hibridación de sondas, como la concentración de disolventes orgánicos, por ejemplo, formamida, que podría incluirse en una mezcla de hibridación,

mientras que el aumento en la concentración de sales facilita la unión. Bajo condiciones de hibridación rigurosas, sondas de hibridación más largas, o cebadores de síntesis, se hibridan más eficientemente que las más cortas, que son suficientes bajo condiciones más permisivas. Preferentemente, la hibridación rigurosa se realiza en un tampón adecuado en condiciones que permiten que la secuencia de ácidos nucleicos de referencia o diana se hibride con 5 las sondas. Las condiciones de hibridación rigurosas pueden variar (por ejemplo, de concentraciones de sales de menos de a aproximadamente 1 M, más normalmente menos de aproximadamente 500 mM y preferentemente menos de aproximadamente 200 mM) y las temperaturas de hibridación pueden oscilar (por ejemplo, de de tan solo 0 ºC a más de 22 ºC, más de aproximadamente 30 ºC y (casi siempre) más de aproximadamente 37 ºC que dependen de las longitudes y/o la composición de ácidos nucleicos de las sondas). Temperaturas de hibridación 10 rigurosas para PCR oscilan de 40 y 75 ºC, preferentemente entre 45 y 70 ºC, dependiendo de las longitudes y composiciones de cebadores. Fragmentos más largos pueden requerir mayores temperaturas de hibridación para hibridación específica. Como varios factores afectan la rigurosidad de hibridación, la combinación de parámetros es más importante que la medida absoluta de un único factor. Por consiguiente, a modo de ejemplo, el término “condiciones de hibridación rigurosas” puede identificarse por aquellos que: (1) emplean baja fuerza iónica y alta 15 temperatura para el lavado, por ejemplo, cloruro sódico 0,015 M / citrato de sodio 0,0015 M / 0,1% de dodecilsulfato de sodio a 50 ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante tal como formamida, por ejemplo, 50% (v/v) de formamida con 0,1% de albúmina de suero bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/ tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 ºC; o (3) emplean 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato 20 de sodio, 5 x disolución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 µg/ml), 0,1% de SDS y 10% de sulfato de dextrano a 42 ºC, con lavados a 42 ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato de sodio) y 50% de formamida a 55 ºC, seguido de un lavado de alta rigurosidad que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55 ºC. Para detalles adicionales y explicación de la rigurosidad de las reacciones de hibridación véase Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995). Por ejemplo, el término “condiciones rigurosas”

25 engloba condiciones de PCR estándar, como se describe más adelante.

[0110] Para una revisión de tecnología de PCR, que incluye condiciones de PCR estándar, aplicada a microbiología clónica, véase DNA Methods in Clinical Microbiology, Singleton P., publicado por Dordrecht; Boston: Kluwer Academic, (2000) Molecular Cloning to Genetic Engineering White, B.A. Ed. en Methods in Molecular Biology

30 67: Humana Press, Totowa (1997) y “PCR Methods and Applications”, de 1991 a 1995 (Cold Spring Harbor Laboratory Press). Ejemplos no limitantes de “condiciones de PCR” incluyen las condiciones desveladas en las referencias citadas en el presente documento, y también en los ejemplos más adelante tal como, por ejemplo, KCI 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), 0,1% de Triton X-100, MgCl2 2,5 mM, con una temperatura de hibridación de 72 ºC; o MgCl2 4 mM, Tris 100 mM, pH 8,3, KCI 10 mM, (NH4)2SO4 5 mM, 0,15 mg de BSA, 4% de trehalosa, con una

35 temperatura de hibridación de 59 ºC, o KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), 0,1% de Triton X-100, MgCl2 2,5 mM, con una temperatura de hibridación de 55 ºC.

[0111] Como se usa en el presente documento, cuando se usa para describir cebadores y/o sondas, los términos “específico” o “específico para especie” se refieren a cebadores y/o sondas que se hibridan o se hibridan

40 bajo condiciones rigurosas y/o condiciones de PCR estándar para ácidos nucleicos de una especie o tipo especificado (por ejemplo, S. aureus o MRSA), y que no se hibridan sustancialmente o se hibridan bajo las mismas condiciones con ácidos nucleicos sin relacionar, tales como ácidos nucleicos distintos de las especies especificadas

o tipo de MREJ.

45 [0112] En una realización preferida, las sondas o cebadores descritos en el presente documento se hibridan bajo condiciones rigurosas con secuencias diana (por ejemplo, secuencias de nuc específicas para S. aureus o secuencias de MREJ). En otras realizaciones preferidas, los cebadores o sondas descritos en el presente documento presentan el 100% de complementariedad con respecto a al menos 10 a 45 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, los cebadores y o sondas presentan complementariedad con respecto a al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15,

50 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 o más nucleótidos con la secuencia diana. En algunas realizaciones, los cebadores o sondas presentan el 100% de complementariedad con la secuencia diana sobre 10 a 45 nucleótidos consecutivos en todas, pero al menos 1 posición (por ejemplo, el cebador y/o sonda contienen un desapareamiento), 2 posiciones, 3 posiciones, 4 posiciones, 5 posiciones, 6 posiciones, 7 posiciones o más.

55 [0113] También se contemplan sondas o cebadores que incluyen secuencias que pueden hibridarse como se describe en el presente documento y que también incluyen una parte que no se hibrida con la secuencia diana (por ejemplo, una marca o un marcador). Por ejemplo, en algunas realizaciones, el cebador y/o sonda pueden contener un resto detectable, tal como un resto fluorescente, o cualquier otro marcador detectable, tal como aquellos descritos más adelante. En algunas realizaciones, el cebador y/o sonda puede contener ácido nucleico u otros componentes moleculares que facilitan las posteriores manipulaciones, tales como reacciones de polimerización, o reacciones enzimáticas tales como digestión con endonucleasas de restricción, y similares, o que acoplan el cebador y/o sonda a un soporte sólido.

Amplificación y detección

[0114] En los procedimientos descritos en el presente documento, la detección de cebadores y/o sondas hibridados puede ser directa o indirecta. Por ejemplo, las sondas pueden hibridarse con la muestra que se prueba, y

10 detectarse directamente. Por otra parte, los cebadores pueden hibridarse con la muestra que se prueba, seguido de una etapa de amplificación. Los productos amplificados pueden detectarse directamente, o mediante detección de sondas que se hibridan con los productos de amplificación.

[0115] En realizaciones preferidas, una amplificación y/o etapa de detección sigue a la etapa de hibridación.

15 En otras realizaciones preferidas, la detección se produce durante la etapa de hibridación. Cualquier tipo de tecnología de amplificación de ácidos nucleicos puede usarse en los procedimientos descritos en el presente documento. Ejemplos no limitantes de reacciones de amplificación que pueden usarse en los procedimientos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a: reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (véase, PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990)

20 y PCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y. (Innis)), reacción en cadena de la ligasa (LCR) (véase, Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117), amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), replicación de secuencias auto-sostenidas (3SR) (véase, Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad Sci. USA, 87:1874), amplificación por desplazamiento de cadenas (SDA), amplificación de señales de ADN ramificado ADNr, amplificación mediada por transcripción (TMA) (véase, Kwoh

25 (1989) Proc. Nalt. Acad. Sci. USA 86:1173), tecnología de sondas cíclicas (CPT), PCR anidada, PCR múltiplex, amplificación en fase sólida (SPA), amplificación de señales dependiente de nucleasa (NDSA), tecnología de amplificación por círculo rodante (RCA), amplificación por desplazamiento de cadenas ancladas, amplificación por círculo rodante (inmovilizada) en fase sólida, amplificación por Q beta replicasa y otras técnicas mediadas por ARN polimerasa (por ejemplo, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario). Estas y otras técnicas también se describen en

30 Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; Sambrook, Ausubel, Mullis (1987), las patentes de EE.UU. nº

4.683.195 y 4.683.202; Amheim (1990) C&EN 36-47; Lomell J. Clin. Chem., 35:1826 (1989); Van Brunt, Biotechnology, 8:291-294 (1990); Wu (1989) Gene 4:560; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564.

[0116] En realizaciones preferidas, la PCR se usa para amplificar ácidos nucleicos en la muestra. Durante la

35 amplificación por PCR de ADN, dos cebadores de oligonucleótidos que se unen respectivamente a cada cadena del ADN diana desnaturalizado por calor del genoma microbiano se usan para amplificar exponencialmente in vitro el ADN diana. Ciclos térmicos sucesivos permiten la desnaturalización de ADN, hibridación de los cebadores y síntesis de nuevas dianas en cada ciclo (Persing y col., (1993), Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, American Society for Microbiology, Washington, D.C.).

40 [0117] El experto apreciará que los protocolos de amplificación convencionales pueden modificarse para mejorar la eficiencia de amplificación de ácidos nucleicos, que incluye modificaciones a la mezcla de reacción. (Ralser y col., (2006), Biochem Biophys Res Commun., 347:747-51, Kang y col., (2005), J Biochem Biophys Methods. (2005), 64:147-51, Chakrabarti y Schutt, (2002), Biotechniques, 32:866-874; Al-Soud y Radstrom, (2000),

45 J. Clin. Microbiol., 38:4463-4470; Al-Soud y Radstrom, 1998, Appl. Environ. Microbiol., 64:3748-3753; Wilson, 1997, Appl. Environ. Microbiol., 63:3741-3751). Tales modificaciones de la mezcla de reacción de amplificación incluyen, pero no se limitan a, el uso de diversas polimerasas o la adición de facilitadores de la amplificación de ácidos nucleicos tales como betaína, BSA, sulfóxidos, proteína gp32, detergentes, cationes y cloruro de tetrametilamonio.

50 [0118] La detección de ácidos nucleicos amplificados puede incluir cualquier tecnología en tiempo real o de post-amplificación conocida para aquellos expertos en la materia. Clásicamente, la detección de productos de amplificación por PCR se realiza por electroforesis en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio convencional; sin embargo, el experto apreciará fácilmente que pueden usarse otros procedimientos para la detección de productos de amplificación específicos, que pueden ser más rápidos y más prácticos para el diagnóstico rutinario, tales como

55 aquellos descritos en la solicitud de patente en tramitación junto con la presente WO01/23604 A2. La detección de amplicones también puede realizarse por hibridación en soporte sólido o líquido usando sondas de ADN internas específicas para especie que se hibridan con un producto de amplificación. Tales sondas pueden generarse a partir de cualquier secuencia de MREJ o secuencias de nuc de ácidos nucleicos proporcionadas en el presente documento, y diseñadas específicamente para hibridarse con productos de amplificación de ADN producidos utilizando los procedimientos desvelados en el presente documento. Alternativamente, pueden caracterizarse amplicones por secuenciación. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente en tramitación junto con la presente WO01/23604 A2 para ejemplos de procedimientos de detección y de secuenciación.

5 [0119] Otros ejemplos no limitantes de tecnologías de detección de ácidos nucleicos que pueden usarse en la realizaciones desveladas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, el uso de procedimientos basados en transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) tales como hibridación de sondas adyacentes (incluyendo procedimientos de sonda-sonda y sonda-cebador) (véase, J. R. Lakowicz, “Principles of Fluorescence Spectroscopy”, Kluwer Academic/Plenum Publishers, Nueva York, 1999), tecnología de sondas

10 TaqMan (véase, la patente europea EP 0 543 942), tecnología de sondas fluorescibles moleculares (véase, Tyagi y col., (1996) Nat. Biotech. 14:303-308), tecnología de sondas Scorpion (véase, Thewell (2000), Nucl. Acids Res. 28:3752), tecnología de sondas de nanopartículas (véase, Elghanian y col. (1997) Science 277:1078-1081.) y tecnología de sondas Amplifluor (véanse las patentes de EE.UU. nº: 5.866.366; 6.090.592; 6.117.635; y 6.117.986).

15 [0120] En realizaciones preferidas, las sondas fluorescibles moleculares se usan para la detección de los ácidos nucleicos diana. La sondas fluorescibles moleculares son oligonucleótidos monocatenarios que, a menos que se unan a la diana, existen en una conformación de horquilla. El extremo 5' del oligonucleótido contiene un colorante fluorescente. Un colorante extintor de la fluorescencia está unido al extremo 3' del oligonucleótido. Si la sonda fluorescible no está unida a diana, la estructura de horquilla posiciona el fluoróforo y extintor de la fluorescencia en

20 estrecha proximidad, de forma que no puede observarse fluorescencia. Sin embargo, una vez la sonda fluorescible se hibrida con la diana, la estructura de horquilla se altera, separando así el fluoróforo y el extintor de la fluorescencia y permitiendo la detección de fluorescencia (véase, Kramer FR., 1996, Nat Biotechnol 3:303-8). Otros procedimientos de detección incluyen la detección de ácidos nucleicos de genes diana mediante procedimientos inmunológicos, procedimientos de hibridación en fase sólida sobre filtros, chips, o cualquier otro soporte sólido. En

25 estos sistemas, la hibridación puede monitorizarse por cualquier procedimiento adecuado conocido para aquellos expertos en la materia que incluye fluorescencia, quimioluminiscencia, potenciometría, espectrometría de masas, resonancia de plasmones, polarimetría, colorimetría, citometría de flujo o escanometría. La secuenciación de nucleótidos, que incluye secuenciar por terminación didesoxi o secuenciar por hibridación (por ejemplo, secuenciación usando un chip de ADN) representa otro procedimiento para detectar y caracterizar ácidos nucleicos

30 diana, tal como secuencias de ácidos nucleicos de nuc o de MREJ.

Procedimientos

[0121] En realizaciones preferidas, los procedimientos para detectar una cepa de S. aureus en una muestra

35 incluyen la etapa de proporcionar un par de cebadores, con un primer y un segundo cebador. El primer y el segundo cebador pueden hibridarse bajo condiciones rigurosas con al menos una de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12, o los complementos de las mismas, tal como cebadores que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12. En realizaciones preferidas, los pares de cebadores comprenden primeros y segundos cebadores que se hibridan bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NOs: 1 y 5;

40 SEQ ID NOs: 1 y 6; SEQ ID NOs: 2 y 5, SEQ ID NOs: 2 y 6; SEQ ID NOs: 3 y 7; SEQ ID NOs: 3 y 8; SEQ ID NOs: 4 y 7; o SEQ ID NOs: 4 y 8, o los complementos de las mismas. Por ejemplo, en realizaciones preferidas, los pares de cebadores pueden comprender, consistir esencialmente en SEQ ID NOs: 1 y 5; SEQ ID NOs: 1 y 6; SEQ ID NOs: 2 y 5, SEQ ID NOs: 2 y 6; SEQ ID NOs: 3 y 7; SEQ ID NOs: 3 y 8; SEQ ID NOs: 4 y 7; o SEQ ID NOs: 4 y 8. La muestra puede ponerse en contacto con y dejar que se hibride con el par de cebadores. Preferentemente, una

45 reacción de amplificación (por ejemplo, PCR) se realiza con el par de cebadores hibridados para amplificar secuencias de nuc específicas para S. aureus usando las técnicas descritas en el presente documento. Los productos de amplificación pueden entonces detectarse usando cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento.

50 [0122] En algunas realizaciones, el par de cebadores incluye un primer cebador que se hibrida bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 1 o el complemento de la misma, y un segundo cebador que se hibrida bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 6, o el complemento de la misma, tal como un par de cebadores que comprende, consiste esencialmente en o consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, el par de cebadores se usa para amplificar secuencias de nuc presentes en la muestra. Opcionalmente, también se

55 proporciona una sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 9 ó 10 o el complemento de las mismas, por ejemplo, una sonda que comprende, consiste esencialmente en o consisten en SEQ ID NO: 9 ó 10. En algunas realizaciones, la sonda es una sonda fluorescible molecular, y el producto de amplificación resultante puede detectarse por la sonda.

[0123] En otras realizaciones preferidas se proporcionan un primer cebador que se hibrida bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 3 o el complemento de la misma, y un segundo cebador que se hibrida bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 8 o el complemento de la misma, tal como un par de cebadores que comprende, consiste esencialmente en o consiste en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el par de cebadores se

5 usa para amplificar secuencias de nuc presentes en la muestra. Opcionalmente, también se proporciona una sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 11 ó 12 o el complemento de las mismas, por ejemplo, una sonda que comprende, consiste esencialmente en o consiste en SEQ ID NO: 11 ó 12. En algunas realizaciones, la sonda es una sonda fluorescible molecular.

10 [0124] Otros aspectos de la invención se refieren a procedimientos y composiciones para detectar la presencia de cepa de S. aureuss e identificar cepas de MRSA de una muestra en un único ensayo o reacción. El término “ensayo individual” o “reacción individual” pretende referirse a la situación en la que las etapas para detectar

S. aureus y las etapas para detectar MRSA se realicen simultáneamente, o sustancialmente a la misma vez, por ejemplo, en el mismo recinto físico. Sin embargo, el experto apreciará que las etapas para detectar S. aureus y las

15 etapas para detectar MRSA también pueden realizarse secuencialmente. En realizaciones preferidas, S. aureus y MRSA se detectan simultáneamente, por ejemplo, en una reacción de PCR múltiplex.

[0125] Algunas realizaciones implican las etapas de poner en contacto la muestra con al menos un cebador y/o sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con una secuencia específica para especie del gen nuc de S.

20 aureus, y poner en contacto la muestra con al menos un cebador y/o sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con una secuencia que es específica para secuencias de MREJ de cepas de MRSA.

[0126] Los cebador(es) y/o sonda(s) específicos para MRSA pueden hibridarse bajo condiciones rigurosas con ácidos nucleicos de MREJ polimórficos que incluyen, por ejemplo, tipos i a xx de MREJ. El término MREJ se 25 refiere al empalme de la extremidad derecha de mec «mec right extremity junction». Los MREJ tienen aproximadamente 1 kilobase (kb) de longitud e incluyen secuencias de la extremidad derecha de SCCmec, además de ADN cromosómico bacteriano a la derecha del sitio de integración de SCCmec (véase, Huletsky y col., (2004) J. Clin. Microbiol., 42:1875-1884). Basándose en la determinación de las secuencias del genoma completo de la cepa N315 y Mu50, la nomenclatura se revisó recientemente debido a que los elementos de SCCmec se localizan en la 30 dirección 3' (y no en la dirección 5') de orfX. Por consiguiente, MREP (polimorfismo de la extremidad derecha de mec) también se denomina MLEP (polimorfismo de la extremidad izquierda de mec). Por una prueba similar, los tipos de MREJ pueden denominarse MLEJ (empalme de la extremidad izquierda de mec). (Chongtrakool y col., (2006), Antimicrob. Agents Chemother. 50:1001-1012). Sin embargo, cualquier forma equivalente para clasificar S. aureus y concretamente cepas de MRSA estará bajo el alcance de esta patente, ya que las secuencias podrán

35 detectar específicamente S. aureus e identificar aquellas que sean resistentes a meticilina.

[0127] Ejemplos no limitantes de secuencias de tipo i a xx de MREJ se enumeran en SEQ ID NOs: 14-88. Por consiguiente, en algunas realizaciones, además de al menos un cebador y/o sonda de nuc específicos para S. aureus (por ejemplo, un oligonucleótido que se hibrida bajo condiciones rigurosas con una de las siguientes SEQ ID 40 NO: 200), se proporciona el complemento de la misma o cualquier secuencia que se diferencie de SEQ ID NO: 200 por 1 a 20 nucleótidos, al menos un cebador y/o sonda que se hibride específicamente bajo condiciones rigurosas con al menos una secuencia de MREJ de tipos i-xx de MREJ (por ejemplo, SEQ ID NOs: 14-88) o el complemento de la misma. Cebadores y sondas y combinaciones de cebadores y sondas a modo de ejemplo útiles para la detección de MRSA de tipos i-xx de MREJ se encuentran en, por ejemplo, la solicitud de patente internacional 45 PCT/CA02/00824 y en la solicitud de patente de EE.UU. nº 11/248.438. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el al menos un cebador y/o sonda específico para MRSA proporcionado en el procedimiento tiene al menos 10 nucleótidos de longitud, y puede hibridarse bajo condiciones rigurosas con una de las siguientes SEQ ID NOs: 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 50 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 15, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 201 (MREJ tipos i-ix) 182, 183, 184, 195, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 196, 197 (tipos xi-xx de MREJ) o 199, o el complemento de las mismas. Por ejemplo, los cebadores específicos para MRSA pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en una de las siguientes SEQ ID NOs: 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 55 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 15, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 201 (tipos i-ix de MREJ), 182, 183, 184, 195, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 196, 197 (tipos xi-xx de MREJ) o 199. Cebadores y/o sondas específicos para nuc (por ejemplo, que comprenden un oligonucleótido que se hibrida bajo condiciones rigurosas con una de las siguientes SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12, o el complemento de las mismas, tal como oligonucleótidos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en una de las siguientes SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12) y cebadores y/o sondas específicos para MRSA (es decir, MREJ) (por ejemplo, que 5 comprende un oligonucleótido que se hibrida bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NOs: 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 15, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 201 (tipos i-ix) 182, 183, 184, 195, 10 186, 187, 188, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 196, 197 (tipos xi-xx) o 199, o el complemento de las mismas) se hibridan con los ácidos nucleicos de la muestra, y se detecta la presencia de cebadores y/o sondas hibridados, o productos de amplificación producidos a partir de los mismos, que indica la presencia y/o cantidad de S. aureus, además de MRSA. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la muestra se pone en contacto con al menos un par de cebadores que comprende oligonucleótidos que se hibridan bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NOs: 92 y 82; 15 92 y 83; 92 y 84; 104 y 86; 104 y 87; 104 y 88; 99 y 89; 99 y 199 (para la detección de tipo i de MREJ); SEQ ID NOs: 92 y 82; 92 y 129; 92 y 130; 93 y 83; y 92 y 84; 99 y 89; 99 y 199 (para la detección de tipo ii de MREJ); SEQ ID NOs: 92 y 136; 92 y 137; 92 y 138; 99 y 202; 99 y 144 (para la detección de tipo iii de MREJ); SEQ ID NOs: 92 y 141; 99 y 105; 99 y 150 (para la detección de tipo iv de MREJ); SEQ ID NOs: 92 y 146; 99 y 196; 99 y 155 (para la detección de tipo v de MREJ); SEQ ID NOs: 92 y 152; 99 y 161; (para la detección de tipo vi de MREJ); SEQ ID 20 NOs: 92 y 153; 92 y 154; 99 y 162; 99 y 163 (para la detección de tipo vii de MREJ); SEQ ID NOs: 92 y 162; 92 y 163; 99 y 170 (para la detección de tipo viii de MREJ); SEQ ID NOs: 92 y 168; 99 y 177 (para la detección de tipo ix de MREJ); SEQ ID NOs: 197 y un oligonucleótido que se hibrida bajo condiciones rigurosas con orf22 (para la detección de tipo x de MREJ); SEQ ID NOs: 189 y 106; 189 y 99; 189 y 190; 189 y 109 (para la detección de tipo xi de MREJ); SEQ ID NOs: 194 y 106; 194 y 99; 104 y 191; 194 y 109 (para la detección de tipo xii de MREJ); SEQ ID 25 NOs: 177 y 106; 177 y 99; 177 y 190; y 177 y 109 (para la detección de tipo xiii de MREJ); SEQ ID NOs: 177 y 106; 177 y 99; 177 y 193; 177 y 109 (para la detección de tipo xiv de MREJ); SEQ ID NOs: 184 y 106; 108 y 99; 184 y 191; 184 y 191 (para la detección de tipo xv de MREJ); SEQ ID NOs: 89 y 109 (para la detección de tipo xvi de MREJ); SEQ ID NOs: 185 y 106; 185 y 99; 185 y 191; 185 y 109 (para la detección de tipo xvii de MREJ); SEQ ID NOs: 186 y 106; 186 y 99; 186 y 193; 186 y 109 (para la detección de tipo xviii de MREJ); SEQ ID NOs: 187 y 106;

30 107 y 99; 187 y 913; 187 y 109 (para la detección de tipo xix de MREJ); SEQ ID NOs: 188 y 106; 188 y 99; 188 y 913; y 188 y 109 (para la detección de tipo xx de MREJ), o el complemento de las mismas

[0128] Las cepas de MRSA más clínicamente relevantes tienen tipos i, ii, iii, iv, v y vii de MREJ. Por consiguiente, procedimientos y composiciones preferidas se refieren a la detección de S. aureus y MRSA de tipos i-v 35 y vii de MREJ en una muestra. Al menos se proporciona un cebador y/o sonda específico para nuc específico para

S. aureus, y se proporcionan cebadores y/o sondas útiles para la detección específica de tipos i, ii, iii, iv, v y vii de MREJ. Por ejemplo, en algunas realizaciones se proporcionan cebadores y/o sondas que se hibridan bajo condiciones rigurosas con cada una de las siguientes SEQ ID NOs o los complementos de las mismas: SEQ ID NOs: 99, 199, 144, 150, 155 y 163, tal como cebadores y/o sondas que comprenden, consisten esencialmente en o

40 consisten en al menos una de las siguientes SEQ ID NOs: 99, 199, 144, 150; 155 y 163. Opcionalmente se proporciona al menos una sonda que comprende un oligonucleótido que se hibrida bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NOs: 126, 128, 130 y 131, o el complemento de las mismas para la detección de secuencias de MREJ de tipos i, ii, iii, iv, v y vii. Por ejemplo, se proporciona al menos un cebador y/o sonda que comprende, consiste esencialmente en o consiste en al menos una de las siguientes SEQ ID NOs: 126, 128, 130 y 131.

45 [0129] En otras realizaciones preferidas, el al menos un cebador(es) y/o sonda(s) que se hibridan con secuencias de MREJ comprenden un par de oligonucleótidos que se hibridan bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NOs: 99 y 199 (para la detección de MREJ de tipo i y tipo ii); SEQ ID NOs: 99 y 144 (para la detección de MREJ de tipo iii); SEQ ID NOs: 99 y 150 (para la detección de MREJ de tipo iv); SEQ ID NOs: 99 y 155 (para la detección

50 de MREJ de tipo v); y SEQ ID NOs: 99 y 163 (para la detección de MREJ de tipo vii), o el complemento de las mismas. Opcionalmente se proporcionan oligonucleótidos que se hibridan bajo condiciones rigurosas con cada una de SEQ ID NOs: 99 y 199 (para la detección de MREJ de tipo i y tipo ii); SEQ ID NOs: 99 y 144 (para la detección de MREJ de tipo iii); SEQ ID NOs: 99 y 150 (para la detección de MREJ de tipo iv); SEQ ID NOs: 99 y 155 (para la detección de MREJ de tipo v); y SEQ ID NOs: 99 y 163 (para la detección de MREJ de tipo vii). Opcionalmente, la

55 muestra también se pone en contacto con una sonda que comprende un oligonucleótido que se hibrida bajo condiciones rigurosas con el ácido nucleico de SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 12, 126, 128, 130 ó 131, para la detección de secuencias de MREJ, o SEQ ID NOs: 9, 10, 11 y 12 para la detección de nuc de S. aureus, o los complementos de las mismas.

[0130] En realizaciones preferidas, los cebador(es) y/o sonda(s) específicos para nuc comprenden al menos un primer par de cebadores que se hibrida bajo condiciones rigurosas con los siguientes pares de oligonucleótidos o los complementos de las mismas: SEQ ID NOs: 1 y 5; SEQ ID NOs: 1 y 6; SEQ ID NOs: 2 y 5, SEQ ID NOs: 2 y 6; SEQ ID NOs: 3 y 7; SEQ ID NOs: 3 y 8; SEQ ID NOs: 4 y 7; o SEQ ID NOs: 4 y 8; para la detección de S. aureus 5 en una muestra. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los cebador(es) y/o sonda(s) específicos para nuc comprenden al menos un primer par de cebadores que comprende, consiste esencialmente en o consiste en: SEQ ID NOs: 1 y 5; SEQ ID NOs: 1 y 6; SEQ ID NOs: 2 y 5, SEQ ID NOs: 2 y 6; SEQ ID NOs: 3 y 7; SEQ ID NOs: 3 y 8; SEQ ID NOs: 4 y 7; o SEQ ID NOs: 4 y 8. Opcionalmente, en realizaciones en las que la muestra se pone en contacto con un primer par de cebadores que comprende oligonucleótidos que se hibridan bajo condiciones 10 rigurosas con SEQ ID NOs: 1 y 5 ó 1 y 6, o los complementos de las mismas (por ejemplo, oligonucleótidos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en SEQ ID NOs: 1 y 5, o SEQ ID NOs: 1 y 6), la muestra también puede ponerse en contacto con una sonda que comprende un oligonucleótido que se hibrida bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 9 (por ejemplo, SEQ ID NO: 10) o el complemento de las mismas. Opcionalmente, en realizaciones en las que la muestra se pone en contacto con un primer par de cebadores que 15 comprende oligonucleótidos que se hibridan bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NOs: 3 y 7, o SEQ ID NOs: 3 y 8, o los complementos de las mismas (por ejemplo, oligonucleótidos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en SEQ ID NOs: 3 y 7, o SEQ ID NOs: 3 y 8), la muestra también puede ponerse en contacto con una sonda que comprende un oligonucleótido que se hibrida bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 11 (por ejemplo, SEQ ID NO: 12) o el complemento de las mismas. Preferentemente, el primer par de cebadores comprende

20 oligonucleótidos que se hibridan bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NOs: 1 y 6; o SEQ ID NOs: 3 y 8 o los complementos de las mismas.

[0131] Opcionalmente, la muestra también se pone en contacto con al menos una sonda que comprende un oligonucleótido que se hibrida bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 12, para la detección de

25 secuencias de nuc de S. aureus, o con SEQ ID NOs: 126, 128, 130 ó 131, para la detección de secuencias de MREJ, o el complemento de las mismas, por ejemplo, al menos una sonda que comprende, consiste esencialmente en o consiste en SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 12, 126, 128, 130 ó 131.

[0132] La presencia y/o cantidad de sonda(s) hibridada(s) puede detectarse, o la cantidad de un producto de

30 amplificación producido mediante hibridación de los cebadores con los ácidos nucleicos puede detectarse, como indicación de la presencia y/o cantidad de S. aureus, y como indicación de la presencia y/o cantidad de MRSA.

Composiciones y kits

35 [0133] En el presente documento también se proporcionan composiciones y kits que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en oligonucleótidos descritos en el presente documento. Preferentemente, los oligonucleótidos tienen entre 10 y 45 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden tener al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o más nucleótidos de longitud. Como entenderán aquellos expertos en la materia, los ácidos nucleicos de las realizaciones desveladas en

40 el presente documento pueden ser monocatenarios (codificantes o antisentido), o bicatenarios, y pueden ser una molécula de ADN (genómico, ADNc o sintético) o ARN. Secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden, pero no necesitan, estar presentes dentro de un ácido nucleico de las realizaciones desveladas en el presente documento, y un ácido nucleico puede, pero no necesita, ligarse a otras moléculas y/o materiales de soporte.

45 [0134] Por consiguiente, algunas realizaciones comprenden, consisten esencialmente en o consisten en al menos un oligonucleótido de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 45 nucleótidos, y preferentemente al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 nucleótidos de longitud que se hibrida bajo condiciones rigurosas con cualquiera de los ácidos nucleicos de las siguientes secuencias derivadas

50 de las secuencias de nuc de S. aureus o los complementos de las mismas: SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12, por ejemplo, oligonucleótidos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en al menos una de las siguientes SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12. Realizaciones preferidas comprenden, consisten esencialmente en o consisten en un par de cebadores que se hibrida bajo condiciones rigurosas con cualquiera de los pares de las siguientes SEQ ID NOs: 1 y 5; SEQ ID NOs: 1 y 6; SEQ ID NOs: 2 y 5, SEQ ID NOs: 2 y 6; SEQ ID

55 NOs: 3 y 7; SEQ ID NOs: 3 y 8; SEQ ID NOs: 4 y 7; o SEQ ID NOs: 4 y 8, o los complementos de las mismas, por ejemplo, pares de cebadores que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en las siguientes SEQ ID NOs: 1 y 5; SEQ ID NOs: 1 y 6; SEQ ID NOs: 2 y 5, SEQ ID NOs: 2 y 6; SEQ ID NOs: 3 y 7; SEQ ID NOs: 3 y 8; SEQ ID NOs: 4 y 7; o SEQ ID NOs: 4 y 8. En algunas realizaciones se proporciona al menos una sonda que comprende un oligonucleótido que se hibrida bajo condiciones rigurosas SEQ ID NOs: 9 y 11 (por ejemplo, SEQ ID

NOs: 10 y 12), o el complemento de las mismas.

[0135] Otros aspectos se refieren a composiciones útiles para la detección de S. aureus y MRSA en una única reacción. Por consiguiente, algunas realizaciones comprenden, consisten esencialmente en o consisten en al menos 5 un cebador y/o sonda que tiene preferentemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 45 nucleótidos de longitud, tal como un oligonucleótido que tiene al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 de longitud que se hibrida con una secuencia de nuc específica para S. aureus, y al menos un cebador y/o sonda que se hibrida con al menos una secuencia de MREJ de tipos i-xx de MREJ. Algunas realizaciones proporcionan al menos dos pares de cebadores, en las que un primer par de cebadores se hibrida bajo 10 condiciones rigurosas con secuencias de nuc específicas para S. aureus (por ejemplo, SEQ ID NOs: 1 y 5; SEQ ID NOs: 1 y 6; SEQ ID NOs: 2 y 5, SEQ ID NOs: 2 y 6; SEQ ID NOs: 3 y 7; SEQ ID NOs: 3 y 8; SEQ ID NOs: 4 y 7; o SEQ ID NOs: 4 y 8) y un segundo par de cebadores se hibrida con secuencias de MREJ (por ejemplo, SEQ ID NOs: 92 y 82; 92 y 83; 92 y 84; 104 y 86; 104 y 87; 104 y 88; 99 y 89; 99 y 199 (para la detección de tipo i de MREJ); SEQ ID NOs: 92 y 82; 92 y 129; 92 y 130; 93 y 83; y 92 y 84; 99 y 89; 99 y 199 (para la detección de tipo ii de 15 MREJ), SEQ ID NOs: 92 y 136; 92 y 137; 92 y 138; 99 y 202; 99 y 144 (para la detección de tipo iii de MREJ); SEQ ID NOs: 92 y 141; 99 y 105; 99 y 150 (para la detección de tipo iv de MREJ); SEQ ID NOs: 92 y 146; 99 y 196; 99 y 155 (para la detección de tipo v de MREJ); SEQ ID NOs: 92 y 152; 99 y 161; (para la detección de tipo vi de MREJ); SEQ ID NOs: 92 y 153; 92 y 154; 99 y 162; 99 y 163 (para la detección de tipo vii de MREJ); SEQ ID NOs: 92 y 162; 92 y 163; 99 y 170 (para la detección de tipo viii de MREJ); SEQ ID NOs: 92 y 168; 99 y 177 (para la detección 20 de tipo ix de MREJ); SEQ ID NOs: 197 y un oligonucleótido que se hibrida bajo condiciones rigurosas con orf22 (para la detección de tipo x de MREJ); SEQ ID NOs: 189 y 106; 189 y 99; 189 y 190; 189 y 109 (para la detección de tipo xi de MREJ); SEQ ID NOs: 194 y 106; 194 y 99; 104 y 191; 194 y 109 (para la detección de tipo xii de MREJ); SEQ ID NOs: 177 y 106; 177 y 99; 177 y 190; y 177 y 109 (para la detección de tipo xiii de MREJ); SEQ ID NOs: 177 y 106; 177 y 99; 177 y 193; 177 y 109 (para la detección de tipo xiv de MREJ); SEQ ID NOs: 184 y 106; 25 108 y 99; 184 y 191; 184 y 191 (para la detección de tipo xv de MREJ); SEQ ID NOs: 89 y 109 (para la detección de tipo xvi de MREJ); SEQ ID NOs: 185 y 106; 185 y 99; 185 y 191; 185 y 109 (para la detección de tipo xvii de MREJ); SEQ ID NOs: 186 y 106; 186 y 99; 186 y 193; 186 y 109 (para la detección de tipo xviii de MREJ); SEQ ID NOs: 187 y 106; 107 y 99; 187 y 913; 187 y 109 (para la detección de tipo xix de MREJ); SEQ ID NOs: 188 y 106; 188 y 99; 188 y 913; y 188 y 109 (para la detección de tipo xx de MREJ)). En algunas realizaciones también se proporciona al

30 menos una sonda que puede hibridarse con productos de amplificación producidos por un par de cebadores de nuc específicos para S. aureus y/o par de cebadores específico para MREJ descrito en el presente documento (por ejemplo, SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 12, 126, 128, 130 ó 131).

[0136] Por consiguiente, algunas realizaciones comprenden, consisten esencialmente en o consisten en pares 35 de cebadores que se hibridan bajo condiciones rigurosas con las secuencias de ácidos nucleicos de:

[0137] SEQ ID NOs: 1 y 6

[0138] SEQ ID NOs: 99 y 199;

40 [0139] SEQ ID NOs: 99 y 144;

[0140] SEQ ID NOs: 99 y 150;

45 [0141] SEQ ID NOs: 99 y 155; y

[0142] SEQ ID NOs: 99 y 163, o los complementos de las mismas

[0143] Otras realizaciones comprenden, consisten esencialmente en o consisten en una pluralidad de pares

50 de cebadores, en las que los cebadores se hibridan bajo condiciones rigurosas con las secuencias de ácidos nucleicos de

[0144] SEQ ID NOs: 3 y 8;

55 [0145] SEQ ID NOs: 99 y 199;

[0146] SEQ ID NOs: 99 y 144;

[0147] SEQ ID NOs: 99 y 150; [0148] SEQ ID NOs: 99 y 155; y

[0149] SEQ ID NOs: 99 y 163, o los complementos de las mismas.

5 [0150] Todavía otros aspectos se refieren a kits para la detección y/o cuantificación de S. aureus, o S. aureus y MRSA. En algunas realizaciones, los kits comprenden, consisten esencialmente en o consisten en al menos un oligonucleótido de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 45 nucleótidos de longitud, por ejemplo al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 nucleótidos de longitud, que se

10 hibrida bajo condiciones rigurosas con cualquiera de los ácidos nucleicos de las siguientes secuencias derivadas de

S. aureus; secuencias de nuc o los complementos de las mismas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12. Realizaciones preferidas proporcionan kits que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en un par de cebadores que se hibridan bajo condiciones rigurosas con cualquiera de los pares de las siguientes SEQ ID NOs: 1 y 5; SEQ ID NOs: 1 y 6; SEQ ID NOs: 2 y 5, SEQ ID NOs: 2 y 6; SEQ ID NOs: 3 y 7; SEQ ID NOs: 3 y 8; SEQ ID

15 NOs: 4 y 7; o SEQ ID NOs: 4 y 8, o los complementos de las mismas. En algunas realizaciones, el kit proporciona al menos una sonda que comprende un oligonucleótido que se hibrida bajo condiciones rigurosas SEQ ID NOs: 9 y 11 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 10 y 12), o el complemento de las mismas.

[0151] Otras realizaciones proporcionan kits útiles para la detección de S. aureus y MRSA juntos. En algunas

20 realizaciones, los kits comprenden, consisten esencialmente en o consisten en al menos un cebador y/o sonda que tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 45 nucleótidos de longitud, por ejemplo, al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 nucleótidos de longitud, que se hibridan con una secuencia de nuc específica para S. aureus y al menos un cebador y/o sonda que se hibridan con al menos una secuencia de MREJ de tipos i-xx de MREJ. Algunas realizaciones proporcionan kits, en las que los kits incluyen al

25 menos dos pares de cebadores. Un primer par de cebadores puede hibridarse bajo condiciones rigurosas con secuencias de nuc específicas para S. aureus (por ejemplo, cebadores que tienen al menos 10 nucleótidos de longitud y pueden hibridarse bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NOs: 1 y 5; SEQ ID NOs: 1 y 6; SEQ ID NOs: 2 y 5, SEQ ID NOs: 2 y 6; SEQ ID NOs: 3 y 7; SEQ ID NOs: 3 y 8; SEQ ID NOs: 4 y 7; o SEQ ID NOs: 4 y 8, o el complemento de las mismas) y un segundo par de cebadores puede hibridarse bajo condiciones rigurosas con

30 secuencias de MREJ (por ejemplo, cebadores que tienen al menos 10 nucleótidos de longitud y pueden hibridarse bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NOs: 92 y 82; 92 y 83; 92 y 84; 104 y 86; 104 y 87; 104 y 88; 99 y 89; 99 y 199 (para la detección de tipo i de MREJ); SEQ ID NOs: 92 y 82; 92 y 129; 92 y 130; 93 y 83; y 92 y 84; 99 y 89; 99 y 199 (para la detección de tipo ii de MREJ); SEQ ID NOs: 92 y 136; 92 y 137; 92 y 138; 99 y 202; 99 y 144 (para la detección de tipo iii de MREJ), SEQ ID NOs: 92 y 141; 99 y 105; 99 y 150 (para la detección de tipo iv de MREJ);

35 SEQ ID NOs: 92 y 146; 99 y 196; 99 y 155 (para la detección de tipo v de MREJ); SEQ ID NOs: 92 y 152; 99 y 161; (para la detección de tipo vi de MREJ); SEQ ID NOs: 92 y 153; 92 y 154; 99 y 162; 99 y 163 (para la detección de tipo vii de MREJ); SEQ ID NOs: 92 y 162; 92 y 163; 99 y 170 (para la detección de tipo viii de MREJ); SEQ ID NOs: 92 y 168; 99 y 177 (para la detección de tipo ix de MREJ); SEQ ID NOs: 197 y un oligonucleótido que se hibrida bajo condiciones rigurosas con orf22 (para la detección de tipo x de MREJ); SEQ ID NOs: 189 y 106; 189 y 99; 189 y

40 190; 189 y 109 (para la detección de tipo xi de MREJ); SEQ ID NOs: 194 y 106; 194 y 99; 104 y 191; 194 y 109 (para la detección de tipo xii de MREJ); SEQ ID NOs: 177 y 106; 177 y 99; 177 y 190; y 177 y 109 (para la detección de tipo xiii de MREJ); SEQ ID NOs: 177 y 106; 177 y 99; 177 y 193; 177 y 109 (para la detección de tipo xiv de MREJ); SEQ ID NOs: 184 y 106; 108 y 99; 184 y 191; 184 y 191 (para la detección de tipo xv de MREJ); SEQ ID NOs: 89 y 109 (para la detección de tipo xvi de MREJ); SEQ ID NOs: 185 y 106; 185 y 99; 185 y 191; 185 y 109

45 (para la detección de tipo xvii de MREJ), SEQ ID NOs: 186 y 106; 186 y 99; 186 y 193; 186 y 109 (para la detección de tipo xviii de MREJ); SEQ ID NOs: 187 y 106; 107 y 99; 187 y 913; 187 y 109 (para la detección de tipo xix de MREJ); SEQ ID NOs: 188 y 106; 188 y 99; 188 y 913; y 188 y 109 (para la detección de tipo xx de MREJ) o los complementos de las mismas). En algunas realizaciones, los kits incluyen al menos una sonda que puede hibridarse bajo condiciones rigurosas con productos de amplificación producidos por un par de cebadores de nuc específicos

50 para S. aureus y/o también se proporciona un par de cebadores específico para MREJ descrito en el presente documento (por ejemplo, una sonda que comprende un oligonucleótido que puede hibridarse bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 12, 126, 128, 130 ó 131, o el complemento de las mismas).

[0152] Por consiguiente, algunas realizaciones proporcionan kits que comprenden, consisten esencialmente

55 en o consisten en pares de cebadores que se hibridan bajo condiciones rigurosas con las secuencias de ácidos nucleicos de:

[0153] SEQ ID NOs: 1 y 6 [0154] SEQ ID NOs: 99 y 199;

[0155] SEQ ID NOs: 99 y 144;

5 [0156] SEQ ID NOs: 99 y 150;

[0157] SEQ ID NOs: 99 y 155; y

[0158] SEQ ID NOs: 99 y 163, o los complementos de las mismas.

10 [0159] Otras realizaciones proporcionan kits que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en una pluralidad de pares de cebadores, en las que los cebadores se hibridan bajo condiciones rigurosas con las secuencias de ácidos nucleicos de:

15 [0160] SEQ ID NOs: 3 y 8;

[0161] SEQ ID NOs: 99 y 199;

[0162] SEQ ID NOs: 99 y 144; 20 [0163] SEQ ID NOs: 99 y 150;

[0164] SEQ ID NOs: 99 y 155; y

25 [0165] SEQ ID NOs: 99 y 163, o los complementos de las mismas.

[0166] Los kits de diagnóstico, cebadores y sondas desvelados en el presente documento pueden usarse para detectar y/o identificar S. aureus, además de detectar y/o identificar tanto S. aureus como MRSA de tipos i a xx de MREJ, en tanto aplicaciones in vitro como in situ. Por ejemplo, se contempla que los kits puedan usarse en 30 combinación con cualquier cebador/sonda previamente descrito para detectar MRSA de tipos i a xx de MREJ. También se contempla que los kits de diagnóstico, cebadores y sondas desvelados en el presente documento puedan usarse solos o en combinación con cualquier otro ensayo adecuado para detectar y/o identificar microorganismos que incluyen, pero no se limitan a: cualquier ensayo basado en detección de ácidos nucleicos, cualquier inmunoensayo, cualquier ensayo enzimático, cualquier ensayo bioquímico, cualquier ensayo lisotípico,

35 cualquier ensayo serológico, cualquier medio de cultivo diferencial, cualquier medio de cultivo de enriquecimiento, cualquier medio de cultivo selectivo, cualquier medio de ensayo específico, cualquier medio de cultivo de identificación, cualquier medio de cultivo de enumeración, cualquier tinción celular, cualquier cultivo sobre líneas celulares específicas y cualquier ensayo de infectividad en animales.

40 [0167] Habiendo descrito generalmente la presente invención, puede obtenerse otro entendimiento por referencia a ciertos ejemplos específicos que se proporcionan en el presente documento para los fines de ilustración solo, y no pretenden ser limitantes.

EJEMPLO 1

45 [0168] Este ejemplo ilustra la utilidad de diversos pares de cebadores, elegidos para detección específica optimizada de S. aureus de una muestra usando PCR. Las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 se diseñaron para hibridarse con regiones específicas para S. aureus del gen nuc. La mezclas de reacción de PCR incluyeron 0,5 µM de cada uno de los cebadores indicados, dNTP 0,2 mM (Roche), MgCl2 2 mM (SIGMA), 1 unidad de Taq ADN

50 polimerasa FASTSTART™ (Roche), Tris 50 mM (EMD), KCl 10 mM (Laboratoire Mat) y (NH4)2SO4 5 mM (SIGMA).

[0169] Para cada par de cebadores probado se ejecutaron tres repeticiones que contienen cantidades variables de ADN molde cromosómico. Un conjunto de reacciones incluyó 15 copias de ADN molde cromosómico de la cepa de S. aureus ATCC 43300 (MRSA). Otro conjunto de reacciones incluyó 185 copias de ADN molde de ATCC

55 43300. También se ejecutó un control negativo, que no tuvo ningún ADN molde añadido. Los conjuntos en paralelo de reacciones se ejecutaron con ADN molde cromosómico de la cepa de S. aureus ATCC 25923 (MSSA).

[0170] Las reacciones de PCR se realizaron usando una máquina de QT-PCR SMARTCYCLER® (Cepheid). Los parámetros de ciclado fueron los siguientes: 95 ºC durante 900 min, seguido de 45 ciclos de 95 ºC durante 5 s, 59 ºC durante 15 s y 72 ºC durante 20 s. Los productos amplificados se visualizaron sobre geles de agarosa (Figuras 1A y 1B).

[0171] Como se muestra en las Figuras 1A y 1B, los siguientes pares de cebadores mostraron resultados 5 particularmente buenos en la amplificación específica de ADN de tanto cepas de S. aureus MSSA como MRSA:

[0172] SEQ ID NOs: 1 y 5

[0173] SEQ ID NOs: 1 y 6 10 [0174] SEQ ID NOs: 2 y 6

[0175] SEQ ID NOs: 4 y 7

15 [0176] SEQ ID NOs: 4 y 8

[0177] SEQ ID NOs: 3 y 7, y

[0178] SEQ ID NOs: 3 y 8.

20 [0179] El par de cebadores SEQ ID NOs: 2 y 5 fue menos sensible, como se indica por la cantidad relativa de producto de amplificación producido, en comparación con otros pares de cebadores.

EJEMPLO 2

25 [0180] Se probó la capacidad para detectar S. aureus y para identificar MRSA en una única reacción. Se diseñó una reacción de PCR múltiplex para incluir cebadores que se hibridan bajo condiciones de PCR estándar con la secuencia de orfX específica para especies de S. aureus y una secuencia del empalme de la extremidad derecha de SCCmec (MREJ) de los tipos de MRSA más comúnmente clínicamente encontrados (es decir, MRSA de tipos i, ii,

30 iii, iv, v, vii de MREJ). SEQ ID NOs: 99, 199, 144, 150, 155 y 163 se usaron para la detección de MRSA de tipos i, ii, iii, iv, v y vii de MREJ. Se usaron cebadores que se hibridan con regiones específicas para S. aureus del gen nuc bajo las mismas condiciones (SEQ ID NOs: 3 y 8) en la reacción para la detección de tanto cepas de MRSA como de MSSA en las reacciones de prueba. Las sondas fluorescibles moleculares que son detectables en el aparato SMARTCYCLER® en los canales de FAM, Texas Red y TET se diseñaron para la hibridación con productos de

35 amplificación de las reacciones específicas para MRSA (SEQ ID NOs: 126 y 130), reacciones específicas para nuc/S. aureus (SEQ ID NO: 12) y un control interno, respectivamente.

[0181] Las reacciones de PCR incluyeron SEQ ID NO: 99 0,9 µM, SEQ ID NO: 199 0,4 µM; SEQ ID NO: 144 0,6 µM, SEQ ID NO: 150 0,3 µM, SEQ ID NO: 155 0,2 µM, SEQ ID NO: 163 0,7 µM, SEQ ID NO: 3 0,1 µM, SEQ ID 40 NO: 8 0,1 µM, SEQ ID NO: 126 0,1 µM, SEQ ID NO: 130 0,1 µM, SEQ ID NO: 12 0,25 µM, ADN de control 0,2 µM, dNTP 0,3 mM (Roche), MgCl2 4 mM (SIGMA), 2,8 unidades Taq ADN polimerasa FASTSTART® (Roche), Tris 100 mM, pH 8,3 (EMD), KCI 10 mM (Laboratoire Mat), (NH4)2SO4 5 mM (SIGMA), 0,15 mg/ml de BSA (SIGMA), 4% de trehalosa (SIGMA), 3000 copias de ADN molde de control interno, 2780 copias de ADN cromosómico de S. epidermidis y tanto 0, 2,5, 5, 10, 15 como 20 copias de ADN cromosómico de MSSA (aislado de la cepa de ATCC

45 25923) o 0, 2,5, 5, 10 ó 20 copias de ADN cromosómico de MRSA (aislado de la cepa de ATCC 43300).

[0182] Las reacciones de PRC se realizaron en un instrumento SMARTCYCLER® (Cepheid). Los parámetros de ciclado fueron los siguientes: 95 ºC durante 900 min, seguido de 45 ciclos de 95 ºC durante 5 s, 59 ºC durante 15 s y 72 ºC durante 20 s. La fluorescencia se midió continuamente a las longitudes de onda apropiadas, y se

50 representa gráficamente en las Figuras 2A y 2B.

[0183] La Figura 2A representa las lecturas de fluorescencia de reacciones que contienen ADN molde de MSSA. Bajo estas condiciones de reacción, 2,5 copias de ADN de MSSA se detectaron fácilmente (canal de Texas Red), demostrando la utilidad de SEQ ID NOs: 3, 8 y 12 en PCR múltiplex. Como era de esperar, señales positivas

55 también están presentes en el canal de TET, que indica que el control interno funcionó apropiadamente y que no estuvieron presentes inhibidores en las reacciones.

[0184] La Figura 2B representa las lecturas de fluorescencia de reacciones que contienen ADN molde de MRSA. Bajo estas condiciones de reacción, 2,5 copias de ADN de MRSA se detectaron fácilmente (canal de FAM).

Esto demuestra la utilidad de SEQ ID NOs: 99, 199, 150, 155, 144, 126 y 130 en una PCR múltiplex que puede detectar todas las cepas de S. aureus, que incluyen MRSA. Como se muestra en el canal de Texas Red, los cebadores y sondas específicos para nuc (SEQ ID NOs: 3, 8 y 12) detectaron 2,5 copias de ADN. Las señales positivas también están presentes en el canal de TET, que indica que el control interno funcionó apropiadamente y

5 que no estuvieron presentes inhibidores en las reacciones.

[0185] Este ejemplo resalta la sensibilidad muy alta obtenible con un ensayo de múltiplex de PCR que amplifica secuencias de MREJ de MRSA y secuencias de nuc de S. aureus con control interno.

10 EJEMPLO 3

[0186] Se analizó la especificidad de un ensayo de PCR múltiplex que amplifica secuencias de MREJ de MRSA y la secuencia de nuc de S. aureus. El ADN cromosómico de 80 especies bacterianas distintas de S. aureus se usó como ADN molde en un ensayo de PCR múltiplex como se describe en el Ejemplo 2. Las cepas probadas se

15 enumeran en la Tabla 2.

[0187] 1 ng de ADN cromosómico aislado de cada especie indicada en la Tabla 1 se usó en una reacción separada que contiene SEQ ID NO: 99 0,9 µM, SEQ ID NO: 199 0,4 µM; SEQ ID NO: 144 0,6 µM, SEQ ID NO: 150 0,3 µM, SEQ ID NO: 155 0,2 µM, SEQ ID NO: 163 0,7µM, SEQ ID NO: 3 0,1 µM, SEQ ID NO: 8 0,1 µM, SEQ ID

20 NO: 126 0,1 µM, SEQ ID NO: 131 0,1 µM, SEQ ID NO: 11 0,25 µM, ADN de control interno 0,2 µM, dNTP 0,3 mM (Roche), MgCl2 4 mM (SIGMA), 2,8 unidades Taq ADN polimerasa FASTSTART® (Roche), Tris 100 nM, pH 8,3 (EMD), KCl 10 mM (Laboratoire Mat), (NH4)2SO4 5 mM (SIGMA), 0,1 mg/ml de BSA (SIGMA), 4% de trehalosa (SIGMA), 3000 copias de ADN molde de control interno y 2780 copias de ADN de S. epidermidis.

25 [0188] Cada reacción se realizó por triplicado. Las reacciones se dejaron avanzar siguiendo los parámetros expuestos en el Ejemplo 2. La Tabla 2 resume los resultados de las reacciones. No se observó señal positiva en los canales de FAM y Texas Red para las 80 especies diferentes tratadas. Se detectó una señal positiva en el canal de TET para cada una de las 80 especies diferentes tratadas, que indica que las reacciones no contuvieron inhibidores. El algoritmo de interpretación de los resultados se resume en la Tabla 3.

30 Tabla 2

Especie

Número de cepa Resultados de PCR

MRSA (FAM)

IC (TET) S. aureus (Texas Red)

Acinetobacter baumannii

ATCC 19606 - + -

Acinetobacter lwoffii

CDCF 3697 - + -

Actinomyces israelii

ATCC 12102 - + -

Actinomyces pyogenes

ATCC 19411 - + -

Bacillus cereus

ATCC 14579 - + -

Bacteroides fragilis

ATCC 25285 - + -

Bifidobacterium breve

ATCC 15700 - + -

Bordetella pertusis

ATCC 9797 - + -

Corynebacterium genitalium

LSPQ3583 - + -

Corynebacterium aquaticus

ATCC 14665 - + -

Corynebacterium bovis

ATCC 7715 - + -

Corynebacterium flavescens

ATCC 10340 - + -

Enterobacter cloacae

ATCC 13047 - + -

Enterococcus faecalis

ATCC19433 - + -

Enterococcus faecium

ATCC 19434 - + -

Enterococcus flavescens

ATCC 49996 - + -

Enterococcus gallinarum

ATCC 49573 - + -

Enterococcus hirae

ATCC 8043 - + -

Escherichia coli

ATCC 23511 - + -

Helicobacter pylori

IDI-2019 - + -

Fusobacterium nucleatum subsp. Polymorphum

ATCC 10953 - + -

Gardnerella vaginalis

ATCC 14019 - + -

Especie

Número de cepa Resultados de PCR

MRSA (FAM)

IC (TET) S. aureus (Texas Red)

Haemophilus influenza

ATCC 9006 - + -

Homo sapiens

2.16 - + -

Klebsiella pneumoniae

ATCC 13883 - + -

Lactobacillus crispatus

ATCC 33820 - + -

Listeria monocytogenes

L 374 - + -

Micrococcus luteus

ATCC 9341 - + -

Moraxella catarrhalis

ATCC 43628 - + -

Neisseria gonorrhoeae

ATCC 35201 - + -

Neisseria meningitides

ATCC 13077 - + -

Pasteurella aerogenes

ATCC 27883 - + -

Peptostreptococcus anaerobius

ATCC 27337 - + -

Peptostreptococcus asaccharolyticus

LSPQ 2639 - + -

Porphyromonas asaccharolytica

ATCC 25260 - + -

Prevotella melaninogenica

ATCC 25845 - + -

Propionibacterium acnes

ATCC 6919 - + -

Proteus mirabilis

ATCC 29906 - + -

Pseudomonas aeruginosa

ATCC 35554 - + -

Pseudomonas fluorescens

ATCC 13525 - + -

Salmonella typhimurium

ATCC 14028 - + -

Serratia marcescens

ATCC 13880 - + -

Shigella sonnei

ATCC 29930 - + -

Staphylococcus arlettae

CCRI-9265 - + -

Staphylococcus auricularis

R413 - + -

Staphylococcus capitis

CCRI-9572 - + -

Staphylococcus caprae

CCRI-9117 - + -

Staphylococcus carnosus

R714 - + -

Staphylococcus chromogenes

ATCC 43764 - + -

Staphylococcus cohnii subsp. Urealyticum

R570 - + -

Staphylococcus delphini

ATCC 49171 - + -

Staphylococcus epidermidis

ATCC 35984 - + -

Staphylococcus equorum

ATCC 43958 - + -

Staphylococcus felis

ATCC 49168 - + -

Staphylococcus gallinarum

ATCC 35539 - + -

Staphylococcus haemolyticus

ATCC 29970 - + -

Staphylococcus hominis

CCRI-1347 - + -

Staphylococcus intermedius

ATCC 29663 - + -

Staphylococcus kloosii

ATCC 43959 - + -

Staphylococcus lentus

ATCC 29070 - + -

Staphylococcus lugdunensis

ATCC 43809 - + -

Staphylococcus pasteuri

ATCC 51129 - + -

Staphylococcus pulvereri

ATCC 51698 - + -

Staphylococcus saprophyticus

ATCC 15305 - + -

Staphylococcus sciuri

R573 - + -

Staphylococcus simulans

ATCC 27848 - + -

Staphylococcus warneri

ATCC 35985 - + -

Staphylococcus xylosus

LSPQ2517 - + -

Streptococcus agalactiae

ATCC 12973 - + -

Streptococcus anginosus

ATCC 33397 - + -

Streptococcus mitis

ATCC 49456 - + -

Streptococcus mutans

ATCC 25175 - + -

Streptococcus pneumoniae

ATCC 49619 - + -

Streptococcus pyogenes

ATCC 12384 - + -

Streptococcus salivarius

ATCC 7073 - + -

Especie

Número de cepa Resultados de PCR

MRSA (FAM)

IC (TET) S. aureus (Texas Red)

Streptococcus sanguinis

ATCC 10556 - + -

Streptococcus suis

ATCC 43765 - + -

Yersinia enterocolitica

ATCC 23715 - + -

Candida albicans

ATCC 10231 - + -

Candida glabrata

ATCC 66032 - + -

Tabla 3

Resultado del ensayo de FAM informado

Resultado del ensayo de Texas Red informado Resultado de IC (TET) informado Interpretación del resultado

Negativo

Negativo APROBADO Sin ADN de S. aureus detectado

Positivo

Positivo o negativo N/A ADN de MRSA detectado

Negativo

Positivo N/A ADN de S. aureus detectado, sin ADN de MRSA detectado

Sin resolver

Fallo Espécimen inhibidor sin resolver o fallo del reactivo

5 [0189] Este ejemplo resalta la completa especificidad alcanzada con un ensayo de PCR múltiplex que amplifica secuencias de MREJ de MRSA y secuencia de nuc de S. aureus con un control interno.

EJEMPLO 4

10 [0190] Se probó la capacidad de un ensayo de PCR múltiplex que amplifica secuencias de MREJ de MRSA y secuencia de nuc de S. aureus para detectar con exactitud S. aureus e identificar MRSA directamente a partir de especímenes de herida.

[0191] Se diseñó una reacción de PCR múltiplex para incluir cebadores para amplificar secuencias específicas

15 para las regiones de MREJ de los MRSA más clínicamente relevantes (por ejemplo, cebadores que se hibridan con secuencias de orfX específicas para especies de S. aureus y secuencias de SCCmec), además de cebadores que se hibridan con regiones específicas para S. aureus del gen nuc de todas las cepas de S. aureus (por ejemplo, MRSA y MSSA), bajo las mismas condiciones. Brevemente, SEQ ID NOs: 99, 199, 144, 150, 155 y 163 se usaron para la amplificación de secuencias de la región de MREJ de diversos MRSA de los tipos i, ii, iii, iv, v y vii de MREJ.

20 Los cebadores que se hibridan con regiones específicas para S. aureus del gen nuc bajo las mismas condiciones (SEQ ID NOs: 3 y 8) se usaron en la reacción para la detección de tanto las cepas de MRSA como de MSSA en las reacciones de prueba. Sondas fluorescibles moleculares que son detectables en el aparato SMARTCYCLER® en canales de FAM, Texas Red y TET se diseñaron para la hibridación con productos de amplificación de las reacciones específicas para MRSA (SEQ ID NOs: 126 y 130), reacciones específicas para nuc/S. aureus (SEQ ID

25 NO: 12) y el control interno, respectivamente.

[0192] Ciento tres muestras de heridas se recogieron en pacientes usando hisopos líquidos Amies (Copan Diagnostics, Inc). Las muestras se cultivaron y se subcultivaron sobre placas de agar sangre (Becton Dickinson). Basándose en su morfología, S. aureus sospechosos se identificaron con una prueba de coagulasa (Jorgenson, J.

30 H., y W. E. Kloos. 1987. Staphylococcal Infections, en B. B. Wentworth (ed.), Diagnostic procedures for bacterial infections, 7ª ed., American Public Health Association, Washington, D. C.) y en algunos casos con aglutinación en látex (Staphaurex, Remel Inc.). La resistencia a meticilina se determinó usando el sistema de identificación bacteriana VITEK™ (bioMérieux, Durham, NC).

35 [0193] Se aisló ADN de las cepas aisladas usando el kit de lisis IDI™ (GeneOhm Sciences, Inc.). Un hisopo de la cepa aislada se rompió en 1 ml de tampón TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) y se agitó con vórtex durante 1 min a alta velocidad. 50 µl de las suspensiones de células se transfirieron a un tubo de lisis que contenía perlas de vidrio y se agitaron con vórtex durante 5 minutos a alta velocidad. Los tubos se centrifugaron a 13.000 rpm durante 2 min y se calentaron a 95 ºC durante 2 minutos. El tubo se dispuso sobre hielo hasta que se usó en la reacción.

40 [0194] Se añadieron 3 µl de la reacción de lisis a una mezcla de PCR que contenía SEQ ID NO: 99 0,9 µM, SEQ ID NO: 199 0,4 µM, SEQ ID NO: 144 0,6 µM, SEQ ID NO: 150 0,3 µM, SEQ ID NO: 155 0,2 µM, SEQ ID NO: 163 0,7 µM, SEQ ID NO: 3 0,1 µM, SEQ ID NO: 8 0,1 µM, SEQ ID NO: 126 0,1 µM, SEQ ID NO: 130 0,1 µM, SEQ ID NO: 12 0,25 µM, ADN de control interno 0,2 µM, dNTP 0,3 µM (Roche), MgCl2 4 mM (SIGMA), 2,8 unidades de Taq polimerasa FASTSTART® (Roche), Tris 100 mM, pH 8,3 (EMD), KCl 10 mM (LaboratoireMat), (NH4)2SO4 5 mM

5 (SIGMA), 0,15 mg/ml de BSA (STIGMA), 4% de trehalosa (SIGMA), 3000 copias ADN de control interno y 2780 copias de ADN cromosómico de S. epidermidis.

[0195] La PCR se llevó a cabo en un SMARTCYCLER® (Cepheid) usando los mismos parámetros de ciclado que se describen en el Ejemplo 2. Para cada espécimen, el umbral de ciclo (UC) en los canales de FAM, Texas Red 10 y TET se determinó usando el software SMARTCYCLER®. Los resultados de ensayo se interpretaron como se indica en la Tabla 3:

[0196] El ensayo de PCR múltiplex anterior se diseña de forma que cualquier cepa de S. aureus produzca una señal positiva en el canal de Texas Red. La presencia de un MRSA clínicamente relevante producirá una señal 15 positiva en el canal de FAM. Por consiguiente, un resultado negativo en el canal de FAM combinado con un resultado positivo en el canal de Texas Red es indicativo de la presencia de MSSA.

[0197] En casos en los que apareció un resultado discordante entre los ensayos de cultivo descritos anteriormente y la reacción de PCR múltiplex, se añadió caldo de soja tríptica al tubo de tampón TE que contenía el 20 hisopo, y se incubó durante la noche a 35 ºC. Se sembraron 50 µl del cultivo durante la noche sobre placas de agar sangre y las cepas aisladas se identificaron como MRSA, MSSA, o negativo (sin S. aureus).

[0198] Los datos recogidos se representan en las Tablas 4A, 4B y 4C, a continuación.

25 Tabla 4ª

(A)

PCR

MRSA

MSSA Negativo Total Sin resolver

Cultivo

MRSA 27 (32)* 0 (0) 0 (0) 27 (32) 1 (0)

MSSA

2 (2) 18 (19) 1 (0) 21 (21) 1 (0)

Negativo

4 (0) 1 (1) 43 (45) 48 (46) 5 (4)

Total

33 (34) 19 (20) 44 (45) 96 (99) 7 (4)

* antes de la resolución de resultados discordantes (después de la resolución de resultados discordante)

Tabla 4B

antes de la resolución

después de la resolución

Sensibilidad a MRSA Sensibilidad a MSSA Sensibilidad a S. aureus Especificidad Sin resolver

100% (27/27) 85,7% (18/21) 97,9% (47/48) 89,6% (43/48) 6,8% (7/103) 100% (32/32) 90,5% (19/21) 100% (53/53) 97,8% (45/46) 3,9% (4/103)

Tabla 4C

Número de espécimen

Resultado del cultivo Resultado de PCR

Estado

MRSA (UC de FAM) IC (UC de TET) S. aureus (UC de Texas Red)

1

MSSA MSSA 0,0 0,0 23,5

2

NEGATIVO Sin resolver 0,0 37,5 0,0

3

MSSA MSSA 0,0 0,0 30,5

4

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 37,8 0,0

5

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 37,3 0,0

6

MRSA MRSA 25,0 0,0 24,5

7

MRSA MRSA 36,0 0,0 0,0

8

MSSA MRSA 30,7 0,0 33,0

9

MSSA MSSA 0,0 0,0 23,8

Número de espécimen

Resultado del cultivo Resultado de PCR

Estado

MRSA (UC de FAM) IC (UC de TET) S. aureus (UC de Texas Red)

NEGATIVO

NEGATIVO 0,0 37,3 0,0

11

MRSA MRSA 27,8 0,0 27,5

12

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 37,1 0,0

13

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 37,1 0,0

14

MRSA MRSA 25,6 0,0 25,0

15

MSSA MSSA 0,0 37,1 35,7

16

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 37,1 0,0

17

MRSA MRSA 23,9 0,0 23,5

18

MRSA MRSA 25,2 0,0 24,5

19

MSSA MSSA 0,0 0,0 21,5

NEGATIVO

NEGATIVO 0,0 37,0 0,0

21

MSSA MSSA 0,0 0,0 21,3

22

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 36,6 0,0

23

MRSA MRSA 26,9 0,0 26,7

24

MRSA MRSA 23,2 0,0 21,5

25

MSSA MRSA 37,1 38,0 38,5

26

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 38,7 0,0

27

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 37,2 0,0

28

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 36,9 0,0

29

MRSA MRSA 27,1 0,0 26,5

NEGATIVO

NEGATIVO 0,0 38,5 0,0

31

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 37,3 0,0

32

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 37,0 0,0

33

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 37,1 0,0

34

NEGATIVO Sin resolver 0,0 36,8 0,0

35

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 36,0 0,0

36

MRSA MRSA 25,9 0,0 25,8

37

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 36,9 0,0

38

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 37,2 0,0

39

MSSA MSSA 0,0 0,0 28,5

NEGATIVO

NEGATIVO 0,0 37,4 0,0

41

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 39,2 0,0

42

NEGATIVO MSSA 0,0 0,0 34,7

43

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 36,9 0,0

44

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 37,3 0,0

45

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 38,5 0,0

46

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 37,5 0,0

47

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 36,7 0,0

48

MSSA MSSA 0,0 36,0 34,9

49

MSSA MSSA 0,0 0,0 29,0

NEGATIVO

NEGATIVO 0,0 37,7 0,0

51

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 36,8 0,0

52

MRSA MRSA 27,6 0,0 23,8

53

MSSA MSSA 0,0 0,0 25,7

54

MSSA MSSA 0,0 34,8 32,8

55

MRSA MRSA 24,5 0,0 24,9

56

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 36,5 0,0

57

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 36,7 0,0

58

MRSA MRSA 24,3 0,0 24,0

59

MRSA MRSA 22,5 0,0 21,5

MRSA

MRSA 28,9 0,0 28,7

61

NEGATIVO Sin 0,0 0,0 0,0

Número de espécimen

Resultado del cultivo Resultado de PCR

Estado

MRSA (UC de FAM) IC (UC de TET) S. aureus (UC de Texas Red)

resolver

62

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 36,7 0,0

63

MRSA MRSA 23,9 0,0 23,5

64

MSSA MSSA 0,0 0,0 23,8

65

MRSA MRSA 29,4 0,0 29,5

66

MRSA MRSA 33,7 0,0 33,8

67

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 36,5 0,0

68

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 36,9 0,0

69

MRSA MRSA 23,2 0,0 22,5

70

MRSA MRSA 23,6 0,0 22,5

71

MRSA MRSA 37,4 0,0 0,0

72

MSSA MSSA 0,0 0,0 22,0

73

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 35,7 0,0

74

MRSA MRSA 36,3 36,8 35,7

75

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 36,5 0,0

76

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 36,7 0,0

77

MRSA MRSA 22,3 0,0 22,1

. 78

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 37,1 0,0

79

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 34,9 0,0

80

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 36,2 0,0

81

MRSA MRSA 21,5 0,0 22,5

82

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 37,7 0,0

83

MSSA MSSA 0,0 0,0 22,7

84

MSSA MSSA 0,0 0,0 22,7

85

MRSA MRSA 22,9 0,0 23,0

86

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 37,9 0,0

87

MRSA MRSA 32,3 0,0 33,7

88

MSSA MSSA 0,0 0,0 30,0

89

MRSA MRSA 21,3 0,0 21,5

90

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 37,4 0,0

91

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 39,2 0,0

92

MSSA MSSA 0,0 0,0 31,2

93

MRSA MRSA 31,9 0,0 32,0

94

NEGATIVO Sin resolver 0,0 0,0 0,0

95

MSSA MSSA 0,0 0,0 25,1

96

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 36,8 0,0

97

MSSA MSSA 0,0 37,5 41,7

98

MRSA MRSA 32,5 0,0 32,9

99

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 37,2 0,0

100

MRSA MRSA 28,8 0,0 29,5

101

MRSA MRSA 23,2 0,0 0,0

102

NEGATIVO NEGATIVO 0,0 36,6 0,0

103

MRSA MRSA 35,2 35,7 36,0

[0199] Como se muestra en las Tablas 4A y 4B, el ensayo de múltiplex es 100% sensible a MRSA, que indica que cada resultado de MRSA positivo conseguido en el ensayo de PCR se correspondió con un resultado positivo en la identificación de cultivo, tanto antes como después de la resolución. La sensibilidad del ensayo de PCR para la

5 detección de S. aureus después de la resolución fue del 90,5%, mostrando 19 de las 21 cepas de MSSA un resultado positivo del ensayo de PCR. Y, lo que es más importante, sin embargo, las dos cepas que se identificaron incorrectamente como que no eran MSSA son cepas que fueron anteriormente MSSA, pero perdieron una parte del elemento de SCCmec y retuvieron el empalme próximo a orfX con el que se hibrida la amplificación por cebadores de PCR.

10 [0200] La Tabla 4C muestra los resultados de PCR y cultivo individuales para cada uno de los 103 especímenes de herida tras la resolución de resultados discordantes. Las entradas sombreadas indican que los resultados obtenidos en la prueba de cultivo y en el ensayo de PCR estuvieron de acuerdo. La columna marcada (UC) indica el ciclo de PCR en el que una señal positiva se vuelve detectable con respecto al ruido de fondo. Como

5 se muestra en la tabla, no pudieron resolverse cuatro muestras en el ensayo de PCR, debido a la presencia de inhibidores de reacción en la muestra.

[0201] Los resultados anteriores demuestran la alta sensibilidad y especificidad del ensayo PCR múltiplex aplicado directamente a especímenes de herida. Por consiguiente, el ensayo de múltiplex ofrece el primer ensayo

10 conveniente, fidedigno, sensible y específico específico para tanto MRSA como MSSA.

[0202] Los procedimientos, composiciones y dispositivos en el presente documento se describen presentemente representativos de realizaciones preferidas, son a modo de ejemplo y no están previstos como limitaciones del alcance de la invención. Cambios en su interior y otros usos se producirán para aquellos expertos en

15 la materia que están englobados dentro del espíritu de la invención y se definen por el alcance de la divulgación. Por consiguiente, será evidente para un experto en la materia que pueden hacerse sustituciones y modificaciones variables a la invención desvelada en el presente documento sin apartarse del alcance y espíritu de la invención.

[0203] Como se usa en las siguientes reivindicaciones y en toda esta divulgación, por el término “que consiste

20 esencialmente en” se indica que incluye cualquier elemento enumerado después de la frase, y limitado a otros elementos que no interfieren con o contribuyen a la actividad o acción especificada en la divulgación para los elementos enumerados. Así, el término “que consiste esencialmente en” indica que los elementos enumerados se requieren o son obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o pueden no estar presentes dependiendo de si afectan o no la actividad o acción de los elementos enumerados.

LISTADO DE SECUENCIAS

[204] 30 <110> GENEOHM SCIENCES, INC. Veronique Jean Melanie Guillot Frank Courjal Chant al Savoye

<120> DETECCIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS E IDENTIFICACIÓN DE ESTAFILOCOCOS RESISTENTES A METICILINA AUREUS

35 <130> GENOM 072VPC

<150> 60/870823

<151>

40 <160> 205

<170> Fast SEQ para Windows Versión 4. 0

<210> 1 45 <211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 50 <223> Staphylococcus aureus

<400> 1

acagaat act t att aagt gc tggc 24 55

<210> 2

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Staphylococcus aureus

5 <400> 2

gt t t caat at t act t at agg gat ggct 27

<210> 3 10 <211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> Staphylococcus aureus

<400> 3

ct gat ggaaa aat ggt aaac gaag 24 20

<210> 4

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 25

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 4

30 at ggaaaaat ggt aaacgaa gc 22

<210> 5

<211> 22 35 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus 40

<400> 5

tgctgagcta cttagacttg aa 22

45 <210> 6

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

50 <220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 6

55 gcatttgctg agct act t ag ac 22

<210> 7

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus 5

<400> 7

gttgttcatg t gt at t gt t a ggttt 25

10 <210> 8

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 8

ttattgacct gaat cagcgt tg 22 20

<210> 9

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 25

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 9

30 cgaaacat t a ct gat agcca t ccct at aag 30

<210> 10

<211> 40 35 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus 40

<400> 10

cgcaccgaaa cat t act gat agccatccct ataaggtgcg 40

45 <210> 11

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

50 <220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 11

55 acat aagcaa ct t t agccaa gcct t gacg 29

<210> 12

<211> 41

<212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus 5

<400> 12 cgcgcaacat aagcaacttt agccaagcct t gacgt gcgc g 41 10 <210> 13

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15 <220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 13 20 at gt caaaaa t cat gaacct cat tac 26

<210> 14

<211> 3050

<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus 30 <400> 14

<210> 15

<211> 385 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 15

<210> 16

<211> 385

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 10

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 16 15

<210> 17

<211> 385 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus 25

<400> 17

30 <210> 18

<211> 385

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

35 <220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 18

<210> 19

<211> 340 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

10 <400> 19

<210> 20 15 <211> 369

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Staphylococcus aureus

<400> 20

<210> 21

<211> 2480

<212> ADN

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<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 21 35

<210> 22

<211>

709 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 22

<210> 23

<211>

3050 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus 10

<400> 23 <210> 24

<211>

960 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 24

<210> 25

<211>

480 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus 10

<400> 25

15 <210> 26

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20 <220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 26

<210> 27

<211> 3050

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5 <220>

<223> Staphylococcus aureus

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<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 28

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<220>

<223> Staphylococcus aureus

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<211> 1132

<212> ADN

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5 <220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 30

<210> 31

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<220>

<223> Staphylococcus aureus

20 <400> 31 <210> 32

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<220>

<223> Staphylococcus aureus

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<220> 20 <223> Staphylococcus aureus

<400> 33

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<211> 1114

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<220>

<223> Staphylococcus aureus

10 <400> 34

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<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Staphylococcus aureus

<400> 35 <210> 36

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<220>

<223> Staphylococcus aureus 10

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<211> 1131

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20 <220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 37

<210> 38 5 <211> 896

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<400> 38

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<220>

<223> Staphylococcus aureus

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<220>

<223> Staphylococcus aureus 10

<400> 40

15 <210> 41

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<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 41

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<400> 42

<210> 43

<211> 479

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<220>

<223> Staphylococcus aureus

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<210> 44

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<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus 10

<400> 44

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<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 45

<210> 46

<211> 480

<212> ADN 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

35 <400> 46 <210> 47

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<213> Desconocido

<220>

<223>

Staphylococcus aureus 10

<220>

<221> msc_feature

<222> 237

<223>

n = a, t, c, o g 15

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20 <210> 48

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<213> Secuencia artificial

25 <220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 48

<210> 49

<211> 480

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<223> Staphylococcus aureus

<400> 49

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<220>

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<400> 50

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25 <220>

<223> Staphylococcus aureus

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25 <220>

<223> Staphylococcus aureus

<220>

<221> msc_feature 30 <222> 406

<223> n = a, t, c, o g

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<211> 480

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<223> Staphylococcus aureus

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<220>

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<223> Staphylococcus aureus

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771 20 <212> ADN

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20 <220>

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<220>

<223> Staphylococcus aureus 10

<400> 87

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20 <220>

<223> Staphylococcus aureus

<400>

88

<400>

92 t cat gaacct cat t act t at gat aagnt 28

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<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 89

gt caaaaat c atgaacct ca ttacttatg

29

<210> 90 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 90

ct at gt caaa aat cat gaac ctcattac

28

<210> 91 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 91

ggaggct aac t at gt caaaa at c

23

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<220> <223> Staphylococcus aureus

<220> <221> msc_feature <222> 27 <223> n = a, t, c, o g

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<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 93 gat agact aa t t at ct t cat c 21

<210> 94

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

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<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 95 t gagat cat c tacat ct t t a 20

<210> 96

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 96 ggat caaaag ct act aaat c 20

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<211> 20

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<213> Secuencia artificial

<220>

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 97

atgctctttg ttttgcagca

20

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<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 98

at gaaagact gcggaggct a act

23

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<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 99

ggatcaaacg gcctgcaca

19

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<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 100

tcattggcgg atcaaacgg

19

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<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 101

acaacgcagt aact acgcac t a

22

<210> 102 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<223> Staphylococcus aureus

<400> 102

t aact acgca ct at cat t ca gc

<210> 103

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 103

acat caaat g at gcgggt tg t g

<210> 104

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 104

t caaat gat g cgggt t gt gt t a

<210> 105

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 105

caaat gat gc gggt t gt gt t aat t

<210> 106

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 106

at caaat gat gcgggt t gt g t

<210> 107

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 107 accaaacgac at gaaaat ca 20

<210> 108

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

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<210> 109

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 109 gaggaccaaa cgacatgaaa at c 23

<210> 110

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 110 gccaaaatta aaccacaatc cac 23

<210> 111

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 111 cat t t t gct g aat gat agt g cgt a 24

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<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 112

aagaat t gaa ccaacgcat g a

<210> 113

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 113

aaacgacat g aaaat cacca t

<210> 114

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 114

t at t gcaggt t t cgat gt tg a

<210> 115

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 115

t gacccat at cgcct aaaat ac

<210> 116.

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 116

aaaggacaac aaggtagcaa ag

<210> 117

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 117 t ct gt ggat a aacacct t ga t g 22

<210> 118

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 118 ggcat aaat g t caggaaaat at c 23

<210> 119

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 119 gt gggaaat g gct gt t gt tg ag 22

<210> 120

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 120 t t cgt t ccct ccat t aact g t c 22

<210> 121

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 121 gttcaagccc agaagcgatg t 21

<210> 122

<211>

23

<211>

48

<212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 122

t cgggcat aa at gt caggaa aat

23

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<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 123

t t at t aggt a aaccagcagt aagt gaacaa cca

33

<210> 124 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 124

cgct t gccac at caaat gat gcgggt t gt g caagcg

36

<210> 125 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 125

cccaccccac at caaat gat gcgggt t gt g ggt ggg

36

<210> 126 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 126

cccgcgcgt a gt t act gcgt t gt aagacgt ccgcggg

37

<210> 127

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 127 cgaccggat t cccacatcaa atgatgcggg ttgtgttaat tccggtcg 48

<210> 128

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 128 cccgcgcr t a gt t act r cgt t gt aagacgt ccgcggg 37

<210> 129

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 129 ccccgt agt t act gcgt t gt aagacgggg 29

<210> 130

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 130 cccgcgcat a gt t act gcgt t gt aagacgt ccgcggg 37

<210> 131

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 131 cccgcgcgt a gt t act acgt t gt aagacgt ccgcggg 37

<210> 132

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 132

gtttttatca ccat at t gaa t t t at ac

<210> 133

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 133

at t t act t ga aagact gcgg aggag

<210> 134

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 134

t gt t t gagct t ccacagct a t t t c

<210> 135

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 135

ccct at aat t ccaat t at t g cact aac

<210> 136

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 136

at gaggagat aat aat t t gg agggt

<210> 137

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 137

gct gaaaaaa ccgcat cat t t r t gr t a

<210> 138

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 138

gct gaaaaaa ccgcat cat t t at gat a

<210> 139

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<220>

<221> msc_feature

<222> 27

<223> n = a, t, c, o g

<400> 139

gaaaaaaccg cat cat t t at gat at gnt

<210> 140

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 140

t at at t gt gg cat gat t t ct tc 22

<210> 141

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 141

cgaat ggact agcact t t ct aaa 23

<210> 142

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 142

agacaacttt at gcaggt cc t t 22

<210> 143

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 143

t aact gct t g ggt aacct t a t c 22

<210> 144

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 144

atttcatata tgtaattcct ccacat cl c 29

<210> 145

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 145

t t t agt t t t a t t t at gat ac gct t ct cca 29

<210> 146

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 146

ct ct at aaac at cgt at gat at t gc 25

<210> 147

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<220>

<221> msc_feature

<222> 29

<223> n = a, t, c, o g

<400> 147

cct aat t t t t agt t t t at t t atgatacgnt 30

<210> 148

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<220>

<221> msc_feature

<222> 34

<223> n = a, t, c, o g

<400> 148

cacaacct aa t t t t t agt t t t at t t at gat acgnt 35

<210> 149

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 149

atattctaga t cat caat ag ttg 23

<210> 150

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus <400> 150

caaat at t at ct cgt aat t t acct tgt t c 29

<210> 151

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 151

ct act at gaa ct gt gcaat t t gt t ct 26

<210> 152

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 152

caat cggt at ct gt aaat at caaat 25

<210> 153

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 153

t t ggt t ccat ct gaact t tg ag 22

<210> 154

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 154

cacagaaatg t aat t t t gga atgagg 26

<210> 155

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 155 ct ct gct t t a t at t at aaaa t t acggct g 29

<210> 156

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 156 tcgcatacct gt t t at ct t c t act 24

<210> 157

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 157 t t t aaat t ca gct at at ggg gaga 24

<210> 158

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 158 ttccgttttg ct at t ccat a at 22

<210> 159

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 159 aaaagaaaga cggtgaaggc 20

<210> 160

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 160 cact t cat t a t act gt t t t c t t t gc 25

<210> 161

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 161 t caccgt ct t t ct t t t gacc t t 22

<210> 162

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 162 cactttttat t ct t caaaga t t t gagc 27

<210> 163

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 163 at ggaaatt c t t aat ct t t a ctt gt acc 28

<210> 164

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 164 agcat ct t ct t t acat cgct t act 24

<210> 165

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 165

t t gaggat ca aaagt t gt t g c 21

<210> 166

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 166

cgat gat t t t at agt aggag a 21

<210> 167

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 167

t t caat ct ct aaat ct aaat cagt tt t g 28

<210> 168

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 168

aggcgagaaa at ggaacat a t caa 24

<210> 169

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 169

cagcaat t cw cat aaacct c at a 23

<210> 170

<211> 27

<212> ADN

<213>

Secuencia artificial

<213>

Secuencia artificial

<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 170

acaaact t t g aggggat t t t t agt aaa

27

<210> 171 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 171

ggat gt gggt at gct aat gt t gt t

24

<210> 172 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 172

t gaacaat t t t at t t ct cat accat ag

27

<210> 173 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 173

t cccct aat g at agct ggt a t at at t

26

<210> 174 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 174

t ct agggaat caaagaaaag t aat agt

27

<210> 175 <211> 26 <212> ADN

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 175 ggt acaagt a aagat t aaga at t t cc 26

<210> 176

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 176 act agaat ct ccaaat gaat ccagt 25

<210> 177

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 177 t gat aagcca t t cat t cacc ct aa 24

<210> 178

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 178 aat ggct t at caaagt gaat at gc 24

<210> 179

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 179 taatttcctt t tttttccatt t cctc c 24

<210> 180

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 180

t gagat ct gc tggaacaaaa gtgaa 25

<210> 181

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 181

cggt cgagt t t gct gaagaa 20

<210> 182

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 182

ctattgttcc acaaattatg attact 26

<210> 183

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 183

cttcttttct tgttattctt t tcttct 26

<210> 184

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 184

gt t gccat ag at t caat t t c t ag 23

<210> 185

<211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 185 caccct gcaa gat at gt t t 19

<210> 186

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 186 aat ggaat t t gt t aat t t ca t aaat

<210> 187

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 187 t t ccgaagct aat t ct gt t a at a

<210> 188

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 188 t t ccgaagt c at aat caat c aaat t

<210> 189

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 189 caaat t gt ag cat t ct t gaa ct at

<210> 190

<211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 190

gccaaaat ca aaccacaat c aac

23

<210> 191 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 191

gccaaaatca aaccacaatc cac

23

<210> 192 <211> 2150 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 192

<210> 193 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 193

gccaaaat t a aaccacaat c cac

23

<210> 194 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 194

ctcccatttc c t t ccaaaaaa t at a

24

<210> 195

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 195

caaat at t at ct cgt aat t t acct tgt t c 29

<210> 196

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 196

ctctgcttta tattataaaa ttacggctg 29

<210> 197 <?11> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 197

caagct ccat t t t gt aat ca ag 22

<210> 198

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 198

caagct ccat t t t gt aat ca ag 22

<210> 199

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 199 at gt caaaaa t cat gaacct cat t ac 26

<210> 200

<211> 686 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus

10 <400> 200

<210> 201 15 <211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Staphylococcus aureus

<400> 201

atttcatata tgtaattcct ccacat ct c 29 25

<210> 202

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 30

<220>

<223> Staphylococcus aureus

<400> 202

35 cccgcgcgt a gt t act gcgt t gt aagacgt ccgcggg 37

<210> 203

<211> 37 40 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Staphylococcus aureus 45

<400> 203

cccgcgcat a gt t act gcgt t gt aagacgt ccgcggg

37

<210> 204 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 204

cccgcgcgt a gt tact acgt t gt aagacgt ccgcggg

37

<210> 205 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Staphylococcus aureus

<400> 205

ggatcaaacg gcctgcac

18

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de detección específica de la presencia de una cepa de Staphylococcus aureus (S. aureus) y detección e identificación específica de una cepa de S. aureus resistente a meticilina de una muestra clínica en un único ensayo, que comprende

   poner en contacto dicha muestra con al menos un cebador y/o sonda de nuc de al menos 13 nucleótidos que se hibrida bajo condiciones rigurosas con una secuencia específica para S. aureus dentro de SEQ ID NO: 200 o el complemento de la misma;

   poner en contacto dicha muestra con al menos un cebador y/o sonda MREJ de al menos 13 nucleótidos que se hibrida bajo condiciones rigurosas con ácidos nucleicos de MREJ polimórficos dentro de al menos una de las siguientes SEQ ID NOs específicas para MREJ: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 u 88, o el complemento de las mismas, en el que el al menos un cebador y/o sonda se hibridan conjuntamente bajo condiciones rigurosas con secuencias de orfX específicas para especies de S. aureus y secuencias polimórficas de la extremidad derecha de SCCmec; y

   detectar la presencia y/o cantidad de sonda(s) nuc y MREJ hibridadas como indicativa de la presencia y/o cantidad de S. aureus y MRSA en la muestra, respectivamente, o detectar la cantidad de un producto de amplificación producido mediante hibridación de los cebadores nuc y MREJ con los ácidos nucleicos, como indicación de la presencia y/o cantidad de S. aureus y MRSA, respectivamente,

   en el que dichas condiciones rigurosas comprenden MgCl2 4 mM, Tris 100 mM (pH 8,3), KCl 10 mM, (NH4)2SO4 5 mM, 0,15 mg/ml de BSA, 4% de trehalosa a 59 ºC.

2. 2.

   El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho al menos un cebador y o sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia de SEQ ID NO: 200 comprende un oligonucleótido que se hibrida bajo condiciones rigurosas con al menos 11 nucleótidos consecutivos del ácido nucleico de una cualquiera de las siguientes SEQ ID NOs: 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12, o el complemento de las mismas.

3. 3.

   Un procedimiento de detección e identificación específica de S. aureus sensible a meticilina y S. aureus resistente a meticilina (MRSA) en un único ensayo que comprende:

   proporcionar al menos un cebador y/o sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11 ó 12, o el complemento de las mismas;

   proporcionar al menos un cebador específico para una cepa de S. aureus resistente a meticilina (MRSA), siendo dicha cepa de MRSA resistente debido a la presencia de un inserto de SCCmec que contiene un gen mecA, estando dicho SCCmec insertado en ácidos nucleicos bacterianos generando así un empalme polimórfico de la extremidad derecha (MREJ) o cualquier nomenclatura equivalente, en el que dichos cebador(es) y/o sonda(s) específicos para MRSA se hibridan bajo condiciones rigurosas con ácidos nucleicos de MREJ polimórficos, comprendiendo dicho MREJ polimórfico tipos i a xx de MREJ;

   hibridar los ácidos nucleicos de la muestra con el (los) cebador(es) y/o sonda(s), en el que la hibridación de al menos un cebador y/o sonda bajo condiciones rigurosas con una cualquiera de SEQ ID NO: 1 a 12 o los complementos de las mismas indica la presencia de una cepa de S. aureus en la muestra, y en el que la hibridación de al menos un cebador y/o sonda bajo condiciones rigurosas con ácidos nucleicos de MREJ polimórficos, comprendiendo dicho MREJ polimórfico tipos i a xx de MREJ; indican la presencia de una cepa de MRSA en la muestra,

   detectar la presencia y/o cantidad de sonda(s) nuc o MREJ hibridadas, o detectar la cantidad de un producto de amplificación producido mediante hibridación de los cebadores nuc o MREJ con los ácidos nucleicos, como indicación de la presencia y/o cantidad de S. aureus, y como indicación de la presencia y/o cantidad de MRSA, respectivamente,

   en el que dichas condiciones rigurosas comprenden MgCl2 4 mM, Tris 100 mM (pH 8,3), KCl 10 mM, (NH4)2SO4 5 mM, 0,15 mg/ml de BSA, 4% de trehalosa a 59 ºC.

4. 4.

   El procedimiento de la reivindicación 3, en el que los cebadores y/o sondas se hibridan con dicho ácido nucleico de muestra bajo las mismas condiciones de hibridación; preferentemente en el que el cebador y/o sondas se disponen en conjunto en el mismo recinto físico.

5. 5.

   El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dichos cebador(es) y/o sonda(s) específicos para MRSA se hibridan bajo condiciones rigurosas con secuencias polimórficas de la extremidad derecha de SCCmec de al menos uno de los tipos i a xx de MREJ, definidas en una cualquiera de SEQ ID NOs: 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 u 88.

6. 6.

   El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dichos cebador(es) y/o sonda(s) específicos para MRSA se hibridan bajo condiciones rigurosas con el ácido nucleico de una cualquiera de SEQ ID NOs: 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143,144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 132, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168 169, 170, 171, 172, 173, 114, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 201 (tipos i-ix) 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 196, 197 (tipos xi-xx) o 199, o el complemento de las mismas.

7. 7.

   El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dichos cebador(es) y/o sonda(s) específicos para MRSA se hibridan bajo condiciones rigurosas con el ácido nucleico de una cualquiera de SEQ ID NOs: 99, 199, 144, 150, 155 y 163, o el complemento de las mismas; que comprenden opcionalmente además al menos una sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con una cualquiera de SEQ ID NOs: 126, 128, 130 ó 131, o el complemento de las mismas.

8. 8.

   El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha muestra se pone en contacto con al menos un par de cebadores, comprendiendo dicho par de cebadores un primer cebador y un segundo cebador que se hibridan bajo condiciones rigurosas con la secuencia de ácidos nucleicos de

   SEQ ID NOs: 1 y 5;

   SEQ ID NOs: 1 y 6;

   SEQ ID NOs: 2 y 6;

   SEQ ID NOs: 4 y 7;

   SEQ ID NOs: 4 y 8;

   SEQ ID NOs: 3 y 7, y

   SEQ ID NOs: 3 y 8, o los complementos de las mismas; opcionalmente, que comprende además poner en contacto dicha muestra con al menos un par de cebadores que comprende un primer cebador y un segundo cebador que se hibridan bajo condiciones rigurosas con la secuencia de ácidos nucleicos de:

   SEQ ID NOs: 99 y 199;

   SEQ ID NOs: 99 y 144;

   SEQ ID NOs: 99 y 150;

   SEQ ID NOs: 99 y 155; y

   SEQ ID NOs: 99 y 163, o el complemento de las mismas.
9. 9. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha muestra se pone en contacto con una pluralidad de pares de cebadores, comprendiendo dichos pares de cebadores un primer cebador y un segundo cebador que se hibridan bajo condiciones rigurosas con las secuencias de ácidos nucleicos de:

   SEQ ID NOs: 3 y 7;

   SEQ ID NOs: 99 y 199;

   SEQ ID NOs: 99 y 144;

   SEQ ID NOs: 99 y 150;

   SEQ ID NOs: 99 y 155; y

   SEQ ID NOs: 99 y 163, o los complementos de las mismas; comprendiendo opcionalmente además poner en contacto la muestra con al menos una sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia de ácidos nucleicos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 9, 10, 126, 128, 130 ó 131, o el complemento de las mismas.
10. 10. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha muestra se pone en contacto con una pluralidad de pares de cebadores, comprendiendo dichos pares de cebadores un primer cebador y un segundo cebador que se hibridan bajo condiciones rigurosas con las secuencias de ácidos nucleicos de:

    SEQ ID NOs: 1 y 6;

    SEQ ID NOs: 99 y 199;

    SEQ ID NOs: 99 y 144;

    SEQ ID NOs: 99 y 150;

    SEQ ID NOs: 99 y 155; y

    SEQ ID NOs: 99 y 163, o los complementos de las mismas; comprendiendo opcionalmente además poner en contacto la muestra con al menos una sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia de ácidos nucleicos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 11, 12, 126, 128, 130 ó 131, o el complemento de las mismas.

11. 11.

    Un kit para detectar la presencia de una cepa de Staphylococcus aureus y de una cepa de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) en una muestra que comprende ácidos nucleicos en un único ensayo, que comprende al menos un oligonucleótido que se hibrida bajo condiciones rigurosas con una de las siguientes SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12, o el complemento de las mismas; y al menos un cebador específico para una cepa de MRSA que se hibrida bajo dichas condiciones rigurosas con ácidos nucleicos de MREJ polimórficos de SEQ ID NO: 14; en el que dichos oligonucleótidos tienen al menos 10 nucleótidos de longitud, y en el que dichas condiciones rigurosas comprenden MgCl2 4 mM, Tris 100 mM (pH 8,3), KCl 10 mM, (NH4)2SO4 5 mM, 0,15 mg/ml de BSA, 4% de trehalosa a 59 ºC.

12. 12.

    El kit de la reivindicación 11, en el que dicho al menos un oligonucleótido específico para MRSA se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia de ácidos nucleicos de una cualquiera de las siguientes SEQ ID NOs: 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 199, o el complemento de las mismas.

13. 13.

    El kit de la reivindicación 11, que comprende una pluralidad de oligonucleótidos que se hibridan bajo condiciones rigurosas con las siguientes SEQ ID NOs: 1, 6, 99, 144, 150, 155 y 163, o el complemento de las mismas, que comprende opcionalmente además al menos una sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con las siguientes SEQ ID NOs: 9, 10, 126, 128, 130 ó 131, o el complemento de las mismas; o que comprende una pluralidad de oligonucleótidos que se hibridan bajo condiciones rigurosas con las siguientes SEQ ID NOs: 3, 8, 99, 144, 150, 155 y 163, o el complemento de las mismas, que comprende opcionalmente además al menos una sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con las siguientes SEQ ID NOs: 11, 12, 126, 128, 130 ó 131, o el complemento de las mismas.

14. 14.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el procedimiento comprende usar cebadores y/o sondas en una reacción de amplificación.

15. 15.

    El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la reacción de amplificación comprende PCR

    múltiplex.